NO301081B1

NO301081B1 - Subtilisinmutant med endret proteolytisk aktivitet eller stabilitet, DNA som koder for mutanter, ekspresjonsvektor, vertscelle samt enzymatisk renseblanding i stand til å nedbryte proteiner

Info

Publication number: NO301081B1
Application number: NO912567A
Authority: NO
Inventors: Robert Mark Caldwell; David Aaron Estell; Thomas Paul Graycar
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1991-06-28
Publication date: 1997-09-08
Also published as: TR25991A; DE69034195T3; EP0451244B9; ATE174961T1; KR970004938B1; NO912567L; IE62771B1; EP0775749B1; MA22573A1; DE69032852T2; US5185258A; EP0775749A1; FI103052B1; EP0451244A1; ES2125224T3; AU6634190A; DE69034195T2; DK0775749T4; BR9006993A; IE903905A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye subtilisinmutanter med endret proteolytisk aktivitet eller stabilitet, og med en

aminosyresekvens hvor en eller flere aminosyreresiduer av en precursor subtilisinmutant, spesielt de ved posisjonene tilsvarende residuer +123 og/eller +274 i Bacillus amylo-liquefaciens subtilisin, har blitt erstattet med en annen aminosyre, som angitt i krav 1. Slike mutante subtilisiner blir generelt erholdt ved in vitro-modifisering av en for-løper DNA-sekvens som koder for et naturlig forekommende eller rekombinant subtilisin til å kode for substitusjonen av en eller begge disse aminosyreresiduer i en precursor aminosyresekvens alene eller i kombinasjon med andre substitusjoner, innskudd eller utelatelser i precursor aminosyresekvensen.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Serinproteaser er en undergruppe av karbonylhydrolase. De omfatter en mangfoldig klasse av enzymer med et bredt spesifisitetsområde og biologiske funksjoner. Stroud, R.M.

(1974), Sei. Amer., 131, 74-88. Til tross for serinprote-asenes funksjonelle mangfoldighet har minst to genetisk særpregede enzymfamilier nærmet seg deres katalytiske maskineri: subtilisinene og de mammaliske chymotrypsinrelaterte og homologe bakterielle serinproteaser (f.eks. trypsin og SL. <q>resius trypsin). Disse to familier av serinproteaser viser bemerkelsesverdig like katalysemeka-nismer. Kraut, J. (1977), Ann. Rev. Biochem. , 46, 331-358. Videre, selv om primærstrukturen er urelatert, bringer tertiærstrukturen av disse to enzymfamilier sammen en konservert katalytisk triade av aminosyrer som består av serin, histidin og aspartat.

Subtilisin er en serin endoprotease (MW 27.500) som blir utskilt i store mengder fra et stort antall av Bacillus-arter og andre mikroorganismer. Proteinsekvensen av subtilisin har blitt bestemt fra minst fire forskjellige arter Bacillus. Markland, F.S. et al., (1983), Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540. Den tredimensjonale krystallografiske struktur av Bacillus amyloli<g>uefaciens subtilisin til 2,5 Å resolusjon har også blitt rapportert. Wright, C.S. et al., (1969), Nature, 221, 235-242; Drenth, J. et al., (1972), Eur. J. Biochem, 26, 177-181. Disse studier indikerer at selv om subtilisin er genetisk urelatert til pattedyr-serinproteasene, har den en lignende aktiv setestruktur. Røntgenstråle-krystallstrukturen for subtilisin inneholdende kovalent bundne peptid-inhibitorer (Robertus, J.D. et al. (1972), Biochemistry, 11, 2439-2449) eller produktkomplekser (Robertus, J.D. et al., (1976), J. Biol. Chem, 251, 1097-1103) har også gitt informasjon an-gående det aktive sete og en forsøksvis substratbindende kløft hos subtilisin. I tillegg har et stort antall kine-tiske og kjemiske modifikasjonsstudier av subtilisin blitt raportert (Philipp, M. et al., (1983), Mol. Cell. Biochem., 51, 5-32; Svendsen, B (1976), Carlsbera Res. Comm, 41, 237-291; Markland, F.S. Id.), såvel som minst én rapport hvor sidekjeden av metionin ved residuum 222 av subtilisin ble konvertert med hydrogenperoksyd til metioninsulfoksyd

(Stauffer, D.C. et al., (1965), J. Biol. Chem, 244, 5333-533 8) og sidekjeden av serin ved residuum 221 konvertert til cystein ved kjemisk modifikasjon (Polgar et al.,

(1981) , Biochimica et Biophysica Acta, 667, 351-354) .

US patent nr. 4.760.025 og EPO publikasjon nr. 0 130 756, publisert 9. januar 1985 beskriver begge modifiseringen av subtilisin-aminosyreresiduer som tilsvarer posisjonene i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin tyrosin -1, aspartat +32, asparagin +155, tyrosin +104, metionin +222, glycin +166, histidin +64, glycin +169, fenylalanin +189, serin

+33, serin +221, tyrosin +217, glutamat +156 og alanin + 152. EPO publ. nr. 0 251 446, publisert 7. januar 1988 beskriver andre aminosyreresiduer i Bacillus amylolique-faciens subtilisin og deres ekvivalenter som kan modifiseres ved hjelp av substitusjon, innsetning eller delesjon,

og som med modifikasjoner kan kombineres med residuene som er identifisert i U.S. patent nr. 4.760.025, for å danne anvendelige subtilisinmutanter. De spesielle residuer identifisert heri er imidlertid ikke angitt i disse referanser.

På lignene måte beskriver PCT-publikasjon nr. WO 89/09819 og WO 89/09830, begge publisert 19 oktober 1989, subtili-sinenzymer dannet ved å mutere en nukleotidsekvens som koder for et subtilisin. Flere aminosyreresiduer-er identifisert i hver av disse publikasjoner som kan modifiseres på en slik måte. Imidlertid, som med de ovenfor nevnte referanser, identifiserer ingen av disse publikasjoner residuene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Følgelig er det et mål heri å fremskaffe karbonylhydrolasemutanter inneholdende substitusjonen av aminosyreresiduer i en precursor karbonylhydrolase tilsvarende posisjonene +123 og/eller +274 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin. Slike mutanter har generelt minst én egenskap som er forskjellig fra samme egenskap hos subtilisinprecursoren hvorfra aminosyren av nevnte mutant er avledet.

Det er et ytterligere mål å fremskaffe DNA-sekvenser som koder for slike subtilisinmutanter, såvel som ekspresjonsvektorer inneholdende slike muterte DNA-sekenser. Videre er et annet mål for oppfinnelsen å fremskaffe vertsceller transformert med slike vektorer, såvel som vertsceller som er i stand til å uttrykke slikt DNA for å danne karbonylhydrolasemutanter, enten intracellulært eller ekstracellu-lært .

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen innbefatter ikke-naturlig forekommende subtilisinmutanter med forskjellige proteolytisk aktivitets-, stabilitets- og/eller effektivitetskarakteristika, sammenlignet med precursor karbonylhydrolase hvorfra aminosyresekvensen av mutanten er avledet. Precursor subtilisinet kan være et naturlig forekommende subtilisin eller rekombinant subtilisin. Spesielt har slike subtilisinmutanter en aminosyresekvens, ikke funnet i naturen, som er avledet ved å erstatte ett eller flere aminosyreresiduer av en precursor karbonylhydrolase med en eller flere forskjellige aminosyrer. Det ene eller de flere aminosyreresiduer av precursorenzymet tilsvarer posisjonene Asn +123 og/eller Ala +274 av Bacillus amyloliguefaciens subtilisin eller ekvivalente aminosyreresiduer i andre subtilisiner.

