RU2659161C1 - Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид - Google Patents

Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид Download PDF

Info

Publication number
RU2659161C1
RU2659161C1 RU2017140106A RU2017140106A RU2659161C1 RU 2659161 C1 RU2659161 C1 RU 2659161C1 RU 2017140106 A RU2017140106 A RU 2017140106A RU 2017140106 A RU2017140106 A RU 2017140106A RU 2659161 C1 RU2659161 C1 RU 2659161C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
glutathione
composition
pharmacologically active
active compound
treatment
Prior art date
Application number
RU2017140106A
Other languages
English (en)
Inventor
Марк Борисович Балазовский
Виктор Георгиевич Антонов
Олег Александрович Игнатенко
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм"
Priority to RU2017140106A priority Critical patent/RU2659161C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2659161C1 publication Critical patent/RU2659161C1/ru
Priority to US16/603,042 priority patent/US10786577B2/en
Priority to ES18801077T priority patent/ES2899374T3/es
Priority to CA3083937A priority patent/CA3083937C/en
Priority to UAA201912306A priority patent/UA123693C2/ru
Priority to KR1020197035436A priority patent/KR102144323B1/ko
Priority to JP2019570489A priority patent/JP6798047B2/ja
Priority to EA201992336A priority patent/EA038932B1/ru
Priority to BR112020009919-8A priority patent/BR112020009919A2/pt
Priority to AU2018370441A priority patent/AU2018370441B2/en
Priority to CN201880037474.XA priority patent/CN110740745A/zh
Priority to EP18801077.1A priority patent/EP3600557B1/en
Priority to PCT/RU2018/000471 priority patent/WO2019098877A1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A61K38/063—Glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20231—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Группа изобретений относится к области фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической композиции (и к ее применению) для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний, включающей дисульфид глутатиона или его фармацевтически приемлемую органическую или неорганическую соль и глутатион дисульфид S-оксида или его фармацевтически приемлемую органическую или неорганическую соль; а также к фармакологической комбинации (и к ее применению), содержащей указанную композицию и фармакологически активное соединение, выбранное из антикоагулянта, ингибитора фактора Ха, антимикробного или противовирусного средства, ингибитора кальциевых каналов; к лекарственному средству, включающему терапевтически эффективное количество указанных композиции или комбинации совместно с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Группа изобретений обеспечивает снижение дозозависимой токсичности и усиление эффективности различных фармакотерапевтически активных агентов. 6 н. и 17 з.п. ф-лы, 14 пр., 7 табл., 6 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности и к медицине, а именно к области получения лекарственных препаратов, и может быть использовано в фармакологии, медицине и ветеринарии.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Повышение терапевтической эффективности фармакологических молекул посредством оптимизации их фармакокинетики и/или фармакодинамики и/или снижения токсичности за счет химической модификации молекулы лекарственного средства и/или ее сочетанным использованием с другим химическим соединением или соединениями является одним из направлений создания лекарственных препаратов нового поколения, проявляющих свою активность в физиологически более оптимальных дозах.
В настоящее время известно вещество - окисленный глутатион (глутатион окисленный, дисульфид глутатиона, GSSG), которое представляет собой димер трипептида глутатиона, γ-глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы указанного трипептида соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками. Как трипептид глутатион (глутатион восстановленный, GSH), так и его димер - GSSG являются природными метаболитами и присутствуют в тканях и биологических жидкостях людей и животных [Isabella Dalle-Donne et al. S-glutathionylation in protein redox regulation / Free Radical Biology & Medicine, 2007, V. 43, pp. 883-898; Калинина E.B. и др. Роль глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-зависимых процессов / Успехи биологической химии, 2014, Т. 54, с. 299-348].
Из уровня техники известно, что окисленный глутатион (GSSG) сам по себе обладает разнообразной фармакологической активностью. В частности, показана способность окисленного глутатиона усиливать продукцию широкого спектра цитокинов, контролирующих комплекс защитных реакций организма, включая противовирусное, антибактериальное, противоопухолевое, антифибротическое действие.
Так, в патенте RU 2089179 С1, опубл. 10.09.1997] и в патенте WO 9721444 А1, опубл. 19.06.1997] раскрывается использование окисленного глутатиона и фармацевтических композиций на его основе для лечения онкологических, инфекционных, иммунологических, неопластических и гематологических заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.
В патенте RU 2206334 С1, опубл. 20.06.2003], патенте RU 2208452 С1, опубл. 20.07.2003] и патенте RU 2208453 С1, опубл. 20.07.2003] раскрывается применение фармацевтических композиций на основе окисленного глутатиона для увеличения устойчивости (резистентности) организма соответственно к тепловому воздействию окружающей среды, к повышенному давлению дыхательной газовой среды и к укачиванию.
Лекарственная форма окисленного глутатиона разрешена к использованию и оказывает иммуномодулирующее, гепатопротективное, гемопоэтическое действие, а также фармакологические действия, регулирующие окислительно-восстановительные процессы в организме [http://www.rlsnet.ru/th_index_id_10764.htm].
Из уровня техники также известно создание композитов окисленного глутатиона или его фармацевтически приемлемых солей с соединениями платины или палладия (в частности композит, состоящий из динатриевой соли окисленного глутатиона с cis-диаминодихлорплатиной), обеспечивающих регуляцию эндогенной продукции цитокинов и/или гемопоэтических факторов, а также процессов метаболизма, пролиферации, дифференцировки и апоптоза нормальных и трансформированных клеток и применяемых для лечения онкологических, инфекционных, иммунологических, гематологических, ишемических, нейродистрофических, метаболических заболеваний [патент RU 2144374 С1, опубл. 20.01.2000; патент RU 2153350 С1, опубл. 27.07.2000; патент US 6312734 В1, опубл. 06.11.2001].
Кроме того, известны комбинированные средства на основе дисульфида глутатиона.
Так, в документе [заявка на патент WO 1998030228 А1, опубл. 16.07.1998] раскрывается применение окисленного глутатиона (GSSG) одного или в комбинации с восстановленной формой глутатиона (GSH), или в комбинации с аскорбат-2-фосфатом, или в комбинации с N-ацетил-L-цистеионом для лечения вирусных инфекций гриппа.
В патенте RU 2482868 С1, опубл. 27.05.2013] описывается комбинация дисульфида глутатиона (GSSG) в виде динатриевой соли с липоевой кислотой, в виде натриевой соли и координационными соединениями, образованными палладием, медью и восстановленным глутатионом (GSH), которая обладает гипогликемизирующей, гипохолестеринемической, гиполипидемической и/или антиоксидантной активностью.
Наиболее близким аналогом является фармацевтическая композиция, представляющая собой лекарственное средство, раскрытая в патенте RU 2153351 С2, опубл. 27.07.2000, содержащая окисленный глутатион GSSG и его фармацевтически приемлемые соли в комбинации с пролонгатором, регулирующая эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов. В качестве пролонгаторов действия окисленного глутатиона используются аскорбиновая кислота, диметилсульфоксид, инозин(гипоксантин-9-D-рибофуранозид), цистамин(2,2'-дитиобис[этиламин]), соединения платины (например, платина-хлорид).
Недостатком указанного известного лекарственного средства, равно и всех перечисленных выше средств, является ограниченное применение в медицине, обусловленное рядом факторов. В частности, GSSG характеризуется очень коротким периодом полураспада в пределах 5-10 секунд после введения, что требует определенной подготовки и соответствующей квалификации медицинского персонала для определения точного места введения для получения искомого терапевтического эффекта препарата либо увеличения дозы и кратности введения. Частично задача решается использованием большого числа пролонгирующих соединений, как указано в RU 2153351, однако это повышает потенциальную опасность средства для пациента и требует тщательного подбора в комбинации GSSG и пролонгирующего агента. В сочетанном или последовательном применении комбинации GSSG и пролонгирующего агента в комплексной терапии с другими лекарственными средствами, дополнительно требуется учитывать схожесть фармакокинетики для получения ожидаемого терапевтического эффекта и отсутствие негативных изменений в профиле токсичности проводимой терапии. Создание комбинации GSSG и какого-либо пролонгирующего агента требует использования дополнительного технологического оборудования, введение дополнительного этапа или этапов в производстве лекарственной субстанции и соответствующей лекарственной формы, расширения перечня вспомогательных веществ. Несмотря на существующие ограничения в использовании препарата на основе окисленного глутатиона, GSSG, представляет несомненный интерес для фармакологических решений, что связано с его биологической активностью, особенностью обмена при патологически процессах, негативно влияющих на терапевтическую эффективность лекарственных средств, что снижает эффективность и безопасность терапии.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является разработка новой фармацевтической композиции, обладающей высокой эффективностью и потенцирующей активностью в отношении фармакологически активных молекул из различных фармакотерапевтических групп. В частности, задачей является оптимизация фармакодинамики и, в конечном счете, фармакодинамики GSSG для того, чтобы стало возможным использование меньших доз для получения необходимого терапевтического эффекта при его введении пациенту в этом нуждающемуся, ингаляционно, энтерально, парентерально, при наружном применении как самостоятельно, так и в сочетании с другими фармакологически активными веществами в составе единой лекарственной формы. Фармакологически активное вещество может быть выбрано из любой фармакотерапевтической группы, включая антимикробные и противовирусные препараты, антикоагулянты, ингибиторы фактора Ха; модуляторы активности ионных каналов клеточной мембраны; иные лекарственные средства для которых будет достигнута оптимизация фармакодинамики и/или фармакокинетики и/или снижение токсичности.
Как фармацевтическая композиция, так и фармацевтическая комбинация могут применяться в виде лекарственного средства, включающего дополнительно эксципиенты.
Техническим результатом данного изобретения является снижение разовой или курсовой дозы и, таким образом, снижение дозозависимой токсичности при принятой терапевтической дозе фармакологически активного вещества; усиление эффективности терапевтически активных агентов из различных фармакотерапевтических групп, соответственно снижение их разовой или курсовой дозы и, таким образом, снижение дозозависимой токсичности.
Указанный технический результат достигается за счет создания новой фармацевтической композиции, представляющей собой лекарственное средство, содержащее комбинацию дисульфида глутатиона (GSSG) или его фармацевтически приемлемой органической или неорганической соли и глутатион дисульфид S-оксида (GS(O)SG) или его фармацевтически приемлемой органической или неорганической соли, взятых в терапевтически эффективных количествах, совместно с фармацевтически приемлемыми эксципиентами и фармакологически активными молекулами из какой либо фармакотерапевтической группы, в отношении которых установлено снижение разовой или курсовой дозы и, соответственно, снижение дозозависимой токсичности.
Обычно фармакологически активное соединение выбирают из следующих фармакотерапевтических групп:
- антикоагулянты, ингибиторы фактора Ха, в частности амидин гидрохлорид;
- антимикробные и противовирусные препараты, в частности моксифлоксацин, антигенный материал антирабической вакцины, интерферона;
- модуляторы активности кальциевых каналов клеточной мембраны, в частности нифедипин; для которых будет достигнута оптимизация фармакодинамики и/или фармакокинетики и/или снижение токсичности.
