PT97565B

PT97565B - Processo para a prparacao de xilanase

Info

Publication number: PT97565B
Application number: PT97565A
Authority: PT
Inventors: Wolfgang Wizani; Hermann Esterbauer; Walter Steiner; Joseph Gomes
Original assignee: Voest Alpine Ind Anlagen
Priority date: 1990-05-08
Filing date: 1991-05-03
Publication date: 1998-08-31
Also published as: DK0456033T3; EP0456033B1; AT394730B; DE59100085D1; ES2054394T3; YU72891A; ATE88497T1; CA2041304A1; FI911812A0; US5183753A; PT97565A; GR3007689T3; FI911812A; ATA103090A; JPH0787970A; EP0456033A2; EP0456033A3; CS133291A2

Description

A invenção refere-se a um processo para a preparação de xilanase, à sua utilização, ao microorganismo Thermomyces lanuginosus DSK 5826 e à xilanase isenta de exocelulose e endocelulose preparada a partir do referido microorganismo.

A decomposição da hemicelulose, que nas plantas anuais ou madeiras é formada principalmente por xilano, é uma operação necessária para a produção de celulose. A citada decomposição pode realizar-se por via química, por exemple por extracção alcalina a quente, ou por via enzimática, por tratamento com enzimas de substrato específicas, em especial com xilanases. ííediante o tratamento enzimático da celulose branqueada ou semibranqueada com xilanases rompem-se as ligações de hemicelulose e decompõe-se o xilano. Para isto, no entanto, podem-se empregar somente xilanases puras, que nao contêm nenhumas impurezas na célulase, visto que, a não ser assim, decompõem também a celulose, o que extremamente indesejável.

As xilanases, que no meio nutritivo decompõem as substâncias em bruto contendo xilano, e são estimadas como fontes de C, são formadas, entre outros elementos, por uma série de microorganismos termófilos e mesófilos. Dependendo das demais matérias primas existentes no meio nutritivo, predominando a celulose, são, todavia, também formadas as celulases específicas para o mencionado substrato. A fim de

se obter xilanases isentas de exocelulose e isentas de endocelulase, a xilanase deve ser separada das celulases formadas e ser purificada por um processo dispendioso. Para reduzir a formação de celulases durante a fermentação, os microorganismos podem ser cultivados também sobre xilano purificado.

Sm D. J. Sénior et al, ”Biotechnology letters, volume 10, n^. 12 páginas 907 - 912 (1988) descreve-se a utilização de xilanases, que foram obtidas a partir de Trichoderma harzianum cultivado sobre xilano purificado, para a decomposição selectiva de xilano.

Ko entanto, a obtenção de xilanase por cultivo de xilano altamente puro não tem interesse por causa dos eleva- í dos custos das matérias primas para a maior parte das aplicações técnicas.

Inesperadamente descobriu-se que a xilanase é produzida com uma actividade surpreendentemente mais elevada, quan do se cultiva um fungo num meio nutritivo que contém maçarocas de milho, de forma que a xilanase produzida não apresenta nenhumas actividades de exocelulose e endocelulose ou apresenta essas actividades de forma apenas muito reduzida.

Consequentemente, o objecto da invenção é um processo para a preparação de xilanase, que é caracterizada pelo facto de se cultivar um fungo num meio nutritivo que contém maçarocas de milho.

De acordo com a invenção, prepara-se uma xilanase por cultura de um fungo num meio nutritivo que contém maçarocas de milho. Por xilanases devem entender-se, neste caso, somente aquelas xilanases que não possuem nenhumas actividades, ou somente actividades muito reduzidas de exocelulases ou endocelulases.