Oppfinnelsen innbefatter også muterte DNA-sekvenser som koder for slike subtilisinmutanter.

Disse mutante DNA-sekvenser er avledet fra en precursor DNA-sekvens som koder for et naturlig forekommende eller rekombinant precursorenzym. De mutante DNA-sekvenser er avledet ved å modifisere precursor DNA-sekvensene til å kode for substitusjonen av en eller flere spesifikke aminosyreresiduer kodet for av precursor DNAS-sekvensen som tilsvarer posisjon +123 og/eller +174 i Bacillus amyloliguef aciens . Disse rekobinante DNA-sekvenser koder for subtilisinmutanter med en ny aminosyresekvens og generelt minst én egenskap som er i hovedsak forskjellig fra samme egenskap av enzymet kodet for av precursor subtilisin DNA-sekvensen. Slike egenskaper innbefatter proteolytisk aktivitet, stabilitet og/eller forbedrede effektivitetskarakteristika.

Oppfinnelsen innbefatter også procaryote og eucaryote subtilisiner med et forskellig aminosyreresiduum, såsom serin, ved posisjonene ekvivalent til Asn +123 i Bacillus am<y>loliguefaciens subtilisin og til subtilisin med forskjellige aminosyreresiduer ved posisjonene ekvivalent til posisjon +274 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin.

Oppfinnelsen omfatter ytterligere ekspresjonsvektorer som inneholder slike mutante karbonylhydrolase DNA-sekvenser, såvel som vertsceller transformert med slike vektorer, som er i stand til å fremstille slike mutanter. Oppfinnelsen angår også detergentblandinger omfattende subtilisinmutantene ifølge oppfinnelsen.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser DNA- og aminosyre sekvensen for Bacillus amyloliguefaciens subtilisin og et partielt restriksjons-kart av dette gen. Fig. 2 viser de konserverte aminosyreresiduer blant subtilisiner fra Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus subtilis varI168 og Bacillus licheniformis (carlsbergensis) . Figurene 3A og 3B viser aminosyresekvensen av subtilisin fra Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus subtilis varI168 og Bacillus licheniformis. Fig. 4 viser aminosyresekvensen av tre subtilisiner. Den øvre linje representerer aminosyresekvensen av subtilisin fra Bacillus am<y>loliguefaciens (enkelte ganger også referert til som BPN'). Andre linje viser aminosyresekvensen av subtilisin fra Bacillus lentus (subtilisin 309 i PCT publikasjon nr. WO 89/06276) . Nedre linje representerer aminosyresekvensen av en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen betegnet GG-RYSA. Symbolet <*> betegner fravær av spesielle aminosyreresiduer sammenlignet med subtilisin

BPN' .

Fig. 5 viser konstruksjonen av plasmid pGG A274.

Fig. 6 viser konstruksjonen av pGG-KVNA, som er et inter-mediat for plasmid pGG-RYSA. Fig. 7. viser oligonukleotid-duplexmetoden brukt for å konstruere et syntetisk Bacillus lentus subtilisin-gen. Fig. 8 viser strategien for å konstruere et syntetisk gen som koder for Bacillus lentus subtilisin. Fig. 9 viser kassetten som ble brukt for å danne substitusjoner i DNAet ved kodonposisjon +123 ved kassettmutagenese. XXX representerer kodonet modifisert for å kode for aminosyresubstitusjonen ved posisjon +123. Fig. 10 viser DNA- og aminosyresekvensen av en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, hvor DNA-sekvensen er et syntetisk DNA. DNA i denne figur er blitt modifisert til å kode for arginin ved posisjon 27, serin ved posisjon 78, tyrosin ved posisjon 104, serin ved posisjon 123 og alanin ved posisjon 274.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det er blitt funnet at in vitro-mutasjoner i karbonylhydrolase-subtilisinet ved et aminosyreresiduum ekvivalent til +123 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin, gir subtilisinmutanter som oppviser endret proteolytisk aktivitet i forhold til precursorsubtilisiner.

Det er også blitt funnet at in vitro-mutasjon ved residuer ekvivalent til +274 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin gir subtilisinmutanter som oppviser endret stabilitet, f.eks. modifisert autoproteolytisk stabilitet. I enkelte tilfeller oppviser disse sistnevnte mutanter også bedret effekt når de brukes i detergente blandinger.

Subtilisiner tilhører karbonylhydrolaser som er enzymer som hydrolyserer forbindelser inneholdende

0

II

C-X

-bindinger hvor X er oksygen eller nitrogen. Slike innbefatter naturlig forekommende karbonylhydrolaser og rekombinante karbonylhydrolaser. Naturlig forekommende karbonylhydrolaser innbefatter i hovedsak hydrolaser, f.eks. pep-

tidhydrolaser, såsom subtilisiner eller metalloproteaser. Peptidhydrolaser innbefatter a-aminoacylpeptidhydrolase, peptidylaminosyrehydrolase, acylaminohydrolase, serinkar-boksypeptidase, metallokarboksypeptidase, tiolproteinase, karboksylproteinase og metalloproteinase. Serin-, metallo-, tiol- og syre-proteaser er innbefattet, såvel som endo- og eksoproteaser.

"Rekombinant subtilisin" refererer til et subtilisin hvor DNA-sekvensen som koder for det naturlig forekommende subtilisin er modifisert til å gi en mutant DNA-sekvens som koder for substitusjonen, innsetningen eller delesjonen av en eller flere aminosyrer i subtilisin-aminosyresekvensen. Passende modifikasjonsmetoder er beskret heri, i EPO publikasjon nr. 0 130 756 av 9. januar 1985 og EPO-publikasjon nr. 0 251 446 av 7. januar 1988.

Subtilisiner er bakterielle eller fungale karbonylhydrolaser som generelt virker for å spalte peptidbindinger av proteiner eller peptider. Som brukt heri betyr "subtilisin" et naturlig forekommende subtilisin eller et rekombinant subtilisin. Det er kjent at en serie naturlig forekommende subtilisiner blir dannet og ofte utskilt av forskjellige mikrobielle arter. Aminosyresekvenser av medlemmer av disse serier er ikke fullstendig homologe. Imidlertid oppviser subtilisinene i disse serier de samme eller lignende typer proteolytisk aktivitet. Denne klasse av serinproteaser har en felles aminosyresekvens som definerer en katalytisk triade som adskiller dem fra den chymotropsinrelaterte klasse av serinproteaser. Subtilisinene og de chymotrypsinrelaterte serinproteaser har begge en katalytisk triade omfattende aspartat, histidin og serin. I de subtilisin-relaterte proteaser er den relative rekkefølge av disse aminosyrer regnet fra amino- til karboksylterminalen aspartat-histidin-serin. I de chymotrypsinrelaterte proteaser er den relative rekkefølge imidlertid histidin-aspartat-serin. Således refererer subtilisin heri seg til en serinprotease med den katalytiske triade av subtilisin-relaterte proteaser. Eksempler innbefatter subtilisinene identifisert i fig. 3 heri og som beskrevet i PCT-publikasjon WO 89/06276 og EPO publikasjon nr. 0 283 075.

"Rekombinant subtilisin" refererer til et subtilisin hvor DNA-sekvensen som koder for subtilisinet er modifisert til å danne en mutant DNA-sekvens som koder for substitusjonen, utelatelsen eller innskuddet av en eller flere aminosyrer i den naturlige forekommende subtilisin-aminosyresekvens. Passende metoder for å danne slike modifikasjoner og som kan kombineres med dem som er beskrevet heri, innbefatter dem angitt i EPO publikasjon nr. 0 130 756 og 0 252 446 og PCT publikasjon nr. WO 89/06279, WO 89/09830 og

WO 89/09819.

