PT95961B

PT95961B - Processo para a preparacao de heparinas supersulfatadas

Info

Publication number: PT95961B
Application number: PT95961A
Authority: PT
Inventors: Renato Conti; Paolo Casati; Maria Beatrice Corini; Antonio Maggi
Original assignee: Iketon Farmaceutici Srl
Priority date: 1989-11-24
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 1996-12-31
Also published as: EP0432537A3; DE69016383D1; IT8922504A1; EP0432537B1; JPH03210302A; DE69016383T2; US5164378A; IE904225A1; PT95961A; ATE117697T1; IT1237518B; ES2068969T3; EP0432537A2; IT8922504A0

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

RESUMO

O presente invento dis respeito a um processo para a despol imerização e a supersulf ataçãto da heparina e divulga as heparinas supersulfatadas assim obtidas. O processo compreende o tratamento da heparina com oleum contenda de 2 a 67. de anidrido sulfúrico livre a uma temperatura de -IO a +20°C. As heparinas obtidas têm pesos moleculares compreendidos entre 2OO0 e 50O0 e um grau de sulfataçâo de 3,4 a 4,3. Todas elas s3o dotadas de um notável grau de actividade antitrombótica.

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Ο presente invento diz respeito a heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular, aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, a um processo para a sua preparação e a composiçSes •farmacêuticas que as contêm como ingredientes activos.

A Patente dos E.U.A. 4,727,063 revela heparinas de baixo peso molecular com um grau de sulfatação de pelo menos 2,5 e um peso molecular ent.re 2000 e 900©, preparadas por despolimerização e sulfatação contemporâneas com uma mistura de ácido sulfúrico e ácido clorossulfónico.

O documento atrás referido revela um conjunto de heparinas supersulfatadas; nenhuma, porém, apresenta um grau de sulfatação até 3,5.

A Patente Europeia EP 214,379 revela um processo para a sulfatação de g1icosaminog1icanos (GAG), em que um determinado GAG é transformado num seu sal solúvel num solvente orgânico específico, o referido sal é dissolvido nesse solvente orgânico e a solução assim obtida é tratada com um reagente de sulfatação convencional. 0 supersulfatados supersulfatados processo atrás referido permite obter GAGs sem provocar despo1imerização, mas os revelados não apresentam, à excepção

GAGs de um dissacárido, um grau de sulfatação superior a 3,41.

Pt Patente dos E.U.A 3,454,560 revela um processo para a despolimerização e sulfatação de sulfato de condroitina por meio de ácido sulfúrico, numa concentração não inferior a 357. p/p. De acordo com este documento, d ácido sulfúrico uado na despolimerização e sulfatação pode cortter um outro agente de sulfatação, tal como anidrido sulfúrico ou ácido clorossulfónico, mas d documenta especifica que, mesmo quando a reacção é levada a cabo num ambiente deste tipo, apenas o ácido sulfúrico participa na reacção de sulfatação.

Descobriu-se que, no caso das heparinas, é possível obter uma heparina supersulfatada de baixo peso molecular, fazendo reagir a referida heparina com oleum.

Descobriu-se surpreender)temente que o anidrido sulfúrico contido no oleum é necessário à sulfatação, e que a utilização de apenas ácido sulfúrico resulta somente na despolimerização sem sulfatação apreciável, podendo de outro modo ocorrer a destruição completa.

Descobriu-se também que, por meio de reacção com oleum, se obtêm novas heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular, com um peso molecular num intervalo de valores relativamente pequena e um grau de sulfatação maior do que o que foi observado em todas as heparinas supersulfatadas descritas até â data.

Descobriu-se igual mente que as novas heparinas supersul f atadas de baixo peso molecular obtidas a partir de heparina por reacção com oleum possuem uma actividade anticoagulante extraordinariamente baixa, uma excelente actividade antitrombótica e uma actividade 1ipoproteinalipásica substancialmente mais elevada do que a de quiasquer heparinas de baixo peso molecular conhecidas até à data.

