RU2133769C1

RU2133769C1 - Strain of bacterium rhodococcus species used for water and soil treatment from oil and petroleum products

Info

Publication number: RU2133769C1
Application number: RU98105708/13A
Authority: RU
Inventors: З.М. Ермоленко; В.П. Холоденко; В.А. Чугунов
Original assignee: Государственный научный центр прикладной микробиологии
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 1999-07-27

Abstract

FIELD: ecology, microbiology. SUBSTANCE: invention relates to a novel strain of bacterium Rhodococcus species MFN isolated from oil of "Druzhba" oil pipeline. The strain is deposited in VKPM at N Ac-1558. This strain utilizes oil, mazut, kerosene, naphthalene, tetradecane, pentadecane, hexadecene, phenyldecane, pristane, benzene and kerosene vapors and propane and butane gases as a single carbon source. Process follows at the broad range of temperature and utilization of petroleum products at 5-th day is 75-95%. The strain shows resistance to heavy metal ions: Mn, Ni, Zn, Mo, Cr, Cu, Fe, Pb, Ag. EFFECT: new strain indicated above, enhanced effectiveness of the strain. 4 ex

Description

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. The invention relates to the field of microbiology and relates to the production of a new strain of bacteria that can be used to purify water and soil from oil and oil products.

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa, PAO, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, которые утилизируют отдельные углеводороды из состава нефти (патент США N 3813316, кл. 195-28, 1974 г.). Недостатком его является нестабильность и потеря плазмид из клеток бактерий. A known strain of Pseudomonas aeruginosa, PAO, containing the plasmids Cam, Oct, Nah, Sal, which utilize individual hydrocarbons from the oil (US patent N 3813316, CL 195-28, 1974). Its disadvantage is the instability and loss of plasmids from bacterial cells.

Широко применяется штамм Pseudomonas putida 36 (а.с. СССР N 1076446, C 12 N 15/00, 1984 г.), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что он растет и утилизирует нефтепродукты лишь ири сравнительно высокой температуре (28 - 30^oC).The Pseudomonas putida 36 strain (USSR AS N 1076446, C 12 N 15/00, 1984), which has high characteristics for the biodegradation of oil and oil products, is widely used. However, the disadvantage of this strain is that it grows and utilizes petroleum products only at a relatively high temperature (28 - 30 ^o C).

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (А.с. SU N 1493666-A1, 1987 г), Flavobacterium tirrennicum (А.с. SU N 1409594, 1988 г.), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти. Known strains of Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (A.S. SU N 1493666-A1, 1987), Flavobacterium tirrennicum (A.S. SU N 1409594, 1988), which can decompose oil hydrocarbons. The disadvantage of the above strains is that they carry out the destruction of oil products only in water and are not able to clean the soil from oil.

Известны штаммы Acinetronacter sp. HB-1 (патент RU N 2077579, 1994 г.) и Acinetronacter sp. JN-2 (патент RU N 2064017, 1993 г.). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть только при высоких температурах. Acinetronacter sp. HB-1 (patent RU N 2077579, 1994) and Acinetronacter sp. JN-2 (patent RU N 2064017, 1993). The disadvantage of the strains is that they only utilize oil at high temperatures.

Наиболее близким предлагаемому штамму является штамм Rhodococcus erythroplis E-15 (патент RU N 2019527, 1993 г.). Этот штамм утилизирует нефть при температуре 10^oC, но процесс протекает медленно, только через 4 недели биодеградация нефти достигает 32% без добавки различных удобрений.The closest to the proposed strain is a strain of Rhodococcus erythroplis E-15 (patent RU N 2019527, 1993). This strain utilizes oil at a temperature of 10 ^o C, but the process proceeds slowly, only after 4 weeks biodegradation of oil reaches 32% without the addition of various fertilizers.

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в относительно короткие сроки в широком диапазоне температур, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов. The objective of the invention is to obtain a strain of bacteria with high utilizing ability in relation to oil and oil products in a relatively short time in a wide temperature range, which can be used to clean soils and water bodies contaminated with oil products and salts of heavy metals.

Предлагаемый штамм бактерий Rhodococcus sp. MFN выделен из нефти нефтепровода "Дружба", полученной на нефтеперерабатывающем комбинате г. Капотня Московской обл. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКМП Ас-1558. The proposed bacterial strain Rhodococcus sp. MFN was isolated from oil from the Druzhba oil pipeline obtained at the Kapotnya oil refinery in the Moscow Region. The strain is deposited by the All-Russian collection of industrial microorganisms, collection number VKMP As-1558.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками. The resulting strain is characterized by the following features.