"Ikke-humane subtilisiner" og det DNA som koder for dem kan erholdes fra mange procaryote og eucaryote organismer. Pas-sende eksempler på procaryote organismer omfatter gramnega-tive organismer, såsom E. coli eller Pseudomonas og gram-positive bakterier, såsom Micrococcus eller Bacillus.

Eksempler på eucariote organismer hvorfra karbonylhydrolase og deres gener kan erholdes, innbefatter gjær, såsom Saccaromvcees cerevisiae, sopp, såsom Aspercrillus sp. og ikke-humane pattedyrskilder, såsom f.eks. bovin sp., hvorfra genet som koder for subtilisinchymosinet kan erholdes. Således er ikke-human subtilisin som brukt heri en funksjonell definisjon som refererer til subtilisin som er assosi-ert, direkte eller indirekte, med procaryote og eucaryote kilder.

En "subtilisinmutant" har en aminosyresekvens som er avledet fra aminosyresekvensen til en "precursorsubtilisin". Precursorsubtilisinhydrolasene innbefatter naturlig forekommende subtilisiner og rekombinante subtilisiner. Aminosyresekvensen til subtilisinmutanten er "avledet" fra precursor subtilisinaminosyresekvensen ved substitusjonen, delesjonen eller innskuddet av en eller flere aminosyrer av precursor-aminosyresekvensen. Slik modifikasjon er av "precursor DNA-sekvensen" som koder for aminosyresekvensen av precursor-subtilisiner, i stedet for manipulering av selve precursor-subtilisinenzymet. Passende metoder for slik manipulering av precursor DNA-sekvensen innbefatter metoder beskrevet heri og i EPO publ. nr. 0 130 756 og nr. 0 251 446.

Spesifikke residuer tilsvarende posisjonene +123 og +274 av Bacillus amyloliguefaciens subtilisin er identifisert heri for substitusjon. Disse aminosyreposisjons-tall refererer til dem angitt i den ferdigutviklede Bacillus amvlolique-faciens subtilisin-sekvens vist i fig. 1. Oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til mutasjonen av dette spesielle subtilisin, men omfatter også precursor subtilisin inneholdende aminosyreresiduer ved posisjoner som er "ekvivalente" til de spesielle identifiserte residuer i Bacillus amyloli-quefaciens subtilisin.

Et residuum (aminosyre) av en precursor-subtitisin er ekvi-valent til et residuum av Bacillus amyloliguefaciens subtilisin dersom den enten er homolog (dvs. tilsvarende i posisjon i enten primær eller tertiær struktur) eller analog til et spesielt residuum eller del av dette residuum 1 Bacillus amyloli<g>uefaciens subtilisin (dvs. med samme eller lignende funksjonell evne til å kombinere, reagere, eller innvirke kjemisk).

For å etablere homologi til primærstruktur, er aminosyresekvensen av en precursor-subtilisin direkte sammenlignet med Bacillus am<y>loliguefaciens subtilisin primærsekvensen og spesielt med et sett av residuer som er kjent for å være invariante i alle subtilisiner for hvilke sekvensen er kjent (fig. 2) . Etter sidestilling av de konserverte residuer, under hensyntagen til nødvendige innskudd og delesjoner for å opprettholde overensstemmelse (dvs. å unngå elimineringen av konserverte residuer gjennom tilfel-dig fjerning og innskudd), blir residuene ekvivalente til spesielle aminosyrer i primærsekvensen av Bacillus amyloliguef aciens subtilisin definert. Overensstemmelse av konserverte residuer bør fortrinnsvis konservere 100% av slike residuer. Imidlertid er overensstemmelse større enn 75% eller så lite som 50% av konserverte residuer også adekvat for å definere ekvivalente residuer. Konservering av den katalytiske triade Asp32/His64/Ser221 bør være bibeholdt.

For eksempel er i fig. 3 aminosyresekvensen av subtilisin fra Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus subtilis varI168 og Bacillus lichenformis (carsbergensis) samstilt for å gi den maksimale mengde av homologi mellom aminosyresekvense-ne. En samstilling av disse sekvenser viser at det foreligger et antall konserverte residuer inneholdt i hver sekvens. Disse er residuene identifisert i fig. 2.

Disse konserverte residuer kan således bli brukt for å definere de tilsvarende ekvivalente aminosyreresiduer av Bacillus amyloliguefaciens subtilisin i andre subtilisiner, såsom subtilisin fra Bacillus lentus (PCT publikasjon nr. WO89/06279, publisert 13. juli 1989) og den foretrukne subtilisinmutant heri. Disse spesielle aminosyresekvenser er samstilt i fig. 4 med sekvensen fra Bacillus amylolique-faciens subtilisin for å gi den maksimale homologi av konserverte residuer. Som det kan observeres, foreligger det et antall delesjoner i sekvensen fra Bacillus lentus og i den foretrukne subtilisinmutant ifølge oppfinnelsen, sammenlignet med Bacillus amylologuefaciens subtilisin. Således er den ekvivalente aminosyre for Val-165 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin i de andre subtilisiner det spesielle isoleucin vist under Val-165.

I fig. 4 er aminosyren ved posisjon 123 arparagin i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin. I Bacillus lentus subtilisin er det ekvivalente residuum det spesielle asparagin som er vist. I den foretrukne subtilisinmutant ifølge oppfinnelsen er imidlertid aminosyren ekvivalent til +123 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin, en aminosyre som er forskjellig fra asparagin og som fortrinnsvis er serinet vist i fig. 4. På lignende måte er i fig. 4 aminosyren ved posisjon +274 Bacillus ■ amyloliguefaciens subtilisin, alanin. Som det kan observeres, er den ekvivalente aminosyre i Bacillus lentus subtilisin det spesielle treonin som er vist i fig. 4. En spesielt foretrukket subtilisinmutant ifølge oppfinnelsen er den ekvivalente aminosyreposisjon 274 opptatt av alaninet vist i fig. 4.

Således blir posisjonene +123 og +274 identifisert ved de primære aminosyresekvenser i fig. 4 for subtilisin fra Bacillus lentus og den foretrukne utførelsesform ifølge oppfinnelsen. Imidlertid kan forskjellige andre aminosyreresiduer modifiseres, som er ekvivalente til spesifikke aminosyrer i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin. Således har, i den foretrukne utførelsesform, aminosyren lysin ved posisjon 27 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin et ekvivalent lysin ved posisjon 27 i Bacillus lentus subtilisin. Som indikert i eksemplene, ble subtilisinet som omfatter en av de foretrukne utførelsesformer i oppfinnelsen, avledet ved å modifisere en DNA-sekvens som koder for Bacillus lentus subtilisin. Slike modifikasjoner til dette DNA innbefattet modifikasjonen av kodoner som var ekvivalente til posisjonene 123 og 274 av Bacillus amvloligue-faciens subtilisin. Imidlertid ble to andre modifikasjoner til Bacillus lentus aminosyresekvensen ved posisjoner ekvivalente til residuene 27 og 104 i Bacillus amvloligue-faciens subtilisin dannet. Som det kan observeres i fig. 4, ble lysinet ved det ekvivalente residuum 27 i Bacillus lentus subtilisin således modifisert til å kode for arginin i den foretrukne utførelsesform. På lignende måte ble valinresiduet ved posisjon 104 av Bacillus lentus, som er ekvivalent til tyrosin 104 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin, også modifisert til å kode for tyrosin. Således inneholder den foretrukne utførelsesform vist i fig. 4 en aminosyresekvens avledet fra Bacillus lentus subtilisin ved å modifisere residuer av dette subtilisin ekvivalent til posisjonene 27, 104, 123 og 274 av Bacillus amvloligue-faciens subtilisin.

