ES2899374T3 - Composición farmacéutica que comprende disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende disulfuro de glutatión o sal orgánica o inorgánica farmacéuticamente aceptable del mismo y disulfuro de glutatión S-óxido de la siguiente estructura: o sal orgánica o inorgánica farmacéuticamente aceptable de la misma, para su uso como medicamento.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición farmacéutica que comprende disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la industria farmacéutica y a la medicina, más precisamente al campo de la preparación de medicamentos y puede utilizarse en farmacología, medicina y medicina veterinaria.

Antecedentes de la invención

Aumentar la eficacia terapéutica de las moléculas farmacológicas optimizando su farmacocinética y/o farmacodinámica, y/o reducir la toxicidad mediante la modificación química de la molécula del fármaco y/o su uso concomitante con otro compuesto o compuestos químicos es una de las direcciones para desarrollar fármacos de nueva generación que exhiban su actividad en dosis fisiológicamente más óptimas.

En la actualidad, se conoce una sustancia: glutatión oxidado (glutatión oxidado, disulfuro de glutatión, GSSG), que es un dímero del tripéptido de glutatión, Y-glutamilcisteinil glicina, en el que dos moléculas de dicho tripéptido están unidas entre sí a través de un enlace disulfuro covalente entre residuos de cisteína. Tanto el tripéptido glutatión (glutatión reducido, GSH) como su dímero GSSG son metabolitos naturales y están presentes en tejidos y fluidos biológicos de humanos y animales [Isabella Dalle-Donne et al. S-glutathionylation in protein redox regulation/Free Radical Biology & Medicine, 2007, V. 43, pp. 883-898; KanuHUHa E. B. u dp. Poflb ^nym am uoHa, ^Aym am uoHmpaHC$epa3bl u ^nymamuoHape^OKCUHa b p e ^ y m ^ u u pedoKC-3aBucuMbix npou,eccoB / ycnexu 6uofl0^u^ecKOÜ xumuu, T. 54, c. 299-348].

En la técnica se sabe que el glutatión oxidado (GSSG) por sí mismo tiene una variedad de actividades farmacológicas. En particular, se muestra la capacidad del glutatión oxidado para mejorar la producción de una amplia gama de citoquinas que controlan un complejo de reacciones protectoras del cuerpo, incluida la acción antiviral, antibacteriana, antitumoral y antifibrótica.

Así, la patente rusa RU 2089179 C1, publicada el 10.09.1997] y la solicitud internacional de patente WO 9721444 A1, publ. 19.06.1997] revelan el uso de glutatión oxidado y sus composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades oncológicas, infecciosas, inmunológicas, neoplásicas y hematológicas, en las que es apropiada la estimulación de la producción endógena de citoquinas y factores hematopoyéticos.

La patente RU 2206334 C1, publicada el 20.06.2003], la patente RU 2208452 C1, publicada el 20.07.2003], y la patente RU 2208453 C1, publicada el 20.07.2003] revelan el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden glutatión oxidado para aumentar la resistencia (tolerancia) del cuerpo a los efectos térmicos del medio ambiente, al aumento de la presión del medio gaseoso respiratorio y al mareo, respectivamente. [LI JUNFA y AL "Glutathiolation of proteins by glutathione disulfide S-oxide derived from S-nitrosoglutathione (GSNO). Modifications of rat brain neurogranin/RC3 and neuromodulin/GAP-43", febrero 2 de 2001], divulga derivados de GSNO.

La forma de dosificación del glutatión oxidado está certificada para su uso y exhibe un efecto inmunomodulador, hepatoprotector, hematopoyético, así como efectos farmacológicos que regulan los procesos redox en el cuerpo [[http://www.rlsnet.rultn_index_id_10764.htm]].

En la técnica también se conoce desarrollar materiales composite de glutatión oxidado o sales farmacéuticamente aceptables con compuestos de platino o paladio (en particular materiales composite que consisten en sal disódica de glutatión oxidado con cis-diaminodicloroplatino) que proporcionan regulación de la producción endógena de citoquinas y/o factores hematopoyéticos, así como procesos de metabolismo, proliferación, diferenciación y apoptosis en células normales y transformadas y que se utilizan para el tratamiento de enfermedades cancerosas, infecciosas, inmunológicas, hematológicas, isquémicas, neurodistróficas, metabólicas [patente rusa RU 2144374 C1, publicada el 20.01.2000; patente rusa RU 2153350 C1, publicada el 27.07.2000; patente estadounidense 6,312,734 B1, publicada el 06.11.2001].

Además, se conocen agentes combinados que comprenden disulfuro de glutatión.

Por lo tanto, el documento [solicitud de patente WO 1998030228 A1, publicada el 16.07.1998] revela el uso de glutatión oxidado (GSSG) solo o en combinación con una forma reducida de glutatión (GSH), o en combinación con ascorbato-2-fosfato, o en combinación con N-acetil-L-cisteína para el tratamiento de infecciones virales por la influenza.

La patente RU2482868 C1, publicada el 27.05.2013] describe una combinación de disulfuro de glutatión (GSSG) en forma de sal disódica con ácido lipoico en forma de sal sódica y compuestos de coordinación formados por paladio, cobre y glutatión reducido (GSH), que tiene actividad hipoglucémica, hipocolesterolémica, hipolipidémica y/o antioxidante.

El análogo más cercano es una composición farmacéutica que es un medicamento divulgado en la patente RU 2153351 C2, publicada el 27.07.2000, que comprende glutatión oxidado GSSG y sus sales farmacéuticamente aceptables en combinación con un prolongador, cuya composición regula la producción endógena de citoquinas y factores hematopoyéticos. El ácido ascórbico, el dimetilsulfóxido, la inosina (hipoxantina-9-D-ribofuranósido), la cistamina (2,2'-ditiobis[etilamina]), los compuestos de platino (por ejemplo, cloruro de platino) se utilizan como prolongadores de la acción del glutatión oxidado.

La desventaja de dicho fármaco conocido, así como de todos los agentes mencionados anteriormente, es un uso limitado en medicina debido a una serie de factores. En particular, GSSG tiene una vida media muy corta en el intervalo de 5-10 segundos después de la administración, lo que requiere cierta capacitación y calificación adecuada del personal de atención médica para determinar el lugar exacto de administración para obtener el efecto terapéutico deseado del fármaco, o para aumentar la dosis y la multiplicidad de la administración. Dicho problema se resuelve parcialmente mediante el uso de una gran cantidad de compuestos prolongadores como se describe en la publicación RU 2153351, pero esto aumenta el peligro potencial del agente para el paciente y requiere una cuidadosa selección de la combinación de GSSG y un prolongador. El uso combinado o secuencial de la combinación de GSSG y un prolongador en la terapia compleja con otros fármacos requiere adicionalmente tener en cuenta la similitud de la farmacocinética para obtener el efecto terapéutico esperado en ausencia de cambios negativos en el perfil de toxicidad de la terapia administrada. El desarrollo de una combinación de GSSG y cualquier prolongador requiere el uso de equipo de procesamiento adicional, la inclusión de un paso o unos pasos adicionales en el proceso de producción de la sustancia farmacéutica y la forma de dosificación correspondiente, la expansión de la lista de excipientes. A pesar de las limitaciones existentes en el uso del fármaco a base de glutatión oxidado, GSSG es de indudable interés para las soluciones farmacológicas, lo cual se asocia con su actividad biológica, una característica del metabolismo en procesos patológicos que afectan negativamente la eficacia terapéutica de los medicamentos, lo cual reduce la eficacia y la seguridad de la terapia.

Divulgación de la invención

La invención se define por las reivindicaciones. El objeto de la presente invención es proporcionar una nueva composición farmacéutica que tiene alta eficacia y actividad potenciadora hacia moléculas farmacológicamente activas de diversos grupos farmacoterapéuticos. En particular, el objetivo es optimizar la farmacodinámica y, en última instancia, la farmacodinámica de GSSG con el fin de hacer posible el uso de dosis más pequeñas para obtener el efecto terapéutico necesario cuando se administra a un paciente que lo necesita, por inhalación, por vía enteral, parenteral, con aplicación externa tanto sola como en combinación con otras sustancias farmacológicamente activas en una sola forma de dosificación. La sustancia farmacológicamente activa se puede seleccionar de cualquier grupo farmacoterapéutico, incluidos los medicamentos antimicrobianos y antivirales, los anticoagulantes, los inhibidores del factor Xa; moduladores de la actividad de los canales iónicos de la membrana celular; otros productos farmacéuticos para los que se logre la optimización de la farmacodinámica y/o farmacocinética y/o la reducción de la toxicidad.

Tanto la composición farmacéutica como la combinación farmacéutica pueden utilizarse como medicamento que comprende excipientes adicionales.

El resultado técnico de esta invención es reducir una dosis única o una dosis cíclica y, por lo tanto, disminuir la toxicidad relacionada con la dosis a la dosis terapéutica establecida de la sustancia farmacológicamente activa; mejorar la eficacia de los agentes terapéuticamente activos de diversos grupos farmacoterapéuticos y, en consecuencia, disminuir su dosis única o cíclica y, por lo tanto, reducir la toxicidad relacionada con la dosis.

Dicho resultado técnico se logra proporcionando una nueva composición farmacéutica la cual es un fármaco que comprende una combinación de disulfuro de glutatión (GSSG) o sal orgánica o inorgánica farmacéuticamente aceptable del mismo y disulfuro de glutatión S-óxido (GS(O)SG) o sal orgánica o inorgánica del mismo farmacéuticamente aceptable en cantidades terapéuticamente efectivas, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables y moléculas farmacológicamente activas de cualquier grupo farmacoterapéutico, para lo cual se ha establecido la reducción en una dosis única o de curso y, en consecuencia, la reducción de la toxicidad relacionada con la dosis.

