JPWO2010010887A1 - 組織発現プロモーター - Google Patents

Abstract

従来のプロモーターは、配列長が大きいために、高い効率で生体に導入することが出来なかった。本発明の目的は、新規なプロモーターを提供することである。このプロモーターは、脂肪組織又は／および膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有する。

Description

本発明は、脂肪組織および／又は膵臓組織での特異的発現に有用である新規プロモーターおよびその利用に関する。

アディポサイト（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）Ｐ２プロモーター（以下、ａＰ２プロモーターともいう）領域は、その下流につないだ遺伝子を脂肪組織（細胞）に特異的に発現させることが知られており、このプロモーター領域との融合遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの報告が過去に多くなされている。例えば、ＭＣＰ−１（モノサイトケモアトラクタントプロテインー１）は脂肪細胞で発現するケモカインの一種である。このケモカインをａＰ２プロモーターと融合させた遺伝子を導入して作製したトランスジェニックマウスは、全身性のインスリン抵抗性を示すことが知られている。このマウスの脂肪組織ではマクロファージが浸潤し、炎症反応が誘発されていることから、脂肪組織における炎症反応とインスリン抵抗性との関連を研究する上で有用といえる。また、ＣＤＯ（システインジオキシダーゼ）はタウリン合成の律速酵素であるが、この酵素をａＰ２プロモーターと融合させた遺伝子を導入して作製したトランスジェニックマウスの脂肪組織においては、タウリン合成を促進できることが知られている。このマウスの脂肪組織では、ＣＤＯが正常マウスの２〜３倍過剰発現しており、タウリンと肥満やメタボリックシンドロームの関連のための研究ツールとして発売されている。

一方、約５．４ｋｂのマウス由来のａＰ２プロモーター（配列番号２４）の最上流に位置する約５２０ｂｐの配列（配列番号２１）は、トランスジェニックマウスによる実験により、インビボでの脂肪組織特異的発現に重要であることが報告されている。ところが、プロモーターの全長を用いた場合と、インビボでの発現強度を比較した結果、その活性は大きく低下しており（非特許文献１）、この領域のみを脂肪組織特異的発現のためのプロモーターとして使用しても、その発現は弱いため実用的なトランスジェニックマウスの作製はできなかった。

Ｓｕｓａｎ Ｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第８７巻、１９９０年、９５９０−９５９４ページ

近年、レンチウイルスベクターを用いてマウス受精卵への遺伝子導入を行うことにより、従来から汎用されてきた顕微注入法と比較して、非常に高い効率でトランスジェニックマウスが作製できることが報告されている（実験医学、２１巻、４号、２００３年、５０９−５１４ページ）。しかしながら、ａＰ２遺伝子プロモーターは約５．４ｋｂの配列長を有しており、レンチウイルスベクターに組み込む場合は、その大きなサイズが障壁となることから、本プロモーターを用いたトランスジェニックマウスの作製は困難であった。プロモーター配列長が大きい故に、ウイルスのパッケージング効率が低下し、トランスジェニックマウスの作製に必要な力価のウイルスを調製できないことが、その理由である。アデノウイルスやＡＡＶなど遺伝子治療に用いられる他のウイルスベクターでも同様の理由が考えられる。

本発明の課題は、脂肪組織及び／又は膵臓組織での特異的発現が可能かつ導入効率のよいエレメントを提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、マウスａＰ２遺伝子プロモーター由来の配列の中の一部の領域が脂肪組織での発現を促進するために重要であること、この領域を含む短縮型のプロモーターを用いてトランスジェニックマウスを作製した場合にも、脂肪組織及び膵臓組織に特異的な活性ならびに十分な発現量を有すること、ヒト由来の配列においてもマウスと同様の活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、
（１） 配列番号：２２に示される塩基配列を少なくとも有するＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／もしくは膵臓において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ、
（２）（ａ）配列番号：２２に示される塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２２に示される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡ、及び（ｃ）配列番号：２２に示される塩基配列からなるＤＮＡに少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡからなる群より選択されたＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／または膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ、
（３） さらに配列番号：２１に示される塩基配列を有するＤＮＡである、前記（１）又は（２）記載の単離されたＤＮＡ、
（４） さらに配列番号：２３に示される塩基配列を有するＤＮＡである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の単離されたＤＮＡ、
（５） 配列番号：２８に示される塩基配列を少なくとも有するＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／もしくは膵臓において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ、
（６） （ａ）配列番号：２８に示される塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２８に示される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡ、及び（ｃ）配列番号：２８に示される塩基配列からなるＤＮＡに少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡからなる群より選択されたＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／または膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ、
（７） さらに配列番号：２７に示される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項５又は６記載の単離されたＤＮＡ、
（８） さらに配列番号：２９に示される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項５〜７のいずれかに記載の単離されたＤＮＡ、
（９） 前記（１）〜（８）のいずれかに記載の単離されたＤＮＡに外来遺伝子が連結されたＤＮＡ、
（１０） 前記（１）〜（８）のいずれかに記載の単離されたＤＮＡと外来遺伝子が作動可能に連結されてなる発現ベクター、
（１１） 外来遺伝子が、対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子である、前記（１０）に記載の発現ベクター、
（１２） 外来遺伝子が、対象疾患を治療するための核酸である、前記（１０）に記載の発現ベクター、
（１３）前記（１１）または（１２）のいずれかに記載の発現ベクターを有効成分として含有してなる治療剤、
（１４）前記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の発現ベクターを保持してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（１５） 発現ベクターが哺乳動物の染色体中に組み込まれてなる、前記（１４）記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（１６） 前記（１４）または請求項（１５）のいずれかに記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する細胞、または
（１７）前記（１４）または（１５）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、スクリーニング方法、
に関する。

