JP2002325585A - Rfrpの製造法 - Google Patents
Rfrpの製造法Info
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- JP2002325585A JP2002325585A JP2001372444A JP2001372444A JP2002325585A JP 2002325585 A JP2002325585 A JP 2002325585A JP 2001372444 A JP2001372444 A JP 2001372444A JP 2001372444 A JP2001372444 A JP 2001372444A JP 2002325585 A JP2002325585 A JP 2002325585A
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- Peptides Or Proteins (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 RFアミドペプチドを工業的かつ大量に製造
するのに有利な製造法を提供する。 【解決手段】 N末端にシステインを有するタンパク質
またはペプチドのN末端にRFアミドペプチドを連結し
た融合タンパク質またはペプチドをシステイン残基のア
ミノ酸側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴と
するRFアミドペプチドの製造法。
するのに有利な製造法を提供する。 【解決手段】 N末端にシステインを有するタンパク質
またはペプチドのN末端にRFアミドペプチドを連結し
た融合タンパク質またはペプチドをシステイン残基のア
ミノ酸側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴と
するRFアミドペプチドの製造法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、融合タンパク質ま
たはポリペプチドを製造し、次いで該融合タンパク質ま
たはポリペプチドをペプチド結合の切断反応に付すこと
により、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:
23、配列番号:25、配列番号:27または配列番
号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドの部分ペプチドまたはその塩を製造する方法などに関
する。さらに、所望に応じて、N末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有する配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩か
ら効率よくN末端の酸化されていてもよいメチオニン残
基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を除去する方
法などに関する。
たはポリペプチドを製造し、次いで該融合タンパク質ま
たはポリペプチドをペプチド結合の切断反応に付すこと
により、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:
23、配列番号:25、配列番号:27または配列番
号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドの部分ペプチドまたはその塩を製造する方法などに関
する。さらに、所望に応じて、N末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有する配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩か
ら効率よくN末端の酸化されていてもよいメチオニン残
基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を除去する方
法などに関する。
【0002】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いて、ペプチドを
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で分解を受けや
すいために、融合タンパク質の形で発現させることがし
ばしば行われている。融合タンパク質からの目的ペプチ
ドの切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断す
る方法(イタクラら、Science, 198, 1056(1977))、フ
ァフターXaを用い酵素的に切断する方法(ナガイら、
Methods in Enzymology,153, 46(1987))が知られてい
る。さらに、タンパク質中のペプチド結合を切断する方
法として、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸による
アシルシステイン結合の切断が知られている(「生化学
実験講座」1,タンパク質の化学II,日本生化学会
編,東京化学同人発行,第247〜250頁,1976
年)。しかしながら、タンパク質から配列番号:19、
配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配
列番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドの切り出し
については、開示されていない。
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で分解を受けや
すいために、融合タンパク質の形で発現させることがし
ばしば行われている。融合タンパク質からの目的ペプチ
ドの切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断す
る方法(イタクラら、Science, 198, 1056(1977))、フ
ァフターXaを用い酵素的に切断する方法(ナガイら、
Methods in Enzymology,153, 46(1987))が知られてい
る。さらに、タンパク質中のペプチド結合を切断する方
法として、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸による
アシルシステイン結合の切断が知られている(「生化学
実験講座」1,タンパク質の化学II,日本生化学会
編,東京化学同人発行,第247〜250頁,1976
年)。しかしながら、タンパク質から配列番号:19、
配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配
列番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドの切り出し
については、開示されていない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】従来知られている技術
において、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニン
を含有するペプチドの製造には適用することはできない
し、切り出し時の収率等に問題が多い。このように、融
合タンパク質またはポリペプチドから配列番号:19、
配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配
列番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを効率良く
切り出す方法が望まれている。さらに、同じ配列番号:
19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドであ
っても、N末端にメチオニンの付加した分子種とそうで
ない分子種とはポリペプチドの高次構造、生物活性、安
定性が相互に異なる可能性があり、さらにメチオニンの
N末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性もあり
うるものと考えられる。従って、産業利用上の観点か
ら、この開始コドンに対応するN末端メチオニン除去法
を確立することは意義あることと考えられる。
において、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニン
を含有するペプチドの製造には適用することはできない
し、切り出し時の収率等に問題が多い。このように、融
合タンパク質またはポリペプチドから配列番号:19、
配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配
列番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを効率良く
切り出す方法が望まれている。さらに、同じ配列番号:
19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドであ
っても、N末端にメチオニンの付加した分子種とそうで
ない分子種とはポリペプチドの高次構造、生物活性、安
定性が相互に異なる可能性があり、さらにメチオニンの
N末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性もあり
うるものと考えられる。従って、産業利用上の観点か
ら、この開始コドンに対応するN末端メチオニン除去法
を確立することは意義あることと考えられる。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造する方法について鋭意検
討を加えたところ、N末端にシステインを有するタンパ
ク質またはポリペプチドのN末端に配列番号:19、配
列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列
番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを連結した融
合タンパク質またはポリペプチドを製造し、次いでこれ
をペプチド結合を切断する反応に付すことにより、配列
番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造できることを見い出し、
これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。さらに、上記の製造方法に従って製造したポリペプ
チド中、特に配列番号:3、配列番号:5、配列番号:
9または配列番号:11で表されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドなどについては、N末端にメチオニン残
基が余分に付加したものが製造される可能性があるた
め、本発明者らは、遺伝子工学的に製造される配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドにおけるN末端のメチオニン残基のみを切断すること
による、天然型のアミノ酸配列を有する配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドの製
造法を鋭意研究したところ、下記のスキーム1に表され
るとおり式(I)で表されるN末端に酸化されていても
よいメチオニン残基を有する配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドに、例えば、α
−ジケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを
供与しうる硫酸銅、塩基(例えばアミン類)であるピリ
ジンを反応させて、アミノ基転移反応を行うことにより
得られる該メチオニン残基のジケトン体を有する配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドに塩基(例えばジアミン類)である3,4−ジアミノ
安息香酸を反応させて加水分解反応を行うことにより、
該メチオニン残基のジケトン体を有する配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドから
メチオニン残基のジケトン体を予想外にも効率よく除去
できることを見出した。すなわち、本発明者らはメチオ
ニン残基を有する配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドから、N末端の酸化されていて
もよいメチオニン残基を除去し、その活性を低下させる
ことなく、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基を有していない配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドを予想外にも高収率で得る方法
を見い出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに
至った。 (スキーム1)
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造する方法について鋭意検
討を加えたところ、N末端にシステインを有するタンパ
ク質またはポリペプチドのN末端に配列番号:19、配
列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列
番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを連結した融
合タンパク質またはポリペプチドを製造し、次いでこれ
をペプチド結合を切断する反応に付すことにより、配列
番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドまたはその塩を効率良く製造できることを見い出し、
これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。さらに、上記の製造方法に従って製造したポリペプ
チド中、特に配列番号:3、配列番号:5、配列番号:
9または配列番号:11で表されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドなどについては、N末端にメチオニン残
基が余分に付加したものが製造される可能性があるた
め、本発明者らは、遺伝子工学的に製造される配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドにおけるN末端のメチオニン残基のみを切断すること
による、天然型のアミノ酸配列を有する配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドの製
造法を鋭意研究したところ、下記のスキーム1に表され
るとおり式(I)で表されるN末端に酸化されていても
よいメチオニン残基を有する配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドに、例えば、α
−ジケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを
供与しうる硫酸銅、塩基(例えばアミン類)であるピリ
ジンを反応させて、アミノ基転移反応を行うことにより
得られる該メチオニン残基のジケトン体を有する配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドに塩基(例えばジアミン類)である3,4−ジアミノ
安息香酸を反応させて加水分解反応を行うことにより、
該メチオニン残基のジケトン体を有する配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドから
メチオニン残基のジケトン体を予想外にも効率よく除去
できることを見出した。すなわち、本発明者らはメチオ
ニン残基を有する配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドから、N末端の酸化されていて
もよいメチオニン残基を除去し、その活性を低下させる
ことなく、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基を有していない配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドを予想外にも高収率で得る方法
を見い出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに
至った。 (スキーム1)
【化1】 [式(I)中、mは0ないし2の整数を示し、Xは配列
番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドのペプチド鎖を示す。] 本願明細書においては、上記スキーム1中、 (1)一般式(I)で表される化合物を「N末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有する配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
はその塩」または「メチオニン残基を有する配列番号:
19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
はその塩」; (2)一般式(I)において
番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドのペプチド鎖を示す。] 本願明細書においては、上記スキーム1中、 (1)一般式(I)で表される化合物を「N末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有する配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
はその塩」または「メチオニン残基を有する配列番号:
19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
はその塩」; (2)一般式(I)において
【化2】 [式中、mは前記と同意義]で表される部分構造を「酸化
されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残
基」または「メチオニン」; (3)一般式(II)で表される化合物を「N末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有す
る配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、
配列番号:25、配列番号:27または配列番号:29
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分
ペプチドまたはその塩」または「メチオニン残基のジケ
トン体を有する配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドまたはその塩」; (4)一般式(II)において
されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残
基」または「メチオニン」; (3)一般式(II)で表される化合物を「N末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有す
る配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、
配列番号:25、配列番号:27または配列番号:29
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分
ペプチドまたはその塩」または「メチオニン残基のジケ
トン体を有する配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドまたはその塩」; (4)一般式(II)において
【化3】 [式中、mは前記と同意義]で表される部分構造を「酸化
されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」または
「メチオニン残基のジケトン体」;および、 (5)一般式(III)に代表される化合物を「N末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していない
配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配
列番号:25、配列番号:27または配列番号:29で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそ
の塩」または「N末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有していない配列番号:19、配
列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列
番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドまたはその塩」と、それぞれ
称することがある。
されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」または
「メチオニン残基のジケトン体」;および、 (5)一般式(III)に代表される化合物を「N末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していない
配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配
列番号:25、配列番号:27または配列番号:29で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそ
の塩」または「N末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有していない配列番号:19、配
列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列
番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドまたはその塩」と、それぞれ
称することがある。
【0005】すなわち本発明は、(1)N末端にシステ
インを有するタンパク質またはポリペプチドのN末端
に、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有
していてもよい配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドを連結した融合タンパク質または
ポリペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド
結合の切断反応に付すことを特徴とする配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(2)N末端にシステインを有するタンパク質またはポ
リペプチドのN末端に、N末端にメチオニン残基を有し
ていてもよい配列番号:19、配列番号:21、配列番
号:23、配列番号:25、配列番号:27または配列
番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドの部分ペプチドを連結した融合タンパク質またはポ
リペプチドをコードするDNAを有するベクターを保持
する形質転換体を培養して融合タンパク質またはポリペ
プチドを発現させ、発現された融合タンパク質またはポ
リペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結
合の切断反応に付すことを特徴とするN末端にメチオニ
ン残基を有していてもよい配列番号:19、配列番号:
21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:2
7または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造
法、(3)切断反応がS−シアノ化反応、次いでアンモ
ノリシスまたは加水分解反応に付す反応である上記
(1)または(2)記載の製造法、(4)配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(1)または(2)記載の製
造法、(5)配列番号:19、配列番号:21、配列番
号:23、配列番号:25、配列番号:27または配列
番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番号:
9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
る上記(1)または(2)記載の製造法、(6)配列番
号:1または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:3、
配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9または配列
番号:11で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドである上記(5)記載の製造法、(7)N末端にシス
テインを有するタンパク質またはポリペプチドのN末端
に、N末端にメチオニン残基を有していてもよい配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドを連結した融合タンパク質もしくはポリペプチドまた
はその塩、(8)配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(7)記載のポリペプチドま
たはその塩、(9)配列番号:19、配列番号:21、
配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27また
は配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列
番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドである上記(7)記載のポリペプチドまたはその塩、
(10)配列番号:1または配列番号:9で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号:1、
配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番
号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドである上記(9)記載のポリペプチ
ドまたはその塩、(11)上記(7)記載の融合タンパ
ク質またはポリペプチドをコードするDNAを有するベ
クター、(12)上記(11)記載のベクターで形質転
換された形質転換体、(13)N末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有する配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩と
α−ジケトン類を反応させた後、加水分解することを特
徴とする該メチオニン残基の除去方法、(14)N末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドが遺伝子工学的に製造された配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドであって、該酸
化されていてもよいメチオニン残基のC末端側に隣接す
るアミノ酸残基がイソロイシン残基、バリン残基、シス
テイン残基、スレオニン残基、アスパラギン酸残基、リ
ジン残基、ロイシン残基、アルギニン残基、アスパラギ
ン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、チロ
シン残基、トリプトファン残基、グルタミン酸残基、グ
ルタミン残基またはヒスチジン残基である上記(13)
記載の方法、(15)配列番号:19、配列番号:2
1、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27
または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(13)または(14)記載
の方法、(16)配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である上記(13)または(14)記載の製造法、(1
7)配列番号:1または配列番号:9で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号:1、配列
番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9
または配列番号:11で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである上記(16)記載の方法、(18)
遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させる
ことを特徴とする上記(13)記載の方法、(19)塩
基の存在下にα−ジケトン類を反応させることを特徴と
する上記(13)記載の方法、(20)遷移金属イオン
および塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させること
を特徴とする上記(13)記載の方法、(21)α−ジ
ケトン類がグリオキシル酸またはその塩である上記(1
3)記載の方法、(22)遷移金属イオンが銅イオンで
ある上記(18)記載の方法、(23)塩基がピリジン
である上記(19)記載の方法。(24)塩基を用いて
加水分解することを特徴とする上記(13)記載の方
法、(25)塩基がアミン類である上記(24)記載の
方法、(26)塩基がジアミン類またはチオもしくはセ
レノセミカルバジド類である上記(24)記載の方法、
(27)ジアミン類がo−フェニレンジアミンまたは
3,4−ジアミノ安息香酸である上記(26)記載の方
法、(28)遺伝子工学的に製造され、N末端にメチオ
ニンが付加した配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドまたはその塩とグリオキシル酸ま
たはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応さ
せた後、o−フェニレンジアミンまたは3,4−ジアミ
ノ安息香酸と反応させることを特徴とする配列番号:1
もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドまたはその塩の製造法、(29)配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項28記載の製造法、(3
0)配列番号:19、配列番号:21、配列番号:2
3、配列番号:25、配列番号:27または配列番号:
29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの
部分ペプチドが、配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記
(28)記載の製造法、(31)配列番号:1または配
列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、
配列番号:7、配列番号:9または配列番号:11で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記
(30)記載の製造法、(32)式 CH3-S(O)m-(CH2)2
-CO-CO-X〔式中、mは0ないし2の整数を、Xは配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドのペプチド鎖を示す。〕で表
される化合物またはその塩、(33)配列番号:19、
配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配
列番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項32記載の化合物またはそ
の塩、(34)配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である上記(32)記載の化合物またはその塩、(3
5)配列番号:1または配列番号:9で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号:1、配列
番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9
または配列番号:11で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである上記(34)記載の化合物またはそ
の塩、(36)上記(32)記載の化合物を加水分解す
ることを特徴とする配列番号:19、配列番号:21、
配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27また
は配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法、(3
7)N末端にシステインを有するタンパク質またはポリ
ペプチドのN末端に、N末端にメチオニン残基を有する
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを連結
した融合タンパク質またはポリペプチドをシステイン残
基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付し、N末
端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するで表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその
塩を得、さらに、該N末端に酸化されていてもよいメチ
オニン残基を有するで表されるアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドまたはその塩とα−ジケトン類を反応させ
た後、加水分解することを特徴とするで表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の製造法、
(38)配列番号:19、配列番号:21、配列番号:
23、配列番号:25、配列番号:27または配列番
号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(37)記載の製造法、(3
9)配列番号:19、配列番号:21、配列番号:2
3、配列番号:25、配列番号:27または配列番号:
29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの
部分ペプチドが、配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記
(37)記載の製造法、(40)配列番号:1または配
列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、
配列番号:7、配列番号:9または配列番号:11で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項
39記載の製造法等を提供する。
インを有するタンパク質またはポリペプチドのN末端
に、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有
していてもよい配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドを連結した融合タンパク質または
ポリペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド
結合の切断反応に付すことを特徴とする配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(2)N末端にシステインを有するタンパク質またはポ
リペプチドのN末端に、N末端にメチオニン残基を有し
ていてもよい配列番号:19、配列番号:21、配列番
号:23、配列番号:25、配列番号:27または配列
番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドの部分ペプチドを連結した融合タンパク質またはポ
リペプチドをコードするDNAを有するベクターを保持
する形質転換体を培養して融合タンパク質またはポリペ
プチドを発現させ、発現された融合タンパク質またはポ
リペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結
合の切断反応に付すことを特徴とするN末端にメチオニ
ン残基を有していてもよい配列番号:19、配列番号:
21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:2
7または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造
法、(3)切断反応がS−シアノ化反応、次いでアンモ
ノリシスまたは加水分解反応に付す反応である上記
(1)または(2)記載の製造法、(4)配列番号:1
9、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(1)または(2)記載の製
造法、(5)配列番号:19、配列番号:21、配列番
号:23、配列番号:25、配列番号:27または配列
番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番号:
9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
る上記(1)または(2)記載の製造法、(6)配列番
号:1または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:3、
配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9または配列
番号:11で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドである上記(5)記載の製造法、(7)N末端にシス
テインを有するタンパク質またはポリペプチドのN末端
に、N末端にメチオニン残基を有していてもよい配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドを連結した融合タンパク質もしくはポリペプチドまた
はその塩、(8)配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(7)記載のポリペプチドま
たはその塩、(9)配列番号:19、配列番号:21、
配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27また
は配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列
番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドである上記(7)記載のポリペプチドまたはその塩、
(10)配列番号:1または配列番号:9で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号:1、
配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番
号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドである上記(9)記載のポリペプチ
ドまたはその塩、(11)上記(7)記載の融合タンパ
ク質またはポリペプチドをコードするDNAを有するベ
クター、(12)上記(11)記載のベクターで形質転
換された形質転換体、(13)N末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有する配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩と
α−ジケトン類を反応させた後、加水分解することを特
徴とする該メチオニン残基の除去方法、(14)N末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドが遺伝子工学的に製造された配列番号:19、配列番
号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番
号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの部分ペプチドであって、該酸
化されていてもよいメチオニン残基のC末端側に隣接す
るアミノ酸残基がイソロイシン残基、バリン残基、シス
テイン残基、スレオニン残基、アスパラギン酸残基、リ
ジン残基、ロイシン残基、アルギニン残基、アスパラギ
ン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、チロ
シン残基、トリプトファン残基、グルタミン酸残基、グ
ルタミン残基またはヒスチジン残基である上記(13)
記載の方法、(15)配列番号:19、配列番号:2
1、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27
または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(13)または(14)記載
