RU2560272C1 - Strain of bacteria serratia plymuthica - decomposer of crude oil and petroleum products - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: strain of bacteria Serratia plymuthica ELA-9 having the ability to dispose quickly of crude oil and petroleum products (diesel fuel, motor oil, hydraulic oil, gas condensate) is deposited in the RNCM under the registration number Serratia plymuthica VKM B-2819D and can be used for purification of soils and water reservoirs contaminated with crude oil and petroleum products, in a wide temperature range from +4 to +30°C.

EFFECT: invention enables to improve the quality of purification of soil and water reservoirs from crude oil and petroleum products.

3 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).The invention relates to the field of microbiology and is a new bacterial strain that can be used to clean soil and water contaminated with oil and oil products (diesel fuel, motor oil, hydraulic oil, gas condensate).

Аналоги изобретенияAnalogs of the invention

Известны штаммы: Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Авторское свидетельство SU № 1493666. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. A1, C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1:01, C12R 1:27, C02F 3/34, C02F 101:32, C02F 103:06. Заявка: 4280617, 09.07.1987. Опубликовано: 15.07.1989. Заявители: Киевский технологический институт пищевой промышленности, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.. Заболотного. Авторы: Клюшникова Т.М., Смирнова Г.Ф., Куберская С.Л., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С.), Flavobacterium tirrennicum (2. Авторское свидетельство SU № 1409594, 1988 г. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum, используемый для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. A1 C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R1:20, C02F 3/34, C02F 101:32. Заявка: 4066152, 24.03.1986. Опубликовано: 15.07.1988. Заявитель: Институт микробиологии и вирусологии АН КАЗССР. Авторы: Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И.), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.Known strains: Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Copyright certificate SU No. 1493666. A method for purifying oil shale wastewater from oil products. A1, C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1:01, C12R 1:27, C02F 3/34, C02F 101: 32, C02F 103: 06. Application: 4280617, 07/09/1987. Published: 07/15/1989 Applicants: Kiev Technological Institute of Food Industry, D. Microbiology and Virology Institute K .. Zabolotnogo Authors: Klyushnikova T.M., Smirnova G.F., Kuberskaya S.L., Slabospitskaya A.T., Zalevsky BC, Kasatkina T.P., Eliseeva G.S.), Flavobacterium tirrennicum ( 2. Copyright certificate SU No. 1409594, 1988. Strain b Flavobacterium tirrennicum, used for the purification of subsistence and industrial wastewater from oil and oil products A1 C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R1: 20, C02F 3/34, C02F 101: 32. Application: 4066152 , 24.03.1986. Published: 07/15/1988 Applicant: Institute of Microbiology and Virology, Academy of Sciences of the KAZSSR Authors: Novozhilova MI, Popova LE, Nedovodieva TP, Kalamkarova LI), which can decompose hydrocarbon oil. The disadvantage of the above strains is that they carry out the destruction of oil products only in water and are not able to clean the soil from oil.

Известен штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (3. Патент RU N 2019527. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений. С1, C02F 3/34, Е02В 15/04, С09K 17/00. Заявка: 93017464/26, 30.04.1993. Опубликовано: 15.09.1994. Заявитель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр. Авторы: Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. Патентообладатель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.A known strain of Rhodococcus erythroplis E-15 (3. Patent RU N 2019527. A method of purifying soils from oil pollution. C1, C02F 3/34, EWB 15/04, C09K 17/00. Application: 93017464/26, 04/30/1993. Published : September 15, 1994. Applicant: Northern State Research and Design Geological Center Authors: Koronelli T.V., Arakelyan E.I., Komarova T.I., Ilyinsky VV Patentee: Northern State Scientific research and development geological center), but the process of biodegradation of oil is slow and only with the addition of nitroammophos ki or nitroammophoski and sodium nitrate.

