PT93933A - Metodos e materiais para a expressao de plasminogenio humano em um sistema de celula eucariotica a que falta um activador de plasminogenio de sitio especifico - Google Patents

Description

THE UNIVERSITY OF NOTRE DAME DU LAC

MÉTODOS E MATERIAIS PARA A EXPRESSÃO DE PLASMINOGENIO HUMANO EM UM SISTEMA DE CÉLULA EUROCARIOTICA A QUE FALTA UM ACTIVAPOR DE PLASMINOGENIO DE SITIO ES-

PECIFICO

Antecedentes A presente invenção refere-se, de um modo geral, a métodos e materiais para a expressão de plasminogénio e, em particular, a métodos e materiais para a expressão do plasminogénio humano num sistema celular de insectos infectados pelo vector do baculovírus e seus produtos que se encontram substancialmente isentos do activador do plasminogénio dos tecidos, de uroquinase e de estreptoquinase.

Impedem-se acumulações deletérias de coágulos da pr£ teína fibrina nos vasos sanguíneos pela degradação proteolítica (fibrinólise) da fibrina ou do seu precursor fibrinogénio, pelo enzima plasmina (Pm). Num grande número de perturbações, os depó_ sitos patológicos de fibrina não se degradam espontaneamente, daí resultando trombose, a presença de coágulos sanguíneos (trombos)

nos vasos sanguíneos. Em muitos casos, a terapia trombolítica,isto é, a dissolução de um coágulo de sangue por Pm, é o único tratamento susceptível de ser efectuado.

Pm é produzida na circulação pelo "pró-enzima" ou "zimogénio" designado por plasminogénio (Pg). Efectua-se a terapia trombolítica pela administração de um activador do plasminogénio. Entre tais activadores do plasminogénio encontram-se a estrepto-quinase (SK), a uroquinase (UK) e o activador do plasminogénio te_ cidular (TPA). 0 Pg humano (HPg) existe na circulação como uma gli-coproteína de cadeia única contendo 791 am-inoácidos com um amino-ácido Glu na extremidade amino (pode, assim, refererir-se o HPg circulante como o plasminogénio C Glu1 JT hjfForsgren et al. ,FEB5 Lett., 213 (1987) 254-260; Malinowski et al., Biochem., 23 (1984) 4243-4250; McLean et al., Nature 330 ( 1987); 132-137; Sottrup-Jeji sen et al., Prog. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis, 3 (1977) 191--209; Wiman, Eur. J. Biochem., 39 (1973) 1-9; e Wiman, Eur. J. Biochem., 76, (1977) 129-137 J. A análise da sequência de hidratos de carbono de HPg revela que existem duas variantes de glicosila-ção, uma primeira que possui dois sítios de glicosilação (Asn2®9 e Thr'^) e uma segunda que possui um sítio de glicosilação(Thr^) com sub-formas que apresentam silação incompleta C Castellino, Chem. Rev. 81, (1981) 431-446 J. Estas formas e sub-formas são exemplos de modificações pós-transferênciais apresentadas pelo plasminogénio circulante. -3- 0 Hpg é activado pela clivagem da ligação peptídica 561 562

Arg Vai para se obter a protease de serina humana Pm (HPm) com ligações de dissulfureto e de duas cadeias. Esta clivagem po de ser catalisada através de uma diversidade de activadores, entre os quais se encontram $K, UK e TPA. C Ver, Castellino e outros. Chem. Rev., 81 (1981) 431-446 J.

Embora a terapia trombolítica seja utilizável o seu potencial terapêutico encontra-se limitado pela disponibilidade do plasminogénio no sítio do trombo. A concentração do plasmino-génio pode ser limitada devido ao consumo de plasminogénio, como resultado de terapia trombolítica, a uma quantidade inadequada de plasminogénio presente no trombo ou a uma depleçlo local de plas_ minogénio relacionada com a idade do trombo e isquémia (uma anemia localizada devido a redução do fluxo sanguíneo) C Anderle e outros, Haemostasis, 1_8, (Suppl. 1), (1988) 165-175 7. Deste modo, é desejável um suplemento da quantidade de plasminogénio localmente disponível.

Embora a expressão de grandes quantidades de plasnú nogénio num sistema de expressão recombinante seja um modo conve niente para se obter plasminogénio para utilização na terapia trombolítica, existem grandes dificuldades na expressão do HPg intacto nos sistemas de expressão dos mamíferos devido à proxinú dade da presença ubíqua de activadores do plasminogénio intracelulares entre os tipos de células dos mamíferos. A presença destes activadores origina o aparecimento de uma forma degradada de HPg no meio celular condicionado de tais sistemas de expressão,a

partir, possivelmente da autodigestão do plasminogénio pela HPm produzida. C Busby e outros, Fibrinolysis, 2, (1988) 64 7

Por este motivo, é desejável possuir um sistema de expressão para o plasminogénio que evite a degradação que se verifica nos referidos sistemas.

