RU2525663C1 - STRAIN OF HYBRID CULTURED ANIMAL CELLS Mus musculus 2F9-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR LYSOSTAPHIN AND INHIBITING ITS LYTIC ACTIVITY - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: new strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus 2F9 - producer of monoclonal antibodies specific for lysostaphin inhibiting its lytic activity and suitable for its quantitation is proposed. High-affinity monoclonal antibodies (mAb) of hybridoma 2F9 enables to determine lysostaphin in the samples to the concentrations of 0.8 ng/ml. The mAb of hybridoma 2F9 can be used to study the structural and functional properties of lysostaphin and quality control of preparations based on lysostaphin.

EFFECT: improved properties.

3 dwg, 1 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к лизостафину.The invention relates to biotechnology and can be used to obtain monoclonal antibodies (MCAs) to lysostaphin.

Лизостафин - цинк зависимая глицил-глициновая эндопептидаза, продуцируемая клетками Staphylococcus simulans, является специфичной для бактерий вида Staphylococcus. aureus. Молекулярный вес лизостафина - 27 кД. Лизостафин разрушает клеточную стенку бактерий S. aureus. Лизостафин не токсичен и слабо иммуногенен для животных и рассматривается как перспективный компонент антибактериальных препаратов для лечения инфекций, вызываемых стафилококками, в частности для лечения эндокардитов, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами S. aureus. Лизостафин - единственный препарат, способный разрушать биопленки бактерий S. aureus и S. epidermidis. Лизостафин активен против всех антибиотикоустойчивых штаммов патогенных стафилококков, включая MRSA-штаммы, и по эффективности превосходит другие противостафилококковые биологические препараты - бактериофаги, бактериоцины и фаговые эндолизины.Lysostaphin, a zinc-dependent glycyl-glycine endopeptidase produced by Staphylococcus simulans cells, is specific for bacteria of the Staphylococcus species. aureus. The molecular weight of lysostaphin is 27 kD. Lysostaphin destroys the cell wall of S. aureus bacteria. Lysostaphin is non-toxic and weakly immunogenic for animals and is considered as a promising component of antibacterial drugs for the treatment of infections caused by staphylococci, in particular for the treatment of endocarditis caused by antibiotic-resistant S. aureus strains. Lysostaphin is the only drug that can destroy the biofilms of bacteria S. aureus and S. epidermidis. Lysostaphin is active against all antibiotic-resistant strains of pathogenic staphylococci, including MRSA strains, and is superior in effectiveness to other anti-staphylococcal biological preparations - bacteriophages, bacteriocins and phage endolysins.

Рекомбинантный лизостафин практически не отличается по свойствам от активной формы лизостафина из бактерий S. simulans. Все клинические штаммы S. aureus чувствительны к рекомбинантному лизостафину с МИК от 0,03 до 2 мкг/мл (Bastos М С F, Coutinho В G and Coelho M L V Lysostaphin: A Staphylococcal Bacteriolysin with Potential Clinical Applications Pharmaceuticals 2010, 3, 1139-1161).Recombinant lysostaphin practically does not differ in properties from the active form of lysostaphin from bacteria S. simulans. All clinical strains of S. aureus are sensitive to recombinant lysostaphin with a MIC from 0.03 to 2 μg / ml (Bastos M C F, Coutinho B G and Coelho MLV Lysostaphin: A Staphylococcal Bacteriolysin with Potential Clinical Applications Pharmaceuticals 2010, 3, 1139-1161 )

Имеются данные о получении гибридом (A1G5A1, A2C1D10 и L1F3), моноклональные антитела которых специфичны к лизостафину и использовались для его очистки с помощью аффинной хроматографии. Известна также гибридома LTN1, продуцирующая МКА к фрагменту лизостафина между 3 и 13 аминокислотами: пептиду (THEHSAQWLN). МКА LTN1 специфически связываются с продуктом гидролиза лизостафина размером 17 кДа (Huang J., Wu H., Zhang J., Huang O. Purification of recombinant lysostaphin by monoclonal antibody affinity chromatography. [Статья на китайском языке] Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 2009 Jan; 25(1): 147-51).There is evidence of obtaining hybridomas (A1G5A1, A2C1D10 and L1F3), the monoclonal antibodies of which are specific for lysostaphin and were used to purify it using affinity chromatography. A hybridoma LTN1 is also known that produces MAB to a lysostaphin fragment between 3 and 13 amino acids: a peptide (THEHSAQWLN). MCAs LTN1 specifically bind to a 17 kDa lysostaphin hydrolysis product (Huang J., Wu H., Zhang J., Huang O. Purification of recombinant lysostaphin by monoclonal antibody affinity chromatography. [Chinese article] Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 2009 Jan; 25 (1): 147-51).