本発明の新規のプロモーターを用いることにより、目的とする遺伝子を脂肪組織および／又は膵臓組織において特異的発現できるトランスジェニックマウスの作製や、これらの組織をターゲットとした遺伝子治療を行うことが可能となる。

図１は、今回作製したａＰ２プロモーター由来配列のレポーターアッセイ用のコンストラクトの模式図である。 図２は、ａＰ２プロモーター由来配列のレポーターアッセイ用コンストラクトと、内部コントロールレポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターであるｐＲＬ−Ｔｋベクターとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。横軸は、２９３でａＰ２−１１−ｌｕｃを導入したときの発光強度を１として他のコンストラクトを用いたときの発光強度の相対値を示している。 図３は、ヒトとマウスのａＰ２プロモーター由来配列のレポーターベクターをそれぞれｐＲＬ−Ｔｋベクターと共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。横軸は、未分化３Ｔ３−Ｌ１でａＰ２−１１を導入したときの発光強度を１として他のコンストラクトを用いたときの発光強度の相対値を示している。

本明細書において、「プロモーター」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼとの会合が可能な発現調節領域を含むものであり、かかる領域の下流（３'末端方向）に存在するコーディング配列の転写を開始させる機能を有する領域を含むものをいう。さらに、前記「プロモーター」は、組織特異的な発現調節を担う、いわゆるエンハンサー領域をも含む領域をいう。

脂肪組織および／又は膵臓組織において特異的な発現とは、脂肪組織および／又は膵臓組織における発現が、他の組織と比較して明らかに高いことを意味する。

脂肪組織とは、哺乳動物の脂肪組織 であれば特に限定はなく、例えば、皮下脂肪組織 、内臓脂肪組織 、白色脂肪組織 、褐色脂肪組織 、生殖器周囲脂肪組織、腸間膜脂肪組織、肩甲骨間褐色脂肪組織等を含む。

本発明のＤＮＡは、配列番号：２２に示される塩基配列を少なくとも有してなるＤＮＡであってかつ脂肪組織および／又は膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有することを１つの特徴とする単離されたＤＮＡである。本発明のＤＮＡは、配列番号：２２に示される塩基配列を有しているため、インビボにおいても脂肪組織および／又は膵臓組織特異的に発現できるという優れた性質を有する。

前記配列番号：２２に示される塩基配列は、マウス由来のアディポサイトＰ２遺伝子プロモーターにおいて１６６２〜２３５７位からなる領域の配列である。今回発明者らはこれらの配列が、インビボにおける脂肪組織および／又は膵臓組織の特異的発現に重要な働きをすることを見出した。一般に、インビトロにおける遺伝子発現の動向はインビボにおける実際の遺伝子発現の動向と大きく異なる場合が多い。

本発明のＤＮＡのプロモーター活性は、例えば、下記のＩ〜ＩＩＩのステップ：Ｉ 被検対象のＤＮＡの制御下に、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子など）を作動可能に連結した配列を保持した活性測定用プラスミドを作製するステップ、ＩＩ 前記Ｉの活性測定用プラスミドを用いて適切な脂肪組織の細胞（もしくは膵臓組織の細胞）及び対照細胞を形質転換するステップ、並びにＩＩＩ 前記ＩＩで得られた細胞におけるレポーター遺伝子の発現の有無を検出し、発現強度を測定するステップを含み、レポータージーンアッセイなどにより決定できる。かかる測定方法により、脂肪組織の細胞（もしくは膵臓組織の細胞）において対照細胞と比較して強い発現が検出された場合、かかるＤＮＡは、脂肪組織(膵臓組織)特異的なプロモーターであることの指標となる。ここでレポーター遺伝子の発現産物量がプロモーター活性の強度の指標となる。

本発明のＤＮＡは、前記配列番号：２２に示される塩基配列において、少なくとも１塩基、具体的には、１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有するＤＮＡであって、かつ脂肪組織及び／又は膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡであってもよい。置換、欠失、挿入又は付加（以下、単に「変異」と称する場合がある）の数及び導入位置は、前記Ｉ〜ＩＩＩのステップを含む、レポータージーンアッセイを実施することによって、脂肪組織及び／又は膵臓組織特異的なプロモーターであることが決定されるものであればよい。好ましくは、１又は数個の置換、欠失、挿入又は付加が挙げられる。

人為的な変異の導入方法としては、慣用の部位特異的変異導入法などにより行なうことができる。部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法 （ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 １２、９４４１〜９４５６ (１９８４)）やアンバー変異を利用したＰＣＲによる方法（国際公開第９８／０２５３５）等を用いることができる。

本発明のＤＮＡは、脂肪組織及び／又は膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡであれば、配列番号：２２に示される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／または膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有する単離されたＤＮＡも本発明に包含される。かかるＤＮＡは、例えば、前記Ｉ〜ＩＩＩのステップを含む、レポータージーンアッセイを実施することによって、脂肪組織および／または膵臓組織特異的なプロモーターであることが決定されるものであればよい。