Resumo da Presente Invenção A presente invenção proporciona células eucarióticas que não possuem activadores do plasminogénio específicos de um sí_ tio, de preferência células de invertebrados, proporciona um vec-tor de expressão que compreende um gene que codifica o plasminogé^ nio de preferência o plasminogénio humano, e proporciona, em espe ciai, um vector de expressão de células de insecto que inclui um gene que codifica HPg. 0 vector de expressão de células de insecto pode ser um vector do baculovirus e, de preferência, um vírus de poliedrose nuclear de Autographa california. Actualmente, prefere-se que o gene que codifica o plasminogénio humano codifique o C Glu ] plasminogénio a que a célula de invertebrado seja uma célula de Spodoptera frugiperda. A presente invenção também proporciona plasminogénio que difere do plasminogénio circulante numa modificação pós-tran-ferencial e que pode ser expresso por uma célula, de acordo com a presente invenção, uma célula Spodoptera frugiperda. Actualmente, dá-se preferência ao plasminogénio humano, especificamente o plas^

A minogénio [ Glu J. -5-

0 plasminogénio, de acordo com a presente invenção, possui uma conformação activa, (isto é, a molécula encontra-se adequadamente entrelaçada numa estrutura terciária que permite a activação para plasmina), encontra-se substancialmente isenta de activadores do plasminogénio e completamente isenta de de UK,SK e de TPA. Emprega-se a expressão " substancialmente isenta" para se fazer referência ao plasminogénio que que não apresenta degra dação (isto é, pelo menos 99% de.proteína intacta) numa mancha de Western efectuada conforme se indica no Exemplo 6 (adiante), após incubação durante 48 horas a 27°C. A presente invenção proporciona, para além disso, uma composição farmacêutica que contem um plasminogénio, de preferência um plasminogénio humano. Dá-se preferência a uma composição farmacêutica isotónica e filtrada em condições estéreis. A composição farmacêutica também pode conter um enzima fibrinolítico tal como TPA ou UK ou tal como SK comple xada com fibrogénio. 0 sítio activo do enzima fibrinolítico pode ser acilado.

Um método para expressão do plasminogénio humano,de acordo com a presente invenção, compreende o passo de cultivo das células eucarióticas que não possuem um activador do.plasminogénio específico de um sítio, de preferência células de invertebrados, contendo um gene que codifique um.plasminogénio sob condições que permitam a expressão do gene e, de preferência compreende o passo de infecção de uma célula de Spodotera frugiperda com um vírus de Autographa californica incluindo um gene que codifique um plasminogénio humano. 0 método pode também envolver a co-tranfecção de

% uma célula de insecto com um plasmídeo de transferência que inclua um gene que codifique HPg e com um ADN virai de Autographa californica de tipo selvagem. Pode produzir-se o plasminogénio, de acordo com a presente invenção, segundo estes métodos. A presente invenção engloba ainda ADN isolado que c£ difica o plasminogénio e que que se encontra ligado de modo funcional a um promotor, de preferência em que o ADN possui a totalidade ou uma parte funcional da sequência de código indicada na Figura 2. 0 ADN pode ser ADN genómico. 0 ADN pode incluir um pr£ motor funcionalmente ligado ao ADN e/ou uma sequência principal para secreção doplasminogénio pela célula. Presentemente prefere--se que o ADN inclua uma sequência de sinal ("signal") reconhecida pelas células do hospedeiro invertebrado.

Um método, de acordo com a presente invenção,inclui a administração a um paciente que necessite de terapia trombolí-tica de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, de acordo com a presente invenção e, de preferência, inclui a administração a um paciente que necessite de terapia trombolitica de uma quantidade eficaz de um composto farmacêutico que contenha um complexo de um plasminogénio e de estreptoquinase.