Сведений о гибридомах-продуцентах МКА, ингибирующих литическую активность лизостафина, в доступной литературе нет.There is no information on hybridoma-producing MCAs that inhibit the lytic activity of lysostaphin.

Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к лизостафину, подавляющие его антистафилакокковую активность и пригодные для количественного определения лизостафина.The objective of the invention is to obtain a strain of hybrid cultured cells producing monoclonal antibodies specific for lysostaphin, inhibiting its antistaphylococcal activity and suitable for the quantitative determination of lysostaphin.

Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к лизостафину, ингибирующих его литическую активность и пригодных для его количественного определения.The problem is solved by the fact that a new strain of hybrid cultured animal cells of Mus musculus 2F9 animals is proposed - a producer of monoclonal antibodies specific for lysostaphin, inhibiting its lytic activity and suitable for its quantitative determination.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - ОБОЛЕНСК», коллекционный номер - Н-29. Депозитор: Федеральное бюджетное учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ).The strain is deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM - OBOLENSK", collection number - H-29. Depositor: Federal State Institution of Science "State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology" of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-being (FBUN SSC PMB).

Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным лизостафином в течение 56 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 4000 (Merk, Германия) (Nowinski R.C, Lostrom M.E., Tam M.R., Stone M.R. and Burnette W.N. The isolation of hybrid lines producing monoclonal antibodies against the p 15 (E) protein of ceotropic murine Leukemia viruses. Virology, 1979, 93, 111-126.). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.The hybridoma strain is obtained by immunizing BALB / c mice with recombinant lysostaphin for 56 days. On the third day after the last booster injection, splenocytes of immune mice (10 ⁸ cells) are hybridized with cells of mouse myeloma PZ-X63 Ag / 8-653 (10 ⁷ cells). Polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 (Merk, Germany) (Nowinski RC, Lostrom ME, Tam MR, Stone MR and Burnette WN The isolation of hybrid lines producing monoclonal antibodies against the p 15 (E) protein of ceotropic murine is used as a fusion agent Leukemia viruses. Virology, 1979, 93, 111-126.). After hybridization, selection, screening, cloning, and cryopreservation of the hybridoma are performed.

Характеристика штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 (гибридомы 2F9).Characterization of a strain of hybrid cultured animal cells of Mus musculus 2F9 animals (hybridomas 2F9).

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.Morphological characteristics. The hybrid cell culture consists of rounded cells weakly attached to the substrate with the size of the original myeloma cell.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы 2F9 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда DMEM или RPMI - 1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2 - 1:3. Посевная концентрация клеток составляет 10⁵ в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 10⁵ на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).Cultural properties. The cultivation of the hybridoma strain 2F9 is carried out at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is DMEM or RPMI - 1640 medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 50 μg / ml gentamicin. Cells are cultured as a stationary suspension in Costar plastic mattresses. Passage of hybridoma cells is carried out 2 times a week with a dilution ratio of 1: 2 - 1: 3. The inoculum concentration of cells is 10 ⁵ in 1 ml of medium. The maximum concentration of hybrid cells during cultivation is 10 ⁵ per 1 ml of medium. The hybrid clone does not lose the ability to synthesize antibodies at 10 passages in vitro (observation period).

Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 10⁶ на одну мышь при первичном введении и 10⁵ на одну мышь при вторичном введении. За 14 суток до введения клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл 2,6,10,14-тетраметилпентодекана (пристана). Иммуноасцитическая жидкость образуется на 14-20 сутки в объеме 3-5 мл. Синтез МКА, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).The cultivation of hybridomas in the body of the animal. Animal species - inbred mice of the BALB / c line. The dose of cells during vaccination is 10 ⁶ per mouse during the initial administration and 10 ⁵ per mouse during the secondary administration. 14 days before the introduction of hybridoma cells, mice were injected intraperitoneally with 0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentodecane (pristan). Immunoascitic fluid is formed on the 14-20th day in the volume of 3-5 ml. The synthesis of MCA produced by the hybridoma is determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Характеристика полезного продукта. Гибридома 2F9 продуцирует специфичные моноклональные антитела к лизостафину, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:1000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) 1:100000. Моноклональные антитела из КЖ и ПАЖ выделяют с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на белок A или G сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.The characteristic of a useful product. Hybridoma 2F9 produces specific monoclonal antibodies to lysostaphin, the titer of which is 1: 1000 in culture fluid (QOL), and 1: 100000 in immuno-ascitic fluid (IAG). Monoclonal antibodies from QOL and PAH are isolated by precipitation with ammonium sulfate followed by affinity chromatography on protein A or G sepharose. The homogeneity of the isolated antibodies is checked by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 2-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения)Strain productivity. MCA production in the cultivation medium is 20-50 μg / ml, in ascitic fluid - 2-4 mg / ml. MCA production in the culture fluid is maintained for 10 passages (observation period) and 5 passages when cultured in the form of ascites tumors in mice (observation period)

Контаминация штамма. Контаминанты, включая бактерии, дрожжи, грибы, в гибридной линии не выявлены. Наличие микроплазм и вирусов в гибридоме не определяли.Strain contamination. Contaminants, including bacteria, yeast, fungi, were not detected in the hybrid line. The presence of microplasmas and viruses in the hybridoma was not determined.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.Cryopreservation. The freezing medium contains fetal calf serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%.

Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре - 70°C и затем опускают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°C. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 65-75%.Cryopreservation and heating mode. Hybrid cells are introduced into cryovials, placed in a foam container with a wall thickness of at least 1 cm and left for 16-24 hours in a kelvinator at a temperature of -70 ° C and then immersed in liquid nitrogen. Defrosting is carried out quickly in a water bath at a temperature of 37 ° C. Ampoules contain 1.0 ml of cryoprotective medium with a concentration of hybrid cells of 10 ⁶ . The viability of restored hybridomas after cryopreservation is 65-75%.

Свойства полезного продукта. Гибридома 2F9 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к IgG1 подклассу иммуноглобулинов мыши. МКА специфичны к нативному и рекомбинантному лизостафину, имеют константу аффинности 1,72×10¹⁰ M^-1 (Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J. Immunol. Methods, 1987, 100, 173-179.), подавляют антистафилококковую активность лизостафина и пригодны для его количественного определения.Properties of a useful product. Hybridoma 2F9 produces monoclonal antibodies belonging to the IgG1 subclass of mouse immunoglobulins. MCAs are specific for native and recombinant lysostaphin and have an affinity constant of 1.72 × 10 ¹⁰ M ^-1 (Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J. Immunol. Methods, 1987, 100, 1987, 100 , 173-179.), Inhibit the antistaphylococcal activity of lysostaphin and are suitable for its quantitative determination.

Доказательства свойств МКА гибридомы 2F9 представлены на следующих фигурах:Evidence of the properties of MCA hybridomas 2F9 are presented in the following figures:

Фиг.1. Твердофазный иммуноферментный анализ для определения лизостафина в анализируемом образце с помощью моноклональных антител гибридомы 2F9.Figure 1. Enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of lysostaphin in the analyzed sample using monoclonal antibodies hybridoma 2F9.

Фиг.2. Подавление роста культуры S. aureus на плотной питательной среде лизостафином в присутствии МКА гибридом 1F5, 2F9 и 2G10.Figure 2. Inhibition of S. aureus culture growth on solid nutrient medium with lysostaphin in the presence of 1F5, 2F9 and 2G10 hybridomas.

Фиг.3. Иммуноблот моноклональных антител гибридом с препаратами лизостафина.Figure 3. Immunoblot of monoclonal antibodies hybridomas with lysostaphin preparations.

Пример 1. Получение гибридомы 2F9.Example 1. Obtaining hybridoma 2F9.

