RU2097425C1 - Strain of the hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to a-determinant of hepatitis b virus surface antigen - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, virology. SUBSTANCE: invention relates to preparing the strain of the hybrid cultured murine cells HBSV-3 producing monoclonal antibodies to a-determinant of hepatitis B virus surface antigen (HBSAg). Strain is obtained by hybridization of cells of myeloma P3-NS1-Ag4-1 with murine splenocytes of strain BALB/c immunized with hepatitis B virus surface antigen isolated from serum blood of patients with chronic hepatitis. The obtained strain produces monoclonal antibodies of class IgG1 interacting with conformational epitope on the group-specific a-determinant HBSAg and showing high stability. Monoclonal antibodies ensure to isolate HBSAg in solutions and biological fluids of organism. EFFECT: strain indicated above, enhanced effectiveness of the strain. 1 dwg

Description

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике гепатита В. The invention relates to hybridoma technology and can be used in the diagnosis of hepatitis B.

Гепатит В является тяжелым инфекционным заболеванием человека. HB_sAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) основной маркер заболевания, подтверждающий наличие острой или хронической формы инфекции или носительства. Для создания тест-систем для диагностики гепатита В необходимо наличие моноклональных антител (МКА) к HB_sAg.Hepatitis B is a serious human infectious disease. HB _s Ag (hepatitis B virus surface antigen) is the main marker of disease, confirming the presence of an acute or chronic form of infection or carriage. The creation of test systems for the diagnosis of hepatitis B requires the presence of monoclonal antibodies (MCAs) to HB _s Ag.

Ряд авторов [1,5] получили коллекции гибридом, продуцирующих МКА (моноклональные антитела) к HB_sAg. Однако только немногие из штаммов обладали свойствами, необходимыми для штаммов-продуцентов, пригодных в производстве диагностических тест-систем высокими ростовыми характеристиками, большим выходом антител на мышь в асцитной жидкости, стабильностью продуцируемых антител в растворе и сорбированными на твердой фазе, высокой активностью в реакции антиген -антитело, специфичностью к определенному участку "а" антигенной детерминанты и, главное, способностью выявлять HB_sAg в низких концентрациях [3,4]
Известно, что группоспецифическая а-детерминанта молекулы HB_sAg является сложной и содержит несколько сайтов связывания антител [6] Наличие МКА к различным сайтам на а-детерминанте молекулы HB_sAg могло бы позволить конструировать диагностикумы по двухсайтовому методу, в котором взаимодействие иммуноспецифических реагентов проводится в одну стадию, используя независимость связывания МКА с разными эпитопами. При конструировании тест-систем по двухсайтному методу можно добиваться более высокой чувствительности [3]
Наиболее близкой к заявляемой является гибридома ЖАК-22, обладающая следующими свойствами: титр асцитной жидкости в ИФА 4•10⁵, содержание специфических антител 9,7 мг/мл, чувствительность при определении HB_sAg в РИА 2 нг/мг, в ИФА 1 нг/мл [1,2] но относится к другому участку а-детерминанты поверхностного антигена вируса гепатита В. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus, продуцирующих МКА определенному сайту группоспецифической а-детерминанты HB_sAg.A number of authors [1,5] obtained collections of hybridomas producing MAB (monoclonal antibodies) to HB _s Ag. However, only a few of the strains possessed the properties necessary for producer strains suitable for the production of diagnostic test systems with high growth characteristics, a high yield of antibodies to the mouse in ascites fluid, the stability of produced antibodies in solution and adsorbed on the solid phase, and high antigen activity -antibody, specificity for a specific site “a” of the antigenic determinant and, most importantly, the ability to detect HB _s Ag in low concentrations [3,4]
It is known that the group-specific a-determinant of the HB _s Ag molecule is complex and contains several antibody binding sites [6] The presence of MCAs to different sites on the a-determinant of the HB _s Ag molecule could allow constructing diagnostics using the two-site method in which the interaction of immunospecific reagents is carried out in one stage, using the independence of the binding of MAB to different epitopes. When designing test systems using the two-site method, higher sensitivity can be achieved [3]
Closest to the claimed is a Jacquard-22 hybridoma, with the following properties: ascitic fluid titer in ELISA 4 • 10 ⁵ , the content of specific antibodies 9.7 mg / ml, the sensitivity in determining HB _s Ag in RIA 2 ng / mg, in ELISA 1 ng / ml [1,2] but relates to another site of the a-determinant of the surface antigen of hepatitis B. The aim of the invention is to obtain a strain of hybrid cultured animal cells Mus. musculus producing MAB to a specific site of the group-specific a-determinant of HB _s Ag.

