RU2768838C1 - Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii - Google Patents
Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii Download PDFInfo
- Publication number
- RU2768838C1 RU2768838C1 RU2020142296A RU2020142296A RU2768838C1 RU 2768838 C1 RU2768838 C1 RU 2768838C1 RU 2020142296 A RU2020142296 A RU 2020142296A RU 2020142296 A RU2020142296 A RU 2020142296A RU 2768838 C1 RU2768838 C1 RU 2768838C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- shiga
- toxin
- strain
- hybrid
- type
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, биоинженерии, биохимии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКАТ), применяемых в иммуноферментном анализе для выявления шигаподобного токсина II типа.The invention relates to the field of biotechnology, bioengineering, biochemistry and can be used to obtain monoclonal antibodies (MAB) used in enzyme immunoassay to detect type II Shiga-like toxin.
Шигаподобные токсины, наряду с шига-токсином, относятся к семейству токсинов, продуцируемых рядом энтеробактерий, и подразделяются на I и II типы. Природными продуцентами шигаподобных токсинов являются шига-токсинпродуцирующие штаммы Escherichia coli (STEC) [Melton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx). Classification, structure, and Function. Microbiol Spectr. 2014; 2 (2): 23].Shiga-like toxins, along with Shiga toxin, belong to a family of toxins produced by a number of enterobacteria and are subdivided into types I and II. Shiga toxin-producing strains of Escherichia coli (STEC) [Melton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx). classification, structure, and function. Microbiol Spectr. 2014; 2(2):23].
Представители семейства шигаподобных токсинов имеют сходную молекулярную структуру, для которой характерно наличие одной субъединицы А (~32 кДа) и пяти субъединиц В (~7,7 кДа каждая). В субъединице А выделяют также связанные между собой дисульфидной связью фрагменты А1 и А2, которые разделяются после проникновения в клетку-мишень, после чего фрагмент А1 блокирует синтез белка в клетке [Szewczak А.А., Moore Р.В., Chan Y.L. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90: 9581-9585].Members of the Shiga-like toxin family have a similar molecular structure characterized by the presence of one A subunit (~32 kDa) and five B subunits (~7.7 kDa each). In subunit A, fragments A1 and A2, which are also interconnected by a disulfide bond, are also isolated, which are separated after penetration into the target cell, after which fragment A1 blocks protein synthesis in the cell [Szewczak A.A., Moore R.B., Chan Y.L. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. sci. USA. 1993; 90: 9581-9585].
Шигаподобные токсины оказывают выраженное нейротоксическое действие, нарушая, прежде всего, функционирование центральной нервной системы. Проявляется это синдромом интоксикации и нарушением всех видов обмена, примерно в 5% случаев поражение шигаподобными токсинами приводит к развитию гемолитико-уремического синдрома. Особенно высокий уровень летальности при этом наблюдается у новорожденных детей [Taylor М.С. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23: 1425-1431].Shiga-like toxins have a pronounced neurotoxic effect, primarily disrupting the functioning of the central nervous system. This is manifested by a syndrome of intoxication and a violation of all types of metabolism, in about 5% of cases, damage by shiga-like toxins leads to the development of hemolytic-uremic syndrome. A particularly high level of mortality is observed in newborns [Taylor M.S. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23: 1425-1431].
Среди шигаподобных токсинов наибольшей опасностью обладают представители II типа. Гемолитико-уремический синдром и другие тяжелые системные осложнения у человека регистрируются в подавляющем большинстве случаев при инфекциях, вызванных штаммами Е. coli, продуцирующими шигаподобный токсин II типа [Boerlin, P. Associations between virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli and disease in humans / P.Boerling [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37, № 3. - P. 497-503].Among Shiga-like toxins, representatives of type II are the most dangerous. Hemolytic uremic syndrome and other severe systemic complications in humans are recorded in the vast majority of cases in infections caused by E. coli strains producing Shiga-like toxin type II [Boerlin, P. Associations between virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli and disease in humans / P. Boerling [et al.] // J. Clin. microbiol. - 1999. - Vol. 37, No. 3. - P. 497-503].
Вспышки заболеваний, вызываемых STEC, происходят регулярно. Как правило, частой причиной вспышек является кишечная палочка серотипа 0157. В то же время наиболее известной является вспышка 2011 года в Европе, вызванная кишечной палочкой серотипа О104:Н4. По данным Всемирной организации здравоохранения в результате этой вспышки погибло 53 человека [E.coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. [Электронный ресурс]. URL.: wvm.efsa.europa.eu/en/press/news/ 120711]; [Онищенко Г.Г., Дятлов И.А., Светоч H.B. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia coli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году. Вестник РАМН. 2015; 1: 70-80].Outbreaks of diseases caused by STEC occur regularly. As a rule, E. coli serotype 0157 is a common cause of outbreaks. At the same time, the 2011 outbreak in Europe caused by E. coli serotype O104:H4 is the most famous. According to the World Health Organization, 53 people died as a result of this outbreak [E.coli: Rapid Response in a crisis. European Food Safety Authority. [Electronic resource]. URL: wvm.efsa.europa.eu/en/press/news/120711]; [Onishchenko G.G., Dyatlov I.A., Svetoch H.V. Molecular genetic characterization of Shiga-toxin-producing Escherichia coli isolated during an outbreak of foodborne infection in St. Petersburg in 2013. Bulletin of RAMN. 2015; 1: 70-80].
Для выявления шигаподобных токсинов активно используют иммунохимические средства диагностики. Они представлены как на зарубежном, так и на отечественном рынке. Фирма R-Biopharm AG (Германия) производит и реализует наборы мультиплексного иммунохроматографического анализа для одновременного выявления шигаподобного токсина I и II типов и специфического антигена 0157 - RIDA®QUICK Verotoxin/015 Combi. Этот же производитель предлагает набор RIDASCREEN® Verotoxin для иммуноферментного полу количественного выявления шигаподобных токсинов.Immunochemical diagnostic tools are actively used to detect Shiga-like toxins. They are presented both in foreign and domestic markets. R-Biopharm AG (Germany) manufactures and sells multiplex immunochromatographic assay kits for the simultaneous detection of Shiga-like toxin types I and II and specific antigen 0157 - RIDA®QUICK Verotoxin/015 Combi. The same manufacturer offers the RIDASCREEN® Verotoxin kit for the ELISA semi-quantitative detection of Shiga-like toxins.
Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации (Роспотребнадзор) разработаны и утверждены к применению методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Е. coli, продуцирующих шигаподобные токсины - инфекций в пищевых продуктах - МУК 4.2.2963-11 [МУК 4.2.2963-11 Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры) и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах. Москва, 2011. [Электронный ресурс]. URL.: www.docs.cntd.ru/document/1200094087]. Данные методические указания предусматривают использование диагностических наборов для латекс-агглютинации производства ФБУН «ГНЦ ПМБ» и иммунохроматографических наборов DUOPATH® Verotoxins (Merck Millipore, США).The Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare of the Russian Federation (Rospotrebnadzor) has developed and approved for use guidelines for the laboratory diagnosis of diseases caused by E. coli that produce Shiga-like toxins - infections in food products - MUK 4.2.2963-11 [ MUK 4.2.2963-11 Guidelines for the laboratory diagnosis of diseases caused by Escherichia coli that produce Shiga toxins (STEC cultures) and the detection of pathogens of STEC infections in food products. Moscow, 2011. [Electronic resource]. URL: www.docs.cntd.ru/document/1200094087]. These guidelines provide for the use of diagnostic kits for latex agglutination produced by FBSI "SRC PMB" and immunochromatographic kits DUOPATH® Verotoxins (Merck Millipore, USA).
Для создания современных средств иммунодиагностики оптимальным вариантом является использование МКАТ, которые позволяют повысить чувствительность иммунологических методов благодаря своей высокой специфичности. Другим преимуществом МКАТ является возможность их наработки в препаративных количествах за сравнительно короткий промежуток времени при наличии специфичных гибридных клеточных линий. В России отсутствуют отечественные средства на основе МКАТ для выявления шигаподобного токсина II типа, а перечень проводимых работ в этом направлении крайне ограничен.To create modern immunodiagnostic tools, the best option is to use mAbs, which can increase the sensitivity of immunological methods due to their high specificity. Another advantage of MAbs is the possibility of their production in preparative quantities in a relatively short period of time in the presence of specific hybrid cell lines. In Russia, there are no domestic means based on MCAT for the detection of type II Shiga-like toxin, and the list of ongoing work in this direction is extremely limited.
Техническим результатом предполагаемого изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 365Е11, продуцирующих одноименные мышиные МКАТ к шигаподобному токсину II типа и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления шигаподобного токсина II типа.The technical result of the proposed invention is to obtain a strain of hybrid cultivated animal cells Mus musculus 365E11, producing the same mouse mAb to type II Shiga-like toxin and suitable for designing test systems based on them for detecting type II Shiga-like toxin.
Технический результат достигается тем, что предложен штамм гибридных клеток Mus musculus 365Е11, продуцирующих одноименные мышиные МКАТ к шигаподобному токсину II типа.The technical result is achieved by the proposed strain of hybrid cells Mus musculus 365E11, producing mouse mAbs of the same name to Shiga-like type II toxin.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 365Е11 - продуцент мышиных МКАТ, специфичных к шигаподобному токсину II типа, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под номером 365Е11.The strain of hybrid cultivated animal cells Mus musculus 365E11, a producer of mouse mAbs specific for type II Shiga-like toxin, was deposited in the State Collection of Microorganisms of the Federal State Budgetary Institution “48 Central Research Institute” of the Russian Ministry of Defense under the number 365E11.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 365Е11 получают следующим образом:The strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus 365E11 is obtained as follows:
Препарат шигаподобного токсина II типа выделяют из культуральной жидкости микробной культуры Е. coli RKI № 11 2027 (серотип О104:Н4, из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России), очистку проводят методами гидрофобной, ионообменной и эксклюзионной хроматографии. Чистоту фракций препарата шигаподобного токсина II типа оценивают методом электрофореза в денатурирующих условиях. Специфическую активность препарата шигаподобного токсина контролируют в иммуноферментном и иммунохроматографическом тестах. Концентрацию белка определяют по методу Лоури.The Shiga-like toxin type II preparation is isolated from the culture fluid of the microbial culture E. coli RKI No. 11 2027 (serotype O104:H4, from the State Collection of Microorganisms of the Federal State Budgetary Institution "48 Central Research Institute" of the Ministry of Defense of Russia), purification is carried out by hydrophobic, ion-exchange and size exclusion chromatography. The purity of the Shiga-like type II toxin preparation fractions was assessed by denaturing electrophoresis. The specific activity of the Shiga-like toxin preparation is monitored in enzyme immunoassay and immunochromatographic tests. The protein concentration is determined by the Lowry method.
Мышей линии BALB/c иммунизируют препаратом шигаподобного анатоксина II типа. Иммунизацию проводят трехкратно, с интервалом 7 суток, препарат вводят подкожно в возрастающих дозах (10, 20 и 40 мкг на мышь) с адъювантом гель гидроксида алюминия. За четыре дня до проведения гибридизации проводят бустер-иммунизацию, препарат вводят внутрибрюшинно в дозе 40 мкг на мышь. Слияние спленоцитов иммунных мышей с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Ag14 проводят по методике G.Kohler и C.Milstein в модификации De St.Fazekas и D.Scheidegger. В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (ПЭГ). Слившиеся клетки рассевают в лунки культуральных планшетов с заранее приготовленным фидерным слоем. После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование, культивирование и криоконсервацию гибридных клеток. Для характеристики МКАТ, продуцируемых гибридной клеточной линией 365Е11, осуществляют выращивание клеток in vivo в виде асцитической жидкости с последующим выделением из нее фракции иммуноглобулинов путем ионообменной хроматографии.BALB/c mice are immunized with Shiga-like type II toxoid. Immunization is carried out three times, with an interval of 7 days, the drug is administered subcutaneously in increasing doses (10, 20 and 40 μg per mouse) with an aluminum hydroxide gel adjuvant. Four days before hybridization, booster immunization is carried out, the drug is administered intraperitoneally at a dose of 40 μg per mouse. The fusion of splenocytes of immune mice with cells of mouse myeloma Sp2/0-Ag14 is carried out according to the method of G.Kohler and C.Milstein modified by De St.Fazekas and D.Scheidegger. Polyethylene glycol (PEG) is used as the fusion agent. Merged cells are seeded into the wells of culture plates with a pre-prepared feeder layer. After hybridization, selection, screening, cloning, cultivation and cryopreservation of hybrid cells are carried out. To characterize the mAbs produced by the 365E11 hybrid cell line, cells are grown in vivo in the form of ascitic fluid, followed by isolation of the immunoglobulin fraction from it by ion-exchange chromatography.