Обычно количество глутатион дисульфид S-оксида составляет 0,01-10 мас. % от массы всей композиции.
Также композиция может дополнительно содержать d-металл (Me), предпочтительно платиновой группы, еще более предпочтительно платину, представленный в виде координационного(-ых) соединений, содержащих связь Me-S-глутатион.
Количество вводимого в композицию d-металла в составе координационного соединения не превышает физиологически допустимых значений для данного d-металла. Однако это значение может быть превышено в случае, когда для достижения терапевтического эффекта требуются большие количества металла, вводимого в составе координационного соединения.
Количество d-металла в композиции варьируется от 1⋅10-10 моль до 1⋅10-3 моль на 1 кг композиции. Предпочтительно 1⋅10-5 моль на 1 кг композиции.
Предлагаемая композиция может быть изготовлена в форме для наружного, ингаляционного, энтерального или парентерального введения.
Характеристика компонентов
Дисульфид глутатиона (или окисленный глутатион, GSSG) - димер трипептида глутатиона, γ-глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы указанного трипептида соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками. В соответствии с настоящим изобретением дисульфид глутатиона в виде соли со щелочным или щелочеземельным металлом может быть получен любым известным из уровня техники способом [патент RU 2144374 С1, опубл. 20.01.2000].
Глутатион дисульфид S-оксида (также называемый глутатион тиосульфинат, или GS(O)SG) или сульфон, имеет следующее строение:
Figure 00000001
.
Глутатион дисульфид S-оксид характеризуется подобной окисленному глутатиону фармакокинетикой, и при этом является негативным регулятором ферментов распада окисленного глутатиона, таким образом, выступает как пролонгирующий агент GSSG, оптимизируя его фармакокинетику, потенцирует биологические эффекты окисленного глутатиона, что оптимизирует фармакодинамику GSSG и делает возможным использование меньших доз GSSG для получения необходимого терапевтического эффекта. Переход на более низкие уровни является одним из ключевых условий снижения токсичности действующего начала лекарственного средства. Таким образом, глутатион дисульфид S-оксид оптимизирует фармакокинетику, фармакодинамику, повышает безопасность использования GSSG, что в совокупности является условием оптимизации фармакоэкономических критериев при использовании комбинации глутатион дисульфид S-оксида и GSSG в терапевтической практике в сравнении с GSSG.
Молекулы дисульфида глутатиона и глутатион дисульфид S-оксида способны образовывать слабые межмолекулярные взаимодействия, такие как Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, с действующим началом лекарственных препаратов, оптимизируя их терапевтические свойства посредством влияния на фармакокинетику и/или фармакодинамику и/или токсичность.
«Координационные соединения» подразумевают соединения, содержащие группу ионов или нейтральных молекул, называемых лигандами, в определенном порядке размещенных (координированных) вокруг центрального атома (иона), называемого комплексообразователем
«d-металлы», «переходные металлы» и «переходные элементы» тождественны, и относятся к химическим элементам периодической системы, у которых происходит заполнение электронами d- подуровней.
«Фармацевтически приемлемые эксципиенты» представляют собой вещества, известные специалисту в данной области техники и подходящие для создания лекарственного средства, включающего предлагаемую в настоящем изобретении композицию, в форме для наружного, ингаляционного, энтерального, парентерального или др. введения. Например, в качестве эксципиентов могут использоваться любые известные фармацевтически приемлемые неорганические или органические носители, консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для регулирования осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты и другие необходимые компоненты.
«Фармацевтически приемлемые» подразумеваются соединения, которые не вызывают токсических или иных нежелательных эффектов при введении в организм пациента.
«Терапевтически эффективный агент» подразумевает любое вещество, которое используется с терапевтическими целями.
«Пациент» обозначает человек или другое млекопитающее, птицы, земноводные или рыбы, в организм которых тем или иным способом вводится композиция или ее комбинация с известным фармакологически активным соединением в частности, ингибитором фактора Ха - амидина гидрохлоридом; антимикробным препаратом - моксифлоксацином, антигенным материалом противовирусной антирабической вакцины, противовирусным средством - интерферономα; ингибитором кальциевых каналов - нифедипином.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 - Электрофореграмма препарата моноклонального антитела, растворенного в различных растворах, хранившихся при температуре 37°C. Дорожка 1 - стандарты размеров (Fermentas PageRuler™ Prestained Protein Ladder); дорожка 2 - образец 2; дорожка 3 - образец 3, дорожка 4 - образец 4, дорожка 5 - образец 1.
Фиг. 2 - Данные ВЭЖХ о структурных интермедиатах моноклонального антитела, возникающих при хранении в образцах сыворотки крови в условиях, имитирующих физиологические ((1) - образец 1; (2) - образец 2; (3) - образец 3; (4) - образец 4).
Фиг. 3 - Средние значения MHO (1) - для субстанции амидина гидрохлорида, полученные из таблицы 1, и (2) - для смеси субстанции амидина гидрохлорида с адьювантом, полученные из таблицы 2 (адъювант - композиция, включающая комбинацию дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид S-оксида).
Фиг. 4 - Са2+ - сигналы, индуцированные АТФ (1), (3) и тапсигаргином (2), (4) в перитонеальных макрофагах в среде, содержащей ионы Са2+ (1), (2) и в бескальциевой среде (3), (4). По вертикали - концентрация Са2+ в цитозоле, нМ. По горизонтали - время в минутах
Фиг. 5 - Влияние дисульфида глутатиона на [Са2+]i в покое и Са2+-сигналы, индуцированные 200 мкМ АТФ (1, 2) и 0,5 мкМ тапсигаргина (ТГ) (3) в макрофагах, находящихся в нормальном физиологическом растворе (1) или в номинально бескальциевой среде (2), (3).
Фиг. 6 - Влияние композиции (препарата) по примеру 3 на внутриклеточную концентрацию кальция [Са2+]i в покое и Са2+-сигналы, вызванные АТФ. Препарат отменяет ингибирующий эффект селективного ингибитора кальциевых каналов - нифедипина (1), эффект самого препарата подавляется восстанавливающим агентом дитиотреитолом (ДТТ) (2).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами осуществления изобретения, которые носят иллюстрирующий характер и никоим образом не ограничивают объем заявленных притязаний.
Сокращения:
GSH - глутатион (восстановленный глутатион);
GSSG - окисленный глутатион (дисульфид глутатиона);
GSO3H - глутатионсульфоновая кислота;
GS(O)SG - глутатион дисульфид S-оксида или сульфон;
GS(O2)SG - глутатион дисульфид S-диоксида.
HPLC (ВЭЖК) - высокоэффективная жидкостная хромотография;
ПААГ - полиакриламидный гель;
SDS (ДСН) - додецилсульфат натрия.
Способы получения композиций
Способ А
К раствору натриевой соли дисульфида глутатиона, полученному из L-глутатиона (пример 2), добавляют синтезированный в соответствии с методикой (пример 1) глутатион дисульфид S-оксида. Количество глутатион дисульфид S-оксида может составлять 0.1-10 мас. % от массы всей композиции. В практическом воплощении, в частности примеры 3 и 4, количество глутатион дисульфид S-оксида составило 2% и 4% соответственно, от массы всей композиции. Предлагаемый способ позволяет контролировать содержание глутатион дисульфид S-оксида с высокой точностью.
Способ В
К полученному раствору натриевой соли глутатион дисульфида в водном растворе гидроксида натрия добавляют избыток пероксида водорода при пониженной температуре, обычно 0-5°C с целью генерации глутатион дисульфид S-оксида in situ. В одном из воплощений (пример 5) при температуре не выше +3°C добавлено 127 г 6% пероксида водорода. Количество глутатион дисульфид S-оксида составило 5% от массы всей композиции.
Композиция, полученная способом А или В, характеризуется способностью влиять на образование и стабильность дисульфидной связи в белках (примеры 5 и 12), а значит и на фолдинг белка, что позволяет формировать и стабилизировать нативную конформацию белка, т.е. конформацию, в которой белок обладает функциональной активностью, в частности на конформацию лекарственного препарата, представленного белковым продуктом моноклональным антителом, состоящим из двух тяжелых и двух легких пептидных цепей, объединенных посредством дисульфидных связей в функционально активную молекулу, обладающую терапевтической активностью (пример 5).
Композиция, полученная способом А или В, характеризуется способностью повышать экспрессию ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков (пример 13), что позволяет использовать ее самостоятельно как токсикомодифицирующее средство, т.е. средство снижающее токсическое действие различных химических молекул, включая комплекс дозозависимых побочных токсических реакций при введении фармакотерапевтических средств.
Композиция, полученная способом А или В может быть использована в комбинации для изготовления лекарственных средств в сочетании с другими известными, фармакологически активными и терапевтически востребованными молекулами: в частности, антикоагулянтом, ингибитором фактора Ха - амидином гидрохлоридом (пример 8); антибиотиком - моксифлоксацином; противовирусными средствами антигенным материалом антирабической вакцины и интерферономα (примеры 9, 10, 14); ингибитором кальциевых каналов - нифедипином (пример 11), в отношении которых установлено снижение дозы и, соответственно, снижение дозозависимой токсичности.
Пример 1. Способ получения глутатион дисульфид S-оксида (сульфон) (GS(O)SG).
К раствору 100 г субстанции L-глутатиона восстановленного (GSH) в 100 мл воды при перемешивании и охлаждении до 0-5°C прикапывают 150 мл 30% раствора надуксусной кислоты в уксусной кислоте в течение 30-40 минут. После окончания прикапывания реакционную массу перемешивают при температуре не выше 5°C в течение 1 часа, после чего замораживают и лиофилизуют в течение 24 часов. Получают 110 г вещества в виде белой пены, согласно данным ВЭЖХ, содержащего смесь компонентов (40% GSO3H, 55% GS(O)SG, 5% GS(O2)SG).
Лиофилизат растворяют в 400 мл воды и проводят очистку с использованием препаративной ВЭЖХ (колонна YMC-Actus Triart Prep C18-S 50×250 мм, элюент - вода), фракции, содержащие целевое соединение с чистотой выше 95% объединяют, упаривают до объема 700 мл и лиофилизуют. Получают 42 г целевого соединения - глутатион дисульфид S-оксида (в виде смеси диастереомеров) с чистотой 95+% (HPLC).
Пример 2. Получение окисленного глутатиона (дисульфид глутатиона).