Normalmente, el compuesto farmacológicamente activo se selecciona entre los siguientes grupos farmacoterapéuticos:

- anticoagulantes, inhibidores del factor Xa, en particular clorhidrato de amidina;

- medicamentos antimicrobianos y antivirales, en particular moxifloxacina, material antigénico de la vacuna antirrábica, interferón a;

- moduladores de la actividad del canal cálcico de la membrana celular, en particular nifedipino;

para los que se logrará la optimización de la farmacodinámica y/o farmacocinética, y/o la reducción de la toxicidad.

Por lo general, la cantidad de disulfuro de glutatión S-óxido es de 0.01-10% en peso de la composición total.

También, la composición puede comprender además un metal d (Me), preferiblemente del grupo platino, aún más preferiblemente platino, presentado en forma de compuesto(s) de coordinación que contiene(n) enlace Me-S-glutatión.

La cantidad de metal d añadida a la composición como compuesto de coordinación no excede los valores fisiológicamente aceptables para el metal d dado. Sin embargo, este valor puede superarse en el caso de que se requieran grandes cantidades de metal añadido en forma de compuesto de coordinación para lograr un efecto terapéutico.

La cantidad de metal d en la composición varía de 1 * 10-10 mol a 1 * 10-3 mol por 1 kg de la composición, preferiblemente, 1 * 10-5 mol por 1 kg de la composición.

La composición suministrada puede prepararse para administración externa, inhalatoria, enteral o parenteral.

Características de los componentes

El disulfuro de glutatión (o glutatión oxidado, GSSG) es un dímero del tripéptido glutatión, Y-glutamilcisteinil glicina, en el que dos moléculas de dicho tripéptido están unidas entre sí a través de un enlace disulfuro covalente entre los residuos de cisteína. Según la presente invención, el disulfuro de glutatión en forma de sal con un metal alcalino o alcalinotérreo puede prepararse por medio de cualquier procedimiento conocido en la técnica [patente RU 2144374 C1, publicada el 20.01.2000].

El disulfuro de glutatión S-óxido (también llamado tiosulfinato de glutatión o GS(O)SG), tiene la siguiente estructura:

El disulfuro de glutatión S-óxido se caracteriza por una farmacocinética similar al del glutatión oxidado y, de esta manera, es un regulador negativo de las enzimas de descomposición de glutatión oxidado, por lo que actúa como un prolongador para GSSG optimizando su farmacocinética, potenciando los efectos biológicos del glutatión oxidado, lo cual optimiza la farmacodinámica de GSSG y permite el uso de dosis más pequeñas de GSSG para obtener el efecto terapéutico deseado. La transición a niveles más bajos es una de las condiciones clave para reducir la toxicidad del principio activo de un fármaco. Por lo tanto, el disulfuro de glutatión S-óxido optimiza la farmacocinética, la farmacodinámica, aumenta la seguridad del uso de GSSG, todo lo cual es una condición para la optimización de criterios farmacoeconómicos para usar la combinación de disulfuro de glutatión S-óxido y GSSG en la práctica terapéutica en comparación con GSSG.

Las moléculas de disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido son capaces de formar interacciones intermoleculares débiles, como las interacciones de van der Waals, con el principio activo de los fármacos, optimizando sus propiedades terapéuticas al influir en la farmacocinética y/o farmacodinámica y/o toxicidad.

Los "compuestos de coordinación" se refieren a compuestos que contienen un grupo de iones o moléculas neutras llamadas ligandos, colocados en un cierto orden (coordinado) alrededor del átomo central (ion) llamado agente complejante.

"Metales d", "metales de transición" y "elementos de transición" son idénticos, y se refieren a elementos químicos del sistema periódico en los que los electrones ocupan los subniveles d.

Los "excipientes farmacéuticamente aceptables" son sustancias conocidas por una persona experta en la técnica y adecuadas para la obtención de un medicamento que comprende la composición de la presente invención para su administración externa, inhalatoria, enteral, parenteral u otra forma de administración. Por ejemplo, como excipientes se pueden utilizar cualquier portador inorgánico u orgánico farmacéuticamente aceptable conocido, conservantes, solubilizantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, saborizantes, sales para regular la presión osmótica, reguladores, agentes enmascarantes o antioxidantes y otros componentes necesarios.

Por "farmacéuticamente aceptables" se entienden los compuestos que no causan efectos tóxicos u otros efectos indeseables cuando se administran a un paciente.

Por "agente terapéuticamente eficaz" se entiende cualquier sustancia que se utilice con fines terapéuticos.

Por "paciente" se refiere al humano u otros mamíferos, aves, anfibios o peces, a cuyo cuerpo de una forma u otra se administra la composición o su combinación con un compuesto farmacológicamente activo conocido, en particular, con el factor inhibidor Xa clorhidrato de amidina; agente antimicrobiano moxifloxacina, material antigénico de la vacuna antiviral antirrábica, agente antiviral interferón a; inhibidor de los canales de calcio nifedipino.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 — Electroferograma de la formulación del anticuerpo monoclonal disuelto en diversas soluciones almacenadas a una temperatura de 37°C. Línea 1 — estándares de tamaño (Fermentas PageRuler™ Prestained Protein Ladder); línea 2 — muestra 2; línea 3 — muestra 3, línea 4 — muestra 4, línea 5 — muestra 1.

Fig. 2 — Datos de HPLC para intermedios estructurales del anticuerpo monoclonal que surgen del almacenamiento en muestras de suero sanguíneo en condiciones que simulan las fisiológicas ((1) — muestra 1; (2) — muestra 2; (3) — muestra 3; (4) — muestra 4).

Fig. 3 — INR media (1) — para la sustancia clorhidrato de amidina obtenida de la Tabla 1, y (2) — para la mezcla de la sustancia clorhidrato de amidina y un adyuvante obtenido de la Tabla 2 (adyuvante es una composición que comprende una combinación de disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido).

Fig. 4 — Señales de Ca2+ inducidas por ATP (1), (3) y tapsigargina (2), (4) en macrófagos peritoneales en un medio que contiene iones Ca2+ (1), (2) y en un medio libre de calcio (3), (4). Verticalmente — concentración de Ca2+ en el citosol, nM. Horizontalmente: tiempo en minutos.

Fig. 5 — Efecto del disulfuro de glutatión sobre [Ca2+]i en reposo y señales de Ca2+ inducidas por 200 pM de ATP (1, 2) y 0.5 |jM de tapsigargina (TG) (3) en macrófagos en solución salina normal (1) o en un medio nominalmente libre de calcio (2), (3).

Fig. 6 — Efecto de la composición (formulación) del Ejemplo 3 sobre la concentración intracelular de calcio [Ca2+]i en reposo y señales de Ca2+ causadas por ATP. La formulación niega el efecto inhibitorio del inhibidor selectivo del canal de calcio nifedipino (1), en donde el efecto del fármaco mismo es suprimido por el agente reductor ditiotreitol (TDT) (2).

Divulgación de la invención

La presente invención se ilustra con formas de realización específicas de la invención que son de naturaleza ilustrativa y no limitan en modo alguno el alcance de las reivindicaciones reivindicadas.

Abreviaturas:

GSH — glutatión (glutatión reducido),

GSSG — glutatión oxidado (disulfuro de glutatión),

GSO3H — ácido glutatonionsulfónico,

GS(O)SG — disulfuro de glutatión S-óxido o sulfóxido;

GS(O2)SG — disulfuro de glutatión S-dióxido;

HPLC — cromatografía líquida de alto rendimiento;

PAAG — gel de poliacrilamida;

SDS — dodecilsulfato de sodio.

Procedimientos para preparar composiciones

Procedimiento A

A la solución de sal sódica de disulfuro de glutatión derivado de L-glutatión (Ejemplo 2) se agregó disulfuro de glutatión S-óxido sintetizado según el procedimiento (Ejemplo 1). La cantidad de disulfuro de glutatión S-óxido puede ser de 0.1-10% en peso de la composición total. En la forma de realización práctica, en particular los ejemplos 3 y 4, la cantidad de disulfuro de glutatión S-óxido fue del 2% y el 4%, respectivamente, basado en el peso de la composición total. El procedimiento proporcionado permite controlar el contenido de disulfuro de glutatión S-óxido con alta precisión.

Procedimiento B

A la solución obtenida de sal sódica de disulfuro de glutatión en una solución acuosa de hidróxido de sodio se añadió un exceso de peróxido de hidrógeno a una temperatura reducida, generalmente 0-5°C, para generar disulfuro de glutatión S-óxido in situ. En una forma de realización (Ejemplo 5), se agregaron 127 g de peróxido de hidrógeno al 6% a una temperatura no superior a 3°C. La cantidad de disulfuro de glutatión S-óxido fue del 5% en peso de la composición total.

La composición obtenida por el procedimiento A o B se caracteriza por la capacidad de influir en la formación y estabilidad del enlace disulfuro en las proteínas (Ejemplos 5 y 12) y por lo tanto, en el plegamiento de la proteína, lo que permite formar y estabilizar la conformación nativa de la proteína, es decir, una conformación en la que la proteína posee actividad funcional, en particular, la conformación de un fármaco representado por un producto proteico que es un anticuerpo monoclonal que consiste en dos cadenas peptídicas pesadas y dos ligeras unidas a través de enlaces disulfuro en una molécula funcionalmente activa que tiene actividad terapéutica (Ejemplo 5).

La composición obtenida por el procedimiento A o B se caracteriza por la capacidad de aumentar la expresión de las enzimas de la segunda fase de la desintoxicación xenobiótica (Ejemplo 13), lo que permite utilizarla solo como agente toxicomodificante, es decir, un agente que reduce el efecto tóxico de diversas moléculas químicas, incluido un complejo de efectos secundarios tóxicos dependientes de la dosis de los agentes farmacoterapéuticos administrados.