Характеристика штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 365Е11:Characteristics of the strain of hybrid cultivated animal cells Mus musculus 365E11:
Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток 365Е11 представлена слабо прикрепленными к подложке округлыми клетками размером с исходную миеломную клетку.Morphological characteristic. The culture of 365E11 hybrid cells is represented by round cells, loosely attached to the substrate, the size of the original myeloma cell.
Культуральные свойства. Штамм гибридных клеток 365Е11 культивируют в виде стационарной суспензии в культуральных флаконах с площадью поверхности роста 25 см2 и 75 см2 в среде RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 80 мг/л гентамицина в атмосфере 5% углекислого газа при температуре 37°С. Оптимальная посевная концентрация клеток составляет 2105 клеток на 1 мл, время культивирования 3-4 суток, кратность рассева 1:4.cultural properties. The hybrid cell strain 365E11 is cultivated as a stationary suspension in culture flasks with a growth surface area of 25 cm 2 and 75 cm 2 in RPMI-1640 medium with 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 80 mg/l gentamicin in an atmosphere of 5% carbon dioxide at a temperature of 37°C. The optimal seed concentration of cells is 210 5 cells per 1 ml, the cultivation time is 3-4 days, the multiplicity of sieving is 1:4.
Культивирование гибридных клеток в организме животного. Для культивирования штамма гибридных клеток 365Е11 in vivo используются мыши линии BALB/c в возрасте 10-20 недель, обработанные пристаном (0,5 мл внутрибрюшинно). Через 14 суток мышам в брюшную полость вводят по 2⋅106 клеток в среде RPMI-1640. Появление асцитов регистрируют на 7-10 сутки, а отбор асцитической жидкости производят на 10-14 сутки в соответствии со скоростью развития каждой отдельной асцитной опухоли.Cultivation of hybrid cells in the animal body. For cultivation of the hybrid cell strain 365E11 in vivo, BALB/c mice aged 10-20 weeks treated with pristane (0.5 ml intraperitoneally) are used. After 14 days, 2⋅10 6 cells are injected into the abdominal cavity of mice in RPMI-1640 medium. The appearance of ascites is recorded on the 7-10th day, and the selection of ascitic fluid is performed on the 10-14th day in accordance with the rate of development of each individual ascitic tumor.
Продуктивность гибридной клеточной линии. Титр антител в культуральной жидкости на 3-4 сутки культивирования в иммуноферментном анализе (ИФА) составляет 1:800, титр антител в асцитической жидкости - 1:2560000. Продукция МКАТ сохраняется на протяжении 10 пассажей in vitro и 5 пассажей in vivo (срок наблюдения).Productivity of the hybrid cell line. The antibody titer in the culture fluid for 3-4 days of cultivation in enzyme immunoassay (ELISA) is 1:800, the antibody titer in ascitic fluid is 1:2560000. MAb production is maintained for 10 passages in vitro and 5 passages in vivo (observation period).
Контаминация штамма гибридных клеток. Бактерии и грибы не выявлены.Contamination of the strain of hybrid cells. Bacteria and fungi were not detected.
Криоконсервация. Суспензию гибридных клеток замораживают в защитной среде (90% фетальной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида) в концентрации 2⋅106 клеток на 1 мл в криопробирках со скоростью 1°С в 1 мин до минус 70°С, затем перемещают в хранилище с жидким азотом. Жизнеспособность восстанавливаемой культуры гибридомы после криоконсервации составляет 90%.Cryopreservation. The suspension of hybrid cells is frozen in a protective medium (90% fetal calf serum, 10% dimethyl sulfoxide) at a concentration of 2⋅10 6 cells per 1 ml in cryotubes at a rate of 1°C per 1 min to minus 70°C, then transferred to storage with liquid nitrogen. The viability of the regenerated hybridoma culture after cryopreservation is 90%.
Характеристика полезного продукта. Полученный штамм гибридных клеток 365Е11 производит специфичные МКАТ субкласса IgG1 к шигаподобному токсину II типа. МКАТ из асцитической жидкости выделяют методом ионообменной хроматографии. Специфическую активность очищенных МКАТ оценивают в непрямом твердофазном ИФА. Концентрацию иммуноглобулинов определяют по методу Лоури.Characteristics of a useful product. The resulting strain of hybrid cells 365E11 produces specific mAbs of the IgG1 subclass to type II Shiga-like toxin. MABs are isolated from ascitic fluid by ion-exchange chromatography. The specific activity of the purified mAbs is evaluated in an indirect solid-phase ELISA. The concentration of immunoglobulins is determined by the Lowry method.
Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is carried out as follows.
Получение препарата шигаподобного токсина II типа.Obtaining a Shiga-like toxin type II preparation.
Для получения препарата шигаподобного токсина II типа используют культуральную жидкость штамма кишечной палочки RKI № 11 2027 (О104:Н4).To obtain a preparation of Shiga-like type II toxin, the culture liquid of the strain of Escherichia coli RKI No. 11 2027 (O104:H4) is used.
Клетки E.coli RKI №11 2027 (О104:Н4) культивируют в колбах в среде «CAYE» (Merck, Германия) с добавлением митомицина до конечной концентрации 400 мкг/мл при температуре 37°С. Культуральную жидкость осветляют центрифугированием, дважды осаждают сульфатом аммония при 65% насыщения, ресуспендируют в дистиллированной воде и диализуют против 0,1 М фосфатного буферного раствора (ФБР) с рН 7,0.Cells of E. coli RKI No. 11 2027 (O104:H4) are cultured in flasks in CAYE medium (Merck, Germany) with the addition of mitomycin to a final concentration of 400 μg/ml at a temperature of 37°C. The culture fluid is clarified by centrifugation, precipitated twice with ammonium sulfate at 65% saturation, resuspended in distilled water and dialyzed against 0.1 M phosphate buffer solution (PBS) pH 7.0.