Цель достигается получением коллекций гибридом, продуцирующих МКА к HB_sAg (по реакции в ИФА) и состоящей из 50 различных клонов. Гибридомы сравниваются по ростовым характеристикам, стабильности продукции антител, прививаемости мышам сингенной линии, объему получаемых асцитных жидкостей, титрам антител асцитных и культуральных жидкостей в разных вариантах ИФА, а также в РПГА и иммунодиффузии. Продуцируемые гибридомами антитела сравнивают также в реакции конкурентного ИФА, что позволяет разделить их на несколько групп конкуренции. Реакции с adw и ayw генноинженерными вариантами HB_sAg позволяет определить МКА, комплементарные а-детерминанте молекулы HB_sAg.The goal is achieved by obtaining collections of hybridomas producing MAB for HB _s Ag (by reaction in ELISA) and consisting of 50 different clones. Hybridomas are compared in terms of growth characteristics, stability of antibody production, grafting in syngeneic mice, the volume of ascites fluids obtained, antibody titers of ascites and culture fluids in different ELISA variants, as well as in RPHA and immunodiffusion. Antibodies produced by hybridomas are also compared in the reaction of competitive ELISA, which allows them to be divided into several competition groups. Reactions with adw and ayw genetically engineered variants of HB _s Ag make it possible to determine MCAs complementary to the a-determinant of the HB _s Ag molecule.

В результате анализа был отобран штамм, комплементарный определенному участку а-детерминанты HB_sAg и обладающий хорошими характеристиками штамма-продуцента МКА.As a result of the analysis, a strain was selected that was complementary to a specific site of the a-determinant of HB _s Ag and possesses good characteristics of the producer strain MAB.

Гибридому получают слиянием клеток миеломы P3-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HB_sAg.The hybridoma is obtained by fusion of P3-NS1-Ag4-1 myeloma cells with BALB / c mouse splenocytes immunized with HB _s Ag.

Мышь линии BALB/c (самка, 8 нед) иммунизируют внутрибрюшинно HB_sAg, выделенным из плазмы сыворотки хронически больных людей, в количестве 20 мкг в 0,5 мл забуференного фосфатом физраствора (ЗФР), содержащего 50% полного адъюванта Фрейнда и через 8 нед 200 мкг HB_sAg в 0,5 мл ЭФР внутривенно. Через 3 дн после второй иммунизации клетки селезенки иммунной мыши гибридизируют с клетками миеломы мыши P3-NS1-Ag4-1 (соотношение 3 1) в 1 мл раствора, содержащего 50% полиэтиленгликоля (м.м. 4000 "Merk") и 5% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные планшеты по 3•10⁵ клеток на лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду ДМЕМ(м) с добавлением 10%-ной телячьей эмбриональной сыворотки, 10^-4 М гипоксантина, 4•10^-7 М аминоптерина и 1,6•10^-5 М тимидина. Гибриды-продуценты отбирают методом иммуноферментного анализа ИФА и дважды клонируют методом лимитирующих разведений.A BALB / c mouse (female, 8 weeks old) was immunized intraperitoneally with HB _s Ag isolated from serum of chronically ill people in an amount of 20 μg in 0.5 ml phosphate-buffered saline solution (PBS) containing 50% of Freund's complete adjuvant and after 8 ned 200 mcg HB _s Ag in 0.5 ml EGF intravenously. 3 days after the second immunization, spleen cells of the immune mouse hybridize with mouse myeloma cells P3-NS1-Ag4-1 (ratio 3 1) in 1 ml of a solution containing 50% polyethylene glycol (mm 4000 “Merk”) and 5% dimethyl sulfoxide . After hybridization and washing from polyethylene glycol, cells are plated in 96-well plates with 3 x 10 ⁵ cells per well. For cultivation and selection of hybrids, DMEM medium (m) with the addition of 10% calf embryonic serum, 10 ^-4 M hypoxanthine, 4 • 10 ^-7 M aminopterin and 1.6 • 10 ^-5 M thymidine is used. Producing hybrids are selected by ELISA and enzyme-linked immunosorbent assay twice cloned by limiting dilution.