ここで、ハイブリダイゼーション操作は、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル 第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行,１９８９年） などに記載の方法に従って、実施することができる。「ストリンジェントな条件」としては、前記の書籍などに記載のハイブリダイゼーションの条件が挙げられ、具体的には、１０% デキストラン硫酸、１Ｍ ＮａCｌ 、１％ ＳＤＳ、１００ mg/ml サケ***ＤＮＡ 、１×10⁶ ｃｐｍ／ｍｌ ³²Ｐ 標識プローブ（配列番号２２）の条件下でハイブリダイズ反応を行った後、２×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ 、室温で２ 回、０．１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ 、６０℃で２回の洗浄を行うような条件が挙げられる。

本発明のＤＮＡには、配列番号：２２に示される塩基配列からなるＤＮＡに少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列同一性を有するＤＮＡであって、脂肪組織および／または膵臓組織において特異的なエンハンサー活性を有する単離されたＤＮＡも含まれる。かかる配列同一性を有するＤＮＡは、例えば、前記Ｉ〜ＩＩＩのステップを含む、レポータージーンアッセイを実施することによって、脂肪組織および／または膵臓組織特異的なプロモーターであることが決定されるものであればよい。

本明細書において、「配列同一性」とは、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ等）を初期設定で用いて決定することができる。本発明において、塩基配列の「配列同一性」とは、比較する２種の塩基配列を整列（アラインメント）させ、整列により一致した塩基配列の数を基準となる塩基配列の総数で除して算出した割合を％で示した数字である。なお、整列により生じたギャップは、不一致と見なして算出する。

本発明の特定の態様としては、さらに配列番号：２１に示される塩基配列を含むものとする。このＤＮＡは作動可能なように連結されるものとするが、一般には配列番号：２１が上流側となるように連結されていることが望ましい。配列番号：２１に示される塩基配列は、マウス由来のアディポサイトＰ２遺伝子プロモーターの最上流の約５２０塩基からなる領域の配列である。この領域は一般に「エンハンサー」と呼ばれる領域であり、転写速度を増大させる働きがある。また、脂肪組織特異的発現に重要な役割を有することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４９巻、１９９２年、２１９−２２４ページ）。

本発明の特定の態様としては、さらに配列番号：２３に示される塩基配列を有するＤＮＡを含むものとする。前記配列番号：２３に示される塩基配列は、マウス由来のアディポサイトＰ２遺伝子プロモーター（ａＰ２プロモーター） において５３５９〜５５４８位の領域の約２００ｂｐの配列である。この領域は、近位プロモーター（ｐｒｏｘｉｍａｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と呼ばれ、ＡＰ−１やＣ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の転写因子の結合領域が含まれている。この領域は、脂肪分化には重要な働きをするが、トランスジェニック動物などインビボにおける脂肪組織特異的発現においての必須領域でないことが報告がされている。（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８７，ｐｐ９５９０−９５９４，１９９０年）。この下流部には、ＴＡＴＡボックスやＣＡＡＴボックスと呼ばれる配列を含んでおり、ＲＮＡポリメレースをその正常な開始部位に導いたり、転写を促進したりする働きをすることが知られている。

本発明のＤＮＡにより、脂肪組織及び／もしくは膵臓組織特異的に外来遺伝子を発現させ得る発現ベクターが提供される。「発現ベクター」という用語は、転写されうる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする外来遺伝子の配列を含むベクターのことを指す。外来遺伝子の配列は、場合によって最終的にはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへと翻訳される。また別の場合には、これらの配列は翻訳されない。例えば、アンチセンス分子、リボザイムの他、ｍｉＲＮＡ(マイクロＲＮＡ)やｓｈＲＮＡ（ショートヘアピン構造ＲＮＡ）のようなＲＮＡ干渉作用を利用してｍＲＮＡを特異的に切断するｓｉＲＮＡの場合である。かかる発現ベクターも本発明に含まれる。

本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡを適切なベクターに挿入することにより得ることができる。本発明に用いられるベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれる。

本発明の発現ベクターは、転写の方向に関して、外来遺伝子配列の上流側に、上記の本発明のＤＮＡが作動可能に連結されていることを１つの特徴とし、脂肪組織及び／もしくは膵臓組織特異的に外来遺伝子を発現させ得るものである。好ましい態様は、配列番号２２に示される塩基配列、および配列番号２１に示される塩基配列を有するＤＮＡの下流に外来遺伝子が作動可能に連結されてなる発現ベクターである。さらに好ましい態様としては、配列番号２２に示される塩基配列、配列番号２１に示される塩基配列、および配列番号２３に示される塩基配列を有するＤＮＡの下流に外来遺伝子が作動可能に連結されてなる発現ベクターである。かかる発現ベクターは、外来遺伝子の上流に本発明のＤＮＡが局在するため、本発明のＤＮＡ中における組織特異的なプロモーターの制御下に外来遺伝子を発現させることができるので、前記外来遺伝子を脂肪組織特異的及び／もしくは膵臓組織特異的に発現させ得る。そのため、本発明の発現ベクターは、それ自体が脂肪組織及び／もしくは膵臓組織における疾患における極めて有用な治療剤のツールとなりうる。また、本発明の発現ベクターを保持してなるトランスジェニック非ヒト動物、及びこれに由来する細胞は、抗肥満薬や糖尿病薬、高脂血症薬、高血圧薬など脂肪組織（もしくは脂肪細胞）や膵臓組織（もしくは膵臓細胞）と関連を有する疾患（メタボリックシンドローム関連疾患など）を改善する薬剤の探索のためのツールになりうる。

