JP3728721B2 - New microorganisms and wastewater treatment methods - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規微生物及び排水の処理方法に係り、その目的は、広い温度域にわたって液状及び固形状の油脂、その他の有機物等を好気的に分解することができる新規微生物及びこの新規微生物を用いた排水の処理方法を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
食品工場、飲食店、一般家庭等から排出される排水中には、動植物性油脂が多量に含まれていることが多い。通常の場合、排水中に含まれる油脂は、自然浮上装置や加圧浮上装置により分離除去されている。このような物理的、或いは化学的な分離除去方法では排水中の油脂を完全に除去することはできず、油脂が含まれた排水は分解槽にまで供給されて、活性汚泥法等の浮遊生物法、回転生物接触法等の生物膜法等の生物学的な処理方法により分解除去されているのが現状である。
【０００３】
油脂が含まれた排水の生物学的な処理方法としては、例えば、特開平８−１９７９８６号公報に、シュードモナス属に属する特定の菌株を用いて、排水中に含まれる動植物性油脂を分解処理する方法が開示されている。
また、特開平９−８５２８３号公報に、バークホルデリア属に属する高温で動植物性油脂を分解し得る細菌を用いて排水を処理する方法が開示されている。
さらに、特開平１１−４７７９８号公報に、シュドモナス属に属する特定の菌株を用いて排水中に含まれる動植物性油脂を分解処理する方法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来の排水の処理方法には、以下のような問題が存在していた。
従来の排水の処理方法において用いられる油脂分解性細菌は、ある特定の温度域、例えば特開平９−８５２８３号公報に開示された細菌の場合では約４０℃以上の温度域、において油脂を分解することができる。しかしながら、生物学的な分解が行われる分解槽内の温度は、気象条件、季節或いは設置場所等により大きな温度変化が発生していることが知られている。このために、従来の油脂分解性細菌は、激しい温度変化が生じる分解槽内では常に高い分解能を発揮することは困難であった。この結果、分解槽内において処理されて排出された処理水の水質は常に一定ではなく、しかも、油脂が完全に分解されずに排出されることがあった。
また、上記の排水の処理方法において用いられる油脂分解性細菌は、液状の油脂を分解することはできるが、固形状の油脂を同様に分解処理することは困難であった。排水中に固形状の油脂が大量に含まれる場合は、処理水の水質を悪化させるとともに、嫌気性細菌が発生して悪臭が発生することがあった。
【０００５】
上記の課題に鑑みて鋭意研究を行った結果、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）に属する一菌株が、広い温度域にわたって液状及び固形状油脂に対する高い分解能を有することを見いだし、本発明の完成に至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、請求項１に係る発明は、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株（FERM BP-7308）に関する。
請求項２に係る発明は、排水と、バークホルデリア セパシア（ Burkholderia cepacia ）ＡＩＫ菌株（ FERM BP-7308 ）を接触させることを特徴とする排水の処理方法に関する。
請求項３に係る発明は、前記排水と、前記バークホルデリア セパシア（ Burkholderia cepacia ）ＡＩＫ菌株（ FERM BP-7308 ）を、２０〜３５℃の温度条件下で接触させることを特徴とする請求項２記載の排水の処理方法に関する。
請求項４に係る発明は、前記排水が常温で固形状の油脂を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載の排水の処理方法に関する。
請求項５に係る発明は、前記常温で固形状の油脂がラード、牛脂、又はやし油のうち一種以上であることを特徴とする請求項４に記載の排水の処理方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
まず、本発明に係る新規微生物について説明する。
本発明に係る新規微生物は、沖縄県石垣島の土壌をサンプリングし、スクリーニングを行った結果、得られた細菌であり、広い温度域において油脂に対する優れた分解能を有するとともに、脂肪酸、タンパク質、炭水化物、糖類等の有機物に対する分解能も有する。
以下、本発明に係る新規微生物の分離方法について説明する。
まず、沖縄県石垣島でサンプリングした１２６サンプルの土壌を、培地▲１▼で培養した。培地▲１▼で成育の良好であったサンプルのみを培地▲２▼で培養した。以下、同様に成育の良好なサンプルのみを順に次の培地で培養することによって最終的に６サンプルを得た。
▲１▼オリーブ油を５％添加した栄養培地（組成；後記表１の組成を精製水に溶解して１０００．０ｍｌとすることにより調整した培地にイーストエキス及びカザミノ酸をそれぞれ１．０ｇ／Ｌ添加）。
▲２▼オリーブ油を１０％添加した栄養培地。
▲３▼オリーブ油を１０％添加した栄養培地。尚、三回植えつぎを行った。
▲４▼実排水。
▲５▼豚脂を２％添加した栄養培地。
▲６▼サラダ油を２％添加した栄養培地。
▲７▼豚脂を１０％添加した栄養培地。
▲８▼サラダ油を１％添加した栄養培地。尚、三回植えつぎを行った。
▲９▼牛脂を２％添加した栄養培地。
【０００８】
上記の方法により分離された６サンプルについて、リパーゼ活性及び油脂含有排水における油脂分解量を測定して、最も良好な結果が得られたサンプルを採取した。
こうして沖縄県石垣島の土壌からバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株を分離した。
【０００９】
以下、分離されたバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株の菌学的性質について説明する。尚、菌学的性質の試験及び分類方法は、E.Yabuuchi et al.,Microbiology and Immunology,36,1251-1275,1992 の記載に基づいて行った。
【００１０】
（１）形態的性質
(a) 細胞の形及び大きさ；長さ１．０〜１．５μｍ、幅０．８μｍの桿菌
(b) グラム染色性；−
(c) 胞子；−
(d) 運動性；＋
(e) コロニーの形態；円形、周縁波状、低凸状、表層縞紋状、黄色（水溶性色素）
(f) 鞭毛の着性；極毛
【００１１】
（２）培養的性質
(a) 肉汁液体培養；表面皮膜形成
(b) リトマスミルク；不変
【００１２】
（２）生理学的性質
(a) カタラーゼ；＋
(b) オキシターゼ；＋
(c) Ｏ／Ｆ試験；−
(d) 硝酸塩還元；−
(e) インドール産生；−
(f) ブドウ糖酸性化；−
(g) アルギニンジヒドロラーゼ；−
(h) ウレアーゼ；−
(i) エスクリン加水分解；＋
(j) ゼラチン加水分解；−
(k) β−ガラクトシダーゼ；−
(l) 脱窒反応；−
(m) ＭＲテスト；＋
(n) ＶＰテスト；−
(o) Ｈ2 Ｓ産生；−
(p) 澱粉加水分解；−
(q) クエン酸の利用； Koser／＋、 Christensen／＋
(r) 無機窒素源の利用；ＮａＮＯ3 ／＋、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ／＋
(s) 色素生成；水溶性黄色色素
(t) 嫌気的成育；−
(u) Ｔｗｅｅｎ８０の分解；＋
(v) ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の分解；−
(w) 基質資化能；ブドウ糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ＤＬ−リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、酢酸フェニルは資化する。マルトースは資化せず。
(x) 糖類から酸の生成の有無；ブドウ糖、キシロース、マンニトール、乳糖、麦芽糖は酸の生成有。
(y) ＯＦ培地による酸及びガス生成（酸／ガス）；Ｌ−アラビノース（−／−）、Ｄ−キシロース（＋／−）、Ｄ−グルコース（＋／−）、Ｄ−マンノース（−／−）、Ｄ−フルクトース（−／−）、Ｄ−ガラクトース（＋／−）、マルトース（＋／−）、シュークロース（＋／−）、ラクトース（＋／−）、トレハロース（＋w ／−）、Ｄ−ソルビトール（−／−）、Ｄ−マンニトール（＋／−）、イノシトール（−／−）、グリセリン（−／−）、デンプン（−／−）。
【００１３】
前記の菌学的性質及び上記の文献の記載から、運動性を有するグラム陰性桿菌でカタラーゼ及びオキシダーゼ共に陰性を示し、ブドウ糖から酸を産生することから、本発明に係る新規微生物は、バークホルデリア属（Burkholderia）に属する微生物であると同定された。
さらに、本発明に係る新規微生物は、ブドウ糖、キシロース、マンニトール、乳糖及び麦芽糖から酸を産生し、アルギニンジヒドロラーゼ陰性を示すことからバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）に属する微生物と判断して、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株と命名した。
バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、平成１２年９月２５日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に微生物寄託番号FERM BP-7308として寄託された。
【００１４】
バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株を培養するために用いられる培地は特に限定されず、通常の液体培地、固体培地が用いられる。培地の栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類などの細菌の成育に必要な栄養源であればよい。炭素源としては、グルコース、ショ糖、糖蜜、澱粉等を例示することができる。窒素源としては、有機窒素源、無機窒素源のいずれも用いることができ、有機窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、大豆分解物、尿素等を、無機窒素源としては、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を例示することができる。無機塩類としては、リン酸塩、硫酸マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、銅、マンガン、亜鉛、塩化カルシウム、硫酸第一鉄等を例示することができる。
【００１５】
培地のｐＨは、２．０〜１２．０、好ましくは５．０〜８．０、より好ましくは６．０〜８．０とされ、７．０〜８．０とすることが最も好ましい。
また、培地の温度は、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株が成育できる温度であればよく、具体的には、１５〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃とされる。
【００１６】
バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、油脂を好適に分解することができる。バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株の油脂を分解する際の温度は特に限定されないが、１５〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃とされる。分解槽内の温度は、通常の場合、約２０〜３５℃の範囲内で変動するから、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、分解槽内において極めて優れた分解能を発揮することが可能である。
また、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、動物性油脂、植物性油脂のいずれの油脂も好適に分解することができ、さらに、サラダ油、オリーブ油、ゴマ油等のような常温で液状の油脂に限られることなく、ラード、牛脂、やし油等の常温で固形状の油脂も好適に分解することができる。しかも、後述する実施例からも明らかなように、短時間で極めて低濃度に分解することが可能である。
また、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、界面活性剤の存在下においても油脂を分解することが可能である。即ち、洗剤が混入している実際の排水中の油脂であっても分解処理することができる。
さらに、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は油脂に加え、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸等の脂肪酸、タンパク質、炭水化物、糖類等の有機物を好適に分解することができる。これらの有機物を分解する際の温度は特に限定されないが、油脂の場合と同様、１５〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃とされる。
【００１７】
次に、本発明に係る排水の処理方法について説明する。本発明に係る排水の処理方法は、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌と、排水とを接触させることを特徴としている。
バークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌としては、主として油脂を分解することができる細菌であれば特に限定はされないが、広い温度域にわたって油脂等を分解処理することができる細菌であることが好ましい。この理由は、分解槽内の温度は常に一定ではなく、気象条件、季節、或いは設置場所等の様々な条件によって激しく変動するからである。（図３参照。尚、図３は、或る分解槽内の月毎の平均温度の変化を示したグラフである。）この分解槽内の温度変動が微生物の分解能に影響を与えるために、分解槽において分解処理された処理水の水質は安定せず、また微生物の分解能力が低下する時期には、油脂が完全に分解処理されず処理水中に油脂が混入して排出されてしまうことがあった。（図４参照。尚、図４は、或る分解槽において分解処理されて排出された処理水中に含まれるｎ−ヘキサン抽出物の量、即ち油脂含有量の平均を示したグラフである。）つまり、少なくとも分解槽内の温度域、具体的には１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の温度域の略全域にわたって高い分解能を発揮することができる細菌を用いることにより、たとえ分解槽内で温度変化が生じたとしても分解能力が低下することなく、常に安定した処理を行うことができるからである。
さらに、用いられるバークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌としては、常温で液状の油脂だけでなく、常温で固形状の油脂も好適に分解することができる細菌であることが好ましい。この理由は、分解槽に流入する排水中には常温で液状の油脂の加え、常温で固形状の油脂も含まれているからである。
また、用いられるバークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌としては、油脂に加えて、油脂以外の有機物、例えば脂肪酸、タンパク質、炭水化物、糖類等も分解することができる細菌であることが望ましい。この理由は、油脂以外の有機物も分解することにより、排水のＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）、ＣＯＤ（化学的酸素要求量）を低減することができるからである。
以上の条件を兼ね備えた細菌としては、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株（FERM BP-7308）等を例示することができる。
【００１８】
本発明に係る排水の処理方法は、活性汚泥法等の浮遊生物法、回転生物接触法、散水ろ床法、接触酸化法、好気性ろ床法等の生物膜法、或いは固定化微生物法のうちのいずれの方法によってもよい。即ち、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌は、活性汚泥を構成する微生物群のうちの一種として用いても、また、円板等の表面に固着された生物膜を構成する微生物群のうちの一種として用いても、さらには、担体に担持された微生物群のうちの一種として用いても構わない。
【００１９】
本発明に係る排水の処理方法は、分解槽内の温度変化に影響されずに液状及び固形状の油脂を好適に分解することができるから、季節、気象条件、設置場所等の環境条件に左右されずに油脂を分解することが可能である。しかも、嫌気性生物の繁殖を抑制して悪臭の発生を防ぐことができるとともに、高い分解能を常に発揮することができるために、分解槽から処理されて排出される処理水の水質を略一定に維持することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
（実施例及び比較例の試料）
バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株を実施例１の試料とした。また、スーパーＨ菌（商品名、コンドーＦＲＰ社製）を比較例１の試料、活性汚泥（工業技術院生命工学工業技術研究所にて培養）を比較例２の試料とした。
【００２１】
（試験例１；ラードの分解）
表１に示される組成を精製水に溶解して１０００．０ｍｌとすることにより調製した培地に、ラード５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍを加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。尚、この合成排水は、性質比較試験により、実際の排水と略同等の性質であることが確かめられた。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調製した合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養した。
最後に、所定時間経過後の合成排水中のラードの濃度を測定した。測定方法は、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を、抽出効率９８．６％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。尚、比較例１の試料を用いて同様の実験を行った。
結果を表２に示す。
【００２２】
【表１】
【表２】
表２に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリアセパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、比較例１に比べ格段に優れた分解能を示し、固形状油脂を４時間で約１／４、９時間で約１／１０の濃度にまで分解することができ、さらに２４時間経過後には略完全に分解することができる。
【００２５】
（試験例２；サラダ油の分解）
試験例１で使用した培地と同様の培地に、サラダ油５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍを加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。尚、この合成排水は、性質比較試験により、実際の排水と略同等の性質であることが確かめられた。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調製した合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養した。
