RU2004137000A - Мутеины плацентарного фактора роста 1 типа, способ их получения и применение - Google Patents

Claims (52)

1. Мутеин мономерной формы плацентарного фактора роста 1-го типа (PLGF-1) человека или животного, характеризующийся тем, что он включает замену или удаление в полипептидной последовательности белка дикого типа, по меньшей мере, одного остатка цистеина (Cys), причем данная замена или удаление не влияет на образование биологически активного димера, но предотвращает мультимеризацию данной мономерной формы.

2. Мутеин по п.1, характеризующийся тем, что заменяемый или удаляемый остаток Cys находится в С-концевой части полипептидной последовательности белка.

3. Мутеин по п.2, характеризующийся тем, что он включает замену или удаление остатка Cys в положении 142 полипептидной последовательности белка-предшественника, которое соответствует цистеину в положении 125 в SEQ ID NO:2.

4. Мутеин по п.3, характеризующийся тем, что остаток Cys в положении 142 заменен остатком глицина (Gly).

5. Мутеин по п.1 в виде белка-предшественника или зрелого белка.

6. Мутеин п.1, в котором еще одна или несколько аминокислот белка дикого типа удаляется, заменяется или добавляется без изменения функциональных характеристик мутеина.

7. Мутеин по п.3 в димерной форме.

8. Мутеин по п.7, содержащий по меньшей мере 98,5% димерной формы.

9. Мутеин по любому из п.7 или 8 для применения в способе терапевтического лечения.

10. Мутеин по п.9 для лечения ишемических заболеваний.

11. Мутеин по п.10 для лечения ишемии ткани миокарда, инфаркта миокарда, ишемического удара и хронических ишемических заболеваний миокарда, ишемии головного мозга и ишемического удара, ишемии кишечника, периферической ишемии конечностей.

12. Мутеин по п.9 для лечения склеродермии.

13. Мутеин по п.9 для лечения кожных язв, ран, ожогов, послеоперационного лечения.

14. Мутеин по п.9 для лечения естественного или преждевременного старения кожных тканей.

15. Мутеин по п.9 для лечения естественного или патологического выпадения волос.

16. Нуклеотидная последовательность, включающая ДНК, кодирующую мутеин по любому из пп.1-6.

17. Нуклеотидная последовательность по п.16, характеризующаяся тем, что кодон TGC или TGT в последовательности, кодирующей PLGF-1 дикого типа, удален или модифицирован.

18. Нуклеотидная последовательность по п.17, в которой кодон TGC или TGT заменен кодоном GGC, GGT, GGA или GGG.

19. Нуклеотидная последовательность по п.18, в которой тимидиновое основание в положении 382 в последовательности SEQ ID NO:1 или ее производных, являющихся результатом вырожденности ДНК, заменено на гуанозиновое основание.

20. Экспрессионная система, включающая нуклеотидную последовательность по п.16, фланкированную нетранслируемыми последовательностями для контроля и регуляции экспрессии.

21. Экспрессионная система по п.20, характеризующаяся тем, что она представляет собой экспрессионную систему, индуцибельную в бактериальных клетках.

22. Экспрессионная система по п.20, характеризующаяся тем, что экспрессия находится под контролем индуцибельного промотора.

23. Экспрессионная система по п.20, характеризующаяся тем, что она представляет собой экспрессионную систему на основе РНК-полимеразы фага Т7 и что экспрессия индуцируется с помощью лактозы, изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) или функционально эквивалентного аналога.

24. Клетка-хозяин, трансформированная при помощи экспрессионной системы по п.20.

25. Клетка-хозяин по п.24, характеризующаяся тем, что она представляет собой бактериальную клетку.

26. Клетка-хозяин по п.25, характеризующаяся тем, что она происходит из штамма Е.coli.

27. Способ получения нуклеотидной последовательности по п.16, характеризующийся тем, что ДНК, кодирующую мутеин, получают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве праймеров олигонуклеотиды, соответствующим образом модифицированные относительно нуклеотидной последовательности дикого типа.

28. Способ по п.27, в котором олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO:3 используется в качестве 5’-3’ (прямого) праймера, а олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO:4 используется в качестве 5’-3’ (обратного) праймера.