Известны штаммы Pseudomonas putida 36 (4. Авторское свидетельство СССР № 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), Acinetobacter sp. JN-2 (5. Патент RU N 2064017. Штамм бактерий Acinetobacter species ВКПМ В-5971, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 93009595/13, 23.02.1993. Опубликовано: 20.07.1996. Заявители: Ушков С.Б., Ильинская Н.В. Авторы: Ушков С.Б., Ильинская Н.В. Патентообладатели: Ушков С.Б., Ильинская Н.В.); Pseudomonas alcaligenes Е7 (6. Патент RU № 2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробиологии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.Н., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробиологии) и Pseudomonas alcaligenes В-1 (7. Патент RU № 2133770. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes B-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. С1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 98105709/13, 25.03.1998. Опубликовано: 27.07.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробиологии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробиологии). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах, что не эффективно в районах с холодным климатом.The known strains of Pseudomonas putida 36 (4. USSR author's certificate No. 1076446, the Pseudomonas putida 36 strain used to clean water and soil from oil and oil products. A1, C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34 , C02F 101: 32, C12N 1/20, C12R 1:40 Application: 3474745, 07/22/1982 Published: 02/28/1984 Applicant: West Siberian Petroleum Research Institute Authors: Dyadechko VN, Tolstokorova L.E., Morozova T.N.), Acinetobacter sp. JN-2 (5. Patent RU N 2064017. The bacterial strain Acinetobacter species VKPM B-5971 used to purify water and soil from oil and oil products. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, B09C 1/10. Application: 93009595/13, 02/23/1993 Published: 07/20/1996 Applicants: Ushkov SB, Ilyinskaya N.V. Authors: Ushkov SB, Ilyinskaya N.V. Patent holders: Ushkov SB, Ilyinskaya N. .AT.); Pseudomonas alcaligenes E7 (6. Patent RU No. 2134723. The bacterial strain Pseudomonas alcaligenes E7 used to clean water and soil from oil and oil products. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Application: 98105707/13, 3/25/1998. Published: 08/20/1999 Applicant: State Scientific Center for Applied Microbiology Authors: Ermolenko Z.M., Kholodenko V.N., Chugunov V.A. State Scientific Center for Applied Microbiology) and Pseudomonas alcaligenes B-1 (7. Patent RU No. 2133770. The bacterial strain Pseudomonas alcaligenes B-1 used to purify water and soil from oil and oil products. C1, C12N 1/20, C02F 3/34 , B09C 1/10 Application: 98105709/13, 03/25/1998 Published: 07/27/1999 Applicant: State Scientific Center for Applied Microbiology Authors: Ermolenko Z.M., Kholodenko V.P., Chugunov V.A., Kobelev BC, Akimova N.A. Patentee: State Scientific Center for Applied Microbiology). The disadvantage of the strains is that they utilize oil at relatively high temperatures, which is not effective in areas with a cold climate.

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (8. Патент RU 2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве и не способен осуществлять очистку воды от нефти и утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +4 до +30°С.The prototype is a bacterial strain "Bacillus subtilis Kolyma 7/2" (8. Patent RU 2446900. The method of cleaning frozen soils from oil with spore-forming bacteria Bacillus subtilis. C2. B09C 1/10 (2006.01). Application: 2010129158/13, 13.07. 2010. Published: 04/10/2012 Authors: Neustroev M.P., Tarabukina N.P., Neustroev M.M., Sazonov N.N., Parnikova S.I., Stepanova AM Patentee: State Scientific Institution Yakutsk Scientific Agricultural Research Institute of the Russian Agricultural Academy), which has the ability to reduce the oil concentration to 0.48%, that is, the oil level from 135143 mg / kg is reduced to 645 mg / kg during the 3 months of the summer period. However, the strain degrades only oil and only in soil and is not able to purify water from oil and dispose of oil products (diesel fuel, engine oil, hydraulic oil, gas condensate), including in a wide temperature range from +4 to + 30 ° FROM.

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C, который может быть использован для очистки почв и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).The objective of the invention is to obtain a strain of bacteria with high utilizing ability in relation to both oil and oil products in a relatively short time, in a wide temperature range from +4 to + 30 ° C, which can be used to clean soils and water contaminated oil and oil products (diesel fuel, motor oil, hydraulic oil, gas condensate).