最後に、所定時間経過後の合成排水中に含まれるサラダ油の濃度を測定した。測定方法は、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を、抽出効率９７．５％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。
尚、比較例１及び比較例２の試料を用いて同様の実験を行った。
結果を表３に示す。
【００２６】
【表３】
表３に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリアセパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、比較例１及び２に比べ格段に優れた分解能を示し、液状の油脂を４時間で約１／７、９時間で約１／１０の濃度にまで分解することができ、さらに２４時間経過後には略完全に分解することができる。
【００２８】
（試験例３；油脂分解における温度依存性）
試験例１同様の組成の培地に、サラダ油５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍを加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を上記調製した合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、所定温度で、１５０ｒｐｍ、４時間振盪培養した。
最後に、サラダ油の分解率を測定した。測定方法は、合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を抽出効率９７．５％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。
一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。
尚、比較例１の試料を用いて同様の実験方法により測定した。
結果を表４及び図１に示す。尚、図１中の実線は実施例、破線は比較例１の結果を示したグラフである。
【００２９】
【表４】
表４及び図１に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、１５℃以下という低温においても、また４０℃以上の高温においても油脂の分解能を有することが分かる。さらに、約２０〜３５℃の温度域においては、８０％以上という極めて優れた分解能を常に発揮できることが分かる。
【００３１】
（試験例４；サラダ油分解における植菌量変化の影響）
試験例１と同様の組成の培地に、サラダ油５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍを加えて滅菌した合成排水とした。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料（培地１リットル中に乾燥重量３．０ｇの菌体含有）の所定量を前記調製した合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで４時間振盪培養した。
最後に、合成排水中におけるサラダ油の濃度を測定した。測定方法は、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を抽出効率９７．５％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。
一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。
結果を表５に示す。
【００３２】
【表５】
表５の結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、極めて少ない添加量でも短時間で油脂を分解することができる。
【００３４】
（試験例５；実際の排水中における油脂の分解）
実際の排水を採取した後に滅菌、濾過した。尚、この排水中のｎ−ヘキサン抽出物の量は１５ｐｐｍであった。
次に、この排水のｎ−ヘキサン抽出物の量が５００ｐｐｍとなるようにサラダ油を添加した後に、１６時間振盪した。
ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調整した排水で洗浄した後に、排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養した。
最後に、所定時間経過後の排水中に含まれるｎ−ヘキサン抽出物の濃度を測定した。
尚、一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。結果を表６に示す。
【００３５】
【表６】
表６の結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、合成排水においても（合成排水を用いて同様の実験を行った表３に示される実施例の結果参照）また実際の排水中においても、略同等の能力を発揮できることが分かる。
【００３７】
（試験例６；ペプトン添加によるサラダ油の分解への影響）
試験例１と同様の組成の培地に、サラダ油５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍ、ペプトン０．１％を加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。
次に、上記説明した試験例２と全く同様の方法により、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を測定した。結果を表７に示す。
【００３８】
【表７】
表７に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリアセパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、油脂に比べ分解しやすいと考えられるペプトンが存在していたとしても、存在していない場合（ペプトンを添加せずに同様の実験を行った表３に示される実施例の結果参照）と略同等の分解能力を発揮することができる。
【００４０】
（試験例７；ｐＨの変化によるサラダ油分解への影響）
試験例１と同様の組成の培地に、０．５ＮのＨＣｌと０．５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨメーターにて調整することにより、表８に示されるｐＨの培地をそれぞれ調整した。次に、それぞれの培地にサラダ油５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍを加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調製したそれぞれの合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで４時間振盪培養した。
最後に、合成排水中に含まれるサラダ油の濃度を測定した。測定方法は、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を、抽出効率９７．５％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。
一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。
結果を表８及び図２に示す。
【００４１】
【表８】
表８及び図２に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、幅広いｐＨ域において油脂を分解することができる。特に、ｐＨが７．０〜８．０においては、極めて優れた分解能を発揮することが分かる。
【００４３】
（試験例８；水道水中におけるサラダ油の分解）
水道水にサラダ油５００ｐｐｍを加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を生理食塩水で洗浄した後に、前記調製した合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。
最後に、合成排水中に含まれるサラダ油の濃度を測定した。測定方法は、培地中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を抽出効率９７．５％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。
また、比較例１の試料を用いて同様の実験を行った。
尚、コントロールとして実施例及び比較例１の試料のいずれも添加しなかった場合も同様の方法により測定を行った。
それぞれのサンプルにつき３回ずつ測定した結果を表９に示す。
【００４４】
【表９】
表９に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリアセパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、油脂以外の栄養分が極端に少ない状況においても活動して油脂を分解できることが分かる。
【００４６】
（試験例９；ラードの分解における洗剤の影響）
試験例１と同様の組成の培地に、ラード５００ｐｐｍを加え滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調製した合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養した。
最後に、所定時間経過後の合成排水中におけるラードの濃度を測定した。測定方法は、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を、抽出効率９８．６％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。
一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。
結果を表１０に示す。
【００４７】
【表１０】
表１０に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、洗剤を添加することにより（洗剤を添加して同様の実験を行った表２に示される実施例の結果参照）固形油脂に対する分解能力が高まることが分かる。