К суспензии 2760 г L-глутатиона восстановленного в 7 л воды добавляют при перемешивании 2245 г 16% раствора гидроксида натрия при температуре не выше 17°C. После полного растворения глутатиона смесь охлаждают и добавляют при перемешивании со скоростью 30-50 мл/мин 2546 г 6% пероксида водорода при температуре реакционной массы не выше +15°C. По окончании добавления пероксида полученный раствор перемешивают при заданной температуре еще 1 час. По окончании реакции (HPLC контроль) получают раствор с содержанием 2,95 кг натриевой соли дисульфида глутатиона в 11,5 л воды, который охлаждают до 3°C. Химическая чистота продукта - натриевой соли дисульфида глутатиона более 98,5% (HPLC контроль), что не требует дополнительных процедур выделения продукта.
Пример 3. Получение композиции (лекарственного средства) дисульфид глутатиона с заданным содержанием глутатион дисульфид S-оксида.
К полученной в примере 2 натриевой соли дисульфида глутатиона (2,95 кг в 11,5 л воды) при температуре 3-5°С добавляют 60 г глутатион дисульфид S-оксида, полученного в соответствии с примером 1, тщательно перемешивают в течение 5 минут, раствор оставляют на 120 мин при температуре 5°C, после чего лиофилизуют.
Пример 4. Получение композиции (лекарственного средства) дисульфид глутатиона с заданным содержанием глутатион дисульфид S-оксида.
К полученной в примере 2 натриевой соли дисульфида глутатиона (2,95 кг в 11,5 л воды) добавляют 120 г глутатион дисульфид S-оксида, полученного в соответствии с примером 1 тщательно перемешивают в течение 5 минут, раствор оставляют на 120 мин при температуре 5°С, после чего лиофилизуют.
Пример 5. Получение композиции натриевой соли дисульфид глутатиона с заданным содержанием глутатион дисульфид S-оксида
К суспензии 2760 г L-глутатиона восстановленного в 7 л воды добавляют при перемешивании 2245 г 16% раствора гидроксида натрия при температуре не выше 17°C. После полного растворения глутатиона смесь охлаждают и добавляют при перемешивании со скоростью 30-50 мл/мин 2546 г 6% пероксида водорода при температуре реакционной массы не выше +15°C. По окончании добавления пероксида полученный раствор перемешивают при заданной температуре еще 1 час. По окончании реакции (HPLC контроль) реакционную массу охлаждают до 3°C. Химическая чистота продукта - натриевой соли дисульфида глутатиона более 98,5% (HPLC контроль)
Затем при температуре не выше +3°C добавляют еще 127 г 6% пероксида водорода со скоростью 30-50 мл/мин. Выдерживают реакционную массу 1 час при температуре +3°C и лиофилизуют.
Полученная композиция содержит 95% натриевой соли дисульфида глутатиона и 4,5-5,0% натриевой соли глутатион дисульфид S-оксида (HPLC контроль), что не требует дополнительных процедур очистки продукта.
Пример 6. Получение композиции дисульфид глутатиона с заданным содержанием глутатион дисульфид S-оксида и Pt-S.
К суспензии 2760 г L-глутатиона восстановленного в 7 л воды добавляют при перемешивании 2245 г 16% раствора гидроксида натрия при температуре не выше 17°C. После полного растворения глутатиона смесь охлаждают, вносят 0,5 г цис-платины и добавляют при перемешивании со скоростью 30-50 мл/мин 2546 г 6% пероксида водорода при температуре реакционной массы не выше +15°C. По окончании добавления пероксида полученный раствор перемешивают при заданной температуре еще 1 час. По окончании реакции (HPLC контроль) получают раствор с содержанием натриевой соли дисульфида глутатиона 2,95 кг в 11,5 л воды, который охлаждают до 3°C. Химическая чистота продукта - натриевой соли дисульфида глутатиона более 98,5% (HPLC контроль), что не требует дополнительных процедур выделения продукта. Раствор охлаждают до 3°C и добавляют 60 г глутатион дисульфид S-оксида, тщательно перемешивают в течение 5 минут, раствор оставляют на 120 мин при температуре 5°С, после чего лиофилизуют.
Пример 7. Анализ фолдирующей активности композиции, полученной по примеру 5.
Состав препарата моноклонального антитела:
моноклональное антитело - 10 мг/мл
глицин - 2 мг/мл;
полисорбат 80 - 0,05 мг/мл;
натрия хлорид - 7 мг/мл;
лимонной кислоты моногидрат - 2,101 мг/мл;
вода для инъекций.
Для воспроизведения физиологических условий использовалась сыворотка крови человека, полученная с письменного добровольного согласия. Номер сыворотки в банке хранения сывороток O-17-1002.
В эксперименте по рефолдингу использовались:
Образец 1 - состав препарата моноклонального антитела в количестве 50 мкл + 1 мл сыворотки O-17-1002.
Образец 2 - состав препарата моноклонального антитела + 0,2 мМ композиции, полученной по примеру 3 в количестве 50 мкл + 1 мл сыворотки O-17-1002.
Образец 3 - состав препарата моноклонального антитела + 0,2 мМ композиции, полученной по примеру 4 в количестве 50 мкл + 1 мл сыворотки О-17-1002.
Образец 4 - состав препарата моноклонального антитела + 0,2 мМ композиции, полученной по примеру 5 в количестве 50 мкл + 1 мл сыворотки O-17-1002.
Флаконы с образцами 1 и 2 помещают на хранение при температуре 37°C. Через 24 часа флаконы извлекают из термостатов и подвергают анализу на стабильность моноклонального антитела в процессе хранения при разных температурах в условиях имитации физиологической среды человеческого организма.
Результаты исследования стабильности вначале анализируют методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле (ПААГ) в восстанавливающих условиях.
Электрофорез проводят в 15%-ном ПААГ в денатурирующих условиях в неоднородной (ступенчатой) буферной системе (диск-электрофорез) с использованием на стадии концентрирования образца механизма изотахофореза (ИТФ). Образцы готовят следующим способом: осаждают клетки центрифугированием и ресуспензируют в 200 мкл буфера (0,2М трис-HCl рН 7,5; 0,2М NaCl; 0,01 М ацетат натрия; 0,01 М b-меркаптоэтанол и 5% - глицерин), после чего кипятят две минуты.
Для проведения электрофореза используют систему из нескольких буферных растворов: катодного буфера - Tris base 0,1 М; Tricine 0,1 М; SDS 0,1% (замыкающий анион - трицин); анодного буфера - Tris base 0,2 М рН 8,9 (ведущий анион - Сl-). Концентрирующий гель Т=2,5-3%, разделяющий гель с Т=5-15% и С=2-5% (где Т - относительное содержание мономеров в геле, С - содержание сшивающего агента в сумме мономеров). Электрофорез клеточных лизатов проводят в денатурирующих условиях в 2% SDS.
Электрофореграмма препаратов белков (фиг. 1) была проанализирована с помощью программы ImageJ. Программа предназначена для денситометрического анализа данных различных экспериментов. В ручном режиме были размечены дорожки, затем отмечены полосы, соответствующие белкам, в рамках каждой из дорожек. Программа оценивает плотность каждой из полос за вычетом фона, что позволяет рассчитать чистоту целевого белка.
Условия ВЭЖХ для изучения структурных интермедиатов моноклонального антитела, возникающих при хранении в условиях, имитирующих физиологические.
Хроматограф Shimadzu LC-20 «Prominence»
Колонка Phenomenex «Jupiter» С18, 5 кмк, 300А, 250×4,6
Детекция при длине волны = 210 нм
Объем инъекции = 25 мкл
Скорость потока = 1.0 мл/мин
Температура колонки = 35°C
Температура ячейки детектора = 35°C
Подвижная фаза:
Элюэнт А. 30% ацетонитрил + 0,1% трифторуксусная кислота в воде
Элюэнт В. 70% ацетонитрил + 0,1% трифторуксусная кислота в воде
Время анализа = 47 мин.
Градиентная программа:
0-1 мин 44% ацетонитрила
1-5 мин 48% ацетонитрила
5-20 мин 50% ацетонитрила
20-30 мин 53,4% ацетонитрила
30-35 мин 60% ацетонитрила
35-37 мин 60% ацетонитрила
37-40 мин 44% ацетонитрила
40-47 мин 44% ацетонитрила
Полученные данные представлены на фиг. 2, которые свидетельствуют о том, что в образцах сыворотки крови, содержащих композиции, полученные по примерам 3, 4, 5 (соответственно фиг. 2 (2), фиг. 2 (3), фиг. 2 (4)), в отличие от образца, не содержащего указанные композиции (фиг. 2 (1)), отсутствует фракция моноклонального антитела с нарушенной структурой, которая неспособна распознавать ген.
Пример 8. Совместное применение композиции, содержащей дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид S-оксид в комбинации с антикоагулянтом, ингибитором фактора Ха - амидином гидрохлоридом.
Исследуют способность композиции, полученной в соответствии с примером 3 настоящей заявки, усиливать терапевтическую эффективность фармакологически активного агента амидина гидрохлорида, который является антикоагулянтом, ингибитором фактора Ха. Тестируемую субстанцию амидина гидрохлорида (например, полученного в соответствии с примером 2 в патенте ЕА 015918 В1, опубл. 30.12.2011) или смесь субстанции амидина гидрохлорида с адъювантом (адъювант - композиция, полученная в примере 3 настоящей заявки) вводят внутривенно с помощью инсулинового шприца с иглой 30G объемом 1 мл в боковую хвостовую вену в области 1/3 ближе к основанию хвоста. Индивидуальный объем вводимой дозы для каждого животного рассчитывают, исходя из значения массы тела, и корректируют после каждого взвешивания. Введение веществ - однократное. Для внутривенного введения животным смеси субстанции амидина гидрохлорида с адъювантом готовят указанные смеси. Для этого субстанцию амидина гидрохлорида и адъювант растворяют в дистиллированной воде отдельно, а затем растворы смешивают. Раствор готовят непосредственно перед введением животным и вводят не позднее, чем через 10 минут после приготовления. Объем доз для крыс составил 0,31-0,42 мл.
Отбор крови осуществляют без наркоза из боковой хвостовой вены выше места внутривенного введения (от 1/3 до 2/3 длины хвоста), предварительно прогревая хвост крысы в течение как минимум 15 минут в водяной бане с температурой 43°C. Кровь объемом 0,36 мл отбирают иглой размером 23G в пластиковые пробирки (типа «Эппендорф»), содержащие 0,04 мл 0,11 М раствора цитрата натрия до объема 0,4 мл, таким образом, чтобы отношение раствора цитрата натрия к крови составляло 1:9. В течение 30 минут после взятия, для получения бедной тромбоцитами плазмы кровь центрифугируют 10 мин при 8000 об/мин (7000 g), плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин (15000 g) при 20°C. Полученную плазму в объеме 110 мкл разливают в пластиковые пробирки (типа «Эппендорф») и замораживают при -20°C. Забор осуществляют 6 раз у одной крысы.