Finalmente, descobriu-se com surpresa que as heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular de acordo com o presente invento, ao contrário da heparina e dos produtos da Patente dos E.U.A. 4,727,063, são agentes inibidores de trombina poderosos.

Deste modo, a presente inventa, de acordo com um dos seu.s aspectos, diz respeito a novas heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular consistindo em misturas de componentes heparínicos com as seguintes caracteristicas:

- peso molecular entre 2000 e Dalton;

- grau de sulfatação, expresso sob a forma da razão sulfato/carboxilato, entre 3,5 e 4,5;

- actividade antitrombínica directa, não mediada pela An titrombina III;

e aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Entre as heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do presente invento, são particularmente vantajosas aquelas que possuem pesos moleculares entre 2900 e 4500, preferindo-se as que possuem pesos moleculares entre 3000 e 4000. Entre estas últimas, uma mistura de componentes heparínicos com um peso molecular médio de 3300 possui propriedades específicas.

peso molecular das heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular de acordo com o invento foi determinado por meio de cromatograf ia de permeação de gel em CLEF¹ sobre uma coluna TSÍ< SW 2000.

As heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do preesnte invento revelam um máximo de absorção no espectro UV a 312 nm. A existência de um tal máximo constitui uma característica peculiar dos produtos do presente invento, uma vez que não é apresentada nem pela heparina nem pelos produtos revelados na

Patente dos E.U.A. 4,727,063. Esse máximo foi determinado numa solução aquosa contendo 10 mg/ml das heparinas referidas.

Relativamente à análise elemental, as heparinas supersu.lfatadas de baixo peso molecular do presente invento apresentam uma razão carbono/azoto (C/N) entre 11,7 e 12,1 (numa base molar) e u.ma razão carbono/enx.ofre (C/S) entre 2,5 e 2,9.

grau de sulfatação das heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do presente invento é, de preferência, de pelo menos 3,6, situando-se entre 3,6 e 4,5, de preferência entre 3,65 e 4,3.

De acordo com Dutro dos seus aspectos, invento diz respeito a um processa para a preparaç:ão supersulfatadas de baixo pese molecular com pesos entre 2000 e 5000 e um grau de sulfatação entre 3, compreende o tratamento da heparina com oleum a uma entre 10 e 30 *C.

o presente de heparinas molecu1 ares 5 e 4,5, que temperatura

A heparina usada como material de partida pode ser heparina convencional ou qualquer outra heparina disponível no mercado, desde que seja de boa qualidade. De um modo geral, utiliza-se um sal de sódio de heparina, mesmo que outros sais possam ser convenientemente usados. é preferível que a heparina de partida seja anidra, pelo que é apropriada a realização de uma operação de desidratação prévia, por exemplo a uma temperatura entre 50-60’^:'C.

D oleum usado para a reacção de despolimerização e sulfatação contém de preferência, entre 2 e 77. de anidrido sulfúrico livre, e é preparado extemporaneamente por adição de oleum com anidrido sulfúrico a 207. a ácido sulfúrico concentrado até se dar a conversão completa da ãgua em ãcido sulfúrico e na presença da quantidade desejada de anidrido sulfúrico livre.

A concentração de heparina em oleum pode variar entre cerca de 5 e cerca de 20% p/v. Na prática, é conveniente usar entre 5 e 15 ml de oleum por cada grama de heparina.

□ tempo de reacção varia entre alguns minutos e mais de uma hora e depende obviamente da temperatura; na prática, é possível trabalhar a uma temperatura entre -1Θ e +30°C, durante um período de tempo entre 5--10 minutos e 75 minutos.

produtD final desejado é recuperado por processos conhecidos, neutralizando o ácido sulfúrico com uma base alcalina, de preferência hidróxido de sódio e, após remoção do sulfato alcalino assim obtido, separando a heparina supersulfatada de baixo peso molecular por meio de diálise e, facultativamente, 1iofilização subsequente.