Os fungos que podem ser utilizados neste caso, são aqueles que no processo de acordo com a invenção, podem produzir elevadas actividades de xilanase. Um exemplo de tais fungos é o fhermomyces lanuginosus (anteriormente Humicola lanuginosa). Uma estirpe da espécie Itonylialis foi isolada de uma pilha de resíduos de juta numa fabrica de juta no Bangladesh, na qual se tratam as fibras de juta com uma emulsão oleosa. A temperatura na pilha de resíduos de juta estava compreendida entre 65 e 7O°C. Esta estirpe foi registada na Colecção Alemã de Kieroorganismos e Culturas de Células com o número DMS 5826. Esta estirpe é especialmente adequada para produzir, num meio nutritivo que contém maçarocas de milho, xilanase com uma actividade surpreendentemente elevada.

microorganismo Thermomyces lanuginosus USM 5826 é novo e constitui igualmente um ohjecto da presente invenção

O meio nutritivo, no qual se cultiva o fungo, contém além das substâncias nutritivas e oligoelementos necessários para o crescimento, maçarocas de milho. As maçarocas de milho podem ser utilizadas como tais ou moídas e eventualmente esterilizadas por meio de aquecimento até uma temperatura compreendida entre 110 e 16O°C ou. por meio de pré-tratamento por exemplo com vapor de água sobreaquecido. Inesperadamente obtêm-se actividades de xilanase particularmente elevadas quando as maçarocas de milho são grosseiramente moídas antes da sua utilização. Se as maçarocas de milho forem trituradas ou finamente moídas, os resultados são sempre realmente ainda surpreendentemente bons; todavia, a aplicação das maçarocas de milho moídas grosseiramente deu resultados superiores.

As fontes de alimentação de azoto apropriadas são, por exemplo, a peptona da carne, peptona de peixe, ureia, sul fato de amónio, extrato de malte, extrato de carne, farinha de soja, extrato de levedura e semelhante; sais inorgânicos, por exemplo hidrogenossulfato de potássio, dihidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dissódio, sulfato de ferro, cloreto de cálcio, sulfato de magnésio e semelhantes. A fim

de acelerar a produção de xilanase no meio nutritivo pode ser vantajoso adicionar substâncias tensioactivas. Hsualmente empregam-se substâncias tensioactivas não iónicas, por exemplo Tween 40, Tween 50 ou Tween 80, numa quantidade compreendida entre 0,05 e 0,5$ em peso em relação à quantidade total do meio nutritivo. Ao meio nutritivo podem-se adicionar eventual mente também oligoelementos, por exemplo metais raros como Mn²⁺, Zn²⁺, Pe²⁺ ou vitaminas.

meio é regulado eventualmente de forma vantajosa com amoníaco ou com ácido fosfórico até se obter um valor de pH compreendido entre 5,0 e 8,0, de preferência entre 6,0 e 7,0.

Cultiva-se o fungo no meio nutritivo numa temperatu) ra compreendida entre cerca de 30 e 70°C, de preferência entre 40 e 60°C> com especial preferência entre 45 e 55°C. Não é necessário manter constante o valor do pH ajustado no início da operaçao de fermentação. No entanto, pode-se também manter constante o referido valor do pH eventualmente com a adição doseada de, por exemplo, amoníaco ou ácido fosfórico.

Depois de terminada a fermentação, pode-se isolar a xilanase de uma maneira convencional, do caldo de fermentação. Para isso separam-se, por exemplo, os micélios do fungo, os esporos e as substâncias residuais não dissolvidas por centrifugação ou filtração. A purificação ulterior da enzima pode realizar-se de maneira usual, por exemplo por salgamento ' com sulfato de amónio ou por precipitação do dissolvente com acetona, álcool e semelhantes. A enzima bruta assim obtida pode eventualmente ainda ser mais purificada, por exemplo mei diante filtração do gel, cromatografia de troca de iões, por electroforese de gel e semelhantes.

A xilanase preparada de acordo com a invenção possui uma elevada aetividade de xilanase. Verificou-se que com o emprego de maçarocas de milho, em vez de outras matérias pri- 5 -

mas não tratadas, tais corro cascas de cevada, palha de trigo, farelo de trigo, cascas de faia moídas, farinha de luzerna, farinha de erva de trevo, óleo de soja como fonte de C, conseguem-se actividades de xilanase surpreendentemente elevadas. Durante a aplicação de maçarocas de milho moídas grosseiramente eleva-se muitíssimo a actividade da xilanase .formada.

A xilanase preparada de acordo com a invenção contém somente actividades de exocelulose e de endocelulose reduzidas, ou até não contém nenhumas dessas actividades. A xilanase preparada com o microorganismo Thermomyceslanuginosus DSM 5826 revelou-se, em diversos ensaios, como estando isenta de exocelulose e de endocelulose. Uma xilanase isenta de exocelulose e de endocelulose desse tipo é nova e constitui igualmente o objecto da presente invenção.