Иммунизацация.Immunization

Мышей линии BALB/c иммунизируют препаратом рекомбинантного лизостафина по схеме:BALB / c mice are immunized with a recombinant lysostaphin preparation according to the scheme:

- подкожное введение мышам 200 мкг лизостафина в 4 точки в полном адъюванте Фрейнда;- subcutaneous administration to mice of 200 μg of lysostaphin at 4 points in complete Freund's adjuvant;

- через 28 суток повторное введение мышам 100 мкг лизостафина в 4 точки в неполном адъюванте Фрейнда;- after 28 days, reintroduction to mice of 100 μg of lysostaphin at 4 points in incomplete Freund's adjuvant;

- через 28 суток внутривенная инъекция мышам 20 мкг лизостафина в физиологическом растворе.- after 28 days, an intravenous injection in mice of 20 μg of lysostaphin in physiological saline.

Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после инъекции лизостафина. Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью твердофазного ИФА.Blood from immune mice is taken on the third day after lysostaphin injection. The titers of specific antibodies in animal sera are determined using solid-phase ELISA.

Гибридизация.Hybridization.

Через 3 суток извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 10⁸ спленоцитов мыши с 10⁷ клетками миеломной линии РЗ-X63-Ag8.653 в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000 (Merk, Германия) в течение 1 минуты.After 3 days, the mouse spleen was removed and 10 ⁸ mouse splenocytes were hybridized with 10 ⁷ cells of the PZ-X63-Ag8.653 myeloma line in the presence of 1 ml of a 50% solution of polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 (Merk, Germany) for 1 minute.

Селекция.Selection.

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде DMEM "Sigma" с 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.After washing the polyethylene glycol, the cells were plated on 96-well plates on a layer of peritoneal macrophages taken from BALB / c mice. Selection of hybrid cells is carried out on a selective medium containing hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT). After 21 days, aminopterin is removed from the medium. Subsequently, the cultivation is carried out on DMEM "Sigma" with 15% fetal calf serum, 2 mm / L-glutamine, 50 μg / ml gentamicin.

Скрининг гибридных клонов.Screening of hybrid clones.

Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют твердофазный иммуноферментный метод.For the selection of positive hybrid clones producing MAB, use the enzyme-linked immunosorbent assay.

Для проведения ИФА в лунки 96-луночной полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 500 нг лизостафина, приготовленного на 0,01 М карбонатном буфере pH 9,6 в объеме 100 мкл и затем выдерживают при температуре 6°C в течение 18 ч. Лунки планшета отмывают забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Тв). Вносят в лунки по 100 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности и инкубируют при температуре 37°С в течение 45 мин. Три раза отмывают ЗФР-Тв и вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл. Панель инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ЗФР-Тв и добавляют в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 40 минут, затем 5 раз отмывают лунки раствором ЗФР-Тв и добавляют в лунки по 100 мкл тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 2 М серной кислоты. Планшеты сканируют на планшетном ридере Пикон (Россия), измеряя поглощение при 450 нм.For ELISA, 500 ng of lysostaphin, prepared in 0.01 M carbonate buffer pH 9.6 in a volume of 100 μl, is added to the wells of a 96-well polystyrene plate for enzyme-linked immunosorbent assay and then kept at 6 ° C for 18 hours. washed with a buffered saline solution containing 0.05% Tween-20 (PBS-Tw). Pipette 100 μl of a 0.5% solution of bovine serum albumin (BSA), tested for the absence of peroxidase activity, and incubated at 37 ° C for 45 minutes. Wash PBS-Tv three times and add supernatant of culture fluid to the wells in a volume of 100 μl. The panel is incubated at 37 ° C for 1 hour. After this, the wells of the tablet are washed three times with PBS-Tv solution and antibodies against mouse immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase in working dilution are added to the wells. The plate is incubated at 37 ° C for 40 minutes, then the wells are washed 5 times with PBS-TV solution and 100 μl of tetramethylbenzidine are added to the wells. The reaction is stopped by adding 50 μl of 2 M sulfuric acid to the wells. The tablets are scanned on a Picon tablet reader (Russia), measuring absorbance at 450 nm.

Клонирование.Cloning.

Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных ммакрофагов мыши из расчета 10⁴ клеток на лунку. Скрининг клонов проводят твердофазным ИФА, как описано выше.Cloning of hybrid cells is carried out by the method of limiting dilutions in 96-well plates on a layer of mouse peritoneal macrophages at the rate of 10 ⁴ cells per well. Clone screening is performed by solid phase ELISA as described above.

Культивирование.Cultivation.

Клоны гибридомы культивируют при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда DMEM или RPMI - 1640, содержащая 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.Hybridoma clones are cultured at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is DMEM or RPMI - 1640 medium containing 15% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 50 μg / ml gentamicin.