Хроматографическую очистку шигаподобного токсина осуществляют с использованием системы «ActaPrime Plus» (GE Healthcare, США). Гидрофобную хроматографию проводят на колонке «HiPrep Phenyl HP 16/10» (GE Healthcare, США) (3 мл/мин, посадочный буферный раствор - 0,1 М ФБР с 0,8 М сульфата аммония с рН 7,2, градиентная элюция - снижением концентрации сульфата аммония от 0,8 до 0,0 М). Ионообменная хроматография осуществляется на колонке «HiPrep DEAE FF 16/10» (GE Healthcare, США) (5 мл/мин, посадочный буферный раствор - 0,1 М трис-HCl буферный раствор с рН 6,5, градиентная элюция - повышением концентрации NaCl от 0,0 до 1,0 М), затем на колонке «HiPrep CM FF 16/10» (GE Healthcare, США) (5 мл/мин, посадочный буферный раствор - 0,05 М цитратный буферный раствор с рН 4,2, градиентная элюция - повышением концентрации NaCl от 0,0 до 1,0 М). Эксклюзионную хроматографию проводят на колонке «HiLoad 16/600 Superdex 200» (GE Healthcare, США) (1 мл/мин, 0,05 М трис-HCl буферный раствор с 0,15 М NaCl, рН 7,2). Промежуточные переводы полуфабрикатов в необходимые буферные системы осуществляли гель-фильтрацией на колонке «HiPrep 26/10 Desalting» (GE Healthcare, США) со скоростью протока 10 мл/мин.Chromatographic purification of Shiga-like toxin is carried out using the ActaPrime Plus system (GE Healthcare, USA). Hydrophobic chromatography is carried out on a HiPrep Phenyl HP 16/10 column (GE Healthcare, USA) (3 ml/min, planting buffer solution - 0.1 M PBS with 0.8 M ammonium sulfate pH 7.2, gradient elution - decrease in the concentration of ammonium sulfate from 0.8 to 0.0 M). Ion-exchange chromatography is carried out on a column "HiPrep DEAE FF 16/10" (GE Healthcare, USA) (5 ml/min, planting buffer solution - 0.1 M Tris-HCl buffer solution with pH 6.5, gradient elution - increasing the concentration of NaCl from 0.0 to 1.0 M), then on a HiPrep CM FF 16/10 column (GE Healthcare, USA) (5 ml/min, planting buffer solution - 0.05 M citrate buffer pH 4.2 , gradient elution - increasing the concentration of NaCl from 0.0 to 1.0 M). Size exclusion chromatography was performed on a HiLoad 16/600 Superdex 200 column (GE Healthcare, USA) (1 ml/min, 0.05 M Tris-HCl buffer solution with 0.15 M NaCl, pH 7.2). Intermediate transfers of semi-finished products into the required buffer systems were performed by gel filtration on a
Чистоту фракций препарата шигаподобного токсина II типа оценивают методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с добавлением 2-меркаптоэтанола. Окраску геля проводят раствором Coomassie brilliant blue R-250. Электрофореграмма исследуемого препарата представлена на фиг. 1, где на дорожке 1 нанесены маркеры молекулярных масс, а на дорожке 2 нанесен препарат шигаподобного токсина II типа. Результаты электрофореза показывают высокую чистоту исследуемого токсинного препарата, а молекулярные массы субъединиц, из которых он состоит, примерно равны 8 и 30 кДа, что соответствует данным литературы о строении шигаподобного токсина II типа.The purity of the Shiga-like toxin type II preparation fractions was assessed by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions with the addition of 2-mercaptoethanol. The gel is stained with Coomassie brilliant blue R-250. The electrophoregram of the study drug is shown in Fig. 1, where
Специфическую активность препарата шигаподобного токсина контролируют в иммуноферментном тесте RIDASCREEN® Verotoxin (R-Biopharm AG, Германия) и в иммунохроматографическом экспересс-тесте DUOPATH® Verotoxin (Merck Millipore, США) в соответствии с инструкциями производителей. Концентрацию белка определяют по методу Лоури.The specific activity of the Shiga-like toxin preparation was monitored in the RIDASCREEN® Verotoxin enzyme immunoassay (R-Biopharm AG, Germany) and in the DUOPATH® Verotoxin immunochromatographic express test (Merck Millipore, USA) in accordance with the manufacturer's instructions. The protein concentration is determined by the Lowry method.
Иммунизация лабораторных животныхImmunization of laboratory animals
Для иммунизации используют препарат шигаподобного анатоксина II типа. Для его приготовления к смеси сорбированного на геле гидроксида алюминия шигаподобного токсина добавляют 2,5% раствор глютарового альдегида из расчета 50 мкл на 1 мг белка. Полученную смесь выдерживают при температуре 22°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании, а затем при температуре 4°С в течение 12 ч.For immunization, a Shiga-like type II toxoid preparation is used. To prepare it, a 2.5% solution of glutaraldehyde is added to a mixture of Shiga-like toxin sorbed on an aluminum hydroxide gel at a rate of 50 μl per 1 mg of protein. The resulting mixture is kept at a temperature of 22°C for 30 minutes with constant stirring, and then at a temperature of 4°C for 12 hours.
Мышей линии BALB/c иммунизируют препаратом шигаподобного анатоксина II типа по схеме: подкожное введение отобранной группе мышей препарата шигаподобного анатоксина II типа в дозе 10 мкг на мышь, интервал 7 суток; подкожное введение отобранной группе мышей препарата шигаподобного анатоксина II типа в дозе 20 мкг на мышь, интервал 7 суток; подкожное введение отобранной группе мышей препарата шигаподобного анатоксина II типа в дозе 40 мкг на мышь.BALB/c mice are immunized with a Shiga-like toxoid type II preparation according to the scheme: subcutaneous administration of a Shiga-like toxoid type II preparation at a dose of 10 μg per mouse to a selected group of mice, interval of 7 days; subcutaneous administration of a Shiga-like type II toxoid preparation at a dose of 20 μg per mouse to a selected group of mice, an interval of 7 days; subcutaneous administration of a Shiga-like toxoid type II preparation at a dose of 40 μg per mouse to a selected group of mice.