の方法、(16)配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である上記(13)または(14)記載の製造法、(1
7)配列番号:1または配列番号:9で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号:1、配列
番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9
または配列番号:11で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである上記(16)記載の方法、(18)
遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させる
ことを特徴とする上記(13)記載の方法、(19)塩
基の存在下にα−ジケトン類を反応させることを特徴と
する上記(13)記載の方法、(20)遷移金属イオン
および塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させること
を特徴とする上記(13)記載の方法、(21)α−ジ
ケトン類がグリオキシル酸またはその塩である上記(1
3)記載の方法、(22)遷移金属イオンが銅イオンで
ある上記(18)記載の方法、(23)塩基がピリジン
である上記(19)記載の方法。(24)塩基を用いて
加水分解することを特徴とする上記(13)記載の方
法、(25)塩基がアミン類である上記(24)記載の
方法、(26)塩基がジアミン類またはチオもしくはセ
レノセミカルバジド類である上記(24)記載の方法、
(27)ジアミン類がo−フェニレンジアミンまたは
3,4−ジアミノ安息香酸である上記(26)記載の方
法、(28)遺伝子工学的に製造され、N末端にメチオ
ニンが付加した配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドまたはその塩とグリオキシル酸ま
たはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反応さ
せた後、o−フェニレンジアミンまたは3,4−ジアミ
ノ安息香酸と反応させることを特徴とする配列番号:1
もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドまたはその塩の製造法、(29)配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチ
ドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項28記載の製造法、(3
0)配列番号:19、配列番号:21、配列番号:2
3、配列番号:25、配列番号:27または配列番号:
29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの
部分ペプチドが、配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記
(28)記載の製造法、(31)配列番号:1または配
列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、
配列番号:7、配列番号:9または配列番号:11で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記
(30)記載の製造法、(32)式 CH3-S(O)m-(CH2)2
-CO-CO-X〔式中、mは0ないし2の整数を、Xは配列番
号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番
号:25、配列番号:27または配列番号:29で表さ
れるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドのペプチド鎖を示す。〕で表
される化合物またはその塩、(33)配列番号:19、
配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配
列番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項32記載の化合物またはそ
の塩、(34)配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である上記(32)記載の化合物またはその塩、(3
5)配列番号:1または配列番号:9で表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号:1、配列
番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9
または配列番号:11で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである上記(34)記載の化合物またはそ
の塩、(36)上記(32)記載の化合物を加水分解す
ることを特徴とする配列番号:19、配列番号:21、
配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27また
は配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法、(3
7)N末端にシステインを有するタンパク質またはポリ
ペプチドのN末端に、N末端にメチオニン残基を有する
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを連結
した融合タンパク質またはポリペプチドをシステイン残
基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付し、N末
端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するで表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその
塩を得、さらに、該N末端に酸化されていてもよいメチ
オニン残基を有するで表されるアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドまたはその塩とα−ジケトン類を反応させ
た後、加水分解することを特徴とするで表されるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の製造法、
(38)配列番号:19、配列番号:21、配列番号:
23、配列番号:25、配列番号:27または配列番
号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドの部分ペプチドが、 1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、 3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)
〜第112番目(Leu)、第124番目(Val)〜
131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第92番
目(Phe)または第1番目(Met)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、 4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番目(V
al)〜第94番目(Phe)、第84番目(Pro)
〜第94番目(Phe)または第118番目(Phe)
〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチド、または 5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番
目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである上記(37)記載の製造法、(3
9)配列番号:19、配列番号:21、配列番号:2
3、配列番号:25、配列番号:27または配列番号:
29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの
部分ペプチドが、配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記
(37)記載の製造法、(40)配列番号:1または配
列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、
配列番号:7、配列番号:9または配列番号:11で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項
39記載の製造法等を提供する。
【0006】本発明の配列番号:19、配列番号:2
1、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27
または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチド(以下、本発明の前駆体ポリペプチドと
称する場合がある)は、それぞれWO00/29441
号公報およびWO01/66134号公報に記載されて
いる配列番号:1、配列番号:8、配列番号:14、配
列番号:33、配列番号:50または配列番号:18で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである。
本発明の前駆体ポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に
従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カ
ルボキシル末端)である。配列番号:1で表されるアミ
ノ酸配列を含有する前駆体ポリペプチドをはじめとす
る、本発明の前駆体ポリペプチドは、C末端が通常カル
ボキシル基(−COOH)またはカルボキシレート(−
COO-)であるが、C末端がアミド(−CONH2)ま
たはエステル(−COOR)であってもよい。ここでエ
ステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、
n−プロピル、イソプロピルもしくはn−ブチルなどの
C1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘ
キシルなどのC3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのC6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C
1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基のほか、経口
用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基
などが用いられる。本発明の前駆体ポリペプチドがC末
端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を
有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエス
テル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末
端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の前駆
体ポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基(例、メチ
オニン残基)のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル
基、アセチル基などのC1- 6アルカノイルなどのC1-6ア
シル基など)で保護されているもの、生体内で切断され
て生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸
化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例え
ば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インド
ール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、
ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基な
どのC1-6アシル基など)で保護されているもの、ある
いは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タ
ンパク質なども含まれる。以下、これらのポリペプチド
を含めて本発明の前駆体ポリペプチドと略称することも
ある。
1、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27
または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチド(以下、本発明の前駆体ポリペプチドと
称する場合がある)は、それぞれWO00/29441
号公報およびWO01/66134号公報に記載されて
いる配列番号:1、配列番号:8、配列番号:14、配
列番号:33、配列番号:50または配列番号:18で
表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである。
本発明の前駆体ポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に
従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カ
ルボキシル末端)である。配列番号:1で表されるアミ
ノ酸配列を含有する前駆体ポリペプチドをはじめとす
る、本発明の前駆体ポリペプチドは、C末端が通常カル
ボキシル基(−COOH)またはカルボキシレート(−
COO-)であるが、C末端がアミド(−CONH2)ま
たはエステル(−COOR)であってもよい。ここでエ
ステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、
n−プロピル、イソプロピルもしくはn−ブチルなどの
C1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘ
キシルなどのC3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのC6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C
1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基のほか、経口
用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基
などが用いられる。本発明の前駆体ポリペプチドがC末
端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を
有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエス
テル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末
端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の前駆
体ポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基(例、メチ
オニン残基)のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル
基、アセチル基などのC1- 6アルカノイルなどのC1-6ア
シル基など)で保護されているもの、生体内で切断され
て生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸
化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例え
ば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インド
ール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、
ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基な
どのC1-6アシル基など)で保護されているもの、ある
いは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タ
ンパク質なども含まれる。以下、これらのポリペプチド
を含めて本発明の前駆体ポリペプチドと略称することも
ある。
【0007】本発明の前駆体ポリペプチドの部分ペプチ
ド(以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある)
としては、前記した本発明の前駆体ポリペプチドの部分
ペプチドであって、例えば、本発明の前駆体ポリペプチ
ドに対するレセプタータンパク質(具体的には、WO0
0/29441号公報およびWO01/66134号公
報に記載されている配列番号:37で表されるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するタンパク質またはその塩)に結合し、プロラクチン
分泌調節活性を有するものであればいかなるものでもよ
い。また、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列
中の1〜5個(好ましくは、1〜3個のアミノ酸が欠失
し、または、そのアミノ酸配列に1〜5個(好ましく
は、1〜3個)のアミノ酸が付加し、または、そのアミ
ノ酸配列に1〜5個(好ましくは、1〜3個のアミノ酸
が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の1〜5個
(好ましくは、1〜3個のアミノ酸が他のアミノ酸で置
換されたアミノ酸配列を含有していてもよく、それらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有していてもよい。ま
た、本発明のポリペプチドはC末端が通常カルボキシル
基(−COOH)またはカルボキシレート(−CO
O-)であるが、前記した本発明の前駆体ポリペプチド
のごとく、C末端がアミド(−CONH2)またはエス
テル(−COOR)(Rは上記と同意義を示す)であっ
てもよい。なかでも、C末端がアミド(−CONH2)
であるものが好ましい。本発明のポリペプチドがC末端
以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有
している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステ
ル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末
端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のポリ
ペプチドには、前記した本発明の前駆体ポリペプチドと
同様に、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)
のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生
体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミ
ン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が
適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結
合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含
まれる。以下、これらのポリペプチドを含めて本発明の
ポリペプチドと略称することもある。
ド(以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある)
としては、前記した本発明の前駆体ポリペプチドの部分
ペプチドであって、例えば、本発明の前駆体ポリペプチ
ドに対するレセプタータンパク質(具体的には、WO0
0/29441号公報およびWO01/66134号公
報に記載されている配列番号:37で表されるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するタンパク質またはその塩)に結合し、プロラクチン
分泌調節活性を有するものであればいかなるものでもよ
い。また、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列
中の1〜5個(好ましくは、1〜3個のアミノ酸が欠失
し、または、そのアミノ酸配列に1〜5個(好ましく
は、1〜3個)のアミノ酸が付加し、または、そのアミ
ノ酸配列に1〜5個(好ましくは、1〜3個のアミノ酸
が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の1〜5個
(好ましくは、1〜3個のアミノ酸が他のアミノ酸で置
換されたアミノ酸配列を含有していてもよく、それらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有していてもよい。ま
た、本発明のポリペプチドはC末端が通常カルボキシル
基(−COOH)またはカルボキシレート(−CO
O-)であるが、前記した本発明の前駆体ポリペプチド
のごとく、C末端がアミド(−CONH2)またはエス
テル(−COOR)(Rは上記と同意義を示す)であっ
てもよい。なかでも、C末端がアミド(−CONH2)
であるものが好ましい。本発明のポリペプチドがC末端
以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有
している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステ
ル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末
端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のポリ
ペプチドには、前記した本発明の前駆体ポリペプチドと
同様に、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)
のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生
体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミ
ン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が
適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結
合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含
まれる。以下、これらのポリペプチドを含めて本発明の
ポリペプチドと略称することもある。
【0008】本発明の前駆体ポリペプチドの部分ペプチ
ドとしては、例えば、RFamide、RSamide
またはRLamide構造を有するペプチド、より好ま
しくは、RFamideまたはRSamide構造を有
するペプチド、特に好ましくは、RFamideを有す
るペプチドが挙げられる。RFamide構造とは、ぺ
プチドのC末端がArginine(アルギニン)−P
henylalanine(フェニルアラニン)−NH
2構造になっていることをいい、RSamide構造と
は、ぺプチドのC末端がArginine(アルギニ
ン)−Serine(セリン)−NH2構造になってい
ることをいい、RLamide構造とは、ぺプチドのC
末端がArginine(アルギニン)−Leucin
e(ロイシン)−NH2構造になっていることを意味す
る。本発明のポリペプチドの中でも、例えば、(1)配
列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番目(S
er)〜第92番目(Phe)、第73番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)〜第9
2番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第101番目(Ser)〜112番目(S
er)、第95番目(Asn)〜第112番目(Se
r)、第115番目(Asn)〜第131番目(Ph
e)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、第
1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1番
目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチド、(2)配列番号:21で表されるア
ミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)、第73番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、第84
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第101番目
(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目(As
n)〜第112番目(Ser)、第115番目(As
n)〜第131番目(Phe)、第124番目(Va
l)〜131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第
92番目(Phe)、第1番目(Met)〜112番目
(Ser)または第1番目(Met)〜131番目(P
he)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)配列
番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目(Se
r)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜第1
12番目(Leu)、第95番目(Asn)〜第112
番目(Leu)、第124番目(Val)〜131番目
(Phe)、第1番目(Met)〜第92番目(Ph
e)または第1番目(Met)〜131番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:
25で表されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜
第94番目(Phe)、第83番目(Val)〜第94
番目(Phe)、第84番目(Pro)〜第94番目
(Phe)または第118番目(Phe)〜第125番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58
番目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番
目(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチドなどが好ましい例としてあげられ、特
に、(1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第
56番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番
目(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)
〜第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜1
12番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112
番目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番
目(Phe)または第124番目(Val)〜131番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)または第124番目(Val)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)
配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第101番目(Ser)
〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)〜第
112番目(Leu)または第124番目(Val)〜
131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチ
ド、(4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第
58番目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番
目(Val)〜第94番目(Phe)、第84番目(P
ro)〜第94番目(Phe)または第118番目(P
he)〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有
するペプチド、(5)配列番号:27で表されるアミノ
酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(Phe)
または第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)の
アミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい例とし
てあげられる。
ドとしては、例えば、RFamide、RSamide
またはRLamide構造を有するペプチド、より好ま
しくは、RFamideまたはRSamide構造を有
するペプチド、特に好ましくは、RFamideを有す
るペプチドが挙げられる。RFamide構造とは、ぺ
プチドのC末端がArginine(アルギニン)−P
henylalanine(フェニルアラニン)−NH
2構造になっていることをいい、RSamide構造と
は、ぺプチドのC末端がArginine(アルギニ
ン)−Serine(セリン)−NH2構造になってい
ることをいい、RLamide構造とは、ぺプチドのC
末端がArginine(アルギニン)−Leucin
e(ロイシン)−NH2構造になっていることを意味す
る。本発明のポリペプチドの中でも、例えば、(1)配
列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番目(S
er)〜第92番目(Phe)、第73番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)〜第9
2番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第101番目(Ser)〜112番目(S
er)、第95番目(Asn)〜第112番目(Se
r)、第115番目(Asn)〜第131番目(Ph
e)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、第
1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1番
目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチド、(2)配列番号:21で表されるア
ミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)、第73番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、第84
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第101番目
(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目(As
n)〜第112番目(Ser)、第115番目(As
n)〜第131番目(Phe)、第124番目(Va
l)〜131番目(Phe)、第1番目(Met)〜第
92番目(Phe)、第1番目(Met)〜112番目
(Ser)または第1番目(Met)〜131番目(P
he)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)配列
番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目(Se
r)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜第1
12番目(Leu)、第95番目(Asn)〜第112
番目(Leu)、第124番目(Val)〜131番目
(Phe)、第1番目(Met)〜第92番目(Ph
e)または第1番目(Met)〜131番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:
25で表されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜
第94番目(Phe)、第83番目(Val)〜第94
番目(Phe)、第84番目(Pro)〜第94番目
(Phe)または第118番目(Phe)〜第125番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(5)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58
番目(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番
目(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチドなどが好ましい例としてあげられ、特
に、(1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第
56番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番
目(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)
〜第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜1
12番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112
番目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番
目(Phe)または第124番目(Val)〜131番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21表されるアミノ酸配列の第56番
目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目(M
et)〜第92番目(Phe)、第81番目(Met)
〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第101番目(Ser)〜112番
目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番目
(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)または第124番目(Val)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)
配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第101番目(Ser)
〜第112番目(Leu)、第95番目(Asn)〜第
112番目(Leu)または第124番目(Val)〜
131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチ
ド、(4)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第
58番目(Ser)〜第94番目(Phe)、第83番
目(Val)〜第94番目(Phe)、第84番目(P
ro)〜第94番目(Phe)または第118番目(P
he)〜第125番目(Phe)のアミノ酸配列を含有
するペプチド、(5)配列番号:27で表されるアミノ
酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(Phe)
または第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)の
アミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい例とし
てあげられる。
【0009】なかでも、(1)配列番号:19で表され
るアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第10
1番目(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目
(Asn)〜第112番目(Ser)、第115番目
(Asn)〜第131番目(Phe)または第124番
目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチド、(2)配列番号:21で表されるア
ミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)、第73番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、第84
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第101番目
(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目(As
n)〜第112番目(Ser)、第115番目(As
n)〜第131番目(Phe)または第124番目(V
al)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチド、(3)配列番号:23で表されるアミノ酸
配列の第58番目(Ser)〜第92番目(Phe)、
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、第10
1番目(Ser)〜第112番目(Leu)、第95番
目(Asn)〜第112番目(Leu)または第124
番目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(P
he)、第83番目(Val)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(5)配列番
号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目(Se
r)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドなどが好ましく、とりわけ、(1)配列番号:
19で表されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第73番目(Met)〜第92
番目(Phe)、第81番目(Met)〜第92番目
(Phe)、第84番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)、第115番目(Asn)〜第131番目(Ph
e)または第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(2)配列番
号:21で表されるアミノ酸配列の第56番目(Se
r)〜第92番目(Phe)、第73番目(Met)〜
第92番目(Phe)、第81番目(Met)〜第92
番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)または第124番目(Val)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)
配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)または第124番目(Va
l)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドが好ましい。
るアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第10
1番目(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目
(Asn)〜第112番目(Ser)、第115番目
(Asn)〜第131番目(Phe)または第124番
目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチド、(2)配列番号:21で表されるア
ミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)、第73番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、第84
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第101番目
(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目(As
n)〜第112番目(Ser)、第115番目(As
n)〜第131番目(Phe)または第124番目(V
al)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチド、(3)配列番号:23で表されるアミノ酸
配列の第58番目(Ser)〜第92番目(Phe)、
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、第10
1番目(Ser)〜第112番目(Leu)、第95番
目(Asn)〜第112番目(Leu)または第124
番目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(P
he)、第83番目(Val)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(5)配列番
号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目(Se
r)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドなどが好ましく、とりわけ、(1)配列番号:
19で表されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第73番目(Met)〜第92
番目(Phe)、第81番目(Met)〜第92番目
(Phe)、第84番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)、第115番目(Asn)〜第131番目(Ph
e)または第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(2)配列番
号:21で表されるアミノ酸配列の第56番目(Se
r)〜第92番目(Phe)、第73番目(Met)〜
第92番目(Phe)、第81番目(Met)〜第92
番目(Phe)、第84番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)または第124番目(Val)〜131番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)
配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)または第124番目(Va
l)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドが好ましい。
【0010】なかでも、(1)配列番号:19で表され
るアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第81番目(Met)〜第92番目(Phe)ま
たは第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)のア
ミノ酸配列を含有するペプチド、(2)配列番号:21
で表されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目
(Phe)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)または第84番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)配列番
号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目(Se
r)〜第92番目(Phe)または第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドが好ましく、とりわけ、(1)配列番号:19
で表されるアミノ酸配列の第81番目(Met)〜第9
2番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第81
番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番目(P
he)のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく、
特に、(1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(2)配列番号:21で表
されるアミノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが
好ましい。
るアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第81番目(Met)〜第92番目(Phe)ま
たは第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)のア
ミノ酸配列を含有するペプチド、(2)配列番号:21
で表されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第9
2番目(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目
(Phe)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)または第84番目(Ser)〜第92番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、(3)配列番
号:23で表されるアミノ酸配列の第58番目(Se
r)〜第92番目(Phe)または第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドが好ましく、とりわけ、(1)配列番号:19
で表されるアミノ酸配列の第81番目(Met)〜第9
2番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第81
番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番目(P
he)のアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく、
特に、(1)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の
第81番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(2)配列番号:21で表
されるアミノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが
好ましい。
【0011】また、本発明のポリペプチドの好ましい例
として、(a)配列番号:19の第81番目(Met)
ないし第92番目(Phe)のアミノ酸配列を有するペ
プチド、(b)配列番号:19の第101番目(Se
r)ないし第112番目(Ser)のアミノ酸配列を有
するペプチド、(c)配列番号:19の第124番目
(Val)ないし第131番目(Phe)のアミノ酸配
列を有するペプチド、(d)配列番号:19の第56番
目(Ser)ないし第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を有するペプチド、(e)配列番号:23の第81番
目(Met)ないし第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を有するペプチド、(f)配列番号:23の第101
番目(Ser)ないし第112番目(Leu)のアミノ
酸配列を有するペプチド、(g)配列番号:23の第5
8番目(Ser)ないし第92番目(Phe)のアミノ
酸配列を有するペプチド、(h)配列番号:25の第8
3番目(Val)ないし第94番目(Phe)のアミノ
酸配列を有するペプチド、(i)配列番号:25の第1
18番目(Phe)ないし第125番目(Phe)のア
ミノ酸配列を有するペプチド、(j)配列番号:25の
第58番目(Ser)ないし第94番目(Phe)のア
ミノ酸配列を有するペプチド、(k)配列番号:27の
第58番目(Ser)ないし第94番目(Phe)のア
ミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
として、(a)配列番号:19の第81番目(Met)
ないし第92番目(Phe)のアミノ酸配列を有するペ
プチド、(b)配列番号:19の第101番目(Se
r)ないし第112番目(Ser)のアミノ酸配列を有
するペプチド、(c)配列番号:19の第124番目
(Val)ないし第131番目(Phe)のアミノ酸配
列を有するペプチド、(d)配列番号:19の第56番
目(Ser)ないし第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を有するペプチド、(e)配列番号:23の第81番
目(Met)ないし第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を有するペプチド、(f)配列番号:23の第101
番目(Ser)ないし第112番目(Leu)のアミノ
酸配列を有するペプチド、(g)配列番号:23の第5
8番目(Ser)ないし第92番目(Phe)のアミノ
酸配列を有するペプチド、(h)配列番号:25の第8
3番目(Val)ないし第94番目(Phe)のアミノ
酸配列を有するペプチド、(i)配列番号:25の第1
18番目(Phe)ないし第125番目(Phe)のア
ミノ酸配列を有するペプチド、(j)配列番号:25の
第58番目(Ser)ないし第94番目(Phe)のア
ミノ酸配列を有するペプチド、(k)配列番号:27の
第58番目(Ser)ないし第94番目(Phe)のア
ミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
【0012】特にこれらのペプチドのアミド体(好まし
くは、これらペプチドのC末端のカルボキシル基(−C
OOH)がアミド化された(−CONH2)ペプチド)
が好ましい。具体的には配列番号:19で表されるアミ
ノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)のアミノ酸配列で表されるペプチドのC末端がアミ
ド化された(−CONH2)ペプチド、配列番号:19
で表されるアミノ酸配列の第101番目(Ser)〜1
12番目(Ser)のアミノ酸配列で表されるペプチド
のC末端がアミド化された(−CONH2)ペプチドお
よび配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第124
番目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
で表されるペプチドのC末端がアミド化された(−CO
NH2)ペプチドなどがあげられる。なかでも、配列番
号:19で表されるアミノ酸配列の第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列で表される
ペプチドのC末端がアミド化された(−CONH2)ペ
プチドまたは、配列番号:19で表されるアミノ酸配列
の第124番目(Val)〜131番目(Phe)のア
ミノ酸配列で表されるペプチドのC末端がアミド化され
た(−CONH2)ペプチドなどが好ましく、配列番
号:19で表されるアミノ酸配列の第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列で表される
ペプチドのC末端がアミド化された(−CONH2)ペ
プチドが特に好ましい。
くは、これらペプチドのC末端のカルボキシル基(−C
OOH)がアミド化された(−CONH2)ペプチド)
が好ましい。具体的には配列番号:19で表されるアミ
ノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)のアミノ酸配列で表されるペプチドのC末端がアミ
ド化された(−CONH2)ペプチド、配列番号:19
で表されるアミノ酸配列の第101番目(Ser)〜1
12番目(Ser)のアミノ酸配列で表されるペプチド
のC末端がアミド化された(−CONH2)ペプチドお
よび配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第124
番目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
で表されるペプチドのC末端がアミド化された(−CO
NH2)ペプチドなどがあげられる。なかでも、配列番
号:19で表されるアミノ酸配列の第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列で表される
ペプチドのC末端がアミド化された(−CONH2)ペ
プチドまたは、配列番号:19で表されるアミノ酸配列
の第124番目(Val)〜131番目(Phe)のア
ミノ酸配列で表されるペプチドのC末端がアミド化され
た(−CONH2)ペプチドなどが好ましく、配列番
号:19で表されるアミノ酸配列の第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列で表される
ペプチドのC末端がアミド化された(−CONH2)ペ
プチドが特に好ましい。
【0013】また、本発明のポリペプチドとしては、例
えば、配列番号:1もしくは配列番号:9で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドなども好ましく用い
られ、具体的には、配列番号:1もしくは配列番号:9
で表されるアミノ酸配列を含有し、例えば、Hinuma et
al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708 (2000)に
記載のRF amide-related peptidesやWO00/294
41号に記載のポリペプチドなどがあげられ、Hinuma e
t al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708 (2000)
やWO00/29441号に記載のレセプターOT7T022
に対し、リガンド活性を有するペプチドであれば、如何
なるものであってもよい。このようなポリペプチドとし
ては、例えば配列番号:1、配列番号:3、配列番号:
5、配列番号:7、配列番号:9または配列番号:11
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあ
げられる。
えば、配列番号:1もしくは配列番号:9で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドなども好ましく用い
られ、具体的には、配列番号:1もしくは配列番号:9
で表されるアミノ酸配列を含有し、例えば、Hinuma et
al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708 (2000)に
記載のRF amide-related peptidesやWO00/294
41号に記載のポリペプチドなどがあげられ、Hinuma e
t al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708 (2000)
やWO00/29441号に記載のレセプターOT7T022
に対し、リガンド活性を有するペプチドであれば、如何
なるものであってもよい。このようなポリペプチドとし
ては、例えば配列番号:1、配列番号:3、配列番号:
5、配列番号:7、配列番号:9または配列番号:11
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあ
げられる。
【0014】本発明の前駆体ポリペプチドをコードする
DNAとしては、具体的には、(1)配列番号:19で
表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来前駆体ポリペ
プチドをコードするDNAとしては、配列番号:20で
表される塩基配列を含有するDNAなどが、(2)配列
番号:21で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来
前駆体ポリペプチドをコードするDNAとしては、配列
番号:22で表される塩基配列を含有するDNAなど
が、(3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列を含
有するウシ由来前駆体ポリペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:24で表される塩基配列を含有す
るDNAなどが、(4)配列番号:25で表されるアミ
ノ酸配列を含有するマウス由来前駆体ポリペプチドをコ
ードするDNAとしては、配列番号:26で表される塩
基配列を含有するDNAなどが、(5)配列番号:27
で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来前駆体ポ
リペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
8で表される塩基配列を含有するDNAなどが、(6)
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するラッ
ト由来前駆体ポリペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:30で表される塩基配列を含有するDN
Aなどが用いられる。
DNAとしては、具体的には、(1)配列番号:19で
表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来前駆体ポリペ
プチドをコードするDNAとしては、配列番号:20で
表される塩基配列を含有するDNAなどが、(2)配列
番号:21で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来
前駆体ポリペプチドをコードするDNAとしては、配列
番号:22で表される塩基配列を含有するDNAなど
が、(3)配列番号:23で表されるアミノ酸配列を含
有するウシ由来前駆体ポリペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:24で表される塩基配列を含有す
るDNAなどが、(4)配列番号:25で表されるアミ
ノ酸配列を含有するマウス由来前駆体ポリペプチドをコ
ードするDNAとしては、配列番号:26で表される塩
基配列を含有するDNAなどが、(5)配列番号:27
で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来前駆体ポ
リペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
8で表される塩基配列を含有するDNAなどが、(6)
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するラッ
ト由来前駆体ポリペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:30で表される塩基配列を含有するDN
Aなどが用いられる。
【0015】本発明のポリペプチドをコードするDNA
としては、例えば、前記した配列番号:20、配列番
号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番
号:28または配列番号:30で表される塩基配列を含
有するDNAの部分塩基配列を有するDNAなどが用い
られる。本発明の部分ペプチドをコードするDNAとし
ては、具体的には、(1)配列番号:19で表されるア
ミノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするD
NAとしては、配列番号:20で表される塩基配列の第
241番目ないし第276番目の塩基配列を含有するD
NA、(2)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の
第101番目(Ser)〜112番目(Ser)のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:20で表される塩基配列の第301番目
ないし第336番目の塩基配列を含有するDNA、
(3)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第12
4番目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:20で表される塩基配列の第370番目ないし
第393番目の塩基配列を含有するDNA、(4)配列
番号:19で表されるアミノ酸配列の第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:20
で表される塩基配列の第1番目ないし第276番目の塩
基配列を含有するDNA、(5)配列番号:19で表さ
れるアミノ酸配列の第1番目(Met)〜112番目
(Ser)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコード
するDNAとしては、配列番号:20で表される塩基配
列の第1番目ないし第336番目の塩基配列を含有する
DNA、(6)配列番号:19で表されるアミノ酸配列
の第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:20で表される塩基配列の第1番目ない
し第393番目の塩基配列を含有するDNA、(7)配
列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番目(S
er)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
0で表される塩基配列の第166番目〜第276番目の
塩基配列を含有するDNA、(8)配列番号:19で表
されるアミノ酸配列の第73番目(Met)〜第92番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコー
ドするDNAとしては、配列番号:20で表される塩基
配列の第217番目〜第276番目の塩基配列を含有す
るDNA、(9)配列番号:19で表されるアミノ酸配
列の第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)のア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとし
ては、配列番号:20で表される塩基配列の第253番
目〜第276番目の塩基配列を含有するDNA、(1
0)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第95番
目(Asn)〜第112番目(Ser)のアミノ酸配列
を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配列
番号:20で表される塩基配列の第283番目〜第39
3番目の塩基配列を含有するDNA、(11)配列番
号:19で表されるアミノ酸配列の第115番目(As
n)〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
0で表される塩基配列の第346番目〜第393番目の
塩基配列を含有するDNA、
としては、例えば、前記した配列番号:20、配列番
号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番
号:28または配列番号:30で表される塩基配列を含
有するDNAの部分塩基配列を有するDNAなどが用い
られる。本発明の部分ペプチドをコードするDNAとし
ては、具体的には、(1)配列番号:19で表されるア
ミノ酸配列の第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするD
NAとしては、配列番号:20で表される塩基配列の第
241番目ないし第276番目の塩基配列を含有するD
NA、(2)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の
第101番目(Ser)〜112番目(Ser)のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:20で表される塩基配列の第301番目
ないし第336番目の塩基配列を含有するDNA、
(3)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第12
4番目(Val)〜131番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:20で表される塩基配列の第370番目ないし
第393番目の塩基配列を含有するDNA、(4)配列
番号:19で表されるアミノ酸配列の第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:20
で表される塩基配列の第1番目ないし第276番目の塩
基配列を含有するDNA、(5)配列番号:19で表さ
れるアミノ酸配列の第1番目(Met)〜112番目
(Ser)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコード
するDNAとしては、配列番号:20で表される塩基配
列の第1番目ないし第336番目の塩基配列を含有する
DNA、(6)配列番号:19で表されるアミノ酸配列
の第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:20で表される塩基配列の第1番目ない
し第393番目の塩基配列を含有するDNA、(7)配
列番号:19で表されるアミノ酸配列の第56番目(S
er)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
0で表される塩基配列の第166番目〜第276番目の
塩基配列を含有するDNA、(8)配列番号:19で表
されるアミノ酸配列の第73番目(Met)〜第92番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコー
ドするDNAとしては、配列番号:20で表される塩基
配列の第217番目〜第276番目の塩基配列を含有す
るDNA、(9)配列番号:19で表されるアミノ酸配
列の第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)のア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとし
ては、配列番号:20で表される塩基配列の第253番
目〜第276番目の塩基配列を含有するDNA、(1
0)配列番号:19で表されるアミノ酸配列の第95番
目(Asn)〜第112番目(Ser)のアミノ酸配列
を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配列
番号:20で表される塩基配列の第283番目〜第39
3番目の塩基配列を含有するDNA、(11)配列番
号:19で表されるアミノ酸配列の第115番目(As
n)〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
0で表される塩基配列の第346番目〜第393番目の
塩基配列を含有するDNA、
【0016】(12)配列番号:21で表されるアミノ
酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:22で表される塩基配列の第16
9番目〜第276番目の塩基配列を含有するDNA、
(13)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第7
3番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:22で表される塩基配列の第220番目〜第2
76番目の塩基配列を含有するDNA、(14)配列番
号:21で表されるアミノ酸配列の第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:22
で表される塩基配列の第244番目〜第276番目の塩
基配列を含有するDNA、(15)配列番号:21で表
されるアミノ酸配列の第84番目(Ser)〜第92番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコー
ドするDNAとしては、配列番号:22で表される塩基
配列の第253番目〜第276番目の塩基配列を含有す
るDNA、(16)配列番号:21で表されるアミノ酸
配列の第101番目(Ser)〜第112番目(Se
r)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするD
NAとしては、配列番号:22で表される塩基配列の第
304番目〜第336番目の塩基配列を含有するDN
A、(17)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の
第95番目(Asn)〜第112番目(Ser)のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:22で表される塩基配列の第283番目
〜第393番目の塩基配列を含有するDNA、(18)
配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第115番目
(Asn)〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチドをコードするDNAとしては、配列番
号:22で表される塩基配列の第346番目〜第393
番目の塩基配列を含有するDNA、(19)配列番号:
21で表されるアミノ酸配列の第124番目(Val)
〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードするDNAとしては、配列番号:22で
表される塩基配列の第373番目〜第393番目の塩基
配列を含有するDNA、(20)配列番号:21で表さ
れるアミノ酸配列の第1番目(Met)〜第92番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコード
するDNAとしては、配列番号:22で表される塩基配
列の第1番目〜第276番目の塩基配列を含有するDN
A、(21)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の
第1番目(Met)〜第112番目(Ser)のアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第
336番目の塩基配列を含有するDNA、(22)配列
番号:21で表されるアミノ酸配列の第1番目(Me
t)〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
2で表される塩基配列の第1番目〜第393番目の塩基
配列を含有するDNA、
酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:22で表される塩基配列の第16
9番目〜第276番目の塩基配列を含有するDNA、
(13)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第7
3番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:22で表される塩基配列の第220番目〜第2
76番目の塩基配列を含有するDNA、(14)配列番
号:21で表されるアミノ酸配列の第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:22
で表される塩基配列の第244番目〜第276番目の塩
基配列を含有するDNA、(15)配列番号:21で表
されるアミノ酸配列の第84番目(Ser)〜第92番
目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコー
ドするDNAとしては、配列番号:22で表される塩基
配列の第253番目〜第276番目の塩基配列を含有す
るDNA、(16)配列番号:21で表されるアミノ酸
配列の第101番目(Ser)〜第112番目(Se
r)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするD
NAとしては、配列番号:22で表される塩基配列の第
304番目〜第336番目の塩基配列を含有するDN
A、(17)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の
第95番目(Asn)〜第112番目(Ser)のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:22で表される塩基配列の第283番目
〜第393番目の塩基配列を含有するDNA、(18)
配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第115番目
(Asn)〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を
含有するペプチドをコードするDNAとしては、配列番
号:22で表される塩基配列の第346番目〜第393
番目の塩基配列を含有するDNA、(19)配列番号:
21で表されるアミノ酸配列の第124番目(Val)
〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードするDNAとしては、配列番号:22で
表される塩基配列の第373番目〜第393番目の塩基
配列を含有するDNA、(20)配列番号:21で表さ
れるアミノ酸配列の第1番目(Met)〜第92番目
(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコード
するDNAとしては、配列番号:22で表される塩基配
列の第1番目〜第276番目の塩基配列を含有するDN
A、(21)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の
第1番目(Met)〜第112番目(Ser)のアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするDNAとして
は、配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第
336番目の塩基配列を含有するDNA、(22)配列
番号:21で表されるアミノ酸配列の第1番目(Me
t)〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
2で表される塩基配列の第1番目〜第393番目の塩基
配列を含有するDNA、
【0017】(23)配列番号:23で表されるアミノ
酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:24で表される塩基配列の第17
2番目〜第276番目の塩基配列を含有するDNA、
(24)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第8
1番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:24で表される塩基配列の第241番目〜第2
76番目の塩基配列を含有するDNA、(25)配列番
号:23で表されるアミノ酸配列の第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
4で表される塩基配列の第301番目〜第336番目の
塩基配列を含有するDNA、(26)配列番号:23で
表されるアミノ酸配列の第95番目(Asn)〜第11
2番目(Leu)のアミノ酸配列を含有するペプチドを
コードするDNAとしては、配列番号:24で表される
塩基配列の第283番目〜第336番目の塩基配列を含
有するDNA、(27)配列番号:23で表されるアミ
ノ酸配列の第124番目(Val)〜第131番目(P
he)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする
DNAとしては、配列番号:24で表される塩基配列の
第370番目〜第393番目の塩基配列を含有するDN
A、(28)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の
第1番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸
配列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、
配列番号:24で表される塩基配列の第1番目〜第27
6番目の塩基配列を含有するDNA、(29)配列番
号:23で表されるアミノ酸配列の第1番目(Met)
〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードするDNAとしては、配列番号:24で
表される塩基配列の第1番目〜第393番目の塩基配列
を含有するDNA、
酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:24で表される塩基配列の第17
2番目〜第276番目の塩基配列を含有するDNA、
(24)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の第8
1番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:24で表される塩基配列の第241番目〜第2
76番目の塩基配列を含有するDNA、(25)配列番
号:23で表されるアミノ酸配列の第101番目(Se
r)〜第112番目(Leu)のアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:2
4で表される塩基配列の第301番目〜第336番目の
塩基配列を含有するDNA、(26)配列番号:23で
表されるアミノ酸配列の第95番目(Asn)〜第11
2番目(Leu)のアミノ酸配列を含有するペプチドを
コードするDNAとしては、配列番号:24で表される
塩基配列の第283番目〜第336番目の塩基配列を含
有するDNA、(27)配列番号:23で表されるアミ
ノ酸配列の第124番目(Val)〜第131番目(P
he)のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする
DNAとしては、配列番号:24で表される塩基配列の
第370番目〜第393番目の塩基配列を含有するDN
A、(28)配列番号:23で表されるアミノ酸配列の
第1番目(Met)〜第92番目(Phe)のアミノ酸
配列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、
配列番号:24で表される塩基配列の第1番目〜第27
6番目の塩基配列を含有するDNA、(29)配列番
号:23で表されるアミノ酸配列の第1番目(Met)
〜第131番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードするDNAとしては、配列番号:24で
表される塩基配列の第1番目〜第393番目の塩基配列
を含有するDNA、
【0018】(30)配列番号:25で表されるアミノ
酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:26で表される塩基配列の第17
2番目〜第282番目の塩基配列を含有するDNA、
(31)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第8
3番目(Val)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:26で表される塩基配列の第247番目〜第2
82番目の塩基配列を含有するDNA、(32)配列番
号:25で表されるアミノ酸配列の第84番目(Pr
o)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:26
で表される塩基配列の第250番目〜第282番目の塩
基配列を含有するDNA、(33)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第118番目(Phe)〜第12
5番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドを
コードするDNAとしては、配列番号:26で表される
塩基配列の第352番目〜第375番目の塩基配列を含
有するDNA、
酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:26で表される塩基配列の第17
2番目〜第282番目の塩基配列を含有するDNA、
(31)配列番号:25で表されるアミノ酸配列の第8
3番目(Val)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:26で表される塩基配列の第247番目〜第2
82番目の塩基配列を含有するDNA、(32)配列番
