WO2021235494A1 - 活性硫黄化合物を主成分とする薬剤 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a drug containing an active sulfur compound as a main medicinal ingredient.
  • Non-Patent Document 1 The physiological importance of reactive sulfur molecular species / active sulfur molecular species (RSS) such as cysteine hydropolysulfide (CysSSH) and glutathione polysulfide (GSSH) has been reported (Non-Patent Document 1).
  • RSS reactive sulfur molecular species / active sulfur molecular species
  • CysSSH cysteine hydropolysulfide
  • GSSH glutathione polysulfide
  • Cysteine hydropolysulfide occurs in large quantities in various organisms, but little is known about its biosynthesis and physiological functions. Extensive persulfide formation is evident in E. coli and mammalian cell cysteine-containing proteins, which are believed to result from post-translational processes involving chemical reactions associated with sulfur metabolites in vivo.
  • CysSSH synthesis from the substrate L-cysteine a reaction catalyzed by prokaryotic and mammalian cystenyl-tRNA synthetase (CARS).
  • CARS cystenyl-tRNA synthetase
  • Targeted disruption of genes encoding mitochondrial CARS in mouse and human cells indicates that CARS plays an important role in endogenous CysSSH production, and these enzymes function as major cysteine hypersulfur synthases in vivo. Suggests to do.
  • CARS also catalyzes co-translational cysteine persulfation and is involved in mitochondrial biosynthesis and regulation of bioenergy.
  • SARS-CoV-2 coronavirus
  • COVID-19 new coronavirus infection
  • SARS-CoV-2 protease inhibitors have been reported as therapeutic agents for COVID-19 (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Documents 2 and 3 Non-Patent Documents 2 and 3.
  • the subject is to provide an intraocular perfusate that sufficiently preserves the intraocular tissue during ophthalmic surgery and is highly safe. It has been disclosed that an intraocular perfusate containing at least a species of active sulfur molecule typified by sulfide solves the problem.
  • An object of the present invention is to provide a drug having a preventive / therapeutic effect against a virus infection by inhibiting a virus-derived protease based on various bioactive actions of an active sulfur compound existing in a living body. And the purpose. This is neither disclosed nor suggested in the above-mentioned Patent Document 3.
  • the first invention is characterized by being an antiviral drug containing an active sulfur compound as a main medicinal ingredient.
  • the active sulfur compound is, for example, R 1 S (S) n R 2 (R 1 and R 2 are independently selected from amino acids and polypeptides having a thiol group, and n represents a portion other than the thiol group. It is an integer of 2 or more, preferably 7 or less).
  • R 1 and R 2 are L-cysteine (Cys), homocysteine (Hcys) or glutathione (GSH), respectively.
  • the active sulfur compound is, for example, glutathione polysulfide, in particular GSSSG.
  • the virus is a coronavirus (CoV), especially a new type coronavirus (SARS-CoV-2).
  • the antiviral drug is, for example, a preventive / therapeutic drug for SARS-CoV-2 pneumonia.
  • the second invention is a prophylactic / therapeutic agent for a new type of coronavirus infection (COVID-19) containing glutathione poly (tri) sulfide (GSSSG, etc.) as a main medicinal ingredient
  • the third invention is glutathione poly (tri).
  • It is an immunoregulatory (modifying) agent having sulfide as a main medicinal ingredient
  • the fourth invention is an anti-inflammatory agent having glutathione poly (tri) sulfide as a main medicinal ingredient.
  • the fifth invention is a pneumonia preventive / therapeutic agent such as viral pneumonia containing an active sulfur compound as a main component.
  • the embodiment of the active sulfur compound is as described above.
  • a preventive and / or therapeutic effect against a virus infection can be obtained. It is possible to provide a drug that plays a role.
  • FIG. 1 is a block diagram showing the antiviral effect of the hydrosulfurized glutathione preparation.
  • FIG. 2 is a diagram showing various COVID-19 therapeutic effects by a hypersulfurized glutathione preparation.
  • FIG. 3 is a graph showing the anti-influenza effect of GSSSG.
  • FIG. 4 is a graph showing the therapeutic effect of elastase-induced COPD by GSSSG.
  • FIG. 5 is a graph showing the inhibitory effect of SARS-CoV-2 protease by GSSSG.
  • FIG. 6 is a graph showing the antiviral effect of GSSSG.