Кровь иммунизированных мышей отбирают на 10 сутки после заключительной инъекции. Титры специфических антител в полученных сыворотках определяют в непрямом твердофазном ИФА. За 4 дня до проведения гибридизации мышам с наибольшими титрами антител делают внутрибрюшинную бустерную инъекцию препарата шигаподобного анатоксина II типа в 0,9% растворе натрия хлорида в дозе 40 мкг на мышь.The blood of immunized mice is taken on the 10th day after the final injection. The titers of specific antibodies in the obtained sera are determined in an indirect solid-phase ELISA. 4 days before hybridization, mice with the highest antibody titers are given an intraperitoneal booster injection of a Shiga-like toxoid type II preparation in 0.9% sodium chloride solution at a dose of 40 μg per mouse.
ГибридизацияHybridization
Гибридизация проводится по методике G.Kohler и C.Milstein в модификации De St.Fazekas и D.Scheidegger. Животных умерщвляют дислокацией шейных позвонков, извлекают селезенки, выделяют спленоциты путем перфузии селезенок средой RPMI-1640 и проводят процедуру слияния (гибридизации) спленоцитов иммунных мышей с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Ag14 (ATCCOCRL-1581™) в количественном соотношении 1:10, соответственно. В качестве агента для слияния применяют 50% раствор ПЭГ с молекулярной массой 1450 (Sigma-Aldrich, США). Слившиеся клетки рассевают в лунки 96-луночных культуральных планшетов (ТРР, Швейцария) с двухдневным фидерным слоем, состоящим из перитонеальных мышиных макрофагов. Культивирование полученных гибридных клеток осуществляют в СО2-инкубаторе (Lamsystems, Россия) при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США) с 20% фетальной телячьей сыворотки (Биолот, Россия), 2 мМ L-глютамина (Gibco, Германия), 1 мМ пирувата натрия (Sigma-Aldrich, США) и 80 мг/л гентамицина. Hybridization is carried out according to the method of G.Kohler and C.Milstein in the modification of De St.Fazekas and D.Scheidegger. The animals are sacrificed by dislocation of the cervical vertebrae, the spleens are removed, splenocytes are isolated by perfusion of the spleens with RPMI-1640 medium, and the splenocytes of immune mice are fused (hybridized) with Sp2/0-Ag14 mouse myeloma cells (ATCCOCRL-1581™) in a quantitative ratio of 1:10, respectively. A 50% PEG solution with a molecular weight of 1450 (Sigma-Aldrich, USA) is used as a fusion agent. Confluent cells are seeded into wells of 96-well culture plates (TPP, Switzerland) with a two-day feeder layer consisting of mouse peritoneal macrophages. Cultivation of the resulting hybrid cells is carried out in a CO 2 incubator (Lamsystems, Russia) at a temperature of 37°C in a humid atmosphere containing 5% carbon dioxide in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, USA) with 20% fetal calf serum (Biolot , Russia), 2 mM L-glutamine (Gibco, Germany), 1 mM sodium pyruvate (Sigma-Aldrich, USA), and 80 mg/L gentamicin.
СелекцияSelection
Селекцию полученных гибридных клеток проводят в ростовой среде, содержащей однократный раствор гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT), (Sigma-Aldrich, США). После 10 суток культивирования селекционную среду заменяют на более щадящую среду с 2 мМ гипоксантина и 2 мМ тимидина (Sigma-Aldrich, США), а после 20 суток культуры поддерживают на среде RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки без селекционных добавок.The selection of the resulting hybrid cells is carried out in a growth medium containing a single solution of hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) (Sigma-Aldrich, USA). After 10 days of cultivation, the selection medium is replaced with a more sparing medium with 2 mM hypoxanthine and 2 mM thymidine (Sigma-Aldrich, USA), and after 20 days the cultures are maintained on RPMI-1640 medium with 10% fetal calf serum without selection additives.
Скрининг гибридных клетокScreening of hybrid cells
Отбор положительных гибридных клеток, продуцирующих специфичные МКАТ, осуществляют методом непрямого твердофазного ИФА. Для проведения ИФА в лунки планшета MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE (Thermo Scientific, США) вносят по 100 мкл препарата шигаподобного токсина II типа в концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе с рН 9,6 и инкубируют при температуре 4°С в течение 18 ч. Трижды отмывают 0,01 М PBS с добавлением 0,05% Tween 20 (Merck, Германия) (PBS-T), каждый раз внося в лунки планшета по 300 мкл отмывающего раствора. Затем в лунки вносят по 100 мкл супернатантов культуральных жидкостей тестируемых гибридных клеток и среду культивирования (отрицательный контроль, К-), инкубируют при 37°С на планшетном орбитальном шейкере (Elmi, Латвия) при скорости вращения платформы 400 оборотов в 1 мин в течение 1 ч. Все исследуемые точки дублируются не менее чем в трех повторностях. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором PBS-T и добавляют в лунки по 100 мкл кроличьих антител к IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США) в рабочем разведении в соответствии с инструкцией изготовителя. Планшет инкубируют 1 ч при тех же условиях, затем трижды отмывают PBS-T. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстратно-индикаторного раствора (5 мг ортофенилендиамина, 1 мл цитратно-перекисного раствора с рН 4,7 на 10 мл дистиллированной воды). Реакцию останавливают через 20 мин добавлением в лунки по 100 мкл 1 М серной кислоты. Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Учет результатов проводят на планшетном фотометре (Tecan, Австрия) при длине волны 492 нм. Исследование культуральных жидкостей гибридных клеточных линий, находящихся в логарифмической фазе роста, проводят не менее трех раз с интервалом 3-4 дня. Контроль морфофункционального состояния гибридных клеток в лунках планшета проводят ежедневно с использованием инвертированного микроскопа (Биолам-1, Россия). Результаты тестирования специфической активности гибридных клеточных линий, продуцирующих МКАТ к шигаподобному токсину II типа, представлены в таблице 1.The selection of positive hybrid cells producing specific mAbs is carried out by the method of indirect solid-phase ELISA. For ELISA, 100 µl of the Shiga-like toxin type II preparation at a concentration of 10 µg/ml in 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer solution with pH 9.6 is added to the wells of the MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE (Thermo Scientific, USA) and incubated at temperature 4°C for 18 hours Wash three times with 0.01 M PBS with the addition of 0.05% Tween 20 (Merck, Germany) (PBS-T), each time adding 300 μl of washing solution to the wells of the plate. Then, 100 µl of supernatants of culture liquids of the tested hybrid cells and culture medium (negative control, K-) are added to the wells, incubated at 37°C on a plate orbital shaker (Elmi, Latvia) at a platform rotation speed of 400 rpm for 1 h. All the studied points are duplicated in at least three repetitions. After that, the wells of the plate are washed three times with a PBS-T solution and 100 μl of rabbit antibodies to mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, USA) are added to the wells in a working dilution in accordance with the manufacturer's instructions. The plate is incubated for 1 hour under the same conditions, then washed three times with PBS-T. After that, 100 μl of a substrate-indicator solution (5 mg of orthophenylenediamine, 1 ml of citrate-peroxide solution with pH 4.7 per 10 ml of distilled water) are added to the wells. The reaction is stopped after 20 min by adding 100 µl of 1 M sulfuric acid to the wells. A positive reaction is assessed by the appearance of a yellow-brown color of the solution. The results are recorded on a tablet photometer (Tecan, Austria) at a wavelength of 492 nm. The study of cultural fluids of hybrid cell lines in the logarithmic phase of growth is carried out at least three times with an interval of 3-4 days. The control of the morphofunctional state of hybrid cells in the wells of the tablet is carried out daily using an inverted microscope (Biolam-1, Russia). The results of testing the specific activity of hybrid cell lines producing mAbs to Shiga-like toxin type II are presented in Table 1.