Preparam-se produtos particularmente interessantes sujeitando o produto dessa1inizada a filtração em gel, de modo a obter heparinas supersulfatadas com distribuição de pesos moleculares num intervalo de valores muito estreito que possuem, consequentemente, uma actividade farmacológica mais bem definida.

A heparina supersulfatada de baixa peso molecular é isolada sob a forma do sal do hidróxido alcalino utilizado, de preferência sob a forma do sal de sódio, e o referido sal pode ser transformado noutro, por exemplo no sal de cálcio, por meio de uma reacção tíe permuta, usando uma resina de permuta iónica.

Os sais de aminoácidos são muitD interessantes, em particular os de lisina. e arginina. Estes sais são obtidos por meio, em primeira lugar, da percolação do sal de sódio através de uma coluna de permuta catiónica, por exemplo Amberlite IR 120 na forma, ácida, a baixa temperatura (cerca de 5*0 , da recolha do material que resulta da eluição directamente numa solução aquosa do aminoácido e do isolamento do sal por 1iofi1isação.

Em comparação com os processo conhecidos de supersulfatação de heparina, o processo de acordo com o presente invento possui vantagens admiráveis. Especificamente, em comparação com o processo revelado ria Patente Europeia EP 214,879, o processa de acordo com o invento não utiliza solventes orgânicos não necessitando consequentemente de etapas de eliminação e recuperação de solventes; além disso, o processo de acordo com o invento pode usar directamente heparina disponível rio mercado sem ser necessário transformá-la num sal solúvel num solvente orgânico. Em comparação com o processo revelado na Patente dos E.U.A. 4,727,063, o processo de acordo com o invento não causa a produção de gases nem a formação de espumas que caracterizam o processo conhecido; além disso, o processo de acordo com o presente invento difere do da Patente dos E.U.A. 4,727,063 no facto de neste a presença de água no meio de reaeção ser critica e controlar o grau de despolimerização, enquanto que no caso do processo de acordo com o presente invento o meio de reaeção é estritamente anidro, o que é surpreenden te.

As heparinas supersu1fatadas de baixo peso molecular de acordo com o presente invento revelam propriedades farmacolóqicas extremamente interessantes, melhores e qualitativamente diferentes de todas aquelas que apresentam os produtos correspondentes descritos na técnica anterior.

Em particular, os novos produtos de acordo com o presente invento revelam uma actividade anticoagulante extremamente reduzida, muito inferior à revelada pela heparina. De acordo com o métc-do in vitro USP, as heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do presente inventa possuem uma actividade de 18-22 IU/mg, enquanto as heparinas injectáveis disponíveis no mercada possuem uma actividade de 175-18€i IU/mg, que ê cerca de dez vezes superiores.

Pelo contrário, a actividade antitrombótica das heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do presente invento é substancialmente idêntica à da heparina, de acordo com o teste de trombose induzida por esta.se na jugular de coelhos (NIADA R. et al . , Pharmac. Res. Commun. 11 , 349, 1979).

Além disso, em comparação com a heparina, as heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do presente invento têm a vantagem de possuírem uma menor tendência para causar hemorragias, tal como se provou com o teste de tempo de hemorragia em ratos (DEJANA et al., Thromb. Haemost. 48, 108, 1982) em que os produtos do presente invento revelaram uma actividade mais de dez vezes inferior.

As heparinas supersu1fatadas de baixo peso molecular do presente invento revelam também uma actividade 1ipoproteinalipásica extremamente elevada, muito superior à actividade da heparina e heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular conhecidas até â data.