Ekvivalente residuer kan også defineres ved å bestemme homologi ved tertiærstrukturnivå for et precursor subtilisin hvis tertiærstruktur har blitt bestemt ved røntgenstrå-lekrystallografi. Ekvivalente residuer defineres som dem for hvilke atomkoordinatene av to eller flere av hovedkjedeatomene til et spesielt aminosyreresiduum av precursorsubtilisinet og Bacillus amyloliguefaciens subtilisin

(N på N, CA på CA, C på C og 0 på 0) ligger innen 0,13 nm og fortrinnsvis 0,1 nm etter samstilling. Samstilling blir oppnådd etter at den beste modell har blitt orientert og lagt i posisjon for å gi den maksimale overlapping av atomkoordinatene av ikke-hydrogen proteinatomer av det subtilisin det er snakk om, til Bacillus amvloliqefaciens subtilisinet. Den beste modell er den krystallografiske modell som gir den laveste R-faktor for eksperimentelle diffraksjonsdata ved den høyest tilgjengelige resolusjon.

Ekvivalente residuer som er funksjonelt analoge til et spesifikt residuum av Bacillus amyloliguefaciens subtilisin defineres som de aminosyrer av precursor-subtilisinene som kan innta en konformasjon slik at de enten endrer, modifi-serer eller samvirker til proteinstruktur, substratbinding eller katalyse på en måte definert og tillagt et spesifikt residuum av Bacillus amyloliguefaciens subtilisinet. Videre er de slike residuer av precursor-subtilisinet (for hvilken en tertiær struktur har blitt erholdt ved røntgenstråle-krystallografi), som opptar en analog posisjon i den ut-strekning at selv om hovedkjedeatomene av det gitte residuum ikke behøver å tilfredsstille ekvivalenskriteriene på basis av å oppta en homolog posisjon, ligger atomkoordinatene av minst to av sidekjedeatomene av residuet ved 0,13 nm av de tilsvarende sidekjedeatomer av Bacillus amyloliguef aciens subtilisin. Koordinatene av den tredimensjonale struktur av Bacillus amyloliguefaciens subtilisin er angitt i EPO publikajson nr. 0 251 446 og kan brukes som skissert ovenfor til å bestemme ekvivalente residuer på tertiærstrukturnivå.

Enkelte av residuene identifisert for substitusjon, innsetning eller delesjon er konserverte residuer, mens andre ikke er det. I tilfeller hvor residuer ikke er konservert, er erstatningen av en eller flere aminosyrer begrenset til substitusjoner som danner en mutant som har en aminosyresekvens som ikke tilsvarer en som er funnet i naturen. I tilfeller med konserverte residuer, bør slike erstatninger ikke resultere i en naturlig forekommende sekvens. Subtilisinmutantene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter de ferdigutviklede former av subtilisnmutanter, såvel som pro-og prepro-former av slike subtilisinmutanter. Preproformene er den foretrukne konstruksjon, siden dette letter ekspre-sjonen, utskillelsen og utviklingen av subtilisinmutantene.

"Prosekvens" refererer til en sekvens av aminosyrer som er bundet til den N-terminale del av den ferdigutviklede form av et subtilisin som, når det fjernes, resulterer i frem-skaffelsen av den "ferdigutviklede" form av subtilisinet. Mange proteolytiske enzymer er funnet i naturen som trans-lasjonene proenzymprodukter, og ved fravær av posttrans-lasjonell behandling, uttrykkes de i denne form. En foretrukket prosekvens for fremstilling av subtilisinmutanter, er den forment-lige prosekvens av Bacillus amylolique-faciens subtilisin, selv om andre subtilisin-prosekvenser kan bli brukt. I eksemplene ble den formentlige prosekvens

fra subtilisinet fra Bacillus lentus (ATCC 21536) brukt.

En "signalsekvens" eller "presekvens" refererer til enhver sekvens av aminosyrer som er bundet til den N-terminale del av et subtilisin eller til den N-terminale del av et pro-subtilisin som kan medvirke i sekresjonen av det ferdigutviklede subtilisin eller proformene av dette. Denne definisjon av signalsekvens er en funksjonell definisjon som er ment å innbefatte alle slike aminosyresekvenser som er kodet for av den N-terminale del av subtilisin-genet som medvirker i å utføre sekresjonen av subtilisin under native betingelser. Foreliggende oppfinnelse anvender slike sekvenser for å fremskaffe sekresjonen av subtilisinmutantene som definert heri. En foretrukket signalsekvens brukt i eksemplene omfatter de første syv aminosyreresiduer av signalsekvensen fra Bacillus subtilis subtilisin fusert til det gjenværende av signalsekvensen av subtilisinet fra Bacillus lentus (ATCC 21536).

En "prepro"- form av en subtilisinmutant består av den ferdigutviklede form av hydrolasen med en prosekvens operativt knyttet til aminoterminalen av subtilisinet og en "pre"-eller "signal"-sekvens operativt knyttet til aminoterminalen av prosekvensen.

"Ekspresjonsvektor" refererer til en DNA-konstruksjon som inneholder en DNA-sekvens som er operativt forbundet til en egnet kontrollsekvens som er i stand til å fremskaffe eks-presjonen av nevnte DNA i en egnet vertsorganisme. Slike kontrollsekvenser innbefatter en promoter for å fremskaffe transkripsjon, en valgfri operatorsekvens til å kontrollere slik transkripsjon, en sekvens som koder for passende mRNA ribosombindende seter og sekvenser som kontrollerer avslut-ning av transkripsjon og translasjon. Vektoren kan være et plasmid, en fag-partikkel eller simpelthen et potensielt genomisk innskudd. Når den er transformert i en egnet vert, kan vektoren replikere og virke uavhengig av vertsgenomet

eller kan i enkelte tilfeller integrere i selve genomet. I foreliggende beskrivelse blir "plasmid" og "vektor" enkelte ganger brukt om hverandre, idet plasmidet er den vanligst brukte form for vektor for tiden. Imidlertid er oppfinnelsen tenkt å innbefatte slike andre former for ekspresjonsvektorer som fremmer ekvivalente funksjoner, som er eller vil bli kjent i faget.

"Vertsceller" brukt i foreliggende oppfinnelse er generelt procaryote eller eucaryote vertsorganismer som fortrinnsvis har blitt manipulert med metodene beskrevet i EPO publikasjon nr. 0130 746 for å gjøre dem ute av stand til å ut-skille enzymatisk aktive endoproteaser.

En foretrukket vertscelle for ekspresjon av subtilisin er Bacillus-stammen BG2036, som er defisient i enzymatisk aktiv nøytral protease og alkalisk protease (Subtilisin). Fremstillingen av stamme BG2 03 6 er beskrevet i detalj i EPO publikasjon nr. 0 130 756 og videre beskrevet av Yang, M. Y. et al. (1984), J. Bacteriol., 160, 15-21. Andre vertsceller for ekspresjon av subtilisin innbefatter Bacillus subtilis 1168 (EPO publikasjon No. 0 130 756).

Vertceller blir transformert eller transfektert med vektorer konstruert ved å bruke rekombinante DNA-teknikker. Slike transformerte vertsceller er i stand til enten å replikere verktorer som koder for subtilisinmutantene eller uttrykke den ønskede subtilisinmutant. I tilfelle med vektorer som koder for pre- eller prepro-formen av subtilisinmutanten, blir slike mutanter, når de uttrykkes, typisk utskilt fra vertscellen til vertscellemediet.