В экспериментах использовался водорастворимый, лиофильно высушенный тромбопластин с добавлением ионов кальция, аттестованный по Международному индексу чувствительности (МИЧ) - Ренампластин (НПО «РЕНАМ»).
Принцип метода: при добавлении к цитратной плазме избытка тканевого тромбопластина и ионов кальция время образования сгустка фибрина зависело только от активности факторов внешнего и общего пути свертывания: факторы I, II, V, VII, X. Измеряют время от момента добавления к плазме тромбопластина с кальцием до момента образования фибринового сгустка.
Проведение анализа: вносят во флакон с лиофильно высушенным ренампластином 8 мл дистиллированной воды и растворяют при покачивании. Перед проведением анализа реагент прогревают при 37°C в течение 30 мин. Вносят в кювету анализатора цитратную плазму объемом 50 мкл, инкубируют при 37°C точно 1-2 минуты. Затем вносят ренампластин 100 мкл и фиксируют время свертывания в секундах на коагулогическом анализаторе Merlin МС 1 компании ABW Medizin und Technik GmbH.
Полученные результаты выражают в Международном Нормализованном Отношении (MHO):
MHO = ПОМИЧ,
где МИЧ - Международный Индекс Чувствительности Ренампластина, который должен быть указан в прилагаемом паспорте. ПО - протромбиновое отношение:
ПО=ПВБ/ ПВ100%,
где ПВБ - протромбиновое время плазмы исследуемого образца в секундах, ПВ100% - усредненное протромбиновое время для образцов, полученных перед введением субстанции для данного животного.
Результаты измерения значений исследованных показателей были усреднены по экспериментальным группам и представлены в виде М±m, где М - среднее по группе, m - стандартное отклонение. Достоверность различий между группами определяют с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при р<0,05 при нормальном распределении выборки и непараметрического U-критерий Манна-Уитни при р<0,05 при ненормальном распределении.
Полученные результаты представлены в таблицах 1 и 2 и на фиг. 3. В таблице 1 и на фиг. 3 (1) приведены данные, полученные для отдельно взятой субстанции амидина гидрохлорида, а в таблице 2 и на фиг. 3 (2) представлены данные, полученные для смеси субстанции амидина гидрохлорида с адъювантом.
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Полученные результаты демонстрируют способность предлагаемых в настоящем изобретении композиций усиливать эффективность других терапевтически активных агентов.
Пример 9. Исследование антимикробной активности комбинации, включающей моксифлоксацин в сочетании с композицией дисульфида глутатиона и глутатион дисульфид S-оксида.
Исследовали препараты, полученные в соответствии с примерами 3, 4, 5 настоящей заявки.
Антимикробную активность препаратов изучали в отношении грамотрицательных: Escherichia coli АТСС 25923, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, клинический изолят - Acinetobacter baumannii и грамположительных бактерий: Listeria monocytogenes EGD (АТСС ВАА-679), Staphylococcus aureus АТСС 25922, MRSA АТСС 33591 - золотистый стафилококк, устойчивый к метициллину.
Микроорганизмы культивируют в течение ночи (16-18 часов) в 2,1% бульоне Мюллера-Хинтон М391 (Oxoid, Германия) при 37°C с непрерывным перемешиванием на шейкере. Затем из ночной культуры отбирают аликвоты суспензии бактерий и переносят в 15 мл свежего стерильного 2,1% бульона Мюллера-Хинтон, после чего инкубируют при 37°C на шейкере в течение 2,5-3 часов. После этого измеряют оптическую плотность (OD) полученной суспензии на спектрофотометре DU-50 (Beckman, США) при длине волны 620 нм против стерильного 2,1% бульона Мюллера-Хинтон и определяют количество колониеобразующих единиц в мл (КОЕ) по формуле: 1×OD620=2.5×108 КОЕ/мл [Protocols in antimicrobial peptides. W. Shafer Ed. Springer-Verlag New York, LLC, 7/8/1997]. Исходя из этого расчета, разводят суспензии бактерий стерильным 2,1% бульоном Мюллера-Хинтон до концентрации 1⋅105 КОЕ/мл.
Используют 96-луночные стерильные планшеты с U-образным дном (Sarstedt, Германия). Готовят двукратные серийные разведения исследуемых препаратов в среде Мюллера-Хинтон (по 8 разведений для каждого препарата в объеме 50 мкл/пробу). Далее в лунки планшетов, вносят по 50 мкл суспензии бактерий (конечная концентрация бактерии в пробах составляла 0,5⋅105 КОЕ/мл). Для каждого разведения препарата готовят по пять параллельных проб.
Планшеты с пробами инкубируют в термостате при 37°C в течение 18 часов.
Регистрацию результатов производят на следующий день. За минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) принимают наименьшую концентрацию вещества, при которой визуально не наблюдается (полностью ингибируется) рост микроорганизмов в соответствующих лунках планшета. Окончательные результаты рассчитывают на основании данных 5 независимых экспериментов, в каждом из которых имелось по 5 параллельных проб для каждого разведения каждого из исследованных образцов.
Антимикробную активность (АМА) препаратов определяют также методом радиальной диффузии в агарозном геле, содержащем тестируемые микроорганизмы, разработанным проф. Лерером, Университет Лос-Анжелеса, США [Lehrer R.I. et al. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial poly-peptides / Journal of Immunological Methods, 1991, V. 137, pp. 167-173]. Микроорганизмы предварительно культивируют в течение 16 ч в среде, представляющей 3%-ный раствор триптического гидролизата сои при 37°C. Аликвоты сред с микробами переносят затем раздельно в свежеприготовленную среду и инкубируют при 37°C в течение 2,5 ч для получения микроорганизмов, находящихся в середине логарифмической фазы роста. Количество клеток каждого из микроорганизмов оценивают, измеряя оптическую плотность суспензий на спектрофотометре при длине волны 620 нм. Аликвоты суспензий, содержащие 4×106 клеток микроорганизмов, перемешивают с 10 мл стерильного 1% раствора агарозы в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащим 0,15М NaCl, при температуре 42°C. Полученную смесь выливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм и оставляют при комнатной температуре до застывания. В лунки, сделанные аппликатором (диаметр 3 мм) вносят анализируемые образцы, представляющие последовательные разведения препаратов в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4 в объеме 5 мкл и инкубируют в воздушном термостате в течение 3 ч при 37°C. Затем чашки заливают 1% агарозой, содержащей 6% ТГС и инкубируют в течение 18 часов при 37°C. Диаметр зоны ингибирования роста (зона вокруг лунки, свободная от микроорганизмов) измеряют, принимая за 1 условную единицу антимикробной активности 0,1 мм и вычитая из измеренного значения 30 условных единиц, соответствующих диаметру самой лунки. Использованные концентрации препаратов - 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл, 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл.
Минимальные ингибирующие рост микроорганизмов концентрации (МИК) препаратов определяют путем построения линейных регрессий зависимости антимикробной активности от концентрации пептидов: y=а+bx, где y - антимикробная активность (у.е.), а х - концентрация препарата. За МИК принималось значение x при y=0, т.е. МИК = -а/b.
Figure 00000005
#Каждое из представленных значений является средним ± стандартная ошибка среднего (n=25).
Figure 00000006
Figure 00000007
#Каждое из представленных значений является средним ± стандартная ошибка среднего (n=25).
*достоверные отличия по сравнению с МИК моксифлоксацина (№13), t - критерий Стъюдента.
Проведенные исследования демонстрируют высокую антимикробную активность предлагаемых в настоящем изобретении композиции в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий.
Пример 10. Использование композиции, полученной по примеру 3, содержащей дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид S-оксид, в качестве адъюванта в вакцинном препарате.
Приготовление комбинации вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой и композиции по примеру 3 настоящей заявки.
Приготовили стерильный раствор гидрооксида аллюминия 0,5 мг/мл в PBS. В 60 мл полученного раствора внесли 12 г композиции, полученной по примеру 3 настоящей заявки. Полученный раствор стерилизовали, пропуская через фильтр с диаметром пор 0,44 мкм. Из полученного раствора приготовили разведение растворы (АД) с концентрацией 20 мг/мл, 10 мг/мл, 5 мг/мл, 1 мг/мл на PBS с концентрацией 0,5 мг/мл гидрооксида аллюминия.
Полученные растворы используют в приготовлении вакцин с разведением 1:200 (расчетные 50% защиты мышей) и 1:1200 (расчетные 20% защиты мышей) в растворе с заданной концентрацией субстанции по примеру 3 (настоящей заявки) на PBS с 0,5 мг/мл гидрооксида аллюминия. Полученные растворы инкубируют при температуре 4°C в течение 1 часа на шейкере (около 150 об./мин), не допуская вспенивания.
В качестве образца сравнения используется вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая с разведением 1:200 и 1:1200.
В качестве объекта исследования использовались мыши линии BALB/c, весом 13-15 г одного привоза.
Рабочее разведение, содержащее от 20 до 100 ЛД50 в 0,03 мл, рассчитывалось из результатов титрования тест-штамма CVS вируса бешенства (10% мозговая суспензия мышей инфицированных вирусом бешенства).
Первая иммунизация мышей проводилась внутрибрюшинно по 0,5 мл из расчета 10 голов на каждое разведение композиции.
Вторая иммунизация мышей через 7 суток внутрибрюшинно по 0,5 мл из расчета 10 голов на каждое разведение композиции.
Приготовление рабочего (разрешающего) разведения вируса и 3-х последующих десятикратных разведений на воде для инъекций с добавлением 2% сыворотки крови лошади, инактивированной при 56°C в течение 30 мин для определения реальной дозы вируса взятой в опыт.
Контрольной группе мышей одновременно с иммунизированными мышами вводят интрацеребрально по 0,03 мл разрешающую дозу и ее десятикратные разведения, используя на каждое разведение 6 мышей.
Срок наблюдения за животными 14 суток. При оценке результатов опыта учитывают мышей, заболевших или павших с 5 по 14 сутки.
Математическая обработка результатов по методу Рида и Менча.
Полученные результаты сведены в таблицу 5.
Figure 00000008
Приведенные данные свидетельствуют о высоких показателях выживаемости животных при введении вакцины, содержащей комбинацию дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид S-оксида. Эти показатели сравнимы, а в большинстве случаев даже выше показателей образца сравнения (для вакцины антирабической культуральной).
Пример 11. Влияние композиции, полученной по примеру 3, содержащей дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид S-оксид на активность ингибиторов кальциевых каналов.
Цель исследования - изучение влияния композиции, полученной в примере 3 настоящей заявки, на активность ионных каналов клеточной мембраны и активность ингибиторов кальциевых каналов.
В качестве исследуемых соединений используют: селективный ингибитор кальциевого канала нифедипин, глутатион дисульфид (полученный в примере 2 настоящей заявки) и композиция по примеру 3 настоящей заявки (содержащая дисульфид глутатиона совместно с глутатион дисульфид S-оксидом).