なお、上記の配列番号２１〜２３で示される塩基配列はいずれもマウス由来であるが、本発明者らは、同様の作用を有する塩基配列をヒト由来の遺伝子より見出した。具体的には配列番号２１で示される塩基配列は配列番号２７で示される塩基配列に、配列番号２２で示される塩基配列は配列番号２８で示される塩基配列に、そして配列番号２３で示される塩基配列は配列番号２９で示される塩基配列に対応しているので、これらに置き換えることにより、同様の効果を得ることは当業者の常識の範囲内である。

外来遺伝子としては、（Ａ）対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子、（Ｂ）対象疾患を治療するための核酸、および（Ｃ）マーカー遺伝子などが挙げられる。

前記「対象疾患」とは、例えば、脂肪組織及び／もしくは膵臓組織特異的に外来遺伝子を発現させることにより治療され得る疾患が挙げられる。具体的には、脂肪組織萎縮症、 II型糖尿病、高脂血症、肥満症及び類似のもの等が挙げられる。

（Ａ）対象疾患を治療するためのタンパク質としては、例えばインスリン、レプチン、及びグルコーストランスポーターなどが挙げられる。

（Ｂ）対象疾患を治療するための核酸としては、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡｉのような合成または天然に存在しない形態の核酸、および当該技術分野で周知の核酸の化学誘導体のような他の形態の核酸を用いることもできる。ｓｉＲＮＡなど干渉作用を利用した塩基配列の設計は、様々なものが利用できるが、一例としてｓｉＤｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｅｓｉｇｎ．ＲＮＡｉ．ｊｐ／）により配列設計が可能である。

（Ｃ）マーカー遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子並びにそれらの誘導体等が挙げられる。前記「誘導体」には、人工的に作製された変異体が含まれる。

本発明の発現ベクターにおいて、外来遺伝子が前記「対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子」や「対象疾患を治療するための核酸」である場合、脂肪組織及び／もしくは膵臓組織特異的な治療剤の有効成分として使用されうる。かかる治療剤も本発明に含まれる。

本発明の治療剤は、前記発現ベクターを有効成分として含有することを１つの特徴とし、脂肪組織及び／もしくは膵臓組織特異的に外来遺伝子、具体的には対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子や対象疾患を治療するための核酸を発現させ得るものである。かかる治療剤は、前記発現ベクターを有効成分として含有しているため、脂肪組織及び／もしくは膵臓組織に対して高い特異性を発揮するという優れた性質を有する。

本発明の治療剤は、有効成分である発現ベクターを安定な状態に保持するための成分、例えば、緩衝成分、分解保護剤（例えば、核酸分解酵素の阻害因子など）などを適宜含有してもよい。本発明の遺伝子発現剤は、細胞及び／又は組織への導入に適した薬剤をさらに含有してもよい。

本発明の治療剤における発現ベクターの量は、使用目的により適宜設定することができる。例えば、後述の治療剤に用いる場合、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、発現ベクター量として０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇであることが望ましい。かかる投与用量を数日ないし数ヶ月に１回投与することが望ましい。

本発明の治療剤は、例えば、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法；ＤＥＡＥ−デキストラン法；微小ガラス管を用いた直接注入法などの方法により、細胞に導入することができる。

本発明の治療剤の組織への導入法としては、内包型リポソームによる導入法、静電気型リポソームによる導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥ リポソーム法）、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともに有効成分を細胞に移入する方法、正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。

本発明の治療剤によれば、脂肪組織や膵臓組織に高い特異性を有しているため、脂肪組織特異的及び／もしくは膵臓組織特異的に外来遺伝子を発現させることにより治療され得る疾患（例えば、肥満、ＩＩ型糖尿病、脂肪組織萎縮症、膵臓癌など）に対して特異的に、症状の軽減又は治癒効果を発揮しうる。したがって、同時に、脂肪組織や膵臓組織以外の組織に対する、治療剤の影響を低減することが可能になるという優れた性質を有する。

「脂肪組織特異的及び／もしくは膵臓組織特異的に外来遺伝子を発現させることにより治療され得る疾患」としては、前記「対象疾患」と同様のものが挙げられる。

本発明の治療剤の患者への導入法としては、該治療剤を直接体内に導入するインビボ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ法がある（日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック, エヌ・ティー・エス,１９９９年 ）。

インビボ法により投与する場合は、本発明の治療剤は、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、又は対象の脂肪組織及び／もしくは膵臓組織そのものに直接局所投与することができる。

製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば、治療剤を含有した注射剤の場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、場合によっては、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。

その他に徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むこと、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。

本発明の治療剤の投与形態は、例えば、実験手引書などにその調製法、投与法などが詳しく解説されている（別冊実験医学, 遺伝子治療の基礎技術, 羊土社,１９９６年 、別冊実験医学, 遺伝子導入＆発現解析実験法, 羊土社,１９９７年）。以下、具体例を挙げて説明する。

本発明の発現ベクターの構築において、非ウイルスベクターが用いられた場合、以下のような手法により、本発明の治療剤を細胞や組織に導入することができる。

細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、微小ガラス管を用いた直接注入法などが挙げられる。

組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソームによる遺伝子導入法、静電気型リポソームによる遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、受容体介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともに有効成分を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。