Продуктивный штамм обозначают HBSV-3. The productive strain is designated HBSV-3.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 30.11.93 под номером ВСКК/П/ 627 Д. Штамм депонирован с научным описанием (паспортом). The strain was deposited in the Specialized collection of transplantable somatic vertebrate cells of the All-Union collection of cell cultures on 11/30/93 under the number VSCK / P / 627 D. The strain was deposited with a scientific description (passport).

Штамм характеризуется следующими признаками:
Родословная штамма.The strain is characterized by the following features:
The pedigree of the strain.

Гибридома получена слиянием клеток миеломы P3-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HB_sAg, с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 4000). Селекцию гибридов проводили на НАТ-среде. Клетки были дважды клонированы, процент позитивных клонов после 2-го клонирования 100% Число пассажей к моменту депонирования: 30 пассажей.The hybridoma was obtained by fusion of P3-NS1-Ag4-1 myeloma cells with BALB / c mouse splenocytes immunized with HB _s Ag using polyethylene glycol (mm 4000). The selection of hybrids was performed on a NAT medium. Cells were cloned twice, the percentage of positive clones after the 2nd clone 100% The number of passages at the time of deposit: 30 passages.

Стандартные условия выращивания. Standard growing conditions.

Среда ДМЕМ с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 40 мкг/мл гентамицина, 37^oC, 5% CO₂.DEMEM medium with 10% fetal calf serum, 40 μg / ml gentamicin, 37 ^o C, 5% CO ₂ .

Культуральные свойства. Cultural properties.

Гибридомы культивируются в стеклянных или пластиковых флаконах объемом 0,05 1,5 л в стационарном состоянии, клетки снимаются смесью растворов трипсина (25 мкг/л) и Версена в соотношении 1 2, посевная доза 150 тыс. клеток в мл, кратность пересева 1 5, время субкультивирования 2-3 сут. Hybridomas are cultured in glass or plastic bottles with a volume of 0.05 1.5 L in a stationary state, the cells are removed with a mixture of trypsin solutions (25 μg / L) and Versen in a ratio of 1 2, inoculative dose of 150 thousand cells per ml, reseeding ratio 1 5 , subculture time 2-3 days.

Культивирование гибридомы в организме животного. The cultivation of hybridomas in the body of the animal.

Гибридома может быть культивирована в организме мышей линии BALB/c, сенсибилизированных внутрибрюшинно за 5 40 дн 0,5 мл пристана или вазелинового масла. Доза клеток при прививке 1 -10•10⁶. Асцит образуется через 7 18 дн. Гибридома может перевиваться.The hybridoma can be cultured in the body of BALB / c mice, sensitized intraperitoneally for 5 40 days, 0.5 ml pristan or paraffin oil. The dose of cells when vaccinated is 1 -10 • 10 ⁶ . Ascites is formed in 7 18 days. Hybridoma may interrupt.

Морфологические признаки. Morphological signs.

Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой P3-NS1-Ag4-1. The culture consists of large rounded cells, similar in morphology and size to the original parental myeloma P3-NS1-Ag4-1.

Данные о видовой принадлежности. Species data.

