RU2020105065A - Способы и композиции для оценки опосредованного crispr/cas разрушения или вырезания и индуцированной crispr/cas рекомбинации с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой in vivo - Google Patents
Способы и композиции для оценки опосредованного crispr/cas разрушения или вырезания и индуцированной crispr/cas рекомбинации с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой in vivo Download PDFInfo
- Publication number
- RU2020105065A RU2020105065A RU2020105065A RU2020105065A RU2020105065A RU 2020105065 A RU2020105065 A RU 2020105065A RU 2020105065 A RU2020105065 A RU 2020105065A RU 2020105065 A RU2020105065 A RU 2020105065A RU 2020105065 A RU2020105065 A RU 2020105065A
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- human animal
- reporter
- protein
- crispr
- guide rna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims 53
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims 50
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims 48
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims 26
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 87
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims 42
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 32
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims 13
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 claims 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims 6
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims 3
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 claims 2
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 claims 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 claims 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 claims 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8775—Murine embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
- A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
- C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Claims (115)
1. Отличное от человека животное, содержащее репортер CRISPR для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR интегрирован в целевой геномный локус и содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны.
2. Отличное от человека животное по п. 1, в котором репортер CRISPR также предназначен для оценки индуцированной CRISPR/Cas рекомбинации репортера CRISPR с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой.
3. Отличное от человека животное по п. 2, в котором первый репортерный белок содержит третью целевую последовательность направляющей РНК, причем рекомбинация репортера CRISPR с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой изменяет кодирующую последовательность для первого репортерного белка на кодирующую последовательность для третьего репортерного белка.
4. Отличное от человека животное по п. 3, в котором кодирующая последовательность для первого репортерного белка изменяется на кодирующую последовательность для третьего репортерного белка путем замены одного кодона.
5. Отличное от человека животное по п. 3 или 4, в котором третья целевая последовательность направляющей РНК перекрывается с частью кодирующей последовательности для первого репортерного белка, модифицированного экзогенной донорской нуклеиновой кислотой.
6. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором один из первого и второго репортерных белков содержит флуоресцентный репортерный белок.
7. Отличное от человека животное по п. 6, в котором флуоресцентный репортерный белок содержит усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) или усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP).
8. Отличное от человека животное по п. 6 или 7, в котором первый и второй репортерные белки содержат флуоресцентный репортерный белок и нефлуоресцентный репортерный белок.
9. Отличное от человека животное по п. 8, в котором флуоресцентный репортерный белок может быть обнаружен в анализе с помощью проточной цитометрии, а нефлуоресцентный белок может быть обнаружен в гистохимическом анализе.
10. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором один из первого и второго репортерных белков содержит белок бета-галактозидазу.
11. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором первый сигнал полиаденилирования также фланкирован сайтами узнавания рекомбиназы для первой рекомбиназы.
12. Отличное от человека животное по п. 11, в котором сайты узнавания рекомбиназы для первой рекомбиназы представляют собой последовательности loxP.
13. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором репортерная кассета содержит мультицистронную нуклеиновую кислоту, содержащую кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка, разделенных промежуточным участком внутренней посадки рибосомы (IRES) или промежуточной кодирующей последовательностью пептида 2A.
14. Отличное от человека животное по п. 13, в котором мультицистронная нуклеиновая кислота содержит кодирующую последовательность бета-галактозидазы и кодирующую последовательность усиленного синего флуоресцентного белка (eBFP) или кодирующую последовательность усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), разделенную промежуточной кодирующей последовательностью пептида P2A.
15. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором репортер CRISPR функционально связан с эндогенным промотором в целевом геномном локусе.
16. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором 5’-конец репортера CRISPR дополнительно содержит 3’-последовательность сплайсинга.
17. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором репортер CRISPR дополнительно содержит кассету селекции.
18. Отличное от человека животное по п. 17, в котором кассета селекции фланкирована сайтами узнавания рекомбиназы для второй рекомбиназы.
19. Отличное от человека животное по п. 17 или 18, в котором кассета селекции содержит ген лекарственной устойчивости.
20. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором расстояние между первой целевой последовательностью направляющей РНК и второй целевой последовательностью направляющей РНК составляет менее чем приблизительно 500 пар нуклеотидов.
21. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором первая целевая последовательность направляющей РНК и вторая целевая последовательность направляющей РНК идентичны, и каждая из них содержит SEQ ID NO: 41.
22. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, причем отличное от человека животное представляет собой крысу или мышь.
23. Отличное от человека животное по п. 22, причем отличное от человека животное представляет собой мышь.
24. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором целевой геномный локус представляет собой локус «безопасной гавани».
25. Отличное от человека животное по п. 24, в котором локус «безопасной гавани» представляет собой локус Rosa26.