Предлагаемый штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9 VKМ В-2819D выделен из почвогрунтов, загрязненных арктическим дизельным топливом на территории Дизельной электростанции с. Чалчылган, Амгинский район, Республика Саха (Якутия). Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером VKMB-2819D.The proposed bacterial strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D isolated from soil contaminated with Arctic diesel fuel in the territory of the Diesel power station Chalchylgan, Amga district, Republic of Sakha (Yakutia). The strain is identified and deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms (VKM) of the Federal State Budgetary Institution of Science Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G.K. Scriabin, Russian Academy of Sciences (IBPM RAS) under registration number VKMB-2819D.

Штамм Serratia plymuthica ELA-9 VKМ В-2819D утилизирует нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в качестве единственного источника углерода. Процесс идет в широком диапазоне температур (+4+30°C).The strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D utilizes oil and oil products (diesel fuel, engine oil, hydraulic oil, gas condensate) as the only carbon source. The process runs in a wide temperature range (+ 4 + 30 ° C).

Использование штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D в естественных условиях, для очистки мерзлотной почвы от нефти, при средней температуре почвы от +8 до +14°C, позволяет достичь 56,98% деструкции нефти за 1 вегетационный период.The use of the strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D in vivo, for cleaning frozen soil from oil, with an average soil temperature of +8 to + 14 ° C, allows to achieve 56.98% of the destruction of oil for 1 growing season.

Деструкция нефти и нефтепродуктов в воде при температуре воды +20°C составляет 59,25 % за 2 месяца.The destruction of oil and oil products in water at a water temperature of + 20 ° C is 59.25% for 2 months.

Деструкция нефти и нефтепродуктов в водной среде с добавлением минеральных компонентов предлагаемым штаммом на 5-е сутки культивирования при температуре +20+30°C составляет 48,78-60,2% - для нефти; 49,6-58,34% - для дизельного топлива; 48,74-57,72% - для масла моторного; 65,40-68,8% - для масла гидравлического; 57,77-65,52% - для газового конденсата; на 14 сутки культивирования при температуре +4°C штамм Serratia plymuthica ELA-9 VKМ В-2819D утилизирует 20,06% - нефти; 25,60% - дизельного топлива; 27,15% - масла моторного; 31,00% - масла гидравлического; 31,8% - газового конденсата.The destruction of oil and oil products in the aquatic environment with the addition of mineral components of the proposed strain on the 5th day of cultivation at a temperature of + 20 + 30 ° C is 48.78-60.2% for oil; 49.6-58.34% - for diesel fuel; 48.74-57.72% - for motor oil; 65.40-68.8% - for hydraulic oil; 57.77-65.52% - for gas condensate; on the 14th day of cultivation at a temperature of + 4 ° C, the strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D utilizes 20.06% of oil; 25.60% - diesel; 27.15% - motor oil; 31.00% - hydraulic oil; 31.8% - gas condensate.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.The resulting strain is characterized by the following features.

Морфологические признаки: грамотрицательные, палочковидные, перитрихиальные, аспорогенные, хемороганотрофные, факультативно-анаэробные бактерии.Morphological signs: gram-negative, rod-shaped, peritrichous, asporogenous, chemorhanotrophic, facultative anaerobic bacteria.

Культуральные признаки.Cultural signs.

Растет при температуре +4+25±1°C, оптимум роста +4+15±°C в аэробных условиях, но может расти при температуре +30°C и в анаэробных условиях, однако теряет пигмент.It grows at a temperature of + 4 + 25 ± 1 ° C, the optimum growth is + 4 + 15 ± ° C under aerobic conditions, but can grow at a temperature of + 30 ° C and under anaerobic conditions, however, it loses pigment.

На мясопептонном агаре (ΜΠΑ) (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2, формирует влажные от малинового до оранжевого цвета колонии диаметром 1-3 мм.On meat peptone agar (ΜΠΑ) (wt.%): Enzymatic peptone - 1.0; sodium chloride - 0.5; agar - 1.0; meat water - the rest, pH 7.0-7.2, forms wet colonies with a diameter of 1-3 mm from raspberry to orange.