Um outro método, de acordo com a presente invenção envolve a preparação de um complexo binário entre o enzima fibrj_ nolítico, de preferência estreptoquinase, e plasminogénio,de pre ferência plasminogénio humano, possuindo o complexo o sitio cata lítico essencial para a actividade fibrinolítica bloqueada por um grupo removível por hidrólise. Este método compreende os passos : cultivo de células de invertebrados que não produzam um activador do plasminogénio endógeno e que se transformam com um vector de expressão que inclui um ácido nucleico que codifica o plasminogé nio sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico; re cuperação do plasminogénio a partir da cultura de células hospedeiras, de preferência a partir do meio de cultura celular;e mis tura do enzima fibrinolítico com o plasminogénio na presença de um excesso de um agente de bloqueador de fórmula geral A-B ou E--F, em que A representa um grupo que é selectivo para o sítio ca^ talítico essencial para a actividade fibrinolítica e que é capaz de transferência entre o grupo B e o grupo catalítico,B represeji ta um grupo que facilita a ligação de A ao enzima, E representa um grupo de localização que localiza o agente no sítio catalítico e F representa um grupo que é capaz de transferência entre o grupo de localização e o síti.o catalítico. Actualmente prefere--se que o agente AB seja £-nitrofeni1-p1-guanidinobenzoato, que o método inclua ainda o passo de isolamento do complexo binário assim formado e que o grupo E seja um grupo £-amidinofenilo ou 2-acetamidofenilo e que o grupo F seja um grupo benzoílo ou acr£ loílo.

Presentemente prefere-se que o grupo removível por hidrólise seja um grupo acilo, mais preferencialmente um grupo benzoílo, um grupo benzoílo substituído, um grupo acriloílo ou um

grupo acriloílo substituído. "Funcionalmente ligado", conforme aqui se utiliza, diz respeito à justaposição de tal modo que se possa efectuar a função normal dos componentes. Deste modo, uma sequência de códj_ go "funcionalmente ligada" a sequências de controlo diz respeito a uma configuração em que a sequência de código se pode expressar sob o controlo destas sequências e em que as sequências de ADN ligadas são contíguas e, no caso de uma sequência principal de secreção, são contíguas e em fase de transcrição.Por.exemplo; o ADN para uma pré-sequência ou para uma sequência principal de secreção encontra-se funcionalmente ligado ao ADN para um poli-péptido se se encontra expresso como uma pré-proteína que parti_ cipa na secreção do polipéptido; um promotor ou intensificador encontra-se funcionalmente ligado a uma sequência de código se afectar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ribo£ sómica encontra-se funcionalmente ligado a uma sequência de códi_ go se se encontrar posicionado para facilitar a transcrição da sequência de código. Efectua-se a ligação ligando nos sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, poderão então utilizar-se adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos de síntese, de acordo com a prática convencional.

De acordo can o modo cano aqui se utilizam, as designações "célula", "linha de células" e "cultura de células" são apH cadas de um modo intermutável e incluem todas a progénie. Assim, "transformantes" ou "células transformadas" incluem a célula in- -9-

dividual primitiva e culturas dela derivadas sem se ter em atenção o número de transferências. Deve ter-se também em conta que nem toda a progénie será precisamente idêntica em conteúdo de ADN devido a mutações intencionais ou não. Também se incluem nestes termos a progénie mutante que possui a mesma função para a qual a célula individual primitiva foi escolhida. Quando se considerarem designações distintas, isso será evidente a partir do conte_x to.

Na "co-transfecção", o ADN virai e um vector de trans ferência (plasmídeo) são aprisionados pela célula hospedeira. 0 ADN do plasmídeo pode ser transferido para o ADN virai por recom binação homóloga levando à produção de vírus recombinantes. 0 especialista terá conhecimento de numerosos métodos de transfecção, por exemplo, métodos em que se utiliza CaP04 e electroporação.Ge^ ralmente, reconhece-se a transfecção bem sucedida quando se dete£ ta o funcionamento do vector no interior da célula hospedeira. "Infecção" refere-se ao aprisionamento de um vector de expressão virai pela célula hospedeira e conduz à expressão de quaisquer sequências de código e à produção do vírus. "Transformação" significa a introdução de ADN no iin terior de -um organismo, de tal modo que o ADN seja replicável, quer como um elemento extra-cromossómico quer por integração cro. mossómica. Dependendo do hospedeiro utilizado, a transformação efectua-se utilizando técnicas normalizadas adequadas a essas células. Utiliza-se geralmente, um tratamento por cálcio, empregan- '10-