【００４９】
（試験例１０；サラダ油の分解における洗剤の添加による影響）
試験例１と同様の組成の培地に、サラダ油５００ｐｐｍを加え滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調製した合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養した。
最後に、所定時間経過後の合成排水中におけるサラダ油の濃度を測定した。測定方法は、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を、抽出効率９８．６％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。
一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。
結果を表１１に示す。
【００５０】
【表１１】
表１１に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、洗剤を添加することにより（洗剤を添加して同様の実験を行った表３に示される実施例の結果参照）液状の油脂に対する分解能が高まることが分かる。
【００５２】
（試験例１１；活性汚泥に組み込んだ際のサラダ油の分解）
試験例１で使用した培地と同様の培地に、サラダ油５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍを加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。尚、この合成排水は、性質比較試験により、実際の排水と略同等の性質であることが確かめられた。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調製した合成排水で洗浄した後に、比較例２の活性汚泥２００ｍｌに組み込み、これを、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養した。
最後に、９時間経過後の合成排水中に含まれるサラダ油の濃度を測定した。測定方法は、所定時間経過後の合成排水中のｎ−ヘキサン抽出物の濃度を、抽出効率９７．５％（コントロールを三本作成して別途算出）として測定することにより行った。一回の測定につき、サンプルを三本ずつ作成して、その平均値を求めた。
尚、比較例２の試料を用いて同様の実験を行った。
結果を表１２に示す。
【００５３】
【表１２】
表１２に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、活性汚泥に組み込んだ場合であっても、油脂に対する優れた分解能を発揮できることが分かる。
【００５５】
（試験例１２；脂肪酸の分解）
バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株による脂肪酸の分解能について実験を行った。尚、基質としては、ラード及びサラダ油の脂肪酸組成を分析し、その双方に最も多く含まれているオレイン酸の単一グリセリドであるトリオレインを使用した。
実験方法は、まず、試験例１で使用した培地と同様の培地に、トリオレイン５００ｐｐｍ、洗剤１０ｐｐｍを加えて滅菌した後に、速度１５０ｒｐｍで１６時間振盪して合成排水とした。
次に、ＬＢ培地で前培養した実施例の試料２０ｍｌ（乾燥重量０．０６ｇの菌体含有）を前記調製した合成排水で洗浄した後に、合成排水２００ｍｌに添加して、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養した。
最後に、１時間、２時間、４時間経過後の合成排水中に含まれるｎ−ヘキサン抽出物の全量をメチル化して、内部標準物質としてHeptadecanoate acid を等量ずつ添加した後に、その一定量をガスクロマトグラフィーによりそれぞれ分析した。１時間経過後のピーク面積を基準として、内部標準物質で補正したオレイン酸のピーク面積を表１３に示す。
【００５６】
【表１３】
表１３に示される結果の通り、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、オレイン酸等の脂肪酸を短時間で分解できることが分かる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、広い温度域における高い油脂分解能を有する。特に、約２０〜３５℃の温度域においては、常に高い分解能を有する。
また、分解される油脂は、液状の油脂に限定されず、固形状の油脂についても液状の油脂の場合と略同等の分解能を有する。
さらに、バークホルデリア セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株は、油脂に加え、脂肪酸、タンパク質、炭水化物、糖類等の有機物も分解することができるために、排水中のＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）、ＣＯＤ（化学的酸素要求量）を低減することが可能である。
【００５９】
本発明に係る排水の処理方法は、主として油脂を好適に分解することができる細菌を用いた排水の処理方法であるから、分解槽内の温度に影響されることなく、常に略一定した分解処理を行うことが可能できる。このために、嫌気性細菌の繁殖を防止して悪臭の発生を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例３の試験結果を示すグラフである。
【図２】試験例７の試験結果を示すグラフである。
【図３】或る分解槽における月毎の分解槽内の平均温度を示したグラフである。
【図４】或る分解槽における処理水中のｎ−ヘキサン抽出物の月毎の平均量を示したグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel microorganism and a method for treating wastewater. The purpose of the present invention is to provide a novel microorganism capable of aerobically decomposing liquid and solid oils and other organic substances over a wide temperature range, and the novel microorganism. It is in providing the processing method of the used waste_water | drain.
[0002]
[Prior art]
Wastewater discharged from food factories, restaurants, general households and the like often contains a large amount of animal and vegetable oils. Usually, the fats and oils contained in the waste water are separated and removed by a natural levitation device or a pressure levitation device. Such physical or chemical separation / removal methods cannot completely remove the fats and oils in the wastewater, and the wastewater containing fats and oils is supplied to the decomposition tank, and suspended organisms such as the activated sludge method. At present, it has been decomposed and removed by a biological treatment method such as a biofilm method such as the method of rotatory biological contact.
[0003]
As a biological treatment method for wastewater containing fats and oils, for example, in JP-A-8-197986, a specific strain belonging to the genus Pseudomonas is used to decompose animal and plant fats and oils contained in the wastewater. A method is disclosed.
Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-85283 discloses a method for treating wastewater using bacteria that can decompose animal and vegetable oils and fats at a high temperature belonging to the genus Burkholderia.
Furthermore, JP-A-11-47798 discloses a method for decomposing animal and vegetable oils and fats contained in wastewater using a specific strain belonging to the genus Pseudomonas.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, the above-described conventional wastewater treatment methods have the following problems.