Neste caso, o microrganismo Thermomyces lanuginosus DSM 5826 pode produzir a referida xilanase não apenas num meio nutritivo que contenha maçarocas de milho, mas também num meio nutritivo que, em vez das maçarocas de milho, contenha outras fontes de alimentação de carbono contendo xilano, sólidas ou dissolvidas, tais como, por exemplo, cascas de cevada, palha de milho moída, celulose não branqueada ou o próprio xilano. Surpreendentemente, no entanto, obtêm-se elevadas actividades de xilanase com as maçarocas de milho no meio nutritivo.

A xilanase isenta de exocelulose e de endocelulose preparada de acordo com a invenção, possuía as seguintes propriedades após a precipitação do etanoi e a secagem por refrigeração:

a) Estabilidade do pH (Figura 1).

Incubou-se a enzima em soluções-tampão com diversos valores do pH durante 66 horas, na temperatura de 20°C. Determinou-se a actividade de todas as amostras com 1/ de hemicelulose e valor de pH de 4,8, da seguinte maneira: incubou-se 1 ml de uma solução de substrato a 1/ em tampão de citrato de sódio (pH de 4»8) (xilano proveniente de cascas de aveia; Sigma X-0527) durante 2 minutos a 50°0 e, após se adicionarem 0,5 ml de uma solução de enzima, incubou-se durante mais 15 minutos a 50°C. Em seguida adicionaram-se e misturaram-se 3 ml de reagente de ácido dinitro-salicílico (como ensaio FPU segundo IUPAC) e 0,5 ml de NaOH 2,5 normal e aqueceu-se durante 5 minutos num banho de água em ebulição. Depois arrefeceu-se bruscamento num banho de água fria e a.valiou-se a extinção a, 540 nm em relação ao valor vazio (tampão de citrato). Deste valor deve-se deduzir a extinção da enzima (0,5 ml de enzima + 1,0 ml de tampão de citrato) e a solução do substrato (1 ml de solução de substrato a 1/ em tampão de citrato). A curva de aferição foi estabelecida com 1,0 ml de tampão de citrato e 0,5 ml de uma solução-padrão (contendo entre 0,5 e 1,5 mg de xilose/ml).

Avaliação da actividade da xilanase:

Συ/ml = mg de açúcar redutor (como xilose/ensaio) x 0,888.

Numa gama de pH compreendida entre 5,0 e 7,0 obtiveram-se 97 a 100/ da actividade original.

b) Valor óptimo do pH (Figura 2):

Determinou-se a actividade da enzima através de incubação (durante 15 minutos, a 50°C com uma suspensão de hemi celulose a 1/ em tampão de citrato (valor do pH compreendido entre 3,0 e 5,5), tampão de tris-HCl (pH entre 7,0 e 9,0) e tampão de fosfato (pH entre 5,5 e 8,0).

Intervalo ideal do pH: - 5,0 a 7,5.

c) Termoestabilidade (Figura 3):

Incubou-se a solução de enzima em 0,05 molares de um tampão de citrato (pH 4,8), a temperaturas compreendidas entre 45 θ 60° C durante 1 a 72 horas. í«ediu-se a actividade da enzima com 1$ de hemicelulose, a 50°C.

Decorridas 20 horas avaliaram-se 93$ da actividade original numa temperatura de 45°0 e 65$ da actividade original numa temperatura de 50°C.

d) Temperatura óptima (Figura 4)

Determinou-se a actividade da enzima mediante a incubação com uma suspensão a 1$ de hemicelulose em 0,05 moles de tampão de citrato, com um valor de pH de 4,8, durante 15 minutos.

Temperatura óptima: 65°C.

e) Teor de exocelulases e endocelulases e beta-glucosidase de uma solução de enzima de 385 XU/ml:

i) exocelulases e endocelulases:

No ensaio FPU segundo o IUPAC não se comprovou nenhu ma actividade da celulase.