26. Отличное от человека животное по п. 25, в котором репортер CRISPR вставлен в первый интрон локуса Rosa26.
27. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, причем отличное от человека животное представляет собой мышь, и
причем целевой геномный локус представляет собой локус Rosa26, и
причем репортер CRISPR функционально связан с эндогенным промотором Rosa26, вставлен в первый интрон локуса Rosa26 и содержит от 5’ к 3’:
(а) 3’ последовательность сплайсинга;
(b) первый сигнал полиаденилирования, фланкированный:
(i) первым и вторым сайтами loxP и
(ii) первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем первая целевая последовательность направляющей РНК и вторая целевая последовательность направляющей РНК идентичны, и каждая из них содержит SEQ ID NO: 41; и
(c) репортерную кассету, содержащую от 5’ к 3’:
(i) кодирующую последовательность бета-галактозидазы;
(ii) кодирующую последовательность P2A;
(iii) кодирующую последовательность усиленного синего флуоресцентного белка (eBFP), причем кодирующая последовательность eBFP содержит третью целевую последовательность направляющей РНК, содержащую SEQ ID NO: 42; и
(iv) второй сигнал полиаденилирования, причем первый сигнал полиаденилирования и второй сигнал полиаденилирования различны.
28. Отличное от человека животное по п. 27, в котором репортер CRISPR дополнительно содержит:
(d) кассету селекции 3’ репортерной кассеты, причем кассета селекции фланкирована сайтами FRT и содержит от 5’ к 3’:
(i) кодирующую последовательность неомицин-фосфотрансферазы, функционально связанную с промотором убиквитина человека; и
(ii) третий сигнал полиаденилирования.
29. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, причем отличное от человека животное является гетерозиготным по отношению к репортеру CRISPR в целевом геномном локусе.
30. Отличное от человека животное по любому из пп. 1-28, причем отличное от человека животное является гомозиготным по отношению к репортеру CRISPR в целевом геномном локусе.
31. Способ исследования способности нуклеазы CRISPR/Cas вырезать геномную нуклеиновую кислоту in vivo, предусматривающий:
(а) введение отличному от человека животному по любому из пп. 1-30:
(i) первой направляющей РНК, предназначенной для гибридизации с первой целевой последовательностью направляющей РНК в репортере CRISPR;
(ii) второй направляющей РНК, предназначенной для гибридизации со второй целевой последовательностью направляющей РНК в репортере CRISPR; и
(iii) белка Cas; и
(b) измерение активности или экспрессии по меньшей мере одного из первого и второго репортерных белков.
32. Способ по п. 31, при котором белок Cas представляет собой белок Cas9.
33. Способ по п. 31 или 32, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме белка.
34. Способ по п. 31 или 32, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме информационной РНК, кодирующей белок Cas.
35. Способ по п. 31 или 32, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей белок Cas, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток в отличном от человека животном.
36. Способ по любому из пп. 31-35, при котором первая направляющая РНК и вторая направляющая РНК идентичны и каждая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
37. Способ по любому из пп. 31-36, при котором репортерный белок, измеренный на стадии (b), представляет собой флуоресцентный репортерный белок, а стадия (b) предусматривает анализ с помощью проточной цитометрии.
38. Способ по любому из пп. 31-36, при котором репортерный белок, измеренный на стадии (b), представляет собой белок бета-галактозидазу, а стадия (b) предусматривает анализ гистохимическим окрашиванием.
39. Способ по любому из пп. 31-38, при котором направляющие РНК на стадии (а) вводят в форме РНК.
40. Способ по любому из пп. 31-38, при котором каждая из направляющих РНК на стадии (а) вводится отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей направляющую РНК, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток у отличного от человека животного.
41. Способ по любому из пп. 31-40, при котором введение предусматривает опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку или гидродинамическую доставку.
42. Способ по п. 41, при котором введение предусматривает опосредованную AAV доставку.
43. Способ по п. 42, при котором введение предусматривает опосредованную AAV8 доставку, и стадия (b) предусматривает измерение активности репортерного белка в печени отличного от человека животного.
44. Способ оптимизации способности нуклеазы CRISPR/Cas вырезать геномную нуклеиновую кислоту in vivo, предусматривающий:
(I) выполнение способа по любому из пп. 31-43 в первый раз у первого отличного от человека животного;
(II) изменение переменной и выполнение способа стадии (I) во второй раз с измененной переменной у второго отличного от человека животного; и
(III) сравнение активности или экспрессии репортерного белка на стадии (I) с активностью или экспрессией по меньшей мере одного репортерного белка на стадии (II) и выбор способа, приводящего к более высокой активности или экспрессии репортерного белка.
45. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки вводимых направляющих РНК и/или белка Cas отличному от человека животному.
46. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения направляющих РНК и/или белка Cas, вводимых отличному от человека животному.
47. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество направляющих РНК и/или белка Cas, введенных отличному от человека животному.
48. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество направляющих РНК, введенных отличному от человека животному, относительно концентрации или количества белка Cas, введенного отличному от человека животному.
49. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой направляющие РНК, введенные отличному от человека животному.
50. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой белок Cas, введенный отличному от человека животному.
51. Способ исследования индуцированной CRISPR/Cas рекомбинации геномной нуклеиновой кислоты с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой in vivo, предусматривающий:
(а) предоставление отличного от человека животного по любому из пп. 1-30, в котором репортер CRISPR также предназначен для оценки индуцированной CRISPR/Cas рекомбинации репортера CRISPR с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой, причем первый сигнал полиаденилирования был удален из репортера CRISPR и причем кодирующая последовательность для первого репортерного белка содержит третью целевую последовательность направляющей РНК, и введение отличному от человека животному:
(i) направляющей РНК, предназначенной для гибридизации с третьей целевой последовательностью направляющей РНК в репортере CRISPR;
(ii) белка Cas и
(iii) экзогенной донорской нуклеиновой кислоты, способной рекомбинировать с репортером CRISPR и изменять кодирующую последовательность для первого репортерного белка на кодирующую последовательность для третьего репортерного белка; и
(b) измерение активности или экспрессии третьего репортерного белка.
52. Способ по п. 51, при котором белок Cas представляет собой белок Cas9.
53. Способ по п. 51, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме белка.
54. Способ по п. 51, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме информационной РНК, кодирующей белок Cas.
55. Способ по п. 51, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей белок Cas, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток отличного от человека животного.
56. Способ по любому из пп. 51-55, при котором третий репортерный белок, измеренный на стадии (b), представляет собой флуоресцентный репортерный белок, а стадия (b) предусматривает анализ с помощью проточной цитометрии.
57. Способ по любому из пп. 51-56, при котором первый репортерный белок представляет собой усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), а третья направляющая РНК содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.
58. Способ по любому из пп. 51-57, при котором первый репортерный белок представляет собой усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), а третий репортерный белок представляет собой усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP).
59. Способ по п. 58, при котором экзогенная донорская нуклеиновая кислота содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16.
60. Способ по любому из пп. 51-59, при котором экзогенная донорская нуклеиновая кислота представляет собой одноцепочечный дезоксинуклеотид.
61. Способ по любому из пп. 51-60, при котором направляющую РНК на стадии (а) вводят в форме РНК.
62. Способ по любому из пп. 51-60, при котором направляющую РНК на стадии (а) вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей направляющую РНК, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток отличного от человека животного.
63. Способ по любому из пп. 51-62, при котором введение предусматривает опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку или гидродинамическую доставку.
64. Способ по п. 63, при котором введение предусматривает опосредованную доставку AAV.
65. Способ по п. 64, при котором введение предусматривает опосредованную доставку AAV8, а стадия (b) предусматривает измерение активности репортерного белка в печени отличного от человека животного.
66. Способ оптимизации способности CRISPR/Cas индуцировать рекомбинацию геномной нуклеиновой кислоты с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой in vivo, предусматривающий:
(I) выполнение способа по любому из пп. 51-65 в первый раз у первого отличного от человека животного;
(II) изменение переменной и выполнение способа стадии (I) во второй раз с измененной переменной у второго отличного от человека животного и
(III) сравнение активности или экспрессии третьего репортерного белка на стадии (I) с активностью или экспрессией третьего репортерного белка на стадии (II) и выбор способа, приводящего к более высокой активности или экспрессии третьего репортерного белка.
67. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки путем введения одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорской нуклеиновой кислоты отличному от человека животному.
68. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорской нуклеиновой кислоты, вводимых отличному от человека животному.
69. Способ по п.66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорской нуклеиновой кислоты, введенной отличному от человека животному.
70. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой экзогенную донорскую нуклеиновую кислоту, введенную отличному от человека животному.
71. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество направляющей РНК, введенной отличному от человека животному, относительно концентрации или количества белка Cas, введенного отличному от человека животному.
72. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой направляющую РНК, введенную отличному от человека животному.
73. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой белок Cas, введенный отличному от человека животному.
74. Клетка отличного животного, содержащая репортер CRISPR для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR интегрирован в целевой геномный локус и содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны.
75. Геном отличного от человека животного, содержащий репортер CRISPR для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR интегрирован в целевой геномный локус и содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны.
76. Нацеливающий вектор, содержащий репортер CRISPR, фланкированный плечами гомологии, причем репортер CRISPR предназначен для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны, и причем плечи гомологии подходят для направления рекомбинации с желаемым целевым геномным локусом для облегчения геномной интеграции.
77. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-30, предусматривающий:
(а) модификацию генома плюрипотентной клетки отличного от человека животного для включения репортера CRISPR, интегрированного в целевой геномный локус, причем репортер CRISPR предназначен для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны;
(b) идентификацию или отбор генетически модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного, содержащей репортер CRISPR;
(c) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного в эмбрион-хозяина отличного от человека животного и
(d) имплантация и гестация эмбриона-хозяина отличного от человека животного в суррогатной матери.
78. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-30, предусматривающий:
(а) изменение генома эмбриона одноклеточной стадии отличного от человека животного для включения репортера CRISPR, интегрированного в целевой геномный локус, причем репортер CRISPR предназначен для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны;
(b) отбор генетически модифицированного эмбриона одноклеточной стадии отличного от человека животного и
(с) имплантацию и гестацию генетически модифицированного эмбриона одноклеточной стадии отличного от человека животного в суррогатной матери.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762539279P | 2017-07-31 | 2017-07-31 | |
| US62/539,279 | 2017-07-31 | ||
| PCT/US2018/044606 WO2019028023A2 (en) | 2017-07-31 | 2018-07-31 | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVALUATING CRISPR / CAS MEDIATED DISRUPTION OR EXCISION AND CRISPR / CAS INDUCED RECOMBINATION USING IN VIVO EXOGENIC DONOR NUCLEIC ACID |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020105065A true RU2020105065A (ru) | 2021-09-02 |
| RU2020105065A3 RU2020105065A3 (ru) | 2021-11-10 |
| RU2782356C2 RU2782356C2 (ru) | 2022-10-26 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20190032092A1 (en) | 2019-01-31 |
| CA3068072A1 (en) | 2019-02-07 |
| US11021719B2 (en) | 2021-06-01 |
| RU2020105065A3 (ru) | 2021-11-10 |
| WO2019028023A4 (en) | 2019-06-13 |
| KR20200033259A (ko) | 2020-03-27 |
| MX2020001177A (es) | 2020-09-25 |
| JP2020533957A (ja) | 2020-11-26 |
| SG11201912236YA (en) | 2020-01-30 |
| AU2018309708A1 (en) | 2020-02-06 |
| US20210261985A1 (en) | 2021-08-26 |
| EP3585160A2 (en) | 2020-01-01 |
| CN111182790A (zh) | 2020-05-19 |
| WO2019028023A3 (en) | 2019-04-04 |
| BR112020001996A2 (pt) | 2020-08-18 |
| WO2019028023A2 (en) | 2019-02-07 |
| IL272333A (en) | 2020-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2019028023A4 (en) | Crispr reporter non-human animals and uses thereof | |
| JP2020533957A5 (ru) | ||
| Pont et al. | mRNA decay factor AUF1 maintains normal aging, telomere maintenance, and suppression of senescence by activation of telomerase transcription | |
| JP2020532952A5 (ru) | ||
| JP2021500867A5 (ru) | ||
| KR102636351B1 (ko) | 고활성 조절 요소 | |
| RU2019143568A (ru) | Способы и композиции для оценки crispr/cas-индуцированной рекомбинации с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой in vivo | |
| US9532555B2 (en) | Humanized dipeptidyl peptidase IV (DPP4) animals | |
| Jordan et al. | Expression of green fluorescent protein in the chicken using in vivo transfection of the piggyBac transposon | |
| EP1642970A1 (en) | Method of preparing transgenic organism with use of methylation and system therefor | |
| Zou et al. | Incorporation of a skeletal muscle-specific enhancer in the regulatory region of Igf1 upregulates IGF1 expression and induces skeletal muscle hypertrophy | |
| JPWO2010010887A1 (ja) | 組織発現プロモーター | |
| JPWO2019067875A5 (ru) | ||
| Karpova et al. | A FTZ-F1-containing yeast artificial chromosome recapitulates expression of steroidogenic factor 1 in vivo | |
| Yang et al. | Mup-knockout mice generated through CRISPR/Cas9-mediated deletion for use in urinary protein analysis | |
| US9180207B2 (en) | Epo knockout GFP anemic mouse | |
| RU2021130741A (ru) | Животные, отличные от человека, содержащие гуманизированный локус альбумина | |
| US20220378943A1 (en) | Enhancer polynucleotide responding to heart failure and expression vector including said enhancer polynucleotide | |
| US10851388B2 (en) | Tissue selective transgene expression | |
| US20230257432A1 (en) | Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents | |
| US20180208942A1 (en) | Nr2e1 mini-promoters | |
| RU2020105343A (ru) | Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения | |
| RU2022125418A (ru) | Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения | |
| EP3388072A1 (en) | Ubiquinone-independent cytoplasmic dihydroorotate dehydrogenase for use as medicament | |
| Bradley et al. | Ablation of endogenously cycling adult cardiomyocytes worsens myocardial function after injury |