号:25で表されるアミノ酸配列の第84番目(Pr
o)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含有する
ペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:26
で表される塩基配列の第250番目〜第282番目の塩
基配列を含有するDNA、(33)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第118番目(Phe)〜第12
5番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチドを
コードするDNAとしては、配列番号:26で表される
塩基配列の第352番目〜第375番目の塩基配列を含
有するDNA、
【0019】(34)配列番号:27で表されるアミノ
酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:28で表される塩基配列の第17
2番目〜第282番目の塩基配列を含有するDNA、
(35)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第8
4番目(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:28で表される塩基配列の第250番目〜第2
82番目の塩基配列を含有するDNAなどがあげられ
る。
酸配列の第58番目(Ser)〜第94番目(Phe)
のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNA
としては、配列番号:28で表される塩基配列の第17
2番目〜第282番目の塩基配列を含有するDNA、
(35)配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第8
4番目(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするDNAとしては、配
列番号:28で表される塩基配列の第250番目〜第2
82番目の塩基配列を含有するDNAなどがあげられ
る。
【0020】本発明の方法に用いられるN末端にシステ
インを有するタンパク質またはポリペプチドとしては、
特定されるものではない。そのN末端にシステインを有
しないタンパク質またはポリペプチドの場合は、公知の
方法によりN末端にシステインを有するようにすればよ
い。該N末端にシステインを有するタンパク質またはポ
リペプチドとしては、分子量が100〜100000の
ものが好ましく、さらに、分子量が300〜50000
のものが好ましい。また、N末端にシステインを有する
タンパク質またはポリペプチドとしては、1〜1000
個のアミノ酸を有するものが好ましく、さらに3〜50
0個のアミノ酸を有するものが好ましい。該タンパク質
またはペプチドとしては、例えばインターフエロン類、
インターロイキン類、線維芽細胞成長因子(aFGF、
bFGFなど)等各種成長因子類、(プロ)ウロキナー
ゼ類、リンホトキシン、腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis
factor(TNF))、β−ガラトシターゼなどの酵素
タンパク類、貯蔵タンパク類、ストレプトアビシン、プ
ロテインA、プロテインG、組織プラスミノーゲンアク
チベーター(Tissue Plasminogen Activator(tP
A))、これらのムテイン又はこれらの一部(断片)な
どのN末端にシステインを有するものがあげられる。な
かでも、線維芽細胞成長因子(aFGF、bFGFな
ど)またはそのムテインまたはこれらの一部(断片)
(例えば、bFGF CS23ムテインなど)などが好
ましく用いられる。bFGF CS23ムテインとして
は、例えば、Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gl
y-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-
Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-Hi
s-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-
Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Ar
g-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gly-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-
Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Se
r-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-
Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Ly
s-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-
Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser-Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Ly
s-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala-Lys-Ser(配
列番号:13)で表されるアミノ酸配列を含有するタン
パク質などがあげられる。
インを有するタンパク質またはポリペプチドとしては、
特定されるものではない。そのN末端にシステインを有
しないタンパク質またはポリペプチドの場合は、公知の
方法によりN末端にシステインを有するようにすればよ
い。該N末端にシステインを有するタンパク質またはポ
リペプチドとしては、分子量が100〜100000の
ものが好ましく、さらに、分子量が300〜50000
のものが好ましい。また、N末端にシステインを有する
タンパク質またはポリペプチドとしては、1〜1000
個のアミノ酸を有するものが好ましく、さらに3〜50
0個のアミノ酸を有するものが好ましい。該タンパク質
またはペプチドとしては、例えばインターフエロン類、
インターロイキン類、線維芽細胞成長因子(aFGF、
bFGFなど)等各種成長因子類、(プロ)ウロキナー
ゼ類、リンホトキシン、腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis
factor(TNF))、β−ガラトシターゼなどの酵素
タンパク類、貯蔵タンパク類、ストレプトアビシン、プ
ロテインA、プロテインG、組織プラスミノーゲンアク
チベーター(Tissue Plasminogen Activator(tP
A))、これらのムテイン又はこれらの一部(断片)な
どのN末端にシステインを有するものがあげられる。な
かでも、線維芽細胞成長因子(aFGF、bFGFな
ど)またはそのムテインまたはこれらの一部(断片)
(例えば、bFGF CS23ムテインなど)などが好
ましく用いられる。bFGF CS23ムテインとして
は、例えば、Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gl
y-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-
Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-Hi
s-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-
Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Ar
g-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gly-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-
Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Se
r-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-
Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Ly
s-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-
Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser-Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Ly
s-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala-Lys-Ser(配
列番号:13)で表されるアミノ酸配列を含有するタン
パク質などがあげられる。
【0021】本発明方法で用いられる融合タンパク質
(融合ポリペプチドを含む)をコードするDNAは、
(1)全塩基配列を化学的に合成してもよいし、(2)タン
パク質をコードする塩基配列のN末端側にシステインを
コードする塩基配列を配置し、さらにそのN末端側に本
発明のポリペプチドをコードする塩基配列を配置するこ
とにより該DNAを構築してもよい。また、(3)本発
明のポリペプチドのフラグメントを得るのが目的の場合
には、所望のフラグメントの直後のアミノ酸残基を部位
特異的突然変異誘発(site-directed mutagenesis)等
の手法でシステインに置換した該DNAを構築すればよ
い。上記の(1)の場合の製造法としては、例えば、公知
のホスホアミダイド法、リン酸トリエステル法、ジエス
テル法、ハイドロジェンホスホネート法などを用いて、
短いものなら一度に、長いものでは分割して合成した後
にT4 DNAリガーゼを用いて連結して作成すること
が可能である。
(融合ポリペプチドを含む)をコードするDNAは、
(1)全塩基配列を化学的に合成してもよいし、(2)タン
パク質をコードする塩基配列のN末端側にシステインを
コードする塩基配列を配置し、さらにそのN末端側に本
発明のポリペプチドをコードする塩基配列を配置するこ
とにより該DNAを構築してもよい。また、(3)本発
明のポリペプチドのフラグメントを得るのが目的の場合
には、所望のフラグメントの直後のアミノ酸残基を部位
特異的突然変異誘発(site-directed mutagenesis)等
の手法でシステインに置換した該DNAを構築すればよ
い。上記の(1)の場合の製造法としては、例えば、公知
のホスホアミダイド法、リン酸トリエステル法、ジエス
テル法、ハイドロジェンホスホネート法などを用いて、
短いものなら一度に、長いものでは分割して合成した後
にT4 DNAリガーゼを用いて連結して作成すること
が可能である。
【0022】上記の(2)の場合の製造法としては、例え
ば、C末端側のタンパク質をコードするDNAは、染色
体から適当な制限酵素で切断し、ベクターに連結して得
るか、もしくはcDNAを取得する。しかる後にN末端
がシステインになるように制限酵素で切断するか、もし
くは、合成DNAを全タンパク質もしくはその一部のD
NAの5'末端に結合しN末端がシステインになるよう
に改変する。その5'末端に目的のタンパク質をコード
するDNA(化学合成したものでも、生体よりクローニ
ングしてきたものでもよい)をつなげる、などの手法が
用いられる。このようにして得られる融合タンパク質を
コードする遺伝子の具体例としては、例えば式 AGCCTGAACTTTGAAGAACTGAAAGATTGGGGTCCGAAAAATGTGATTAAAATGAGCACCCCGGCGGTGAAT AAAATGCCGCATAGCTTTGCGAATCTGCCGCTGCGTTTT-TGCまたはTGT-R (I) 〔式中、Rは CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT GGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC(配列番号:14;hbFGFムテインCS23の断 片)からなる塩基配列を示す。〕で表されるDNAなどがあげられる。
ば、C末端側のタンパク質をコードするDNAは、染色
体から適当な制限酵素で切断し、ベクターに連結して得
るか、もしくはcDNAを取得する。しかる後にN末端
がシステインになるように制限酵素で切断するか、もし
くは、合成DNAを全タンパク質もしくはその一部のD
NAの5'末端に結合しN末端がシステインになるよう
に改変する。その5'末端に目的のタンパク質をコード
するDNA(化学合成したものでも、生体よりクローニ
ングしてきたものでもよい)をつなげる、などの手法が
用いられる。このようにして得られる融合タンパク質を
コードする遺伝子の具体例としては、例えば式 AGCCTGAACTTTGAAGAACTGAAAGATTGGGGTCCGAAAAATGTGATTAAAATGAGCACCCCGGCGGTGAAT AAAATGCCGCATAGCTTTGCGAATCTGCCGCTGCGTTTT-TGCまたはTGT-R (I) 〔式中、Rは CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT GGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC(配列番号:14;hbFGFムテインCS23の断 片)からなる塩基配列を示す。〕で表されるDNAなどがあげられる。
【0023】上記式(I)は配列番号:7で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNA
の塩基配列にシステインをコードする塩基配列を介して
Rで示される塩基配列が結合していることを示す。5'
末端にATGを有し、その下流に該融合タンパク質をコ
ードする領域、ついで翻訳終止コドンを有するDNA
(プラスミド)は、化学合成で、あるいは遺伝子工学的
に製造された公知の該タンパク質のcDNA、もしく
は、染色体由来の該タンパク質のDNAを加工すること
により製造することができる。本発明のN末端にシステ
インを有するタンパク質またはポリペプチドのN末端に
本発明のポリペプチドを連結した融合タンパク質または
ポリペプチドをコードするDNAを、従来のDNA技
術、例えば部位特異的突然変異誘発技術を用いて目的の
ムテインをコードする遺伝子に変換することができる。
部位特異的突然変異誘発技術は周知であり、アール・エ
フ・レイサー(Lather, R. F.)及びジェイ・ピー・レ
コック(lecoq, J. P.)、ジェネティック・エンジニア
リング(Genetic Engineering)、アカデミックプレス
社(1983年)、第31−50頁に示されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス
(Smith, M.)及びエス・ギラム(Gillam, S.)、ジェ
ネティック・エンジニアリング:原理と方法、プレナム
プムス社(1981年)、3巻、1−32頁に示されて
いる。
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNA
の塩基配列にシステインをコードする塩基配列を介して
Rで示される塩基配列が結合していることを示す。5'
末端にATGを有し、その下流に該融合タンパク質をコ
ードする領域、ついで翻訳終止コドンを有するDNA
(プラスミド)は、化学合成で、あるいは遺伝子工学的
に製造された公知の該タンパク質のcDNA、もしく
は、染色体由来の該タンパク質のDNAを加工すること
により製造することができる。本発明のN末端にシステ
インを有するタンパク質またはポリペプチドのN末端に
本発明のポリペプチドを連結した融合タンパク質または
ポリペプチドをコードするDNAを、従来のDNA技
術、例えば部位特異的突然変異誘発技術を用いて目的の
ムテインをコードする遺伝子に変換することができる。
部位特異的突然変異誘発技術は周知であり、アール・エ
フ・レイサー(Lather, R. F.)及びジェイ・ピー・レ
コック(lecoq, J. P.)、ジェネティック・エンジニア
リング(Genetic Engineering)、アカデミックプレス
社(1983年)、第31−50頁に示されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス
(Smith, M.)及びエス・ギラム(Gillam, S.)、ジェ
ネティック・エンジニアリング:原理と方法、プレナム
プムス社(1981年)、3巻、1−32頁に示されて
いる。
【0024】本発明のN末端にシステインを有するタン
パク質またはポリペプチドのN末端に本発明のポリペプ
チドを連結した融合タンパク質またはポリペプチド(以
下、本発明の融合タンパク質と称する場合がある)をコ
ードする領域を有するDNAを含有するプラスミドを製
造するにあたって、ベクターとして用いられるプラスミ
ドとしては、例えば大腸菌(Escherichia coli)由来の
pBR322〔ジーン(Gene),2,95(1977)〕、
pBR313〔ジーン,2,75(1977)〕、pBR
324、pBR325〔ジーン,4,124(197
8)〕、pBR327、pBR328〔ジーン,9,2
87(1980)〕、pBR329〔ジーン,17,79
(1982)〕、pKY2289〔ジーン,3,1(19
78)〕、pKY2700〔生化学,52,770(19
80)〕、pACYC177、pACYC184〔ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacterio
logy),134,1141(1978)〕、pRK24
8、pRK646、pDF〔メソッズ・イン・エン ジ
ーモロジー(Methods in Enzymology),68,268(1
979)〕、pUC18、pUC19〔ヤニシューペロ
ンら,ジーン(Gene),33,103(1985)〕などが
あげられる。また、バクテリオファージ、例えばλファ
ージを使用したλgt系のλgt・λC〔Proc. Nat. A
cad. Sci. U.S.A.71,4579(1974)〕、λ
gt・λB〔Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72,
3461(1975)〕、λDam〔ジーン,1,255
(1977)〕やシャロンベクター〔サイエンス,(Scien
ce),196,161(1977);ジャーナル・オブ・
ビーロロジー(Journal of Virology),29,555(1
979)〕、繊維状ファージを使用したmp系のmp1
8、mp19〔ヤニシューペロンら,ジーン(Gene),3
3,103(1985)〕ベクターなどもあげられる。
パク質またはポリペプチドのN末端に本発明のポリペプ
チドを連結した融合タンパク質またはポリペプチド(以
下、本発明の融合タンパク質と称する場合がある)をコ
ードする領域を有するDNAを含有するプラスミドを製
造するにあたって、ベクターとして用いられるプラスミ
ドとしては、例えば大腸菌(Escherichia coli)由来の
pBR322〔ジーン(Gene),2,95(1977)〕、
pBR313〔ジーン,2,75(1977)〕、pBR
324、pBR325〔ジーン,4,124(197
8)〕、pBR327、pBR328〔ジーン,9,2
87(1980)〕、pBR329〔ジーン,17,79
(1982)〕、pKY2289〔ジーン,3,1(19
78)〕、pKY2700〔生化学,52,770(19
80)〕、pACYC177、pACYC184〔ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacterio
logy),134,1141(1978)〕、pRK24
8、pRK646、pDF〔メソッズ・イン・エン ジ
ーモロジー(Methods in Enzymology),68,268(1
979)〕、pUC18、pUC19〔ヤニシューペロ
ンら,ジーン(Gene),33,103(1985)〕などが
あげられる。また、バクテリオファージ、例えばλファ
ージを使用したλgt系のλgt・λC〔Proc. Nat. A
cad. Sci. U.S.A.71,4579(1974)〕、λ
gt・λB〔Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72,
3461(1975)〕、λDam〔ジーン,1,255
(1977)〕やシャロンベクター〔サイエンス,(Scien
ce),196,161(1977);ジャーナル・オブ・
ビーロロジー(Journal of Virology),29,555(1
979)〕、繊維状ファージを使用したmp系のmp1
8、mp19〔ヤニシューペロンら,ジーン(Gene),3
3,103(1985)〕ベクターなどもあげられる。
【0025】上記DNAは、ATGの上流にプロモータ
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌(Esch
erichia coli)ではtrpプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、
lppプロモーター、T7プロモーターなど、枯草菌
(Bacillus subtilis)ではSPO1プロモーター、S
PO2プロモーター、penPプロモーターなど、酵母
(Saccharomyces cerevisiae)ではPHO5プロモータ
ー、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH
プロモーターなど、動物細胞ではSV40由来のプロモ
ーターなどがあげられる。必要によりSD(シャイン−
ダルガーノ)配列をプロモーターの下流に挿入してもよ
い。T7プロモーターの系を用いる場合には、T7プロ
モーターとしては、T7DNA上で見い出されている1
7種のプロモーター〔J. L. Oakley ら,Proc.Natl. A
cad. Sci, U.S.A,74:4266−4270(19
77),M. D. Rosa, Cell 16:815−825(19
79),N. Panayotatos ら,Nature,280:35(1
979),J. J. Dunn ら,J. Mol. Biol.,166:4
77−535(1983)〕のいずれでもよいがφ10プ
ロモーター〔A. H. Rosenberg ら,Gene,56:125
−135(1987)〕が好ましい。
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌(Esch
erichia coli)ではtrpプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、
lppプロモーター、T7プロモーターなど、枯草菌
(Bacillus subtilis)ではSPO1プロモーター、S
PO2プロモーター、penPプロモーターなど、酵母
(Saccharomyces cerevisiae)ではPHO5プロモータ
ー、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH
プロモーターなど、動物細胞ではSV40由来のプロモ
ーターなどがあげられる。必要によりSD(シャイン−
ダルガーノ)配列をプロモーターの下流に挿入してもよ
い。T7プロモーターの系を用いる場合には、T7プロ
モーターとしては、T7DNA上で見い出されている1
7種のプロモーター〔J. L. Oakley ら,Proc.Natl. A
cad. Sci, U.S.A,74:4266−4270(19
77),M. D. Rosa, Cell 16:815−825(19
79),N. Panayotatos ら,Nature,280:35(1
979),J. J. Dunn ら,J. Mol. Biol.,166:4
77−535(1983)〕のいずれでもよいがφ10プ
ロモーター〔A. H. Rosenberg ら,Gene,56:125
−135(1987)〕が好ましい。
【0026】転写ターミネーターとしては、大腸菌の系
で作動するターミネーター、好ましくはTφターミネー
ター〔F. W. Studier ら,J. Mol. Biol.,189:1
13−130(1986)〕が用いられる。T7 RNA
ポリメラーゼ遺伝子としてはT7遺伝子〔F. W. Studie
r ら,J.Mol. Biol.,189:113−130(198
6)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベクター
にT7プロモーター,T7ターミネーターを組み込んで
構築されるのが好ましく、このようなベクターとして
は、pET−1、pET−2、pET−3、pET−
4、pET−5〔A. H. Rosenberg, Gene 56:125
−135(1987)〕、pTB960−2〔EP−A−
499990〕などをあげることができるが、好ましく
はpTB960−2が用いられる。
で作動するターミネーター、好ましくはTφターミネー
ター〔F. W. Studier ら,J. Mol. Biol.,189:1
13−130(1986)〕が用いられる。T7 RNA
ポリメラーゼ遺伝子としてはT7遺伝子〔F. W. Studie
r ら,J.Mol. Biol.,189:113−130(198
6)〕をあげることが出来る。ベクターは上記ベクター
にT7プロモーター,T7ターミネーターを組み込んで
構築されるのが好ましく、このようなベクターとして
は、pET−1、pET−2、pET−3、pET−
4、pET−5〔A. H. Rosenberg, Gene 56:125
−135(1987)〕、pTB960−2〔EP−A−
499990〕などをあげることができるが、好ましく
はpTB960−2が用いられる。
【0027】本発明の形質転換体は、上記方法で得られ
る発現用プラスミドを公知の方法〔例、コーエンS, N,
ら,プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.
A.),69,2110(1972)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、例えば、エシェリヒア(Escheric
hia)属菌,バチルス(Bacillus)属菌,酵母,動物細
胞などがあげられる。上記エシェリヒア属菌の例として
は、エシェリヒア・コリ(E. coli)があげられ、具体
的にはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12
DH1〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.),60,160(1968)〕、JM−103
〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids
Research),9,309(1981)〕、JA221〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal
of Molecular Biology),120,517(197
8)〕、HB101〔ジャーナル・オ ブ・モレ キュラ
ー・バイオロジー,41,459(1969)〕、C60
0〔ジェネティックス(Genetics),39,440(19
54)〕、N4830〔セル(Cell),25,713(19
81)〕、K−12 MM294〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ,
73,4174(1976)〕、BL−21などがあげら
れる。
る発現用プラスミドを公知の方法〔例、コーエンS, N,
ら,プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.
A.),69,2110(1972)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、例えば、エシェリヒア(Escheric
hia)属菌,バチルス(Bacillus)属菌,酵母,動物細
胞などがあげられる。上記エシェリヒア属菌の例として
は、エシェリヒア・コリ(E. coli)があげられ、具体
的にはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12
DH1〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.),60,160(1968)〕、JM−103
〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids
Research),9,309(1981)〕、JA221〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal
of Molecular Biology),120,517(197
8)〕、HB101〔ジャーナル・オ ブ・モレ キュラ
ー・バイオロジー,41,459(1969)〕、C60
0〔ジェネティックス(Genetics),39,440(19
54)〕、N4830〔セル(Cell),25,713(19
81)〕、K−12 MM294〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ,
73,4174(1976)〕、BL−21などがあげら
れる。
【0028】上記バチルス属菌としては、例えばバチル
ス・サチルス(Bacillus subtilis)があげられ、具体
的にはバチルス・サチルスMI114(ジーン,24,
255(1983))、207−21〔ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),
95,87(1984)〕などがあげられる。上記酵母と
しては、例えばサッカロマイセス・セレビシェ(Saccha
romyces cerevisiae)があげられ、具体的には、サッカ
ロマイセス・セレビシェAH22〔Proc. Natl. Acid.
Sci. USA,75,1929(1978)〕、XSB5
2−23C〔Proc. Natl. Acid. Sci. USA,77
2173(1980)〕、BH−641A(ATCC 2
8339)、20B−12〔Genetics,85,23(1
976)〕、GM3C−2〔Proc. Natl. Acid. Sci. U
SA,78 2258(1981)〕などがあげられる。
ス・サチルス(Bacillus subtilis)があげられ、具体
的にはバチルス・サチルスMI114(ジーン,24,
255(1983))、207−21〔ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),
95,87(1984)〕などがあげられる。上記酵母と
しては、例えばサッカロマイセス・セレビシェ(Saccha
romyces cerevisiae)があげられ、具体的には、サッカ
ロマイセス・セレビシェAH22〔Proc. Natl. Acid.
Sci. USA,75,1929(1978)〕、XSB5
2−23C〔Proc. Natl. Acid. Sci. USA,77
2173(1980)〕、BH−641A(ATCC 2
8339)、20B−12〔Genetics,85,23(1
976)〕、GM3C−2〔Proc. Natl. Acid. Sci. U
SA,78 2258(1981)〕などがあげられる。
【0029】動物細胞としては、例えばサル細胞COS
−7〔セル(Cell),23,175(1981)〕、Ver
o〔(日本臨床 21,1209(1963))、チャイニ
ーズハムスター細胞CHO〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン(J. Exp. Med.),108,9
45(1985)〕、マウスL細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.),4,165(1943)〕、ヒトFL細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォ
ー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシン(Proc.Sco. Etp. Biol. Med.),94,532(1
957)〕、ハムスターC細胞などがあげられる。
−7〔セル(Cell),23,175(1981)〕、Ver
o〔(日本臨床 21,1209(1963))、チャイニ
ーズハムスター細胞CHO〔ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン(J. Exp. Med.),108,9
45(1985)〕、マウスL細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.),4,165(1943)〕、ヒトFL細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォ
ー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィシン(Proc.Sco. Etp. Biol. Med.),94,532(1
957)〕、ハムスターC細胞などがあげられる。
【0030】T7プロモーターの系を用いる場合には、
その形質転換体の宿主としては、T7 RNAポリメラ
ーゼ遺伝子(T7遺伝子1)〔F. W. Studierら,J. Mo
l. Biol. 189:113−130(1986)〕を組み
込んだ大腸菌株、例えばMM294、DH−1、C60
0、JM109、BL21あるいはT7 RNAポリメ
ラーゼ遺伝子(T7遺伝子1)を他のプラスミドと共に
組込んだ大腸菌株などならいずれでもよい。好ましくは
T7遺伝子1を組み込んだλファージが溶原化したMM
294株およびBL21株が用いられる。この場合T7
遺伝子1のプロモーターとしては、イソプロピル−1−
チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTGと略する
ことがある。)で発現が誘導されるlacプロモーター
が用いられる。
その形質転換体の宿主としては、T7 RNAポリメラ
ーゼ遺伝子(T7遺伝子1)〔F. W. Studierら,J. Mo
l. Biol. 189:113−130(1986)〕を組み
込んだ大腸菌株、例えばMM294、DH−1、C60
0、JM109、BL21あるいはT7 RNAポリメ
ラーゼ遺伝子(T7遺伝子1)を他のプラスミドと共に
組込んだ大腸菌株などならいずれでもよい。好ましくは
T7遺伝子1を組み込んだλファージが溶原化したMM
294株およびBL21株が用いられる。この場合T7
遺伝子1のプロモーターとしては、イソプロピル−1−
チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTGと略する
ことがある。)で発現が誘導されるlacプロモーター
が用いられる。
【0031】バチルス属菌を宿主として形質転換するに
は、例えばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス(Molecular and General Genetics), 168,
111(1979)など公知の方法に従って行なうことができ
る。酵母を宿主として形質転換するには、例えばProc.
Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929(1978)などの公知の
方法に従って行なうことができる。動物細胞を宿主とし
て形質転換するには、例えばヴィーロロジー(Virolog
y), 52, 456(1973)などの公知の方法に従って行なう
ことができる。本発明の融合タンパク質は、上述の形質
転換体を培地に培養し、産生された本発明の融合タンパ
ク質を採取することにより製造することができる。培地
のpHは約6〜8が望ましい。
は、例えばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス(Molecular and General Genetics), 168,
111(1979)など公知の方法に従って行なうことができ
る。酵母を宿主として形質転換するには、例えばProc.
Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929(1978)などの公知の
方法に従って行なうことができる。動物細胞を宿主とし
て形質転換するには、例えばヴィーロロジー(Virolog
y), 52, 456(1973)などの公知の方法に従って行なう
ことができる。本発明の融合タンパク質は、上述の形質
転換体を培地に培養し、産生された本発明の融合タンパ
ク質を採取することにより製造することができる。培地
のpHは約6〜8が望ましい。
【0032】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972〕〕が好ましい。
ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば3β−インドリルアクリル酸やイソプロピル
β−D−チオガラクトピラノシドのような薬剤を加える
ことができる。
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972〕〕が好ましい。
ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、例えば3β−インドリルアクリル酸やイソプロピル
β−D−チオガラクトピラノシドのような薬剤を加える
ことができる。
【0033】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bost
ian, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. S
ci.) USA,77, 4505(1980)〕があげられる。培地のpH
は約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20
℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加える。
常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
例えばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bost
ian, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. S
ci.) USA,77, 4505(1980)〕があげられる。培地のpH
は約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20
℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加える。
【0034】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際の培地としては、例えば約0.2〜20%好ましく
は約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエ
ンス(Science),122, 501(1952)〕、DME培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕、RPMI 16
40培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association),199, 519(1967)〕、199培
地〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of t
he Society for the Biologcal Medicine),73, 1 (195
0)〕などがあげられる。pHは約6〜8であるのが好ま
しい。培養は通常約30〜40℃、培養時間は約15〜
60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
る際の培地としては、例えば約0.2〜20%好ましく
は約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエ
ンス(Science),122, 501(1952)〕、DME培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕、RPMI 16
40培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association),199, 519(1967)〕、199培
地〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of t
he Society for the Biologcal Medicine),73, 1 (195
0)〕などがあげられる。pHは約6〜8であるのが好ま
しい。培養は通常約30〜40℃、培養時間は約15〜
