RU2460788C1 - Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis - Google Patents
Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460788C1 RU2460788C1 RU2011131566/10A RU2011131566A RU2460788C1 RU 2460788 C1 RU2460788 C1 RU 2460788C1 RU 2011131566/10 A RU2011131566/10 A RU 2011131566/10A RU 2011131566 A RU2011131566 A RU 2011131566A RU 2460788 C1 RU2460788 C1 RU 2460788C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- cells
- capsular
- mice
- monoclonal antibodies
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к капсульному F1 антигену Yersinia pestis.The invention relates to biotechnology and can be used to obtain monoclonal antibodies (MCAs) to the capsular F1 antigen of Yersinia pestis.
Возбудитель чумы (Y.pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов и единственный представитель бактерий, относящийся к возбудителям первого (наивысшего) класса опасности.The causative agent of plague (Y. pestis) is one of the most virulent microorganisms for humans and the only representative of bacteria related to pathogens of the first (highest) hazard class.
Имея неограниченный природный резервуар в грызунах, чума до сих пор остается непобежденным заболеванием, вспышки которого регулярно регистрируются в разных точках земного шара.Having an unlimited natural reservoir in rodents, the plague still remains an undefeated disease, outbreaks of which are regularly recorded in different parts of the globe.
Ежегодно фиксируется около 2000 случаев заболевания чумой, и Всемирная Организация Здравоохранения недавно признала чуму как вновь циркулирующее заболевание [1].About 2,000 cases of plague are reported each year, and the World Health Organization has recently recognized plague as a newly circulating disease [1].
Закономерность эпидемиологического процесса, с одной стороны, ее характером как природно-очаговой трансмиссивной инфекции со своеобразными особенностями течения эпизоотии среди различных видов грызунов, а с другой - факторами, способствующими проявлению антропонозного механизма передачи. В природных очагах чума проявляется в виде эпизоотии среди более чем 200 видов грызунов и зайцеобразных мировой фауны. Чума передается между ними трансмиссивным и, вероятно, алиментарным путем [2].The regularity of the epidemiological process, on the one hand, by its nature as a natural focal transmissible infection with peculiar features of the course of epizootics among various species of rodents, and on the other, by factors contributing to the manifestation of the anthroponous transmission mechanism. In natural foci, the plague manifests itself in the form of epizootics among more than 200 species of rodents and rabbit-like world fauna. Plague is transmitted between them in a transmissible and probably alimentary way [2].
Чумной микроб неустойчив вне организма теплокровных животных и эктопаразитов и чувствителен к воздействию физических, химических и биологических факторов. Низкую температуру возбудитель чумы переносит значительно лучше, выдерживая троекратное замораживание и оттаивание.The plague microbe is unstable outside the body of warm-blooded animals and ectoparasites and is sensitive to the effects of physical, chemical and biological factors. The plague pathogen tolerates low temperature much better, withstanding three times freezing and thawing.
При благоприятных температурных условиях, влажности и отсутствия микробов-конкурентов чумной микроб остается жизнеспособным в воде в течение месяца, молоке до 3 месяцев, в земле до 2 месяцев. В высохшей мокроте чумного больного микробы выживают в течение недели, во влажной - больше месяца (при низких температурах). В зараженных и голодающих блохах - до 396 дней [3].Under favorable temperature conditions, humidity and the absence of competing microbes, the plague microbe remains viable in water for a month, milk for up to 3 months, in the ground for up to 2 months. In the dried sputum of the plague sick, the microbes survive for a week, in the wet - more than a month (at low temperatures). In infected and starving fleas - up to 396 days [3].
Одним из наиболее лабильных свойств возбудителя чумы является синтез капсульного антигена F1. Данный признак находится в прямой зависимости от характера эпизоотийного процесса: по мере угасания эпизоотии происходит увеличение числа культур со сниженной способностью синтезировать капсульный антиген, вплоть до полной его утраты. Это коррелирует с нарастанием числа серопозитивных в отношении F1 животных [4].One of the most labile properties of the plague pathogen is the synthesis of capsular antigen F1. This symptom is directly dependent on the nature of the epizootic process: as the epizootic fades, an increase in the number of cultures with a reduced ability to synthesize capsular antigen, up to its complete loss. This correlates with an increase in the number of seropositive animals with respect to F1 [4].
Штамм Y.pestis EV линии НИИЭГ обладает повышенной субстратной специфичностью и при этом невысокой скоростью роста при оптимальной температуре для синтеза капсульного антигена - 37°C [5].The Y.pestis EV strain of the NIIEG line has an increased substrate specificity and, at the same time, a low growth rate at an optimum temperature of 37 ° C for the synthesis of capsular antigen [5].
Классическая иммунодиагностика чумы построена на выявлении капсульного антигена F1 или анти-F1-антител.Classical plague immunodiagnostics is based on the detection of capsular F1 antigen or anti-F1 antibodies.
Практическое здравоохранение остро нуждается в сертифицированных современных иммунодиагностических тест-системах для индикации возбудителей чумы. В связи с разработкой иммуночипов и мультипараметрических диагностических систем большое значение придается получению специфических иммунореагентов, прежде всего, моноклональных или монорецепторных поликлональных антител.Practical healthcare urgently needs certified modern immunodiagnostic test systems for indicating plague pathogens. In connection with the development of immunochips and multiparameter diagnostic systems, great importance is attached to the production of specific immunoreagents, primarily monoclonal or monoreceptor polyclonal antibodies.
Специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимости от специфичности антитела, используемого для приготовления диагностического препарата. Диагностикумы, приготовленные на основе моноклональных антител (МКА), строго специфичны, поскольку направлены на выявление одного антигена.The specificity of immunological reactions is directly dependent on the specificity of the antibody used to prepare the diagnostic drug. Diagnostics based on monoclonal antibodies (MCAs) are strictly specific because they are aimed at identifying a single antigen.
Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к капсульному F1 антигену Y.pestis и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя чумы.The objective of the invention is to obtain a strain of hybrid cultured cells that produce monoclonal antibodies specific for the F1 capsular antigen Y. pestis and suitable for constructing test systems based on them to identify the plague pathogen.
Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 13F8 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к капсульному F1 антигену Y.pestis.The problem is solved by the fact that a new strain of hybrid cultured animal cells of Mus museums 13F8 is proposed - a producer of highly specific monoclonal antibodies to the capsular F1 antigen Y. pestis.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 13F8 депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ МПБ) коллекционный номер - Н18.The strain of hybrid cultured animal cells Mus museums 13F8 was deposited in the state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures of the Federal budget institution of science of the State scientific center of applied microbiology and biotechnology (FBUN SSC BCH) collection number - H18.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 13F8 получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют 4- кратным введением рекомбинантного антигенного препарата F1 в дозе 100 мкг/мышь. На третьи сутки после последней иммунизации проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×108 клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (1×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.Mus museums 13F8 hybrid cultured animal cell strain is obtained by immunizing BALB / c mice. Mice are immunized with 4-fold administration of a recombinant antigenic preparation F1 at a dose of 100 μg / mouse. On the third day after the last immunization, the splenocytes of the immune mice (1 × 10 8 cells) are hybridized with the cells of mouse myeloma PZ-X63 Ag / 8-653 (1 × 10 7 cells). Polyethylene glycol (Sigma, USA) is used as a fusion agent. After hybridization, selection, screening, cloning, and cryopreservation of the hybridoma are performed.
Характеристика штамма гибридных клеток животных Mus museums 13F8.Characterization of the strain of hybrid cells of animals Mus museums 13F8.
Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку.Morphological characteristics. The hybrid cell culture consists of rounded cells loosely attached to the substrate the size of the original myeloma cell.
Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридных клеток 13F8 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/Lглутамина, 100 мкг/мл гентамицина.Cultural properties. The cultivation of the strain of hybrid cells 13F8 is carried out at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI-1640 medium containing 20% fetal calf serum, 2 mM / L glutamine, 100 μg / ml gentamicin.
Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование гибридных клеток 13F8 проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2-1:3. Посевная концентрация клеток составляет 1×105 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1×105 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).Cells are cultured as a stationary suspension in Costar plastic mattresses. Passion of 13F8 hybrid cells is carried out 2 times a week with a dilution ratio of 1: 2-1: 3. The inoculum cell concentration is 1 × 10 5 in 1 ml of medium. The maximum concentration of hybrid cells during cultivation is 1 × 10 5 per 1 ml of medium. The hybrid clone does not lose the ability to synthesize antibodies at 10 passages in vitro (observation period).
Культивирование гибридных клеток 13F8 в организме животного.Cultivation of 13F8 hybrid cells in an animal.
Мышей линии BALB/c 20-недельного возраста обрабатывают пристаном (Sigma, США) по 0,5 мл внутрибрюшинно и через 2-3 недели интраперитонеально вводят по 1×1010 гибридных клеток. Появление иммуноасцитов регистрируют на 7-15 сутки, отбор иммуноасцитической (ИАЖ) жидкости производят на 10-21 сутки. Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) [6].20-week-old BALB / c mice were treated with a pieran (Sigma, USA) 0.5 ml intraperitoneally and after 2–3
Характеристика полезного продукта. Штамм гибридных клеток 13F8 продуцирует специфичные моноклональные антитела к капсульному F1 антигену Y.pestis, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:640000, в ИАЖ 1:1000000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяли путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, BIO RAD, США).The characteristic of a useful product. The strain of hybrid cells 13F8 produces specific monoclonal antibodies to the capsular F1 antigen Y. pestis, the titer of which is in the culture fluid (QOL) 1: 640000, in IAG 1: 1000000. Monoclonal antibodies from QOL and IAG were isolated by affinity chromatography on a column of protein G-Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). The purity of the obtained immunoglobulin fractions was evaluated in SDS-PAGE-electrophoresis under denaturing conditions. The concentration of immunoglobulins was determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm (Smart Spec Plus spectrophotometer, BIO RAD, USA).
Продуктивность штамма гибридных клеток 13F8.The productivity of the strain of hybrid cells 13F8.
Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения)MCA production in the cultivation medium is 20-50 μg / ml, in ascitic fluid - 5-10 mg / ml. MCA production in the culture fluid is maintained for 10 passages (observation period) and 5 passages when cultured in the form of ascites tumors in mice (observation period)
Контаминация штамма гибридных клеток 13F8.Contamination of a strain of hybrid cells 13F8.
Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.Hybrid line contaminants, including bacteria, yeast, fungi, were not detected. Mycoplasmas were not determined.
Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.Cryopreservation. The freezing medium contains fetal calf serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%.
Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре -70°C и затем опускают в жидкий азот.Cryopreservation and heating mode. Hybrid cells are introduced into cryovials, placed in a foam container with a wall thickness of at least 1 cm and left for 16-24 hours in a kelvinator at a temperature of -70 ° C and then immersed in liquid nitrogen.
Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°C.Defrosting is carried out quickly in a water bath at a temperature of 37 ° C.
Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 1×106. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.Ampoules contain 1.0 ml of cryoprotective medium with a concentration of hybrid cells of 1 × 10 6 . The viability of restored hybridomas after cryopreservation is 75-85%.
Свойства полезного продукта. Штамм гибридных клеток 13F8 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgGl подклассу иммуноглобулинов мыши.Properties of a useful product. The 13F8 hybrid cell strain produces monoclonal antibodies belonging to the IgGl subclass of mouse immunoglobulins.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.The invention is illustrated by the following graphic materials.
Фиг.1 Дот-блот с МКА 13F8. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов.Figure 1 Dot blot with MCA 13F8. Determination of nonspecific activity against microbial cells of other microorganisms.
Фиг.2 Дот-блот с МКА 13F8. Определение специфической активности к капсульному F1 антигену Y.pestis.Figure 2 Dot blot with MCA 13F8. Determination of specific activity for the capsular F1 antigen of Y. pestis.
Фиг.3 SDS-PAGE электрофорез МКА 13F8.Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis of MCA 13F8.
Фиг.4 Определение подклассовой принадлежности МКА 13F8.Figure 4 Determination of subclass affiliation MCA 13F8.
Фиг.5 Иммуноблотинг МКА 13F8 с капсульным F1 антигеном Y.pestis.Figure 5 Immunoblotting MCA 13F8 with capsular F1 antigen Y. pestis.
Фиг.6 Обнаружение капсульного Fl Y.pestis в реакции латекс-агглютинации.6 Detection of capsular Fl Y.pestis in latex agglutination reaction.
Фиг.7 Выявление капсульного F1 антигена Y.pestis методом ИФА с использованием МКА 13F8.Fig. 7 Detection of the capsular F1 Y.pestis antigen by ELISA using MCA 13F8.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.
Пример 1. Получение штамма гибридных клеток 13F8.Example 1. Obtaining a strain of hybrid cells 13F8.
ИммунизацацияImmunization
Для иммунизации используют мышей линии BALB/c в возрасте 3-4 месяцев. Иммунизацию проводят по следующей схеме:For immunization, BALB / c mice aged 3-4 months are used. Immunization is carried out according to the following scheme:
0 день - 100 мкг антигена в PBS эмульгированного в ПАФ (0.2 мл) подкожно;0 day - 100 μg of antigen in PBS emulsified in PAF (0.2 ml) subcutaneously;
21 день - 100 мкг антигена в PBS эмульгированного в НАФ (0.2 мл) подкожно;21 days - 100 μg of antigen in PBS emulsified in NAF (0.2 ml) subcutaneously;
51 день - 100 мкг антигена в PBS внутривенно;51 days - 100 μg of antigen in PBS intravenously;
58 день - 100 мкг антигена в PBS внутривенно;58 day - 100 μg of antigen in PBS intravenously;
Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после последней инъекции антигеном в концентрации 100 мкг согласно Animal protocol №Р 02-19 стр.7.Blood from immune mice was taken on the third day after the last injection of antigen at a concentration of 100 μg according to Animal protocol No. P 02-19 p.7.
Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.The titers of specific antibodies in animal sera are determined using indirect solid-phase ELISA.
ГибридизацияHybridization
Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 1×108 спленоцитов мыши с 1×107 клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-653 в присутствии 1 мл полиэтиленгликоля (SIGMA, США) в течение 1 минуты.3 days after the last intravenous injection, the mouse spleen is removed and 1 × 10 8 mouse splenocytes are hybridized with 1 × 10 7 cells of the P3-X63 Ag / 8-653 myeloma line in the presence of 1 ml of polyethylene glycol (SIGMA, USA) for 1 minute.
СелекцияSelection
После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде RPMI-1640 "Sigma" с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.After washing the polyethylene glycol, the cells were plated on 96-well plates on a layer of peritoneal macrophages taken from BALB / c mice. Selection of hybrid cells is carried out on a selective medium containing hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT). After 21 days, aminopterin is removed from the medium. Subsequently, cultivation was carried out on RPMI-1640 Sigma medium with 20% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin.
Скрининг гибридных клоновHybrid Clone Screening
Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют непрямой твердофазный ИФА.Indirect solid-state ELISA is used to select positive hybrid clones producing MABs.
Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1 мкг/лунку капсульного F1 антигена Y.pestis и выдерживают при температуре 37°C в течение 1 часа или при 4°C в течение 18 часов. Три раза отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7.4, содержащим 0,5% твин-20 (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности, и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. Три раза отмывают ФСБ-Т, вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа, затем 6 раз отмывают лунки раствором ФСБ-Т. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстратиндикаторного раствора (10 мкл 30% Н2O2 и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят на фотометре (фотометр Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм.To perform an indirect ELISA, 1 μg / well of Y. pestis F1 capsule F1 antigen is added to the wells of a 96-well polystyrene ELISA plate and kept at 37 ° C for 1 hour or at 4 ° C for 18 hours. Three times washed with phosphate-buffered saline pH 7.4, containing 0.5% tween-20 (FSB-T). Then, 160 μl of a 0.5% solution of bovine serum albumin (BSA), tested for the absence of peroxidase activity, is added to the wells and incubated at 37 ° C for 1 hour. Wash FSB-T three times, add supernatant of culture fluid to the wells in a volume of 100 μl and incubate at 37 ° C for 1 hour. After this, the wells of the tablet are washed three times with a solution of PBS-T and the peroxidase conjugate is added to the wells to the whole mouse IgG molecule (Sigma, USA) in working dilution. The plate is incubated at 37 ° C for 1 hour, then the wells are washed 6 times with FSB-T solution. After that, 100 μl of a sub-stratification solution (10 μl of 30% H 2 O 2 and 8 mg of orthophenylenediamine per 10 ml of phosphate-citrate buffer pH 5.0) is added to the wells. A positive reaction is evaluated by the appearance of a tan solution. The reaction is stopped by adding 50 μl of 4N sulfuric acid to the wells. The results are taken into account on a photometer (Picon photometer, RF) for ELISA at a wavelength of 492 nm.
КлонированиеCloning
Клонирование гибридных клеток 13Р8 проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 1×104 клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.Cloning of 13P8 hybrid cells was performed by limiting dilution in 96-well plates on a layer of peritoneal macrophages at the rate of 1 × 10 4 cells per well. Clone screening is carried out by indirect solid-phase ELISA, as described above.
КультивированиеCultivation
Культивирование клонов гибридомы 13F8 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.Cultivation of 13F8 hybridoma clones is carried out at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI-1640 medium containing 20% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin.
КриоконсервацияCryopreservation
Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.Hybridoma clones are cryopreserved on a freezing medium consisting of fetal calf serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%. Hybridoma clones are stored in Dewar vessels with liquid nitrogen.
Пример 2. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов методом дот-блот анализа.Example 2. Determination of nonspecific activity against microbial cells of other microorganisms by dot blot analysis.
Для проведения данного исследования использовали панель из 37 микроорганизмов различных видов. В качестве положительного контроля использовали капсульный F1 антиген Y.pestis. На нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбировали инактивированные микробные клетки в концентрациях 1×106 клеток/л. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 13F8 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.To conduct this study, a panel of 37 microorganisms of various species was used. As a positive control, the capsular F1 antigen of Y. pestis was used. Inactivated microbial cells were adsorbed at a concentration of 1 × 10 6 cells / L on a nitrocellulose membrane (GE Water & Process Technologies, USA) using a BIO-DOT device (BIO RAD, USA). Microorganism strains were obtained from the collection of microorganisms of the Federal State Institution of Science and Science of the Russian Academy of Medical Sciences. The membranes were then blocked with an inert protein solution and sequentially incubated with 13F8 MCA and peroxidase conjugate to the whole mouse IgG molecule (Sigma, USA). The reaction was visualized with a solution of a substrate mixture based on diaminobenzidine (0.05% diaminobenzidine (Sigma, United States), 0.015% H 2 O 2 , 0.01 M phosphate-buffered saline, pH 7.4). The reaction was stopped by washing with distilled water.
Как показал проведенный анализ, МКА 13F8 специфически взаимодействовали с F1 антигеном Y.pestis и не давали перекрестных реакций с другими близкородственными иерсиниями. (фиг.1).As the analysis showed, MCA 13F8 specifically interacted with the F1 antigen of Y. pestis and did not give cross-reactions with other closely related yersinia. (figure 1).
Проверка специфичности МКА 13F8.Checking the specificity of MCA 13F8.
Пример 3. Определение специфической активности к F1 антигену Y.pestisExample 3. Determination of specific activity to F1 antigen Y.pestis
Была проведена проверка специфической активности КЖ гибридом в отношении капсульного F1 антигена Y.pestis методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали F1 антиген с начальной концентрацией 0,025 мкг/лунку и титровали двукратным шагом до конечной концентрации 0,0002 мкг/лунку. Далее мембрану блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 13F8 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2; 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.The specific activity of QOL hybridomas against the capsular F1 capsule of the Y.pestis antigen was tested by dot blot analysis. An F1 antigen with an initial concentration of 0.025 μg / well was sorbed onto a nitrocellulose filter using a Bio-Dot device (Bio-Rad, USA) and titrated in two steps to a final concentration of 0.0002 μg / well. Then, the membrane was blocked with an inert protein solution and incubated sequentially with 13F8 MCA and peroxidase conjugate to the whole mouse IgG molecule (Sigma, USA). The reaction was visualized with a solution of a substrate mixture based on diaminobenzidine (0.05% diaminobenzidine (Sigma, United States), 0.015% H 2 O 2 ; 0.01 M phosphate-buffered saline, pH 7.4). The reaction was stopped by washing with distilled water.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 13F8 выявляют до 7 нг/мл F1 антигена (фиг.2).As a result of the analysis, it was found that MCA 13F8 detect up to 7 ng / ml F1 antigen (figure 2).