La composición obtenida por los procedimientos A o B puede utilizarse en combinación para la preparación de medicamentos junto con otras moléculas farmacológicamente activas conocidas y ampliamente utilizadas terapéuticamente: en particular, un anticoagulante, un inhibidor del factor Xa clorhidrato de amidina (Ejemplo 8); antibiótico moxifloxacina; agentes antivirales, material antigénico de la vacuna antirrábica e interferón a (Ejemplos 9, 10, 14); inhibidor de los canales de calcio nifedipino (Ejemplo 11), para el cual se establece una reducción de la dosis y, en consecuencia, una disminución de la toxicidad relacionada con la dosis.

Ejemplo 1. Procedimiento para la preparación de disulfuro de glutatión S-óxido (GS(O)SG).

A una solución de 100 g de sustancia L-glutatión reducido (GSH) en 100 ml de agua, se añadieron 150 ml de solución al 30% de ácido peracético en ácido acético con agitación a una temperatura de 0-5 °C durante 30-40 minutos. Después de la adición gota a gota, la masa de reacción se agitó a una temperatura no superior a 5°C durante 1 hora, después de lo cual se congeló y liofilizó durante 24 horas. Se obtuvieron 110 g de una sustancia en forma de espuma blanca, que contiene una mezcla de componentes según el análisis de HPLC (40% de GSO3H, 55% de GS(O)SG, 5% de GS(O2)SG).

El material liofilizado se disolvió en 400 ml de agua y se purificó utilizando HPLC preparativa (columna YMC-Actus Triart Prep C18-S 50x250 mm, agua como eluyente), se combinaron fracciones que contenían el compuesto de título con una pureza superior al 95%, se evaporaron a un volumen de 700 ml y se liofilizaron. Se obtuvieron 42 g del compuesto deseado disulfuro de glutatión S-óxido (como una mezcla de diastereoisómeros) con una pureza de 95+% (HPLC).

Ejemplo 2. Preparación de glutatión oxidado (disulfuro de glutatión).

A una suspensión de 2760 g de L-glutatión reducido en 7 L de agua se añadieron 2245 g de solución al 16% de hidróxido de sodio con agitación a una temperatura no superior a 17°C. Después de la disolución completa del glutatión, se enfrió una mezcla y se agregaron 2546 g de peróxido de hidrógeno al 6% a una velocidad de 30-50 ml/min con agitación a una temperatura de masa de reacción de no más de 15°C. Después de la adición de peróxido, la solución resultante se agitó a una temperatura predeterminada durante 1 hora adicional. Después de la finalización de la reacción (control con HPLC) se obtuvo una solución que contenía 2.95 kg de sal disódica de disulfuro de glutatión en 11.5 L de agua que se había enfriado a 3°C. La pureza química del producto, la sal disódica del disulfuro de glutatión, fue superior al 98.5% (control con HPLC), lo que no requería procedimientos adicionales para el aislamiento del producto.

Ejemplo 3. Preparación de la composición (fármaco) de disulfuro de glutatión con el contenido dado de disulfuro de glutatión S-óxido.

A la sal disódica de disulfuro de glutatión preparada en el Ejemplo 2 (2.95 kg en 11.5 L de agua), se añadieron 60 g de disulfuro de glutatión S-óxido obtenido según el Ejemplo 1 a una temperatura de 3-5 C, mezclando de manera completa durante 5 minutos, la solución se dejó durante 120 minutos a una temperatura de 5 °C, después de lo cual se liofilizó.

Ejemplo 4. Preparación de la composición (fármaco) de disulfuro de glutatión con el contenido dado de disulfuro de glutatión S-óxido.

Se agregaron 120 g de disulfuro de glutatión S-óxido preparado según el Ejemplo 1 a la sal disódica de disulfuro de glutatión (2.95 kg en 11.5 L de agua) preparada en el Ejemplo 2 con un mezclado completo durante 5 minutos, la solución se dejó durante 120 minutos a una temperatura de 5 °C, después de lo cual se liofilizó.

Ejemplo 5. Preparación de la composición de sal disódica de disulfuro de glutatión con el contenido dado de disulfuro de glutatión S-óxido.

A una suspensión de 2760 g de L-glutatión reducido en 7 L de agua, se añadieron 2245 g de solución al 16% de hidróxido de sodio con agitación a una temperatura no superior a 17°C. Después de la disolución completa del glutatión, la mezcla se enfrió y se agregaron 2546 g de peróxido de hidrógeno al 6% a una velocidad de 30-50 ml/min con agitación a una temperatura de masa de reacción de no más de 15°C. Después de la adición de peróxido, la solución resultante se agitó a una temperatura predeterminada durante 1 hora adicional. Después de la finalización de la reacción (control con HPLC), la masa de reacción se enfrió a 3°C. La pureza química del producto, la sal disódica de disulfuro de glutatión fue superior al 98.5% (control con HPLC).

Luego se agregaron 127 g adicionales de peróxido de hidrógeno al 6% a una velocidad de 30-50 ml/min a una temperatura no superior a 3°C. Se dejó reposar la masa de reacción durante 1 hora a 3°C y luego se liofilizó. La composición resultante contiene un 95 % de sal disódica de disulfuro de glutatión y un 4.5-5.0 % de sal disódica de disulfuro de glutatión S-óxido (control con HPLC), lo que no requiere procedimientos de purificación adicional del producto.

Ejemplo 6. Preparación de la composición de disulfuro de glutatión con el contenido dado de disulfuro de glutatión S-óxido y Pt-S.

A una suspensión de 2760 g de L-glutatión reducido en 7 L de agua, se añadieron 2245 g de solución al 16% de hidróxido de sodio a una temperatura no superior a 17°C. Después de la disolución completa del glutatión, la mezcla se enfrió, se agregaron 0.5 g de cis-platino y se agregaron 2546 g de peróxido de hidrógeno al 6% con agitación a una velocidad de 30-50 ml/min a una temperatura de la masa de reacción no superior a 15°C. Al final de la adición de peróxido, la solución resultante se agitó a una temperatura predeterminada durante 1 hora adicional. Después de la finalización de la reacción (control con HPLC) se obtuvo la solución que contenía 2.95 kg de sal disódica de disulfuro de glutatión en 11.5 L de agua que se había enfriado a 3°C. La pureza química del producto, la sal disódica de disulfuro de glutatión, fue superior al 98.5% (control con HPLC), lo que no requería procedimientos adicionales para el aislamiento del producto. La solución se enfrió a 3°C y se agregaron 60 g de disulfuro de glutatión S-óxido, se mezcló completamente durante 5 minutos, la solución se dejó durante 120 minutos a 5°C y luego se liofilizó.

Ejemplo 7. Análisis de la actividad de plegamiento de la composición obtenido en el Ejemplo 5.

Composición de la formulación de anticuerpos monoclonales:

anticuerpo monoclonal — 10 mg/ml;

glicina — 2 mg/ml;

polisorbato 80 — 0,05 mg/ml;

cloruro de sodio — 7 mg/ml;

ácido cítrico monohidrato — 2,101 mg/ml;

agua para inyección.

Para reproducir las condiciones fisiológicas, se obtuvo el suero sanguíneo humano con el consentimiento voluntario por escrito. El número sérico en el banco de almacenamiento de sueros es 0-17-1002.

En el experimento de plegamiento se utilizó lo siguiente:

Muestra 1 — composición de la formulación de anticuerpo monoclonal en una cantidad de 50 pl 1 ml de suero 0-17­ 1002.

Muestra 2 — composición de la formulación de anticuerpo monoclonal 0.2 mM de la composición obtenida en el Ejemplo 3 en una cantidad de 50 pl 1 ml de suero 0-17-1002.

Muestra 3 — composición de la formulación de anticuerpo monoclonal 0.2 mM de la composición obtenida en el Ejemplo 4 en la cantidad de 50 j l 1 ml de suero 0-17-1002.

Muestra 4 — composición de la formulación de anticuerpo monoclonal 0.2 mM de la composición obtenida en el Ejemplo 5 en la cantidad de 50 j l 1 ml de suero 0-17-1002.

Los viales con las muestras 1 y 2 se almacenaron a una temperatura de 37°C. Después de 24 horas, los viales se retiraron de los termostatos y se analizaron para determinar la estabilidad del anticuerpo monoclonal durante el almacenamiento a diferentes temperaturas en condiciones de simulación del entorno fisiológico del cuerpo humano. Los resultados del estudio de estabilidad se analizaron primero mediante separación electroforética en un gel de poliacrilamida (PAAG) en condiciones reductoras.

La electroforesis se realizó al 15 % de PAAG en condiciones de desnaturalización en un sistema regulador no homogéneo (paso a paso) (electroforesis de disco) usando el mecanismo de isotacoforesis (ITP) en la etapa de concentración de la muestra. Las muestras se prepararon mediante el siguiente procedimiento: las células se precipitaron por centrifugación y se volvieron a suspender en 200 jL de regulador (0.2 M de Tris-HCI pH 7.5; 0.2 M de NaCl; 0.01 M de acetato de sodio; 0.01 M de b-mercaptoetanol y 5% de glicerol) y luego se hirvieron durante dos minutos.

Para llevar a cabo la electroforesis, se utilizó un sistema de varias soluciones reguladoras: el regulador en el cátodo fue base Tris al 0.1 M; Tricina al 0.1 M; SDS al 0.1% (anión terminal — tricina); el regulador del ánodo fue base Tris al 0.2 M pH 8.9 (anión plomo — Cl-). Gel concentrador T = 2.5-3%, gel separador con T = 5-15% y C = 2-5% (donde T es el contenido relativo de monómeros en el gel, C es el contenido del agente reticulante en la suma de los monómeros). La electroforesis de los lisados celulares se llevó a cabo en condiciones de desnaturalización en SDS al 2%.

El electroforograma de preparaciones proteicas (Fig. 1) se analizó mediante el programa ImageJ. El programa está diseñado para el análisis densitométrico de datos de diversos experimentos. Las líneas se marcaron en el modo manual, luego las bandas correspondientes a las proteínas se marcaron dentro de cada uno de las líneas. El programa evalúa la densidad de cada una de las bandas, menos el fondo, lo que permite calcular la pureza de la proteína objetivo.