本発明の発現ベクターの構築において、ウイルスベクターを用いる場合、かかるウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。より具体的には、例えば、レンチウイルス、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡと該ＤＮＡに作動可能に連結した外来遺伝子とを導入し、得られた発現ベクターを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。前記ウイルスベクターのうち、受精卵への感染はレンチウイルスを用いることが望ましい。これは、レンチウイルスが宿主細胞ＤＮＡに不可逆的に組み込まれるというレトロウイルスの一般的な特徴を有するだけでなく、非増殖細胞を感染させる能力も有するからである。レンチウイルスはレトロウイルスの亜群であり、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などの種々の霊長類ウイルスならびに非霊長類ウイルス（たとえば、マエディビスナウイルス（ＭＷ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））が含まれる。

本発明の治療剤の導入方法は、前記と同様である。投与量については、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、治療剤中に含まれる発現ベクター量として０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇであることが望ましい。かかる投与用量を数日ないし数ヶ月に１回投与することが望ましい。

本発明の発現ベクターによれば、かかる発現ベクターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、前記発現ベクターを保持してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該発現ベクター中の外来遺伝子が脂肪組織および／もしくは膵臓組織特異的に発現することを１つの特徴とする。外来遺伝子として、マーカー遺伝子を含有した発現ベクターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、脂肪組織や膵臓組織において特異的なプロモーターを保持しているため、これらの組織特異的なマーカー遺伝子の発現の有無及び強度を指標として、簡便に糖尿病薬や抗肥満薬などを含むメタボリックシンドローム関連疾患の治療薬をスクリーニングすることができるという優れた性質を有する。また、外来遺伝子として、対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子や、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの核酸を含有した発現ベクターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、脂肪組織および／もしくは膵臓組織において特異的なプロモーターを保持しているため、これらの組織において発現させた場合の該タンパク質や該核酸の治療効果を評価することができる。そのほか、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、特定の遺伝子の生体中のこれらの組織への影響を調べるものとして使用される。例えば、肥満患者と健常人の間において脂肪組織における発現量が異なる遺伝子があれば、これらをコードするタンパク質を脂肪組織において発現させることにより生体内でその影響を調べることができる。また、脂肪組織などに特異的に発現させたｍｉＲＮＡなどの核酸の治療効果を調べることができる。

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物においては、発現ベクターが哺乳動物の染色体中に組み込まれて保持されていてもよい。

「非ヒト哺乳動物」としては、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物などが挙げられる。なかでも、医薬研究用途での長い利用実績とデータの蓄積があり、これまでに数多くの病態モデルが作製されてきた実績があることや、遺伝子改変動物の作製技術が確立されている等の観点から、マウス、ラットなどに代表されるげっ歯類動物が好ましく、特にマウスが好ましい。

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、公知の方法により作製することができる。例えば、例えば下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法により製造することができる。
（ａ）ベクター等を受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；
（ｂ）前記動物から出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する工程；および
（ｃ）前記選別した動物（ファウンダー）から系統を樹立する工程。

（ａ）の工程のベクターなどを受精卵に導入する場合にはマイクロインジェクション法（マウス胚の操作マニュアル（近代出版、１９８９年）、分子生物学プロトコール（南江堂、１９９４年））や、レンチウイルスを受精卵に感染させるレンチウイルス法（Ｌｏｉｓ Ｃら，サイエンス、第２９５巻、２００２年、８６８−８７２ページ）が用いられる。

しかし一般的には、レンチウイルス法でトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することが望ましい。なぜなら、マイクロインジェクション法は導入遺伝子が染色体の不特定の１ヵ所に数十〜数百個連結して挿入されるため、挿入箇所によっては、導入遺伝子の発現が全くない個体が生まれてしまう。したがって、マウスを作製後に有用な系統の選抜を行い、実験に用いるマウスを生産するまでに１〜２年の期間を要する。一方、レンチウイルス法は作製期間が短いうえにトランスジェニックマウスの作製効率が高く、１世代目の産仔で実験に用いるマウス個体数を得ることができる。また、導入遺伝子がゲノム上の異なる箇所に１コピーずつ挿入されるため、様々な発現量を示すマウスを一度に複数匹得ることができるという利点を有するからである。本発明のプロモーターは、天然型に比してその配列長が短いことを特徴とすることから、レンチウイルスベクターのパッケージング効率が改善され、高タイターのウイルスを調製することが可能となり、受精卵への遺伝子導入効率が上がるので、レンチウイルス法によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製を高い効率で行うことが可能となる。

本発明のメタボリックシンドローム関連疾患の治療薬のスクリーニング方法の態様の一つとして、マーカー遺伝子を含有した発現ベクターを保持したトランスジェニック非ヒト哺乳動物もしくは該トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来の細胞に、被検物質を投与した後、動物の組織や細胞におけるマーカー遺伝子の発現レベルを評価する方法を挙げることができる。

具体的には、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、マーカー遺伝子の発現を抑制させることが、生体内での各組織における脂肪細胞が低減することの指標として評価することができる。

このとき、被験物質には、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。

各種プラスミドの作製
ａＰ２−０、ａＰ２−１１−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲの作製
ａＰ２プロモーター／エンハンサー領域全長約５．５ｋｂを含むベクターａＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩを鋳型にして、転写開始点から約５．５ｋｂにあるエンハンサー領域約５２０ｂｐを、配列番号１の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いて９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。また、転写開始点から約２００ｂｐにあるプロモーター領域を配列番号３の塩基配列からなるプライマー、および配列番号４の塩基配列からなるプライマーを用いて９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。エンハンサー領域の断片をＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。このプラスミドをＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩで処理し、ｐＥＮＴＲ４（インビトロジェン社）のＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。このプラスミドをＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで処理し、先にＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入したプロモーター断片を連結してａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲを作製した。このＤＮＡには、配列番号：２４に示されるａＰ２プロモーター全長のうち最上流の約５２０塩基からなる領域および５３５９〜５５４８位からなる領域の約２００ｂｐの配列が含まれている。
ａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲをＳａｌＩ処理し、エンハンサー領域を含む断片を除いた後、自己で連結し、ａＰ２−１１−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲを作製した。このＤＮＡには、配列番号：２４に示されるａＰ２プロモーター全長のうち５３５９〜５５４８位からなる領域の約２００ｂｐの配列が含まれている。