"Operativt forbundet", når det beskrives i forbindelse med to DNA-områder, betyr ganske enkelt at de er funksjonelt relaterte til hverandre. For eksempel er en presekvens operativt forbundet til et peptid dersom den fungerer som en signalsekvens som medvirker i utskillelsen av den

ferdigutviklede form av proteinet, som høyst sannsynlig innbefattter spaltning av signalsekvensen. En promoter er operativt forbundet til en kodende sekvens dersom den kontrollerer transkripsjonen av sekvensen; et ribosombindende sete er operativt forbundet til en kodende sekvens dersom den ligger i en posisjon slik at den tillater translasj on.

Genene som koder for den naturlig forekommende precursor

av subtitlisinet kan erholdes i samsvar med de generelle metoder beskrevet i EPO publikasjon nr. 0 130 756 og 0 251 44 6. Som det kan observeres fra eksemplene beskrevet deri, omfatter metodene generelt å syntetisere merkede prober med sekvenser som formodentlig koder for områder av det subtilisin som er av interesse, fremstille genomiske biblioteker fra organismer som uttrykker subtilisinet, og velge ut fra bibliotekene genet av interesse ved hybridisering til probene. Positivt hybridiserende kloner blir så kartlagt og sekvensert.

Det klonede subtilisin blir deretter brukt til å trans-formere en vertscelle for å uttrykke subtilisinet. Subtilisingenet blir så ligert i et plasmid med høyt kopiantall. Dette plasmid replikerer i vertsceller i den forstand at det inneholder de velkjente elementer som er nødvendig for plasmidreplikasjon: en promoter operativt forbundet til genet det er snakk om (som kan tilføres som genets egen homologe promotor dersom dette blir gjenkjent, dvs. trans-skribert, av vertscellen), en transkripsjonsavslutning og polyadenyleringsregion (som er nødvendig for stabilitet for det transkriberte mRNA av vertscellen fra hydrolasegenet i visse eucaryote vertsceller) som er eksogen eller fremskaf-fet av den endogene terminatorregion av subtilisin, og fortrinnsvis et utvelgelsesgen, såsom et gen for antibiot-isk resistens som tillater kontinuerlig dyrkningsopprettho-ldelse av plasmidinfiserte vertsceller ved vekst i medier inneholdende antibiotikum. Plasmider med høyt kopiantall inneholder også en replikasjonsopprinnelse for vertscellen for derved å tillate store antall av plasmider å bli dannet i cytoplasma uten kromosomale begrensninger. Imidlertid ligger det innenfor bredden heri å integrere multiple kopier av subtilisingenet i vertsgenomet. Dette blir utført ved procaryote og eucaryote organismer som er spesielt tilgjengelige for homolog rekombinasjon.

Alternativt kan et syntetisk gen som koder for en naturlig forekommende eller mutant precursor for subtilisin bli fremstilt. I denne tilnærmingsmåte blir DNA og/eller aminosyresekvensen av precursorsubtilisinet bestemt. Multiple overlappende syntetiske enkeltkjedede DNA-fragmenter blir deretter syntetisert, som ved hybridisering og ligering danner et syntetisk DNA som koder for precursor-subtilisin. Denne metode gir flere fordeler i forhold til å klone det naturlige gen, ved at restriks j onsseter kan innbefattes gjennom hele DNA uten endring i aminosyresekvensen som er kodet for, for å lette etterfølgende modifisering for å danne mutante subtilisiner. Videre tillater den syntetiske metode å justere kodonanvendelsen i det syntetiske gen for å overensstemme med kodonbasen for de spesielle ekspresjonsvertsorganismer som skal brukes. Et eksempel på syntetisk genkonstruksjon er angitt i eksemplene .

Når det naturlig forekommende eller syntetiske precursor subtilisingen har blitt klonet, blir et antall modifikasjoner foretatt for å fremme bruken av genet utover syntese av den naturlig forkommende precursor-subtilisin. Slike modifikasjoner innbefatter fremstillingen av rekombinante subtilisiner beskrevet i EPO-publikasjoner nr. 0 130 756 og

0 251 446 og produksjonen av subtilisinmutanter beskrevet heri.

Den følgende kassett-mutagenesemetode kan bli brukt for å lette konstruksjonen og identifiseringen av subtilisinmutantene ifølge foreliggende oppfinnelse, selv om andre metoder, innbefattende seterettet mutagenese, kan brukes. Først blir det naturlig forekommende gen som koder for subtilisin erholdt og sekvensert fullstendig eller delvis. Derpå blir sekvensen gjennomgått for for å finne et punkt ved hvilket det er ønsket å foreta en mutasjon (delesjon, innskudd eller substitusjon) av en eller flere aminosyrer i det kodede enzym. Sekvensene som ligger ved siden av dette punkt, blir vurdert for tilstedeværelse av restriksjonsposisjoner for å erstatte et kort segment av genet med en oligonukleotidmengde som, når den uttrykkes, vil kode for forskjellige mutanter. Slike restriksjonsposisjoner er fortrinnsvis unike seter innen subtilisingenet for å lette erstatningen av gensegmentet. Imidlertid kan ethvert pas-sende restriksjonssete som ikke forekommer i utstrakt grad i subtilisingenet bli brukt, forutsatt at genfragmentene dannet ved restriksjonsfordøying kan bli satt sammen i passende sekvens. Dersom restriksjonssetet ikke er tilstede ved beliggenheter innen en passende avstand fra det valgte punkt (fra 10 til 15 nukleotider), blir slike seter dannet ved å substituere nukleotider i genet på en slik måte at hverken leserammen eller aminosyrene som er kodet for blir endret i den endelige konstruksjon. Mutering av genet for å endre dets sekvens for å få den ønskede sekvens blir utført ved M13 primerforlengelse i henhold til generelt kjente metoder. Oppgaven å lokalisere egnede flankerende regioner og vurdere de nødvendige endringer for å komme til to pas-sende restriksjonssetesekvenser, blir foretatt ruti-nemessig ut fra degenereringen av den genetiske kode, et restriksjonsenzymkart av genet og det store antall forskjellige restriksjonsenzymer. Bemerk at dersom et passende sideliggende restriksjonssete er tilgjengelig, behøver ovenfornevnte metode kun å brukes i forbindelse med det sideliggende område som ikke inneholder et sete.

Når det naturlig forekommende DNA eller syntetiske DNA er klonet, blir restriksjonssetene som ligger ved siden av posisjonene som skal muteres, fordøyet med de gjenkjennende restriksjonsenzymer og et antall av endeterminale komplementære oligonukleotidkassetter blir ligert i genet. Muta-genesen blir enormt forenklet ved denne metode, fordi alt av nukleotidene kan syntetiseres til å ha samme restriksj-onsseter, og ingen syntetiske linkere er nødvendige for å danne restriksjonsposisjonene.

Som brukt heri blir proteolytisk aktivitet definert som hydrolysehastigheten av peptidbindinger pr. mg av aktivt enzym. Det finnes mange velkjente fremgangsmåter for å måle proteolytisk aktivitet (K. M. Kalisz, "Microbial Protein-ases", Advances in Biochemical En<g>ineering/ Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988.