Condiciones de HPLC para el estudio de los intermedios estructurales del anticuerpo monoclonal que surgen del almacenamiento en condiciones fisiológicas simuladas.

Cromatógrafo Shimadzu LC-20 "Prominence"

Columna Fenomenex "Júpiter" C18, 5 jm , 300A, 250x4.6

Detección en la longitud de onda = 210 nm

Volumen de inyección = 25 j l

Caudal = 1.0 ml/min

Temperatura de la columna = 35°C

Temperatura de la celda del detector = 35°C

Fase móvil:

Eluyente A. 30% de acetonitrilo 0.1% de ácido trifluoroacético en agua

Eluyente B. 70 % de acetonitrilo 0.1% de ácido trifluoroacético en agua

Tiempo de ejecución = 47 min

Programa de gradiente:

0- 1 min 44% de acetonitrilo

1- 5 min 48% de acetonitrilo

5-20 min 50% de acetonitrilo

20-30 min 53.4% de acetonitrilo

30-35 min 60% de acetonitrilo

35-37 min 60% de acetonitrilo

37-40 min 44% de acetonitrilo

40-47 min 44% de acetonitrilo

Los datos obtenidos se muestran en la Fig. 2, lo que sugiere que la fracción del anticuerpo monoclonal con una estructura deteriorada que es incapaz de reconocer el antígeno estuvo ausente en muestras de suero sanguíneo que contenían las composiciones obtenidas según los Ejemplos 3, 4, 5 (Fig. 2 (2), Fig. 2 (3), Fig. 2 (4), respectivamente), en contraste con la muestra que no contiene dichas composiciones (Fig. 2 (1)).

Ejemplo 8. El uso combinado de la composición que comprende disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido en combinación con un anticoagulante, inhibidor del factor Xa clorhidrato de amidina.

Se estudió la composición obtenida según el ejemplo 3 de esta solicitud para determinar la capacidad de mejorar la eficacia terapéutica del agente farmacológicamente activo clorhidrato de amidina, que es un anticoagulante, inhibidor del factor Xa. La sustancia de ensayo clorhidrato de amidina (por ejemplo, obtenida según el Ejemplo 2 en la patente EA 015918 B1, publicada el 30.12.2011) o la mezcla de sustancia de clorhidrato de amidina con un adyuvante (adyuvante fue la composición obtenida en el Ejemplo 3 de esta solicitud) se administraron por vía intravenosa con una jeringa de insulina de 1 ml equipada con la aguja 30 G en la vena de la cola lateral en la región 1/3 más cercana a la base de la cola. El volumen de dosis individual para cada animal se calculó en base al peso corporal y se corrigió después de cada pesaje. La administración de sustancias fue única. Dichas mezclas se prepararon para la administración intravenosa a los animales de una mezcla de sustancia clorhidrato de amidina con un adyuvante. Para este propósito, la sustancia de clorhidrato de amidina y el adyuvante se disolvieron por separado en agua destilada, y luego se mezclaron las soluciones. La solución se preparó inmediatamente antes de la administración a los animales y se inyectó a más tardar 10 minutos después de la preparación. El volumen de la dosis para ratas fue de 0.31-0.42 ml.

La toma de muestras de sangre se realizó sin anestesia desde la vena lateral de la cola por encima del sitio de administración intravenosa (de 1/3 a 2/3 de la longitud de la cola), con un precalentamiento de la cola de la rata durante al menos 15 minutos en un baño de agua con una temperatura de 43°C. Un volumen de sangre de 0.36 ml se tomó con una aguja 23G en tubos de plástico (como Eppendorf) que contenían 0.04 ml de solución de 0.11 M de citrato de sodio a un volumen de 0.4 ml, de modo que la proporción de solución de citrato de sodio a sangre fue de 1:9. Dentro de los 30 minutos posteriores al muestreo, la sangre se centrifuga durante 10 minutos a 8000 rpm (7000 g), el plasma se transfirió a otro tubo y se volvió a centrifugar a 12000 rpm (15000 g) a 20°C durante 10 minutos para obtener un plasma deficiente en plaquetas. El plasma resultante en un volumen de 110 pl se vertió en tubos de plástico (como Eppendorf) y se congeló a - 20°C. El muestreo se realizó 6 veces en cada rata.

En los experimentos se utilizó la tromboplastina hidrosoluble y deshidratada por congelación con la adición de iones de calcio, certificada según el Índice Internacional de Sensibilidad (ISI), Renamplastina (NPO "RENAM").

El principio del procedimiento: cuando se agrega un exceso de tromboplastina tisular y iones de calcio al plasma de citrato, el tiempo para la formación de un coágulo de fibrina depende solo de la actividad de los factores de la vía de coagulación externa y general: factores I, II, V, VII, X. Se mide el tiempo desde el momento de la adición de tromboplastina con calcio al plasma hasta la formación de coágulos de fibrina.

Ensayo: se añaden 8 ml de agua destilada al vial con renamplastina liofilizada y se disuelven con agitación. Antes del ensayo, el reactivo se calienta a 37°C durante 30 minutos. Se añaden 50 pl de plasma de citrato a la cubeta del analizador, se incuban a 37°C durante exactamente 1-2 minutos. Luego, se agregan 100 pl de renamplastina y el tiempo de coagulación en segundos se registra en el analizador de coagulograma Merlin m C 1 de ABW Medizin und Technik GmbH.

Los resultados obtenidos se expresan como la Relación Internacional Normalizada (INR):

INR = PRISI,

donde ISI es el Índice Internacional de Sensibilidad de la Renamplastina, que debe indicarse en el pasaporte adjunto. PR — relación de protrombina:

PR = PTb/PT100%,

donde PTb es el tiempo de protrombina del plasma de la muestra de ensayo en segundos, PT100% es el tiempo medio de protrombina para las muestras obtenidas para un animal dado antes de la administración de la sustancia.

Los resultados de la medición de los parámetros del estudio se promediaron en los grupos experimentales y se representan como M ± m, donde M es el promedio del grupo, m es la desviación estándar. La significancia de la diferencia entre los grupos se determina utilizando la prueba t paramétrica de Student para p < 0.05 para la distribución normal de la muestra y la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para p < 0.05 para una distribución anormal.

Los resultados obtenidos se presentan en las Tablas 1 y 2, y en la Fig. 3. La Tabla 1 y la Fig. 3(1) muestran los datos obtenidos para la sustancia de clorhidrato de amidina sola, y la Tabla 2 y la Fig. 3(2) muestran los datos obtenidos para la mezcla de sustancia de clorhidrato de amidina y adyuvante.

Tabla 1

Tabla 2

Los resultados obtenidos demuestran la capacidad de las composiciones de la presente invención para mejorar la eficacia de otros agentes terapéuticamente activos.

Ejemplo 9: Estudio de la actividad antimicrobiana de la combinación que comprende moxifloxacina combinada con la composición de disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido.

Se estudiaron las formulaciones obtenidas según los Ejemplos 3, 4 y 5 de esta solicitud.

Se estudió la actividad antimicrobiana de las formulaciones contra Gram-negativos: Escherichia coli ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii aislada clínica y bacterias Gram-positivas: Listeria monocytogenes EGD (ATCC BAA-679), Staphylococcus aureus ATCC 25922, MRSA ATCC 33591, que es Staphylococcus aureus resistente a la meticilina.

Los microorganismos se cultivaron durante la noche (16-18 horas) en caldo Mueller-Hinton M391 al 2.1% (Oxoid, Alemania) a 37°C con agitación continua en un agitador. Después de esto, las alícuotas de la suspensión bacteriana se retiraron del cultivo nocturno y se transfirieron a 15 ml de caldo fresco estéril de Mueller-Hinton al 2.1%, y luego se incubaron a 37°C en un agitador durante 2.5-3 horas. Luego, se midió la densidad óptica (OD) de la suspensión resultante en el espectrofotómetro DU-50 (Beckman, EE.UU.) a la longitud de onda de 620 nm contra el caldo estéril de Mueller-Hinton al 2.1% y se determinó el número de unidades formadoras de colonias por ml (UFC) mediante la fórmula: 1 * OD620 = 2.5 * 108 ufc/ml [Protocols in antimicrobial peptides. W. Shafer Ed. Springer-Verlag Nueva York, LLC, 7/8/1997]. Basado en este cálculo, las suspensiones bacterianas se diluyeron con caldo estéril de Mueller-Hinton al 2.1% a una concentración de 1 * 105 ufc/ml.

Se utilizaron placas estériles con fondo en U de 96 pozos (Sarstedt, Alemania). Se prepararon diluciones en serie dobles de las formulaciones de ensayo en el medio de Müller-Hinton (8 diluciones para cada formulación en un volumen de 50 pl/muestra). Además, se agregaron 50 pl de la suspensión de bacterias a los pozos de las placas (la concentración final de bacterias en las muestras fue de 0.5 * 105 ufc/ml). Se prepararon cinco duplicados para cada dilución de la formulación.

Las placas con muestras se incubaron en un termostato a 37°C durante 18 horas.

Los resultados se registraron al día siguiente. La concentración más baja de la sustancia obtenida, a la que el crecimiento de microorganismos en los pozos correspondientes de la placa no fue observado visualmente (completamente inhibido) fue aceptado como concentración inhibitoria mínima (MIC). Los resultados finales se calcularon sobre la base de los datos de 5 experimentos independientes, cada uno de los cuales tenía 5 duplicados para cada dilución de cada una de las muestras analizadas.

La actividad antimicrobiana (AMA) de las formulaciones también se determinó por difusión radial en gel de agarosa que contenía microorganismos de prueba desarrollados por el profesor Lehrer, Universidad de Los Ángeles, EE. UU.