Além disso tratou-se um tubo de diálise (celulose regenerada) durante 72 horas com a enzima num meio aquoso, e examinou-se o meio quanto à presença de glucose em que não se verificou nenhuma glucose. Pelo contrário, as enzimas contendo celulase dissolvem o tubo de diálise dentro de poucas horas.

Determinou-se ainda no decurso de uma incubação, por período de tempo prolongado, da enzima sobre celulose num valor de pH de 6,5, o tipo do açúcar redutor libertado. As avaliações decorreram depois de 3, 7, 19 θ 163 horas. Neste caso comprovou-se que, em todos os casos, tinham-se libertado somente xilose, xilobioses e xilotrioses, todavia nenhuma glucose. Com a ajuda de uma técnica de réplicas com gel de agar tingido-hidroxietilcelulose-OBR, examinou-se a respeito de actividades da endocelulase, em que não se encontrou nenhu

ma actividade. A enzima, de acordo com todas as experiências e ensaios realizados, estava totalmente isenta de celulases.

A xilanase de acordo com a invenção, num limite de comprovação posterior de 0,1 unidade/ml, também não revelou nenhuma actividade de carboximetilcelulose (endo-beta-1,4-celulase) e, portanto, também pode ser utilizada na preparação de viscose.

ii) beta-glucosidase:

Pré-incubaram-se durante 2 minutos, a 50°C, 0,6 ml de 0,05 moles de um tampão de citrato de sódio (pH de 4,8) e 0,3 ml de uma solução de enzima. Em seguida, adicionaram-se 0,3 ml de p-nitrofenol-beta-P-glucósido (4 mg/ml de tampão de citrato de sódio) e incubou-se durante 10 minutos a 50°C.

A reacção foi interrompida por adição de 2,4 ml de 1 molar de solução de NagOO^ e avaliou-se a extinção em 405 mm relativamente ao valor de vazio. Calculou-se a actividade da beta -glucosidase conforme se segue:

Ιϋ/ml = Ξ . 12

18,5 x t

E ... extinção t ... tempo da reacção (minutos)

A xilanase de acordo com a invenção revelou uma actií vidade da beta-glucosidase compreendida entre 0,2 e 0,9 IU/mlj teor de beta-glucosidase, que dissocia a celobiose em glucose, não tem nenhuma influência na actuação da xilanase de acordo com a invenção na produção de celulose, visto que, devido à ausência das endocelulases e exocelulases, não resultam nenhuns produtos provocados pela decomposição da celulose, que sejam captáveis pela beta-glucosidase.

f) Além disso, determinou-se uma actividade de beta'y

Λ 9-- Λ

-xilosidase, arabinosidase, acetilesferase, acetilxilan.esterase e mananase de, respectivamente, 100 unidades A·

g) A proporção da proteína solúvel na mistura de enzimas era de 800 mg/1, o peso molecular da proteína principal estava compreendido entre 24 θ 25 kBa e o ponto isoeléctrico da proteína principal era de 4,1.

g) ííidrolizou-se enzimaticamente a enzima purificada para se obterem 11 péptidos. Foram obtidos em sequência 4 péptidos com 8, 16, 5 ou 12 aminoácidos. Neste caso, a xilanase pesquisada revelou-se bloqueada com N terminais e, portanto, não podia ser continuada em sequência desde a extremidade com N terminais, enquanto uma xilanase que tinha sido isolada a partir do microrganismo Humicola lanuginosa sp (= Thermomyces lanuginosus) de acordo com Anand et al, Arch. Biochem. Biophys. 276, 546-553 (1990), continha como aminoácido N-terminal a arginina.

A xilanase preparada de acordo com a invenção serve para o tratamento de matérias primas vegetais contendo xilanocelulose e lignocelulose, e substâncias fibrosas obtidas a partir das mencionadas matérias primas, e pode ser utilizada, por exemplo, vantajosamente para o branqueamento, o destingimento e o acabamento aperfeiçoado da celulose durante a produção de viscose, ou para um outro pré-tratamento, como por exemplo para a remoção do xilano antes da decomposição.

Por matérias primas vegetais contendo xilano e ligno celulose, entendem-se as matérias primas a partir de árvores de folha caduca e coníferas, plantas anuais, por exemplo linho, palha, bagaço, quenafe, canas, junco, erva de elefante e outras, mas também substâncias fibrosas provenientes de matérias primas vegetais, tais como a celulose branqueada, semi-branqueada ou não branqueada ou papel velho.