ａＰ２−１、ａＰ２−２、ａＰ２−３、ａＰ２−４、ａＰ２−５、ａＰ２−６、ａＰ２−７、ａＰ２−８、ａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲの作製
ａＰ２プロモーター／エンハンサー領域全長約５．５ｋｂを含むベクターａＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩを鋳型にして、下記のプライマー対（配列番号５の塩基配列からなるプライマー、および配列番号６の塩基配列からなるプライマー）、（配列番号７の塩基配列からなるプライマー、および配列番号８の塩基配列からなるプライマー）、（配列番号９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマー）、（配列番号１１の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１２の塩基配列からなるプライマー）、（配列番号１３の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１４の塩基配列からなるプライマー）、（配列番号１５の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１６の塩基配列からなるプライマー）、（配列番号１７の塩基配列からなるプライマー、および配列番号１８の塩基配列からなるプライマー）、および（配列番号１９の塩基配列からなるプライマー、および配列番号２０の塩基配列からなるプライマー）を用いて、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ４５秒を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩ制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。

これらの断片をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで処理し、ａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲのＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩの部位に挿入し、それぞれａＰ２−１−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−２−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−３−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−４−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−５−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−６−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−７−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−８−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲを得た。これらのＤＮＡには、配列番号：２１と配列番号：２３に示される塩基配列が共通して含まれており、かつ、配列番号：２４で示されるａＰ２プロモーター全長において、それぞれ、４８１〜１１３７位、１０６９〜１７８０位、１６６２〜２３５７位、２２９６〜２９８８位、２９０８〜３５５８位、３４９６〜４１９９位、４１２２〜４８２３位、４７２８〜５３８０位からなる領域の配列を含んでいる。また、ａＰ２プロモーター領域全長約５．５ｋｂを含むベクターａＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩを鋳型にして、上記のプライマー対を用いて、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ４分を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩ制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで処理し、ａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲのＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩの部位に挿入し、ａＰ２プロモーター領域全長を含むａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲを得た。このＤＮＡには、配列番号：２１と配列番号：２３に示される塩基配列が含まれており、かつ、配列番号：２４で示されるａＰ２プロモーター全長において、４８１〜５３８０位からなる領域の配列を含んでいる。

ａＰ２−０、ａＰ２−１、ａＰ２−２、ａＰ２−３、ａＰ２−４、ａＰ２−５、ａＰ２−６、ａＰ２−７、ａＰ２−８、ａＰ２−１１、ａＰ２−１２−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲの作製ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を鋳型にして、配列番号１の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用いて９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＡｇｅＩとＮｏｔＩ制限酵素部位を導入したルシフェラーゼ遺伝子の断片を得た。この断片をＡｇｅＩとＮｏｔＩで処理し、ａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−１−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−２−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−３−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−４−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−５−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−６−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−７−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−８−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−１１−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲのＡｇｅＩとＮｏｔＩの部位に挿入してＥＧＦＰをルシフェラーゼ遺伝子に変換したプラスミド、ａＰ２−０−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−１−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−２−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−３−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−４−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−５−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−６−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−７−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−８−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−１１−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−１２−ｌｕｃ／ｐＥＮＴＲを得た。これらのプラスミドの構造の模式図を図１に示す。

ａＰ２−０、ａＰ２−３、ａＰ２−５、ａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨの作製
レンチウイルスベクターｐＣＤＨ１−ＭＣＳ１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をＳｐｅＩおよびＸｂａＩで処理し、ＣＭＶプロモーター断片を除いた後、平滑末端処理し、自己で連結することでＣＭＶプロモーターの欠損したｐＣＤＨ−ＭＣＳ１−δＣＭＶを得た。次にＧａｔｅｗａｙＣａｓｓｅｔｔｅの両端にＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位を導入した断片をｐＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）のＮｈｅＩ、ＫｐｎＩ部位に導入した後、このベクターをＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ処理し、切り出したＧａｔｅｗａｙＣａｓｓｅｔｔｅをｐＣＤＨ−ＭＣＳ１−δＣＭＶのＮｈｅＩ、ＳａｌＩ部位に導入することで、ｐＣＤＨ−δＣＭＶ−ＧＷベクターを得た。このベクターとａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−３−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−５−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲ、ａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＥＮＴＲをそれぞれＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックス（インビトロジェン社）で組み換えることにより、ａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨ、ａＰ２−３−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨ、ａＰ２−５−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨ、ａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨを得た。