[Lehrer R.I. et al. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides/Journal of Immunological Methods, 1991, V.137, pp. 167-173]. Los microorganismos fueron precultivados durante 16 horas en el medio representando una solución al 3% de hidrolizado tríptico de soja a 37°C. Las alícuotas de medios con microbios se transfirieron por separado al medio recién preparado y se incubaron a 37°C durante 2.5 horas para obtener microorganismos en medio de la fase de crecimiento logarítmico. El número de células de cada uno de los microorganismos se evaluó midiendo la densidad óptica de las suspensiones en un espectrofotómetro a 620 nm. Las alícuotas de las suspensiones que contienen 4 * 106 células de microorganismos se mezclan con 10 ml de solución estéril de agarosa al 1% en regulador de fosfato de sodio de 10 mM, pH 7.4, que contiene 0.15 M de NaCl a una temperatura de 42°C. La mezcla resultante se vierte en placas de Petri de plástico estéril con un diámetro de 90 mm y se deja a temperatura ambiente hasta que se solidifique. Las muestras analizadas que representan diluciones sucesivas de las formulaciones en regulador de fosfato de sodio de 10 mM, pH 7.4, en un volumen de 5 pl, se agregaron a los pozos hechos por el aplicador (diámetro 3 mm) y se incubaron en un termostato de aire durante 3 horas a 37°C. Luego, la agarosa al 1% que contiene 6% de TGS se vierte en las placas y se incuba durante 18 horas a 37°C. El diámetro de la zona de inhibición del crecimiento (zona alrededor del pozo, libre de microorganismos) se mide tomando 1 unidad convencional de actividad antimicrobiana de 0.1 mm y restando del valor medido 30 unidades convencionales correspondientes al diámetro del propio pozo. Las concentraciones de formulaciones utilizadas fueron de 64 pg/ml, 32 pg/ml, 16 pg/ml, 8 pg/ml, 4 pg/ml, 2 pg/ml, 1 pg/ml.

Las concentraciones mínimas que inhiben el crecimiento de microorganismos (MIC) de las formulaciones se determinan mediante la construcción de regresiones lineales de la dependencia de la actividad antimicrobiana de la concentración de péptidos: y = a bx, donde y es la actividad antimicrobiana (c.u.), y x es la concentración de la formulación. Se tomó MIC como el valor de x en caso de y = 0, es decir, MIC = - a/b.

Tabla 3

Concentraciones inhibitorias mínimas de los péptidos, en pg/ml para Escherichia coli ATCC 25922# (procedimiento de dilución en serie en un medio de cultivo líquido)

# Cada uno de los valores presentados es la media ± error estándar de la media (n = 25)

oncentracones n toras m nmas e os p pt os, en g m para ap yococcus aureus

procedimiento de dilución en serie en un medio de cultivo líquido

# Cada uno de los valores presentados es la media ± error estándar de la media (n = 25)

* Diferencia significativa frente a moxifloxacina MIC (No. 13), prueba t de Student.

Los estudios realizados demuestran la alta actividad antimicrobiana de las composiciones de la presente invención contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas.

Ejemplo 10. Uso de la composición obtenida en el Ejemplo 3 que contiene disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido como adyuvante en la formulación de una vacuna.

Preparación de una combinación de vacuna antirrábica inactivada purificada, derivada de células, concentrada en seco y una composición según el ejemplo 3 de esta solicitud.

Se preparó una solución estéril de 0.5 mg/ml de hidróxido de aluminio en PBS. Se añadieron 12 g de la composición obtenida según el ejemplo 3 de esta solicitud a 60 ml de la solución resultante. La solución resultante se esterilizó pasando a través de un filtro con un diámetro de poro de 0.44 jm . A partir de la solución resultante se prepararon soluciones diluidas (AD) a una concentración de 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 1 mg/ml en PBS a una concentración de 0.5 mg/ml de hidróxido de aluminio.

Las soluciones obtenidas se utilizaron para la preparación de vacunas con una dilución de 1:200 (protección de ratones calculada de 50 %) y 1:1200 (protección de ratones calculada de 20%) en la solución con la concentración predeterminada de la sustancia según el Ejemplo 3 (presente solicitud) en PBS con 0.5 mg/ml de hidróxido de aluminio. Las soluciones resultantes se incubaron a 4°C durante 1 hora en un agitador (aproximadamente 150 rpm), sin permitir la formación de espuma.

Como muestra de referencia se utilizó la vacuna antirrábica inactivada purificada concentrada en seco, derivada de células, con una dilución de 1:200 y 1:1200.

Los ratones BALB/s que pesaban 13-15 g de un suministro se utilizaron como objeto del estudio.

La dilución de trabajo que contenía de 20 a 100 DL50 en 0.03 ml se calculó sobre la base de los resultados de la titulación de la cepa de prueba CVS del virus de la rabia (suspensión cerebral del 10 % de ratones infectados con el virus de la rabia).

La primera inmunización de ratones se realizó por vía intraperitoneal por 0.5 ml a partir del cálculo de 10 cabezas por cada dilución de la composición.

La segunda inmunización de ratones después de 7 días por vía intraperitoneal con 0.5 ml del cálculo de 10 cabezas por cada dilución de la composición.

Preparación de la dilución de trabajo (permisiva) del virus y tres diluciones consecutivas de diez veces en agua para inyección con la adición de un 2 % de suero de caballo, inactivado a 56°C durante 30 minutos, para determinar la dosis real del virus tomada en el experimento.

La dosis permisiva de 0.03 ml y sus diluciones decimales se administraron intracerebralmente a un grupo control de ratones simultáneamente con ratones inmunizados utilizando 6 ratones por dilución.

El período de seguimiento de los animales fue de 14 días. La evaluación de los resultados del experimento tiene en cuenta los ratones que se enfermaron o murieron de 5 a 14 días.

El procesamiento matemático de los resultados mediante el procedimiento de Reed-Muench.

Los resultados obtenidos se recopilan en la Tabla 5.

Resultados de la influencia del adyuvante en la eficacia de la formulación de la vacuna

Los datos presentados indican una alta tasa de supervivencia de los animales cuando se administra la vacuna que contiene la combinación de disulfuro de glutatión y disulfuro de glutatión S-óxido. Estos valores son comparables y, en la mayoría de los casos, incluso superiores a los de la muestra de referencia (para la vacuna antirrábica derivada de células).

Ejemplo 11. Efecto de la composición que comprende el disulfuro de glutatión y el disulfuro de glutatión S-óxido obtenido según el Ejemplo 3 en la actividad de los inhibidores de los canales de calcio.

El objetivo del estudio es probar el efecto de la composición obtenida en el ejemplo 3 de esta solicitud en la actividad de los canales iónicos de la membrana celular y la actividad de los inhibidores de los canales de calcio.

Se utilizaron los siguientes compuestos como compuestos de prueba: inhibidor selectivo de los canales de calcio nifedipino, disulfuro de glutatión (preparado en el ejemplo 2 de esta solicitud) y la composición según el ejemplo 3 de esta solicitud (que comprende disulfuro de glutatión junto con disulfuro de glutatión S-óxido).

Preparación de formulaciones para el estudio:

Los compuestos y composiciones de prueba se almacenaron a 4°C; las sustancias se disolvieron en agua desionizada (super Q) inmediatamente antes del inicio del experimento. La solución preparada se almacenó a 4°C durante no más de 5 horas. Los compuestos se añadieron al medio de cultivo celular hasta la concentración final a estudiar.

La formulación se agregó a las células una vez durante el período de tiempo indicado.

Línea celular utilizada, condiciones de cultivo:

Los experimentos se realizaron en macrófagos de rata peritoneal residentes cultivados. Los macrófagos residentes se aislaron de la cavidad peritoneal de ratas que pesaban 200-300 g mediante el procedimiento descrito anteriormente en [ Conrad R.E. Induction and collection of peritoneal exudate macrophages. Manual of macrophages methodology /Nueva York: Marcell Dekker. - pp.5-11; Randriamampita C. et al. Ionic channels in murine macrophages/Cell Biology, 1987, V.105, pp.761-769]. Inmediatamente después del aislamiento, las células tenían una forma esférica y un diámetro de 10-20 pm. La suspensión celular se colocó en placas de cultivo que contenían vidrios de cuarzo de 10 * 10 mm. Las células en vidrios se cultivaron en el medio 199 (pH 7.2) con la adición de suero bovino al 20%, solución de glutamina (3%), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml) durante 1-3 días a 37°C. La tinción de esterasa de acetato de a-naftilo [Monahan R.A. et al. Ultrastructural localization of nonspecific esterase activity in guinea pig and human monocytes, macrophages and lymphocytes/Blood, 1981, V.58, pp. 1089-1099] determinó que al menos el 96% de las células en las monocapas eran macrófagos. Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente de 20-22°C en 2-3 días de cultivo celular.

Se colocaron vidrios de cuarzo con células en la cámara experimental llena de la solución fisiológica de la siguiente composición iónica (mM): NaCl — 140, KCl — 5, CaCh — 1, MgCh — 1, HEPES-NaOH — 5; pH 7.3-7.4 (Alonso-Torre, Trautmann, 1993). El medio libre de calcio contenía 0 mM de CaCh y 1 mM EGTA.

En los experimentos se utilizaron reactivos de Sigma. Se prepararon soluciones madre de tapsigargina (500 pM), nifedipino (20 mM) en dimetilsulfóxido. Las soluciones madre de disulfuro de glutatión y la composición según el Ejemplo 3 (0.45 pmol/ml), ATP (100 mM) se prepararon en agua.

Desarrollo del experimento:

Para medir la concentración intracelular de calcio ([Ca2+]i) se utilizó una sonda fluorescente Fura-2AM. Los macrófagos se incubaron durante 45 minutos en solución salina que contenía 2 pM Fura-2AM a temperatura ambiente (para prevenir la endocitosis de las micelas Fura-2AM que ocurre a 37°C) [Alonso-Torre S.R. et al. Calcium responses elicited by nucleotides in macrophages. Interaction between two receptor subtypes/The Journal of Biological Chemistry, 1993, V.268, pp.18640-18647].