Para a aplicação, a xilanase preparada de acordo com a invenção deve não ser purificada, é suficiente a remoção do meio nutritivo sólido. Depois da retirada do material nutritivo sólido, pode-se utilizar o caldo de fermentação como tal directamente para o tratamento de substâncias de fibras oriun das de matérias primas vegetais.

Durante a aplicação na indústria de celulose, pode-se tratar tanto a celulose não branqueada, como também a celulose semi-branqueada e ainda a celulose branqueada, com a xilanase preparada de acordo com a presente invenção. Mediante o tratamento da celulose quebram-se as ligações entre a hemicelulose e a lignina. Mo processo de branqueamento subsequente gasta-se, portanto, menos agente de branqueamento. Durante o tratamento da celulose semi-branqueada, após a operação de pré-branqueamento, decompõe-se o xilano residual, e por isso obtêm-se daí polpas mais puras e mais claras Determina-se o efeito do tratamento com enzima com a ajuda do índice K, que indica o teor de substância oxidável, portanto, por exemplo, o teor de lignina. Ha celulose branqueada consegue-se, por meio do tratamento com a xilanase um teor mais elevado de alfa-celulose.

Exemplo 1

Num meio nutritivo de 300 ml constituído por:

g de maçarocas de milho secas e moídas;

3,3 g de peptona de carne;

0,6 g de (NH₄)₂ S0₄;

0,45 g de ureia;

0,09 g de MgSO₄.7H₂O;

0,09 g de 0aCl₂.2H₂0;

4,5 g de KH₂ro₄;

0,3 ml de Tween 80;

0,3 ml de (1,5 g/ϊ de BiS0₄.H20; 3,45 g/1 de ZnS0₄.7H₂0; 2,0 g/1 de 0aCl₂.5H₂0) e 0,3 ml de S₂ (5 gA de

FeSO^.THgO) tiveram o valor do pH ajustado para 6 e, dentro de ura balão de agitação, foram colocados numa autoclave a 128°C, durante 60 minutos.

Inoculou-se no referido meio o microrganismo Thermomyces lanuginosus DMS 5826 em pré-cultura, e cultivou-se durante 4 dias e meio com agitação (na velocidade de 140 rpm) a 50°0.

Decorridos 4»5 dias filtrou-se e determinou-se a actividade quanto a xilanase (XLT/ml), beta-glucosidase (TTT/ /ml), carboximetilcelulase (OMC-ase/ml) e exoglucanase (EDU/ /ml).

XU/ml 389,7 após repouso de 3 dias a 4°C 395,0

IU/ml 0,29

EPU/ml não assinalável

OMC-ase/ml não assinalável

Exemplo 2

Efectuaram-se as seguintes operações em maçarocas de milho:

a) as maçarocas foram trituradas (os pedaços das maçarocas tinham um tamanho superior a 10 mm);

b) as maçarocas foram moídas grosseiramente (tamanho dos pedaços de maçarocas compreendido entre 3 e 10 mm);

c) as maçarocas foram finamente moídas (tamanho dos pedaços de maçarocas inferior a 3 mm).

1000 ml de um meio nutritivo formado por:

28,6 g de extrato de levedura;

4,23 g de (NH₄)₂ S0₄;

g de KH₂EO₄;

0,3g de EeS0₄.7H₂0;

0,3 g de M SO^.7H₂O; e

0,3 g de CaClg·2H₂0 e 25 g de maçarocas de milho secas que foram: a) trituradas, b) grosseiramente moídas e c) finamente moídas, respectivamente, tiveram 0 valor do seu pH ajustado para 6,5 e foram colocadas num balão de agitação para dentro de uma autoclave a 121°C, durante 25 minutos.

microrganismo Thermomyces lanuginosus DMS 5826 em pré-cultura foi inoculado no referido e cultivado com agitação a 50°C.