Приготовление препаратов для проведения исследования:
Исследуемые соединения и композиции хранят при +4°C; непосредственно перед началом эксперимента вещества растворяют в деионизированной воде (super Q). Приготовленный раствор хранят не более 5 часов при +4°C. Соединения добавляют в среду культивирования клеток до исследуемой конечной концентрации.
Препарат добавляют к клеткам однократно на указанный период времени.
Использованная линия клеток, условия культивирования:
Эксперименты проводят на культивируемых резидентных перитонеальных макрофагах крысы. Резидентные макрофаги выделяют из перитонеальной полости крыс весом 200-300 г по методу, описанному ранее в [Conrad R.E. Induction and collection of peritoneal exudate macrophages. Manual of macrophages methodology / New York: Marcell Dekker. - pp. 5-11; Randriamampita C. et al. Ionic channels in murine macrophages / Cell Biology, 1987, V. 105, рр. 761-769]. Сразу после выделения клетки имеют сферическую форму и диаметр 10-20 мкм. Суспензию клеток помещают в бакпечатки, содержащие кварцевые стекла размером 10×10 мм. Клетки на стеклах культивируют в среде 199 (рН 7,2) с добавлением 20% сыворотки крови быка, раствора глутамина (3%), пенициллина (100 ед./мл) и стрептомицина (100 мг/мл) в течение 1-3 суток при 37°C. По окрашиванию α-нафтил ацетат эстеразой [Monahan R.A. et al. Ultrastructural localization of nonspecific esterase activity in guinea pig and human monocytes, macrophages and lymphocytes / Blood, 1981, V. 58, pp. 1089-1099] было определено, что, по меньшей мере, 96% клеток в монослоях были макрофагами. Эксперименты проводят при комнатной температуре 20-22°C на 2-3 сутки культивирования клеток.
Кварцевые стекла с клетками помещают в экспериментальную камеру, заполненную физиологическим раствором следующего ионного состава (мМ): NaCl - 140, KCl - 5, CaCl2 - 1, MgCl2 - 1, HEPES-NaOH - 5; рН 7,3-7,4 (Alonso-Torre, Trautmann, 1993). Бескальциевая среда содержала 0 мМ СаС12 и 1 мМ ЭГТА.
В опытах используют реактивы фирмы Sigma. Маточные растворы тапсигаргина (500 мкМ), нифедипина (20 мМ) готовят в диметилсульфоксиде. Маточные растворы дисульфида глутатиона и композиции по примеру 3 (0,45 мкмоль/мл), АТФ (100 мМ), готовили на воде.
Ход эксперимента:
Для измерения внутриклеточной концентрации кальция ([Са2+]i) используют флуоресцентный зонд Fura-2AM. Макрофаги инкубируют в течение 45 мин в физиологическом растворе, содержащем 2 мкМ Fura-2AM при комнатной температуре (для предотвращения эндоцитоза мицелл Fura-2AM, который происходит при 37°C) [Alonso-Torre S.R. et al. Calcium responses elicited by nucleotides in macrophages. Interaction between two receptor subtypes / The Journal of Biological Chemistry, 1993, V. 268, pp. 18640-18647].
Стекла с окрашенными клетками отмывают физиологическим раствором и переносят в экспериментальную камеру, расположенную на столике люминесцентного микроскопа «Люмам-КФ». Флуоресценцию Fura-2 возбуждают при 337 нм с помощью азотного лазера ЛГИ-503. Лазер располагают сбоку от микроскопа под углом 30° к экспериментальной камере, что позволяет направить луч лазера непосредственно на объект. Интенсивность флуоресценции регистрируют с помощью спектрофотонасадки СФН-10 при длине волны 510 нм. Сигнал с ФЭУ-79 усиливают специально сконструированным усилителем и регистрируют на компьютере IBM PC с использованием оригинального программного обеспечения. В экспериментах используют объектив 10X0,40. При данном увеличении в площадь фотометрируемого участка попадает 40-50 клеток. С целью избежания фотовыгорания измерения проводят через каждые 20 с облучением объекта в течение 2,5 с. При добавлении АТФ и УТФ клетки облучают непрерывно до достижения максимума флуоресценции. Значения [Са2+]i рассчитывают по уравнению Гринкевича [
Figure 00000009
G. et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties / The Journal of Biological Chemistry, 1985, V. 260, pp. 3440-3450]:
[Са2+]i=Kd⋅(F-Fmin)/(Fmax-F),
где F - наблюдаемая интенсивность флуоресценции; Fmax - флуоресценция красителя, насыщенного Са2+; Fmin - флуоресценция красителя, свободного от Са2+ (в бескальциевой среде).
При 20°C и рН 7,1-7,2, константа диссоциации, Кd, для комплекса Fura-2AM:Ca2+ составляет 135 нМ, Fmax измеряют после добавления 10 мкМ иономицина или 25 мкМ дигитонина к клеткам, находящимся в среде, содержащей Са2+. Обработка клеток дигитонином позволяет ионам Са2+ свободно проникать через плазматическую мембрану, не влияя на проницаемость мембран митохондрий и эндоплазматического ретикулума. После стабилизации сигнала добавляют 5 мМ ЭГТА и определяют флуоресценцию красителя в номинально бескальциевой среде (Fmin). Уровень собственной флуоресценции вычитают после добавления к макрофагам раствора MnCl2 (100 мкМ). Mn2+ вытесняет Ca2+ из комплекса с Fura-2, а флуоресценция комплекса красителя с Mn2+ в 100 раз ниже флуоресценции комплекса Fura-2 с Са2+. Для Fura-2, Fmin=Fmax/3
В исследованиях используют два экспериментальных подхода. В первом исследовали действие фармакологических агентов на Са2+-ответ, вызываемый АТФ, УТФ, тапсигаргином или циклопьязониковой кислотой (ЦПК) в макрофагах, находящихся в нормальном физиологическом растворе. Агенты вводят либо до действия агонистов, либо после, во время фазы плато Са2+-сигнала, отражающей вход Са2+ из наружной среды. Во втором варианте опытов для выявления и усиления входа Са2+ в клетки используют следующую схему эксперимента (Ca2+-free/Ca2+-reintroduction protocol). Макрофаги инкубировали в номинально бескальциевой среде, затем на них действовали одним из агонистов, вызывая мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо. После добавления в наружную среду 2 мМ Са2+ и восстановления физиологического градиента концентрации Са2+, 15 наблюдается быстрое повышение [Са2+]i, отражающее вход Са2+ в клетку. Далее исследуют влияние фармакологических агентов, добавленных до введения агонистов, до введения Са2+ или во время развивающегося входа Са2+ из наружной среды.
Результаты влияния исследуемых соединений на внутриклеточную концентрацию Са2+ и Са2+-сигналы, индуцированные АТФ и тапсигаргином, в макрофагах крысы:
Введение в среду инкубации перитонеальных макрофагов крысы 200 мкМ АТФ вызывает двухфазный Са2+-сигнал, состоящий из начального кратковременного пика, связанного в основном, с мобилизацией Са2+ из депо, вызванной активацией Р2и-рецепторов, и выраженной длительной фазой «плато». Эта фаза плато обусловлена входом Са2+ из наружной среды и отражает, по-видимому, одновременную активацию Р2u и Р2z-рецепторов. На фиг. 4 (1) представлен характерный Са2+-сигнал, индуцированный внеклеточной АТФ (200 мкМ) в популяции из 40-50 макрофагов, находящихся в нормальном физиологическом растворе.
В ответ на введение экстраклеточной АТФ [Са2+]i увеличивается от базального уровня 75±18 нМ до пика 820±105 нМ. Далее следует медленно убывающая фаза плато, во время которой [Са2+]i, составляет в среднем 460±115 нМ через 4 мин после добавления АТФ.
Специфический ингибитор эндоплазматических Са2+-АТФаз тапсигаргин (0,5 мкМ) также вызывает двухфазный Са2+-сигнал: достаточно быстрый пик, связанный с мобилизацией Са2+ из депо, и длительную фазу, отражающую депо-зависимый вход Са2+ из наружной среды. На фиг. 4 (2) представлен типичный Са2+-сигнал, индуцированный тапсигаргином в макрофагах, находящихся в нормальном физиологическом растворе.
Для выявления и усиления фазы входа Са2+ в клетку были проведены эксперименты с использованием бескальциевой среды. После стимуляции макрофагов 200 мкМ АТФ (фиг. 4 (3)) или 0,5 мкМ тапсигаргина (фиг. 4 (4)) в номинально бескальциевой среде (0 мМ СаС12 и 1 мМ ЭГТА), вход Са2+ индуцируют введением в наружную среду 2 мМ Са2+.
На фиг. 5 представлено влияние дисульфида глутатиона на [Ca2+]i в покое и Са2+-сигналы, индуцированные 200 мкМ АТФ (1), (2) и 0,5 мкМ тапсигаргина (3) в макрофагах, находящихся в нормальном физиологическом растворе (1) или в номинально бескальциевой среде (2), (3).
Полученные данные свидетельствуют о способности дисульфида глутатиона увеличивать [Са2+]i до 180±19 нМ за счет мобилизации кальция из внутриклеточного депо. Опустошение внутриклеточных депо кальция снижает эффект от действия АТФ. Тапсигаргин полностью отменяет действие способности дисульфида глутатиона осуществлять мобилизацию кальция из депо.
На фиг. 6 показано влияние композиции (препарата) по примеру 3 настоящей заявки на внутриклеточную концентрацию кальция [Са2+]i в покое и Са2+-сигналы, вызванные АТФ. Препарат отменяет ингибирующий эффект селективного ингибитора кальциевых каналов - нифедипина (1), эффект самого препарата подавляется восстанавливающим агентом дитиотреитолом (2).
Полученные данные свидетельствуют о способности дисульфида глутатиона совместно с глутатион дисульфид S-оксидом увеличивать [Са2+]i до 240±28 нМ за счет мобилизации кальция из внутриклеточного депо. Опустошение внутриклеточных депо кальция снижает эффект от действия АТФ. Дисульфид глутатиона совместно с глутатион дисульфид S-оксидом стабилизирует процесс поступления кальция в клетку из среды, что выражается в подавлении действия на этот процесс ингибитора кальциевых каналов - нифедипина. Дитиотреитол отменял стабилизирующее влияние дисульфида глутатиона совместно с глутатион дисульфид S-оксидом на работу кальциевых каналов.
Таким образом, глутатион дисульфид S-оксид способен усиливать действие одних соединений на клетки, в поставленном эксперименте таковым был дисульфид глутатиона, по отношению к которому глутатион дисульфид S-оксида выступал в качестве синергиста. Глутатион дисульфид S-оксид в сочетании с дисульфидом глутатиона снижать или подавлять влияние других соединений (в поставленном эксперименте - нифедипин), по отношению к которому композиция выступает в качестве антагониста и средства устраняющего токсичность нифедипина.