60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【0035】本発明の融合タンパク質は、上記形質転換
体を培養し、培養物中に該融合タンパク質を生成,蓄積
せしめ、これを採取することにより製造することができ
る。培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含
むM9培地〔ミラー,J.,エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネテイクス(Experiments in Molecula
r Genetics),431−433(Cold Spring Horbor Lab
oratort,New York1972)〕、2×YT培地〔メシン
グ,メソッド・イン・エンザイモロジー(Methods in En
zymology),101,20(1983)〕、LB培地など
があげられる。
体を培養し、培養物中に該融合タンパク質を生成,蓄積
せしめ、これを採取することにより製造することができ
る。培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含
むM9培地〔ミラー,J.,エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネテイクス(Experiments in Molecula
r Genetics),431−433(Cold Spring Horbor Lab
oratort,New York1972)〕、2×YT培地〔メシン
グ,メソッド・イン・エンザイモロジー(Methods in En
zymology),101,20(1983)〕、LB培地など
があげられる。
【0036】培養は通常約15〜43℃で約3〜24時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λc
Itsリプレッサーと、λPLプロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約15〜36℃、好ましくは約30℃〜36℃の
温度で行い、λcItsリプレッサーの不活化は約37
℃〜42℃で行うのが好ましい。またrecAプロモー
ターをより効率良く働かせるため、すなわちrecA遺
伝子発現抑制機能を低下せしめるため、必要によりマイ
トマイシンC,ナルジキシン酸などのような薬剤を添加
したり、紫外線を照射する、あるいは培養液のpHをア
ルカリ側に変化させてもよい。T7プロモーターの系を
用いている場合には、(1)lacプロモーターの下流に
連結されているT7遺伝子(RNAポリメラーゼ遺伝
子)を発現させる時はIPTGなどを添加する、もしく
は(2)λPLプロモーターの下流に連結されているT7
遺伝子(RNAポリメラーゼ遺伝子)を発現させる時は
培養の温度を上昇させることなどにより、生成するT7
ファージRNAポリメラーゼ1により特異的にT7プロ
モーターを作動させる。
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λc
Itsリプレッサーと、λPLプロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約15〜36℃、好ましくは約30℃〜36℃の
温度で行い、λcItsリプレッサーの不活化は約37
℃〜42℃で行うのが好ましい。またrecAプロモー
ターをより効率良く働かせるため、すなわちrecA遺
伝子発現抑制機能を低下せしめるため、必要によりマイ
トマイシンC,ナルジキシン酸などのような薬剤を添加
したり、紫外線を照射する、あるいは培養液のpHをア
ルカリ側に変化させてもよい。T7プロモーターの系を
用いている場合には、(1)lacプロモーターの下流に
連結されているT7遺伝子(RNAポリメラーゼ遺伝
子)を発現させる時はIPTGなどを添加する、もしく
は(2)λPLプロモーターの下流に連結されているT7
遺伝子(RNAポリメラーゼ遺伝子)を発現させる時は
培養の温度を上昇させることなどにより、生成するT7
ファージRNAポリメラーゼ1により特異的にT7プロ
モーターを作動させる。
【0037】培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば
緩衝液に懸濁したのち、例えば、タンパク質変性剤処
理,超音波処理やリゾチームなどの酵素処理,グラスビ
ーズ処理,フレンチプレス処理,凍結融解処理などを行
って菌体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上
清を得る。上記により得られた上清から、本発明の融合
タンパク質を単離するには、通常知られているタンパク
質の精製法に従えばよい。例えば、ゲル濾過法,イオン
交換クロマトグラフィー,吸着クロマトグラフィー,高
速液体クロマトグラフィー,アフイニティークロマトグ
ラフィー,疎水クロマトグラフィー,電気泳動等を適切
に組合せて行うことができる。本発明のポリペプチドの
N末端がイソロイシン残基、バリン残基、システイン残
基、スレオニン残基、アスパラギン酸残基、リジン残
基、ロイシン残基、アルギニン残基、アスパラギン残
基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、チロシン
残基、トリプトファン残基、グルタミン酸残基、グルタ
ミン残基またはヒスチジン残基である場合(例えば、配
列番号:3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドまたは配列番号:11で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチドなどである場合)には、こ
のようにして得られる本発明の融合タンパク質のN末端
には、翻訳開始コドンに由来するメチオニンが付加して
いる場合がある。また、該融合タンパク質は、精製する
ことなく、あるいは部分精製の状態で、次の反応工程に
進んでもよい。次に、このようにして得られる本発明の
融合タンパク質をシステイン残基のアミノ基側のペプチ
ド結合の切断反応に付す。該切断反応としては、例え
ば、S−シアノ化反応次いで加水分解反応があげられ
る。本発明のポリペプチドのアミドまたはその塩を最終
物として得る場合には、該切断反応としては、例えば、
S−シアノ化反応次いでアンモノリシスを行うことがあ
げられる。該S−シアノ化反応は、原料化合物に、S−
シアノ化試薬を作用させることにより行なう。
緩衝液に懸濁したのち、例えば、タンパク質変性剤処
理,超音波処理やリゾチームなどの酵素処理,グラスビ
ーズ処理,フレンチプレス処理,凍結融解処理などを行
って菌体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上
清を得る。上記により得られた上清から、本発明の融合
タンパク質を単離するには、通常知られているタンパク
質の精製法に従えばよい。例えば、ゲル濾過法,イオン
交換クロマトグラフィー,吸着クロマトグラフィー,高
速液体クロマトグラフィー,アフイニティークロマトグ
ラフィー,疎水クロマトグラフィー,電気泳動等を適切
に組合せて行うことができる。本発明のポリペプチドの
N末端がイソロイシン残基、バリン残基、システイン残
基、スレオニン残基、アスパラギン酸残基、リジン残
基、ロイシン残基、アルギニン残基、アスパラギン残
基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、チロシン
残基、トリプトファン残基、グルタミン酸残基、グルタ
ミン残基またはヒスチジン残基である場合(例えば、配
列番号:3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドまたは配列番号:11で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチドなどである場合)には、こ
のようにして得られる本発明の融合タンパク質のN末端
には、翻訳開始コドンに由来するメチオニンが付加して
いる場合がある。また、該融合タンパク質は、精製する
ことなく、あるいは部分精製の状態で、次の反応工程に
進んでもよい。次に、このようにして得られる本発明の
融合タンパク質をシステイン残基のアミノ基側のペプチ
ド結合の切断反応に付す。該切断反応としては、例え
ば、S−シアノ化反応次いで加水分解反応があげられ
る。本発明のポリペプチドのアミドまたはその塩を最終
物として得る場合には、該切断反応としては、例えば、
S−シアノ化反応次いでアンモノリシスを行うことがあ
げられる。該S−シアノ化反応は、原料化合物に、S−
シアノ化試薬を作用させることにより行なう。
【0038】S−シアノ化試薬としては例えば2−ニト
ロ−5−チオシアノ安息香酸(NTCB)、1−シアノ
−4−ジメチルアミノピリジウム塩(DMAP−C
N)、CN-イオンなどがあげられる。該S−シアノ化
試薬の量は、全チオール基の約2倍から50倍量であれ
ばよい。より好ましくは約5倍〜10倍量であればよ
い。反応温度は約0℃〜80℃の間であれば、いずれで
もよく、約0℃〜50℃の間がより好ましい。用いる溶
媒としては、S−シアノ化試薬と反応しないものであれ
ばいずれの緩衝液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩
衝液、トリス−酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液などがあげられる。また、有機溶媒は、S−シアノ化
試薬と反応しないものであれば、存在していてもよい。
該反応は、pH1〜12の間で行なうのが良い。特に、
NTCBを用いる場合にはpH7〜10、DMAP−C
Nを用いる場合にはS−S交換反応を防止するため、p
H2〜7の間が好ましい。また、反応液中には、塩酸グ
アニジン等の変性剤が存在していてもよい。
ロ−5−チオシアノ安息香酸(NTCB)、1−シアノ
−4−ジメチルアミノピリジウム塩(DMAP−C
N)、CN-イオンなどがあげられる。該S−シアノ化
試薬の量は、全チオール基の約2倍から50倍量であれ
ばよい。より好ましくは約5倍〜10倍量であればよ
い。反応温度は約0℃〜80℃の間であれば、いずれで
もよく、約0℃〜50℃の間がより好ましい。用いる溶
媒としては、S−シアノ化試薬と反応しないものであれ
ばいずれの緩衝液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩
衝液、トリス−酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液などがあげられる。また、有機溶媒は、S−シアノ化
試薬と反応しないものであれば、存在していてもよい。
該反応は、pH1〜12の間で行なうのが良い。特に、
NTCBを用いる場合にはpH7〜10、DMAP−C
Nを用いる場合にはS−S交換反応を防止するため、p
H2〜7の間が好ましい。また、反応液中には、塩酸グ
アニジン等の変性剤が存在していてもよい。
【0039】上記加水分解反応としては、例えばアルカ
リ処理に付すことがあげられる。該アルカリ処理として
は、原料化合物を含有する水溶液のpHを7〜14に調
整することにより行なわれる。該pHの調整は、例えば
アンモニア、水酸化ナトリウム、アミノ化合物、トリツ
マベース(トリス〔ヒドロキシメチル〕−アミノメタ
ン)、リン酸第2ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化
バリウム等の溶液を原料化合物を含有する水溶液に適当
量加えて行うが、特にアンモニアなどが好ましい。上記
反応の際の溶液の濃度としては、例えばアンモニアまた
はアミノ化合物の場合は約0.01〜15N、好ましく
は約0.1〜5N、水酸化ナトリウムの場合は約0.01
〜2N、好ましくは0.05〜1N、トリツマベースの
場合は約1mM〜1M、好ましくは約20mM〜200m
M、リン酸第2ナトリウムの場合は約1mM〜1M、好
ましくは約10mM〜100mM、水酸化カリウムの場合
は約0.01〜4N、好ましくは約0.1〜2N、水酸化
カリウムの場合は約0.01〜0.2 M、好ましくは約
0.1〜0.2Mがあげられる。反応温度は約−20℃〜
80℃の間であればいずれでもよく、約−10℃〜50
℃の間がより好ましい。
リ処理に付すことがあげられる。該アルカリ処理として
は、原料化合物を含有する水溶液のpHを7〜14に調
整することにより行なわれる。該pHの調整は、例えば
アンモニア、水酸化ナトリウム、アミノ化合物、トリツ
マベース(トリス〔ヒドロキシメチル〕−アミノメタ
ン)、リン酸第2ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化
バリウム等の溶液を原料化合物を含有する水溶液に適当
量加えて行うが、特にアンモニアなどが好ましい。上記
反応の際の溶液の濃度としては、例えばアンモニアまた
はアミノ化合物の場合は約0.01〜15N、好ましく
は約0.1〜5N、水酸化ナトリウムの場合は約0.01
〜2N、好ましくは0.05〜1N、トリツマベースの
場合は約1mM〜1M、好ましくは約20mM〜200m
M、リン酸第2ナトリウムの場合は約1mM〜1M、好
ましくは約10mM〜100mM、水酸化カリウムの場合
は約0.01〜4N、好ましくは約0.1〜2N、水酸化
カリウムの場合は約0.01〜0.2 M、好ましくは約
0.1〜0.2Mがあげられる。反応温度は約−20℃〜
80℃の間であればいずれでもよく、約−10℃〜50
℃の間がより好ましい。
【0040】反応時間は、好ましくは、S−シアノ化反
応は約1〜60分、好ましくは約15〜30分が、アン
モノリシスは約5分〜24時間、好ましくは約10〜1
80分が、加水分解反応は約5分〜100時間、好まし
くは10分〜15時間があげられる。上記のS−シアノ
化または加水分解により、〔図1〕に示される反応が起
こると考えられる。〔図1〕において、XはR1−(NR
2)−(式中、R1およびR2は同一または異なって、(i)
水素、(ii)C1-20アルキル,C3-8シクロアルキル,C
6-14アリール(aryl)またはC6-14アリール−C1-3ア
ルキル(これらは置換基を有していないかあるいは1〜
3個のアミノ基,水酸基などを炭素原子上に有していて
もよい)、(iii)置換されていてもよいアミノ、(iv)水酸
基またはC1-6アルコキシ基を示す。)またはOHを示
す。上記C1-20アルキルの例としては、例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec
−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、1
−エチルペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチ
ル、オクチル、ノナニル、デカニル、ウンデカニル、ド
デカニル、テトラデカニル、ペンタデカニル、ヘキサデ
カニル、ヘプタデカニル、オクタデカニル、ノナデカニ
ルおよびエイコサニルなどがあげられる。上記C3-8シ
クロアルキルの例としては、例えば、シクロプロピル、
シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチルなどがあげられる。上記C
6-14アリールの例としては、フェニル、ナフチル、アン
スリル、フェナンスリル、アセナフチレニルなどがあげ
られる。上記C6-14アリール−C1-3アルキルの例とし
ては、例えばベンジル、フェネチル、3−フェニルプロ
ピル、(1−ナフチル)メチル、(2−ナフチル)メチ
ルなどがあげられる。上記C1-6アルコキシの例として
は、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキ
シ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどがあげられ
る。
応は約1〜60分、好ましくは約15〜30分が、アン
モノリシスは約5分〜24時間、好ましくは約10〜1
80分が、加水分解反応は約5分〜100時間、好まし
くは10分〜15時間があげられる。上記のS−シアノ
化または加水分解により、〔図1〕に示される反応が起
こると考えられる。〔図1〕において、XはR1−(NR
2)−(式中、R1およびR2は同一または異なって、(i)
水素、(ii)C1-20アルキル,C3-8シクロアルキル,C
6-14アリール(aryl)またはC6-14アリール−C1-3ア
ルキル(これらは置換基を有していないかあるいは1〜
3個のアミノ基,水酸基などを炭素原子上に有していて
もよい)、(iii)置換されていてもよいアミノ、(iv)水酸
基またはC1-6アルコキシ基を示す。)またはOHを示
す。上記C1-20アルキルの例としては、例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec
−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、1
−エチルペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチ
ル、オクチル、ノナニル、デカニル、ウンデカニル、ド
デカニル、テトラデカニル、ペンタデカニル、ヘキサデ
カニル、ヘプタデカニル、オクタデカニル、ノナデカニ
ルおよびエイコサニルなどがあげられる。上記C3-8シ
クロアルキルの例としては、例えば、シクロプロピル、
シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチルなどがあげられる。上記C
6-14アリールの例としては、フェニル、ナフチル、アン
スリル、フェナンスリル、アセナフチレニルなどがあげ
られる。上記C6-14アリール−C1-3アルキルの例とし
ては、例えばベンジル、フェネチル、3−フェニルプロ
ピル、(1−ナフチル)メチル、(2−ナフチル)メチ
ルなどがあげられる。上記C1-6アルコキシの例として
は、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキ
シ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどがあげられ
る。
【0041】上記(iii)の置換されていてもよいアミノ
の置換基の例としては、例えばアミノ酸,2〜10個の
アミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。上記アミ
ノ酸としては、L体でもD体でもよく、その例として
は、例えば、Ala、Arg、Asp、Asn、Gl
u、Gln、Gly、His、Ile、Met、Le
u、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Ty
r、Valなどがあげられる。該反応において、アンモ
ニアまたはアミノ化合物を用いた場合には、対応するア
ミド体が得られる。
の置換基の例としては、例えばアミノ酸,2〜10個の
アミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。上記アミ
ノ酸としては、L体でもD体でもよく、その例として
は、例えば、Ala、Arg、Asp、Asn、Gl
u、Gln、Gly、His、Ile、Met、Le
u、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Ty
r、Valなどがあげられる。該反応において、アンモ
ニアまたはアミノ化合物を用いた場合には、対応するア
ミド体が得られる。
【0042】切り出された本発明のポリペプチドを単離
するには、通常知られているペプチドの精製法に従えば
よい。例えば、ゲル濾過法,イオン交換クロマトグラフ
ィー,高速液体クロマトグラフィー,アフィニティーク
ロマトグラフィー,疎水クロマトグラフィー,薄層クロ
マトグラフィー,電気泳動等を適宜組み合せて行うこと
ができる。上述のとおり、得られる本発明のポリペプチ
ドのN末端には翻訳開始コドンに由来するメチオニンが
付加している場合があるが、下記に詳述される方法に準
じて、例えば、グリオキシル酸などのα−ジケトン類を
反応(好ましくは、硫酸銅などの遷移金属イオンとピリ
ジンなどの塩基の存在下に反応)させた後、o−フェニ
レンジアミンなどのジアミン類を用いて加水分解するこ
とによりN末端のメチオニンを除去することも可能であ
る。
するには、通常知られているペプチドの精製法に従えば
よい。例えば、ゲル濾過法,イオン交換クロマトグラフ
ィー,高速液体クロマトグラフィー,アフィニティーク
ロマトグラフィー,疎水クロマトグラフィー,薄層クロ
マトグラフィー,電気泳動等を適宜組み合せて行うこと
ができる。上述のとおり、得られる本発明のポリペプチ
ドのN末端には翻訳開始コドンに由来するメチオニンが
付加している場合があるが、下記に詳述される方法に準
じて、例えば、グリオキシル酸などのα−ジケトン類を
反応(好ましくは、硫酸銅などの遷移金属イオンとピリ
ジンなどの塩基の存在下に反応)させた後、o−フェニ
レンジアミンなどのジアミン類を用いて加水分解するこ
とによりN末端のメチオニンを除去することも可能であ
る。
【0043】〔本発明のポリペプチドのN末端のメチオ
ニンの除去方法〕本明細書において、酸化されていても
よいメチオニン残基は、メチオニン残基またはそのS酸
化体を示し、メチオニン残基のS酸化体としては、スル
ホキシドおよびスルホン体が挙げられる。N末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有する本発明のポリ
ペプチドとしては、 式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-X [式中、mは0ないし2の整数を示し、Xは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。]で表されるポリペプ
チドが挙げられ、これらは塩を形成してもよく、塩とし
ては、上記した本発明のポリペプチドの塩と同様のもの
が挙げられる。N末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基を有する本発明のポリペプチドまたはその塩は、
遺伝子工学的に製造されたN末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドまたは
その塩であることが好ましい。
ニンの除去方法〕本明細書において、酸化されていても
よいメチオニン残基は、メチオニン残基またはそのS酸
化体を示し、メチオニン残基のS酸化体としては、スル
ホキシドおよびスルホン体が挙げられる。N末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有する本発明のポリ
ペプチドとしては、 式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-X [式中、mは0ないし2の整数を示し、Xは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。]で表されるポリペプ
チドが挙げられ、これらは塩を形成してもよく、塩とし
ては、上記した本発明のポリペプチドの塩と同様のもの
が挙げられる。N末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基を有する本発明のポリペプチドまたはその塩は、
遺伝子工学的に製造されたN末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドまたは
その塩であることが好ましい。
【0044】上記式中、mとしては0が好ましい。ま
た、Xで示される本発明のポリペプチドのペプチド鎖と
しては上記した本発明のポリペプチドが挙げられる。上
記の本発明のポリペプチドまたはその塩は、N末端の酸
化されていてもよいメチオニン(Met)残基または該
メチオニン残基のジケトン体の除去工程に付す前あるい
は後にリフォールディング(活性化、再生化)を行うこ
とができる。
た、Xで示される本発明のポリペプチドのペプチド鎖と
しては上記した本発明のポリペプチドが挙げられる。上
記の本発明のポリペプチドまたはその塩は、N末端の酸
化されていてもよいメチオニン(Met)残基または該
メチオニン残基のジケトン体の除去工程に付す前あるい
は後にリフォールディング(活性化、再生化)を行うこ
とができる。
【0045】本明細書において、N末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有する本発明の
ポリペプチドまたはその塩とは、 式CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X [式中、mは0ないし2の整数を示し、Xは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。]で表される化合物ま
たはその塩を示す。N末端に酸化されていてもよいメチ
オニン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩は、化学反応または酵素反応等各種反応に
より得ることができる。例えば、N末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基を有する本発明のポリペプチド
またはその塩をα−ジケトン類と反応させるアミノ基転
移反応により、N末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチドまた
はその塩を得ることができる。本明細書において、α−
ジケトン類は、上記した本発明のポリペプチドまたはそ
の塩のアミノ基転移反応を進行させうるものであれば何
れでもよく、例えば式R1−CO−CO−R2[式中、R
1は水素またはカルボキシル基で置換されていてもよい
低級アルキルもしくはフェニル基(好ましくは水素また
はメチル、さらに好ましくは水素)を示し、R2は水酸
基、低級アルコキシ基または低級アルキルで置換されて
いてもよいアミノ基(好ましくは水酸基)を示す。]で
表される化合物またはその塩などが挙げられる。上記式
中、R1で示される低級アルキル基としては、メチル、
エチル、プロピル、i−プロピル、ブチル、i−ブチ
ル、sec−ブチル、t−ブチルなどの炭素数1ないし
6程度のアルキル基などが挙げられ、R2で示される低
級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポ
キシ、i−プロポキシ、ブトキシ、i−ブトキシ、se
c−ブトキシ、t−ブトキシなどの炭素数1ないし6程
度のアルコキシ基などが挙げられる。また、R2で示さ
れる低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基とし
ては、前記したR1で示される低級アルキル基を1ない
し2個有していてもよいアミノ基などが挙げられる。さ
らに、塩としては、上記したN末端に酸化されていても
よいメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドの塩
と同様なものが挙げられる。α−ジケトン類の具体例と
しては、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、
フェニルグリオキシル酸、2−オキソグルタル酸などが
挙げられるが、なかでも、グリオキシル酸が好ましく用
いられる。α−ジケトン類は塩を形成していてもよく、
ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、塩酸
塩などの無機酸の塩などがあげられる。
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有する本発明の
ポリペプチドまたはその塩とは、 式CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X [式中、mは0ないし2の整数を示し、Xは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。]で表される化合物ま
たはその塩を示す。N末端に酸化されていてもよいメチ
オニン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩は、化学反応または酵素反応等各種反応に
より得ることができる。例えば、N末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基を有する本発明のポリペプチド
またはその塩をα−ジケトン類と反応させるアミノ基転
移反応により、N末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチドまた
はその塩を得ることができる。本明細書において、α−
ジケトン類は、上記した本発明のポリペプチドまたはそ
の塩のアミノ基転移反応を進行させうるものであれば何
れでもよく、例えば式R1−CO−CO−R2[式中、R
1は水素またはカルボキシル基で置換されていてもよい
低級アルキルもしくはフェニル基(好ましくは水素また
はメチル、さらに好ましくは水素)を示し、R2は水酸
基、低級アルコキシ基または低級アルキルで置換されて
いてもよいアミノ基(好ましくは水酸基)を示す。]で
表される化合物またはその塩などが挙げられる。上記式
中、R1で示される低級アルキル基としては、メチル、
エチル、プロピル、i−プロピル、ブチル、i−ブチ
ル、sec−ブチル、t−ブチルなどの炭素数1ないし
6程度のアルキル基などが挙げられ、R2で示される低
級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポ
キシ、i−プロポキシ、ブトキシ、i−ブトキシ、se
c−ブトキシ、t−ブトキシなどの炭素数1ないし6程
度のアルコキシ基などが挙げられる。また、R2で示さ
れる低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基とし
ては、前記したR1で示される低級アルキル基を1ない
し2個有していてもよいアミノ基などが挙げられる。さ
らに、塩としては、上記したN末端に酸化されていても
よいメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドの塩
と同様なものが挙げられる。α−ジケトン類の具体例と
しては、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、
フェニルグリオキシル酸、2−オキソグルタル酸などが
挙げられるが、なかでも、グリオキシル酸が好ましく用
いられる。α−ジケトン類は塩を形成していてもよく、
ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、塩酸
塩などの無機酸の塩などがあげられる。
【0046】N末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有する本発明のポリペプチドまたはその塩とα−
ジケトン類とのアミノ基転移反応は、通常、本発明のポ
リペプチドまたはその塩1モルに対して、1ないし1万
モル(好ましくは2000ないし4000モル)程度の
α−ジケトン類を、約0ないし70℃(好ましくは約2
0ないし40℃)で約10分ないし5時間(好ましくは
約20分ないし2時間)反応させるのが好ましい。上記
したアミノ基転移反応を阻害しないものであれば何れの
緩衝液(例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液など)を用いてもよいが、なかでも、酢酸緩衝液が好
ましく用いられる。また、反応のpHは、約2ないし
9、なかでも、約4ないし7、とりわけ、約5ないし6
に調整して反応を進行させるのがよい。該アミノ基転移
反応を促進するため、遷移金属イオンの存在下にα−ジ
ケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケ
トン類1モルに対して、0.001ないし0.1モル(好
ましくは0.01ないし0.05モル)程度の遷移金属イ
オンを用いるのが好ましい。遷移金属イオンとしては、
例えば、銅イオン(Cu+,Cu2+)、コバルトイオン
(Co2+,Co3+)、ニッケルイオン(Ni2+,N
i3+)、鉄イオン(Fe2+,Fe3+)、亜鉛イオン(Z
n2+)、アルミニウムイオン(Al3+)、マンガンイオ
ン(Mn2+など)、ガリウムイオン(Ga3+)、インジ
ウムイオン(In3+)、マグネシウムイオン(M
g2+)、カルシウムイオン(Ca2+)などを用いること
ができるが、なかでも、銅イオン、コバルトイオンな
ど、とりわけ、銅イオン(Cu2+)が好ましく用いられ
る。これらの遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩
酸、過塩素酸などの無機酸との塩または酢酸、シュウ
酸、クエン酸、炭酸などの有機酸との塩として、反応溶
媒に添加することができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、
とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられる。
残基を有する本発明のポリペプチドまたはその塩とα−
ジケトン類とのアミノ基転移反応は、通常、本発明のポ
リペプチドまたはその塩1モルに対して、1ないし1万
モル(好ましくは2000ないし4000モル)程度の
α−ジケトン類を、約0ないし70℃(好ましくは約2
0ないし40℃)で約10分ないし5時間(好ましくは
約20分ないし2時間)反応させるのが好ましい。上記
したアミノ基転移反応を阻害しないものであれば何れの
緩衝液(例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液など)を用いてもよいが、なかでも、酢酸緩衝液が好
ましく用いられる。また、反応のpHは、約2ないし
9、なかでも、約4ないし7、とりわけ、約5ないし6
に調整して反応を進行させるのがよい。該アミノ基転移
反応を促進するため、遷移金属イオンの存在下にα−ジ
ケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケ
トン類1モルに対して、0.001ないし0.1モル(好
ましくは0.01ないし0.05モル)程度の遷移金属イ
オンを用いるのが好ましい。遷移金属イオンとしては、
例えば、銅イオン(Cu+,Cu2+)、コバルトイオン
(Co2+,Co3+)、ニッケルイオン(Ni2+,N
i3+)、鉄イオン(Fe2+,Fe3+)、亜鉛イオン(Z
n2+)、アルミニウムイオン(Al3+)、マンガンイオ
ン(Mn2+など)、ガリウムイオン(Ga3+)、インジ
ウムイオン(In3+)、マグネシウムイオン(M
g2+)、カルシウムイオン(Ca2+)などを用いること
ができるが、なかでも、銅イオン、コバルトイオンな
ど、とりわけ、銅イオン(Cu2+)が好ましく用いられ
る。これらの遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩
酸、過塩素酸などの無機酸との塩または酢酸、シュウ
酸、クエン酸、炭酸などの有機酸との塩として、反応溶
媒に添加することができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、
とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられる。
【0047】また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類1モル
に対して、0.1ないし20モル(好ましくは0.5ない
し10モル)程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基と
しては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン
などのアルキルアミン類、N,N−ジメチルアニリン、
ピリジン、ルチジン、コリジン、4−(ジメチルアミ
ノ)ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類など
を用いることができるが、なかでも、ピリジンが好まし
く用いられる。また、アミノ基転移反応の際に、N末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する本発明
のポリペプチドまたはその塩、および該本発明のポリペ
プチドまたはその塩のアミノ基転移反応で得られるメチ
オニン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩の沈殿防止などを目的として、アミノ基転
移反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好まし
い。例えば、緩衝液中に尿素を好ましくは約1ないし8
M、より好ましくは約3ないし6Mの濃度になるよう添
加することが好ましい。
応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類1モル
に対して、0.1ないし20モル(好ましくは0.5ない
し10モル)程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基と
しては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン
などのアルキルアミン類、N,N−ジメチルアニリン、
ピリジン、ルチジン、コリジン、4−(ジメチルアミ
ノ)ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類など
を用いることができるが、なかでも、ピリジンが好まし
く用いられる。また、アミノ基転移反応の際に、N末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する本発明
のポリペプチドまたはその塩、および該本発明のポリペ
プチドまたはその塩のアミノ基転移反応で得られるメチ
オニン残基のジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩の沈殿防止などを目的として、アミノ基転
移反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好まし
い。例えば、緩衝液中に尿素を好ましくは約1ないし8
M、より好ましくは約3ないし6Mの濃度になるよう添
加することが好ましい。
【0048】さらに、上記したアミノ基転移反応は、遷
移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオ
ン、塩基およびα−ジケトン類の3成分(例えば、硫酸
銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など)を含有する混
合液を、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有する本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する
水溶液に添加して、アミノ基転移反応を進行させる。該
アミノ基転移反応により得られる、 式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X [式中、mは0ないし2の整数を示し、Xは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。]で表される化合物ま
たはその塩(メチオニン残基のジケトン体を有する本発
明のポリペプチドまたはその塩)は、ペプチドまたはタ
ンパク質の公知精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、
再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から
単離・精製することもできるが、そのまま次の加水分解
反応に付すこともできる。アミノ基転移反応で得られた
メチオニンのジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩は、通常、塩基による加水分解反応に付し
て、N末端の酸化されていてもよいメチオニン残基ある
いは該メチオニン残基のジケトン体を有していない本発
明のポリペプチドまたはその塩に変換することができ
る。
移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオ
ン、塩基およびα−ジケトン類の3成分(例えば、硫酸
銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など)を含有する混
合液を、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有する本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する
水溶液に添加して、アミノ基転移反応を進行させる。該
アミノ基転移反応により得られる、 式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X [式中、mは0ないし2の整数を示し、Xは本発明のポ
リペプチドのペプチド鎖を示す。]で表される化合物ま
たはその塩(メチオニン残基のジケトン体を有する本発
明のポリペプチドまたはその塩)は、ペプチドまたはタ
ンパク質の公知精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、
再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から