Гибридома является мышиной получена слиянием клеток мышиной миеломы и спленоцитов мыши, может культивироваться в организме мыши, секретируемые ею МКА взаимодействуют с антисывороткой к иммуноглобулинам мыши. A hybridoma is a mouse obtained by fusion of mouse myeloma cells and mouse splenocytes; it can be cultured in the mouse organism; the MCAs secreted by it interact with antiserum to mouse immunoglobulins.

Маркерные признаки и методы их оценки. Marker signs and methods for their assessment.

Гибридома представляет собой монослойно-суспензионную культуру клеток и продуцирует антитела со следующими маркерными признаками -антитела принадлежат к классу IgG1, слабо взаимодействуют с белком А золотистого стафилококка (по данным ИФА и аффинной хроматографии), реагируют в ИФА с HB_s-антигеном плазматическим и HB_s-антигеном генноинженерным adw и ayw серотипов, дают положительный ответ в реакции диффузной преципитации в геле, РПГА и в "сэндвич"-варианте ИФА, взаимодействуя одновременно с HB_sAg, сорбированном на твердой фазе, конъюгированном с перксидазой и находящемся в растворе.The hybridoma is a monolayer-suspension cell culture and produces antibodies with the following marker features — antibodies belong to the IgG1 class, weakly interact with Staphylococcus aureus A protein (according to ELISA and affinity chromatography), and react with ELISA with HB _s plasma antigen and HB _s antigen by the genetically engineered adw and ayw serotypes give a positive response in the diffuse precipitation reaction in the gel, RPHA, and the sandwich ELISA variant, interacting simultaneously with HB _s Ag adsorbed on the solid phase conjugated with perxidase and in solution.

Данные о контаминации. Contamination data.

Бактерии и грибы не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился. Bacteria and fungi were not detected, control for contamination with viruses and mycoplasmas was not carried out.

Характеристика биосинтеза полезных продуктов. Characterization of the biosynthesis of useful products.

Секретируемые гибридомой МКА имеют титр около 1•10^-3 в культуральной жидкости, 1•10^-5 в асцитной жидкости (по данным ИФА), стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре клеток (срок наблюдения).MAB secreted by hybridoma have a titer of about 1 • 10 ^-3 in the culture fluid, 1 • 10 ^-5 in ascites fluid (according to ELISA), the stability of antibody production is maintained for 30 passages in the cell culture (observation period).

Способ криоконсервации. The method of cryopreservation.

Клетки замораживаются на ростовой среде с 40%-ной фетальной сывороткой теленка и 10%-ным диметилсульфоксидом при температуре -70^oC в пенопластовом контейнере с толщиной стенок 1,5 см в течение ночи, хранятся в жидком азоте, размораживаются в течение 1 2 мин при температуре 37 - 40^oC, отмываются от криозащитной среды и культивируются на ростовой среде в стеклянных или пластиковых флаконах; выживаемость клеток при размораживании составляет 70 80% (по окраске трипановым синим).Cells are frozen on growth medium with 40% fetal calf serum and 10% dimethyl sulfoxide at a temperature of -70 ^o C in a foam container with a wall thickness of 1.5 cm overnight, stored in liquid nitrogen, thawed for 1 2 min at a temperature of 37 - 40 ^o C, washed from cryoprotective medium and cultivated on a growth medium in glass or plastic bottles; cell survival during thawing is 70–80% (by trypan blue stain).

На чертеже, на оси абсцисс номер трехкратного разведения конкурента, на оси ординат -процент конкуренции. Конкуренция меченых МКА HBSV-3 с МКА HBSV-3 и МКА ЖАК-22 из культуральной жидкости (2 и 3), конкуренция меченых МКА ЖАК-22 с МКА HBSV-3 (1). In the drawing, on the abscissa axis, the number of three-fold dilution of the competitor, on the ordinate axis is the percentage of competition. Competition of labeled MAB HBSV-3 with MAB HBSV-3 and MAB JAC-22 from the culture fluid (2 and 3), competition of labeled MAB JAC-22 with MAB HBSV-3 (1).