На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5, формирует пастообразные матовые, от малинового до оранжевого цвета колонии диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.On nutrient agar based on a fish meal hydrolyzate (wt.%): A fish meal hydrolyzate - 1.2; enzymatic peptone - 1.2; sodium chloride - 0.6; agar - 1.0; distilled water the rest; pH 7.1-7.5, forms a paste-like dull, from raspberry to orange color colonies with a diameter of 1-3 mm. The consistency is soft, easily removed from the surface of the agar, easily smeared.

На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3, формирует сметанообразные колонии оранжевато-малинового цвета, диаметром 1-5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.On the environment of Saburo (wt.%): Hydrolyzed fish meal - 1.0; casein pancreatic hydrolyzate - 1.0; yeast extract - 0.2; monosubstituted sodium phosphate - 0.2; D-glucose 4.0; agar - 1.0; distilled water - the rest; pH 6.0 ± 3, forms creamy colonies of orange-raspberry color, 1-5 mm in diameter. The consistency is soft, easily removed from the surface of the medium, easily smeared.

В мясопептонном бульоне (масс. %): ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2, вызывает диффузное помутнение с диффунгированием малинового пигмента в бульон.In meat and peptone broth (wt.%): Enzymatic peptone - 1.0, sodium chloride - 0.5, meat water - the rest; pH 7.0-7.2, causes diffuse turbidity with diffusion of raspberry pigment in the broth.

На минеральной среде Мюнца (9. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава: (масс. %) ΚΝO₃ - 0,4; MgSO₄·7Η₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРO₄ - 0,14; KН₂РO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, растет в виде пастообразных малиновых колоний диаметром 1-3 мм.On the mineral environment of Münz (9. Kersten DK Morphological and cultural properties of indicator microorganisms of oil and gas imaging - Microbiology, 1963, No. 5 - S. 1024-1030) with oil and oil products (diesel fuel, motor oil, hydraulic oil, gas condensate , gasoline) of the following composition: (wt.%) ΚΝO ₃ - 0.4; MgSO ₄ · 7Η ₂ O - 0.08; NaCl - 0.1; K ₂ HPO ₄ - 0.14; KH ₂ PO ₄ - 0.06; agar - 2.0; oil or petroleum products - 1.0; distilled water - the rest, pH 7.2, grows in the form of pasty raspberry colonies with a diameter of 1-3 mm.

Биохимические признаки.Biochemical signs.

Оксидазаположительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен. Сероводород не продуцирует. Активен в отношении инозита. Уреазаположителен. Тест с β-галактозидазой - положительный. Ферментирует сахарозу, маннит, сорбит, мальтозу. Не ферментирует лактозу, ацетат натрия, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии нефтяные УВ.Oxidase-positive, does not decarboxylate lysine and ornithine, is not able to break down phenylalanine. Indolenegative. Hydrogen sulfide does not produce. Active against inositol. Urease positive. The test with β-galactosidase is positive. Ferments sucrose, mannitol, sorbitol, maltose. Does not ferment lactose, sodium acetate, sodium citrate, sodium malonate. Uses petroleum hydrocarbons as an energy source.

Устойчив к каотиму, амоксициллину, пефлоксацину, амоксиклаву, левомицетину, цефатоксиму, цефтриаксону, полимиксину, фуразолидону, метранидазолу, амосину. Слабоустойчив к бензилпенициллину, мозивару, оксациллину, ампициллину.Resistant to caotima, amoxicillin, pefloxacin, amoxiclav, chloramphenicol, cefatoxime, ceftriaxone, polymyxin, furazolidone, metranidazole, amosin. Weakly resistant to benzylpenicillin, mozivar, oxacillin, ampicillin.

При секвенировании вариабельных участков 16SpPHK получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:When sequencing the variable regions of 16SpPHK, the following assembled nucleotide sequence was obtained for the studied strain:

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16SpPHK тестируемый штамм отнесен к виду Serratia plymuthica.According to the results of the analysis of sequencing of variable regions of 16SpPHK, the test strain is assigned to the species Serratia plymuthica.

Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм наиболее близок к виду Serratia plymuthica (99,77%).Screening using the GenBank and RDP-II database showed that the studied strain is closest to the species Serratia plymuthica (99.77%).

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).The strain is not virulent, not toxic, not toxigenic, not phytotoxic (the test was carried out on white mice and seeds of higher plants (oats cultivar Skakun and wheat cultivar Prilenskaya-19)).

Условия хранения:Storage conditions:

1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°C.1. In lyophilized form in ampoules at + 4 ° C.

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном ΜΠΑ.2. The strain can be maintained by regular reseeding (1 time in 2 weeks) on slant ΜΠΑ.

Пример 1. Культивирование штамма Serratia ptymuthica ELA-9 VKM B-2819DExample 1. The cultivation of a strain of Serratia ptymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Предлагаемый штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D выделен из почвогрунтов, загрязненных арктическим дизельным топливом на территории Дизельной электростанции с. Чапчылган, Амгинский район, Республика Саха (Якутия).The proposed bacterial strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D isolated from soil contaminated with Arctic diesel fuel in the territory of the Diesel power station Chapchylgan, Amga district, Republic of Sakha (Yakutia).

Культивирование штамма проводили в минеральной среде Мюнца следующего состава (г/дм³): ΚΝO₃ - 4,0; MgSO₄·7Η₂Ο-0,8; NaCl - 1,0; K₂НРO₄- 1,4; KН₂РO₄ - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная 1,0 дм³; pH среды - 7,2. Для чего 1,0 г нефтезагрязненной почвы с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°C. Рост бактерий наблюдали уже через 72 часа инкубации по образованию мутной розоватой эмульсии и исчезновению маслянистых пятен нефти. Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с агаром из гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар). Далее посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при +4+15+20+30°C. Через 48 часов на поверхности ГРМ-агара появились сметанообразные колонии малинового цвета, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (10. Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.) идентифицированы как штамм Serratia plymuthica.The cultivation of the strain was carried out in the Muntz mineral medium of the following composition (g / dm <sup>3</sup> ): ΚΝO <sub>3</sub> - 4.0; MgSO <sub>4</sub> · 7Η <sub>2</sub> Ο-0.8; NaCl - 1.0; K <sub>2</sub> HPO <sub>4</sub> - 1.4; KH <sub>2</sub> PO <sub>4</sub> 0.6; agar - 20.0; distilled water 1.0 dm <sup>3</sup> ; the pH of the medium is 7.2. For this, 1.0 g of oil-contaminated soil from the above object was added to 250 ml of the Muntz mineral medium. As the only source of carbon and energy, oil was used, which was introduced into the Münz medium in an amount of 1000 mg per 1.0 dm <sup>3 of</sup> medium. The incubation was carried out in thermostatic rocking conditions on the installation "UVMT-12-250" at 200 rpm and a temperature of + 20 ± 1 ° C. Bacterial growth was observed after 72 hours of incubation by the formation of a turbid pinkish emulsion and the disappearance of oily stains of oil. A pure bacterial culture was obtained by culturing under the above conditions and repeated reseeding (more than 10) of the accumulative culture on Petri dishes with agar from a fish meal hydrolyzate (timing agar). Further, the crops were incubated under stationary conditions in a thermostat at + 4 + 15 + 20 + 30 ° C. After 48 hours, creamy raspberry-colored colonies appeared on the surface of the timing agar, which, according to the cultural-morphological and biochemical characteristics, as well as the results of the analysis of the nucleotide sequences of the 16SpPHK gene and key phenotypic characters according to the taxonomic descriptions given in the Bergi Identifier (10. Bergey` s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.) identified as a strain of Serratia plymuthica.

Изолированные колонии пересевали на скошенный мясопептонный агар. Через 48 часов инкубации при температуре +20°C клетки штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D со скошенного агара использовали для определения активности в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.Isolated colonies were subcultured on slanted meat-peptone agar. After 48 hours of incubation at a temperature of + 20 ° C, cells of the strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D from mowed agar were used to determine activity in the process of destruction of oil and oil products.

Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности штамма бактерий Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819DExample 2. The study of the oil-oxidizing activity of the bacterial strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Клетки штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D со скошенного мясо-пептонного агара смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.Cells of the strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D are washed off with beveled meat-peptone agar using a 0.9% NaCl solution, and an initial microbial suspension of the bacterial isolate is prepared, with a volume of 25 cm ³ , with a concentration of 1 × 10 ⁹ microbial cells / cm ³ by optical GISK standard to them. AM Tarasevich.

Полученный бактериальный изолят штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D культивируют в минеральной среде Мюнца, состав которой описан в примере 1.The obtained bacterial isolate of the strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D was cultured in a mineral Münz medium, the composition of which is described in example 1.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ клеток/см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин, при температурах +4°C; +20°C; +30°C в течение 5 суток.100.0 cm ^{3 of the} finished mineral medium and 1000 mg of oil are introduced into cones with a volume of 200.0 cm ³ . Flasks are seeded with cells of the strain to a concentration of 1 · 10 ⁹ cells / cm ³ . As a control, put the same flask with medium, oil and without bacteria to determine the total (natural) losses. The experiment is carried out in triplicate. The flasks are cultured in rocking conditions on the installation "UVMT-12-250" at 200 rpm, at temperatures + 4 ° C; + 20 ° C; + 30 ° C for 5 days.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (11.ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»; 12.РД 39-0147098-90 Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома).Biodegradation of oil and oil products is determined by the spectrometric method using an IKN-025 concentrator (11.FR 1.31.2007.03234 MVI 02/01/117 Method for measuring the mass concentration of oil products in drinking, natural and waste waters by the IR spectrometric method using an IKN concentrator -025 "; 12. RD 39-0147098-90 Instructions for monitoring the condition of soils at the facilities of enterprises of the Ministry of Oil and Gas Industry).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм уже на 5-е сутки при температуре +20+30°C утилизирует 48,78-60,2% - нефти; 49,6-58,34% - дизельного топлива; 48,74-57,72% - масла моторного; 65,40-68,8% - масла гидравлического; 57,77-65,52% - газового конденсата; на 14 сутки при температуре +4°C утилизирует 20,06% - нефти; 25,60% - дизельного топлива; 27,15% - масла моторного; 31,00% - масла гидравлического; 31,8% - газового конденсата (таблица 1).The experimental data show that in the aquatic environment with mineral components the proposed strain already utilizes 48.78-60.2% of oil on the 5th day at a temperature of + 20 + 30 ° C; 49.6-58.34% - diesel fuel; 48.74-57.72% - motor oil; 65.40-68.8% - hydraulic oil; 57.77-65.52% - gas condensate; on day 14 at a temperature of + 4 ° C utilizes 20.06% of oil; 25.60% - diesel; 27.15% - motor oil; 31.00% - hydraulic oil; 31.8% - gas condensate (table 1).

Пример 3. Приготовление препарата на основе клеток штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819DExample 3. Preparation of a preparation based on cells of the strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Клетки штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D со скошенного мясо-пептонного агара смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.Cells of the strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D from mowed meat-peptone agar are washed with 0.9% NaCl solution, the initial microbial suspension of the bacterial isolate is prepared, with a volume of 25 cm ³ , with a concentration of 1 · 10 ⁹ microbial cells / cm ³ optical GISK standard to them. AM Tarasevich.

В стерильных условиях в 100,0 см³ минеральной среды Мюнца (по примеру 1) 10,0 см³ суспензии бактериального изолята. Культивируют в колбах на качалке в течение 48 часов, при температуре 20±1°C. Получают жидкую мутноватую эмульсию малинового оттенка, с титром не менее 1 млрд клеток/см³, которую используют как препарат для обработки почвы или воды от загрязнений нефтью.Under sterile conditions, a 100.0 cm ³ Muntz mineral medium (Example 1), 10.0 cm ³ of suspension of the bacterial isolate. Cultivate in flasks on a rocking chair for 48 hours at a temperature of 20 ± 1 ° C. Get a liquid turbid emulsion of raspberry color, with a titer of at least 1 billion cells / cm ³ , which is used as a preparation for treating soil or water from oil pollution.