Los vidrios con las células coloreadas se lavaron con solución salina y se transfirieron a la cámara experimental ubicada en la mesa del microscopio luminiscente ".TlKiMaM-KO". La fluorescencia de Fura-2 se excitó a 337 nm con un láser de nitrógeno nn/l-503. El láser se colocó junto al microscopio en el ángulo de 30 ° hacia la cámara experimental, lo que permite dirigir el rayo láser directamente al objeto. La intensidad de la fluorescencia se registró utilizando el espectrofotoencabezal COH-10 a 510 nm. La señal de 0 ^ y -79 se amplificó con el amplificador especialmente diseñado y se registró en el ordenador IBM PC utilizando el software original. En los experimentos se utilizó una lente 10X0.40. En un aumento dado, 40-50 células entran en el área de la región fotométrica. Para evitar el quemado de la foto, las mediciones se toman cada 20 segundos con la irradiación del objeto de 2.5 segundos. Cuando se agregan ATP y UTP, las células se irradian continuamente hasta que se alcanza un máximo de fluorescencia. Los valores de [Ca2+]i se calculan a partir de la ecuación de Grynkiewicz [Grynkiewicz G. et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties/The Journal of Biological Chemistry, 1985, V.260, pp.3440-3450]:

[Ca2+]¡ = Kc x (F - Fmin)/(Fmax - F),

donde F es la intensidad observada de la fluorescencia; Fmax es la fluorescencia del colorante saturado con Ca2+; Fmin es la fluorescencia del colorante libre de Ca2+ (en un medio libre de calcio).

La constante de disociación, Kd del complejo Fura-2AM:Ca2+ es de 135 nM a 20°C y pH 7.1-7.2, la Fmax se midió después de la adición de 10 pM de ionomicina o 25 pM de digitonina a las células en un medio que contenía Ca2+. El tratamiento de las células con digitonina permite que los iones Ca2+ penetren libremente a través de la membrana plasmática, sin afectar la permeabilidad de las membranas mitocondriales y el retículo endoplásmico. Después de estabilizar la señal, se agrega 5 mM de EGTA y se determina la fluorescencia del colorante en el medio nominalmente libre de calcio (Fmin). El nivel de fluorescencia intrínseca se restó después de la adición de la solución de MnCh (100 pM) a los macrófagos. Mn2+ desplaza Ca2+ del complejo con Fura-2, y la fluorescencia del complejo de colorante con Mn2+ es 100 veces menor que la fluorescencia del complejo Fura-2 con Ca2+. Para Fura-2, Fmin = Fmax/3.

En los estudios se utilizaron dos enfoques experimentales. En el primero, se investigó el efecto de los agentes farmacológicos sobre la respuesta de Ca2+ causada por ATP, UTP, tapsigargina o ácido ciclopiasónico (CPC) en macrófagos en solución salina normal. Los agentes se administraron antes de la acción de los agonistas, o después, durante la fase de meseta de la señal de Ca2+ que refleja la entrada de Ca2+ desde el medio externo. En la segunda variante de experimentos, se utilizó el siguiente esquema de experimento (Ca2+-libre/Ca2+- protocolo de reintroducción) para detectar y mejorar la entrada de Ca2+ en las células. Los macrófagos se incubaron en un medio nominalmente libre de calcio, luego se expusieron a uno de los agonistas, causando la movilización de Ca2+ desde el depósito intracelular. Después de la adición de 2 mM de Ca2+ al medio externo y la restauración del gradiente fisiológico de la concentración de Ca2+, se observó un rápido aumento de [Ca2+]i, reflejando la entrada de Ca2+ en la célula. Además, se investigó el efecto de los agentes farmacológicos añadidos antes de la administración de agonistas previamente a la administración de Ca2+ o durante el desarrollo de la entrada de Ca2+ desde el entorno externo.

Los resultados del efecto de los compuestos de prueba sobre la concentración intracelular de C2+ y señales de Ca2+ inducidas por ATP y tapsigargina en macrófagos de rata:

La adición de 200 pM de ATP al medio de incubación de macrófagos peritoneales de rata provoca una señal de Ca2+ de dos fases que consiste en un pico inicial a corto plazo asociado principalmente con la movilización de Ca2+ desde el depósito causada por la activación del receptor P2u y una pronunciada fase de "meseta" prolongada. Esta fase de meseta es causada por la entrada de Ca2+ desde el medio externo y presumiblemente refleja la activación simultánea de los receptores P2u y P2z. La Fig. 4 (1) muestra la señal característica de Ca2+ inducida por ATP extracelular (200 pM) en la población de 40-50 macrófagos en solución salina normal.

En respuesta a la adición de ATP extracelular [Ca2+]i aumenta desde el nivel basal de 75 ± 18 nM a un pico de 820 ± 105 nM. Luego sigue la fase lentamente decreciente de la meseta, durante la cual el promedio de [Ca2+]i es de 460 ± 115 nM 4 minutos después de la adición de ATP.

Un inhibidor específico de Ca2+-ATPasas endoplásmica tapsigargina (0.5 pM) también provoca una señal de Ca2+ bifásica: pico asociado a la movilización de Ca2+ desde el depósito, que es bastante rápido, y una fase larga que refleja la entrada de Ca2+, dependiente del depósito, desde el entorno externo. La Fig. 4(2) presenta la típica señal de Ca2+ inducida por la tapsigargina en macrófagos en solución salina normal.

Se realizaron experimentos con medio libre de calcio para identificar y mejorar la fase de entrada de Ca2+ en la célula. Después de la estimulación de macrófagos con 200 pM de ATP (Fig. 4 (3)) o 0.5 pM de tapsigargina (Fig. 4 (4)) en el medio nominalmente libre de calcio (0 mM de CaCh y 1 mM de EGTA), la entrada de Ca2+ fue inducida mediante la adición de 2 mM Ca2+ en el ambiente externo.

La Fig. 5 muestra el efecto del disulfuro de glutatión sobre [Ca2+]i en reposo y las señales de Ca2+ inducidas por 200 pM de ATP (1), (2) y 0.5 pM de tapsigargina (3) en macrófagos en solución salina normal (1) o en medio nominalmente libre de calcio (2), (3).

Los datos obtenidos indican la capacidad del disulfuro de glutatión para aumentar [Ca2+]i hasta 180 ± 19 nM debido a la movilización de calcio desde el depósito intracelular. El agotamiento del depósito de calcio intracelular reduce el efecto del ATP. La tapsigargina revierte completamente el efecto de la capacidad del disulfuro de glutatión para movilizar el calcio desde el depósito.

La Fig. 6 muestra el efecto de la composición (formulación) según el Ejemplo 3 de esta solicitud sobre la concentración intracelular de calcio [Ca2+]i en reposo y las señales de Ca2+ inducidas por ATP. La formulación niega el efecto inhibitorio del inhibidor selectivo del canal de calcio nifedipino (1), en donde el efecto de la formulación misma se suprime mediante el agente reductor ditiotreitol (2).

Los datos obtenidos indican la capacidad del disulfuro de glutatión junto con el disulfuro de glutatión S-óxido para aumentar [Ca2+]i hasta 240 ± 28 nM debido a la movilización de calcio desde el depósito intracelular. El agotamiento del depósito de calcio intracelular reduce el efecto del ATP. El disulfuro de glutatión junto con el disulfuro de glutatión S-óxido estabiliza el proceso de suministro de calcio a la célula desde el medio, lo que se exhibe como supresión del efecto del inhibidor del canal de calcio nifedipino sobre este proceso. El ditiotreitol canceló el efecto estabilizador del disulfuro de glutatión junto con el disulfuro de glutatión S-óxido sobre el rendimiento de los canales de calcio.

Por lo tanto, el disulfuro de glutatión S-óxido es capaz de mejorar el efecto de ciertos compuestos en las células, en el experimento realizado fue el disulfuro de glutatión con respecto al cual el disulfuro de glutatión S-óxido actuó como sinergista. El disulfuro de glutatión S-óxido en conjunto con el disulfuro de glutatión puede reducir o inhibir el efecto de otros compuestos (en el experimento realizado fue nifedipino), hacia el hecho que la composición actúa como un antagonista y un remedio que neutraliza la toxicidad de nifedipino.

Los resultados de los ejemplos presentados muestran que el disulfuro de glutatión junto con el disulfuro de glutatión S-óxido exhibe una alta actividad biológica, que se exhibe como un aumento en la actividad de movilización de calcio en un 30-50%. Teniendo en cuenta la capacidad del disulfuro de glutatión para modular la actividad de los receptores de células superficiales y los canales iónicos, esto apunta a la capacidad de influir en los receptores extracelulares e intracelulares, las proteínas transportadoras de la membrana citoplasmática e intracelular, las moléculas reguladoras y de transporte extracelulares de naturaleza peptídica, las proteínas del citoesqueleto, las reacciones autoinmunes; unión y reconocimiento de antígenos, procesos de exocitosis y endocitosis, quimiotaxis, quimiocinesis, citocinesis; interacciones intercelulares, celulares matriciales y celulares humorales; se puede suponer que el disulfuro S-óxido actuará como sinergista en estos efectos del disulfuro de glutatión, que se puede utilizar en el desarrollo de nuevos fármacos, la posibilidad de usar a dosis más bajas sin pérdida de eficacia terapéutica y una variedad reductora de efectos tóxicos y secundarios dependientes de la dosis.

Ejemplo 12. Efecto de la composición obtenido en el Ejemplo 5 por la velocidad de formación del enlace disulfuro.