Пример 1. Определение специфической активности антител. Example 1. Determination of the specific activity of antibodies.

HB_sAg из плазмы больных людей или генноинженерный ayw серотипа сорбируют в лунки полистироловых планшетов из раствора ЗФР, содержащего антиген в концентрации 10 мкг/мл, в течение ночи; неспецифические места связывания на пластике блокируют с помощью 0,1%-ного раствора казеина в ЭФР; проводят титрование культуральной и асцитной жидкости с разведения 1/30 с кратностью 3 в блокирующем буфере; время реакции антиген -антитело ночь при комнатной температуре; после отмывки в лунки добавляют антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазной хрена периодатным методом [7] После окончания инкубации (1 ч, 37^oC) несвязавшиеся продукты реакции отмывают и связавшийся конъюгат определяют количественно по расщеплению субстрата (H₂O₂) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Титром считается разведение раствора антител, при котором наблюдалось оптическое поглощение 0,2 о.е./мл при длине волны 492 нм.HB _s Ag from the plasma of sick people or a genotype engineering ayw serotype is sorbed into the wells of polystyrene plates from a PBS solution containing 10 μg / ml antigen overnight; non-specific binding sites on the plastic are blocked with a 0.1% solution of casein in EGF; titration of the culture and ascites fluid with a dilution of 1/30 with a multiplicity of 3 in blocking buffer; reaction time antigen-antibody night at room temperature; after washing, antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase by the periodic method are added to the wells [7] After incubation (1 h, 37 ^° C), unbound reaction products are washed and the bound conjugate is quantified by cleavage of the substrate (H ₂ O ₂ ) in the presence of chromogen - orthophenylenediamine. A positive reaction is manifested by brown staining and calculated at 492 nm. A titer is considered to be a dilution of an antibody solution in which an optical absorption of 0.2 pu / ml was observed at a wavelength of 492 nm.

При реакции с плазматическим HB_sAg титры культуральной жидкости составляют 10^-3, титры асцитной жидкости 10^-5. Соотношение титров при реакции с HB_sAg плазматическим и генноинженерным ayw серотипа 1 243.When reacting with plasma HB _s Ag, the titers of the culture fluid are 10 ^-3 , the titers of ascites fluid are 10 ^-5 . The ratio of titers in the reaction with HB _s Ag plasma and genetically engineered ayw serotype 1 243.

Пример 2. Реакция МКА с разными серотипами HB_sAg.Example 2. The reaction of MAB with different serotypes of HB _s Ag.

При сравнении реакции с разными серотипами генноинженерного HB_sAg (adw и ayw) антитела сорбируют из раствора ЭФР, содержащего МКА с концентрацией 10 мкг/мл, в лунках полистироловых планшетов, блокируют 0,1%-ным раствором казеина и добавляют adw и ayw варианты генноинженерного HB_sAg в блокирующем буфере и в концентрации от 100 до 1,3 нг/мл с кратностью разведений 3. МКА для сорбции очищают с помощью аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка [8] Реакцию антиген антитело ведут в течение ночи при комнатной температуре. После отмывки добавляют МКА HBSV-3, конъюгированные с пероксидазой хрена на 1 ч при 37^oC. Положительную реакцию определяли как описано выше. МКА HBSV-3 реагируют как с adw, так и с ayw серотипами генноинженерного HB_sAg с соотношением титров 1 1.When comparing the reactions with different serotypes of genetically engineered HB _s Ag (adw and ayw), antibodies are sorbed from an EGF solution containing 10 μg / ml MCA in the wells of polystyrene plates, blocked with a 0.1% casein solution, and adw and ayw options are added genetically engineered HB _s Ag in blocking buffer and at a concentration of from 100 to 1.3 ng / ml with a dilution ratio of 3. Stabilized staphylococcus aureus Protein A affinity chromatography was used for sorption [8] Antigen-antibody reaction was carried out overnight at room temperature . After washing, add HBSV-3 MCA conjugated to horseradish peroxidase for 1 h at 37 ^° C. The positive reaction was determined as described above. HBSV-3 MCAs react with both adw and ayw serotypes of genetically engineered HB _s Ag with a titer ratio of 1 1.