単離・精製することもできるが、そのまま次の加水分解
反応に付すこともできる。アミノ基転移反応で得られた
メチオニンのジケトン体を有する本発明のポリペプチド
またはその塩は、通常、塩基による加水分解反応に付し
て、N末端の酸化されていてもよいメチオニン残基ある
いは該メチオニン残基のジケトン体を有していない本発
明のポリペプチドまたはその塩に変換することができ
る。
【0049】加水分解反応に用いる塩基としては、例え
ば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミ
ンなどのアルキルアミン類またはその塩、N,N−ジメ
チルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、4−
(ジメチルアミノ)ピリジン、イミダゾールなどの芳香
族アミン類またはその塩、o−フェニレンジアミン、ト
リレン−3,4−ジアミン、3,4−ジアミノ安息香酸
およびそのN−アルキル置換体(例えば、N−メチル−
1,2−フェニレンジアミン、N−エチル−1,2−フ
ェニレンジアミン、N−イソプロピル−1,2−フェニ
レンジアミンなど)、2,3−ジアミノフェノール、4
−クロロ−o−フェニレンジアミンなどのジアミン類
(好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、3,4−ジ
アミノ安息香酸およびそのN−アルキル置換体(例え
ば、N−メチル−1,2−フェニレンジアミン、N−エ
チル−1,2−フェニレンジアミン、N−イソプロピル
−1,2−フェニレンジアミンなど)またはそれらの塩
など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジ
ド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバ
ジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカ
ルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類
またはその塩などを用いることができるが、なかでも、
アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバ
ジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、
3,4−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用い
られる。加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、
例えば上記のN末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有する本発明のポリペプチドの塩と同様のものな
どがあげられる。
ば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミ
ンなどのアルキルアミン類またはその塩、N,N−ジメ
チルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、4−
(ジメチルアミノ)ピリジン、イミダゾールなどの芳香
族アミン類またはその塩、o−フェニレンジアミン、ト
リレン−3,4−ジアミン、3,4−ジアミノ安息香酸
およびそのN−アルキル置換体(例えば、N−メチル−
1,2−フェニレンジアミン、N−エチル−1,2−フ
ェニレンジアミン、N−イソプロピル−1,2−フェニ
レンジアミンなど)、2,3−ジアミノフェノール、4
−クロロ−o−フェニレンジアミンなどのジアミン類
(好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、3,4−ジ
アミノ安息香酸およびそのN−アルキル置換体(例え
ば、N−メチル−1,2−フェニレンジアミン、N−エ
チル−1,2−フェニレンジアミン、N−イソプロピル
−1,2−フェニレンジアミンなど)またはそれらの塩
など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジ
ド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバ
ジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカ
ルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類
またはその塩などを用いることができるが、なかでも、
アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバ
ジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、
3,4−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用い
られる。加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、
例えば上記のN末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有する本発明のポリペプチドの塩と同様のものな
どがあげられる。
【0050】塩基の量は、通常、メチオニン残基のジケ
トン体を有する本発明のポリペプチドまたはその塩1モ
ルに対して約1ないし1万モル、好ましくは約200な
いし3000モル、より好ましくは約500ないし30
00モルである。加水分解反応は、通常、約0ないし7
0℃(好ましくは約20ないし40℃)で約1時間ない
し7日間(好ましくは約10時間ないし5日間)で進行
させるのが好ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用
いることが好ましく、緩衝液としては、例えば、リン酸
系緩衝液、酢酸系緩衝液、クエン酸系緩衝液、ギ酸系緩
衝液などが挙げられる。上記した加水分解反応を阻害し
ないものであれば何れの緩衝液を用いてもよいが、なか
でも、酢酸−ギ酸ナトリウム、ギ酸−ギ酸ナトリウムま
たはギ酸−酢酸ナトリウム緩衝液などのギ酸系緩衝液が
好ましく用いられる。また、反応のpHは、約2ないし
9、なかでも、約3ないし7、とりわけ、約4ないし6
に調整して、反応を進行させるのがよい。これらの緩衝
液は、好ましくは約0.1〜8mol/L、より好ましくは
約0.5〜6mol/Lで用いられる。また、加水分解の際
に、N末端の酸化されていてもよいメチオニン残基のジ
ケトン体を有する本発明のポリペプチドまたはその塩お
よび加水分解反応により生成する該メチオニン残基を有
していない本発明のポリペプチドまたはその塩の沈殿防
止等を目的として、加水分解反応のための緩衝液中に尿
素を添加することが好ましい。例えば、緩衝液中に尿素
を、好ましくは約1ないし6M、より好ましくは約2な
いし5Mの濃度になるよう添加することが好ましい。こ
のようにして得られる本発明のポリペプチドまたはその
塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再
結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単
離・精製することもできるが、好ましい例として、例え
ば、SP−セファロース(ファルマシアバイオテク
(株))あるいは、DEAE−5PW(東ソー(株))を介
したイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法が
挙げられる。
トン体を有する本発明のポリペプチドまたはその塩1モ
ルに対して約1ないし1万モル、好ましくは約200な
いし3000モル、より好ましくは約500ないし30
00モルである。加水分解反応は、通常、約0ないし7
0℃(好ましくは約20ないし40℃)で約1時間ない
し7日間(好ましくは約10時間ないし5日間)で進行
させるのが好ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用
いることが好ましく、緩衝液としては、例えば、リン酸
系緩衝液、酢酸系緩衝液、クエン酸系緩衝液、ギ酸系緩
衝液などが挙げられる。上記した加水分解反応を阻害し
ないものであれば何れの緩衝液を用いてもよいが、なか
でも、酢酸−ギ酸ナトリウム、ギ酸−ギ酸ナトリウムま
たはギ酸−酢酸ナトリウム緩衝液などのギ酸系緩衝液が
好ましく用いられる。また、反応のpHは、約2ないし
9、なかでも、約3ないし7、とりわけ、約4ないし6
に調整して、反応を進行させるのがよい。これらの緩衝
液は、好ましくは約0.1〜8mol/L、より好ましくは
約0.5〜6mol/Lで用いられる。また、加水分解の際
に、N末端の酸化されていてもよいメチオニン残基のジ
ケトン体を有する本発明のポリペプチドまたはその塩お
よび加水分解反応により生成する該メチオニン残基を有
していない本発明のポリペプチドまたはその塩の沈殿防
止等を目的として、加水分解反応のための緩衝液中に尿
素を添加することが好ましい。例えば、緩衝液中に尿素
を、好ましくは約1ないし6M、より好ましくは約2な
いし5Mの濃度になるよう添加することが好ましい。こ
のようにして得られる本発明のポリペプチドまたはその
塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再
結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単
離・精製することもできるが、好ましい例として、例え
ば、SP−セファロース(ファルマシアバイオテク
(株))あるいは、DEAE−5PW(東ソー(株))を介
したイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法が
挙げられる。
【0051】本発明の方法で製造される本発明のポリペ
プチドまたはその塩は滅菌水,ヒト血清アルブミン(H
SA),生理食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合することができ、哺乳動物(例、ヒトなど)
に対して非経口的に又は局所に投与することができる。
たとえば、その1日投与量は1人あたり、約0.01m
g−50mg、好ましくは、約0.1mg−10mg
を、静注または筋注などにより非経口的に投与すること
ができる。本発明の方法で製造される本発明のポリペプ
チドまたはその塩を含有する製剤は、塩、希釈剤、アジ
ュバント、他の担体、バッファー、結合剤、界面活性
剤、保存剤のような生理的に許容される他の活性成分も
含有していてもよい。非経口的投与製剤は、滅菌水溶液
又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液アンプル、ま
たは生理学的に許容される希釈液で用時希釈して使用し
うる滅菌粉末(通常ペプチド溶液を凍結乾燥して得られ
る)アンプルとして提供される。
プチドまたはその塩は滅菌水,ヒト血清アルブミン(H
SA),生理食塩水その他公知の生理学的に許容される
担体と混合することができ、哺乳動物(例、ヒトなど)
に対して非経口的に又は局所に投与することができる。
たとえば、その1日投与量は1人あたり、約0.01m
g−50mg、好ましくは、約0.1mg−10mg
を、静注または筋注などにより非経口的に投与すること
ができる。本発明の方法で製造される本発明のポリペプ
チドまたはその塩を含有する製剤は、塩、希釈剤、アジ
ュバント、他の担体、バッファー、結合剤、界面活性
剤、保存剤のような生理的に許容される他の活性成分も
含有していてもよい。非経口的投与製剤は、滅菌水溶液
又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液アンプル、ま
たは生理学的に許容される希釈液で用時希釈して使用し
うる滅菌粉末(通常ペプチド溶液を凍結乾燥して得られ
る)アンプルとして提供される。
【0052】本発明の製造法によって得られる本発明の
ポリペプチドはプロラクチン分泌の調節作用、つまり、
プロラクチン分泌の促進および抑制作用を有する。即
ち、本発明のポリペプチドは、まずプロラクチン分泌の
促進作用を有するため、プロラクチン分泌不全に関係す
る各種疾患の予防および治療薬に用いることができる。
一方、本発明のポリペプチドは、そのレセプタータンパ
ク質との親和性が強いため、投与量が増えるとプロラク
チン分泌に対し脱感作(desensitization)が起こる結
果、プロラクチン分泌を抑制する作用も有する。この場
合、プロラクチン過剰分泌に関係する各種疾患の予防お
よび治療薬に用いることができる。従って、本発明のポ
リペプチドは、プロラクチン分泌促進剤として、卵巣機
能低下症、精嚢発育不全、骨粗鬆症、更年期障害、乳汁
分泌不全、甲状腺機能低下、腎不全などのプロラクチン
分泌に関係する各種疾患の予防および治療薬として有用
である。さらに、本発明のポリペプチドは、プロラクチ
ン分泌促進作用に基づき、***促進作用(フェロモン的
作用)を有するため、***促進剤としても有用である。
また、本発明のポリペプチドは、プロラクチン分泌抑制
剤として、高プロラクチン血症、下垂体腺腫瘍、間脳腫
瘍、月経異常、ストレス、自己免疫疾患、プロラクチノ
ーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末
端肥大症、キアリ・フロンメル(Chiari-Frommel)症候
群、アルゴンツ-デル・カスティロ(Argonz-del Castil
o)症候群、フォーベス・アルブライト(Forbes-Albrig
ht)症候群、乳癌リンパ腫またはシーハン症候群または
***形成異常などのプロラクチン分泌に関係する各種疾
患の予防および治療薬として有用である。また、本発明
のポリペプチドは、プロラクチン分泌抑制作用に基づい
て、避妊薬としても有用である。その他、本発明のポリ
ペプチドは、プロラクチン分泌機能を調べるための検査
薬としても、また、牛、ヤギ、ブタなどの畜産哺乳動物
の乳汁の分泌促進剤などの動物薬としても有用であり、
さらには該畜産哺乳動物体内で有用物質を生産させ、こ
れをその乳汁中への分泌することによる有用物質生産な
どへの応用も期待される。さらにまた、本発明のポリペ
プチドは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞
状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異
常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬と
しても有用である。
ポリペプチドはプロラクチン分泌の調節作用、つまり、
プロラクチン分泌の促進および抑制作用を有する。即
ち、本発明のポリペプチドは、まずプロラクチン分泌の
促進作用を有するため、プロラクチン分泌不全に関係す
る各種疾患の予防および治療薬に用いることができる。
一方、本発明のポリペプチドは、そのレセプタータンパ
ク質との親和性が強いため、投与量が増えるとプロラク
チン分泌に対し脱感作(desensitization)が起こる結
果、プロラクチン分泌を抑制する作用も有する。この場
合、プロラクチン過剰分泌に関係する各種疾患の予防お
よび治療薬に用いることができる。従って、本発明のポ
リペプチドは、プロラクチン分泌促進剤として、卵巣機
能低下症、精嚢発育不全、骨粗鬆症、更年期障害、乳汁
分泌不全、甲状腺機能低下、腎不全などのプロラクチン
分泌に関係する各種疾患の予防および治療薬として有用
である。さらに、本発明のポリペプチドは、プロラクチ
ン分泌促進作用に基づき、***促進作用(フェロモン的
作用)を有するため、***促進剤としても有用である。
また、本発明のポリペプチドは、プロラクチン分泌抑制
剤として、高プロラクチン血症、下垂体腺腫瘍、間脳腫
瘍、月経異常、ストレス、自己免疫疾患、プロラクチノ
ーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末
端肥大症、キアリ・フロンメル(Chiari-Frommel)症候
群、アルゴンツ-デル・カスティロ(Argonz-del Castil
o)症候群、フォーベス・アルブライト(Forbes-Albrig
ht)症候群、乳癌リンパ腫またはシーハン症候群または
***形成異常などのプロラクチン分泌に関係する各種疾
患の予防および治療薬として有用である。また、本発明
のポリペプチドは、プロラクチン分泌抑制作用に基づい
て、避妊薬としても有用である。その他、本発明のポリ
ペプチドは、プロラクチン分泌機能を調べるための検査
薬としても、また、牛、ヤギ、ブタなどの畜産哺乳動物
の乳汁の分泌促進剤などの動物薬としても有用であり、
さらには該畜産哺乳動物体内で有用物質を生産させ、こ
れをその乳汁中への分泌することによる有用物質生産な
どへの応用も期待される。さらにまた、本発明のポリペ
プチドは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞
状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異
常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬と
しても有用である。
【0053】本明細書および図面において、アミノ酸,
ペプチド,保護基,活性基,その他に関し略号で表示す
る場合、それらはIUPAC−IUB(Commission on
Biochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に
あげる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。 DNA :デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 EDTA :エチレンジアミン四酢酸 Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニールアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン ATP :アデノシン三リン酸
ペプチド,保護基,活性基,その他に関し略号で表示す
る場合、それらはIUPAC−IUB(Commission on
Biochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に
あげる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。 DNA :デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 EDTA :エチレンジアミン四酢酸 Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニールアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン ATP :アデノシン三リン酸
【0054】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 [配列番号:1]9アミノ酸残基からなる本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:2]配列番号:1のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:3]12アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:4]配列番号:3のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:5]20アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:6]配列番号:5のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:7]37アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:8]配列番号:7のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:9]9アミノ酸残基からなる本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:10]配列番号:9のアミノ酸配列で表さ
れるポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示
す。 [配列番号:11]17アミノ酸残基からなる本発明の
ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:12]配列番号:11のアミノ酸配列で表
されるポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示
す。 [配列番号:13]bFGF CS23ムテインのアミ
ノ酸配列を示す。 [配列番号:14]式(I)で表される融合タンパク質
をコードする遺伝子の断片の塩基配列を示す。 [配列番号:15]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#1の塩基
配列を示す。 [配列番号:16]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#2の塩基
配列を示す。 [配列番号:17]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#3の塩基
配列を示す。 [配列番号:18]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#4の塩基
配列を示す。 [配列番号:19]本発明のヒト由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:20]配列番号:19のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:21]本発明のヒト由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:22]配列番号:21のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:23]本発明のウシ由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:24]配列番号:23のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:25]本発明のマウス由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:26]配列番号:25のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:27]本発明のラット由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:28]配列番号:27のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:29]本発明のラット由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:30]配列番号:29のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。
配列を示す。 [配列番号:1]9アミノ酸残基からなる本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:2]配列番号:1のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:3]12アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:4]配列番号:3のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:5]20アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:6]配列番号:5のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:7]37アミノ酸残基からなる本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:8]配列番号:7のアミノ酸配列で表され
るポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:9]9アミノ酸残基からなる本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:10]配列番号:9のアミノ酸配列で表さ
れるポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示
す。 [配列番号:11]17アミノ酸残基からなる本発明の
ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:12]配列番号:11のアミノ酸配列で表
されるポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示
す。 [配列番号:13]bFGF CS23ムテインのアミ
ノ酸配列を示す。 [配列番号:14]式(I)で表される融合タンパク質
をコードする遺伝子の断片の塩基配列を示す。 [配列番号:15]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#1の塩基
配列を示す。 [配列番号:16]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#2の塩基
配列を示す。 [配列番号:17]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#3の塩基
配列を示す。 [配列番号:18]後述の実施例1で本発明のポリペプ
チドの構造遺伝子の調製に用いたプライマ-#4の塩基
配列を示す。 [配列番号:19]本発明のヒト由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:20]配列番号:19のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:21]本発明のヒト由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:22]配列番号:21のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:23]本発明のウシ由来前駆体ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:24]配列番号:23のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:25]本発明のマウス由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:26]配列番号:25のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:27]本発明のラット由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:28]配列番号:27のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。 [配列番号:29]本発明のラット由来前駆体ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。 [配列番号:30]配列番号:29のアミノ酸配列で表
される前駆体ポリペプチドをコードするDNAの塩基配
列を示す。
【0055】後述の実施例2で得られた形質転換体Esch
erichia coli MM294(DE3)/pTFCRFRP-1は受託番号FER
M BP−7313として2000年9月28日付で茨
城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号3
05−8566)の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター(旧 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所(NIBH))に寄託されている。
また2000年9月19日付で受託番号IFO 164
76として大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番8
5号(郵便番号532−8686)の財団法人発酵研究
所(IFO)に寄託されている。
erichia coli MM294(DE3)/pTFCRFRP-1は受託番号FER
M BP−7313として2000年9月28日付で茨
城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号3
05−8566)の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター(旧 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所(NIBH))に寄託されている。
また2000年9月19日付で受託番号IFO 164
76として大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番8
5号(郵便番号532−8686)の財団法人発酵研究
所(IFO)に寄託されている。
【0056】
【発明の実施の形態】以下に実施例をあげて、本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
【0057】
【実施例】実施例1 本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
構造遺伝子の調製 配列番号:15〜18に示す4種類のDNA断片(#
1:配列番号:15、#4:配列番号:18;キコーテ
ック社製)(#2:配列番号:16、#3:配列番号:
17;アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)を
用いて、公知の方法により、本発明のポリペプチド(配
列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド)の構造遺伝子を調製した。 a)DNAオリゴマーのリン酸化 5’末端になるべき#1及び#4を除いた2種類のオリ
ゴマー各1μgを100μLのリン酸化反応液[50mM T
ris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10m
M ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、
1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ
(日本ジーン)]中で37℃、1時間反応させ、5’末
端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水
層を回収し2倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却
した後、遠心でDNAを沈殿させた。 b)DNAフラグメントの連結 上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及
び#4各1μgを合わせ10mM Tris/HCl、
2mM EDTA(pH8.0)に加え、120μLとし
た。この混合液を80℃で10分間保った後、室温まで
徐冷しアニーリングを行った。TaKaRa DNA Ligation Ki
t ver.2(宝酒造)を用いてライゲーション反応を行っ
た。アニーリング液30μLにキットに付属のII液3
0μLを加え良く混合した後、キットに付属のI液60
μLを加え、37℃、1時間反応させ、ライゲーション
を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し2
倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心
でDNAを沈殿させた。 c)5’末端のリン酸化 沈殿をTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)
10 μLに溶解し、100μLのリン酸化反応液[50mM Tris-
HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジ
チオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM
ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ(日本
ジーン)]中で37℃、1時間反応させ、5’末端のリ
ン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回
収し2倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した
後、遠心でDNAを沈殿させ、20μLのTE緩衝液に溶
解した。
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
構造遺伝子の調製 配列番号:15〜18に示す4種類のDNA断片(#
1:配列番号:15、#4:配列番号:18;キコーテ
ック社製)(#2:配列番号:16、#3:配列番号:
17;アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)を
用いて、公知の方法により、本発明のポリペプチド(配
列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド)の構造遺伝子を調製した。 a)DNAオリゴマーのリン酸化 5’末端になるべき#1及び#4を除いた2種類のオリ
ゴマー各1μgを100μLのリン酸化反応液[50mM T
ris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10m
M ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、
1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ
(日本ジーン)]中で37℃、1時間反応させ、5’末
端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水
層を回収し2倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却
した後、遠心でDNAを沈殿させた。 b)DNAフラグメントの連結 上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及
び#4各1μgを合わせ10mM Tris/HCl、
2mM EDTA(pH8.0)に加え、120μLとし
た。この混合液を80℃で10分間保った後、室温まで
徐冷しアニーリングを行った。TaKaRa DNA Ligation Ki
t ver.2(宝酒造)を用いてライゲーション反応を行っ
た。アニーリング液30μLにキットに付属のII液3
0μLを加え良く混合した後、キットに付属のI液60
μLを加え、37℃、1時間反応させ、ライゲーション
を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し2
倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心
でDNAを沈殿させた。 c)5’末端のリン酸化 沈殿をTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA)
10 μLに溶解し、100μLのリン酸化反応液[50mM Tris-
HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジ
チオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM
ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ(日本
ジーン)]中で37℃、1時間反応させ、5’末端のリ
ン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回
収し2倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した
後、遠心でDNAを沈殿させ、20μLのTE緩衝液に溶
解した。
【0058】実施例2 本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
発現プラスミドの調製 発現用ベクターとしてはpTFC(特開2000−27
0871号公報に記載)をNdeIおよびAvaI(宝
酒造)で37℃ 4時間消化した後、1%アガロースゲ
ル電気泳動により4.4kbのDNA断片をQIAquick Gel
Extraction Kit(キアゲン社)を用いて抽出し、25μ
lのTE緩衝液に溶解した。このpTFCのNdeI、
AvaI断片と上記により調製した本発明のポリペプチ
ド(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド)の構造遺伝子をTaKaRa DNA ligation kit ve
r.2 (宝酒造)を用いてライゲーション反応を行った。
この反応液を10μl用いて大腸菌JM109コンピテ
ントセル(東洋紡)を形質転換し、10μg/mlのテ
トラサイクリンを含むLB寒天培地上に播き、37℃で
1晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニー選ん
だ。この形質転換体をLB培地で一晩培養し、QIAprep8
Miniprep Kit(キアゲン社)を用いてプラスミドpTFCR
FRP-1を調製した(図2)。この本発明のポリペプチド
(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド)構造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオ
システムズ社モデル377DNAシーケンサーを用いて
確認した。プラスミドpTFCRFRP-1で大腸菌MM294
(DE3)を形質転換し、RFRP-1−CS23融合タンパ
ク質発現株大腸菌(Escherichia coli)MM294(DE3)/pTF
CRFRP-1を得た。
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
発現プラスミドの調製 発現用ベクターとしてはpTFC(特開2000−27
0871号公報に記載)をNdeIおよびAvaI(宝
酒造)で37℃ 4時間消化した後、1%アガロースゲ
ル電気泳動により4.4kbのDNA断片をQIAquick Gel
Extraction Kit(キアゲン社)を用いて抽出し、25μ
lのTE緩衝液に溶解した。このpTFCのNdeI、
AvaI断片と上記により調製した本発明のポリペプチ
ド(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド)の構造遺伝子をTaKaRa DNA ligation kit ve
r.2 (宝酒造)を用いてライゲーション反応を行った。
この反応液を10μl用いて大腸菌JM109コンピテ
ントセル(東洋紡)を形質転換し、10μg/mlのテ
トラサイクリンを含むLB寒天培地上に播き、37℃で
1晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニー選ん
だ。この形質転換体をLB培地で一晩培養し、QIAprep8
Miniprep Kit(キアゲン社)を用いてプラスミドpTFCR
FRP-1を調製した(図2)。この本発明のポリペプチド
(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド)構造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオ
システムズ社モデル377DNAシーケンサーを用いて
確認した。プラスミドpTFCRFRP-1で大腸菌MM294
(DE3)を形質転換し、RFRP-1−CS23融合タンパ
ク質発現株大腸菌(Escherichia coli)MM294(DE3)/pTF
CRFRP-1を得た。
【0059】実施例3 実施例2で得られた形質転換体を、5.0mg/Lのテ
トラサイクリンを含むLB培地(1%ペプトン、0.5
%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム)1Lを用い
て、2リットル容フラスコ中で37℃、8時間振とう培
養した。得られた培養液を19リットルの主発酵培地
(1.68%リン酸1水素ナトリウム、0.3%リン酸
2水素カリウム、0.1%塩化アンモニウム、0.05
%塩化ナトリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.