Результаты приведенных примеров показывают, что дисульфид глутатиона в сочетании с глутатион дисульфид S-оксидом проявляет высокую биологическую активность, что выражается в повышении мобилизующей активности кальция на 30-50%. Учитывая способность дисульфида глутатиона модулировать активность поверхностно-клеточных рецепторов и ионных каналов указывает, оказывать влияние на внеклеточные и внутриклеточные рецепторы, белки транспортеры цитоплазматической и внутриклеточных мембран, внеклеточные регуляторные и транспортные молекулы пептидной природы, белки цитоскелета, аутоиммунные реакции; связывание и распознавание антигена, процессы экзо- и эндоцитоза, хемотаксиса, хемокинеза, цитокинеза; межклеточные, матрикс клеточные и гуморально-клеточные взаимодействия можно полагать, что дисульфид S-оксид будет выступать в качестве синергиста в этих воздействиях дисульфида глутатиона, что может быть использовано в создании новых лекарственных средств, возможностью использования в более низких дозах без потери терапевтической эффективности, но и снижением спектра дозозависимых токсических и побочных эффектов.
Пример 12. Влияние композиции, полученной по примеру 5, на скорость образования дисульфидной связи.
Образец весом 1 г, полученный по примеру 5 (содержание глутатион дисульфид S-оксида - 5%), растворяют в воде (9 мл). К полученному раствору при перемешивании добавляют 1 мл раствора натриевой соли L-глутатиона восстановленного (2,5 мг/мл). Реакционную массу перемешивают 5 мин и анализируют ВЭЖХ. В полученном растворе глутатион дисульфид S-оксид не обнаружен.
Пример 13. Влияние композиции, полученной по примеру 6, включающей глутатион дисульфид S-оксид с дисульфидом глутатиона и металлом - соединение платины - цисплатин Pt-S на экспрессию ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков.
В качестве исследуемых соединений используют:
1 - глутатион дисульфид S-оксид (соединение, полученное в примере 1);
2 - дисульфид глутатиона (соединение, полученное в примере 2);
3 - композиция глутатион дисульфид S-оксид с дисульфидом глутатиона (композиция, полученная в примере 5);
4 - композиция глутатион дисульфид S-оксида с дисульфидом глутатиона и металлом - соединение платины - цисплатин Pt-S (композиция, полученная в примере 6);
Исследование проводят на белых рандомбредных крысах-самцах массой 140-160 г, из питомника РАМН «Рапполово», гепатотоксическое действие у которых вызывалось ежедневным, в течение 10 суток, введением циклофосфана (ЦФ) в дозе 20 мг/кг подкожно в физиологическом растворе.
Было сформировано 6 групп экспериментальных животных.
№1 - интактные животные, получавшие инъекции растворителя изучаемых соединений (физиологический раствор) (контроль растворителя);
№2 - животные, получившие ЦФ, которым в дальнейшем в качестве лечебного средства вводили физиологический раствор (контроль);
Опытные группы:
№3 - животные, получившие исследуемое соединение 1 в физиологическом растворе внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней через 30 мин после введения токсиканта ЦФ.
№4 - животные, получившие исследуемое соединение 2 в физиологическом растворе внутрибрюшинно в дозе 0.1 мг/кг в течение 10 дней через 30 мин после введения токсиканта ЦФ.
№5 - животные, получившие исследуемую композицию 3 в физиологическом растворе внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней через 30 мин после введения токсиканта ЦФ.
№6 - животные, получившие исследуемую композицию 4 в физиологическом растворе внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней через 30 мин после введения токсиканта ЦФ.
Исследовались ферменты второй фазы детоксикации ксенобиотиков в цитозольной фракции клеток печени: глутатион-S-трансфераза (КФ 2.5.1.18), глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9), глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49.)
Результаты исследования
Результаты изучения комплекса молекулярных реакций, обеспечивающих толерантность к действию токсических веществ, свидетельствуют о способности сульфона (1), дисульфида глутатиона (2), композиций с их использованием (3 и 4) индуцировать активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков - глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2), глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9), глутатион-S-трансферазы (КФ 2.5.1.18) а также сопряженного с ними обмена восстановленного глутатиона (табл. 6).
Таблица 6
Изменение активности ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков в клетках печени белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана в дозе
20 мг/кг в течение 10 суток
(Активность ферментов в мкмоль/(минт белка, восстановленного глутатиона - мкмоль/г белка) при действии исследуемых веществ: 1 - сульфон; 2 - дисульфид глутатиона; 3 - композиция сульфона с дисульфидом глутатиона (композиция, полученная в примере 5); 4 - композиция сульфона с дисульфидом глутатиона и металлом - соединение платины - цисплатин Pt-S (композиция, полученная в примере 6).
Figure 00000010
* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля
** - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой отравленных животных без коррекции
GR - глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2)
GP - глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9)
GST - глутатион-8-трансфераза (КФ 2.5.1.18)
G6PDG - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49.)
GSH - восстановленный глутатион
Введение в композицию соединения металла, в частности соединения платины Pt-S, повышало способность композиции дисульфида глутатиона и сульфона индуцировать активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, увеличивали интенсивность обмена ключевого, сопряженного с ними метаболита восстановленного глутатиона.
Таким образом, соединение металла, в частности, соединения платины Pt, обладающей способностью индуцировать активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, усиливают ее токсикомодифицирующее и, соответственно, цитопротекторное действие за счет индукции ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков композиции сульфона и дисульфида глутатиона.
Пример 14. Влияния глутатион дисульфид S-оксида и композиций с его участием на противовирусную эффективность интерферона α.
Изучение влияния глутатион дисульфид S-оксида и композиций с его участием (примеры 1, 2, 5, 6) на противовирусную активность интерферона проводят на культуре инфицированных клеток.
Метод оценки противовирусной активности интерферона основан на определении его минимального количества, защищающего клетки линии Л-68 от цитопатического действия вируса. Композиции вводят в среду инкубации клеток до концентрации 0,0015 мкмоль/мл, 0.015 мкмоль/мл и 0.15 мкмоль/мл перед внесением интерферона, совместно с интерфероном, после внесения интерферона через 10 мин, 30 мин и 60 мин. Титр интерферона в экспериментах составил 4×10-4 Ед/мл, 8×10-4 Ед/мл, 1,6×10-5 Ед/мл, 3,2×10-5 Ед/мл, 6,4×10-5 Ед/мл, 1,28×10-6 Ед/мл, 2,56×10-6 Ед/мл, 5,12×10-6 Ед/мл. Противовирусную активность препаратов оценивали по способности живых клеток поглощать кристаллический фиолетовый. Количество поглощенного кристаллического фиолетового определялось фотометрически при длине волны 595 нм, после выделения фракции живых клеток и экстракции красителя метанолом. Количество поглощенного красителя пропорциональное количеству живых клеток выражалось в единицах оптической плотности.
Подготовка клеточной линии Л-68 для эксперимента.
Клеточная линия Л-68 является штаммом диплоидных клеток легкого эмбриона человека, полученного в Московском НИИ вирусных препаратов АМН РФ из клеток легкого эмбриона человека 11 недель, абортированного у женщины 28 лет, у которой онкологические, венерические заболевания, гепатит, туберкулез, генетические и врожденные аномалии отсутствовали.
Посевной банк штамма диплоидных клеток Л-68 аттестован для приготовления иммунобиологических препаратов в МНИИ ВП АМН РФ совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ.
Клетки линии Л-68 культивируют при 37°C в полной ростовой среде I. Культивирование проводят в пластиковых флаконах вместимостью 250 мл (типа "Costar"). Клетки распластываются на дне флакона, формируя монослой с типичной для диплоидных фибропластов морфологией. Распластанные клетки переводят в суспензию специальной средой, состоящей из равных частей 0,02% раствора Версена и 0,25% раствора трипсина. Для этого из флакона со сформировавшимся монослоем клеток сливают полную ростовую среду, дважды промывают монослой специальной средой (раствор Версена с трипсином) и инкубируют при 37°C в течение 5 мин. За это время происходит отлипание монослоя фибробластов от пластика. Отлипшие клетки разводят полной ростовой средой, разбивая конгломераты клеток многократным пипетированием. Клетки переносят в стерильную пробирку для центрифугирования, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин. Образовавшийся супернатант сливают и клетки переводят в полную ростовую среду. Далее клетки подсчитывают в камере Горяева и используют в опытах.
Для определения активности и токсичности могут использоваться культуры клеток, прошедшие не менее 20 и не более 30 пассажей.
Подготовка вируса везикулярного стоматита.
Для эксперимента используют лиофильно высушенный вирус везикулярного стоматита (ВВС), стерильно расфасованный в стеклянные запаянные ампулы.
Наращивание вируса проводят на линии клеток L-929. Для этого во флакон со сформировавшимся монослоем клеток в полной культуральной среде добавляют заранее оттитрованную дозу вируса (инфекционный титр ВВС - максимальное разведение вируса, при котором в течение 1 суток при 37°C происходит полное разрушение монослоя клеток). Содержимое во флаконе культивируют в течение 1 суток при 37°C, после чего культуральную среду сливают в стерильные пробирки вместимостью 50 мл и центрифугируют при 2000 об/мин. Далее полученный супернатант, содержащий вирус везикулярного стоматита, разливают в стерильных условиях по 1 мл в ампулы и лиофильно высушивают.
Определение инфекционного титра вируса.
В 96-луночный планшет (типа "Costar") вносят приготовленные клетки линии Л-68, переведенные в суспензию в полной культуральной среде 1 в концентрации 5⋅104 клеток на лунку в объеме 0,2 мл. После этого планшет инкубируют в течение 1 суток при температуре 37°С в СO2-инкубаторе в атмосфере 5% СO2. За это время клетки распластываются в лунках, образуя сплошной монослой. Через 1 сутки культуральную среду декантируют в стерильных условиях и в лунки планшета вносят заранее приготовленные двукратные разведения вируса в четырех параллелях. Вирус ВВС вносится в полной культуральной среде в объеме 0,2 мл. После этого планшет инкубируют в условиях, описанных выше. По окончании инкубации (через 1 сутки) культуральную среду декантируют и в лунки вносят по 0,05 мл 0,2% раствора кристаллического фиолетового на 20% метаноле. Через 10 мин краску удаляют, планшет промывают под струей воды и высушивают. Далее в планшет добавляют 0,1 мл лизирующего буфера для элюции красителя в раствор. Интенсивность окрашивания учитывают на ридере для микропланшетов при длине волны 595 нм.
За инфекционный титр вируса принимают максимальное разведение вируса, при котором в течение 1 суток в данных условиях происходит полное разрушение монослоя клеток в лунках. Оптическая плотность раствора в данных лунках будет минимальной и близкой к фоновому значению.
Определение активности.