培養細胞における各プロモーターの反応
３Ｔ３−Ｌ１脂肪分化細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、ａＰ２プロモーター／エンハンサー由来の各コンストラクトの脂肪細胞における転写活性を調べた。比較のために、分化誘導していない３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞を用いた。１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で３Ｔ３−Ｌ１細胞を培養し、コンフルエント２日後、インスリン、デキサメタゾン、ＩＢＭＸを含む培地で分化誘導を開始した。トランスフェクションはエレクトロポレーションにて行った。また、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞のトランスフェクションはＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）を用い、添付のプロトコールに従った。レポーターとしてａＰ２−０−ｌｕｃ、ａＰ２−１−ｌｕｃ、ａＰ２−２−ｌｕｃ、ａＰ２−３−ｌｕｃ、ａＰ２−４−ｌｕｃ、ａＰ２−５−ｌｕｃ、ａＰ２−６−ｌｕｃ、ａＰ２−７−ｌｕｃ、ａＰ２−８−ｌｕｃ、ａＰ２−１１−ｌｕｃ、ａＰ２−１２−ｌｕｃと内部コントロールレポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターであるｐＲＬ−Ｔｋベクターを導入した。トランスフェクションを行ってから２４時間後、それぞれの細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、発光強度を測った。結果を図２に示す。この図においては、２９３でａＰ２−１１−ｌｕｃを導入したときの発光強度（図中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と示す）を１として他のコンストラクトを用いたときの発光強度の相対値を示した。

この結果、ａＰ２−０−ｌｕｃ、ａＰ２−１−ｌｕｃ、ａＰ２−２−ｌｕｃ、ａＰ２−３−ｌｕｃ、ａＰ２−４−ｌｕｃ、ａＰ２−５−ｌｕｃ、ａＰ２−６−ｌｕｃ、ａＰ２−７−ｌｕｃ、ａＰ２−８−ｌｕｃを導入した場合、いずれも３Ｔ３−Ｌ１脂肪分化細胞で２倍以上の転写活性が得られたが、比活性は約６倍〜１４倍と差が認められた。この結果から、配列番号：２１に示されるａＰ２プロモーター最上流に位置する約５２０ｂｐの配列が脂肪細胞での特異的発現に必要であるが、その他の領域もプロモーター活性に影響を与えることが予想された。一方、ａＰ２−１２−ｌｕｃはａＰ２プロモーター最上流に位置する約５２０ｂｐの配列を含んでいるにも関わらず、他のコンストラクトに比べて脂肪細胞での活性が低かった。

レンチウイルスを使ったトランスジェニックマウスの作製及び各組織での発現
１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で２９３ＴＮ細胞（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を培養した。トランスフェクションはＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）を用い、添付のプロトコールに従った。使用するベクターは、実施例２の結果から脂肪細胞で特異性が見られたもののうち、最もプロモーターサイズが小さいａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨ、３Ｔ３−Ｌ１未分化細胞、２９３細胞で比較的活性の低かったａＰ２−３−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨ、ａＰ２−５−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨ、ａＰ２プロモーター全長を含むａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨを選択し、それぞれｐＰＡＣＫＨ１（ＳＢＩ社）と共導入した。トランスフェクションを行ってから７２時間後、培地を回収し、超遠心で濃縮後、スクロース精製を行い、トランスジェニックマウス作製用のレンチウイルス液を調製した。ウイルスタイターはｐ２４ Ａｎｔｉｇｅｎ ＥＬＩＺＡ ｋｉｔ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社）を用いて測定した。ＢＤＦ１雌マウスにＰＭＳＧ（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）を５ＩＵ、その４８時間後にＨＣＧ（胎盤性性腺刺激ホルモン）を５ＩＵ投与して過***を誘発し、ＢＤＦ１雄マウスと交配した。交配翌日に膣栓を確認できた雌マウスの卵管を、交配後約４０時間で採取し、０．４％ＢＳＡ溶液で灌流した。回収できた２細胞期胚はｋＳＯＭ培地（アークリソース社）中で短期間培養した後、１分から２分程度酸性タイロード（アークリソース社）処理することで胚の透明体を除去した。首尾よく透明帯が除去された胚は、ｋＳＯＭ培地中で洗浄し、ウイルス感染まで同培地中で培養した。胚へのウイルス感染は、ウイルス粒子数を約１５０ｐｇ／μlまたは１５００ｐｇ／μl含むように希釈したｋＳＯＭ培地のドロップ（６μl／スポット）にて、透明帯を除去した胚を２日間培養することにより行った。胚の培養は、全て５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で行った。ウイルス感染後に、胚盤胞期もしくは桑実胚期まで発生した胚を、膣栓確認後２．５日の偽妊娠マウス子宮内へ移植し、移植１７日後に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を得た。生後４週齢で採取した産仔の尾端より、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡをテンプレートとして配列番号２５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６の塩基配列からなるプライマーを用いて９５℃ １５秒、５７℃ １５秒、７２℃ ３０秒を４０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、ＥＧＦＰ遺伝子の一部を増幅した後、アガロースゲル電気泳動を行うことで、導入遺伝子を検出し、トランスジェニックマウスの遺伝子型を判定した。生後８週齢前後でトランスジェニックマウスから生殖器周囲脂肪の一部を生検採取し、蛍光実体顕微鏡下でＥＧＦＰ蛍光の観察を行なった。ＥＧＦＰ蛍光が認められた個体の剖検を行い、蛍光実体顕微鏡下で主要臓器と４種の脂肪組織におけるＥＧＦＰ蛍光を観察し、結果を以下の表１に示した。