  • SARS-CoV-2 expresses two different cysteine (thiol) proteases based on its own viral genome. These are papain-like proteases (PLpros) and 3C-like proteases (also known as 3C-like proteases, 3CLpros, or main proteases, mainprotease, Mpros), which are the host cells of the virus. Essential for internal replication. The crystal structure of these proteases has been clarified.
  • PLpros papain-like proteases
  • 3C-like proteases also known as 3C-like proteases, 3CLpros, or main proteases, mainprotease, Mpros
  • the inventor is a donor of active sulfur molecules and one of the active sulfur compounds, in particular glutathione trisulfide (GSSSG, etc., G: glutathione) is the active center of these two proteases, PLpro and 3CLpro.
  • Glutathione trisulfide G: glutathione
  • the inventor of the present application has developed a novel anti-SARS-CoV-2 drug by utilizing the fact that GSSSG as a glutathione polysulfide has a direct antiviral effect by inhibiting the protease activity of SARS-CoV-2 and its mutants.
  • the cytokine storm which was invented (Fig. 1) and further utilized by the strong inflammatory / immunoregulatory activity (inflammation / immunosuppression) of GSSSG (Fig. 2), is regarded as the pathological condition of COVID-19 severe (fulminant) pneumonia.
  • glutathione trisulfide achieves antiviral activity by inhibiting two cysteine proteases. Glutathione trisulfide suppresses interleukin-6 production by the immune response induced by SARS-CoV-2 infection and achieves immunoregulatory, anti-inflammatory and anti-cytokine effects. Furthermore, glutathione trisulfide reacts with and binds to nitrogen monoxide (NO) to enhance vasodilation and platelet aggregation inhibitory activity by NO, resulting in thrombus formation and vasculitis, which are known as complications of COVID-19. It exerts a strong vasodilatory effect against blood vessel damage.
  • NO nitrogen monoxide
  • FIG. 3 shows the results of an example of the anti-influenza effect of GSSSG.
  • 2000 pfu / ml (PBS) of influenza virus PR8 strain (A / PR / 8/34 (H1N1), Akaike T. et al, Journal of Infectious Diseases, 170, 1023-1026, 1994) in multiple B6 mice (each) Group 10 animals, 8 weeks old) were administered to each and infected. This administration was performed by intratracheal administration of 40 ⁇ L of PBS virus solution under anesthesia.
  • GSSSG 50 ⁇ L, 1 mM was nasally administered under anesthesia 6 hours before virus inoculation, and over time, the survival rate of mice, lung injury (14 days after infection), and the number of various inflammatory cells (infection 3). After a day) was measured and analyzed. The survival rate, the presence or absence of lung injury, and the number of various inflammatory cells were compared between the GSSSG-administered group and the control group (PBS-administered group / GSSSG-non-administered group). For lung disorders, the pneumonia image was evaluated by HE staining. For the measurement of the number of inflammatory cells, bronchoalveolar lavage (BAL) was performed using PBS to analyze the number of cells and cytokines in BAL.
  • BAL bronchoalveolar lavage
  • bronchial asthma chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and pulmonary fibrosis model (Fig. 4).
  • Idiopathic interstitial pneumonia / pulmonary fibrosis has been reported as a sequela of SARS experienced in the past, and there is concern about the occurrence of similar intractable lung disease in COVID-19. It provides a wide range of preventive and therapeutic effects on the entire course from the early stage to the late stage of SARS-CoV-2 infection and all pathological conditions including prognosis and complications.
  • FIG. 4 shows an example showing the therapeutic effect of GSSSG on elastase-induced COPD.
  • PPE pancreatic elastase
  • FIG. 4 shows an example showing the therapeutic effect of GSSSG on elastase-induced COPD.
  • PPE pancreatic elastase
  • BALF bronchial alveolar lavage fluid
  • GSSSG-administered group GSSSG (+)
  • the number of inflammatory cells was smaller than that in the GSSSG-non-administered group (GSSSG (-) / control group), and as can be seen from the images obtained from CT, GSSSG. It was confirmed that emphysema was alleviated compared to the non-administered group.
  • GSSSG not only showed an ameliorating effect on severe pneumonia in a mouse model of influenza pneumonia, but also through suppression of production of inflammatory cytokines in a mouse model of bronchial asthma, COPD, and pulmonary fibrosis. It has been found to reduce lung damage and lung fibrosis. It is generally known that COVID-19 becomes severe in patients with such an underlying disorder.