I et aspekt av oppfinnelsen er målet å sikre et mutant subtilisin med en større (numerisk stor) proteolytisk aktivitet sammenlignet med precursor subtilisinet, for derved å muliggjøre bruken av enzymet for mer effektivt å virke på et målsubstrat. Spesifikke aminosyrer som er anvendelige for å erholde slike resultater i subtilisiner ved residuer ekvivalente til +123 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin, er vist i eksemplene. I enkelte tilfeller kan en lavere proteolytisk aktivitet være ønsket. I slike tilfeller kan en minskning i proteolytisk aktivitet bli dannet ved å substituere aminosyrene identifisert i eksemplene ved residuene ekvi-valent til +123 i Bacillus amyloliguef aciens subtilisin.

For precursor-subtilisiner hvor serin ikke er residuet ved posisjonen ekvivalent til +123 i Bacillus amyloliguefaciens , blir den største proteolytiske aktivitet erholdt når serin blir substituert i precursoren ved posisjon +123. Videre er det ikke kjent at det eksisterer noen naturlig forekommende Bacillus subtilisin som inneholder serin ved en posisjon ekvivalent til +123 i Bacillus amylolique-faciens subtilisin.

Basert på den oppdagelse at serin ved denne posisjon øker proteolytisk aktivitet, kan fagmannen velge ut naturlig forekommende Bacillus subtilisin til å identifisere og klone en naturlig mutant inneholdende serin ved denne posisjon. Slike naturlige Bacillus subtilisinmutanter ligger innenfor bredden av oppfinnelsen.

Hvor subtilisinet er fra andre organismer enn Bacillus og et serin er tilstede ved +123 i precursorenzymet, kan substitusjonen være slik at proteolytisk aktivitet minskes. Dette ville være nyttig, f.eks. hvor den syntetiske aktivitet av subtilisinene er ønsket (som for syntetisering av peptider). Man kan ønske å minske denne proteolytiske aktivitet som er i stand til å ødelegge produktet fra slik syntese.

I et annet aspekt av oppfinnelsen har det blitt bestemt at residuer ekvivalent til +274 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin er viktige ved modulering av de totale effekt-karakteristika av enzymet i detergentblandinger. Således kan, som angitt i eksemplene, treoninet i Bacillus lentus subtilisin ved ekvivalent posisjon +274 bli mutert til alanin i den foretrukne utførelsesform for å gi øket effekt av mutantenzymet. Som også beskrevet i eksemplene, resulterer substitusjon av dette residuum med en aminosyre forskjellig fra treonin, såsom leucin, serin, valin og alanin, i en minkning i mutantens stabilitet. Slik minkning i stabilitet er antatt å være resultatet av autokatalytisk nedbrytning av mutanten. Således er modifikasjoner av residuer som er ekvivalente til +274 i Bacillus subtilisin i stand til å øke den totale effekt av enzymet i en detergentblanding og å modulere den totale stabilitet av enzymet . I dette aspekt av oppfinnelsen er målet å sikre et mutant subtilisin som har øket effekt når det brukes i en detergentblanding, sammenlignet med precursor-subtilisinet. Som brukt heri er øket effekt i en detergent definert som øket rensing av visse enzymsensitive flekker, som av gress eller blod. Denne rensing blir bestemt ved visuell vurde-ring etter en standard vaskesyklus.

En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er angitt i eksemplene, hvor lysinet ved posisjon 27 er erstattet med arginin, valinet ved posisjon 104 er erstattet med tyrosin, asparaginet ved posisjon 123 er erstattet med serin og treoninet ved residuum 274 er erstattet med alanin i Bacillus lentus subtilisin. Selv om stabiliteten av dette enzym er noe redusert, sammenlignet med precursor Bacillus lentus subtilisinet, er effektnivået av dette enzym i en detergentblanding vesentlig øket, slik at den samme effekt av denne Bacillus lentus subtilisinmutant blir erholdt, sammenlignet med det umodifiserte Bacillus lentus subtilisin, når det brukes omtrent halvdelen av mengden av enzymet.

Basert på de erholdte resultater med dette og andre mutant-subtilisiner, er det tydelig at residuene i subtilisiner ekvivalent til posisjonene +123 og +274 i Bacillus amyloliguef aciens -subtilisin er viktige for den proteolytiske aktivitet, effekt og/eller stabilitet av disse enzymer.

Mange av subtilisinmutantene ifølge oppfinnelsen er anvendelige ved utvikling av forskjellige detergente blandinger. Et antall av kjente forbindelser er egnede overflateaktive stoffer som er anvendelige i blandinger som omfatter subtilisinmutantene ifølge oppfinnelsen. Disse innbefatter ikke-ioniske, anioniske, kationiske, anioniske eller zwitterioniske detergenter, som beskrevet i U.S. 4.404.128 til Barry J. Anderson og U.S. 4.261.868 til Jiri Flora et al. Fagområdet er kjent med de forskjellige sammensetninger som kan bli brukt som vaskemidler.

Subtilisiner ifølge oppfinnelsen kan utformes i kjente pulverformige og flytende detergenter med pH mellom 6,5 og 12,0 ved nivåer på omkring 0,01 til omkring 5 vekt%, fortrinnsvis 0,1 - 0,05 vekt%. Disse detergente vaskemidler kan også innbefatte andre enzymer, såsom kjente proteaser og amylaser, såvel som fyllstoffer og stabilisatorer.

Tilsetning av subtilisiner ifølge oppfinnelsen til vanlige vaskemidler gir ingen spesiell bruksbegrensning. Med andre ord er enhver temperatur og pH som er passende for deter-genten også egnet for foreliggende blandinger, så lenge pH ligger innenfor ovennevnte område og teperaturen er under denatureringstemperaturen for subtilisinene ifølge oppfinnelsen. I tillegg kan subtilisiner ifølge oppfinnelsen bli brukt i vaskemidler uten detergenter, igjen enten alene eller i kombinasjon med fyllmidler og stabilisatorer.

Eksempel 1

Konstruksjoner for ekspresjon av Bacillus lentus subtilisingen i Bacillus subtilis

Plasmid pSA, fig. 5, bærer en translasjonen fusjon via et felles Sau3A restriksjonssete ved syvende/åttende signal-sekvenskodon av subtilisingenene av B. subtilis og B. amyloliguef aciens. Som vist i fig. 5 ble dette gen på et EcoRI-BamHI 2,0 Kb-fragment subklonet i M13mpl9 for å isolere enkeltkjedet templat-DNA som skal brukes for seterettet mutagenese for å danne pSAR-Q2 75R. Denne mutage-nesefremgangsmåte var essensielt den samme som for Zoller, M. et al., (1983), Methods Enzymol., 100, 468-500; (1) og brukte et syntetisk oligonukleotid med sekvensen:

hvor stjernene betegner endringer fra villtype gensekven-sene og det understrekede representerer et innført Pstl

restriksjonsendonukleasesete brukt ved utvelgelse av det spesielle mutantgen som koder for Q275R-endringen. Disse endringer ble foretatt for (1) å konvertere aminosyren ved denne posisjon til den funnet i Bacillus lentus subtilisin og (2) å tillate tilkobling av terminatoren i pSAR til den ferdigutviklede kodende region av Bacillus lentus via et Pst-sete som på lignende måte var innført i pGG3 6 fra Bacillus lentus (ATCC 21536).

Plasmid pGG3 6, fig. 5, inneholder et 2,1 kb genomisk DNA-fragment fra Bacillus lentus (ATCC 21536) som koder for det fullstedige subtilisingen som ble klonet ved standardmeto-der i skyttelvektoren pBS42. Band, L. et al. (1984), DNA, 3, 17-21.