Морфолого-культуральные признаки. Грамоположительные прямые, изогнутые палочки, часто встречаются V-формы. Размеры палочек из 24-часовой культуры 0,6 х 4,0 - 6,0 мкм, старые культуры распадаются на кокковые формы. Культура неподвижна, кислотонеустойчива. Morphological and cultural characteristics. Gram-positive straight, curved sticks, often V-shaped. The size of the sticks from a 24-hour culture is 0.6 x 4.0 - 6.0 microns, old cultures break up into coccal forms. The culture is motionless, acid-unstable.

На мясопептонном агаре через 48 часов дает мелкие, выпуклые, круглые с ровным краем колонии розового цвета по консистенции палочки пастообразные, непрозрачные, блестящие, легко снимаются с агара. On meat-peptone agar, after 48 hours, it gives small, convex, round, with an even edge, pink colonies with the consistency of sticks, pasty, opaque, shiny, easily removed from the agar.

В мясопептонном бульоне растет в виде осадка на дне и пленки на поверхности. In meat and peptone broth, it grows in the form of sediment at the bottom and films on the surface.

Культура растет на минеральной среде, используя в качестве источника углерода нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. Источниками углерода могут служить пары бензина и керосина, газы пропан и бутан. The culture grows on a mineral medium, using oil, oil products and individual oil hydrocarbons as a carbon source. Sources of carbon can be vapors of gasoline and kerosene, propane and butane gases.

Физиолого-биохимические признаки. Факультативный аэроб, растет в температурном дипазоне от 4^oC до 40^oC оптимум 28^oC. Углеводы не окисляет и не сбраживает, кроме глюкозы и манита. Отношение к источникам азота: нитраты не восстанавливает, денитрификация отсутствует, фенилаланин не дезаменирует. протолической активностью не обладает. Оксидазоотрицательная, каталазоположительная, обладает уреазной активностью. В дополнительных факторах роста не нуждается. Не растет на среде Симмонса и на среде Мак-Конки.Physiological and biochemical characteristics. Optional aerobic grows in a temperature range from 4 ^o C to 40 ^o C optimum 28 ^o C. Carbohydrate does not oxidize and does not ferment, except glucose and mannitol. Attitude to nitrogen sources: nitrates does not restore, denitrification is absent, phenylalanine does not replace. does not possess protolic activity. Oxidase-negative, catalase-positive, has urease activity. It does not need additional growth factors. It does not grow on the environment of Simmons and on the environment of McConkey.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах). The strain is not virulent, not toxic, not toxigenic (tested on white mice).

Генетические особенности. Культура устойчива к антибиотикам: полимиксину, новобиоцину и бацитроцину. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлоа: Mn(II), Ni - 10 мг/л, Zn - 100 мг/л, Mo - 100 мг/л, Cu, Cr (IV), Cr (VII) - 20 мг/л, Pb - 100 мг/л, Fe - 100 мг/л, Ag - 10 мг/л. Genetic features. The culture is resistant to antibiotics: polymyxin, novobiocin and bacitrocin. The strain is resistant to heavy metal ions: Mn (II), Ni - 10 mg / L, Zn - 100 mg / L, Mo - 100 mg / L, Cu, Cr (IV), Cr (VII) - 20 mg / L, Pb - 100 mg / L, Fe - 100 mg / L, Ag - 10 mg / L.

Условия хранения: в лимофилизированном виде а ампулах при 4^oC. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на минеральной среде 8E с нефтью и нефтепродуктами, а также на полноценной среде.Storage conditions: in a lyophilized form and in ampoules at 4 ^o C. The strain can be maintained by regular reseeding (1 time in 2 weeks) on mineral medium 8E with oil and oil products, as well as on a complete medium.

Изобретение поясняется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Штамм Rhodococcus sp. MFN выращивают на минеральной среде 8E следующего состава, г/л: (NH₄)₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,7; NaCl - 0,5; MgSO₄ • 7H₂O - 0,8; дистиллированная вода - 1 л; pH 7,2. В качестве единственного источника углерода добавляют 1% ксенобиотика. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды и 300 мг нефти, мазута и керосина отдельно в каждую. колбы засевают клетками предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтепродуктом и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, 10^oC и 28^oC в течение 10 дней. Биодеградацию определяют на газовом хроматографе. Данные эксперимента показывают, что предлагаемый штамм уже на пятый день при 10^oC утилизирует соответственно 29%, 16%, 41% и 64% нефти, мазута, дизельного топлива и керосина, а при 28^oC соответственно 81,5%, 26,1%, 74,0%, 95,3%.Example 1. The strain Rhodococcus sp. MFN is grown on mineral medium 8E of the following composition, g / l: (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ - 0.5; KH ₂ PO ₄ 0.7; NaCl - 0.5; MgSO ₄ • 7H ₂ O - 0.8; distilled water - 1 l; pH 7.2. As a single carbon source, 1% xenobiotic is added. In 100 ml cones, 30 ml of mineral medium and 300 mg of oil, fuel oil and kerosene are added separately to each. flasks are seeded with the cells of the proposed strain to a concentration of 1 • 10 ⁷ cells / ml. As a control, put the same flask with medium, oil and without bacteria to determine the total (natural) losses. The experiment is carried out in triplicate. The flasks were cultivated on a shaker at 200 rpm, 10 ^o C and 28 ^o C for 10 days. Biodegradation is determined on a gas chromatograph. The experimental data show that on the fifth day at 10 ^o C the proposed strain utilizes 29%, 16%, 41% and 64% of oil, fuel oil, diesel fuel and kerosene, respectively, and at 28 ^o C, respectively, 81.5%, 26, 1%, 74.0%, 95.3%.