  • CARS2-deficient mice cytokines such as IL-6 are elevated, confirming the anticytokine activity of active sulfur molecules (RSS) such as GSSSG.
  • RSS active sulfur molecules
  • GSSSG can be locally administered to the target organ of the virus as an inhalant (dry powder) or eye drops in addition to injections and infusions.
  • inhalant dry powder
  • eye drops in addition to injections and infusions.
  • NO nitric oxide
  • NO nitric oxide
  • NO is also toxic at high concentrations, difficult to set and adjust doses, and NO itself is responsible for inflammation and oxidative stress. Since it is also a mediator, there is concern that it may worsen the pathophysiology of COVID-19 infection. In particular, it may be more serious for patients with underlying lung disease.
  • Glutathione polysulfide has extremely high superiority from the viewpoint of its strong anti-inflammatory and immunoregulatory functions. That is, it is expected to have a medicinal effect of suppressing the occurrence of various complications such as cytokine storm and lung fibrosis after infection.
  • the point of action is to pinpoint the thiol group, which is the active center of the virus prosthesis, excellent effects can be expected in multidrug combination therapy with other drugs.
  • GSSSG can widely target not only viruses but also proteases on the host side, it can be applied as a preventive / therapeutic agent to various viruses including coronavirus and influenza other than SARS-CoV-2.
  • FIG. 5 shows the results of the SARS-CoV-2 protease inhibition test by GSSSG.
  • GSSSG can be generated based on the description in paragraphs [0025] and [0031] of Japanese Patent Application No. 2017-543669.
  • Recombinant papain-like prosthesis (PLpro) and main protease (3CLpro) derived from SARS-CoV-2 each 0.3 mM GSSSG and ebselen (2-phenyl-1,2-benzoisoselenazole-3 (2H) -on ), NO (nitrogen monoxide) and 37 ° C. for 15 minutes, then protease activity was measured using an MCA fluorescent substrate and a fluorescent plate reader (excitation wavelength 380 nm, fluorescence wavelength 460 nm).
  • GSSSG was confirmed to have the same strong inhibitory activity as ebselen against the control (GSSSG (-)) against the two proteases described above. It has been reported in the above-mentioned Non-Patent Documents 3 and 4 that ebselen has a strong inhibitory activity against two proteases.
  • PLpro and 3CLpro were synthesized based on the published SARS-CoV-2 genome.
  • papain-like protease was expressed as a His tag fusion protein
  • main protease was expressed as a His tag SUMO tag fusion protein in Escherichia coli.
  • These recombinant proteins were purified with Ni-NTA agarose, and the main protease recombinant protein was further treated with SUMO protease to remove His tags and SUMO tags.
  • Papain-like protease and main protease base sequences used for gene cloning are shown below.
  • the concentration of GSSSG in the formulation is usually 0.0003 ⁇ g / mL or higher, may be 0.003 ⁇ g / mL or higher, may be 0.01 ⁇ g / mL or higher, and may be 0.03 ⁇ g / mL or higher. , 0.1 ⁇ g / mL or higher, 0.3 ⁇ g / mL or higher, 1 ⁇ g / mL or higher, 3 ⁇ g / mL or higher, 10 ⁇ g / mL or higher, It may be 30 ⁇ g / mL or more.
  • the upper limit is usually 1000 ⁇ g / mL or less, may be 300 ⁇ g / mL or less, may be 100 ⁇ g / mL or less, and may be 30 ⁇ g / mL or less.
  • TMPRSS2 type II transmembrane serine protease overexpressing African green monkey renal epithelial cells
  • FIG. 6 shows the test results of the anti-SARS-CoV-2 action by GSSSG. According to FIG. 6, as the GSSSG dose was increased, the amount of RNA virus decreased.
  • Glutathione trisulfide can be synthesized, for example, based on WO2018 / 117186 Gazette.
  • GSH (20 mM) was reacted with 20 mM NaHS for 15 minutes at room temperature in the presence of I 2 (20 mM) in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). The reaction mixture was subjected to RP-HPLC for purification of GS (S) n G.