Una muestra de 1 g obtenida según el ejemplo 5 (contenido de disulfuro de glutatión S-óxido de 5%) se disolvió en agua (9 ml). A la solución resultante, se añadió 1 ml de la solución de sal sódica de L-glutatión reducido (2.5 mg/ml) con agitación. La masa de reacción se agitó durante 5 minutos y se analizó mediante HPLC. El disulfuro de glutatión S-óxido no se detectó en la solución resultante.

Ejemplo 13. Efecto de la composición que comprende el disulfuro de glutatión S-óxido con disulfuro de glutatión y metal, compuesto de platino Pt-S cisplatino, obtenido según el Ejemplo 6 sobre la expresión de las enzimas de la segunda fase de desintoxicación xenobiótica.

Como compuestos de prueba se utilizan:

1 — disulfuro de glutatión S-óxido (compuesto obtenido en el Ejemplo 1);

2 — disulfuro de glutatión (compuesto obtenido en el ejemplo 2);

3 — composición del disulfuro de glutatión S-óxido con disulfuro de glutatión (composición obtenida en el ejemplo 5);

4 — composición del disulfuro de glutatión S-óxido con disulfuro de glutatión y metal, compuesto de platino Pt-S cisplatino (composición obtenida en el Ejemplo 6).

El estudio se llevó a cabo en ratas macho blancas criadas al azar con un peso de 140-160 g, procedentes de la hepatotoxicidad RAMS "Rappolovo" del criadero en el que fue causada por la administración diaria de ciclofosfano (CP) a una dosis de 20 mg/kg s.c. en solución salina durante 10 días.

Se formaron 6 grupos de animales de experimentación.

No. 1 — animales intactos que reciben inyecciones de disolvente de los compuestos estudiados (solución salina) (control de disolvente);

No. 2 — animales que reciben CP y luego solución salina como agente terapéutico (control); Grupos experimentales:

No. 3 — animales que reciben el compuesto de ensayo 1 en solución salina por vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg 30 minutos después de la administración del agente tóxico CP durante 10 días;

No. 4 — animales que reciben el compuesto de ensayo 2 en solución salina por vía intraperitoneal a una dosis de 0.1 mg/kg 30 minutos después de la administración del agente tóxico CP durante 10 días;

No. 5 — animales que reciben la composición de ensayo 3 en solución salina por vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg 30 minutos después de la administración del agente tóxico CP durante 10 días;

No. 6 — animales que reciben la composición de prueba 4 en solución salina por vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg a los 30 minutos después de la administración del agente tóxico CP durante 10 días.

Las enzimas de la segunda fase de la desintoxicación xenobiótica en la fracción citosólica de las células hepáticas: glutatión-S-transferasa (XE 2.5.1.18), glutatión peroxidasa (XE 1.11.1.9), glutatión reductasa (XE 1.6.4.2) glucosasfosfato deshidrogenasa (XE 1.1.1.49).

Resultados del estudio

Los resultados del estudio de un complejo de reacciones moleculares que proporcionan tolerancia a la acción de sustancias tóxicas indican la capacidad del disulfuro de glutatión S-óxido (1), disulfuro de glutatión (2), composiciones de los mismos (3 y 4) para inducir la actividad de enzimas de la segunda fase de desintoxicación xenobiótica glutatión reductasa (XE 1.6.4.2), glutatión peroxidasa (XE 1.11.1.9), glutatión-S-transferasa (XE 2.5.1.18) e intercambio de glutatión reducido asociado a ellas (Tabla 6).

Tabla 6

La adición de compuestos metálicos, especialmente compuestos de platino Pt-S, a la composición mejoró la capacidad de la composición del disulfuro de glutatión y el disulfuro de glutatión S-óxido para inducir la actividad de la enzima de la segunda fase de la desintoxicación xenobiótica, aumentó la intensidad del intercambio de metabolitos clave de glutatión reducido asociado con ellos.

Así, los compuestos metálicos, en particular los compuestos de platino Pt que tienen la capacidad de inducir la actividad de las enzimas de la segunda fase de la desintoxicación xenobiótica, aumentan su efecto toxicomodificante y, en consecuencia, citoprotector debido a la inducción de las enzimas de la segunda fase de desintoxicación xenobiótica por la composición del disulfuro de glutatión S-óxido y el disulfuro de glutatión.

Ejemplo 14. Efectos del disulfuro de glutatión S-óxido y sus composiciones sobre la eficacia antiviral del interferón a. El estudio del efecto del disulfuro de glutatión S-óxido y sus composiciones (Ejemplos 1, 2, 5, 6) sobre la actividad antiviral del interferón se lleva a cabo en el cultivo de células infectadas.

El procedimiento para evaluar la actividad antiviral del interferón se basa en la determinación de su cantidad mínima que protege a las células de la

n-68

línea de acción citopática del virus. Las composiciones se añaden al medio de incubación celular a una concentración de 0.0015 pmol/ml, 0.015 pmol/ml y 0.15 pmol/ml antes de añadir interferón, junto con interferón, y 10 min, 30 min y 60 min después de añadir interferón. El título de interferón en los experimentos fue de 4 * 10'4 U/ml, 8 * 10'4 U/ml, 1.6 x 10-5 U/ml, 3,2 * 10-5 U/ml, 6,4 * 10-5 U/ml, 1.28 * 10-6 U/ml, 2.56 * 10-6 U/ml, 5.12 * 10-6 U/ml. La actividad antiviral de las formulaciones fue evaluada por la capacidad de las células vivas para absorber el cristal violeta. La cantidad de cristal violeta absorbido se determinó fotométricamente a 595 nm, después de la separación de la fracción de células vivas y la extracción del tinte con metanol. La cantidad de colorante absorbido fue proporcional al número de células vivas y se expresó en términos de densidad óptica.

Preparar la

n-68

línea celular para el experimento.

La

n-68

línea celular es una cepa de células diploides del pulmón embrionario humano obtenida del Instituto de Investigación de Preparaciones Virales de Moscú (MRIVP) de la Academia Rusa de Ciencias Médicas (RAMS) de células pulmonares del embrión humano a la edad de 11 semanas abortado de una mujer a la edad de 28 años que no tenía enfermedades oncológicas, venéreas, hepatitis, tuberculosis, anomalías genéticas y congénitas.

Banco de semillas de la cepa de células diploides n-68 está certificado para la preparación de preparaciones inmunobiológicas en MRIVP RAMS junto con el Instituto Estatal de Investigación Científica para la Estandarización y el Control de Preparaciones Biológicas Médicas que lleva el nombre de L.A Tarasevich (SISC).

Las células de la línea n-68 se cultivaron a 37°C en medio de crecimiento completo I. El cultivo se lleva a cabo en viales de plástico de 250 ml (tipo "Costar"). Las células cubrieron la parte inferior del vial, formando una monocapa con la morfología típica de los fibroblastos diploides. Las células planas se suspendieron utilizando un medio especial que consistía en partes iguales de solución de Versene al 0.02% y solución de tripsina al 0.25%. Para hacer esto, se drenó un medio de crecimiento completo del vial con una monocapa formada de células, la monocapa se lavó dos veces con el medio especial (solución de Versene con tripsina) y se incubó a 37°C durante 5 minutos. Durante este tiempo, la monocapa de fibroblastos se separó del plástico. Las células separadas se diluyeron con un medio de crecimiento completo, rompiendo conglomerados celulares mediante pipeteo múltiple. Las células se transfirieron a un tubo de centrífuga estéril y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se drenó y las células se transfirieron al medio de crecimiento completo. Luego, las células se contaron en la cámara de Gorjaev y se utilizaron en los experimentos.

Los cultivos celulares que hayan pasado al menos 20 y no más de 30 pasajes se pueden utilizar para determinar la actividad y la toxicidad.

Preparación del virus de la estomatitis vesicular.

Para el experimento se utilizó el virus de la estomatitis vesicular (VSV) liofilizado, envasado en ampollas de vidrio selladas en condiciones estériles.

El virus se cultivó en la línea celular L-929. Para hacer esto, se agregó una dosis pretitulada del virus al vial con una monocapa formada de células en el medio de cultivo completo (el título infeccioso de VSV fue la dilución máxima del virus, lo que causó la destrucción completa de la monocapa de células durante 1 día a 37°C). El contenido del vial se culturó durante 1 día a 37°C, después de lo cual el medio de cultivo se drenó en tubos estériles de 50 ml y se centrifugaron a 2000 rpm. Además, las alícuotas de 1 ml del sobrenadante obtenido, que contenía el virus de la estomatitis vesicular, se dispensaron en ampollas en condiciones estériles y se liofilizaron.

Determinación del título infeccioso del virus.

Las células preparadas de línea suspendidas en medio de cultivo completo 1 a una concentración de 5 * 104 células/pozo en un volumen de 0.2 ml se agregaron a la placa de 96 pozos (tipo "Costar"). Después de esto, la placa se incubó durante 1 día a 37°C en una incubadora de CO2 con atmósfera que contenía 5% de CO2. Durante este tiempo, las células cubrieron los pozos, formando una monocapa continua. Después de 1 día, el medio de cultivo se decantó en condiciones estériles y se agregaron diluciones dobles del virus previamente preparadas a los pozos de la placa en cuatro duplicados. El virus VSV se agregó en un medio de cultivo completo en un volumen de 0.2 ml. La placa se incubó en las condiciones descritas anteriormente. Al final de la incubación (después de 1 día), se decantó el medio de cultivo y a los pozos se agregaron 0.05 ml de solución al 0.2% de violeta cristalina en metanol al 20%. Después de 10 minutos, se retiró el tinte, la placa se lavó bajo un chorro de agua y se secó. Además, se agregó 0.1 ml del regulador de lisis a la placa para eluir el tinte en la solución. La intensidad de la tinción se registró en el lector de microplacas a 595 nm.

La dilución máxima del virus, que causa la destrucción completa de la monocapa de células en los pozos en 1 día en estas condiciones, se toma como el título infeccioso del virus. La densidad óptica de la solución en estos pozos será mínima y cercana al valor de fondo.