The oil-degrading bacteria used in the conventional wastewater treatment methods decompose fats and oils in a specific temperature range, for example, in the case of bacteria disclosed in JP-A-9-85283, a temperature range of about 40 ° C. or higher. be able to. However, it is known that the temperature in the decomposition tank in which biological decomposition is performed undergoes a large temperature change depending on weather conditions, season, installation location, or the like. For this reason, it has been difficult for conventional oil-degrading bacteria to always exhibit high resolution in a decomposition tank in which a drastic temperature change occurs. As a result, the quality of the treated water treated and discharged in the decomposition tank is not always constant, and the fats and oils may be discharged without being completely decomposed.
In addition, the oil-degrading bacteria used in the above-described wastewater treatment method can decompose liquid oil, but it is difficult to decompose solid oil in the same manner. When solid fats and oils are contained in a large amount in the waste water, the quality of the treated water is deteriorated, and anaerobic bacteria are generated to generate a bad odor.
[0005]
As a result of diligent research in view of the above problems, it was found that one strain belonging to Burkholderia cepacia has high resolution for liquid and solid oils and fats over a wide temperature range, and completed the present invention. It came.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
That is, the invention according to
The invention according to
The invention according to claim 3The drainage and the Burkholderia Sepasia ( Burkholderia cepacia AIK strain ( FERM BP-7308 The waste water treatment method according to
The invention according to claim 4The wastewater treatment method according to
The invention according to claim 5The method for treating waste water according to
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
First, the novel microorganism according to the present invention will be described.
The novel microorganism according to the present invention is a bacteria obtained as a result of sampling and screening the soil of Ishigaki Island in Okinawa Prefecture, and has an excellent resolution for fats and oils in a wide temperature range, fatty acids, proteins, carbohydrates, It also has a resolution for organic substances such as sugars.
Hereinafter, the method for separating a novel microorganism according to the present invention will be described.
First, 126 samples of soil sampled in Ishigaki Island, Okinawa Prefecture were cultured in the medium (1). Only samples that were well grown in medium (1) were cultured in medium (2). Similarly, 6 samples were finally obtained by culturing only samples with good growth in the following medium in order.
(1) Nutrient medium supplemented with 5% olive oil (Composition; 1.0 g / L each of yeast extract and casamino acid was added to a medium prepared by dissolving the composition shown in Table 1 below in purified water to make 1000.0 ml. ).
(2) Nutrient medium supplemented with 10% olive oil.
(3) Nutrient medium supplemented with 10% olive oil. In addition, the planting was performed three times.
(4) Actual drainage.
(5) Nutrient medium supplemented with 2% pork fat.
(6) Nutrient medium supplemented with 2% salad oil.
(7) Nutrient medium supplemented with 10% pork fat.
(8) Nutrient medium supplemented with 1% salad oil. In addition, the planting was performed three times.
(9) Nutrient medium supplemented with 2% beef tallow.
[0008]
About 6 samples isolate | separated by said method, the lipase activity and the amount of fats and oils decomposition | disassembly in fats and oils containing waste water were measured, and the sample with the best result was extract | collected.
Thus, Burkholderia cepacia AIK strain was isolated from the soil of Ishigaki Island, Okinawa Prefecture.
[0009]
Hereinafter, the mycological properties of the isolated Burkholderia cepacia AIK strain will be described. The test and classification method of mycological properties are described in E. Yabuuchi et al., Microbiology and Immunology,36, 1251-1275, 1992.
[0010]
(1) Morphological properties
(a) Shape and size of cells; Neisseria gonorrhoeae having a length of 1.0 to 1.5 μm and a width of 0.8 μm
(b) Gram staining;
(c) Spores;
(d) Motility; +
(e) Colony morphology: circular, fringe, low convex, surface stripe, yellow (water-soluble dye)
(f) Flagella wear; polar hair
[0011]
(2) Culture characteristics
(a) Meat broth liquid culture; surface film formation
(b) Litmus milk; unchanged
[0012]
(2) Physiological properties
(a) Catalase; +
(b) Oxidase; +
(c) O / F test;
(d) nitrate reduction;
(e) Indole production;
(f) Glucose acidification;
(g) Arginine dihydrolase;
(h) Urease;
(i) Esculin hydrolysis; +
(j) Gelatin hydrolysis;
(k) β-galactosidase;
(l) Denitrification reaction;
(m) MR test; +
(n) VP test;
(o) H2 S production;
(p) starch hydrolysis;
(q) Use of citric acid; Koser / +, Christensen / +
(r) Use of inorganic nitrogen source; NaNOThree / +, (NHFour )2 SOFour / +
(s) Dye formation; Water-soluble yellow dye
(t) Anaerobic growth;
(u) Tween 80 degradation; +
(v) degradation of poly-β-hydroxybutyric acid;
(w) Substrate utilization ability: glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-D-glucosamine, potassium gluconate, n-capric acid, adipic acid, DL-malic acid, sodium citrate The phenyl acetate is assimilated. Maltose is not assimilated.
(x) Presence or absence of acid generation from saccharides; glucose, xylose, mannitol, lactose and maltose have acid generation.
(y) Acid and gas production (acid / gas) by OF medium; L-arabinose (− / −), D-xylose (+/−), D-glucose (+/−), D-mannose (− / −) ), D-fructose (-/-), D-galactose (+/-), maltose (+/-), sucrose (+/-), lactose (+/-), trehalose (+w /-), D-sorbitol (-/-), D-mannitol (+/-), inositol (-/-), glycerin (-/-), starch (-/-).
[0013]
From the above bacteriological properties and the description in the above literature, gram-negative bacillus having motility is negative for both catalase and oxidase and produces acid from glucose. Therefore, the novel microorganism according to the present invention is Burkholderia. It was identified as a microorganism belonging to the genus (Burkholderia).
Furthermore, the novel microorganism according to the present invention produces an acid from glucose, xylose, mannitol, lactose and maltose, and is negative for arginine dihydrolase. Therefore, it is judged as a microorganism belonging to Burkholderia cepacia, It was designated as the holder of Burkholderia cepacia AIK.
Burkholderia cepacia AIK strain was deposited on September 25, 2000 at the Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry under the name of microbial deposit number FERM BP-7308.
[0014]
The medium used for culturing Burkholderia cepacia AIK strain is not particularly limited, and a normal liquid medium or solid medium is used. The nutrient source of the medium may be any nutrient source necessary for the growth of bacteria such as a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts. Examples of the carbon source include glucose, sucrose, molasses, starch and the like. As the nitrogen source, either an organic nitrogen source or an inorganic nitrogen source can be used. As the organic nitrogen source, peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, soybean degradation product, urea, etc. can be used as the inorganic nitrogen source. Examples thereof include ammonium nitrate and sodium nitrate. Examples of inorganic salts include phosphate, magnesium sulfate, potassium, sodium, calcium, copper, manganese, zinc, calcium chloride, ferrous sulfate and the like.