Пример 4. Выделение и очистка МКА 13F8Example 4. Isolation and purification of MCA 13F8
Выделение МКА 13F8 из асцитической жидкости проводят путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Клеточные компоненты из культуральной и асцитической жидкостей удаляют центрифугированием (2000 g×20 мин), рН культуральной жидкости доводят до 8.6 при помощи 1 N раствора NaOH, асцитическую жидкость разводят 1:1 посадочным буфером (0.05 М трис, 0.15 М NaCl, 0.02% NaN3, рН 8.6). Колонку уравновешивают посадочным буфером и проводят нанесение образцов со скоростью 10 мл/час при комнатной температуре. После нанесения образцов колонку отмывают от несвязавшихся компонентов и проводят элюцию иммуноглобулинов 0.05 М глициновым буфером, 0.15 М NaCl, рН 2.3. Контроль выхода фракции иммуноглобулинов осуществляют при помощи УФ детектора ("Pharmacia LKB", Швеция).The isolation of MCA 13F8 from ascitic fluid is carried out by affinity chromatography on a column of protein G-Sepharose (
Выделенные иммуноглобулины концентрируют осаждением при помощи сухого сульфата аммония (до 50% насыщения) и переводят в фосфатно-солевой буферный раствор методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (PD-10, "Pharmacia LKB", Швеция) емкостью 10 мл. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях.The isolated immunoglobulins are concentrated by precipitation with dry ammonium sulfate (up to 50% saturation) and transferred to a phosphate-buffered saline by gel filtration on a Sephadex G-25 column (PD-10, Pharmacia LKB, Sweden) with a capacity of 10 ml. The purity of the obtained immunoglobulin fractions was evaluated in SDS-PAGE-electrophoresis under denaturing conditions.
В результате были получены очищенные препараты иммуноглобулинов (фиг.3).As a result, purified immunoglobulin preparations were obtained (FIG. 3).
Пример 5. Определение подклассовой принадлежности МКА 13F8Example 5. The definition of subclass affiliation MCA 13F8
Подклассы полученных МКА 13F8 определяют с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США). В культуральную жидкость объемом 500 мкл погружают иммунохроматографическую полоску для определения изотипов мышиных моноклональных антител не глубже чем на 1,5 см на 5 минут. После проявления контрольной полосы и полосы, соответствующей тестируемым Ig, определяют с помощью контрольной иммунохроматографической полоски (прилагается к набору для определения изотипов мышиных моноклональных антител) подкласс антител.Subclasses of the obtained 13F8 MCAs are determined using a murine monoclonal antibody isotype determination kit (Roche Diagnostic Corporation, USA). An immunochromatographic strip is immersed in a culture liquid of 500 μl to determine the isotypes of murine monoclonal antibodies no deeper than 1.5 cm for 5 minutes. After the development of the control band and the band corresponding to the tested Ig, the antibody subclass is determined using the control immunochromatographic strip (attached to the kit for determining isotypes of murine monoclonal antibodies).
Определение подкласса полученных МКА 13F8 показало, что штамм гибридных клеток продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgGl подклассу иммуноглобулинов мыши (фиг.4).The subclass of the obtained 13F8 MCA showed that the hybrid cell strain produces monoclonal antibodies belonging to the IgGl subclass of mouse immunoglobulins (Fig. 4).
Пример 6. Иммуноблотинг МКА 13F8 с капсульным F1 антигеном Y.pestisExample 6. Immunoblotting MCA 13F8 with capsular F1 antigen Y. pestis
Для проверки специфичности МКА 13F8 с капсульным F1 антигеном Y.pestis проводят SDS-PAGE-электрофорез в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 1 часа при 220 В, 20 мА. F1 из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) в течение 1 часа при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в ФСБ рН 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран используют ФСБ-Т рН 7,4. Блокированную и промытую мембрану инкубируют в растворе МКА гибридомы 13F8 в течение одного часа при температуре 37°C. Далее, после промывки буфером, мембрану инкубируют с пероксидазным конъюгатом к суммарной фракции Ig мыши (Sigma, США) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают ФСБ-Т. Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2, 0.01 М фосфатно-солевой буфер - ФСБ, рН 7.4). Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.To verify the specificity of 13A8 MCA with the Y.pestis capsular F1 antigen, SDS-PAGE electrophoresis was performed on 10% polyacrylamide gel (PAGE) for 1 hour at 220 V, 20 mA. F1 from PAGE is transferred to a nitrocellulose membrane (GE Water & Process Technologies, USA) for 1 hour at a current of 380 mA. After the transfer is complete, the membrane is blocked by immersing in a 1% BSA solution in FSB pH 7.4 for 1 hour at room temperature. For washing the membranes using FSB-T pH 7.4. The blocked and washed membrane is incubated in a 13F8 hybridoma MCA solution for one hour at 37 ° C. Further, after washing with a buffer, the membrane is incubated with a peroxidase conjugate to the total mouse Ig fraction (Sigma, USA) in working dilution under the same conditions, washed with PBS-T. The reaction was visualized with a solution of a substrate mixture based on diaminobenzidine (0.05% diaminobenzidine (Sigma, USA), 0.015% H 2 O 2 , 0.01 M phosphate-saline buffer - FSB, pH 7.4). The reaction is stopped by washing with distilled water.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 13F8 взаимодействуют с капсульным F1 антигеном Y.pestis (фиг 5).As a result of the analysis, it was found that MCA 13F8 interact with the capsular F1 antigen Y.pestis (Fig. 5).