Для дальнейшей работы отобрали гибридную клеточную линию 365Е11, обладающую наилучшими продуктивными (по результатам ИФА) и культуральными свойствами (таблица 1).For further work, a hybrid cell line 365E11 was selected, which has the best productive (according to the results of ELISA) and cultural properties (table 1).
КлонированиеCloning
Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений (из расчета 1 клетка на лунку) в 96-луночных планшетах с фидерным слоем перитонеальных макрофагов. Скрининг клонов проводят методом непрямого твердофазного ИФА, как описано выше. Исследуют только те лунки, которые содержат моноклональную популяцию клеток. Клоны, показавшие наилучший результат в ИФА тестируют не менее трех раз с интервалом 3-4 дня. Наиболее стабильные клоны гибридных клеток подвергают криоконсервации.Cloning of hybrid cells is carried out by the method of limiting dilutions (at the rate of 1 cell per well) in 96-well plates with a feeder layer of peritoneal macrophages. Clones are screened by indirect ELISA as described above. Examine only those wells that contain a monoclonal population of cells. Clones that showed the best result in ELISA are tested at least three times with an interval of 3-4 days. The most stable clones of hybrid cells are subjected to cryopreservation.
Культивированиеcultivation
Культивирование гибридной клеточной линии 365Е11 ведут в культуральных флаконах (ТРР, Швейцария) Т-25 и Т-75 при температуре 37°С в атмосфере 5% углекислого газа. Средой культивирования является RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 80 мг/л гентамицина. Количество клеток при культивировании поддерживают в диапазоне 2⋅105-1⋅106 клеток на 1 мл. Обновление среды путем частичной замены производят ежедневно. Оценку характера и скорости роста осуществляли в инвертированном световом микроскопе.Cultivation of the hybrid cell line 365E11 is carried out in culture flasks (TRP, Switzerland) T-25 and T-75 at a temperature of 37°C in an atmosphere of 5% carbon dioxide. The culture medium is RPMI-1640 with 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 80 mg/l gentamicin. The number of cells during cultivation is maintained in the range of 2⋅10 5 -1⋅10 6 cells per 1 ml. The environment is updated by partial replacement daily. The nature and rate of growth were assessed using an inverted light microscope.
Культивирование клона гибридной клеточной линии 365Е11 в организме животного. Для стимуляции процесса образования асцитных форм опухолей мышам-реципиентам интраперитонеально вводят по 0,5 мл пристана (Sigma-Aldrich, США). Через 14 суток вводят внутрибрюшинно не менее 2⋅106 гибридных клеток 365Е11 в среде RPMI-1640. Появление асцитов регистрируют на 7-10 сутки, а отбор асцитической жидкости производят на 10-14 сутки в соответствии со скоростью развития каждой отдельной асцитной опухоли.Cultivation of a clone of the hybrid cell line 365E11 in an animal body. To stimulate the formation of ascitic forms of tumors, 0.5 ml of pristane (Sigma-Aldrich, USA) is intraperitoneally administered to recipient mice. After 14 days, at least 2⋅10 6 365E11 hybrid cells are injected intraperitoneally in RPMI-1640 medium. The appearance of ascites is recorded on the 7-10th day, and the selection of ascitic fluid is performed on the 10-14th day in accordance with the rate of development of each individual ascitic tumor.
КонтаминацияContamination
Контаминацию культуры гибридных клеток 365Е11 бактериями и грибами исследуют бактериологическим методом - результат отрицательный.The contamination of the culture of hybrid cells 365E11 with bacteria and fungi is examined by bacteriological method - the result is negative.
Криоконсервацияcryopreservation
Клон гибридных клеток 365Е11 замораживают в криопробирках объемом 1,8 мл (Thermo, США). В качестве среды для криоконсервации используют фетальную телячью сыворотку (Биолот, Россия) с 10% диметилсульфоксида (Sigma-Aldrich, США). Снятие клеток с поверхности культуральных флаконов производят потряхиванием и пипетированием. Суспензию клеток центрифугируют при 1000 оборотов в 1 мин в течение 10 мин на центрифуге 5810 R (Eppendorf, Германия), супернатант удаляют, осадок клеток ресуспендируют в среде для криоконсервации и разливают в криопробирки по 1 мл. Криопробирки охлаждают до минус 70°С со скоростью заморозки ГС в 1 мин. Длительное хранение культур осуществляют в жидком азоте. Жизнеспособность культуры гибрид омы после криоконсервации оценивают в камере Горяева после окраски 0,4% трипановым синим, после размораживания она составила 90%.A clone of 365E11 hybrid cells was frozen in 1.8 ml cryotubes (Thermo, USA). As a medium for cryopreservation, fetal calf serum (Biolot, Russia) with 10% dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich, USA) is used. Removal of cells from the surface of the culture vials produced by shaking and pipetting. The cell suspension is centrifuged at 1000 rpm for 10 min in a 5810 R centrifuge (Eppendorf, Germany), the supernatant is removed, the cell pellet is resuspended in a cryopreservation medium and poured into 1 ml cryotubes. Cryotubes are cooled down to minus 70°C at a HS freezing rate of 1 min. Long-term storage of cultures is carried out in liquid nitrogen. The viability of the Oma hybrid culture after cryopreservation is assessed in a Goryaev chamber after staining with 0.4% trypan blue; after thawing, it was 90%.