Abstract

生体内に存在する活性硫黄化合物の多彩な生理活性作用に基づいて、ウイルス由来のプロテアーゼを阻害することにより、ウイルス感染症に対する予防・治療効果を奏する薬剤を提供する。

Description

活性硫黄化合物を主成分とする薬剤
　本発明は、活性硫黄化合物を主要薬効成分とする薬剤に関する。
　システインヒドロポリスルフィド（CysSSH）、グルタチオンポリスルフィド（GSSH）などの反応性硫黄分子種／活性硫黄分子種（reactive sulfur species, RSS）の生理学的重要性が、報告されている（非特許文献１）。
　システインヒドロポリスルフィド（CysSSH）は、さまざまな生物で大量に発生するが、その生合成と生理学的機能についてはほとんど知られていない。大腸菌および哺乳動物細胞のシステイン含有タンパク質では広範な過硫化物の形成が明らかであり、これは、生体内の硫黄代謝物に関連する化学反応を含む翻訳後プロセスから生じると考えられている。
　原核生物および哺乳類のシステイニル-tRNAシンテターゼ（CARS）によって触媒される反応である、基質L-システインからの効果的なCysSSH合成が存在する。マウスおよびヒト細胞のミトコンドリアCARSをコードする遺伝子の標的破壊は、CARSが内因性のCysSSH産生に重要な役割を果たしていることを示し、これらの酵素がin vivoで主要なシステイン過硫黄合成酵素として機能することを示唆している。CARSは、同時翻訳システイン過硫化も触媒し、ミトコンドリアの生合成と生体エネルギーの調節に関与している。
　したがって、CARS依存性過硫化代謝物の産生メカニズムの解明は、生理学的および病態生理学的条件における異常な酸化還元シグナル伝達を理解し、酸化ストレスおよびミトコンドリア機能障害に基づいた治療標的を示唆する可能性がある。
　RSS代謝プロファイリングを使用して、活性硫黄メタボロミクス分析を確立することにより、原核生物と真核生物の両方で内生的および遍在的に生成されるかなりの量のRSSの生体内動態が明らかになるであろう。ただし、ポリスルフィドの化学的性質は、その反応性または複雑なレドックス活性特性のため、完全には理解され、そして、解明されていない。
　一方、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の原因となる新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の病態解明と予防・治療法の確立が急務となっている。COVID-19の治療薬としてSARS-CoV-2プロテアーゼ阻害剤が報告されている（非特許文献２，３）。なお、WO/2017/005768公報には、眼科手術時に眼内組織が十分に保謹され、更に安全性が高い眼内灌流液を提供することを課題とし、システインパ一スルフィド、グル夕チオンパ一スルフィドに代表される活性イオウ分子の少なくともー種を含有した眼内灌流液により課題を解決することが、開示されている。
WO/2017/005768号公報
NATURE COMMUNICATIONS|8:1177，Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics，27 October 2017. Zhang L, et al. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved α ketoamide inhibitors. Science 368:409-412 (2020). Jin Z, et al. Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors. Nature 582:289-293 (2020).
　本発明は、生体内に存在する活性硫黄化合物の多彩な生理活性作用に基づいて、ウイルス由来のプロテアーゼを阻害することにより、ウイルス感染症に対する予防・治療効果を奏する薬剤を提供することを課題とし、かつ目的とする。既述の特許文献３には、このことは開示も示唆もされていない。
　前記目的を達成するために、第１の発明は、活性硫黄化合物を主要薬効成分として含有する抗ウイルス薬であることを特徴とする。前記活性硫黄化合物は、例えば、R1S（S）nR2（R1及びR２は、独立してチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドから選択され、チオール基以外の部分を表す。nは２以上の整数であり、７以下であることが好ましい）である。前記活性硫黄化合物は、例えば、前記R1及びR２が夫々Ｌ－システイン（Cys）、ホモシステイン（Hcys）またはグルタチオン（GSH）である。前記活性硫黄化合物は、例えば、グルタチオンポリスルフィドであり、特に、ＧＳＳＳＧである。