Криоконсервация.Cryopreservation.

Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной сыворотки теленка - 90% и диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.Hybridoma clones are cryopreserved on a freezing medium consisting of calf embryonic serum - 90% and dimethyl sulfoxide - 10%. Hybridoma clones are stored in Dewar vessels with liquid nitrogen.

Пример 2. Определение количества лизостафина в твердофазном иммуноферментном анализе.Example 2. Determination of the amount of lysostaphin in enzyme-linked immunosorbent assay.

Для проведения твердофазного ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят лизостафин в концентрациях 4 мкг, 800 нг, 160 нг, 32 нг, 6,4 нг, 3,2 нг, 1,6 нг и 0,8 нг в мл 0,01 М карбонатного буфера (pH 9,6) в объеме 100 мкл и выдерживают при температуре 6°C в течение 16 часов. Последующие стадии анализа проводят аналогично стадиям, описанным для скрининга гибридных клонов. Моноклональные антитела вносят в лунки в объеме 100 мкл с концентрацией 5 мкг/мл. Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.To conduct a solid-phase ELISA, lysostaphin at a concentration of 4 μg, 800 ng, 160 ng, 32 ng, 6.4 ng, 3.2 ng, 1.6 ng and 0.8 ng are added to the wells of a 96-well polystyrene plate for enzyme-linked immunosorbent assay ml of 0.01 M carbonate buffer (pH 9.6) in a volume of 100 μl and incubated at a temperature of 6 ° C for 16 hours. The subsequent steps of the analysis are carried out similarly to the steps described for screening hybrid clones. Monoclonal antibodies are added to the wells in a volume of 100 μl with a concentration of 5 μg / ml. Negative control - 1/1000 dilution of intact mouse serum.

В ИФА моноклональные антитела гибридомы 2F9 специфически взаимодействуют с лизостафином и определяют до 0,80 нг/мл белка в анализируемом образце (фиг.1).In ELISA, monoclonal antibodies of hybridoma 2F9 specifically interact with lysostaphin and determine up to 0.80 ng / ml of protein in the analyzed sample (figure 1).

Пример 3. Ингибирование литической активности лизостафина в суспензии бактерий стафилококка МКА гибридомы 2F9.Example 3. Inhibition of the lytic activity of lysostaphin in a suspension of bacteria staphylococcus MKA hybridoma 2F9.

Ночную агаровую культуру S. aureus суспендируют в буфере ЗФР. Бактерии инактивируют прогревом суспензии при температуре 80°С в течение 1 час. Прогретую суспензию разводят до мутности, равной оптической плотности 0,32 при длине волны 590 нм.The S. aureus overnight agar culture was suspended in PBS. Bacteria inactivate by heating the suspension at a temperature of 80 ° C for 1 hour. The heated suspension is diluted to a turbidity equal to an optical density of 0.32 at a wavelength of 590 nm.

90 мкл культуральной жидкости гибридом 1F5 и 2F9 смешивают с 10 мкл лизостафина с концентрацией 300 мкг/мл. Смеси инкубируют в течение 1 час при температуре 37°C. После инкубации смеси вносят в 1 мл инактивированной суспензии S. aureus с оптической плотностью 0,32. Реакцию гидролиза клеток стафилококка проводят в течение 1 час при температуре 37°C. После реакции суспензию разводят ЗФР в два раза и измеряют оптическую плотность (таблица 1).90 μl of culture fluid hybrid 1F5 and 2F9 are mixed with 10 μl of lysostaphin at a concentration of 300 μg / ml. The mixture is incubated for 1 hour at a temperature of 37 ° C. After incubation, the mixture is added to 1 ml of an inactivated suspension of S. aureus with an optical density of 0.32. The hydrolysis of staphylococcus cells is carried out for 1 hour at a temperature of 37 ° C. After the reaction, the suspension was diluted with PBS twice and the absorbance was measured (table 1).

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2F9, в отличие от МКА гибридомы 1F5 подавляют литическое действие лизостафина в инактивированной суспензии бактерий S. aureus (таблица 1).Monoclonal antibodies produced by 2F9 hybridoma, in contrast to 1F5 mAb, inhibit the lytic effect of lysostaphin in an inactivated suspension of S. aureus bacteria (table 1).