A actividade lipopcoteinalipásica de um produto representativo do presente invento, denominado SH-40/1 (ver Exemplo 1), foi determinada no plasma de coelhos após administração subcutânea, sendo comparada com a de uma heparina sódica disponível no mercado (Diosynth lote 1334) e a de um produto preparado de acordo com o Exempla 1 da Patente dos E.U.A. 4,727,063 (AH-16, grau de sulfatação 3,Ô). Os produtos examinados foram administrados a coelhos da Nova Zelândia pesando 2,6-2,8 kg e que se encontravam em jejum desde a noite anterior. Colheitas de sangue realizadas em citrato Ο-3Ο-60-90-12Ο-18Θ-24Ο minutos após a administração.

{

A actividade 1ipoproteinalipásica foi determinada doseando os ácidos gordos livres libertados da incubação do plasma com um substrato contendo triglicéridos (Intralipid). Neste teste, o produto SH-4C/1 revelou ser dez vezes mais activa )

do que a heparina e duas vezes mais activo do que o produto que serviu de termo de comparação, AH-16.

Novamente, as heparinas supersulfatadasde baixo peso molecular do presente invento, e em particular aquelas que são obtidas após fraccionamento, constituem inibidores directos de trombina e este facto constitui outra propriedade surpreendente e peculiar.

Essa característica foi destacada no teste in vitro de actividade amidolítica relativamente à trombina humana, quer na presença quer na ausência de antitrombina III (AT III). A . trombina actua sobre um substrato sintético Chromozym TH Boehringer (Tdsí1-Slu-Pro-Arg-p-nitro anilido), libertando p-nitroani1ina, que possui uma absorção forte a 405 nm. A variação de CD a 405 nm é proporcional à quantidade de trombina no teste. Na presença de agentes inibidores, a variação QD^_f)5 é

J reduzida. Recorrendo a este teste observou-se que, ao contrário da heparina, que proporciona uma fraca inibição directa de trombina e uma inibição forte na presença de AT III, e da heparina supersu1fatada da Patente dos E.U.A. 4,727,063, que proporciona uma forte inibição directa de trombina e um aumenta da inibição na presença de AT III, o produto do presente invento proporciona uma forte inibição directa da trombina e nenhum aumento do grau de inibição na presença de AT 111.

Assim, descobriu-se surpreendemtemente que as heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do presente invento não possuem afinidade relativamente a AT III.

As heparinas supersu1fatadas de baixo peso molecular do presente invento apresentam uma toxicidade extremamente baixa e são bem toleradas quando administradas por via oral ou parentérica. F'or isso, constituem valiosos ingredientes activos para medicamentos úteis como agentes antrombóticos e anti-arterioescleróticos. Em particular, a sua elevada actividade lipoproteinalipásica fá-las potenciais agentes anti-hiper1ipémicos extremamente interessantes.

De acordo com outro dos seus aspectos, o presente invento proporciona, por conseguinte, composições farmacêuticas contendo, como ingredientes activos, as heparinas supersulfatadas de baixo peso molecular do invento.

As composições farmacêuticas do presente invento podem ser formuladas para efeitos de administração oral, sublingual, subcutânea, intravenosa, transdérmica ou rectal em unidades de dosagem e misturadas com excipientes ou veículos farmacêuticos. Formas de dosagem convenientes incluem, entre as que se destinam a administração oral, comprimidas, pás, granulados, e, entre as que se destinam a administração parentérica, soluções, em especial para admin ist.ração subcutânea, intramuscular ou intravenosa.

As composições farmacêuticas do presente invento são administradas nas formas e pelas vias atrás referidas, a animais e seres humanos em caso de um aumento patológico de trombina e lípidos, em particular para prevenir tromboses e no tratamento da arterioesclerose.

fi quantidade diária nas indicações atrás dadas pode variar entre 0,1 e ICO mg/kg e cada unidade de dosagem pode conter de 1 a 1Ο0Θ mg do ingrediente activo. Estas unidades de dosagem podem ser administradas de 1 a 3 vezes por dia para o tratamento de problemas de coagulação e do metabolismo dos lípidos e da arterioesclerose.