　前記ウイルスはコロナウイルス（CoV）であり、特に、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）である。前記抗ウイルス薬は、例えば、SARS-CoV-2肺炎の予防・治療薬である。
　第２の発明はグルタチオンポリ（トリ）スルフィド（ＧＳＳＳＧ等）を主要薬効成分とする、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の予防・治療薬であり、第３の発明はグルタチオンポリ（トリ）スルフィドを主要薬効成分とする免疫制御（調整）剤であり、第４の発明は、グルタチオンポリ（トリ）スルフィドを主要薬効成分とする抗炎症剤である。
　第５の発明は活性硫黄化合物を主成分とするウイルス性肺炎等の肺炎予防・治療薬である。当該活性硫黄化合物の態様は既述のとおりである。
　本発明によれば、生体内に存在する活性硫黄化合物の多彩な生理活性作用に基づいて、例えば、ウイルス由来のプロテアーゼを阻害する等して、ウイルス感染症に対する予防、及び／又は、治療効果を奏する薬剤を提供することができる。
図１は、過イオウ化グルタチオン製剤による抗ウイルス効果を示すブロック図である。 図２は、過イオウ化グルタチオン製剤による様々なCOVID-19治療効果を示す図である。 図３はGSSSGによる抗インフルエンザ効果を示すグラフである。 図４はGSSSGによるエラスターゼ誘導性COPDの治療効果を示すグラフである。 図５はGSSSGによるSARS-CoV-2プロテアーゼの阻害効果を示すグラフである。 図６はGSSSGによる抗ウイルス効果を示すグラフである。
　SARS-CoV-2は、自身のウイルスゲノムに基づいて、ふたつの異なるシステイン（チオール）プロテアーゼを発現している。これは、パパイン様プロテアーゼ（papain-like protease, PLpro）と3C様プロテアーゼ（3C-like protease, 3CLpro、あるいは、メインプロテアーゼ, main protease, Mproとも呼ばれる）であり、これらのプロテアーゼは、ウイルスの宿主細胞内での複製に必須である。これらプロテアーゼの結晶構造は明らかになっている。
　発明者は、活性イオウ分子の供与体であり、活性硫黄化合物の一つであり、特に、グルタチオンポリスルフィド（glutathione trisulfide,ＧＳＳＳＧ等，Ｇ：グルタチオン）が、これらふたつのプロテアーゼ、PLproと3CLproの活性中心のチオール基に特異的に共有結合することで、その酵素活性を強力に阻害する発明を確立した。既に、同様の阻害様式を示すエブセレンが、結果として、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）に対して顕著な増殖抑制効果を示すことが報告されている（既述の非特許文献２、３）。酸化型のポリスルフィドの中央の硫黄（ＧＳＳＳＧ）の求核性は、還元型のポリスルフィド（ＧＳＳＳＨ）よりも強力であるために、酸化型のポリスルフィドの方が有用である。
　本願発明者は、グルタチオンポリスルフィドとしてのＧＳＳＳＧがSARS-CoV-2やその変異株のプロテアーゼ活性を阻害することで直接的な抗ウイルス効果をもたらすことを利用して新規抗SARS-CoV-2薬を発明し（図１）、さらに、ＧＳＳＳＧの強力な炎症・免疫制御活性（炎症・免疫抑制）を利用して（図２）、COVID-19重症（劇症）肺炎の病態とされるサイトカインストーム、および、その合併症あるいは後遺症（合併症）として重要視されている間質性肺炎・肺線維症などの難治性疾病の発生予防を行うことで、単純な抗ウイルス療法にとどまらない統合的な抗COVID-19治療剤の発明に至った（図２）。グルタチオンポリスルフィドは、SARS-CoV-2等のウィルス感染の結果の炎症に対する抑制効果を発揮する。
　図２において、グルタチオントリスルフィドは、二つのシステインプロテアーゼを阻害することによって、抗ウイルス作用を達成する。グルタチオントリスルフィドは、SARS-CoV-2感染により誘発される免疫応答によるインターロイキン-６産生を抑制し、免疫制御、抗炎症、抗サイトカイン作用を達成する。さらに、グルタチオントリスルフィドは、一酸化窒素（NO）と反応・結合して、NOによる血管拡張や血小板凝集抑制活性を増強することで、COVID-19の合併症として知られる血栓形成や血管炎・血管損傷などに対する強力な血管保護作用を発揮する。
　抗ウイルス剤の開発に向けて、これまでウイルスプロテアーゼ阻害剤探索が活発に行われてきた。しかしながら、多くの化合物は、いずれかのプロテアーゼのみに特化し、事実、各プロテアーゼのみに限定した阻害活性を有するに留まり、グルタチオンポリスルフィド（ＧＳＳＳＧ）のように、SARS-CoV-2の二つのシステインプロテアーゼを同時に阻害して強力な薬効を発揮するものは、前例がない。