Determinación de la actividad.

En un medio de crecimiento completo, se prepararon diluciones dobles (por encima y por debajo del título esperado) de la muestra de actividad estándar (42-28-119-96P; SISC según L.A. Tarasevich), cuya actividad se expresó en unidades internacionales IU. La dilución del estándar se llevó a cabo en una placa de 96 pozos (tipo "Costar") en un volumen de 0.1 ml, con al menos 4 pozos utilizados para cada dilución. Se dejó una fila de la placa para controlar el medio de cultivo (4 pozos) y para controlar la dosis del virus VSV (4 pozos). Se agregó 0.1 ml a estos pozos. Después de la dilución del estándar, a la placa se agregaron las células preparadas de línea suspendidas en medio de cultivo completo I a una concentración de 5-104 células/pozo en un volumen de 0.1 ml. Después de esto, las fracciones estudiadas se agregaron a la parte de las filas con estándar diluido en ciertos intervalos de tiempo:

1 — disulfuro de glutatión S-óxido (compuesto obtenido en el Ejemplo 1);

2 — disulfuro de glutatión (compuesto obtenido en el ejemplo 2);

3 — composición del disulfuro de glutatión S-óxido con disulfuro de glutatión (composición obtenida en el ejemplo 5); 4 — composición del disulfuro de glutatión S-óxido con disulfuro de glutatión y metal, compuesto de platino Pt-S cisplatino (composición obtenida en el ejemplo 6)

a concentraciones de 0.0015 pmol/ml, 0.015 pmol/ml y 0.15 pmol/ml. A continuación, cada placa se incubó durante 1 día a 37°C en una incubadora de CO2 con atmósfera que contenía 5% de CO2. Durante este tiempo, las células cubren los pozos, formando una monocapa continua. Después de 1 día, el medio de cultivo de crecimiento completo se decantó en condiciones estériles y el virus VSV con título infeccioso predeterminado se agregó a los pozos de cada placa. El virus VSV se agregó en un medio de cultivo completo en un volumen de 0.2 ml. Se agregaron 0.2 ml del mismo medio sin el virus VSV a los pozos como medio de control. Después de esto, cada placa se incubó en las condiciones descritas anteriormente. Al final de la incubación (después de 1 día), se decantó el medio de cultivo y a los pozos se agregaron 0.05 ml de una solución al 0.2% de violeta cristalina en metanol al 20%. Después de 10 minutos, se retiró el tinte, la placa se lavó bajo un chorro de agua y se secó. En los pozos de control del medio, la monocapa de color debe estar libre de signos de destrucción. Además, a la solución se agregó 0.1 ml del regulador de lisis a la placa para eluir el tinte. La intensidad de la tinción se registró en el lector de microplacas a 595 nm. El valor inverso de la dilución de la preparación, que protege completamente el cultivo celular del efecto citopático del virus en el 50 % de los pozos, se toma como título de interferón.

Resultados del experimento.

Se estableció experimentalmente que la preincubación de células con cada compuesto de prueba no tuvo ningún efecto sobre la actividad antiviral del interferón.

Los resultados de los experimentos en los que se agregó cada composición después del interferón apuntan a la capacidad de prácticamente todas las sustancias de prueba para aumentar la eficacia del interferón si la composición se agregó no antes de treinta minutos después de la exposición de las células al interferón.

Las sustancias de ensayo aumentaron la eficacia en diversos grados con los títulos de interferón de 6.4 * 10'5 a 1.28 x 10'6, lo que se exhibió como un mayor aumento de la densidad óptica en el experimento, donde el interferón actuó junto con una u otra sustancia frente al experimento en el que solo actuó el interferón.

Para determinar un valor más fiable del aumento de la eficacia del interferón con una u otra composición, se realizó un experimento para obtener un mayor número de datos experimentales sobre la dilución del interferón, donde se observó su actividad (Tabla 7).

Valores cuantitativos de eficacia de interferón creciente (expresados como unidades de densidad óptica)

* P < 0.1

** P < 0.05

Los resultados obtenidos indican que todas las composiciones de prueba aumentan la actividad antiviral del interferón a en un cierto intervalo de sus concentraciones si se agregan después de este. Una naturaleza similar del efecto de la composición se debe a la ausencia o cantidad relativamente insuficiente de agente oxidante en el medio de cultivo cuando se administra previamente o se coadministra con interferón. La composición compleja del medio de cultivo conduce a la desaparición relativamente rápida de las pequeñas cantidades del principio activo del medio de cultivo hacia el espacio intracelular. La acción del interferón sobre las células tropicales se acompaña de la producción de agentes oxidantes; sin embargo, el tiempo de su producción en cantidad suficiente excede el tiempo que el compuesto de coordinación del metal pasa en el medio de cultivo. La adición preliminar de interferón y su efecto sobre las células tropicales promueve la producción de agente oxidante por estas células, que posteriormente se utiliza en la acción catalítica sobre los grupos sulfhidrilo de diversos receptores, incluidos los receptores de interferón, lo que eventualmente contribuye, entre otros, a aumentar el número de células que interactúan con el interferón, y esto a su vez determina la mejora de su efecto antiviral.

Por lo tanto, todas las sustancias de ensayo son capaces de aumentar la eficacia de la acción del interferón a, pero el compuesto de coordinación de metales en la formulación de la composición potencia significativamente su actividad, aumentando el número de células capaces de interactuar con interferón a. En tal caso cabe destacar que prácticamente coincide la potenciación del efecto antiviral del interferón a con las sustancias obtenidas según los Ejemplos 1 y 2 y es del 9-10% a diferentes diluciones. La acción combinada de las sustancias según el Ejemplo 1 y 2 en la forma de la composición según el Ejemplo 5 permite obtener una mejora adicional del efecto antiviral del interferón a a diluciones más bajas (hasta el 18%) y una amplificación casi doble a grandes diluciones de interferón a, es decir, a dosis más bajas de interferón a. Se encontró un patrón similar al usar la composición según el Ejemplo 6: el efecto antiviral del interferón a fue más pronunciado, en particular aumentó en un 50% en diluciones bajas y 2.5 veces en las más profundas. El efecto antiviral del interferón a en dosis terapéuticas se asocia con el desarrollo de efectos secundarios dependientes de la dosis y efectos tóxicos en el 72% de los pacientes que reciben formulaciones de interferón a. El síndrome similar a la gripe, los síntomas de trastornos gastrointestinales y psicógenos, los signos de mielosupresión, los trastornos de las funciones de la tiroides y las glándulas paratiroides, la formación de un grupo de autoanticuerpos contra el interferón a endógeno del paciente se informan con mayor frecuencia entre las manifestaciones negativas de la terapia administrada. La posibilidad de usar interferón a a dosis terapéuticas más bajas junto con la composición según el Ejemplo 5 o 6 permite reducir significativamente la variedad de efectos secundarios y las reacciones tóxicas dependientes de la dosis de interferón a.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende disulfuro de glutatión o sal orgánica o inorgánica farmacéuticamente aceptable del mismo y disulfuro de glutatión S-óxido de la siguiente estructura:

o sal orgánica o inorgánica farmacéuticamente aceptable de la misma, para su uso como medicamento.

2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que la cantidad de disulfuro de glutatión S-óxido es del 0.01-10% en peso de la composición total.

3. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende además un d-metal (Me), representado como un compuesto o unos compuestos de coordinación que contiene(n) un enlace Me-S-glutatión.

4. La composición para el uso de la reivindicación 3, en la que el d-metal se selecciona del grupo del platino.

5. La composición para el uso de la reivindicación 3, en la que el d-metal es platino.

6. La composición para el uso de la reivindicación 3, en la que la cantidad de d-metal en la composición varía de 1 * 10'10 moles a 1 * 10‘3 moles por 1 kg de la composición.

7. La composición para el uso de la reivindicación 3, en la que la cantidad de d-metal en la composición es de 1 * 10' 5 moles por 1 kg de la composición.

8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso para eliminar la toxicidad dependiente de la dosis y mejorar la actividad terapéutica de un compuesto farmacológicamente activo en el tratamiento de enfermedades infecciosas y no infecciosas.

9. Una combinación farmacológica que comprende la composición de las reivindicaciones 1-8 y un compuesto farmacológicamente activo seleccionado del grupo de anticoagulante, inhibidor del factor Xa, agente antimicrobiano o antiviral, inhibidor del canal de calcio, para su uso como medicamento.

10. La combinación de la reivindicación 9, para su uso para eliminar la toxicidad dependiente de la dosis y mejorar la actividad terapéutica del compuesto farmacológicamente activo en el tratamiento de enfermedades infecciosas y no infecciosas.

11. La combinación de la reivindicación 10, para su uso para la terapia de las trombosis, en la que el compuesto farmacológicamente activo es anticoagulante, inhibidor del factor Xa clorhidrato de amidina.

12. La combinación de la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, que incluyen: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y: Listeria monocytogenes EGD, Staphylococcus aureus, MRSA — Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, y en la que el compuesto farmacológicamente activo es el agente antimicrobiano moxifloxacina.

13. La combinación de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de enfermedades virales, en la que el compuesto farmacológicamente activo es un agente antiviral de un amplio espectro de acción antiviral: interferón alfa.

14. La combinación de la reivindicación 10 para su uso en la prevención de la rabia, en la que el compuesto farmacológicamente activo es material antigénico de la vacuna antirrábica.

15. Un medicamento que comprende al menos una composición o combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en una cantidad terapéuticamente eficaz junto con excipientes farmacéuticamente aceptables, para su uso como un medicamento.

16. El medicamento de la reivindicación 15 para su uso para eliminar la toxicidad relacionada con la dosis y mejorar la actividad terapéutica de un compuesto farmacológicamente activo en el tratamiento de enfermedades infecciosas y no infecciosas.

17. El medicamento para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15-16, en el que dicho medicamento se fabrica para administración externa, inhalatoria, enteral o parenteral.