Пример 4. Ингибрование подавления роста культуры стафилококка на плотной питательной среде лизостафином МКА гибридомы 2F9.Example 4. Inhibition of growth inhibition of staphylococcus culture on a solid nutrient medium with lysostaphin MCA hybridoma 2F9.

Ночную агаровую культуру S. aureus суспендируют в ЗФР до мутности, равной стандарту оптической плотности 10 единиц. Полученную суспензию разводят в 10 раз ЗФР и 0,2 мл разведенной суспензии равномерно наносят на питательный агар LA, залитый в чашку Петри. Толщина агара - 15 мм. 200 мкл культуральной жидкости гибридом 1F5, 2F9 и 2G10 смешивают с 20 мкл лизостафина с концентрацией 300 мкг/мл. Полученную смесь последовательно разводят двукратно культуральной жидкостью гибридом до концентрации лизостафина 15 и 7,5 мкг/мл. Смеси инкубируют в течение 1 час при температуре 37°C.После инкубации в пробирки титрования лизостафина вносят бумажные фильтры и после их смачивания наносят на агар LA с засеянной культурой стафилококка. Чашки инкубируют 18 ч при температуре 37°C.The overnight agar culture of S. aureus was suspended in PBS until a turbidity equal to the optical density standard of 10 units. The resulting suspension was diluted 10 times with PBS and 0.2 ml of the diluted suspension was uniformly applied to nutrient agar LA, poured into a Petri dish. The thickness of the agar is 15 mm. 200 μl of culture fluid hybridomas 1F5, 2F9 and 2G10 are mixed with 20 μl of lysostaphin at a concentration of 300 μg / ml. The resulting mixture was successively diluted twice with hybridoma culture fluid to a concentration of lysostaphin 15 and 7.5 μg / ml. The mixtures are incubated for 1 hour at a temperature of 37 ° C. After incubation, paper filters are added to the lysostaphin titration tubes and, after wetting, they are applied to LA agar with seeded staphylococcus culture. The plates are incubated for 18 hours at 37 ° C.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2F9 в отличие от МКА гибридомы 1F5 и 2G10 подавляют бактерицидное действие лизостафина при выращивании бактерий S. aureus на плотной питательной среде (Фиг.2).Monoclonal antibodies produced by 2F9 hybridoma, in contrast to the 1A5 and 2G10 hybridomas, inhibit the bactericidal effect of lysostaphin when growing S. aureus bacteria on a solid nutrient medium (Figure 2).

Пример 5. Иммуноблот.Example 5. Immunoblot.