この結果、全長プロモーターを搭載したａＰ２−１２−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨで作製したトランスジェニックマウスにおいては、トランスジェニックマウスの作製効率が他の短縮型プロモーターを使用した場合と比較して１／１０以下に低下し、得られたトランスジェニックマウスにおいては、どの組織でも蛍光が見られなかった。これはウイルスのパッケージング効率の低下が原因だと考えられる。また、ａＰ２−０−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨで作製したトランスジェニックマウスは、脂肪組織で蛍光が確認されたが、その強度が弱く、また、膵臓でも同程度であった。一方、ａＰ２−３−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨで作製したトランスジェニックマウスは、膵臓の他、脂肪組織で強い蛍光が観察された。このことから、ａＰ２−３−ＥＧＦＰ／ｐＣＤＨに含まれる配列には生体内で脂肪組織及び膵臓組織に導入遺伝子を十分な強度で発現させるために必要なエレメントが含まれると考えられる

ヒトａＰ２−０、ヒトａＰ２−１１、ヒトａＰ２−３／ｐＧＬ３の作製
ヒトａＰ２遺伝子の転写開始点より上流約１０ｋｂに対して、配列番号：２１、２２、２３に示される配列の相同領域をそれぞれ検索し、配列番号：２７、２８、２９に示される配列を得た。これらの領域をクローニングするため、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型にして、下記のプライマー対（配列番号３０の塩基配列からなるプライマー、および配列番号３１の塩基配列からなるプライマー）、（配列番号３２の塩基配列からなるプライマー、および配列番号３３の塩基配列からなるプライマー）、および（配列番号３４の塩基配列からなるプライマー、および配列番号３５の塩基配列からなるプライマー）を用いて、ＰＣＲを行うことにより、それぞれＳａｃＩとＮｈｅＩ、ＮｈｅＩとＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。配列番号２９を含む増幅断片をＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの部位に連結してヒトａＰ２−１１／ｐＧＬ３を得た。次にこのプラスミドをＳａｃＩとＮｈｅＩで処理し、配列番号２７を含む増幅断片をＳａｃＩとＮｈｅＩで処理した断片を連結してヒトａＰ２−０／ｐＧＬ３を作製した。次にこのプラスミドをＮｈｅＩとＸｈｏＩで処理し、配列番号２８を含む増幅断片をＮｈｅＩとＸｈｏＩで処理した断片を連結してヒトａＰ２−３／ｐＧＬ３を作製した。

培養細胞における各プロモーターの反応
３Ｔ３−Ｌ１脂肪分化細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、ヒトａＰ２プロモーター由来の各コンストラクトの脂肪細胞における転写活性を調べた。比較のために、分化誘導していない３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞を用いた。１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で３Ｔ３−Ｌ１細胞を培養し、コンフルエント２日後、インスリン、デキサメタゾン、ＩＢＭＸを含む培地で分化誘導を開始した。トランスフェクションはエレクトロポレーションにて行った。また、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞のトランスフェクションはＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）を用い、添付のプロトコールに従った。内部コントロールレポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターであるｐＲＬ−Ｔｋベクターを導入した。トランスフェクションを行ってから２４時間後、それぞれの細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、発光強度を測った。結果を図３の上段に示し、比較対象にマウスの結果を下段に示した。この図においては、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞にａＰ２−１１を導入したときの発光強度（図中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と示す）を１として他のコンストラクトを用いたときの発光強度の相対値を示した。

この結果、ａＰ２−１１に対してａＰ２−０、ａＰ２−３を導入した場合、マウスの場合と同様に、ヒトにおいても３Ｔ３−Ｌ１脂肪分化細胞でのみ転写活性の上昇が認められた。このことから、ヒト由来の配列でもａＰ２プロモーターの相同領域には生体内で脂肪組織及び膵臓組織に特異的に導入遺伝子を発現させるために必要なエレメントが含まれることが予想される。

Claims (17)

1. 配列番号：２２に示される塩基配列を少なくとも有するＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／もしくは膵臓において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ。
2. （ａ）配列番号：２２に示される塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２２に示される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡ、及び（ｃ）配列番号：２２に示される塩基配列からなるＤＮＡに少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡからなる群より選択されたＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／または膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ。
3. さらに配列番号：２１に示される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項１又は２記載の単離されたＤＮＡ。
4. さらに配列番号：２３に示される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の単離されたＤＮＡ。
5. 配列番号：２８に示される塩基配列を少なくとも有するＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／もしくは膵臓において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ。
6. （ａ）配列番号：２８に示される塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２８に示される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡ、及び（ｃ）配列番号：２８に示される塩基配列からなるＤＮＡに少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡからなる群より選択されたＤＮＡであって、かつ脂肪組織および／または膵臓組織において特異的なプロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ。
7. さらに配列番号：２７に示される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項５又は６記載の単離されたＤＮＡ。
8. さらに配列番号：２９に示される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項５〜７のいずれかに記載の単離されたＤＮＡ。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載の単離されたＤＮＡに外来遺伝子が連結されたＤＮＡ。
10. 請求項１〜８のいずれかに記載の単離されたＤＮＡと外来遺伝子が作動可能に連結されてなる発現ベクター。
11. 外来遺伝子が、対象疾患を治療するためのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１０に記載の発現ベクター。
12. 外来遺伝子が、対象疾患を治療するための核酸である、請求項１０に記載の発現ベクター。
13. 請求項１１または１２のいずれかに記載の発現ベクターを有効成分として含有してなる治療剤。
14. 請求項１０〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを保持してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
15. 発現ベクターが哺乳動物の染色体中に組み込まれてなる、請求項１４記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
16. 請求項１４または請求項１５のいずれかに記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する細胞
17. 請求項１４または１５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、スクリーニング方法。

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