do cloreto de cálcio, conforme descrito por Cohen, Proc, Natl. Acad. Sei. (USA) 69,( 1972) 21 10-, para as células de procariotas ou para outras células que possuam consideráveis barreiras de parede celular. A "mutagénese dirigida de um sítio" consiste numa técnica normalizada na especialidade e leva-se a efeito utilizaji do um aprontadorCprimer") nucleotído sintético complementar de um ADN de bacteriófago de cadeia única que se pretende mutar, com excepção de combinações incompatíveis limitadas que represein tam a mutação desejada. Resumidamente, utiliza-se o oligonucleó-tido sintético como um promotor para conduzir a síntese de um cordão complementar para o bacteriófago e transforma-se o ADN de cordão duplo daí resultante no interior de uma bactéria hospedej^ ra que suporta o bacteriófago. Colocam-se as culturas de bactérias transformadas na parte superior de agar, permitindo a foriM ção de placa a partir de células individuais que englobam o bacteriófago. Teoricamente, 50¾ das novas placas contêm o bacteriófago, possuindo, na forma de um cordão único, a forma mutada.; 50% possuirão a sequência original. Hibridaram-se as placas com aprontador sintético tratado por quinase a uma temperatura que permitia a hibridação de uma união exacta, mas â qual as uniões incompatíveis com o cordão original fossem suficientes para evitar a hibridação. Seleccionaram-se e cultivaram-se as placas que se hibridaram com a sonda e recuperou-se o ADN. A expressão "sequências de controlo" refere-se a se quências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de código funcionalmente ligada, num dado organismo hospedeiro. A expressão "sistema de expressão" refere-se a ADN que contêm a sequência de código e a sequência de controlo desejadas em ligação funcional, de modo a que os hospedeiros transfo£ mados com estas sequências sejam capazes de produzir as proteínas codificadas. Para se efectuar a transformação, pode incluir-se o sistema de expressão num vector aqui designado por "vector de expressão". No entanto, pode, também, integrar-se o ADN relevante no cromossoma hospedeiro. " Modificação pós-transferencial", conforme aqui se utiliza, refere-se, em primeiro lugar,à glicosilação mas pode também envolver a proteólise, a fosforilação, a acilação, a sulfa

ção, a tf -carboxi1 ação ou a

Breve Descrição das Gravuras A Figura 1 é um mapa de restrição do vector ρ119PN127.6, de acordo com a presente invenção. A Figura 2 representa uma sequência nucleotídica para o vector ρ119PN127.6, incluindo uma sequência de aminoácidos deduzida para o plasminogénio humano; A Figura 3 é um gráfico que indica de modo esquemáti co a construção de um vector de transferência, de acordo com a -12-

presente invenção. A Figura 4 é um mapa de restrição que indica, de um modo esquemático, um vector de transferência do baculovirus, de acordo com a presente invenção; A Figura 5, representa manchas de Western de materiais das células hospedeiras, de acordo com a presente invenção; A Figura 6 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de activação de HPg produzido de acordo com a presente invenção; A Figura 7 representa um ensaio imunológico por pon_ tos ("immunodot assay") para HPg nas fracções recuperadas de uma coluna de purificação de acordo com a presente invenção; A Figura 8 ilustra um ensaio de mancha de Western de amostras de diversos estádios de purificação de acordo com a presente invenção; A Figura 9 é uma ilustração de uma análise electro-forética sobre gel de alíquotas de HPg ou HPg recombinante de acordo com a presente invenção, após activação pela uroquinase.

Descrição Pormenorizada

No sentido de se aplicar eficazmente a metodologia do ADN recombinante na produção de Pg, é importante ter um sist£ ma de expressão para esta grande e complexa molécula que não degrade o produto de expressão. Para este fim, é útil um sistema de -13-

* expressão de um invertebrado, devido ao facto de os activadores do plasminogénio não parecerem estar presentes nestas células.

De acordo com a presente invenção, obtém-se uma for ma funcional de C Glu1jPg por expressão de ADN de /TGlu1JPg nas células dos invertebrados ou nas células dos eucariotas que não possuem activadores do plasminogénio. De preferência, obtém--se a expressão em células dos insectos infectadas com baculovi-rus recombinante contendo o gene de Pg. 0 processo de expressão nestas células encontra-se ligado à produção de oclusões virais incluindo a de uma proteína principal de estrutura virai a polie drina.

Inseriu-se um cADN que codifica o plasminogénio humano de modo adjacente ao promotor da poliedrina no genoma do vj_ rus da poliedrose nuclear do baculovirus Autographa californica. Depois, utilizou-se o vírus para se infectarem células cultivadas da lagarta dos cereais Spodoptera fungiperda. 0 HPg recombinante (rec-HPg) foi segregado no meio de 24 horas apôs a infecção (p.i.), ponto este em: que não restava virtualmente nada de antfgeno rec-HPg no interior das cê lulas. As 48 horas p.i., encontrava-se presente no meio um nível máximo de rec-HPg intacto. 0 rec-HPg descoberto no meio era de, pelo menos 99¾ de proteína intacta (extensão total).