29. Способ по п.27, в котором последовательность ДНК, кодирующая белок PLGF-1 без сигнального пептида, используется в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции.

30. Способ по п.27, в котором последовательность ДНК, полученную в полимеразной цепной реакции, подвергают реакции заполнения, а затем расщепляют соответствующими рестрикционными ферментами и клонируют в подходящий вектор.

31. Способ получения и экстракции мутеина фактора PLGF-1, характеризующийся тем, что клетки-хозяева по п.24 культивируют в подходящей культуральной среде, что экспрессию белка индуцируют с помощью соответствующего индуктора, что клетки выделяют и подвергают лизису, и что мутеин экстрагируют из лизисной смеси.

32. Способ по п.31, в котором культуральная среда включает одно или несколько селективных агентов, дрожжевой экстракт, глицерин и соли аммония и свободна от материала, происходящего из животных или человека.

33. Способ по п.31, в котором клетки культивируют, перед стадией индукции экспрессии, до достижения оптической плотности (OD) культуральной среды от 0,2 до 50 единиц при 600 нм.

34. Способ по п.33, в котором экспрессию индуцируют с помощью лактозы, изопропил-β-тиогалактопиранозида (IPTG) или функционально эквивалентного аналога.

35. Способ по п.31, в котором лизис клеток осуществляют при помощи замораживания/оттаивания, пресса Френча или другим эквивалентным методом.

36. Способ по п.35, в котором тельца включения, высвобождаемые во время лизиса, выделяют при помощи, по меньшей мере, двух циклов центрифугирования и промывки в соответствующем буфере.

37. Способ по п.36, в котором тельца включения солюбилизируют в денатурирующем буфере, содержащем мочевину, гуанидинизотиоцианат, гуанидингидрохлорид или другой денатурирующий агент и при необходимости гомогенизируют или обрабатывают ультразвуком.

38. Способ по п.37, в котором после солюбилизации телец включения раствор разбавляют и ренатурируют белковый материал в димерной форме путем добавления в раствор окислительно-восстановительных агентов и инкубации в течение от 10 до 30 ч, предпочтительно от 18 до 20 ч, при температуре от 10 до 30°С, предпочтительно 20°С, с перемешиванием.

39. Способ по п.31, дополнительно включающий, по меньшей мере, одну стадию очистки димерного белка.

40. Способ по п.39, в котором стадия очистки заключается в ионообменной хроматографии.

41. Способ по п.39, в котором раствор после стадии ренатурирования наносят на анионообменную колонку при соотношении наносимого объема и колоночного объема от 1:1 до 10:1, предпочтительно 10:1.

42. Способ по п.39, включающий стадию очистки на колонке методом обращено фазовой хроматографии.

43. Способ по п.31, включающий дополнительную стадию ультрафильтрации с последующей лиофилизацией в присутствии или в отсутствие соответствующих добавок.

44. Поликлональное, моноклональное антитело или его функционально активный фрагмент, обладающие способностью к распознаванию мутеина по любому из пп.1-8, способностью к перекрестной реакции с PLGF-1 дикого типа и к нейтрализации его ангиогенной активности.

45. Антитело по п.44 в качестве лекарственного средства для нейтрализации ангиогенной активности эндогенного PLGF-1 при лечении патологических состояний, сопровождающихся аномальной продукцией PLGF-1.

46. Антитело по п.44 для лечения различных видов опухолей.

47. Антитело по п.44 в качестве реагента в способе диагностики патологических состояний, сопровождающихся аномальной продукцией эндогенного PLGF-1.

48. Фармацевтическая композиция, содержащая мутеин по любому из п.7 или 8 либо антитело по п.44 и фармакологически приемлемый наполнитель.

49. Фармацевтическая композиция по п.48, пригодная для парентерального, наружного, орального, назального применения или применения в имплантах.

50. Косметическая композиция, содержащая мутеин по любому из п.7 или 8 и косметически приемлемый наполнитель.

51. Способ получения фармацевтической композиции по п.48, в котором мутеин PLGF-1 объединяют с фармакологически приемлемым наполнителем и с другими обычными добавками.

52. Способ получения косметической композиции по п.50, в котором мутеин PLGF-1 объединяют с косметически приемлемым наполнителем и с другими обычными добавками.