Выделение, очистка и определение субкласса МКАТ, продуцируемых гибридной клеточной линией 365Е11.Isolation, purification and subclass determination of MABs produced by the 365E11 hybrid cell line.
Клеточные компоненты, содержащиеся в асцитической жидкости, удаляют центрифугированием при 1000 g в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают и осаждают глобулиновую фракцию добавлением насыщенного раствора сульфата аммония (Thermo, США) в соотношении 1:1, выдерживают при температуре 22°С в течение 30 мин. Преципитат осаждают центрифугированием при 8000 g в течение 30 мин, супернатант удаляют. Осадок растворяют в 0,5 М растворе калия фосфорнокислого двузамещенного с рН 8,9, диализуют против 0,1 М ФБР с рН 7,5 в течение 18 ч со сменой ФБР через 2 и 6 ч. Ионообменную хроматографию проводят с использованием системы «ActaPrime Plus». Для этого в колонку «HiPrep DEAE FF 16/10», уравновешенную 0,05 M ФБР с рН 7,5, наносят образец со скоростью 3 мл/мин, иммуноглобулины элюируют при той же скорости градиентом ФБР (от 0,1 М до 0,5 М). Мониторинг проводят по оптической плотности при длине волны 280 нм.Cellular components contained in the ascitic fluid are removed by centrifugation at 1000 g for 15 min, the supernatant is drained and the globulin fraction is precipitated by adding a saturated solution of ammonium sulfate (Thermo, USA) in a ratio of 1:1, kept at a temperature of 22°C for 30 min. The precipitate is precipitated by centrifugation at 8000 g for 30 min, the supernatant is removed. The precipitate is dissolved in a 0.5 M solution of disubstituted potassium phosphate with pH 8.9, dialyzed against 0.1 M PBS with pH 7.5 for 18 hours with a change in PBS after 2 and 6 hours. Ion-exchange chromatography is carried out using the ActaPrime system. Plus". To do this, a sample is applied to a HiPrep DEAE FF 16/10 column equilibrated with 0.05 M PBS pH 7.5 at a rate of 3 ml/min, immunoglobulins are eluted at the same rate with a PBS gradient (from 0.1 M to 0 .5 M). Monitoring is carried out by optical density at a wavelength of 280 nm.
Специфическую активность фракций элюата, содержащих МКАТ 365Е11, оценивают в непрямом твердофазном ИФА, как описано выше. Концентрацию иммуноглобулинов во фракциях определяют по методу Лоури. Фракции элюата характеризуются титрами МКАТ 1:640000 и более и содержанием белка не менее 3 мг/мл.The specific activity of the eluate fractions containing MAB 365E11 was evaluated in an indirect solid-phase ELISA as described above. The concentration of immunoglobulins in the fractions is determined by the method of Lowry. The eluate fractions are characterized by MCAT titers of 1:640,000 or more and a protein content of at least 3 mg/ml.
Для определения субкласса очищенных МКАТ 365Е11, продуцируемых одноименной гибридной клеточной линией, используют иммунохроматографический экспресс-тест IsoQuick™ (Thermo, США) согласно инструкции производителя. МКАТ 365Е11 относятся к субклассу IgG1.To determine the subclass of purified mAb 365E11 produced by the hybrid cell line of the same name, the IsoQuick™ immunochromatographic rapid test (Thermo, USA) was used according to the manufacturer's instructions. MCAT 365E11 belongs to the IgG1 subclass.
Оценка диагностических свойств МКАТ, продуцируемых гибридной клеточной линией 365Е11, в отношении целевой мишени.Evaluation of the diagnostic properties of mAbs produced by the 365E11 hybrid cell line in relation to the target target.
Для оценки диагностических свойств МКАТ, продуцируемых гибридной клеточной линией 365Е11, используют фракции иммуноглобулинов с наибольшими специфической активностью в ИФА и содержанием белка. Исследование проводят в «сэндвич»-варианте ИФА. Для этого из очищенных МКАТ синтезируют иммунопероксидазный конъюгат (ИПК) по методике перйодатного окисления.To assess the diagnostic properties of mAbs produced by the 365E11 hybrid cell line, immunoglobulin fractions with the highest specific activity in ELISA and protein content are used. The study is carried out in the "sandwich" version of the ELISA. For this, an immunoperoxidase conjugate (IPC) is synthesized from purified mAbs using the periodate oxidation method.
Для проведения ИФА в лунки 96-луночного планшета вносят по 100 мкл МКАТ в концентрации 20 мкг/мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе с рН 9,6 и инкубируют при температуре 4°С в течение 18 ч. Трижды отмывают PBS-T, каждый раз внося в лунки планшета по 300 мкл отмывающего раствора. Затем в лунки вносят по 100 мкл последовательных двукратных разведений шигаподобного токсина II типа от 64 нг/мл до 0,25 нг/мл, инкубируют при 37°С на планшетном орбитальном шейкере при скорости вращения платформы 400 оборотов в 1 мин в течение 1 ч. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором PBS-T и добавляют в лунки по 100 мкл ИПК, разведенного PBS-T до рабочей концентрации. Свободные центры связывания блокируют добавлением в ИПК бычьего сывороточного альбумина (Диа М, Россия) до конечной концентрации 100 мкг/мл. Планшет инкубируют 1 ч в тех же условиях, затем трижды отмывают PBS-T. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстратно-индикаторного раствора на основе ортофенилендиамина. Реакцию останавливают через 20 мин добавлением в лунки по 100 мкл 1 М серной кислоты. Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Учет результатов проводят на планшетном фотометре при длине волны 492 нм. Результаты ИФА считают положительными, если оптическая плотность в лунках с исследуемыми пробами превышает величину 0,3. При этом фоновые значения иммунопероксидазного конъюгата (К-) не должны превышать величину оптической плотности равную 0,15. По результатам данного ИФА была составлена таблица 2.For ELISA, 100 µl of MAb at a concentration of 20 µg/ml in 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer solution with pH 9.6 is added to the wells of a 96-well plate and incubated at 4°C for 18 hours. Washed three times with PBS -T, each time adding 300 µl of washing solution to the wells of the tablet. Then, 100 µl of sequential two-fold dilutions of type II shiga-like toxin from 64 ng/ml to 0.25 ng/ml are added to the wells, incubated at 37°C on a plate orbital shaker at a platform rotation speed of 400 rpm for 1 hour. After that, the wells of the tablet are washed three times with a solution of PBS-T and 100 μl of IPC diluted with PBS-T to a working concentration are added to the wells. Free binding sites are blocked by adding bovine serum albumin (Dia M, Russia) to IPC to a final concentration of 100 μg/ml. The plate is incubated for 1 h under the same conditions, then washed three times with PBS-T. After that, 100 μl of a substrate-indicator solution based on orthophenylenediamine is added to the wells. The reaction is stopped after 20 min by adding 100 µl of 1 M sulfuric acid to the wells. A positive reaction is assessed by the appearance of a yellow-brown color of the solution. The results are recorded on a tablet photometer at a wavelength of 492 nm. The ELISA results are considered positive if the optical density in the wells with the test samples exceeds 0.3. In this case, the background values of the immunoperoxidase conjugate (K-) should not exceed the optical density value equal to 0.15. Based on the results of this ELISA, Table 2 was compiled.