Aminosyresekvensen for dette subtilisin er den samme som den beskrevet for subtilisin 3 09 i PCT publikassjon nr. 89/06279. Dette gen ble subklonet i M13 som ovenfor for seterettet mutagenese ved å bruke et oligonukleotid av sekvensen:

for å 1) innføre et Pstl-sete ved samme beliggenhet i dette gen tilsvarende setet som er innført i pSAR ovenfor, og 2) å substituere treoninet ved posisjon 274 med alanin for å danne pGG3 6-T274A.

De mutante pSAR-Q275R- og pGG36-T274A-gener ble individuelt subklonet tilbake i pBS42 før Pstl/BamHI-fordøyinger, fragmentisolering og ligering for å danne plasmid GG-A274B. amy. term. som vist i fig. 5, alt med standard metoder.

En syntetisk DNA-linker ble dannet ved å sammekoble komplementære enkeltkjedede oligonukleotider av sekvensene: og

for å gi det dobbeltkjedede DNA-fragment #2 vist i fig. 6. De tilbakeliggende venstre- og høyresiders ender av denne dupleks-linker er komplementære til henholdsvis Sau3A-enden av fragment #1 (fra pSAR) og Clal-enden av fragment #3 (fra pGG-A274 B.amy.term). Disse tre fragmenter ble kombinert med fragment 4 fra pSAR-Q275R etter restriksjonsendonukle-asefordøying av plasmider, fragmentisolering og ligering ved standard metoder for å danne plasmid pGG-KVNA. Beteg-nelsen GG-KVNA indikerer at dette subtilisin inneholder subtilisinet kodet for av pGG-36, som innbefatter lysin (K) ved posisjon 27, valin (V) ved posisjon 104, asparagin (N) ved posisjon 123 og substitusjonen av trionin ved posisjon 274 med alanin (A).

Eksempel 2

Modifisering av PGG-KVNA

Som angitt i fig. 6, ble GG-KVNA-genet (2,1 kb EcoRI-BamHI-fragment) subklonet i M13 i tre påhverandre følgende runder av seterettet mutagenese ved å bruke oligonukleotider med sekvensen: og

Stjernene betegner endringer fra vi11type gensekvensen. Det understrekede representerer i (a) et innført Xbal-sete og i (b) og (c) innførte Nhel-seter brukt for velge ut tilstedeværelsen av henholdsvis de tilkoblede R27, Y104 og S123-mutasjoner. I tillegg, i (c) betegner det overstrekede et ødelagt Sphl-sete. Endelig ble 2,1 kb GG-RYSA-genet subklonet tilbake i pBS42 for ekspresjon i Bj. subtilis-verts - organismer.

Det resulterende plasmid ble betegnet pGG-RYSA. Denne betegnelse indikerer at fire residuer var modifisert i pGG-KVNA-plasmidet. Lysin (K) ved posisjon 27 til arginin (R), valin (V) til tyrosin (Y) ved posisjon 104 og asparagin (N) ved posisjon 123 til serin (S). Alaninet på forhånd substituert ved residuum 274 ble ikke modifisert i denne prose-dyre .

Lysinet ved posisjon 27 ble substituet med arginin basert på aminosyresekvenseringen av subtilisin 309. Som indikert i PCT publikasjon nr. WO89/06279, ligger lysin ved posisjon 27. Imidlertid, etter uavhengug sekvensering av dette sub-tilisinprotein indikerte de initielle data at arginin var residuet ved posisjon 27. I tilfelle med substitusjon med tyrosin for valin ved residuum 104 ble substitusjonen foretatt for å senke pH-aktivitetsprofilen og å øke effekten av enzymet basert på resultater på forhånd erholdt for Bacillus amyloliguefaciens subtilisin (enkelte ganger referert til som BPN'). Denne substitusjon av asparagin ved posisjon 123 med serin er basert på resultatene erholdt nedenfor, hvor det ble bestemt at substitusjonen av serin ved posisjon 123 maksimaliserte den proteolytiske aktivitet av enzymet i en nært relatert mutant.

Eksempel 3

Konstruksjon av syntetisk Bacillus lentus subtilisin-gen DNA som koder for aminosyresekvensen av Bacillus lentus subtilisin, ble også fremstilt ved å konstruere et gen som koder for en syntetisk DNA-sekvens.

Det 2,1 kb HindiII genomiske fragment fra plasmid pGG36 ble sekvensert. Den avledede aminosyresekvens fra det ferdigutviklede genprodukt (GG36 subtilisin) ble brukt for å lage en syntetisk ferdigutviklet kodende sekvens med de følgende egenskaper: (1) Generelt ble de kodonene som oftest ble funnet for hver aminosyre i syv forskellige B. subtilis-gener (fra en tabulering av kodonanvendelser, tabell 2 fra Maryama, T. et al., (1986), Nucl. Acids Res., Supplement 14 s. rl51-rl97) brukt i tilfellene hvor alternative kodoner resulterte i passende beliggende restriksjonsenzym-gjen-kj ennelsesseter inne i gener; (2) Omtrent hvert 40-60 bp av den 0,8 ferdigutviklede kodende region ble kombinasjo-ner på to eller tre spesielt utvalgte kodoner anvendt, som resulterte i innføringen av relativt jevnt fordelte, unike restriksjonsposisjoner. Disse posisjoner ble valgt for å lette (a) senere kassettmutagenese og utvelgelsesstudier og (b) konstruksjoner som innbefatter mer enn én mutasjon; (3) Et unikt PstI gjenkjennelsessete ble utformet for å dekke kodoner 272-274 som tillater festing til terminatorsekven-sene av et Bacillus amyloli<g>uefaciens-aen på lignende måte modifisert over de samme tre kodoner og ved å substituere treonin ved posisjon 274 med alanin; og (4) Et unikt Nrul-sete ble innført for å dekke ferdigutviklede kodonresiduer 9-10 som tillater festing til GG36's pre-pro-kodende sekvens via en kort syntetisk dupleks DNA-linker. Basert på denne utforming ble oligonukleotider ("oligos") syntetisert, slik at ved tilkobling av de kodende og ikke-kodende oligos for en gitt h-60 bp kodende region ville det resulterende dupleks DNA-fragment ha ved sine ender enkeltkjedede områder som er komplementære til enden av det neste duplex-fragment av genene (se fig. 7).

Et totale på 36 adskilte oligos (omfattende 18 individuelle duplekser) ble brukt i skjemaet som skissert ovenfor, noe som resulterte i en +0,8 kb dupleks syntetisk ferdigutviklet kodende region (Fragment 3 i fig. 8).

Endelig ble et ytterligere par av syntetiske oligos syntetisert som ved sammenkobling (for å gi fragment 2 i fig. 8) har et Ncol-sete ved sin 5' ende (komplementær til GG36's Ncol-sete ved ferdigutviklede kodoner 5-6) og et Nrul-sete ved sin 3' ende (komplementær til 3 sin 5' ende av fragment 3) .

Den endelige konstruksjon for å gi en fullstendig ekspre-sjonsenhet bestående av B. subtilis promoter og de første syv aminosyrer av signalsekvensen koblet til GG36's sekvenser som koder for det gjenværende av signalsekvensen, den fullstendige prosekvens og de første seks ferdigutviklede aminosyrer (fragment 1 fra GG-KVNA), det syntetiske gen som koder for ferdigutviklede residuer 7-274 (fragmenter 2+3) og terminatorregionen (innbefattende det endelige ferdigutviklede genkodon 27 9) av Bacillus amyloli<g>uefaciens (fragment 4) ble foretatt som en firetrinns ligering som angitt i figur 6.