Em contraste, no sistema celular renal de um hamster de tenra idade (BHK) (Busby e outros, Fibrinôlvs, 2 (1988) 64) verificou-se o aparecimento no meio de menos de 10¾ do plasmino- -14- \ génio sintetizado. Apesar de se tratar de plasminogénio inicialmente de extensão total, foi rapidamente degradado para formas menores. No interior das células BHK apenas se descobriram formas degradadas de plasminogénio.

Em culturas de agrupamentos de células, de acordo com a presente invenção, após 48 horas p.i. o rec-HPg sofreu considerável digestão proteolítica. Detectou-se esta digestão pe la observação de bandas imuno-reactivas numa análise de mancha de Western de amostras de culturas que tinham sido semeadas com 5 2 3,5 X 10 células/cm . Estas bandas surgiram para pesos moleculares inferiores ao do rec-HPg nativo. Com o decorrer do tempo,a intensidade da banda nativa diminuiu e as intensidades das bandas de menor peso molecular aumentaram. Além disso, também diminuiu o peso molecular das bandas menores. A' digestão proteolítica observada após 48 horas p.i. parecia ocorrer quando as células se encontravam agrupadas (isto 5 2 é, para 3,5 X 10 /cm ) e actualmente prefere-se que as células 5 2 sejam cultivadas a uma densidade inferior (1,33 X 10 células/cm ) Conforme se pode verificar na Figura 5, não existe aparentemente, degradação, mesmo decorridas 93 horas p.i. quando se plaqueiam as células a uma densidade inferior. A porção de proteína de rec-HPg produzida por este sistema de expressão possuía um peso molecular substancialmente 1 equivalente ao do plasminogénio Γ Glu J do plasma. 0 rec-HPg foi adsorvido em Sepharose-1 isina e eluído com ácido £-aminoca- -15-

próico. A proteína recombinante interactuava com os anticor pos policlonais gerados para o HPg do plasma, bem como com um a_n 1 -3 ticorpo monoclonal dirigido contra uma região distinta (Kringles da molécula HPg plasmática, de um modo equivalente ao da proteína do plasma humano. Finalmente, o rec-HPg expresso pela célula de insecto era activável para plasmina pela uroquinase. Estes resul_ tados demonstram que o sistema de expressão de acordo com a presente invenção produz um plasminogénio recombinante de cordão úni_ co funcional de extensão total (rec-Pg) que se pode isolar sob uma forma intacta a partir do meio de cultura, tendo em consideração os fenómenos temporais que ocorrem na secreção e na degradação a longo prazo da proteína. Pode converter-se o rec-HPg, de acordo com a presente invenção, em Pm, por um activador que inter actue com os anticorpos policlonais e monoclonais anti-Pg plas-mático, bem como com o ligando, o ácido ^-aminocapróico. Estes resultados indicam que a molécula conserva as importantes proprie_ dades funcionais referidas (isto é, que é Pg funcional), e que está correctamente dobrada.

Assim, um gene de Pg incorporado no interior do gen£ ma de um baculovirus pode expressar-se em uma forma funcional com pleta nas células dos insectos infectadas com um virus recombinaji te. Crê-se que esta expressão em uma forma funcional completa não foi conseguida até à data nos sistemas de expressão dos mamífe ros. 16-

Conforme aqui se utiliza, "plasminogénio" ou "Pg", refere-se a um plasminogénio, tal como o plasminogénio humano que possui a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2, conjuntamente com os seus análogos e variantes que possuem a ac-tividade biológica do Pg humano nativo. A actividade biológica do Pg nativo é compartilhada por qualquer seu análogo ou varian te que seja capaz de ser clivado por um activador do plasminogé nio ( por exemplo, estreptoquinase, uroquinase ou activador do plasminogénio tecidular)·. Para produzir plasmina ou que possui um epítope imunológico que reage imunologicamente de modo reticular com um anticorpo lançado contra pelo menos um epitope .do Pg nativo. Definem-se análogos ou variantes como moléculas nas quais a sequência de aminoacidos, glicosilação ou outras carac-teristicas do Pg nativo foram modificadas de modo covalente ou não covalente. As variantes das sequências de aminoacidos incluem não apenas alelos da sequência da Figura 2, mas, também, as suas mutações pré-determinadas. Geralmente, as variantes da sequência de aminoacidos possuem uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, cerca de 80¾ de;homologia e, mais tipicamente, pelo menos cerca de 90¾ de homologia em relação ao Pg nativo da Figura 2. Daqui em diante, o termo Pg dirá respeito tanto à sequência nativa como a forma variante, salvo indicação em contrá^ rio. Ί