□s exemplos que se seguem constituem uma ilustração adicional do inventa. Os perfis CLEP das produtos obtidos são apresentados na fig. 1.

EXEMPLO 1 g de heparinato de sódio (de mucosa de porco Diosynth lote 1334), secos no vácuo a 60*C durante 65 horas são adicionados sob forte agitação a 400 ml de oleum com 4% SO-, mantido è temperatura de +5*C. Após agitação a +5*C durante 10 minutos, a temperatura é aumentada gradualmente para +20*C e mantida a esse valor durante 30 minutos. fi mistura de reacção é depois vertida sobre 5 1 de água fria (2-3*0, adicionando-se ao mesmo tempo uma solução de hidróxido de sódio a 30% (p/v) de modo a obter um valor de pH entre 5 e 9. fi solução é mantida a 2-3*C de um dia. para o outro e o sulfato de sódio cristalizado é separado por meio de filtração no vácuo.

□ filtrado (cerca de 7 1) é separado do sal por meio de ultrafiltração (Amicon DC 10 LA com membrana S ΙΟ X3) (cut off a. 3000) , concentrado por meio de ultrafiltração e liofilizado.

Obtêm-se 47,4 g da produto (SH 40), rendimento 94,817., com as seguintes características:

- análise elemental C 15,687

H 2,937 N 1,567 S 16,487

- razão sulfato/carboxilato 4,30

- peso molecular médio 4100 Dalton.

EXEMPLO 2 g de heparinato de sódio (de mucosa de porco Diosynth lote 1334) , secos no vácuo a 6O'^:'C durante 48 horas, são adicionados sob forte agitação a 35 ml de oleuin com 27 SO, .j» mantida a +10'-'C.

A suspensão é agitada durante 5 minutos a 10°C e depois a temperatura é aumentada para 25°C, prosseguindo-se com a agitação durante mais 25 minutos. A solução é depois neutralizada, vertendo-a lentamente sobre 500 ml de água arrefecida para 2-3'-C, adicionando-se ao mesmo tempo solução de hidróxido de sódio a 3C7 e ajustando o pH para um valor entre 5 e 9. Após separação dc« sulfato de sódio cristalizado, a solução é concentrada sob vácuo e, após eliminação de sulfata de sódio adicional, é aplicada a uma coluna Sephadex G 50 (K50/100) equilibrada com NaCl Θ,3Μ. Os primeiros 1000 ml de eluato são postos de parte e recolhem-se os 250 ml seguintes, que são separados de sais e

concentrados por meio de ultrafi1tração numa célula Amicon 8400 com uma membrana YM2 (cut off a 1000).

Obtêm-se por meio de 1iofi1ização 1,3 g de produto (SH 40/1), rendimento 36,167-, com as seguintes características:

- análise elementai C 15,43%

H 2,89%

Ν 1,53% ) S 16,33%

- razão sulfato/carboxilato 4,24

- peso molecular médio 3300 Dalton.

EXEMPLO 3 g de heparinato de sódio (de mucosa de porco Diosynth lote 1334), secos no vácuo a 60*C durante 48 horas, são adicionados a 35 ml de oleum com 2% S0„ __p, •_--R a -5’-’C.

.)

Após agitação durante 15 minutos a -5*0, a temperatura é aumentada e mantida a 20*C durante 60 minutos. A mistura de reacção é neutralizada vertendo-a lentamente sobre 500 ml de gelo-águ.a, e adicionando simultaneamente uma solução de hidróxido de sódio a 307. de modo a manter o valor do pH entre 5 e 9. A solu.ção é arrefecida (4-5°C) de um dia para o outro e, após separação do sulfato de sódio cristalizado, é concentrada sob vácuo para. 6€> ml e submetida a diálise contra água em sacos de diálise SPECTRAPOR 1 (cut off” a 6000-8000). Finalmente, a solução é concentrada sob vácuo e liofilizada. Obtêm-se 5,5 g de produto <SH 40/2), rendimento 1107., com as seguintes características:

- análise elemental C 15,717

H 2,997 Ν 1,557 S 16,637

- ra.zão sulfato/carboxilato 4,23

- peso molecular médio 3500 Dalton.