Для проверки специфичности МКА гибридомы 2F9 к рекомбинантному лизостафину и лизостафину, продуцируемуму бактериями S. Simulans, проводят СДС-электрофорез белков в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 2 часов при 220 В, 20 мА. Белки из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-P) в течение 1 час при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в 20 мМ трис-буфер, pH 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран и приготовления растворов МКА и конъюгата антител против иммуноглобулинов G мыши с пероксидазой хрена используют 20 мМ трис-буфер, pH 7,4, содержащий 150 мМ NaCl и 0,5% твин 20. Блокированные и промытые мембраны разрезают на полосы, содержащие адсорбированные фракции препаратов лизостафина, и инкубируют каждую полосу отдельно в растворах МКА с концентрацией 1 мкг/мл в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее, после промывки буфером полоски обрабатывают раствором антимышиных антител конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают буфером и окрашивают диаминобензидином с использованием 0,5 мг/мл 3.3′-диаминобензидина с 0,1 мг/мл NiCl₂, 0,1 мг/мл CoCl₂, 0,03% H₂O₂ в ЗФР pH 7,2. Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.To test the specificity of the 2F9 MCA hybridoma to recombinant lysostaphin and lysostaphin produced by the bacteria S. Simulans, SDS protein electrophoresis was performed on 10% polyacrylamide gel (PAG) for 2 hours at 220 V, 20 mA. PAAG proteins are transferred onto a nitrocellulose membrane (Hybond-P) for 1 hour at a current of 380 mA. After the transfer is complete, the membrane is blocked by immersing in a 1% BSA solution in 20 mM Tris buffer, pH 7.4 for 1 hour at room temperature. For washing the membranes and preparing solutions of MCA and the conjugate of antibodies against immunoglobulins G mice with horseradish peroxidase, 20 mM Tris buffer, pH 7.4, containing 150 mM NaCl and 0.5% Tween 20. Blocked and washed membranes are cut into strips containing adsorbed fractions of lysostaphin preparations, and each lane is incubated separately in MCA solutions with a concentration of 1 μg / ml for 1 hour at a temperature of 37 ° C. Further, after washing with a buffer, the strips are treated with a solution of anti-mouse antibodies conjugated with horseradish peroxidase (Sigma) in working dilution under the same conditions, washed with a buffer and stained with diaminobenzidine using 0.5 mg / ml 3.3′-diaminobenzidine with 0.1 mg / ml NiCl ₂ , 0.1 mg / ml CoCl ₂ , 0.03% H ₂ O ₂ in PBS pH 7.2. The reaction is stopped by washing with distilled water.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2F9, по данным иммуноблота взаимодействуют с нативным и рекомбинантным лизостафином (фиг.3). Не ингибирующие литическую активность лизостафина МКА (гибридомы 1F5 и 2G10) выявляют помимо основной полосы лизостафина (27 кД) три дополнительные полосы (23, 18 и 16 кД) у рекомбинантного белка и полосу 23 кД у природного белка, а МКА 2F9 - три дополнительные полосы (21, 19 и 18 кД) как у рекомбинантного, так и у природного белка.Monoclonal antibodies produced by 2F9 hybridoma, according to the immunoblot, interact with native and recombinant lysostaphin (Fig. 3). Non-inhibiting lytic activity of lysostaphin MCA (hybridomas 1F5 and 2G10), in addition to the main band of lysostaphin (27 kD), three additional bands (23, 18 and 16 kD) in the recombinant protein and the 23 kD band in the natural protein are detected, and MCA 2F9 - three additional bands (21, 19 and 18 kDa) in both recombinant and natural proteins.

Таким образом, на основании представленных примеров МКА гибридомы 2F9 специфичны к лизостафину и ингибируют его литическую активность. Высокоаффинные МКА гибридомы 2F9 позволяют определять лизостафин в образцах до концентраций 0,8 нг/мл. МКА гибридомы 2F9 могут быть использованы для изучения структурно-функциональных свойств лизостафина и контроля качества препаратов на основе лизостафина.Thus, based on the presented examples, MCA 2F9 hybridomas are specific for lysostaphin and inhibit its lytic activity. High affinity 2F9 mAb hybridomas allow the determination of lysostaphin in samples to concentrations of 0.8 ng / ml. MCA hybridomas 2F9 can be used to study the structural and functional properties of lysostaphin and quality control of drugs based on lysostaphin.

Таблица 1Table 1 Ингибирование литической активности лизостафина МКА в суспензии бактерий S. aureus.Inhibition of the lytic activity of lysostaphin MCA in a suspension of bacteria S. aureus. Состав смесиMixture composition Оптическая плотностьOptical density культуральная жидкость гибридомы 2F9, суспензия бактерий S. aureushybridoma culture fluid 2F9, suspension of bacteria S. aureus 0,160.16 культуральная жидкость гибридомы 2F9, лизостафин, суспензия бактерий S. aureushybridoma culture fluid 2F9, lysostaphin, S. aureus bacterial suspension 0,150.15 культуральная жидкость гибридомы 1F5, суспензия бактерий S. aureushybridoma culture fluid 1F5, S. aureus bacterial suspension 0,160.16 культуральная жидкость гибридомы 1F5, лизостафин, суспензия бактерий S. aureushybridoma culture fluid 1F5, lysostaphin, suspension of bacteria S. aureus 0,120.12 Питательная среда для гибридом, суспензия бактерий S. aureusHybridoma culture medium, S. aureus bacterial suspension 0,160.16 Питательная среда для гибридом, лизостафин, суспензия бактерий S. aureusHybridoma culture medium, lysostaphin, S. aureus bacterial suspension 0,120.12

Claims (1)

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к лизостафину, ингибирующих его литическую активность и пригодных для количественного определения лизостафина, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - ОБОЛЕНСК», коллекционный номер Н-29. The strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus 2F9, a producer of monoclonal antibodies specific for lysostaphin, inhibiting its lytic activity and suitable for the quantitative determination of lysostaphin, was deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM - OBOLENSK", collection number H-29.

Images