No C Glu J Pg, uma cadeia pesada de plasmina laten_ te, que inclui os resíduos 1-561, contêm cinco regiões altamente >Ί7- homólogas designadas por "Kringles" C Sottrup-Jensen et al.,Prog. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis, 3 (1977) 191-209J,contendo cada uma delas, aproximadamente, 80 aminoácidos. Estes Kringles existem muito provavelmente como domínios independentes ZTCastellino et al., J. Biol. Chem., 256 (1981) 4778-4782 J e são importantes para as propriedades funcionais de HPg e de HPm. Como exemplos, o domínio Kringle 1 ( restos aminoácidos 84-162 ) pode ser importante na interacção da plasmina ou do plasminogénio com a fibrina ou com o fibrogénio [ Lucas et al., J. Biol. Chem., 258 (1983) 4249-4256 7 e conter o forte sítio de ligação (G1u^) Pg para o efector positivo, ácido £ -aminocapróico (EACA) C Markus et al., J. Biol. Chem., 253 (1978) 727-732 7· Além disso, este mesmo segmento é responsável pela rápida ligação inicial de HPm ao seu inibidor plasmático principal, <X2-antiplasmina 7Morol et al., J. Biol. Chem., 251 (1976) 5956-5965^ A região Kringle 4 (restos 358-435) parece conter o(s) sítio(s) de ligação fracos EACA presente em [ Glu J Pg, que pode encontrar-se envolvido na 4 grande alteração de conformação de [ Glu J Pg induzida pelo ligando [ Violand et al., J.. Biol. Chem., 251 (1976) 3906-3912 7»e num concomitante aumento da taxa de activação do zimogeno na pns sença do efector positivo EACA, £*Claeys et al., Biochim. Biophys. Acta, 342, (1974) 351-359.

Encontra-se incluído no âmbito da presente invenção o Pg expresso em uma célula eucariótica que contem o Pg que possui uma glicosilação original na sequência de aminoácidos,confojr -18- me adiante se indica na Figura 2,proteínas análogas a Pg provenientes de outras espécies animais tais como bovinos, equinos, porcinos, ovinos, caninos, murinos, felinos e similares derivados desglicosilados ou não glicosilados de.tais proteínas Pg e variantes de sequências de aminoácidos biologicamente activas de Pg, incluindo alelos e derivados covalentes gerados in vitro de proteínas Pg que demonstravam actividade plasminogénica.

As variantes das sequências de aminoácidos de Pg,i_n cluem, por exemplo, eliminações, inserções ou substituições de restos da sequência de aminoácidos de Pg indicada na Figura 2. Pode efectuar-se qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição, para se atingir a construção final, desde que a construção possua a actividade desejada.E óbvio que se prefere que as mutações efectuadas no ADN que codifica a variante de Pg não coloque a sequência fora da faixa de transcrição e,prefere--se para além disso, que não se criem regiões complementares que poderiam produzir estruturas secundárais de mARN (ver, por exemplo a publicação do pedido de patente de invenção europeia Π- 075 444).

As inserções na sequência de aminoácidos incluem f]j sões da extremidade amino- e/ou carboxi que vão desde um resto a polipéptidos de extensão essencialmente não limitada, bem como inserções intrasequenciais de restos de aminoácidos simples ou múltiplos. As inserções intra-sequenciais, (isto é, as inserções -19-

na sequência do HPg maduro) podem atingir,geralmente, 1 a 10 res_ tos, de um modo preferencial 1 a 5 restos). Um exemplo de uma iji serção terminal simples é o HPg maduro com um resto de metionilo na extremidade N. Esta variante pode obter-se com um artefacto da expressão directa de rec-Pg na cultura de células recombinan-tes, isto é, expressão sem uma sequência de sinal ("signal") para comandar a secreção ou associação da membrana celular de rec--Pg maduro. Outros exemplos de inserções nas extremidades incluem: (1) fusões de sequências de sinal, tanto heterólogas como homólogas, na extremidade N de rec-Pg maduro para facilitar a secreção do rec-Pg maduro a partir dos hospedeiros recombinantes, (2) fusões de polipéptidos imunogénicos ( isto é polipéptidos suficieii temente grandes para conferir imunogenicidade à sequência alvo), por exemplo, polipéptidos bacterianos, tais como a /3-lactamase, (3-galactosidase, ou um enzima codificado pelo locus trp da E. col i, e (3) fusões com substâncias que se ligam à superfície de células, tais como as âncoras de membrana. As fusões com substân_ cias que se ligam à superfície das células não necessitam de ser produzidas pelos métodos recombinantes, mas podem ser o produto de associação covalente ou não covalente com rec-Pg. 0 terceiro grupo de variantes é aquele no qual se removeu pelo menos um e, de preferência, apenas um resto de ami-noácido na molécula de rec-Pg, tendo-se inserido em seu lugar um resto diferente.Tais substituições efectuam-se, geralmente, com o Quadro 1, seguinte, quando se deseja modular finamente as carac teristicas de rec-Pg. / QUADRO 1