02%消泡剤、0.00025%硫酸第一鉄、0.00
025%塩酸チアミン、1.5%ブドウ糖、1.5%カ
ザミノ酸)を仕込んだ50L容発酵槽へ移植して、30
℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約500
クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−D−
チオガラクトピラノシドの最終濃度が12mg/Lにな
るように添加し、さらに4時間培養を行った。培養終了
後、培養液を遠心分離し、約500gの湿菌体を取得
し、−80℃で凍結保存した。
トラサイクリンを含むLB培地(1%ペプトン、0.5
%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム)1Lを用い
て、2リットル容フラスコ中で37℃、8時間振とう培
養した。得られた培養液を19リットルの主発酵培地
(1.68%リン酸1水素ナトリウム、0.3%リン酸
2水素カリウム、0.1%塩化アンモニウム、0.05
%塩化ナトリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.
02%消泡剤、0.00025%硫酸第一鉄、0.00
025%塩酸チアミン、1.5%ブドウ糖、1.5%カ
ザミノ酸)を仕込んだ50L容発酵槽へ移植して、30
℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約500
クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−D−
チオガラクトピラノシドの最終濃度が12mg/Lにな
るように添加し、さらに4時間培養を行った。培養終了
後、培養液を遠心分離し、約500gの湿菌体を取得
し、−80℃で凍結保存した。
【0060】実施例4 本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
の取得 実施例2で得た菌体500gに6M グアニジン塩酸塩、
0.2M トリス/HCl(pH8.0)溶液1000ml
を加え、約4時間攪拌した後、遠心分離(10000rp
m、60分)を行い、上澄液を0.6M アルギニン、
1mM ジチオトレイトール、50mM トリス/HCL
(pH8.0)29Lで希釈した。一晩10℃で静置した
後、濃塩酸でpH6.0に調整し、50mM リン酸緩
衝液(pH6.0)で平衡化したAF-Heparin Toyopearl
650Mカラム(11.3cmID×13cmL、東ソー)に通
液し、吸着、洗浄した後、50mM リン酸緩衝液、2
MNaCl、pH6.0で溶出を行い、1000mlの
本発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド)−CS23融合タンパク
質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカセット(ミ
リポア社)で0.1M酢酸を加えながら濃縮を行い、本
発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド)−CS23融合タンパク質
の0.1M酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度6Mと
なるように尿素を添加した後、1−シアノ−4−ジメチ
ルアミノピリジニウム塩(DMAP−CN)445mgを
加えて、室温で15分間反応した。反応終了後、反応液
を10%酢酸で平衡化したSephadex G−25
カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平衡
化に用いた10%酢酸を6ml/minの流速で展開
し、S−シアノ化された本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
−CS23融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペ
リコンミニカセット(ミリポア社)で濃縮・脱塩を行
い、本発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド)−CS23融合タン
パク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度6Mとな
るように尿素を添加した後、さらに、3M濃度となるよ
うに25%アンモニア水を加え、15℃で15分間反応
させた。反応終了後、酢酸でpH6.0に調整し、本発
明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチド)を得た。この反応液を3M尿
素を含む50mMMES緩衝液(pH4.5)で平衡化
したSP−5PW(5.5cmID×30cmL、東ソー)
に通液し、吸着、洗浄した後、0−50%B(B=50
mM MES緩衝液+1M NaCl+3M尿素)の段階
勾配で溶出を行い、本発明のポリペプチド(配列番号:
7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)画分
を得た(溶出時間:60分)。この本発明のポリペプチ
ド(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド)画分を、さらに0.1%トリフルオロ酢酸
(TFA)で平衡化したODS−120T(21.5mmID×300m
mL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、30−60
%B(B:80%アセトニトリル/ 0.1%TFA)の段
階勾配で溶出を行い、本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
画分をプールした(溶出時間:45分)後、凍結乾燥を
行い、本発明のポリペプチド(配列番号:7で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド)凍結乾燥粉末を得
た。 a)アミノ酸組成分析 得られた本発明のポリペプチド(配列番号:7で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸組成
をアミノ酸分析計(日立L−8500A Amino Acid A
nalyzer)を用いて決定した(酸加水分解(6N 塩酸−
4%チオグリコール酸、110℃、24,48時間加水
分解))。その結果、本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
のDNA塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致し
た(表1)。
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
の取得 実施例2で得た菌体500gに6M グアニジン塩酸塩、
0.2M トリス/HCl(pH8.0)溶液1000ml
を加え、約4時間攪拌した後、遠心分離(10000rp
m、60分)を行い、上澄液を0.6M アルギニン、
1mM ジチオトレイトール、50mM トリス/HCL
(pH8.0)29Lで希釈した。一晩10℃で静置した
後、濃塩酸でpH6.0に調整し、50mM リン酸緩
衝液(pH6.0)で平衡化したAF-Heparin Toyopearl
650Mカラム(11.3cmID×13cmL、東ソー)に通
液し、吸着、洗浄した後、50mM リン酸緩衝液、2
MNaCl、pH6.0で溶出を行い、1000mlの
本発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド)−CS23融合タンパク
質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカセット(ミ
リポア社)で0.1M酢酸を加えながら濃縮を行い、本
発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド)−CS23融合タンパク質
の0.1M酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度6Mと
なるように尿素を添加した後、1−シアノ−4−ジメチ
ルアミノピリジニウム塩(DMAP−CN)445mgを
加えて、室温で15分間反応した。反応終了後、反応液
を10%酢酸で平衡化したSephadex G−25
カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平衡
化に用いた10%酢酸を6ml/minの流速で展開
し、S−シアノ化された本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
−CS23融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペ
リコンミニカセット(ミリポア社)で濃縮・脱塩を行
い、本発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド)−CS23融合タン
パク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度6Mとな
るように尿素を添加した後、さらに、3M濃度となるよ
うに25%アンモニア水を加え、15℃で15分間反応
させた。反応終了後、酢酸でpH6.0に調整し、本発
明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチド)を得た。この反応液を3M尿
素を含む50mMMES緩衝液(pH4.5)で平衡化
したSP−5PW(5.5cmID×30cmL、東ソー)
に通液し、吸着、洗浄した後、0−50%B(B=50
mM MES緩衝液+1M NaCl+3M尿素)の段階
勾配で溶出を行い、本発明のポリペプチド(配列番号:
7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)画分
を得た(溶出時間:60分)。この本発明のポリペプチ
ド(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド)画分を、さらに0.1%トリフルオロ酢酸
(TFA)で平衡化したODS−120T(21.5mmID×300m
mL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、30−60
%B(B:80%アセトニトリル/ 0.1%TFA)の段
階勾配で溶出を行い、本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
画分をプールした(溶出時間:45分)後、凍結乾燥を
行い、本発明のポリペプチド(配列番号:7で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド)凍結乾燥粉末を得
た。 a)アミノ酸組成分析 得られた本発明のポリペプチド(配列番号:7で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸組成
をアミノ酸分析計(日立L−8500A Amino Acid A
nalyzer)を用いて決定した(酸加水分解(6N 塩酸−
4%チオグリコール酸、110℃、24,48時間加水
分解))。その結果、本発明のポリペプチド(配列番
号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)
のDNA塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致し
た(表1)。
【0061】
【表1】
【0062】b)N末端アミノ酸配列分析 得られた本発明のポリペプチド(配列番号:7で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド)のN末端アミノ
酸配列を気相プロテインシーケンサー(アプライドバイ
オシステムズ モデル477A)を用いて決定した(本
発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド)100pmolを用いて分
析を行った)。その結果、得られた本発明のポリペプチ
ド(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド)はDNA塩基配列から予想されるN末端アミ
ノ酸配列と一致した(表2)。
るアミノ酸配列を有するポリペプチド)のN末端アミノ
酸配列を気相プロテインシーケンサー(アプライドバイ
オシステムズ モデル477A)を用いて決定した(本
発明のポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド)100pmolを用いて分
析を行った)。その結果、得られた本発明のポリペプチ
ド(配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド)はDNA塩基配列から予想されるN末端アミ
ノ酸配列と一致した(表2)。
【0063】
【表2】
【0064】c)C末端アミノ酸分析 得られた本発明のポリペプチド(配列番号:7で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド)のC末端アミノ
酸をアミノ酸分析計(日立L−8500A Amino Acid
Analyzer)を用いて分析したが、C末端はアミド化さ
れているため、不検出であった。
るアミノ酸配列を有するポリペプチド)のC末端アミノ
酸をアミノ酸分析計(日立L−8500A Amino Acid
Analyzer)を用いて分析したが、C末端はアミド化さ
れているため、不検出であった。
【表3】
【0065】実施例5 実施例4で得られた本発明のポリペプチド(配列番号:
7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)を用
いて、WO00/29441号公報の実施例10に記載
の方法でcAMP産生抑制活性を測定したところ、化学
合成したポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド)と同等の活性を有するこ
とが確認された。
7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)を用
いて、WO00/29441号公報の実施例10に記載
の方法でcAMP産生抑制活性を測定したところ、化学
合成したポリペプチド(配列番号:7で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド)と同等の活性を有するこ
とが確認された。
【0066】
【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Method of Production for RFRP <130> P01-0262 <150> JP 2000-373125 <151> 2000-12-07 <160> 30 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 1 Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe 1 5 9 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Human <400> 2 agctttgcga atctgccgct gcgtttt 27 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 3 Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe 1 5 10 12 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Human <400> 4 atgccgcata gctttgcgaa tctgccgctg cgtttt 36 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 5 Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu 1 5 10 15 Pro Leu Arg Phe 20 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Human <400> 6 atgagcaccc cggcggtgaa taaaatgccg catagctttg cgaatctgcc gctgcgtttt 60 <210> 7 <211> 37 <212> PRT <213> Human <400> 7 Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile 1 5 10 15 Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn 20 25 30 Leu Pro Leu Arg Phe 35 37 <210> 8 <211> 111 <212> DNA <213> Human <400> 8 agcctgaact ttgaagaact gaaagattgg ggtccgaaaa atgtgattaa aatgagcacc 60 ccggcggtga ataaaatgcc gcatagcttt gcgaatctgc cgctgcgttt t 111 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 9 Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg Phe 1 5 8 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Human <400> 10 gttcctaacc tgccccaaag gttt 24 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Human <400> 11 Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg 1 5 10 15 Phe 17 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Human <400> 12 aatatggagg tgagcctcgt gagacgtgtt cctaacctgc cccaaaggtt t 51 <210> 13 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 13 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145 146 <210> 14 <211> 432 <212> DNA <213> Human <400> 14 cccgaggatg gcggcagcgg cgccttcccg cccggccact tcaaggaccc caagcggctg 60 tactgcaaaa acgggggctt cttcctgcgc atccaccccg acggccgagt tgacggggtc 120 cgggagaaga gcgaccctca catcaagcta caacttcaag cagaagagag aggagttgtg 180 tctatcaaag gagtgagcgc taatcgttac ctggctatga aggaagatgg aagattacta 240 gcttctaagt ctgttacgga tgagtgtttc ttttttgaac gattggaatc taataactac 300 aatacttacc ggtcaaggaa atacaccagt tggtatgtgg cactgaaacg aactgggcag 360 tataaacttg gatccaaaac aggacctggg cagaaagcta tactttttct tccaatgtct 420 gctaagagct gc 432 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tatgagcctg aactttgaag aactgaaagat tggggtccga aaaatgtgat taaaatg 57 <210> 16 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 agcaccccgg cggtgaataa aatgccgcat agctttgcga atctgccgct gcgtttttgc 60 c 61 <210> 17 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ggtgctcatt ttaatcacat ttttcggacc ccaatctttc agttcttcaa agttcaggct 60 ca 62 <210> 18 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tcggggcaaa aacgcagcgg cagattcgca aagctatgcgg cattttattc accgccgg 58 <210> 19 <211> 180 <212> PRT <213> Human <400> 19 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Leu Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Leu Leu Thr Ser Asn Ile Phe Cys Ala Asp Glu Leu Val Met 20 25 30 Ser Asn Leu His Ser Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Tyr Ser Glu Pro Arg 35 40 45 Gly Tyr Pro Lys Gly Glu Arg Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp 50 55 60 Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys 65 70 75 80 Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg Asn Val 85 90 95 Gln Glu Glu Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Asn Leu Pro Leu Arg Ser 100 105 110 Gly Arg Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro 115 120 125 Gln Arg Phe Gly Arg Thr Thr Thr Ala Lys Ser Val Cys Arg Met Leu 130 135 140 Ser Asp Leu Cys Gln Gly Ser Met His Ser Pro Cys Ala Asn Asp Leu 145 150 155 160 Phe Tyr Ser Met Thr Cys Gln His Gln Glu Ile Gln Asn Pro Asp Gln 165 170 175 Lys Gln Ser Arg 180 <210> 20 <211> 540 <212> DNA <213> Human <400> 20 atggaaatta tttcatcaaa actattcatt ttattgactt tagccacttc aagcttgtta 60 acatcaaaca ttttttgtgc agatgaatta gtgatgtcca atcttcacag caaagaaaat 120 tatgacaaat attctgagcc tagaggatac ccaaaagggg aaagaagcct caattttgag 180 gaattaaaag attggggacc aaaaaatgtt attaagatga gtacacctgc agtcaataaa 240 atgccacact ccttcgccaa cttgccattg agatttggga ggaacgttca agaagaaaga 300 agtgctggag caacagccaa cctgcctctg agatctgga agaaatatgga ggtgagcctc 360 gtgagacgtg ttcctaacct gccccaaagg tttgggagaa caacaacagc caaaagtgtc 420 tgcaggatgc tgagtgattt gtgtcaagga tccatgcatt caccatgtgc caatgactta 480 ttttactcca tgacctgcca gcaccaagaa atccagaatc ccgatcaaaa acagtcaagg 540 <210> 21 <211> 196 <212> PRT <213> Human <400> 21 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Leu Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Leu Leu Thr Ser Asn Ile Phe Cys Ala Asp Glu Leu Val Met 20 25 30 Ser Asn Leu His Ser Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Tyr Ser Glu Pro Arg 35 40 45 Gly Tyr Pro Lys Gly Glu Arg Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp 50 55 60 Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys 65 70 75 80 Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg Asn Val 85 90 95 Gln Glu Glu Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Asn Leu Pro Leu Arg Ser 100 105 110 Gly Arg Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro 115 120 125 Gln Arg Phe Gly Arg Thr Thr Thr Ala Lys Ser Val Cys Arg Met Leu 130 135 140 Ser Asp Leu Cys Gln Gly Ser Met His Ser Pro Cys Ala Asn Asp Leu 145 150 155 160 Phe Tyr Ser Met Thr Cys Gln His Gln Glu Ile Gln Asn Pro Asp Gln 165 170 175 Lys Gln Ser Arg Arg Leu Leu Phe Lys Lys Ile Asp Asp Ala Glu Leu 180 185 190 Lys Gln Glu Lys 195 <210> 22 <211> 588 <212> DNA <213> Human <400> 22 atggaaatta tttcatcaaa actattcatt ttattgactt tagccacttc aagcttgtta 60 acatcaaaca ttttttgtgc agatgaatta gtgatgtcca atcttcacag caaagaaaat 120 tatgacaaat attctgagcc tagaggatac ccaaaagggg aaagaagcct caattttgag 180 gaattaaaag attggggacc aaaaaatgtt attaagatga gtacacctgc agtcaataaa 240 atgccacact ccttcgccaa cttgccattg agatttggga ggaacgttca agaagaaaga 300 agtgctggag caacagccaa cctgcctctg agatctggaa gaaatatgga ggtgagcctc 360 gtgagacgtg ttcctaacct gccccaaagg tttgggagaa caacaacagc caaaagtgtc 420 tgcaggatgc tgagtgattt gtgtcaagga tccatgcatt caccatgtgc caatgactta 480 ttttactcca tgacctgcca gcaccaagaa atccagaatc ccgatcaaaa acagtcaagg 540 agactgctat tcaagaaaat agatgatgca gaattgaaac aagaaaaa 588 <210> 23 <211> 196 <212> PRT <213> Bovine <400> 23 Met Glu Ile Ile Ser Leu Lys Arg Phe Ile Leu Leu Met Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Leu Leu Thr Ser Asn Ile Phe Cys Thr Asp Glu Ser Arg Met 20 25 30 Pro Asn Leu Tyr Ser Lys Lys Asn Tyr Asp Lys Tyr Ser Glu Pro Arg 35 40 45 Gly Asp Leu Gly Trp Glu Lys Glu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Glu Val 50 55 60 Lys Asp Trp Ala Pro Lys Ile Lys Met Asn Lys Pro Val Val Asn Lys 65 70 75 80 Met Pro Pro Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg Asn Met 85 90 95 Glu Glu Glu Arg Ser Thr Arg Ala Met Ala His Leu Pro Leu Arg Leu 100 105 110 Gly Lys Asn Arg Glu Asp Ser Leu Ser Arg Trp Val Pro Asn Leu Pro 115 120 125 Gln Arg Phe Gly Arg Thr Thr Thr Ala Lys Ser Ile Thr Lys Thr Leu 130 135 140 Ser Asn Leu Leu Gln Gln Ser Met His Ser Pro Ser Thr Asn Gly Leu 145 150 155 160 Leu Tyr Ser Met Ala Cys Gln Pro Gln Glu Ile Gln Asn Pro Gly Gln 165 170 175 Lys Asn Leu Arg Arg Arg Gly Phe Gln Lys Ile Asp Asp Ala Glu Leu 180 185 190 Lys Gln Glu Lys 195 <210> 24 <211> 588 <212> DNA <213> Bovine <400> 24 atggaaatta tttcattaaa acgattcatt ttattgatgt tagccacttc aagcttgtta 60 acatcaaaca tcttctgcac agacgaatca aggatgccca atctttacag caaaaagaat 120 tatgacaaat attccgagcc tagaggagat ctaggctggg agaaagaaag aagtcttact 180 tttgaagaag taaaagattg ggctccaaaa attaagatga ataaacctgt agtcaacaaa 240 atgccacctt ctgcagccaa cctgccactg agatttggga ggaacatgga agaagaaagg 300 agcactaggg cgatggccca cctgcctctg agactcggaa aaaatagaga ggacagcctc 360 tccagatggg tcccaaatct gccccagagg tttggaagaa caacaacagc caaaagcatt 420 accaagaccc tgagtaattt gctccagcag tccatgcatt caccatctac caatgggcta 480 ctctactcca tggcctgcca gccccaagaa atccagaatc ctggtcaaaa gaacctaagg 540 agacggggat tccagaaaat agatgatgca gaattgaaac aagaaaaa 588 <210> 25 <211> 188 <212> PRT <213> Mouse <400> 25 Met Glu Ile Ile Ser Leu Lys Arg Phe Ile Leu Leu Thr Val Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Thr Ser Asn Thr Phe Cys Thr Asp Glu Phe Met Met 20 25 30 Pro His Phe His Ser Lys Glu Gly Asp Gly Lys Tyr Ser Gln Leu Arg 35 40 45 Gly Ile Pro Lys Gly Glu Lys Glu Arg Ser Val Ser Phe Gln Glu Leu 50 55 60 Lys Asp Trp Gly Ala Lys Asn Val Ile Lys Met Ser Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Asn Lys Val Pro His Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg 85 90 95 Thr Ile Asp Glu Lys Arg Ser Pro Ala Ala Arg Val Asn Met Glu Ala 100 105 110 Gly Thr Arg Ser His Phe Pro Ser Leu Pro Gln Arg Phe Gly Arg Thr 115 120 125 Thr Ala Arg Ser Pro Lys Thr Pro Ala Asp Leu Pro Gln Lys Pro Leu 130 135 140 His Ser Leu Gly Ser Ser Glu Leu Leu Tyr Val Met Ile Cys Gln His 145 150 155 160 Gln Glu Ile Gln Ser Pro Gly Gly Lys Arg Thr Arg Arg Gly Ala Phe 165 170 175 Val Glu Thr Asp Asp Ala Glu Arg Lys Pro Glu Lys 180 185 <210> 26 <211> 564 <212> DNA <213> Mouse <400> 26 atggaaatta tttcattaaa acgattcatt ttattgactg tggcaacttc aagcttctta 60 acatcaaaca ccttctgtac agatgagttc atgatgcctc attttcacag caaagaaggt 120 gacggaaaat actcccagct gagaggaatc ccaaaagggg aaaaggaaag aagtgtcagt 180 tttcaagaac taaaagattg gggggcaaag aatgttatta agatgagtcc agcccctgcc 240 aacaaagtgc cccactcagc agccaacctg cccctgagat ttggaaggac catagatgag 300 aaaagaagcc ccgcagcacg ggtcaacatg gaggcaggga ccaggagcca tttccccagc 360 ctgccccaaa ggtttgggag aacaacagcc agaagcccca agacacccgc tgatttgcca 420 cagaaacccc tgcactcact gggctccagc gagttgctct acgtcatgat ctgccagcac 480 caagaaattc agagtcctgg tggaaagcga acgaggagag gagcgtttgt ggaaacagat 540 gatgcagaaa ggaaaccaga aaaa 564 <210> 27 <211> 203 <212> PRT <213> Rat <400> 27 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Arg Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Thr Ser Asn Thr Leu