В полной ростовой среде готовят двукратные разведения (выше и ниже предполагаемого титра) стандартного образца активности (42-28-119-96П, ГИСК им. Л.А. Тарасевича), активность которого выражена в международных единицах ME. Разведения стандарта проводят в 96-луночном планшете (типа «Costar") в объеме 0,1 мл. На каждое разведение используют не менее 4 лунок. Один ряд планшета оставляют для контроля культуральной среды (4 лунки) и для контроля дозы вируса ВВС (4 лунки). В эти лунки вносят по 0,1 мл. После разведения стандарта в планшет вносят приготовленные клетки линии L-68, переведенные в суспензию в полной культуральной среде I в концентрации 5-104 клеток на лунку в объеме 0,1 мл. После этого через определенные промежутки времени в часть рядов с разведенным стандартом вносят исследуемые фракции:
1 - сульфон (соединение, полученное в примере 1);
2 - дисульфид глутатиона (соединение, полученное в примере 2);
3 - композиция сульфона с дисульфидом глутатиона (композиция, полученная в примере 5);
4 - композиция сульфона с дисульфидом глутатиона и металлом - соединение платины - цисплатин Pt-S (композиция, полученная в примере 6);
в концентрациях 0,0015 мкмоль/мл, 0.015 мкмоль/мл и 0.15 мкмоль/мл. Далее каждый планшет инкубируют в течение 1 суток при температуре 37°C в СO2-инкубаторе в атмосфере 5% CO2. За это время клетки распластываются в лунках, образуя сплошной монослой. Через 1 сутки полную ростовую культуральную среду декантируют в стерильных условиях и в лунки каждого планшета вносят вирус ВВС, инфекционный титр которого был определен заранее. Вирус ВВС вносится в полной ростовой культуральной среде в объеме 0,2 мл. В лунки для контроля среды вносится по 0,2 мл среды того же состава без вируса ВВС. После этого каждый планшет инкубируют в условиях, описанных выше. По окончании инкубации (через 1 сутки) культуральную среду декантируют и в лунки вносят по 0,05 мл 0,2% раствора кристаллического фиолетового на 20% метаноле. Через 10 мин краску удаляют, планшет промывают под струей воды и высушивают. В лунках, где проводился контроль среды, окрашенный монослой должен быть без признаков разрушения. Далее в каждый планшет добавляют 0,1 мл лизирующего буфера для элюции красителя в раствор. Интенсивность окрашивания учитывают на ридере для микропланшетов при длине волны 595 нм.
За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса.
Результаты эксперимента.
Экспериментально установлено, что предварительная инкубация клеток с каждым исследуемым соединением не сказывалась на противовирусной активности интерферона.
Результаты экспериментов, в которых каждую композицию вводили после интерферона, свидетельствуют о способности практически всех исследуемых веществ повышать эффективность интерферона в случае, если композиция вносилась не ранее, чем через тридцать минут после воздействия интерферона на клетки.
Исследуемые вещества в разной степени повышали эффективность при титрах интерферона 6,4×10-5 1,28×10-6, что выражалось в большем повышении оптической плотности в опыте, где действие интерферона осуществлялось совместно с тем или иным веществом относительно опыта где действовал только интерферон.
Для выявления более достоверного значения величины повышения эффективности интерферона той или иной композицией был проведен эксперимент с получением большего числа экспериментальных данных в области разведений интерферона, где отмечается его активность (Таблица 7).
Figure 00000011
* - Р<0.1
** - Р<0.05
Полученные результаты указывают на то, что все исследуемые композиции повышают противовирусную активность интерферона α в определенной области его концентраций и в случае, если они вводятся после него. Подобный характер эффекта композиции обусловлен тем, что при его предварительном или совместном введении с интерфероном в культуральной среде нет или в относительно недостаточном количестве присутствует окисляющий агент. Сложный состав культуральной среды приводит к тому, что малые количества действующего начала относительно быстро исчезают из культуральной среды во внутриклеточное пространство. Действие интерферона на тропные клетки сопровождается продукцией окисляющих агентов, однако время их наработки в достаточном количестве превышает время нахождения в культуральной среде координационного соединения металла. Предварительное введение интерферона и его действие на тропные клетки, способствует продукции этими клетками окисляющего агента, который в последующем используется в каталитическом воздействии на сульфгидрильные группы различных рецепторов, включая рецепторы интерферона, что в итоге способствует и увеличению числа клеток, вступивших во взаимодействие с интерфероном, а это в свою очередь предопределяет усиление его противовирусного эффекта.
Таким образом, все исследуемые вещества способны повышать эффективность действия интерферона α, однако координационное соединение металла в составе композиции существенно потенцирует его активность, увеличивая число клеток способных к рецептор опосредованному взаимодействию с интерфероном α. При этом следует отметить, что потенцирование противовирусного эффекта интерферона α веществами полученными по примерам 1 и 2 практически совпадает и составляет 9-10% при различных разведениях. Совместное воздействие веществ по примеру 1 и 2 в составе композиции по примеру 5 позволяет получить дополнительное усиление противовирусной эффекта интерферона α на меньших разведениях (до 18%) и практически двукратное усиление на больших разведениях интерферона α т.е. при меньших дозах интерферона α. Схожая закономерность выявлена в случае использования композиции по примеру 6: противовирусный эффект интерферона α носил более выраженный характер, в частности - возрастал на 50% при малых разведениях и в 2.5 раза при более глубоких. Противовирусное действие интерферона α в терапевтических дозах сопряжено с развитием дозозависимых побочных и токсических эффектов у 72% пациентов получающих препараты интерферона α. Среди негативных проявлений проводимой терапии наиболее часто встречается гриппоподобный синдром, симптомы гастроинтестинальных и психогенных нарушений, признаки миелосупрессии, расстройства функций щитовидной и паращитовидной желез, формирование пула аутоантител к эндогенному интерферону α пациента. Возможность использования интерферона α в более меньших терапевтических дозах в сочетании с композицией по примеру 5 или 6 позволяет существенно сократить спектр побочных и токсических дозозависимых реакций интерферона α.

Claims (25)

1. Фармацевтическая композиция для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний, включающая дисульфид глутатиона или его фармацевтически приемлемую органическую или неорганическую соль и глутатион дисульфид S-оксида следующей структуры:
Figure 00000012
или его фармацевтически приемлемую органическую или неорганическую соль.
2. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что количество глутатион дисульфид S-оксида составляет 0,01-10 мас. % от массы всей композиции.
3. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что дополнительно содержит металл (Me), представленный в виде координационного(-ых) соединений, содержащих связь Me-S-глутатион.
4. Композиция по п. 3, характеризующаяся тем, что металл выбран из платиновой группы.
5. Композиция по п. 3, характеризующаяся тем, что металлом является платина.
6. Композиция по п. 3, характеризующаяся тем, что количество d-металла в композиции варьируется от 1⋅10-10 моль до 1⋅10-3 моль на 1 кг композиции.
7. Композиция по п. 3, характеризующаяся тем, что количество d-металла в композиции составляет 1⋅10-5 моль на 1 кг композиции.
8. Фармакологическая комбинация для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний, включающая в себя композицию по пп. 1-7 и фармакологически активное соединение, выбранное из группы антикоагулянта, ингибитора фактора Ха, антимикробного или противовирусного средства, ингибитора кальциевых каналов.
9. Комбинация по п. 8, характеризующаяся тем, что может использоваться для терапии тромбозов, где фармакологически активное соединение представляет собой антикоагулянт, ингибитор фактора Ха - амидина гидрохлорид.
10. Комбинация по п. 8, характеризующаяся тем, что может использоваться для терапии инфекционных заболеваний, вызванных грамотрицательными и грамположительными бактериями, включая: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и: Listeria monocytogenes EGD, Staphylococcus aureus, MRSA - золотистый стафилококк, устойчивый к метициллину, где фармакологически активное соединение представляет собой антимикробное средство - моксифлоксацин.
11. Комбинация по п. 8 для терапии вирусных заболеваний, где фармакологически активное соединение представляет собой противовирусное средство широкого спектра противовирусного действия - интерферон альфа.
12. Комбинация по п. 8 для профилактики бешенства, где фармакологически активное соединение представляет собой антигенный материал антирабической вакцины.
13. Лекарственное средство для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний, включающее, по меньшей мере, одну композицию по любому из пп. 1-7 в терапевтически эффективном количестве совместно с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
14. Лекарственное средство для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний, включающее, по меньшей мере, комбинацию по любому из пп. 8-12 в терапевтически эффективном количестве совместно с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
15. Лекарственное средство для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний, по пп. 13-14, характеризующееся тем, что может быть изготовлено в форме для наружного, ингаляционного, энтерального или парентерального введения.
16. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 1-7 для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний.
17. Применение по п. 16, характеризующееся тем, что композиция дополнительно содержит d-металл (Me), предпочтительно платиновой группы, еще более предпочтительно платину, представленный в виде координационного(-ых) соединений, содержащих связь Me-S-глутатион, при этом количество вводимого пациенту координационного соединения d-металла составляет 10-3-10-15 моль/кг массы тела.
18. Применение фармакологической комбинации по любому из пп. 8-12 для устранения дозозависимой токсичности и повышения терапевтической активности фармакологически активного соединения в терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний.
19. Применение по п. 18, характеризующееся тем, что фармакологически активное соединение представляет собой антикоагулянт, ингибитор фактора Ха - амидин гидрохлорид для терапии тромбозов.
20. Применение по п. 18, характеризующееся тем, что фармакологически активное соединение представляет собой антимикробное средство - моксифлоксацином для лечения инфекционных заболеваний, вызванных грамотрицательными и грамположительными бактериями, включая: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и: Listeria monocytogenes EGD, Staphylococcus aureus, MRSA - золотистый стафилококк, устойчивый к метициллину.
21. Применение по п. 18, характеризующееся тем, что фармакологически активное соединение представляет собой противовирусное средство - интерферон альфа для терапии вирусных заболеваний.
22. Применение по п. 18, характеризующееся тем, что фармакологически активное соединение представляет собой антигенный материал антирабической вакцины для профилактики бешенства.
23. Применение по п. 18, характеризующееся тем, что введение указанной фармакологической комбинации проводят ингаляционно, энтерально или парентерально.