　ＧＳＳＳＧは、ウイルス性肺炎に対して、その強力な抗炎症作用を介して治療効果を発揮する。実際、ＧＳＳＳＧをマウスに経鼻投与するとことで、A型インフルエンザウイルス肺炎の予防と治療効果が発揮されることが分かってきた（図３）。図３は、ＧＳＳＳＧによる抗インフルエンザ効果の実施例の結果を示すものである。インフルエンザウイルスPR8株（A/PR/8/34 (H1N1)、Akaike T. et al, Journal of Infectious Diseases, 170, 1023-1026, 1994）の2000 pfu/ml（PBS）を複数のB6マウス（各グループ１０匹、８週令）夫々に投与して感染させた。この投与は、PBS 40μLのウイルス液を麻酔下で気管内投与によって行った。さらに、ＧＳＳＳＧ（50μL,１mM）をウイルス接種６時間前に、麻酔下で経鼻投与し、経時的に、マウスの生存率、肺障害（感染１４日後）、および、各種炎症細胞数（感染３日後）を測定・解析した。生存率、肺障害の有無、および、各種炎症細胞数を、ＧＳＳＳＧを投与した群とコントロール群（PBS投与群/ ＧＳＳＳＧ非投与）とを対比した。肺障害については、HE染色により、肺炎像を評価した。炎症細胞数の測定については、PBSを用いて、気管支肺胞洗浄（bronchoalveolar lavage, BAL）を行い、BAL中の細胞数やサイトカインを解析した。
　また、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）や肺線維症モデルに対してもＧＳＳＳＧの治療効果が確認された（図４）。過去に経験されているSARSの後遺症として特発性間質肺炎・肺線維症が報告されており、COVID-19においても同様の難治性肺疾患の発生が懸念されているが、ＧＳＳＳＧは、この様なSARS-CoV-2感染初期から後期までの全経過と予後・合併症に及ぶすべての病態について幅広く予防と治療効果をもたらす。
　図４は、ＧＳＳＳＧによるエラスターゼ誘導性COPDの治療効果を示す実施例であり、Cars2欠損B6マウス*1のブタ膵臓エラスターゼ（PPE）誘発肺気腫モデルにおいて、ＧＳＳＳＧ（50μL,1mM）を６時間前および２日後と４日後の３回気道投与し、PPE投与５日後の気管支肺胞洗浄液（bronchial alveolar lavage fluid, BALF）中の炎症性細胞数を測定し、CTにより肺気腫病変を解析した。炎症性細胞数の測定は図３の実施例と同様にして行った。ＧＳＳＳＧ投与群（ＧＳＳＳＧ（+））では、ＧＳＳＳＧ非投与群（ＧＳＳＳＧ（－）/コントロール群）に比較して、炎症性細胞数が少なく、かつ、CTから得られた画像から分かるように、ＧＳＳＳＧ非投与群に比べて肺気腫が緩解されていることが確認された。
*1：NATURE COMMUNICATIONS|8:1177，Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics，27 October 2017.
　生体内には多様な活性硫黄分子が存在するが、主要なものとしてグルタチオンに過剰に硫黄分子が付加したＧＳＳＳＧがあり、これは比較的安定で、大量に高純度で合成することができることから、発明者は、これまでその薬効を検討してきた。一方、この様な活性硫黄が、タンパク質のシステインのチオール基にも形成されていることが分かっており、例えば、パパインなどのチオールプロテアーゼの活性中心のシステインのチオールは、このイオウ付加反応（過イオウ化：persulfidation）により活性が抑制されることが明らかとなった。
　また、発明者は、ＧＳＳＳＧがマウスのインフルエンザ肺炎モデルにおいて重症肺炎の改善効果を示すだけでなく、マウスの気管支喘息、COPD、肺線維症モデルにおいて、炎症性サイトカインの産生抑制を介して、気道や肺損傷、肺繊維化を軽減することを見出している。一般に、COVID-19は、この様な基礎疾患を有する患者において重症化することが知られている。既述のCARS2欠損マウスにおいては、IL-6などのサイトカインが上昇することから、ＧＳＳＳＧなどの活性硫黄分子（RSS）の抗サイトカイン活性が確認された。
　薬剤投与にあたってＧＳＳＳＧを、注射剤、輸液の他、吸入薬（ドライパウダー）や点眼剤として、ウイルスの標的臓器に局所投与することができることは大きな利点がある。類似したアプローチとして、一酸化窒素（NO）吸入療法が試験的に行われているが、NOは、高濃度では毒性もあり、投与量の設定と調整が難しく、NO自身が炎症や酸化ストレスのメディエータでもあるので、COVID-19感染病態を逆に増悪させることが懸念されている。特に、肺の基礎疾患をもつ患者に対してはかえって重篤化させる可能性がある。