[0015]
The pH of the medium is 2.0 to 12.0, preferably 5.0 to 8.0, more preferably 6.0 to 8.0, and most preferably 7.0 to 8.0.
Moreover, the temperature of a culture medium should just be a temperature which can grow a Burkholderia cepacia (Burkholderia cepacia) AIK strain, Specifically, 15-45 degreeC, Preferably it is 15-40 degreeC, More preferably, it is 20-35 degreeC. It is said.
[0016]
Burkholderia cepacia AIK strain can degrade fats and oils suitably. Although the temperature at the time of decomposing | disassembling the fats and oils of Burkholderia cepacia AIK strain is not specifically limited, It is 15-45 degreeC, Preferably it is 15-40 degreeC, More preferably, it is 20-35 degreeC. Since the temperature in the digestion tank usually varies within a range of about 20 to 35 ° C., Burkholderia cepacia strain AIK can exhibit extremely excellent resolution in the digestion tank. It is.
In addition, Burkholderia cepacia AIK strain can suitably decompose any of oils and fats of animal oils and vegetable oils, and further, oils and fats at room temperature such as salad oil, olive oil and sesame oil Without being limited to the above, solid fats and oils such as lard, beef tallow and coconut oil can be suitably decomposed at room temperature. Moreover, as can be seen from the examples described later, it can be decomposed to a very low concentration in a short time.
In addition, Burkholderia cepacia AIK strain can decompose fats and oils even in the presence of a surfactant. That is, even the fats and oils in the actual waste water mixed with the detergent can be decomposed.
Further, Burkholderia cepacia AIK strain can suitably decompose fatty acids such as lauric acid, myristic acid, oleic acid, organic substances such as proteins, carbohydrates, and saccharides in addition to fats and oils. Although the temperature at the time of decomposing | disassembling these organic substances is not specifically limited, It is 15-45 degreeC like the case of fats and oils, Preferably it is 15-40 degreeC, More preferably, it is 20-35 degreeC.
[0017]
Next, the waste water treatment method according to the present invention will be described. The wastewater treatment method according to the present invention is characterized in that wastewater is brought into contact with bacteria belonging to the genus Burkholderia.
The bacterium belonging to the genus Burkholderia is not particularly limited as long as it can mainly degrade oils and fats, but is preferably a bacterium that can decompose oils and fats over a wide temperature range. . This is because the temperature in the decomposition tank is not always constant, and varies greatly depending on various conditions such as weather conditions, seasons, or installation location. (See FIG. 3. Note that FIG. 3 is a graph showing a change in the average temperature in a certain decomposition tank every month.) In order for the temperature fluctuation in the decomposition tank to affect the resolution of microorganisms, The quality of the treated water decomposed in the decomposition tank is not stable, and when the ability of microorganisms to degrade deteriorates, the fats and oils may not be completely decomposed and discharged into the treated water. there were. (See FIG. 4. Note that FIG. 4 is a graph showing the amount of n-hexane extract contained in the treated water discharged after being decomposed in a certain decomposition tank, that is, the average of the fat and oil content.) That is, by using bacteria capable of exhibiting high resolution over at least the temperature range in the decomposition tank, specifically 15 to 40 ° C., preferably 20 to 35 ° C., even in the decomposition tank, This is because, even if a temperature change occurs, stable treatment can always be performed without degrading the decomposition ability.
Furthermore, the bacteria belonging to the genus Burkholderia are preferably bacteria that can suitably decompose not only liquid fats and oils at room temperature but also solid oils and fats at room temperature. The reason for this is that the waste water flowing into the decomposition tank contains oil and fat that are liquid at room temperature and oil and fat that is solid at room temperature.
The bacteria belonging to the genus Burkholderia are preferably bacteria that can decompose organic substances other than fats and oils, such as fatty acids, proteins, carbohydrates, and sugars, in addition to fats and oils. This is because by decomposing organic substances other than fats and oils, the BOD (biochemical oxygen demand) and COD (chemical oxygen demand) of the waste water can be reduced.
Examples of the bacterium having the above conditions include Burkholderia cepacia AIK strain (FERM BP-7308).
[0018]
The wastewater treatment method according to the present invention is a floating biological method such as an activated sludge method, a rotating biological contact method, a water trickling filter method, a biofilm method such as an aerobic filter bed method, or an immobilized microorganism method. Any of these methods may be used. That is, bacteria belonging to the genus Burkholderia (Burkholderia) can be used as a kind of microorganism group constituting the activated sludge, or among the microorganism group constituting the biofilm fixed on the surface of a disc or the like. It may be used as a kind of microbial group supported on a carrier.
[0019]
Since the wastewater treatment method according to the present invention can suitably decompose liquid and solid oils and fats without being affected by temperature changes in the decomposition tank, it depends on the environmental conditions such as season, weather conditions, and installation location. It is possible to decompose the fats and oils without being. In addition, it is possible to prevent the generation of malodors by suppressing the growth of anaerobic organisms, and to always exhibit high resolution, so that the quality of the treated water discharged from the decomposition tank is kept almost constant. Can be maintained.
[0020]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited at all by the following example.
(Samples of Examples and Comparative Examples)
A sample of Example 1 was Burkholderia cepacia AIK strain. Super H bacteria (trade name, manufactured by Condo FRP) was used as the sample of Comparative Example 1, and activated sludge (cultured at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology) was used as the sample of Comparative Example 2.
[0021]
(Test Example 1: Lard decomposition)
A medium prepared by dissolving the composition shown in Table 1 in purified water to make 1000.0 ml was sterilized by adding 500 ppm of lard and 10 ppm of detergent, and then shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water. In addition, it was confirmed by the property comparison test that this synthetic waste water has substantially the same properties as the actual waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a cell weight of 0.06 g in dry weight) was washed with the prepared synthetic waste water, added to 200 ml of the synthetic waste water, and shaken at 30 ° C. and 150 rpm. Cultured.