Пример 4. Применение препарата на основе клеток штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D для очистки почвы от нефтезагрязненияExample 4. The use of a preparation based on cells of the strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D for cleaning the soil from oil pollution

Способность штамма Serratia plymuthica VKM B-2819D активировать процессы деградации нефтезагрязнений в почве показаны в условиях полевого опыта. Препарат, полученный по примеру 3, вносят в количестве 1 литра на 10 кг нефтезагрязненного субстрата. Почву перемешивают и экспонируют в течение 1 вегетационного периода (2,5 месяца) (таблица 2).The ability of the strain Serratia plymuthica VKM B-2819D to activate the processes of degradation of oil pollution in the soil is shown in a field experiment. The preparation obtained in example 3 is added in an amount of 1 liter per 10 kg of oil-contaminated substrate. The soil is mixed and exposed for 1 growing season (2.5 months) (table 2).

За один вегетационный период деградация нефтезагрязнений на опытных участках, обработанных бактериальной суспензией, составляла при использовании штамма: Serratia plymuthica VKM B-2819D - 56,98%; в контрольной почве, не обработанной бактериальной суспензией, естественные потери нефтезагрязнения составили - 11,5%.During one growing season, the degradation of oil pollution in the experimental sites treated with a bacterial suspension was when using the strain: Serratia plymuthica VKM B-2819D - 56.98%; in the control soil not treated with bacterial suspension, the natural losses of oil pollution amounted to 11.5%.

Пример 5. Очистка воды от нефти с помощью препарата на основе клеток штамма Serratia plymuthica VKM B-2819DExample 5. Water purification from oil using a preparation based on cells of the strain of Serratia plymuthica VKM B-2819D

В эксикатор объемом 5,0 дм³, вносили 3,0 дм³ воды и 30,0 см³ препарата на основе штамма бактерий Serratia plymuthica VKM B-2819D, полученного вышеописанным способом (пример 3). Для создания нефтяной пленки, в емкости добавляли 30000 мг сырой неочищенной нефти. В качестве контроля использовали воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микроорганизмов.3.0 dm ^{3 of} water and 30.0 cm ^{3 of a} preparation based on the bacterial strain Serratia plymuthica VKM B-2819D obtained as described above were added to a desiccator with a volume of 5.0 dm ³ (example 3). To create an oil film, 30,000 mg of crude crude oil was added to the tank. As a control, water was used in an amount of 3.0 dm ³ with the addition of 30,000 mg of oil and without introducing microorganisms.

Эксперименты проводились в течение 2-х месяцев при температуре воды +20±1°C.The experiments were carried out for 2 months at a water temperature of + 20 ± 1 ° C.

Биодеградацию нефти определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025».Oil biodegradation is determined by spectrometric method using a concentrator "IKN-025".

Установлено, что деструкция нефти в воде за 2 месяца составила 59,25%. Деструкция в контрольной емкости за 2 месяца существенно не изменилась (таблица 3).It was found that the destruction of oil in water for 2 months amounted to 59.25%. The destruction in the control capacity for 2 months has not changed significantly (table 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма Serratia plymuthica VKM B-2819D является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C, который может быть использован как для очистки почв, так и для очистки воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).Thus, the advantage of the proposed strain of Serratia plymuthica VKM B-2819D is that it has a high utilizing ability with respect to both oil and oil products in a relatively short time, over a wide temperature range from +4 to + 30 ° C, which It can be used both for cleaning soils and for treating water contaminated with oil and oil products (diesel fuel, motor oil, hydraulic oil, gas condensate).

Claims (1)

Штамм бактерий Serratia plymuthica VKM B-2819D - деструктор нефти и нефтепродуктов. The bacterial strain Serratia plymuthica VKM B-2819D is a destructor of oil and oil products.