EXEMPLO 4 g de heparinato de sódio (de mucosa de porco Diosynth lote 1334), secos no vácuo a 60*C durante 4B horas, são adicionados a 400 ml de oleum com 3,57 de SO_j. mantido a +10*C.

Após agitação durante 5 minutos a +Í0*C, a temperatura é aumentada e mantida a +25°C durante 30 minutos. A mistura de reacção é neutralizada vertendo-a sabre 5 1 de gelo-água, a que se adiciona ao mesmo tempo uma solução de hidróxido de sódio a 307 (p/v). Após a separação do sulfata de sódio, que cristaliza a. +5-C, a solução (cerca de 7 1) é submetida a ul trafi 1 tração com um ultrafiltro AMICON DC 10 LA com dispositivo de carga em espiral S 10 Y3, cut off a 10000. 0 permeato é concentrado usando o mesmo ultrafiltro e uma membrana S 10 Y3 com cut off a 3000, lavado até è eliminação completa de sulfato de sódio e liofilizado. Obtém—se 12,95 g de p>roduto (SH 41 Β) , rendimento 377, com as seguintes características:

análise el emen tal C ló,977.

H 3,267.

N 1,697.

S 16,197.

razão sulfato/carboxilato 3,65 peso molecular médio 3650 Dalton.

EXEMPLO 5

SO g de heparinato de sódio (de mucosa de porco Diosyrtth lote 1334), secos no vácuo a 60^C'C durante 48 horas, são adicionados a 400 ml de oleum com 2,57. de SD_ a ~5*C.

Após agitação durante 20 minutos a -5°C, a temperatura é aumentada e mantida a +20*C durante 50 minutos, sendo depois baixada novamente para +5'-C; a mistura de reacção é neutralizada vertendo-a sobre 5 1 de çelo-áqua, adicionando-se ao mesmo tempo solução de hidróxido de sódio a 307. (p/v). A reacção é depois levada a cabo tal como se descreve no exemplo 4. Obtêm—se 25,4 q de produto (SH 43 B), rendimento 50,297., com as seguintes carac— terísticas:

- análise elemental C 17,227.

H 3,227.

Ν 1,677.

S 15,887

- razão sulfato/carboxilato 3,85

EXEMPLO 6 g do produto obtido tal como se descreve no exemplD 3 são dissolvidos em 20© ml de água destilada e convertidos na forma ácida fazendo-os passar através de 4©© ml de resina de permuta iónica IF: 12© H⁺ numa coluna de cromatograf ia arrefecida para 5°C. A solução obtida é neutralizada com 64© mg de hidróxido de cálcio suspenso em 1© ml de água destilada e é liofilizada. Obtêm—se 5,14 g de produto consistindo em sal de cálcio de heparina supersu1fatada.

EXEMPLO 7 g do produto obtido tal como se descreve no exemplo 3 são dissolvidos em 2©© ml de água destilada e convertidos na forma ácida fazendo-os passar através de 4©© ml de resina de permutei iónica IF: 12© H⁺ numa coluna de cromatografia arrefecida para. 5'^:'C. A solução obtida é neutralizada com 2,64 g de base arginina e liofilizada. Obtêm—se 7,58 g de produto consistindo em sal arginina de heparina supersulfatada.

EXEMPLO 8 g do produto obtido tal como se descreve no exemplo 3 são dissolvidos em 200 ml de água destilada e convertidos na forma ácida fazendo-os passar através de 400 ml de resina de permuta iónica IR 120 H⁺ numa coluna de cromatografia arrefecida para 5°C. A solução obtida é neutralizada com 2,76 g de base lisina e lofilizada. Obtem-se 7,6 g de produto consistindo em sal lisina de heparina supersulfatada.