Endelig ble tre ytterligere separate mutasjoner innført i den ferdigutviklede kodende region av dette hybridgen av full lengde. Den første substituerte lysinet ved posisjon 27 med arginin. Den andre substituerte valinet ved posisjon 104 med tyrosin. Den tredje substituerte asparaginet ved posisjon 123 med serin. Det resulterende plasmid er betegnet pBC3-RYSA. Det følgende eksempel beskriver metoden som ble brukt til å modifisere posisjon 123 i det syntetiske gen. Lignende metoder ble brukt for å modifisere posisjon 27 og 104 i dette syntetiske gen.

Eksempel 4

Konstruksjon av posisjon 123-mutanter

Et Xho I-sete ble innført over kodoner 111/112 i det syntetiske gen fra eksempel 3 ved å danne tre fenotypisk stumme mutasjoner via seterettet mutagenese (primereksten-sjons-mutagenese i M13) . Det resulterende plasmid, pX123 (fig. 9) , ble fordøyet med Xho I og Ava I og det store vektorinneholdende fragment isolert ved elektroeluering fra agarosegel. Komplementære syntetiske oligonukleotider ble sammenkoblet, ligert med det pX123 store fragment og transformert i EL_ coli stamme MM294. Disse kassetter kodet individuelt for alle tyve naturlig forekommende aminosyrer ved posisjon 123, og inneholdt i tillegg en stum mutasjon som ødela et eneste Sph I-sete som lå mellom Xho I og AVA I-setene i pX123. Resulterende plasmider fra IL_ coli trans-formanter ble valgt ut for tap av det eneste Sph I-sete. Positive elementer ble ved restriksjonsanalyse (dvs. Sph I negativer) sekvensert for å bekrefte tilstedeværelsen av de ønskede posisjon 123-mutasjoner subklonet i skyttelvektoren pBS42 og transformert i Basillus subtilis BG2 03 6 for ekspresj on.

Eksempel 5

Aktivitet av forskjellige +123-mutanter

Proteolytisk aktivitet av hver av subtilisinmutantene kodet for av de ovenfor modifiserte posisjon +123-mutanter ble undersøkt ved å blande 0,04 ml av supernatant fra sentrifu-gerte kulturmedier med 0,56 ml av 1% w/v kasein i 0, IM Tris pH 8,60. Etter en 2 0 minutters inkubering ved 37°C ble reaksjonene avsluttet ved utfelling med 10% trikloreddik-syre (TCA). Aktivitet ble bestemt utfra absorbensen ved en bølgelengde på 280 nm for supernatanten etter utfelling med 10% TCA.

Under den endelige bekreftelse av DNA-sekvensen av det syntetiske gen som koder for enzymet BC3-RYSA, ble prolin funnet å være ved posisjon 78 i stedet for serin (aminosyren ved denne posisjon i Bacillus lentus subtilisin). De opprinnelige egenskaper av posisjon 123-mutasjonene ble undersøkt i dette enzym, BC3-RPYA (prolin ved posisjon 78). Disse resultater er vist i tabell I. Aminosyren ved posisjon 78 ble deretter endret tilbake til serin for å danne DNA- og aminosyresekvensen vist i fig. 10 ved å erstatte den syntetiske DNA-dupleks som tilsvarer denne posisjon i

genet.

Som det kan ses, resulterer substitusjonen av Asn med Ser ved posisjon +123 i en vesentlig økning i proteolytisk aktivitet. Forholdet mellom de forskjellige subtilisiner beskrevet heri er oppsummert for posisjon 27, 78, 104, 123 og 274 i tabell II.

Eksempel 6

Stabilitet av posisjon 274-mutanter

Stabilitet av posisjon 274-mutanter i BC4-RPY (arginin ved posisjon 27, prolin ved posisjon 78 og tyrosin ved posisjon 104 i Bacillus lentus subtilis) er vist i tabell III. Data er prosentvis aktivitet som er tilbake etter inkubering ved 37°C i 50 mM EDTA i 60 minutter.

Mutasjoner ved denne posisjon innvirker klart på stabiliteten av enzymet. Selv om alaninmutas j onen ikke var så stabil som serin eller treonin ved denne posisjon, ga dette enzym overlegen effekt i forhold til Bacillus lentus subtilisin under anvendelsesbetingelsene som er beskrevet. For forskjellige anvendelser kan andre aminosyrer ved posisjon 274 bli brukt.

Eksempel 7

Detergentsammensetning

En spraytørket fosfatdetergent-granul med følgende sammen-setning ble fremstilt:

<*> Alkohol og monoetoksylatalkohol fjernet.

<**> mg aktivt enzym/g (2,0 mg aktivt enzym/g blanding)

En 0,1 vekt% oppløsning av denne blanding i vann hadde en pH på 10,0. Blandingen med subtilisinmutant ifølge oppfinnelsen (fig. 7) ga overlegen rensing av enzymfølsomme flekker, sammenlignet med Bacillus lentus ved 0,068 mg aktivt enzym pr. gram produkt, i en 3 5°C vask ved 6 korn pr. gallon (3,8 1) (gpg) hårdhet. (3:1 Ca/Mg).

Gjennom denne anvendelse blir det referert til forskjellige aminosyrer via vanlige én- og tre-bokstavskoder. ■ Slike koder er identifisert i Proteins: Structures and Molecular Proteases, Thomas E. Creighton, eds. W.N. Freeman, N.Y., N.Y. (1983), s. 3.

Claims

1. Subtilisinmutant med endret proteolytisk ektivitet eller stabilitet, karakterisert ved at den har en aminosyresekvens som ikke finnes i naturen, avledet fra et precursor subtilisin ved å substituere en forskjellig aminosyre i stedet for aminosyreresiduet ved en posisjon i nevnte pre-cursor ekvivalent til +123 eller +274 i Bacillus am<y>loliguefaciens subtilisin, som vist i figur 1.

2. Subtilisinmutant ifølge krav 1, karakterisert ved at substitusjonen er ved en posisjon ekvivalent til +123.

3. Subtilisinmutant ifølge krav 2, karakterisert ved at aminosyreresiduet i nevnte subtilisinmutant ved nevnte posisjon er serin.

4. Subtilisinmutant ifølge krav 1, karakterisert ved at den er avledet fra et Bacillus subtilisin.

5. Mutant Bacillus subtilisin ifølge krav 1 som oppviser .forbedret proteolytisk aktivitet, karakterisert ved at det er avledet fra naturlig forekommende eller mutant precursor Bacillus subtilisin som har aminosyreresiduet ved en posisjon ekvivalent til +123 i Bacillus am<y>loliguefaciens subtilisin endret til serin.

6. Mutant Bacillus subtilisin ifølge krav 1, karakterisert ved at det har aminosyresekvensen :

7. DNA, karakterisert ved at det koder for karbonylhydrolasemutanten ifølge krav 1.

8. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den koder for DNA ifølge krav 7 og er istand til å uttrykke det gitte genet.

9. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 8 .

10. Enzymatisk renseblanding som er i stand til å nedbryte proteiner, karakterisert ved at den omfatter: a) et overflateaktivt middel, og b) en subtilisinmutant med en aminosyresekvens som ikke er funnet i naturen, avledet fra en precursor subtilisinmutant ved å substituere en forskjellig aminosyre for aminosyreresiduet ved en posisjon i nevnte precursor som er ekvivalent til +123 eller +174 i Bacillus amyloliguefaciens subtilisin, som vist i figur 1.

11. Blanding ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte subtilisin har følgende aminosyresekvens:

12. Blanding ifølge krav 10, karakterisert ved at det overflateaktive middel omfatter en detergent.

13. Blanding ifølge krav 12, karakterisert ved at den omfatter en spray-tørket detergentgranul.