RU2017140106A 2017-11-17 2017-11-17 Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид RU2659161C1 (ru)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017140106A RU2659161C1 (ru) 2017-11-17 2017-11-17 Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид
PCT/RU2018/000471 WO2019098877A1 (en) 2017-11-17 2018-07-17 Pharmaceutical composition comprising glutatione disulfide and glutathione disulfide s-oxide
KR1020197035436A KR102144323B1 (ko) 2017-11-17 2018-07-17 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 s-옥사이드를 포함한 제약학적 조성물
ES18801077T ES2899374T3 (es) 2017-11-17 2018-07-17 Composición farmacéutica que comprende disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido
CA3083937A CA3083937C (en) 2017-11-17 2018-07-17 Pharmaceutical composition comprising glutatione disulfide and glutathione disulfide s-oxide
UAA201912306A UA123693C2 (ru) 2017-11-17 2018-07-17 Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и с-оксид дисульфида глататиона
US16/603,042 US10786577B2 (en) 2017-11-17 2018-07-17 Pharmaceutical composition comprising glutatione disulfide and glutathione disulfide S-oxide
JP2019570489A JP6798047B2 (ja) 2017-11-17 2018-07-17 グルタチオンジスルフィド及びグルタチオンジスルフィドｓ−オキシドを含む医薬組成物
EA201992336A EA038932B1 (ru) 2017-11-17 2018-07-17 Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид
BR112020009919-8A BR112020009919A2 (pt) 2017-11-17 2018-07-17 composição farmacêutica compreendendo glutationa dissulfeto e s-óxido de glutationa dissulfeto
AU2018370441A AU2018370441B2 (en) 2017-11-17 2018-07-17 Pharmaceutical composition comprising glutatione disulfide and glutathione disulfide S-oxide
CN201880037474.XA CN110740745A (zh) 2017-11-17 2018-07-17 含有谷胱甘肽二硫化物和谷胱甘肽二硫化物s-氧化物的药物组合物
EP18801077.1A EP3600557B1 (en) 2017-11-17 2018-07-17 Pharmaceutical composition comprising glutatione disulfide and glutathione disulfide s-oxide

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017140106A RU2659161C1 (ru) 2017-11-17 2017-11-17 Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2659161C1 true RU2659161C1 (ru) 2018-06-28

Family

ID=62815737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017140106A RU2659161C1 (ru) 2017-11-17 2017-11-17 Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10786577B2 (ru)
EP (1) EP3600557B1 (ru)
JP (1) JP6798047B2 (ru)
KR (1) KR102144323B1 (ru)
CN (1) CN110740745A (ru)
AU (1) AU2018370441B2 (ru)
BR (1) BR112020009919A2 (ru)
CA (1) CA3083937C (ru)
EA (1) EA038932B1 (ru)
ES (1) ES2899374T3 (ru)
RU (1) RU2659161C1 (ru)
UA (1) UA123693C2 (ru)
WO (1) WO2019098877A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2720134C1 (ru) * 2019-11-28 2020-04-24 Общество с ограниченной ответственностью "Ай Кью Витаминная студия" Фармацевтическая композиция для парентерального капельного введения
RU2747890C1 (ru) * 2021-03-24 2021-05-17 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Средство для снижения риска и облегчения симптомов заражения бета-коронавирусной инфекцией
RU2801579C1 (ru) * 2022-10-05 2023-08-11 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Фармацевтическая композиция с противовоспалительным действием

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235494A1 (ja) * 2020-05-20 2021-11-25 孝章 赤池 活性硫黄化合物を主成分とする薬剤
CN111840535B (zh) * 2020-08-07 2021-08-03 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV-2061制备狂犬病疫苗的工艺
CN112195149B (zh) * 2020-10-20 2022-05-17 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种制备人用狂犬病疫苗的方法
CN113189232B (zh) * 2021-04-28 2022-12-27 玉林市食品药品检验检测中心 测定护肝类中成药中的谷胱甘肽、硫普罗宁、肌苷的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2144374C1 (ru) * 1998-11-23 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Способ получения композита окисленного глутатиона с cis-диаминодихлорплатиной и фармацевтических композиций на его основе, регулирующих метаболизм, пролиферацию, дифференцировку и механизмы апоптоза нормальных и трансформированных клеток
RU2153351C2 (ru) * 1995-12-14 2000-07-27 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Средство для регулирования эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов (варианты) и способ его использования
US20020002136A1 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Hebert Rolland F. Salts of glutathione

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2089179C1 (ru) 1995-12-14 1997-09-10 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гепопоэтических факторов и способ его использования
WO1997021444A1 (en) 1995-12-14 1997-06-19 Mark Borisovich Balazovsky Cytokine and hemopoietic factor endogenous production enhancer and methods of use thereof
DE69841217D1 (de) 1997-01-13 2009-11-19 Univ Emory Glutathion zur behandlung von influenzainfektionen
US6312734B1 (en) 1998-11-23 2001-11-06 Novelos Therapeutics, Inc. Methods for production of the oxidized glutathione composite with cis-diamminedichloroplatinum and pharmaceutical compositions based thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptotic mechanisms for normal and transformed cells
US20030073618A1 (en) * 2001-02-08 2003-04-17 Kozhemyakin Leonid A. Compounds comprising disulfide-containing peptides and nitrogenous bases, and medical uses thereof
RU2208452C1 (ru) 2002-02-11 2003-07-20 Жуковский Юрий Георгиевич Способ повышения устойчивости организма к повышенному давлению дыхательной газовой среды
RU2206334C1 (ru) 2002-02-11 2003-06-20 Жуковский Юрий Георгиевич Способ повышения резистентности организма к тепловому воздействию
RU2208453C1 (ru) 2002-02-11 2003-07-20 Жуковский Юрий Георгиевич Способ увеличения резистентности организма к укачиванию
EA015918B1 (ru) 2010-03-03 2011-12-30 Дмитрий Геннадьевич ТОВБИН УРЕТАНЫ, МОЧЕВИНЫ, АМИДЫ И РОДСТВЕННЫЕ ИНГИБИТОРЫ ФАКТОРА Xa
IT1401504B1 (it) * 2010-08-02 2013-07-26 Cattarini Mastelli Composizione comprendente glutatione reduttasi e glutatione ossidato
RU2451010C1 (ru) * 2011-01-11 2012-05-20 Закрытое Акционерное Общество "Ива Фарм" Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп, комбинация и композиция на их основе и способ терапевтического воздействия
RU2482868C1 (ru) 2011-12-30 2013-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Средство для лечения диабета, фармацевтическая композиция и способ лечения заболеваний
CN103441739B (zh) * 2013-08-21 2015-04-22 昂宝电子（上海）有限公司 具有一个或多个通道的放大***和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2153351C2 (ru) * 1995-12-14 2000-07-27 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Средство для регулирования эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов (варианты) и способ его использования
RU2144374C1 (ru) * 1998-11-23 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Способ получения композита окисленного глутатиона с cis-диаминодихлорплатиной и фармацевтических композиций на его основе, регулирующих метаболизм, пролиферацию, дифференцировку и механизмы апоптоза нормальных и трансформированных клеток
US20020002136A1 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Hebert Rolland F. Salts of glutathione

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Junfa Li et al. Glutathiolation of proteins by glutathione disulfide S-oxide derived from S-nitrosoglutathione. Modifications of rat brain neurogranin/RC3 and neuromodulin/GAP-43 / Journal of Biological Chemistry, 2001, V.276, N.5, pp.3098-3105. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2720134C1 (ru) * 2019-11-28 2020-04-24 Общество с ограниченной ответственностью "Ай Кью Витаминная студия" Фармацевтическая композиция для парентерального капельного введения
RU2747890C1 (ru) * 2021-03-24 2021-05-17 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Средство для снижения риска и облегчения симптомов заражения бета-коронавирусной инфекцией
RU2801579C1 (ru) * 2022-10-05 2023-08-11 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Фармацевтическая композиция с противовоспалительным действием

Also Published As

Publication number Publication date
CA3083937A1 (en) 2019-05-23
CA3083937C (en) 2021-12-28
JP6798047B2 (ja) 2020-12-09
US10786577B2 (en) 2020-09-29
EA038932B1 (ru) 2021-11-11
EP3600557A1 (en) 2020-02-05
WO2019098877A1 (en) 2019-05-23
EP3600557B1 (en) 2021-11-03
EA201992336A1 (ru) 2020-02-13
BR112020009919A2 (pt) 2020-10-13
JP2020523402A (ja) 2020-08-06
CN110740745A (zh) 2020-01-31
AU2018370441B2 (en) 2020-08-27
ES2899374T3 (es) 2022-03-11
KR20190142395A (ko) 2019-12-26
US20200121802A1 (en) 2020-04-23
UA123693C2 (ru) 2021-05-12
AU2018370441A1 (en) 2020-06-11
KR102144323B1 (ko) 2020-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2659161C1 (ru) Фармацевтическая композиция, включающая дисульфид глутатиона и глутатион дисульфид s-оксид
Lump et al. A molecular tweezer antagonizes seminal amyloids and HIV infection
Bourgonje et al. N-acetylcysteine and hydrogen sulfide in coronavirus disease 2019
Silachev et al. The mitochondria-targeted antioxidants and remote kidney preconditioning ameliorate brain damage through kidney-to-brain cross-talk
US9125893B2 (en) Highly concentrated anti-CD40 antibody pharmaceutical preparation
JP2019527712A (ja) Ｐｄ−１抗体製剤
Fung et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy
RU2315623C2 (ru) Жидкий препарат, содержащий производное кампототецина, и фармацевтическая композиция, получаемая путем лиофилизации препарата
CA2504872C (en) Use of resveratrol for the preparation of a medicament useful for the treatment of influenza virus infections
ES2607646T3 (es) Formulaciones de acetato de caspofungina
Ferrera et al. Esc peptides as novel potentiators of defective cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: An unprecedented property of antimicrobial peptides
RU2538597C2 (ru) Органические соединения для регуляции векторных ионных каналов
US9770500B2 (en) S-nitrosylation of glucosylating toxins and uses therefor
Kuo et al. Glutathione liposomes carrying ceftriaxone, fk506, and nilotinib to control overexpressed dopamine markers and apoptotic factors in neurons
Chen et al. Effect of ambroxol on the concentration of cefotaxime in the bronchoalveolar lavage fluid of rats with pulmonary fibrosis
US20190364882A1 (en) Compositions and methods for preserving red blood cells and platelets
US10420755B2 (en) Use of ciclopirox for the treatment of congenital erythropoietic porphyria
DK3078372T3 (en) Therapeutic agent for disease based on inhibitory effect of macrophage migration inhibitory factor
RU2238758C2 (ru) Водный раствор интерферона-альфа-два человека для инъекций
Joseph The Response of Hydroxychloroquine for Covid-19
CALEB THE EFFECTS OF HYDROGEN SULFIDE (H2S) ON THE RELEASE OF INFLAMMATORY MEDIATORS FROM MOUSE MACROPHAGES
RU2586283C1 (ru) ИНЪЕКЦИОННЫЙ ИЛИ ИНФУЗИОННЫЙ РАСТВОР L-АРГИНИНИЕВОЙ СОЛИ 5-МЕТИЛ-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[1,5-а]ПИРИМИДИН-7-ОНА МОНОГИДРАТА ДЛЯ ТЕРАПИИ ГРИППА И ДРУГИХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Huang The effects of hydrogen sulfide (H2S) on the release of inflammatory mediators from mouse macrophages
JP2017100957A (ja) 永久脱毛剤