　グルタチオンポリスルフィドは、その強力な抗炎症と免疫制御機能という視点から極めて高い優位性を持つ。即ち、サイトカインストームや感染後の肺繊維化などの多様な合併症の発生を抑制するという薬効も期待される。また、作用点が、当該ウイルスプロテーゼの活性中心のチオール基をピンポイントに狙うものなので、他の薬剤との多剤併用療法に優れた効果が見込める。さらに、ＧＳＳＳＧは、ウイルスのみならず、宿主側のプロテアーゼも幅広くターゲットできるので、SARS-CoV-2以外のコロナウイルスやインフルエンザを含めた様々なウイルスに対しても予防・治療薬として応用できる。
　活性硫黄化合物の好適なものとしてのポリスルフィドには、還元型と酸化型があり、R-(S)ｎ-SH（n=1,2,・・・・）が還元型であり、R-(S)ｎ-R（n=2,3,・・・・）が酸化型である。
　図５に、ＧＳＳＳＧによるSARS-CoV-2プロテアーゼの阻害試験の結果を示す。ＧＳＳＳＧは、特願2017-543669の段落［００２５］、［００３１］の記載に基づいて生成することができる。SARS-CoV-2由来の組換えパパイン様プロテーゼ（PLpro）およびメインプロテアーゼ（3CLpro）を、各0.3 mMのGSSSGやエブセレン（2-フェニル-1,2-ベンゾイソセレナゾール-3(2H)-オン）、NO（一酸化窒素）と37℃で15分間インキュベート後、プロテアーゼ活性をMCA蛍光基質および蛍光プレートリーダー（励起波長380 nm、蛍光波長460 nm）を用いて測定した。
　図５によれば、ＧＳＳＳＧは、コントロール（ＧＳＳＳＧ（－））に対して、エブセレンと同程度の強い阻害活性が既述の二つのプロテアーゼに対して確認された。エブセレンが二つのプロテアーゼに対して強い阻害活性を有することは既述の非特許文献３、４において報告されている。PLproと3CLproは、SARS-CoV-2のゲノムは公開されているため、それに基づき合成された。
　SARS-CoV-2のPapain-like proteaseおよびMain proteaseのクローニングについて、SARS-CoV-2ゲノム（Accession number: NC_045512）からpapain-like protease (4946-5923)、main protease(10055-10972)領域について人工遺伝子合成を行なった。塩基配列は大腸菌のコドン使用頻度に近似させた。これらの人工遺伝子断片についてpapain-like proteaseはpET53 vectorにクローニング後、NiCo21(DE3)に形質転換し、main proteaseはpE SUMO vectorにクローニングした後、BL21(DE3)に形質転換した。IPTG誘導によりpapain-like proteaseはHisタグ融合タンパク質、main proteaseはHisタグSUMOタグ融合タンパク質として大腸菌内で発現させた。これらの組換えタンパク質はNi-NTA agaroseで精製し、main protease組換えタンパク質はさらにSUMO protease処理をすることでHisタグSUMOタグ除去を行なった。
　遺伝子クローニングに用いたpapain-like protease およびmain protease塩基配列を以下に示す。
　Papain-like protease　配列表１
　Main protease　配列表２
　ＧＳＳＳＧの製剤中の濃度は、通常０．０００３μｇ／ｍＬ以上であり、０．００３μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．０１μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．０３μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．１μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．３μｇ／ｍＬ以上であってよく、１μｇ／ｍＬ以上であってよく、３μｇ／ｍＬ以上であってよく、１０μｇ／ｍＬ以上であってよく、３０μｇ／ｍＬ以上であってよい。一方上限は、通常１０００μｇ／ｍＬ以下であり、３００μｇ／ｍＬ以下であってよく、１００μｇ／ｍＬ以下であってよく、３０μｇ／ｍＬ以下であってよい。
　次に、SARS-CoV-2のJPN/TY/WK-521株（国立感染症研究所より入手）をII型膜貫通型セリンプロテアーゼ（TMPRSS2）過剰発現アフリカミドリザル腎上皮細胞（VeroE6/TMPRSS2細胞、JCRB細胞バンクより入手）にMOI 0.01で感染させて増殖させたモデルを作成し、2019新型コロナウイルス検出試薬キット（株式会社島津製作所）およびCFX Connect Real-Time System (Bio-Rad Laboratories, Inc.)を用いた定量ＰＣＲ法によってＧＳＳＳＧの抗SARS-CoV-2作用を確認した。モデルは、ＧＳＳＳＧ投与群（10μM、100μM、300μM）とＧＳＳＳＧ非投与群とから構成した。