Пример 3. Проведение конкурентного ИФА. Example 3. Carrying out a competitive ELISA.

Метод основан на конкуренции между мечеными пероксидазой хрена и не мечеными МКА при ограниченной концентрации антигена. Конъюгаты МКА с пероксидазой хрена получают периодатным методом [7] В лунки полистироловых планшетов с сорбированным HB_sAg добавляют конкурирующие антитела в серии 3-кратных разведений, инкубируют 2 ч при 43^oC. Разведение меченых МКА подбирают так, что они в отсутствии конкурента дают в ИФА значение экстинкции на 492 нм 1 о.е. /мл. Количество связавшейся метки определяют как описано выше. Процент конкуренции вычисляют по формуле:

где A величина связывания метки в отсутствии конкурента;
B связывание метки в присутствии немеченного МКА.The method is based on competition between horseradish peroxidase labeled and non-labeled MCA with limited antigen concentration. Conjugates of horseradish peroxidase MCA are prepared by the periodic method [7] Competitive antibodies are added to the wells of polystyrene tablets with sorbed HB _s Ag in a series of 3-fold dilutions, incubated for 2 hours at 43 ^° C. The dilutions of labeled MCAs are selected so that they give in the absence of a competitor in ELISA, the extinction value at 492 nm is 1 p.u. / ml The amount of bound label is determined as described above. The percentage of competition is calculated by the formula:

where A is the label binding value in the absence of a competitor;
B label binding in the presence of unlabeled MCA.

На чертеже. приведены кривые конкуренции клонов HBSV-3 и ЖАК-22. Из чертежа следует, что МКА HBSV-3 не подавляют связывание с HB_sAg меченых МКА ЖАК-22, и наоборот, МКА ЖАК-22 подавляют связывание с HB_sAg МКА HBSV-3. Это указывает на то, что эпитопы на молекуле HB_sAg для этих двух МКА различны и лишь частично перекрываются или близко расположены так, что МКА ЖАК-22, реагируя с молекулой HB_sAg, изменяют ее конформацию и таким образом мешают связыванию молекулы МКА HBSV-3.In the drawing. competition curves of HBSV-3 and ZhAK-22 clones are shown. It follows from the drawing that HBSV-3 MABs do not inhibit binding to HB _s Ag of labeled JAC-22 MABs, and vice versa, JAC-22 MABs inhibit binding to HB _s Ag HBSV-3 MABs. This indicates that the epitopes on the HB _s Ag molecule for these two MABs are different and only partially overlap or are closely located so that the JAC-22 MAB, reacting with the HB _s Ag molecule, change its conformation and thus interfere with the binding of the HBSV MAB molecule -3.

Пример 4. Определение стабильности МКА в растворах. Example 4. Determination of the stability of MCA in solutions.

Стабильность МКА определяют по соотношению титров в ИФА культуральных и асцитных жидкостей после их обработки следующими способами: прогрев при 37^oC в течение 48 ч, прогрев при 60^oC в течение 1 ч, трехкратная заморозка и разморозка.The stability of the MCA is determined by the ratio of titers in ELISA of culture and ascites liquids after their treatment in the following ways: heating at 37 ^° C for 48 hours, heating at 60 ^° C for 1 hour, triple freezing and defrosting.

Показано, что при всех методах обработки титры специфических антител, определенные методом ЖАК-22, в культуральной и асцитной жидкости не менялись. It was shown that with all processing methods, the titers of specific antibodies determined by the ZhAK-22 method did not change in the culture and ascites fluids.

Пример 5. Определение HB_sAg в растворах.Example 5. Determination of HB _s Ag in solutions.