Resto Original Substituições Exemplificativas

Ala Gly; Ser Arg Lys Asn Gin; His Asp Glu Cys Ser Gin Asn Glu Asp Gly Ala; Pro His Asn; Gin Ile Leu; Vai Leu Ile; Vai Lys Arg; Gin; Glu Met Leu; Tyr; Ile Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Vai Ile; Leu

Podem efectuar-se alterações substânciais na função ou na identidade imunológica, seleccionando substituições que s^ jam menos conservadoras do que as do Quadro 1, isto é, seleccionando restos que diferem mais significativamente no seu efeito ou conservando (a) a estrutura da cadeia polipeptídica na área de substituição, por exemplo, como uma conformação em faixa ou em hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o tamanho da cadeia lateral. As substituições que, em geral se espera produzam as grandes alterações nas propriedades de rec-Pg serão aquelas em que la) a glicina e/ou a prolina são substituídas por outro aminoácido ou eliminadas ou inseridas; (b) um resto hidrófilo por exemplo serilo ou treonilo, substitui ( ou é substituído por) um resto hidrofóbò',?, por exemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo ou alanilo; (c) uma cisteína substitui (ou é substituída por qualquer outro resto; (d) um re£ to com uma cadeia lateral electropositiva, por exemplo lisilo, arginilo ou histidilo, substitui (ou é substituído por um resíduo eletronegativo, por exemplo glutamilo ou aspartilo; ou (e) um resto com uma cadeia lateral volumosa, por exemplo fenilalani_ na, substitui (ou é substituído por) outro que não possua uma tal cadeia lateral, por exemplo glicina.

Podem preparar-se as variantes por mutagénese coman^ dada de ;um sítio de nucleótidos no ADN que codifica o Pg, produzindo desse modo o ADN que codifica a variante e que, por isso, exprime o ADN na cultura de células de invertebrados. -22-

Também se pode sintetizar quimicamente e reunir o ADN que codifica Pg ou as suas variantes, de acordo com qualquer uma das numerosas técnicas, antes da expressão numa célula hosp£ deira. [ Ver, e.g., Caruthers, patente de invenção norte-america_ na P 4 500 707; Balland et al., Biochimie, 67 (1985) 725-736 ; Edge et al., Nature, 292 (1982) 756-762 J.

Podem preparar-se, convenientemente, por sintese in vitro, fragmentos de variantes de Pg tendo até cerca de 100 restos .

As variantes apresentam, de um modo caracteristico, a mesma actividade biológica qualitativa das formas que ocorrem naturalmente.

Embora o sítio para se introduzir uma variação da sequência de aminoácidos seja pré-determinado,a própria variação não necessita de ser pré-determinada. Por exemplo,para se optimi-zar as caraeterísticas de uma mutação num dado sítio, podem efec-tuar-se mutagéneses aleatórias no codão ou região alvo e podem rastrear-se as variantes de Pg expressão quanto à combinação óptima da actividade desejada. As técnicas para se efectuarem muta_ ções de substituição em sítios pré-determinados do ADN que possuí uma sequência conhecida, são bem conhecidas, tal como a mutagéne-se do aprontador ("primer") M13.