Cys Ser Asp Glu Leu Met Met 20 25 30 Pro His Phe His Ser Lys Glu Gly Tyr Gly Lys Tyr Tyr Gln Leu Arg 35 40 45 Gly Ile Pro Lys Gly Val Lys Glu Arg Ser Val Thr Phe Gln Glu Leu 50 55 60 Lys Asp Trp Gly Ala Lys Lys Asp Ile Lys Met Ser Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Asn Lys Val Pro His Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg 85 90 95 Asn Ile Glu Asp Arg Arg Ser Pro Arg Ala Arg Ala Asn Met Glu Ala 100 105 110 Gly Thr Met Ser His Phe Pro Ser Leu Pro Gln Arg Phe Gly Arg Thr 115 120 125 Thr Ala Arg Arg Ile Thr Lys Thr Leu Ala Gly Leu Pro Gln Lys Ser 130 135 140 Leu His Ser Leu Ala Ser Ser Glu Leu Leu Tyr Ala Met Thr Arg Gln 145 150 155 160 His Gln Glu Ile Gln Ser Pro Gly Gln Glu Gln Pro Arg Lys Arg Val 165 170 175 Phe Thr Glu Thr Asp Asp Ala Glu Arg Lys Gln Glu Lys Ile Gly Asn 180 185 190 Leu Gln Pro Val Leu Gln Gly Ala Met Lys Leu 195 200 <210> 28 <211> 609 <212> DNA <213> Rat <400> 28 atggaaatta tttcatcaaa gcgattcatt ttattgactt tagcaacttc aagcttctta 60 acttcaaaca ccctttgttc agatgaatta atgatgcccc attttcacag caaagaaggt 120 tatggaaaat attaccagct gagaggaatc ccaaaagggg taaaggaaag aagtgtcact 180 tttcaagaac tcaaagattg gggggcaaag aaagatatta agatgagtcc agcccctgcc 240 aacaaagtgc cccactcagc agccaacctt cccctgaggt ttgggaggaa catagaagac 300 agaagaagcc ccagggcacg ggccaacatg gaggcaggga ccatgagcca ttttcccagc 360 ctgccccaaa ggtttgggag aacaacagcc agacgcatca ccaagacact ggctggtttg 420 ccccagaaat ccctgcactc cctggcctcc agtgaattgc tctatgccat gacccgccag 480 catcaagaaa ttcagagtcc tggtcaagag caacctagga aacgggtgtt cacggaaaca 540 gatgatgcag aaaggaaaca agaaaaaata ggaaacctcc agccagtcct tcaaggggct 600 atgaagctg 609 <210> 29 <211> 203 <212> PRT <213> Rat <400> 29 Met Glu Ile Ile Ser Ser Lys Arg Phe Ile Leu Leu Thr Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Thr Ser Asn Thr Leu Cys Ser Asp Glu Leu Met Met 20 25 30 Pro His Phe His Ser Lys Glu Gly Tyr Gly Lys Tyr Tyr Gln Leu Arg 35 40 45 Gly Ile Pro Lys Gly Val Lys Glu Arg Ser Val Thr Phe Gln Glu Leu 50 55 60 Lys Asp Trp Gly Ala Lys Lys Asp Ile Lys Met Ser Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Asn Lys Val Pro His Ser Ala Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe Gly Arg 85 90 95 Asn Ile Glu Asp Arg Arg Ser Pro Arg Ala Arg Ala Asn Met Glu Ala 100 105 110 Gly Thr Met Ser His Phe Pro Ser Leu Pro Gln Arg Phe Gly Arg Thr 115 120 125 Thr Ala Arg Arg Ile Thr Lys Thr Leu Ala Gly Leu Pro Gln Lys Ser 130 135 140 Leu His Ser Leu Ala Ser Ser Glu Ser Leu Tyr Ala Met Thr Arg Gln 145 150 155 160 His Gln Glu Ile Gln Ser Pro Gly Gln Glu Gln Pro Arg Lys Arg Val 165 170 175 Phe Thr Glu Thr Asp Asp Ala Glu Arg Lys Gln Glu Lys Ile Gly Asn 180 185 190 Leu Gln Pro Val Leu Gln Gly Ala Met Lys Leu 195 200 <210> 30 <211> 609 <212> DNA <213> Rat <400> 30 atggaaatta tttcatcaaa gcgattcatt ttattgactt tagcaacttc aagcttctta 60 acttcaaaca ccctttgttc agatgaatta atgatgcccc attttcacag caaagaaggt 120 tatggaaaat attaccagct gagaggaatc ccaaaagggg taaaggaaag aagtgtcact 180 tttcaagaac tcaaagattg gggggcaaag aaagatatta agatgagtcc agcccctgcc 240 aacaaagtgc cccactcagc agccaacctt cccctgaggt ttgggaggaa catagaagac 300 agaagaagcc ccagggcacg ggccaacatg gaggcaggga ccatgagcca ttttcccagc 360 ctgccccaaa ggtttgggag aacaacagcc agacgcatca ccaagacact ggctggtttg 420 ccccagaaat ccctgcactc cctggcctcc agtgaatcgc tctatgccat gacccgccag 480 catcaagaaa ttcagagtcc tggtcaagag caacctagga aacgggtgtt cacggaaaca 540 gatgatgcag aaaggaaaca agaaaaaata ggaaacctcc agccagtcct tcaaggggct 600 atgaagctg 609
【0067】
【発明の効果】本発明の製造方法を用いると、プロラク
チン分泌不全またはプロラクチン分泌過剰に関係する各
種疾患の予防および治療薬などとして用いることができ
るポリペプチドを工業的かつ大量に製造することができ
る。
チン分泌不全またはプロラクチン分泌過剰に関係する各
種疾患の予防および治療薬などとして用いることができ
るポリペプチドを工業的かつ大量に製造することができ
る。
【図1】本発明の製造方法における反応メカニズムを示
す。
す。
【図2】実施例2で得られたプラスミドpTFCRFR
P−1の構築図を示す。
P−1の構築図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 1/15 C12N 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C 5/10 A61P 5/14 C12P 21/02 13/12 // A61K 38/00 15/00 A61P 5/14 171 13/12 15/10 15/00 15/12 171 15/14 15/10 19/10 15/12 35/00 15/14 37/02 19/10 43/00 111 35/00 C12N 15/00 ZNAA 37/02 5/00 A 43/00 111 A61K 37/02 (72)発明者 山田 隆央 大阪府松原市一津屋4丁目3番26号 (72)発明者 西村 紀 兵庫県川西市大和西1丁目54番地の16 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA20 BA80 CA05 CA07 HA17 4B064 AG01 CA19 CC24 CE10 DA01 4B065 AA26X AB01 CA24 CA44 4C084 AA06 AA07 BA04 BA31 CA59 DB70 MA55 MA66 ZA811 ZA861 ZA971 ZB071 ZB261 ZC021 ZC611 ZC631 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 EA20 FA15 FA74
Claims (40)
- 【請求項1】 N末端にシステインを有するタンパク質
またはポリペプチドのN末端に、N末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基を有していてもよい配列番号:
19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:2
5、配列番号:27または配列番号:29で表されるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドを連
結した融合タンパク質またはポリペプチドをシステイン
残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すこと
を特徴とする配列番号:19、配列番号:21、配列番
号:23、配列番号:25、配列番号:27または配列
番号:29を含有するポリペプチドの部分ペプチドまた
はその塩の製造法。 - 【請求項2】 N末端にシステインを有するタンパク質
またはポリペプチドのN末端に、N末端にメチオニン残
基を有していてもよい配列番号:19、配列番号:2
1、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27
または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドの部分ペプチドを連結した融合タンパク
質またはポリペプチドをコードするDNAを有するベク
ターを保持する形質転換体を培養して融合タンパク質ま
たはポリペプチドを発現させ、発現された融合タンパク
質またはポリペプチドをシステイン残基のアミノ基側の
ペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とするN末端
にメチオニン残基を有していてもよい配列番号:19、
配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配
列番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドまたはその
塩の製造法。 - 【請求項3】 切断反応がS−シアノ化反応、次いでア
ンモノリシスまたは加水分解反応に付す反応である請求
項1または2記載の製造法。 - 【請求項4】 配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、(1)配列番号:19で表さ
れるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第10
1番目(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目
(Asn)〜第112番目(Ser)、第115番目
(Asn)〜第131番目(Phe)、第124番目
(Val)〜131番目(Phe)、第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第1番目(Met)〜1
12番目(Ser)または第1番目(Met)〜131
番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目
(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜11
2番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番
目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第101番目(Ser)〜第112番目(Le
u)、第95番目(Asn)〜第112番目(Le
u)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)また
は第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番
目(Phe)、第83番目(Val)〜第94番目(P
he)、第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、または(5)
配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項1または2記載の製造法。 - 【請求項5】 配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である請求項1または2記載の製造法。 - 【請求項6】 配列番号:1または配列番号:9で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、
配列番号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドである請求項5記載の製造
法。 - 【請求項7】 N末端にシステインを有するタンパク質
またはポリペプチドのN末端に、N末端にメチオニン残
基を有していてもよい配列番号:19、配列番号:2
1、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27
または配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドの部分ペプチドを連結した融合タンパク
質もしくはポリペプチドまたはその塩。 - 【請求項8】 配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、(1)配列番号:19で表さ
れるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番目
(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第81番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第10
1番目(Ser)〜112番目(Ser)、第95番目
(Asn)〜第112番目(Ser)、第115番目
(Asn)〜第131番目(Phe)、第124番目
(Val)〜131番目(Phe)、第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第1番目(Met)〜1
12番目(Ser)または第1番目(Met)〜131
番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目
(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜11
2番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番
目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第101番目(Ser)〜第112番目(Le
u)、第95番目(Asn)〜第112番目(Le
u)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)また
は第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番
目(Phe)、第83番目(Val)〜第94番目(P
he)、第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、または(5)
配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項7記載のポリペプチドまた
はその塩。 - 【請求項9】 配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である請求項7記載のポリペプチドまたはその塩。 - 【請求項10】 配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、
配列番号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドである請求項9記載のポリペ
プチドまたはその塩。 - 【請求項11】 請求項7記載の融合タンパク質または
ポリペプチドをコードするDNAを有するベクター。 - 【請求項12】 請求項11記載のベクターで形質転換
された形質転換体。 - 【請求項13】 N末端に酸化されていてもよいメチオ
ニン残基を有する配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドまたはその塩とα−ジケトン類
を反応させた後、加水分解することを特徴とする該メチ
オニン残基の除去方法。 - 【請求項14】 N末端に酸化されていてもよいメチオ
ニン残基を有する配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが遺伝子工学的に製造された配
列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列
番号:25、配列番号:27または配列番号:29で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプ
チドであって、該酸化されていてもよいメチオニン残基
のC末端側に隣接するアミノ酸残基がイソロイシン残
基、バリン残基、システイン残基、スレオニン残基、ア
スパラギン酸残基、リジン残基、ロイシン残基、アルギ
ニン残基、アスパラギン残基、メチオニン残基、フェニ
ルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、
グルタミン酸残基、グルタミン残基またはヒスチジン残
基である請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、(1)配列番号:19で表
されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番
目(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、
第101番目(Ser)〜112番目(Ser)、第9
5番目(Asn)〜第112番目(Ser)、第115
番目(Asn)〜第131番目(Phe)、第124番
目(Val)〜131番目(Phe)、第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第1番目(Met)〜1
12番目(Ser)または第1番目(Met)〜131
番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目
(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜11
2番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番
目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第101番目(Ser)〜第112番目(Le
u)、第95番目(Asn)〜第112番目(Le
u)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)また
は第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番
目(Phe)、第83番目(Val)〜第94番目(P
he)、第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、または(5)
配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項13または14記載の方
法。 - 【請求項16】 配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である請求項13または14記載の製造法。 - 【請求項17】 配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、
配列番号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドである請求項16記載の方
法。 - 【請求項18】 遷移金属イオンの存在下にα−ジケト
ン類を反応させることを特徴とする請求項13記載の方
法。 - 【請求項19】 塩基の存在下にα−ジケトン類を反応
させることを特徴とする請求項13記載の方法。 - 【請求項20】 遷移金属イオンおよび塩基の存在下に
α−ジケトン類を反応させることを特徴とする請求項1
3記載の方法。 - 【請求項21】 α−ジケトン類がグリオキシル酸また
はその塩である請求項13記載の方法。 - 【請求項22】 遷移金属イオンが銅イオンである請求
項18記載の方法。 - 【請求項23】 塩基がピリジンである請求項19記載
の方法。 - 【請求項24】 塩基を用いて加水分解することを特徴
とする請求項13記載の方法。 - 【請求項25】 塩基がアミン類である請求項24記載
の方法。 - 【請求項26】 塩基がジアミン類またはチオもしくは
セレノセミカルバジド類である請求項24記載の方法。 - 【請求項27】 ジアミン類がo−フェニレンジアミン
または3,4−ジアミノ安息香酸である請求項26記載
の方法。 - 【請求項28】 遺伝子工学的に製造され、N末端にメ
チオニンが付加した配列番号:19、配列番号:21、
配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27また
は配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩とグリオキシル
酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反
応させた後、o−フェニレンジアミンまたは3,4−ジ
アミノ安息香酸と反応させることを特徴とする配列番
号:1もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列を
含有するポリペプチドまたはその塩の製造法。 - 【請求項29】 配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、(1)配列番号:19で表
されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番
目(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、
第101番目(Ser)〜112番目(Ser)、第9
5番目(Asn)〜第112番目(Ser)、第115
番目(Asn)〜第131番目(Phe)、第124番
目(Val)〜131番目(Phe)、第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第1番目(Met)〜1
12番目(Ser)または第1番目(Met)〜131
番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目
(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜11
2番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番
目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第101番目(Ser)〜第112番目(Le
u)、第95番目(Asn)〜第112番目(Le
u)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)また
は第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番
目(Phe)、第83番目(Val)〜第94番目(P
he)、第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、または(5)
配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項28記載の製造法。 - 【請求項30】 配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である請求項28記載の製造法。 - 【請求項31】 配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、
配列番号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドである請求項30記載の製造
法。 - 【請求項32】 式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X〔式
中、mは0ないし2の整数を、Xは配列番号:19、配
列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列
番号:27または配列番号:29で表されるアミノ酸配
列で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部
分ペプチドのペプチド鎖を示す。〕で表される化合物ま
たはその塩。 - 【請求項33】 配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、(1)配列番号:19で表
されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番
目(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、
第101番目(Ser)〜112番目(Ser)、第9
5番目(Asn)〜第112番目(Ser)、第115
番目(Asn)〜第131番目(Phe)、第124番
目(Val)〜131番目(Phe)、第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第1番目(Met)〜1
12番目(Ser)または第1番目(Met)〜131
番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目
(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜11
2番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番
目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第101番目(Ser)〜第112番目(Le
u)、第95番目(Asn)〜第112番目(Le
u)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)また
は第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番
目(Phe)、第83番目(Val)〜第94番目(P
he)、第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、または(5)
配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項32記載の化合物またはそ
の塩。 - 【請求項34】配列番号:19、配列番号:21、配列
番号:23、配列番号:25、配列番号:27または配
列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である請求項32記載の化合物またはその塩。 - 【請求項35】 配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、
配列番号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドである請求項34記載の化合
物またはその塩。 - 【請求項36】 請求項32記載の化合物を加水分解す
ることを特徴とする配列番号:19、配列番号:21、
配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27また
は配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドの部分ペプチドまたはその塩の製造法。 - 【請求項37】 N末端にシステインを有するタンパク
質またはポリペプチドのN末端に、N末端にメチオニン
残基を有するで表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを連結した融合タンパク質またはポリペプチドを
システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応
に付し、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有するで表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドまたはその塩を得、さらに、該N末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基を有するで表されるアミノ酸配
列を含有するポリペプチドまたはその塩とα−ジケトン
類を反応させた後、加水分解することを特徴とするで表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその
塩の製造法。 - 【請求項38】 配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、(1)配列番号:19で表
されるアミノ酸配列の第56番目(Ser)〜第92番
目(Phe)、第73番目(Met)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第84番目(Ser)〜第92番目(Phe)、
第101番目(Ser)〜112番目(Ser)、第9
5番目(Asn)〜第112番目(Ser)、第115
番目(Asn)〜第131番目(Phe)、第124番
目(Val)〜131番目(Phe)、第1番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第1番目(Met)〜1
12番目(Ser)または第1番目(Met)〜131
番目(Phe)のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(2)配列番号:21で表されるアミノ酸配列の第56
番目(Ser)〜第92番目(Phe)、第73番目
(Met)〜第92番目(Phe)、第81番目(Me
t)〜第92番目(Phe)、第84番目(Ser)〜
第92番目(Phe)、第101番目(Ser)〜11
2番目(Ser)、第95番目(Asn)〜第112番
目(Ser)、第115番目(Asn)〜第131番目
(Phe)、第124番目(Val)〜131番目(P
he)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)、
第1番目(Met)〜112番目(Ser)または第1
番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ酸配列
を含有するペプチド、(3)配列番号:23で表される
アミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第92番目(P
he)、第81番目(Met)〜第92番目(Ph
e)、第101番目(Ser)〜第112番目(Le
u)、第95番目(Asn)〜第112番目(Le
u)、第124番目(Val)〜131番目(Ph
e)、第1番目(Met)〜第92番目(Phe)また
は第1番目(Met)〜131番目(Phe)のアミノ
酸配列を含有するペプチド、(4)配列番号:25で表
されるアミノ酸配列の第58番目(Ser)〜第94番
目(Phe)、第83番目(Val)〜第94番目(P
he)、第84番目(Pro)〜第94番目(Phe)
または第118番目(Phe)〜第125番目(Ph
e)のアミノ酸配列を含有するペプチド、または(5)
配列番号:27で表されるアミノ酸配列の第58番目
(Ser)〜第94番目(Phe)または第84番目
(Pro)〜第94番目(Phe)のアミノ酸配列を含
有するペプチドである請求項37記載の製造法。 - 【請求項39】 配列番号:19、配列番号:21、配
列番号:23、配列番号:25、配列番号:27または
配列番号:29で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドの部分ペプチドが、配列番号:1または配列番
号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
である請求項37記載の製造法。 - 【請求項40】 配列番号:1または配列番号:9で表
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番
号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、
配列番号:9または配列番号:11で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドである請求項39記載の製造
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001372444A JP2002325585A (ja) | 2000-12-07 | 2001-12-06 | Rfrpの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000-373125 | 2000-12-07 | ||
JP2000373125 | 2000-12-07 | ||
JP2001372444A JP2002325585A (ja) | 2000-12-07 | 2001-12-06 | Rfrpの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002325585A true JP2002325585A (ja) | 2002-11-12 |
JP2002325585A5 JP2002325585A5 (ja) | 2005-05-19 |
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ID=26605437
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001372444A Withdrawn JP2002325585A (ja) | 2000-12-07 | 2001-12-06 | Rfrpの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2002325585A (ja) |
-
2001
- 2001-12-06 JP JP2001372444A patent/JP2002325585A/ja not_active Withdrawn
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