　図６に、ＧＳＳＳＧによる抗SARS-CoV-2作用の試験結果を示す。図６によれば、ＧＳＳＳＧ投与量を増加させるに従い、RNAウイルス量が減少する結果となった。
　グルタチオントリスルフィドは、例えば、WO2018/117186公報に基づいて合成できる。ＧＳ（Ｓ）ｎＧ（ｎ＝１－７）は、さらに、7606pp-7611pp /PNAS/May 27, 2014/ vol. 111/no. 21(www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1321232111)に基づいて合成されることが可能である。ＧＳＨ（２０ｍＭ）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＩ２（２０ｍＭ）の存在下で、室温で１５分間、２０ｍＭ ＮａＨＳと反応させた。反応混合物を、ＧＳ（Ｓ）ｎＧの精製のためにRP-HPLCに供した。HPLCは、UV検出器を210nmに設定したWaters e2695シリーズを使用して実施した。サンプルはTSKgel ODS-80Tsカラム（4.6×150 mm;東ソー）、摂氏４０°、移動相A（H2O + 0.1％トリフルオロ酢酸）およびB（メタノール）を、15分で2％から70％Bまでの直線勾配で、1 ml / minの流速で実行された。ＧＳ（Ｓ）ｎＧ（ｎ＝３－７）の夫々について、ＧＳＳＳＧと同様な効果が確認できる。

Claims (17)

  1. 　活性硫黄化合物を主要薬効成分として含有する抗ウイルス薬。
  2. 　前記活性硫黄化合物が、
    　R1S（S）nR2
    （R1及びR2は、独立してチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドから選択され、チオール基以外の部分を表す。nは２以上の整数である。）
    　である、
    　請求項１記載の抗ウイルス薬。
  3. 　前記活性硫黄化合物が、前記R1及びR2が夫々Ｌ－システイン（Cys）、ホモシステイン（Hcys）またはグルタチオン（GSH）である、
    　請求項２記載の抗ウイルス薬。
  4. 　前記活性硫黄化合物が、グルタチオンポリスルフィドである、
    　請求項３記載の抗ウイルス薬。
  5. 　前記活性硫黄化合物がＧＳＳＳＧである、
    　請求項４記載の抗ウイルス薬。
  6. 　前記ウイルスがコロナウイルス（CoV）である、
    　請求項１乃至５の何れか１項記載の抗ウイルス薬。
  7. 　前記コロナウイルスが新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）である、
    　請求項６記載の抗ウイルス薬。
  8. 　ウイルス性肺炎の治療薬である、請求項１乃至７の何れか１項記載の抗ウイルス薬。
  9. 　グルタチオントリトリスルフィド（ＧＳＳＳＧ）を主要薬効成分とする、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）予防・治療薬。
  10. 　グルタチオントリトリスルフィド（ＧＳＳＳＧ）を主要薬効成分とする、免疫制御（調整）剤。
  11. 　グルタチオントリトリスルフィド（ＧＳＳＳＧ）を主要薬効成分とする、抗炎症剤。
  12. 　活性硫黄化合物を主成分とするウイルス肺炎の予防・治療薬。
  13. 　前記活性硫黄化合物が、
    　R1S（S）nR2
    （R1及びR2は、独立してチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドから選択され、チオール基以外の部分を表す。nは２以上の整数である。）
    　である、
    　請求項１２記載のウイルス肺炎の予防・治療薬。
  14. 　前記活性硫黄化合物が、前記R1及びR2が夫々Ｌ－システイン（Cys）、ホモシステイン（Hcys）またはグルタチオン（GSH）である、
    　請求項１３記載のウイルス肺炎の予防・治療薬。
  15. 　前記活性硫黄化合物が、グルタチオンポリスルフィドである、
    　請求項１４記載のウイルス肺炎の予防・治療薬。
  16. 　前記活性硫黄化合物がＧＳＳＳＧである、
    　請求項１５記載のウイルス肺炎の予防・治療薬。
  17. 　慢性閉塞性肺疾患(COPD)の予防・治療薬である、請求項１２記載のウイルス肺炎の予防・治療薬。
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