Пример 7. Обнаружение капсульного F1 Y.pestis в реакции латекс-агглютинацииExample 7. Detection of capsular F1 Y. pestis in latex agglutination reaction
Для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА) используют полиакролеиновые латексные частицы диаметром 1 и 1,2 мкм (Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва) и МКА 13F8. Иммобилизацию МКА 13F8 на латексных частицах проводят согласно протоколу производителя: к 50 мкл 10% латексной суспензии добавляют 100 мкл МКА 13F8 с концентрацией 1 мг/мл, доводят объем до 0,5 мл и инкубируют 2 часа при комнатной температуре и перемешивании. Для блокировки непрореагировавших групп добавляют 4 мл 1% раствора овальбумина (Sigma, США) в 0,1 М боратном буфере (ББ), pH 8,2. От несвязавшихся МКА 13F8 латексные частицы отмывают в ББ трехкратным 10-минутным центрифугированием при 1200 g. Осадок ресуспендируют в 5 мл ББ с 1% овальбумином.For the formulation of the latex-agglutination reaction (RLA), polyacrolein latex particles with a diameter of 1 and 1.2 μm are used (Institute of Bioorganic Chemistry named after Academician M.M.Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov RAS, Moscow) and ICA 13F8. The immobilization of MCA 13F8 on latex particles is carried out according to the manufacturer's protocol: 100 μl of MCA 13F8 with a concentration of 1 mg / ml is added to 50 μl of a 10% latex suspension, the volume is adjusted to 0.5 ml and incubated for 2 hours at room temperature with stirring. To block unreacted groups add 4 ml of a 1% solution of ovalbumin (Sigma, USA) in 0.1 M borate buffer (BB), pH 8.2. From unbound MCA 13F8, latex particles are washed in the BB by three-fold 10-minute centrifugation at 1200 g. The pellet was resuspended in 5 ml BB with 1% ovalbumin.
Реакцию латекс-агглютинации проводят в 96-луночных планшетах с V-образным профилем лунок (фирма Пан Эко, Россия). В качестве контроля используют капсульный F1 антиген и клетки штамма Y.pestis EV НИИЭГ, выращенные при 37°C. Для контроля специфичности используют штаммы: Y.pestis EV НИИЭГ (выращенные при 28°C), Y. enterocolitica 287, Y.pseudotuberculosis III, S. enteritidis 1127, S.typhi H-901, Sal.paratyphi A-225, Sh.disenteriae 1362, E.coli ATCC 25922, E.coli 1282 ГИСК, L.pneumophila ATCC-33152, P.alcalifaciens 1068-50, P.aeruginosa ATCC27853.The latex agglutination reaction is carried out in 96-well plates with a V-shaped profile of the wells (company Pan Eco, Russia). As a control, capsular F1 antigen and cells of the Y. pestis EV strain NIIEG grown at 37 ° C are used. To control specificity, the following strains were used: Y. pestis EV NIIEG (grown at 28 ° C),
В качестве отрицательного контроля используют 0,1 М боратный буфер, рН 8,2.As a negative control using 0.1 M borate buffer, pH 8.2.
Разведения клеток штаммов микроорганизмов с шагом 2 готовят в объеме 25 мкл в 96-луночных планшетах в боратном буфере. После добавления во все лунки по 25 мкл латексных частиц с иммобилизованными МКА 13F8, планшет встряхивают и инкубируют 1,5-2,0 часа при комнатной температуре.Dilutions of cells of microorganism strains with
Учет результатов проводят визуально по четырех крестной системе на светлом фоне при хорошем освещении.The results are taken into account visually on the four cross system on a light background in good light.
4+ - все частицы латекса агглютинированы, равномерно покрывают дно лунки, образуя «зонтик».4+ - all latex particles are agglutinated, uniformly cover the bottom of the hole, forming an "umbrella".
3+ - Агглютинированы почти все частицы латекса, что выражается в уменьшении диаметра «зонтика».3+ - Almost all latex particles are agglutinated, which is reflected in a decrease in the diameter of the “umbrella”.
2+ - Агглютинирована половина латексных частиц.2+ - Half of the latex particles are agglutinated.
1+ - Большинство частиц не агглютинировано и осело на дно лунки, но диаметр «пуговицы» пока еще отличается от «точки».1+ - Most particles are not agglutinated and settled on the bottom of the hole, but the diameter of the “button” is still different from the “point”.
«-» - Признаков агглютинации нет, латексные частицы осели на дно лунки в виде «точки» ярко синего цвета в центре лунки.“-” - There are no signs of agglutination, latex particles settled on the bottom of the hole in the form of a “dot” of bright blue in the center of the hole.
Положительной считается реакция, оцениваемая не менее чем на 3+.A positive reaction is considered to be rated at least 3+.
В результате проведенной реакции латекс-агглютинации было установлено, что латексные частицы с иммобилизованными МКА 13F8 выявляют F1 антиген в концентрации 0,0038 мкг/мл и клетки штамма Y.pestis EV НИИЭГ (при 37°C) в концентрации 3,6×105 клеток/мл и не выявляют гетерологичные культуры микроорганизмов в концентрации 5×108 клеток/мл и ниже (фиг.6, фиг.7, таблица 1, таблица 2, таблица 3).As a result of the latex-agglutination reaction, it was found that latex particles with immobilized MCA 13F8 reveal F1 antigen at a concentration of 0.0038 μg / ml and cells of the Y.pestis EV strain NIIEG (at 37 ° C) at a concentration of 3.6 × 105 cells / ml and do not reveal heterologous cultures of microorganisms at a concentration of 5 × 10 8 cells / ml and below (Fig.6, Fig.7, table 1, table 2, table 3).