EXEMPLO 9

100 g de heparinato de sódio (de mucosa de porco Diosynth lote 1583), secos no vácuo a Ó0*C durante 48 horas são adicionados sob agitação forte a 400 ml de oleum com 27. de S0-. mantido a +12°C.

A suspensão é agitada durante 5 minutos a + 12°C e depois a temperatura é aumentada para 25°C e a suspensão mantida sob a agitação a essa temperatura durante mais 25 minutos. A solução é depois neutralizada vertendo-a sobre 10 1 de gelo-água, adicionando-se ao mesmo tempo uma solução de hidróxido de sódio a 307. de forma a menter o valor do pH entre 5 e 9. A solução neutralizada, cujo pH final é 6,7, é deixada à temperatura de 5^OC de um dia para o outro. 0 sulfato de sódio, que se separa por meio de cristalização. é eliminada por meio de filtração no vácuo; o filtrado, com um volume de cerca de 20 1, é concentrado e separado de sais num ultrafiltro Amicon DC 10 com dispositivo de carga em espiral S 10 Y3 (cut off a 3000).

A solução concentrada (500 ml) é depois submetida a cromatografia sobre uma columa Amicon G 180x1000 contendo 25 1 de

Sephadex G 50 (Pharmacia) e equilibrada com NaCl 0,3Μ. Os primeiros 7500 ml de eluato são postos de parte e recolhem-se os

4500 ml seguintes, que são concert trados e separados de sais num

IS ultrafiltro de célula off a 1000).

Amicon 2000 sobre uma membrana Υ1Ί2 (cut

Obtêm-se 500 ml de solução, e 35g de produto (SH 14 D) por meio de liofilização, com as seguintes características:

- análise elemental C 16,857.

H 2,397.

N 1,637.

S 16,507.

- razão sulfato/carboxilato 4,33

- peso molecular médio 3436 Dalton.

Claims

REIVINDICACSES lâ - Processo para a preparação de heparina supersulfatada de peso molecular reduzida, sendo as referidas heparinas constituídas por uma mistura de componentes heparínicos com as seguintes caracterlsticas:

- peso molecular entre cerca de 2000 e 5000

- grau de sulfatação expressa coma uma razão sulfatos/carboxilos de 3,5 a 4,5

- actividade ari ti trombínica directa, não mediada pela Antitrombina III;

caracterizado por se fazer reagir uma heparina previamente desidratada, a uma temperatura de 50-60*C, com oleum (ácido sulfúrico fumante), contendo de 2 a 77. de trióxido de enxofre livre, a uma temperatura compreendida entre -10 e +30.
2§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a concentração de partida da heparina em oleum ser de cerca de 2 a cerca de 77. p/v e par se usarem 5 a 15 ml de oleum por cada grama de heparina.

3â - Processa de acorda cam qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o produto final ser isolada sob a forma de um sal alcalino por neutralização com a base alcalina correspondente, por se separar d sulfato alcalino que se formou e por se isolar o produto por diálise ou ultrafi1 tração e se possível por 1iofi1ização.

4â rizado por o

- Processo de acorda com a produto obtido sob a forma reivindicação 3, caractede um sal ser submetido a fraccianamento por cromatografia de gel numa coluna de Sephadex G 50.

5ê - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se usar o hidróxido de sódio como base alcalina e por □ produto final ser isolado como sal de sódio.

óê - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o sal de sódio ser transformado em sal de cálcio por meio de uma resina de permuta iónica.

7ê - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o sal de sódio ser transformado em sal com um aminoácido, por percolação de uma solução do referido sal de sódio através de uma resina de permuta de catiSes sob a forma de H⁺ e por se recolher o eluato directamente numa solução do aminoácido numa quantidade adequada para se obter um pH de cerca de 7.

Bã - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o aminoácido ser a arginina.

9â - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o aminoácido ser a lisina.

Lisboa, 22 de Novembro de 1990