Finally, the concentration of lard in the synthetic waste water after a predetermined time elapsed was measured. The measurement method was carried out by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after the lapse of a predetermined time as the extraction efficiency of 98.6% (three controls were created and calculated separately). Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained. The same experiment was conducted using the sample of Comparative Example 1.
The results are shown in Table 2.
[0022]
[Table 1]
[Table 2]
As shown in Table 2, Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, has a remarkably superior resolution as compared with Comparative Example 1, and solid oils and fats can be obtained in 4 hours. It can be decomposed to a concentration of about 1/10 in about 1/4 or 9 hours, and can be decomposed almost completely after 24 hours.
[0025]
(Test Example 2; decomposition of salad oil)
The same medium as used in Test Example 1 was sterilized by adding 500 ppm of salad oil and 10 ppm of detergent, and then shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water. In addition, it was confirmed by the property comparison test that this synthetic waste water has substantially the same properties as the actual waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a cell weight of 0.06 g in dry weight) was washed with the prepared synthetic waste water, added to 200 ml of the synthetic waste water, and shaken at 30 ° C. and 150 rpm. Cultured.
Finally, the concentration of the salad oil contained in the synthetic waste water after a predetermined time was measured. The measurement method was carried out by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after the lapse of a predetermined time as an extraction efficiency of 97.5% (three controls were created and calculated separately). Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained.
A similar experiment was performed using the samples of Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
The results are shown in Table 3.
[0026]
[Table 3]
As the results shown in Table 3, the Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, has a remarkably superior resolution as compared with Comparative Examples 1 and 2, and the liquid fat is 4 It can be decomposed to a concentration of about 1/7 in time and about 1/10 in 9 hours, and can be decomposed almost completely after 24 hours.
[0028]
(Test Example 3; Temperature dependence in oil and fat decomposition)
A medium having the same composition as in Test Example 1 was sterilized by adding 500 ppm of salad oil and 10 ppm of detergent, and then shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a cell weight of 0.06 g in dry weight) was washed with the synthetic wastewater prepared above, and then added to 200 ml of the synthetic wastewater. Cultured with shaking for 4 hours.
Finally, the decomposition rate of salad oil was measured. The measurement method was performed by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water as an extraction efficiency of 97.5% (created separately for three controls and calculated separately).
Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained.
In addition, it measured by the same experiment method using the sample of the comparative example 1.
The results are shown in Table 4 and FIG. The solid line in FIG. 1 is a graph showing the results of Example, and the broken line is a graph showing the results of Comparative Example 1.
[0029]
[Table 4]
As shown in Table 4 and FIG. 1, Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, can be used for fats and oils even at a low temperature of 15 ° C. or lower and at a high temperature of 40 ° C. or higher. It can be seen that it has resolution. Further, it can be seen that in the temperature range of about 20 to 35 ° C., an extremely excellent resolution of 80% or more can always be exhibited.
[0031]
(Test Example 4: Influence of inoculum change on salad oil degradation)
Synthetic waste water was sterilized by adding 500 ppm of salad oil and 10 ppm of detergent to a medium having the same composition as in Test Example 1.
Next, after washing a predetermined amount of the sample of the example preliminarily cultured in the LB medium (containing microbial cells having a dry weight of 3.0 g in 1 liter of the medium) with the prepared synthetic wastewater, The mixture was cultured with shaking at 30 ° C. and 150 rpm for 4 hours.
Finally, the concentration of salad oil in the synthetic waste water was measured. The measurement method was carried out by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after the lapse of a predetermined time as the extraction efficiency of 97.5% (three controls were created and calculated separately).
Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained.
The results are shown in Table 5.
[0032]
[Table 5]
As a result of Table 5, Burkholderia cepacia (Burkholderia cepacia) AIK strain which is a novel microorganism according to the present invention can decompose fats and oils in a short time even with an extremely small addition amount.
[0034]
(Test Example 5: Decomposition of fats and oils in actual waste water)
After collecting the actual waste water, it was sterilized and filtered. The amount of n-hexane extract in this waste water was 15 ppm.
Next, the salad oil was added so that the amount of the n-hexane extract of this waste water was 500 ppm, and then shaken for 16 hours.
After washing 20 ml of the sample of the example preliminarily cultured in the LB medium (containing a microbial cell having a dry weight of 0.06 g) with the adjusted waste water, it was added to 200 ml of waste water, and cultured with shaking at 30 ° C. and 150 rpm.
Finally, the concentration of the n-hexane extract contained in the waste water after a predetermined time was measured.
Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained. The results are shown in Table 6.
[0035]
[Table 6]
As shown in the results of Table 6, Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, was also used in synthetic wastewater (Examples shown in Table 3 in which similar experiments were performed using synthetic wastewater). It can also be seen that substantially the same ability can be achieved even in actual waste water.
[0037]
(Test Example 6: Effect of peptone addition on decomposition of salad oil)
The medium having the same composition as in Test Example 1 was sterilized by adding 500 ppm salad oil, 10 ppm detergent, and 0.1% peptone, and then shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water.
Next, the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after a predetermined time was measured by the same method as in Test Example 2 described above. The results are shown in Table 7.
[0038]
[Table 7]
As shown in Table 7, Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, is present even if peptone, which is considered to be more easily degraded than oil, is present. If not (see the result of the example shown in Table 3 where a similar experiment was conducted without adding peptone), the decomposition ability substantially equivalent to that can be exhibited.
[0040]
(Test Example 7: Effect on salad oil degradation by pH change)
The culture medium having the same composition as in Test Example 1 was adjusted with a pH meter using 0.5 N HCl and 0.5 N NaOH, thereby adjusting the pH media shown in Table 8. Next, 500 ppm of salad oil and 10 ppm of detergent were added to each medium for sterilization, and then shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain synthetic waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a cell weight of 0.06 g in dry weight) was washed with each of the prepared synthetic waste water, and then added to 200 ml of the synthetic waste water, at 30 ° C. and 150 rpm. For 4 hours with shaking.
Finally, the concentration of salad oil contained in the synthetic waste water was measured. The measurement method was carried out by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after the lapse of a predetermined time as an extraction efficiency of 97.5% (three controls were created and calculated separately).
Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained.
The results are shown in Table 8 and FIG.
[0041]
[Table 8]
As shown in Table 8 and FIG. 2, the Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, can degrade oils and fats in a wide pH range. In particular, it can be seen that an extremely excellent resolution is exhibited when the pH is 7.0 to 8.0.