МКА HBSV-3, очищенные методом аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка, конъюгируют с пероксидазой хрена. В лунках полистироловых планшетов сорбируют очищенные МКА HBSV-3 из раствора ЭФР, содержащего МКА в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи; места неспецифического связывания блокируют 0,1%-ным раствором казеина в ЭФР, отмывают трижды водой и добавляют HB_sAg в серии 3-кратных разведений в концентрации от 100 до 0,01 нг в объеме 100 мкл и конъюгат МКА HBSV-3 с пероксидазой хрена в разведении 1/1000 в объеме 50 мкл на 3 ч при 43^oC. Реакцию проявляют как описано выше. Положительной считают реакцию, когда значение экстинкции на 492 нм превышает значение экстинкции для контрольной лунки (без HB_sAg) на 0,04 о.е. Метод позволяет определять до 0,3 нг/мл HB_sAg в растворе.HBSV-3 MCAs, purified by affinity chromatography on Staphylococcus aureus Protein A, are conjugated to horseradish peroxidase. In the wells of polystyrene plates, purified HBSV-3 MCAs are sorbed from an EGF solution containing 10 μg / ml MCA overnight; nonspecific binding sites are blocked with 0.1% casein in EGF, washed three times with water and HB _s Ag is added in a series of 3-fold dilutions at a concentration of 100 to 0.01 ng in a volume of 100 μl and HBSV-3 conjugate with peroxidase horseradish in a dilution of 1/1000 in a volume of 50 μl for 3 hours at 43 ^o C. The reaction is shown as described above. A reaction is considered positive if the extinction value at 492 nm exceeds the extinction value for the control well (without HB _s Ag) by 0.04 p.u. The method allows determination of up to 0.3 ng / ml HB _s Ag in solution.

Штамм отличается от других близких штаммов следующей совокупностью признаков: продуцируемые им МКА реагируют в ИФА со следующими вариантами HB_sAg: плазматическим из сыворотки переболевших людей, генноинженерными осповакцинными adw и ayw серотипов; связывание МКА HBSV-3 с HB_sAg подавляется МКА ЖАК-22, но связывание МКА ЖАК-22 с HB_sAg не подавляется МКА HBSV-3, МКА не реагируют с HB_sAg, денатурированным 2-меркаптоэтанолом; следовательно МКА комплементарны конфармационной эпитопе на группоспецифической "а" антигенной детерминанте молекулы HB_sAg (этот участок а-детерминанты молекулы HB_sAg обозначается С).The strain differs from other similar strains in the following set of features: the MABs produced by it react in ELISA with the following HB _s Ag variants: plasma from the serum of ill people, genetically engineered vaccinia adw and ayw serotypes; the binding of HBSV-3 MAB to HB _s Ag is suppressed by JAC-22 MCA, but the binding of HACV-22 MAB to HB _s Ag is not inhibited by HBSV-3 MAB, MAB does not react with HB _s Ag denatured by 2-mercaptoethanol; therefore, MCAs are complementary to the confirmation epitope on the group-specific "a" antigenic determinant of the HB _s Ag molecule (this region of the a-determinant of the HB _s Ag molecule is denoted by C).

МКА относятся к IgG1, могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка с высоким выходом (96%), обладают высокой стабильностью при хранении в растворах и сорбировании на пластике, клетки обладают отличными ростовыми характеристиками, стабильны по продукции МКА (срок наблюдения около 30 пассажей), хорошо прививаются животным и дают хороший выход асцитной жидкости на мышь (1,5 2 мл) с содержанием специфических антител (5 10 мг/мл) и с высокими титрами специфических антител в ИФА (10⁵), МКА пригодны для выявления HB_sAg в растворах, сыворотке людей и сорбированного на пластике.MCAs belong to IgG1, can be purified by affinity chromatography on protein A of Staphylococcus aureus with high yield (96%), they are highly stable when stored in solutions and adsorbed on plastic, cells have excellent growth characteristics, and are stable for MCA production (observation period about 30 passages), vaccinate well in animals and give a good yield of ascitic fluid per mouse (1.5 to 2 ml) containing specific antibodies (5 10 mg / ml) and with high titers of specific antibodies in ELISA (10 ⁵ ), MCAs are suitable for detecting HB _s Ag in solutions, human serum and adsorbed on plastic.