Depois de 5 dias filtrou-se e avaliou-se a activida-

de de xilanase (Σϋ/ml) nos diversos	meios:
Maçarocas	Σϋ/ml	Σϋ/ml após 1 dia de
de milho	repouso a 4°C
trituradas	764	831
grosseiramente moídas	1601	1526
finamente moídas	388	423

Exemplo 3

No meio nutritivo descrito no Exemplo 2 e da maneira ali descrita, todavia com a utilização de outras fontes de alimentação de 0, determinaram-se as seguintes actividades da xilanase:

Fonte de alimentação de 0 Actividade da xilanase (Σϋ/ml)

Maçarocas de milho 477 (50$ finamente moídas,

50$ moídas grosseiramente)

Palha de trigo Farelo de trigo

232

186

- ·

Ponte de alimentação de 0

Cascas de cevada Uiva rifide (Alga)

Luzerna moída Erva moída Casca de faia moída Amido solúvel Óleo de soja

Exemplo 4

Actividade da xilanase (XU/ml)

Cultivou-se, de forma correspondente à do Exemplo 1 o microrganismo Thermomyces lanuginosus DBS 5826, em que se utilizou 9 s de palha de trigo moída, em vez das maçarocas de milho moídas.

XU/ml após um repouso de 3 dias a 4°C

IU/ml

EPU/ml

CMC-ase/ml

104,3

123,9

0,51 não assinalável não assinalável

Exemplo 5

Cultivou-se o microrganismo Thermomyces lanuginosus DBS 5826 de uma maneira correspondente à do Exemplo 1, em que se utilizaram cascas de cevada em vez das maçarocas de milho moídas.

XU/ml 222,9 após 3 dias de repouso a 4°C 196,2

IU/ml 0,60

EPU/ml não assinalável

CMC-ase/ml não assinalável f ir Λ n7 -

Exemplo 6

Cultivou-se o microrganismo Thermomyces lanuginosus PliSS 5326 de forma correspondente à do Exemplo 1, em que se utilizaram 9 g de hemicelulose (xilano), en) vez das maçarocas de milho moídas.

EU/ml

IU/ml

3?jPU/ml

CMC-ase/ml

151,55 não assinalável não assinalável não assinalável

Exemplo 7

Tratamento da celulose de sulfato:

Aqueceu-se com água durante 1 hora até 45°C e agitou

-se celulose de sulfato seca oriunda de Ruzomberok (madeira dura). Em seguida adicionou-se xilanase preparada de maneira análoga à do Exemplo 1 e agitou-se com uma velocidade de 230 rpm.

a) 30 g de caldo de fermentação 220 g de celulose (E = 19,97)

350 g de água por grama de fibra adicionaram-se 100 XTJ de enzima

b) 90 g de caldo de fermentação 220 g de celulose (E = 19,97)

290 g de água por grama de fibras adicionaram-se 300 EU de enzima

Após a separação da celulose por filtração, determinou-se o índice E índice E: a) 17,45

b) 13,39

Claims

REIVINDICAÇÕES:

I^a. Processo para a preparação de xilanase por via microbiológica, caracterízado pelo facto de se cultivar um fungo num meio nutritivo que contém maçarocas de milho.
2 . Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterízado pelo facto de, como fungo se utilizar uma variedade de Thermomvces lanuginosus.
3 . Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterízado pelo facto de como fungo se utilizar Thermomvces lanuginosus DSM 5826.
4^a. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterízado pelo facto de se cultivar o fungo a uma temperatura compreendida entre 30 e 70θΟ e a um valor de pH entre 5,0 e 8,0.
5 . Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterízado pelo facto de se cultivar o fungo a uma temperatura compreendida entre 45° e 55°C e com um valor de pH compreendido entre 5,0 e 8,0.
6 . Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadc pelo facto de se cultivar o fungo Thermomvces lanuginosus DSR 5826 a uma temperatura compreendida entre 45 e 50 °C e a um valor de pH compreendido entre 6,0 e 7,0.

/
7 . Processo para o tratamento enzimático de matérias primas vegetais contendo xilano e lignocelulose e das fibras obtidas a partir das citadas matérias primas, caracterizado pelo facto de se empregar xilanase isenta de exocelulase e endocelulase.

a
8 . Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a xilanase isenta de exocelulase e endocelulase ser obtida por cultivo de Thermomyces lanuqinosus DSM 5826.