Пример 7. Выявление капсульного F1 антигена Y. pestis методом ИФА с использованием МКА 13F8Example 7. Detection of capsular F1 antigen of Y. pestis by ELISA using MKA 13F8
МКА 13F8 в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 с начальной концентрацией 5 мкг/лунку титровали двукратным шагом по вертикали до конечной концентрации 0,035 мкг/лунку (по 100 мкл/лунку в ФСБ). Для титрования использовали 96-ти луночные стрипованные планшеты для ИФА. В первый вертикальный ряд планшета вносили положительные (К+) и отрицательные контроли (K-) контроли. Лунку A1 с отрицательным контролем использовали как бланк. Планшет с антителами инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°C, затем 4 раза промывали ФСБ-Т. Участки неспецифического связывания блокировали добавлением в лунки по 160 мкл молока 0,5% жирности, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°C и промывали 3 раза ФСБ-Т. F1 антиген титровали двукратным шагом по горизонтали с начальной концентрацией 0,1 мкг/лунку в ФСБ до конечной концентрации 0,000097 мкг/лунку в ФСБ (по 100 мкл/лунку в ФСБ), инкубировали при тех же условиях, после чего промывали планшет 4 раза в ФСБ-Т. Биотинилированные МКА 10G4 (фракция №3-1,7 мг/мл) вносили заведомо в избытке (разведение 1:500) по 100 мкл/лунку в ФСБ, инкубацию и промывку планшета проводили четырехкратно, как описано выше. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена («Имтек», Россия) в разведении 1:5000 (согласно инструкции по применению) в ФСБ. После инкубации и четырехкратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл субстрат-индикаторной смеси (0,008 мг ортофенилендиамина в 10 мл фосфатно-цитратного буфера, pH 5,0 с 1 мкл/мл 33% H2O2). Планшет помещали на 3-5 мин в защищенное от света место при комнатной температуре, затем останавливали реакцию 4N серной кислотой (50 мкл/лунку). Учет результатов проводили с помощью планшетного спектрофотометра xMark («Bio-Rad», США) при длине волны 492 нм.MCA 13F8 in phosphate-buffered saline, pH 7.4 with an initial concentration of 5 μg / well, was titrated twice in vertical steps to a final concentration of 0.035 μg / well (100 μl / well in PBS). For titration, 96-well stripped ELISA plates were used. Positive (K +) and negative controls (K-) controls were added to the first vertical row of the tablet. Well A1 with negative control was used as blank. The antibody plate was incubated for 1 h on a shaker at 37 ° C, then washed with FSB-
В результате проведенного анализа (таблица 4) было установлено, что для иммобилизованных МКА 13F8 наиболее оптимальной является концентрация 5 мкг/лунку, позволяющая уверенно определять минимальные количества F1 (4 нг/мл).As a result of the analysis (table 4), it was found that for immobilized MCA 13F8, the concentration of 5 μg / well is the most optimal, allowing confidently determine the minimum amount of F1 (4 ng / ml).
Источники информацииInformation sources
1. Bleves S, Cornells G.R. (2000) How to survive in the host: the Yersinia lesson. Microbes Infect 2.1. Bleves S, Cornells G.R. (2000) How to survive in the host: the Yersinia lesson. Microbes Infect 2.
2. Домарадский И.В.Чума - М.: Медицина, 1998 г.2. Domaradsky I.V. Chuma - M .: Medicine, 1998
3. Санитарные правила 3.4./4.2. 19-30-2005 2005 г. Профилактика заболевания людей чумой. Лабораторная диагностика чумы.3. Sanitary rules 3.4./4.2. 19-30-2005 2005. Prevention of people with plague. Laboratory diagnosis of plague.
4. Пунский Е.Е., Адаменко Н.И. Медико-географические проблемы аридной зоны. - Ашхабад, 1982. - С.36-384. Punsky E.E., Adamenko N.I. Medical and geographical problems of the arid zone. - Ashgabat, 1982. - S.36-38
5. Руководство по профилактике чумы. / Под ред. Наумова А.В., Самойловой Л.В.. - Саратов, 1992. - 278 с.5. Guidelines for the prevention of plague. / Ed. Naumova A.V., Samoilova L.V. - Saratov, 1992 .-- 278 p.
6. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. / Т. 33 - М.: Высш. Шк., 1991. - С.174-175.6. Egorov A.M., Osipov AP, Dzantiev BB, Gavrilova EM Theory and practice of enzyme immunoassay. / T. 33 - M .: Higher. Shk., 1991 .-- S.174-175.