[0043]
(Test Example 8: Decomposition of salad oil in tap water)
After sterilizing by adding 500 ppm of salad oil to tap water, it was shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water. Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in LB medium (containing 0.06 g of dry cells) was washed with physiological saline and then added to 200 ml of the prepared synthetic waste water at 30 ° C. and 150 rpm. Cultured with shaking for 24 hours.
Finally, the concentration of salad oil contained in the synthetic waste water was measured. The measurement method was performed by measuring the concentration of the n-hexane extract in the medium as an extraction efficiency of 97.5% (three controls were created and calculated separately).
The same experiment was performed using the sample of Comparative Example 1.
As a control, the measurement was carried out by the same method when neither the sample of Example nor Comparative Example 1 was added.
Table 9 shows the results obtained by measuring three times for each sample.
[0044]
[Table 9]
As shown in Table 9, it can be seen that Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, can act and decompose fats and oils even in a situation where nutrients other than fats and oils are extremely small. .
[0046]
(Test Example 9: Effect of detergent on decomposition of lard)
The medium having the same composition as in Test Example 1 was sterilized by adding 500 ppm of lard, and then shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a cell weight of 0.06 g in dry weight) was washed with the prepared synthetic waste water, added to 200 ml of the synthetic waste water, and shaken at 30 ° C. and 150 rpm. Cultured.
Finally, the concentration of lard in the synthetic waste water after a predetermined time was measured. The measurement method was carried out by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after the lapse of a predetermined time as the extraction efficiency of 98.6% (three controls were created and calculated separately).
Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained.
The results are shown in Table 10.
[0047]
[Table 10]
According to the results shown in Table 10, Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, was obtained by adding a detergent (the same experiment was conducted with the addition of detergent) in Table 2. It can be seen that the decomposition ability for solid fats is increased.
[0049]
(Test Example 10: Effect of addition of detergent on decomposition of salad oil)
After sterilizing 500 ppm of salad oil in a medium having the same composition as in Test Example 1, it was shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a cell weight of 0.06 g in dry weight) was washed with the prepared synthetic waste water, added to 200 ml of the synthetic waste water, and shaken at 30 ° C. and 150 rpm. Cultured.
Finally, the concentration of salad oil in the synthetic waste water after a predetermined time elapsed was measured. The measurement method was carried out by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after the lapse of a predetermined time as the extraction efficiency of 98.6% (three controls were created and calculated separately).
Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained.
The results are shown in Table 11.
[0050]
[Table 11]
As a result shown in Table 11, Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, is obtained by adding a detergent (the same experiment was performed by adding a detergent) in Table 3. It can be seen that the resolution for liquid oils and fats is increased.
[0052]
(Test Example 11; decomposition of salad oil when incorporated in activated sludge)
A medium similar to that used in Test Example 1 was sterilized by adding 500 ppm of salad oil and 10 ppm of detergent, and then shaken at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water. In addition, it was confirmed by the property comparison test that this synthetic waste water has substantially the same properties as the actual waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a microbial cell having a dry weight of 0.06 g) was washed with the prepared synthetic waste water and then incorporated into 200 ml of the activated sludge of Comparative Example 2, which was synthesized. The mixture was added to 200 ml of waste water and cultured with shaking at 30 ° C. and 150 rpm.
Finally, the concentration of the salad oil contained in the synthetic waste water after 9 hours was measured. The measurement method was carried out by measuring the concentration of the n-hexane extract in the synthetic waste water after the lapse of a predetermined time as an extraction efficiency of 97.5% (three controls were created and calculated separately). Three samples were prepared for each measurement, and the average value was obtained.
The same experiment was conducted using the sample of Comparative Example 2.
The results are shown in Table 12.
[0053]
[Table 12]
As shown in Table 12, it can be seen that Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, can exhibit excellent resolution against oils and fats even when incorporated in activated sludge. .
[0055]
(Test Example 12: Decomposition of fatty acid)
Experiments were conducted on the resolution of fatty acids by Burkholderia cepacia AIK strain. As a substrate, the fatty acid composition of lard and salad oil was analyzed, and triolein, which is a single glyceride of oleic acid contained most in both, was used.
The experimental method was as follows. First, 500 ppm triolein and 10 ppm detergent were added to the same medium as used in Test Example 1 and sterilized, followed by shaking at a speed of 150 rpm for 16 hours to obtain a synthetic waste water.
Next, 20 ml of the sample of the example pre-cultured in the LB medium (containing a cell weight of 0.06 g in dry weight) was washed with the prepared synthetic waste water, added to 200 ml of the synthetic waste water, and shaken at 30 ° C. and 150 rpm. Cultured.
Finally, after methylation of the total amount of n-hexane extract contained in the synthetic waste water after 1 hour, 2 hours and 4 hours, and adding Heptadecanoate acid as an internal standard substance in equal amounts, Each was analyzed by gas chromatography. Table 13 shows the peak area of oleic acid corrected with the internal standard based on the peak area after 1 hour.
[0056]
[Table 13]
As shown in Table 13, it can be seen that Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, can degrade fatty acids such as oleic acid in a short time.
[0058]
【The invention's effect】
Burkholderia cepacia AIK strain, which is a novel microorganism according to the present invention, has high oil and fat resolving ability in a wide temperature range. In particular, in the temperature range of about 20 to 35 ° C., it always has a high resolution.
Moreover, the fats and oils to be decomposed are not limited to liquid fats and oils, and solid fats and oils have substantially the same resolution as that of liquid fats and oils.
Furthermore, since Burkholderia cepacia AIK strain can decompose organic substances such as fatty acids, proteins, carbohydrates, and sugars in addition to fats and oils, BOD (biochemical oxygen demand) in wastewater, It is possible to reduce COD (chemical oxygen demand).
[0059]
The wastewater treatment method according to the present invention is mainly a wastewater treatment method using bacteria capable of suitably decomposing fats and oils, so that it is always substantially constant without being affected by the temperature in the decomposition tank. Can be done. For this reason, the growth of anaerobic bacteria can be prevented and the generation of malodor can be suppressed.
[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the test results of Test Example 3. FIG.
FIG. 2 is a graph showing the test results of Test Example 7.
FIG. 3 is a graph showing an average temperature in the decomposition tank every month in a certain decomposition tank.
FIG. 4 is a graph showing the monthly average amount of n-hexane extract in treated water in a certain decomposition tank.
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