Перечисленные свойства позволяют использовать штамм HBSV-3 для производства диагностических тест-систем. These properties allow the use of strain HBSV-3 for the production of diagnostic test systems.

Источники информации
1. Кущ А. А. Момот А.М. Шумай Е.П. и др. Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В, Вопросы вирусологии, 1987, N 4, с. 448 451.Sources of information
1. Kushch A. A. Momot A.M. Shumai E.P. and others. Obtaining and characterization of hybridomas producing monoclonal antibodies to the surface antigen of hepatitis B virus, Questions of Virology, 1987, N 4, p. 448,451.

2. Жданов В.М. Кущ А.А. Момот А.М. и др. Свойства моноклональных антител, взаимодействующих с детерминантами поверхностного антигена вируса гепатита В, Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, N 12, с 37 40. 2. Zhdanov V.M. Kushch A.A. Momot A.M. et al. Properties of monoclonal antibodies interacting with determinants of the hepatitis B virus surface antigen, Molecular Genetics, Microbiology and Virology, 1986, N 12, p 37 40.

3. Кущ А. А. Момот А.М. и др. Сравнения различных тест-систем для радиоиммунологического определения поверхностного антигена вируса гепатита В с использованием моноклональных антител, Вопросы вирусологии, 1987, N 5, с. 544 -548. 3. Kushch A. A. Momot A. M. et al. Comparisons of various test systems for radioimmunological determination of hepatitis B virus surface antigen using monoclonal antibodies, Issues of Virology, 1987, N 5, p. 544-548.

4. Воробьев С.М. Симонов В.И. Кущ А.А. Использование моноклональных антител для иммуноферментного определения поверхностного антигена вируса гепатита В, Биотехнология, 1987, N 6, с. 720 724. 4. Vorobyov S.M. Simonov V.I. Kushch A.A. The use of monoclonal antibodies for enzyme immunoassay to determine the surface antigen of hepatitis B virus, Biotechnology, 1987, N 6, p. 720 724.

5. Wands J.R. Zurawski V.R. High affinity monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen (HB_sAg) produced by somatic cell hybrids, Gastroenterology, 1981, v. 80, p. 225 232.5. Wands JR Zurawski VR High affinity monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen (HB _s Ag) produced by somatic cell hybrids, Gastroenterology, 1981, v. 80, p. 225,232.

6. Wands J.R. et al. Signature analisis of hepatitis B viral antigenic structure analisis by monoclonal radioimmunoassays, PNAS USA, 1984, v. 81, p. 2237 2241. 6. Wands J.R. et al. Signature analisis of hepatitis B viral antigenic structure analisis by monoclonal radioimmunoassays, PNAS USA, 1984, v. 81, p. 2237 2241.

7. Nakane P.K. and Kawaoi A. Histochem. Cytochem. 1974, v. 22, p. 1084. 7. Nakane P.K. and Kawaoi A. Histochem. Cytochem. 1974, v. 22, p. 1084.

8. Ey P.L. Prowse S.J. and Genkin C.R. Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose, Immunoohemistry, v. 15, p. 429 436. 8. Ey P.L. Prowse S.J. and Genkin C.R. Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose, Immunoohemistry, v. 15, p. 429,436.

Claims (1)

Штамм гибридных культивируемых клеток животного Mus musculus L. ВСКК(II) N 627Д продуцент моноклональных антител к а-детерминанте поверхностного антигена вируса гепатита В. The strain of hybrid cultured cells of the animal Mus musculus L. VSCC (II) N 627D producer of monoclonal antibodies to the α-determinant of the hepatitis B surface antigen.