Результаты учета реакции латекс-агглютинацииTable 1
Latex-agglutination reaction results
Результаты учета реакции латекс-агглютинацииtable 2
Latex-agglutination reaction results
Результаты учета реакции латекс-агглютинацииTable 3
Latex-agglutination reaction results
Выявление капсульного F1 антигена Yersinia pestis методом ИФАTable 4
Detection of capsular F1 antigen of Yersinia pestis by ELISA
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011131566/10A RU2460788C1 (en) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011131566/10A RU2460788C1 (en) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2460788C1 true RU2460788C1 (en) | 2012-09-10 |
Family
ID=46938932
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011131566/10A RU2460788C1 (en) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2460788C1 (en) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000073347A1 (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-07 | Us Government As Represented By The Secretary Of The Navy | Diagnostic monoclonal antibody for yersinia pestis |
RU2004107171A (en) * | 2004-03-10 | 2005-10-10 | Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" МЗ РФ (РосНИПЧИ "Микроб") (RU) | STRAIN OF HYBRID CULTIVATED ANIMAL CELLS MUS MUSCULUS L. PKKK (P) 679D PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO PROTEIN-POLYSACHARID ANTIBODIES YERSINIA 03EOCOLIT |
WO2010117455A2 (en) * | 2009-04-08 | 2010-10-14 | U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Human monoclonal antibodies protective against bubonic plaque |
RU2420588C2 (en) * | 2009-06-25 | 2011-06-10 | Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ) | MURINE MONOCLONAL ANTIBODIES BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST, METHOD AND KIT FOR Yersinia pestis DETECTION |
RU2420587C2 (en) * | 2009-06-25 | 2011-06-10 | Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ) | HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST |
-
2011
- 2011-07-28 RU RU2011131566/10A patent/RU2460788C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000073347A1 (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-07 | Us Government As Represented By The Secretary Of The Navy | Diagnostic monoclonal antibody for yersinia pestis |
RU2004107171A (en) * | 2004-03-10 | 2005-10-10 | Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" МЗ РФ (РосНИПЧИ "Микроб") (RU) | STRAIN OF HYBRID CULTIVATED ANIMAL CELLS MUS MUSCULUS L. PKKK (P) 679D PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO PROTEIN-POLYSACHARID ANTIBODIES YERSINIA 03EOCOLIT |
WO2010117455A2 (en) * | 2009-04-08 | 2010-10-14 | U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Human monoclonal antibodies protective against bubonic plaque |
RU2420588C2 (en) * | 2009-06-25 | 2011-06-10 | Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ) | MURINE MONOCLONAL ANTIBODIES BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST, METHOD AND KIT FOR Yersinia pestis DETECTION |
RU2420587C2 (en) * | 2009-06-25 | 2011-06-10 | Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ) | HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI86377B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV THERAPEUTICALLY ACTIVE HUMAN MONOCLONAL ANTIKROPPAR ELLER DERAS BINDANDE FRAGMENT. | |
RU2439148C1 (en) | STRAIN OF HYBRID CULTIVATED CELLS OF ANIMAL Mus musculur 1E6-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES, SPECIFIC TO BACILLUS Anthracis spores | |
EP0303309B1 (en) | A genus-specific Listeria antigen identified by monoclonal antibodies | |
RU2460788C1 (en) | Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis | |
RU2460787C1 (en) | Hybrid cell strain of mus musculus animals 10g4 - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis | |
RU2478703C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 5G6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN | |
RU2478704C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 2B8 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN | |
RU2451078C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain 11d6 producer of monoclonal antibodies specific to lipopolysaccharide francisella tularensis | |
RU2566553C1 (en) | STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B | |
Fasihi-Ramandi et al. | Production and characterization of monoclonal and polyclonal antibody against recombinant outer membrane protein | |
RU2768838C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii | |
RU2583306C1 (en) | Hybrid strain of cultured cells of animals mus musculus -t 2e5 - producer of monoclonal antibodies isotype g 1 to b subunit of cholera toxin | |
RU2783897C1 (en) | Homo sapiens/mus musculus 1b9c7 hybrid cultured cell strain: producer of human monoclonal antibodies specific to the proteolytic domain of botulinum type a toxin | |
RU1835848C (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to choleraic enterotoxin | |
Galkin et al. | New monoclonal antibodies to the Chlamydia trachomatis main outer membrane protein and their immunobiological properties | |
Zeninskaya et al. | Production and Characterization of Rat Monoclonal Antibodies against the PAL Antigen of Legionella spp. | |
RU2535982C1 (en) | Strain of cultivated hybrid animal cells mus musculus l cchfv vd-1-producer of monoclonal antibody 4g4/b6 to virus of crimean-congo hemorrhagic fever (cchf) | |
CN104017068B (en) | The method of the multiple antiviral antibiotic authentic monoclonal antibody of a kind of quick preparation | |
RU2012594C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to 146s-component of foot and mouth disease virus asia-1 | |
RU2525663C1 (en) | STRAIN OF HYBRID CULTURED ANIMAL CELLS Mus musculus 2F9-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR LYSOSTAPHIN AND INHIBITING ITS LYTIC ACTIVITY | |
CN114231496B (en) | Salmonella equine abortus competition ELISA antibody detection kit and application thereof | |
RU2451071C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human recombinant erythropoietin (versions) | |
SU1740415A1 (en) | Strain of hybrid cultured cells of animals mus musculus l as a producer of monoclonal antibodies to the pseudomonas pseudomalei antibodies, which do not react with malleus infection pathogenic organism of the nearest relationship | |
RU2097425C1 (en) | Strain of the hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen | |
RU2590587C1 (en) | Cultivated hybrid animal cells mus musculus ht 3e5 - producer of monoclonal antibodies isotype g 2a to b- subunit of cholera toxin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150729 |