Как показывает проведенный анализ, МКАТ, продуцируемых гибридной клеточной линией 365Е11, позволяют в «сэндвич»-варианте твердофазного ИФА выявлять шигаподобный токсин II типа в концентрации 1 нг/мл и более (таблица 2).As the analysis shows, mAbs produced by the 365E11 hybrid cell line make it possible to detect Shiga-like toxin type II at a concentration of 1 ng/ml or more in the "sandwich" variant of solid-phase ELISA (Table 2).
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020142296A RU2768838C1 (en) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020142296A RU2768838C1 (en) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2768838C1 true RU2768838C1 (en) | 2022-03-24 |
Family
ID=80819523
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020142296A RU2768838C1 (en) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2768838C1 (en) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2496874C1 (en) * | 2012-06-05 | 2013-10-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | STRAIN OF BACTERIOPHAGE Escherichia coli ECD4, HAVING LYTIC ACTIVITY IN RESPECT TO BACTERIA Escherichia coli OF SEROTYPE O104:H4 |
RU2583306C1 (en) * | 2015-03-11 | 2016-05-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Hybrid strain of cultured cells of animals mus musculus -t 2e5 - producer of monoclonal antibodies isotype g 1 to b subunit of cholera toxin |
-
2020
- 2020-12-21 RU RU2020142296A patent/RU2768838C1/en active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2496874C1 (en) * | 2012-06-05 | 2013-10-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | STRAIN OF BACTERIOPHAGE Escherichia coli ECD4, HAVING LYTIC ACTIVITY IN RESPECT TO BACTERIA Escherichia coli OF SEROTYPE O104:H4 |
RU2583306C1 (en) * | 2015-03-11 | 2016-05-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Hybrid strain of cultured cells of animals mus musculus -t 2e5 - producer of monoclonal antibodies isotype g 1 to b subunit of cholera toxin |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
КОТКОВА Н.В. Экспериментальная колиэнтеротоксемия, обусловленная шигаподобным токсином Escherichia coli, авто диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, Краснодар, 2007, 21 с., с. 6, 10. * |
КОТКОВА Н.В. Экспериментальная колиэнтеротоксемия, обусловленная шигаподобным токсином Escherichia coli, автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, Краснодар, 2007, 21 с., с. 6, 10. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0151128B1 (en) | Monoclonal antibodies reactive with endotoxin core | |
US4596769A (en) | Monoclonal antibodies to peptidoglycan and methods of preparing same | |
JPS62187417A (en) | Crossreactive and crossdefensive monoclonal antibody againstpseudomonas aeruginosa serum | |
WO1986002358A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
WO1986002364A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
RU2768838C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii | |
CN114591917A (en) | Hybridoma cells producing antibodies that bind beta-amyloid and uses thereof | |
KR101851332B1 (en) | Staphylococcus aureus-Specific Novel Monoclonal Antibody, Hybridoma For Producing The Antibody, Method For Detecting The Same Comprising The Antibody And Kit For Detecting The Same | |
WO1987000531A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
RU2783897C1 (en) | Homo sapiens/mus musculus 1b9c7 hybrid cultured cell strain: producer of human monoclonal antibodies specific to the proteolytic domain of botulinum type a toxin | |
KR20160072516A (en) | Staphylococcus aureus-Specific Novel Monoclonal Antibody, Hybridoma For Producing The Antibody, Method For Detecting The Same Comprising The Antibody And Kit For Detecting The Same | |
RU2699983C1 (en) | Strain of hybrid cultured animal cells of mus musculus 1f11pal - producer of murine monoclonal antibodies specific to peptidoglycan-associated lipoprotein (pal) legionella pneumophila | |
WO1986002362A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
WO1986002355A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
RU2451078C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain 11d6 producer of monoclonal antibodies specific to lipopolysaccharide francisella tularensis | |
Rafidah et al. | Bacteria leaf blight disease of rice: characterisation of pathogen and polyclonal antibody production of Xanthomonas oryzae pv. oryzae. | |
CN109970854B (en) | Tyrophagus putrescentiae Der p10 monoclonal antibody and preparation method and application thereof | |
RU2478703C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 5G6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN | |
RU2319743C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus as producer of monoclonal antibodies to hypoglycosidated and deglycosidated isoforms of tumor-associated human antigen muc i | |
WO1986002363A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
SU1604849A1 (en) | Strain of hybride cultivable mus musculus l. cells producing monoclonal antibodies to bacteria of brucella variety | |
RU2555544C1 (en) | STRAIN OF CULTIVATED HYBRID CELLS OF ANIMAL Mus musculus Bpm Vd-8 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODY 3C6/A9 TO ANTIGEN 200 kDa OF PSEUDOCHOLERA ACTIVATOR | |
RU2652885C1 (en) | MUS MUSCULUS HYBRID CULTIVATED ANIMAL CELLS STRAIN α - THE PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO THE CANCER-TESTICULAR ANTIGEN OF THE PERSON GAGE | |
RU2265051C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l, pkkk(p) 679d - producer of monoclonal antibody with specificity to protein-polysaccharide antigen from yersinia enterocolitica o3 and o9 serovars | |
RU2571208C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 1G7 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR BOTULINUM TOXIN OF TYPE B |