Пример 2. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды E8 и 1% смеси углеводородов нефти (нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан). Колбы инфицируют исследуемой культурой в концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контрольную колбу оставляют неинфицированной. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, 20^oC в течение 5 дней. Обработку результатов проводят на газовом хроматографе. Результаты показывают, что биодеградация указанных углеводородов прошла на 77,8%, 53,8%, 56,2%, 63,9%, 42,1% и 43,7% соответственно по сравнению с контролем.Example 2. In 100 ml cones, 30 ml of E8 mineral medium and 1% mixture of petroleum hydrocarbons (naphthalene, tetradecane, pentadecane, hexadecene, phenyldecane, pristan) are added. Flasks infect the test culture at a concentration of 1 • 10 ⁷ cells / ml. The control flask is left uninfected. The cultivation is carried out on a rocking chair at 200 rpm, 20 ^o C for 5 days. Processing the results is carried out on a gas chromatograph. The results show that the biodegradation of these hydrocarbons was 77.8%, 53.8%, 56.2%, 63.9%, 42.1% and 43.7%, respectively, compared with the control.

Пример 3. В колбы на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды E8, 300 мл нефти, 10 мг/л солей Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Ni, Ag, и Cr - 50 мкг/л и клетки предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контролем служит колба, в которую вносят нефть и клетки бактерий. Опыт проводят в трех повторностях. Культивируют колбы на качалке при 28^oC при 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты опыта показывают, что в колбе с солями металлов и без них клетки предлагаемого штамма утилизируют нефть на 51%.Example 3. In 100 ml flasks, 30 ml of E8 mineral medium, 300 ml of oil, 10 mg / l of salts of Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Ni, Ag, and Cr - 50 μg / l and cells of the proposed strain are added to a concentration of 1 • 10 ⁷ cells / ml. The control is a flask in which oil and bacterial cells are introduced. The experiment is carried out in triplicate. The flasks are cultivated on a rocking chair at 28 ^o C at 200 rpm for 5 days. The results of the experiment show that in a flask with metal salts and without them, the cells of the proposed strain utilize oil by 51%.

Пример 4. Исследуемую культуру наносят петлей на чашки Петри с голодным агаром и ставят в эксикаторы с газами пропаном и бутаном, которые служат единственным источником углерода, а также с парами бензина и керосина. Учет результата и пересев осуществляют через 5 дней культивирования. Результаты показывают, что предлагаемая культура Rhodococcus sp. MFN выдерживает 10 и более пересевов, утилизируя газообразные источники углерода. Данных по утилизации газообразных углеводородов нефти штаммом-прототипом нет. Example 4. The test culture is looped on Petri dishes with hungry agar and placed in desiccators with propane and butane gases, which serve as the sole carbon source, as well as gasoline and kerosene vapors. Accounting for the result and reseeding is carried out after 5 days of cultivation. The results show that the proposed culture of Rhodococcus sp. MFN withstands 10 or more transfers, utilizing gaseous carbon sources. There is no data on the utilization of gaseous hydrocarbons of oil by the prototype strain.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он относительно быстро утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо и керосин как при температуре 28^oC, так и при 10^oC. Утилизирует такие углеводороды нефти, как нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан и пристан. Штамм может утилизировать углерод из газов пропан и бутан, а также из паров бензина и керосина. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов, что расширяет диапазон его применения при очистке территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.Thus, the advantage of the proposed strain is that it utilizes oil, fuel oil, diesel fuel and kerosene relatively quickly both at a temperature of 28 ^o C and at 10 ^o C. It utilizes oil hydrocarbons such as naphthalene, tetradecane, pentadecane, hexadecene, phenyldecane and marina. The strain can utilize carbon from propane and butane gases, as well as from gasoline and kerosene vapors. The strain is resistant to heavy metal ions, which expands the range of its application in the cleaning of territories from contamination by oil and oil products.

Claims

Штамм бактерий Rhodococcus species MFN, депонирован в ВКПМ АС-1558, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. The bacterial strain Rhodococcus species MFN, deposited in VKPM AC-1558, used to purify water and soil from oil and oil products.