As eliminações da sequência de aminoácidos, atingem, geralmente cerca de 1 a 30 restos, maia preferencialmente 1 a 10 -23- e habitualmente são contíguas. Não se espera qua a maioria das eliminações e inser ções e, em particular, as substituições, produzam alterações radicais nas características da molécula de rec-Pg. No entanto, quando se torna difícil prever o efeito exacto da substituição, eliminação ou inserção,antes de o fazer, por exemplo quando se modifica o sítio activo de Pg ou um epitope imunolôgico, o especialista verificará que pode avaliar o efeito por ensaios de ras^ treio rotineiros. Por exemplo, pode efectuar-se habitualmente uma variante por mutagénese especifica de um sítio do ácido nucleico que codifica o Pg nativo, expressão da variante de^ácido nucleico na cultura de células recombinantes e, opcionalmente purifica^ ção da cultura de células, por exemplo, por adsorção em imuno--afinidade numa coluna anti-Pg policlonal de coelho ( para absojr ver a variante por, pelo menos, um epítope restante ). Pode então, efectuar-se o rastreio da actividade do lisado celular ou da variante de Pg purificada, num ensaio de rastreio adequado à característica desejada. Por exemplo, pode medir-se uma alteração no carácter imunolôgico de Pg, tal como a afinidade para um dado anticorpo, segundo um ensaio imunolôgico competitivo. Medem--se as alterações nos níveis de activação, de acordo com ensaios adequados. As modificações de propriedades de proteínas tais como estabilidade redox ou térmica, hidrofobicidade, susceptibi1i-dade à degradação proteolítica ou a tendência para se agregar a veículos ou em multimeros, ensaiam-se de acordo com métodos bem conhecidos na especialidade. Em princípio, de acordo com a pre- -24- ílr ΰ -Λ sente invenção, qualquer cultura de células é susceptível de ser trabalhada, quer seja uma cultura proveniente de vertebrados quer de invertebrados, se as células não contiverem activadores endógenos do plasminogénio. Para os presentes propósitos, " activad£ res do plasminogénio " são enzimas que activam o plasminogénio do zimogeno para originar a plasmina protease de serina ( por cliva^ gem em Arg 560 Vai561 ) que degrada diversas proteínas, incluindo a fibrina. Entre os activadores do pl-ãsminogénio encontram-se a estreptoquinase, uma proteína bacteriana, a uroquinase, um enzima sintetizado no rim e noutras partes e originalmente extraído a partir da urina, e o activador do plasminogénio tecidular humano, um enzima produzido pelas células de revestimento das p_a redes dos vasos sanguíneos.

Podem empregar-se os micróbios eucariotas, tais como as culturas de leveduras, de acordo com a presente invenção. 0 Saccharomyces cerevisiae, ou o vulgar fermento de padeiro, é o mais vulgarmente utilizado de entre os microorganis^ mos eucariotas, apesar de se encontrarem habitualmente disponíveis numerosas outras estirpes. Por exemplo, para expressão no Saccharomyces, utiliza-se, vulgarmente o plasmídeo YRp7 C Stinch^ comb et al., Nature, 282 (1979) 39; Kingsman et al., Gene, 7 (1979) 141 ; Tschemper et al., Gene, 10 (1980) 157 J7- 0 plasmídeo contém o gene trpl que proporciona um indicador de selecção para uma estirpe mutante de levedura que não possui a capacidade de se desenvolver em triptofano, por exemplo, ATCC Ns 44 076 ou PEP4-1 [ Jones, Genetics, 85 (1977) 12 J. A existência da lesão trpl como uma característica do genoma das células hospedeiras de levedura proporciona um ambiente eficaz para a detecção de transformação,por crescimento na ausência de triptofano.

As sequências promotoras adequadas nos vectores de levedura incluem os promotores para 3-fosfogliceratoquinase C Hi tzeman et al., J. Biol. Chem.,255 (1980)112073-12080 ou outros enzimas glicaliticos Hess et al., J. Adv. Enzyme reg., 7 (1968) 149; Holland et al., Biochemistry, 17 (1978) 4900 J7, taTcomo enola-ses, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruva-to-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomera-se, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvatoquinase, triosefosfato-iso-merase,fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. Na construção de plasmídeo de expressão adequados, também se ;ligam as sequências de terminação associadas a estes genes no vector de expressão 3‘ da sequência que se deseja exprimir para proporcionar a poliade-nilação do mARN e a terminação. Outros promotores, que têm ainda avantagemcde a transcrição ser controlada pelas condições de crescimento, são a região promotora para a desidrogenase alcoo'lj_ ca 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradantes associados ao metabolismo do azoto e o gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase anteriormente mencionado e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose. Qualquer vector plasmídico que contenha um promotor compatível de levedura,uma origem de re plicação e sequências de terminação é adequado. -26- y \

Além dos microrganismos, também se -podem utilizar como hospedeiros as culturas de células derivadas de organismos multicelulares. Em princípio, é possível trabalhar-se com qualquer cultura destas células, quer sejam de vertebrados quer de invertebrados. Dá-se preferência às células que naturalmente não contêm activadores endógenos do plasminogénio, tais como as células dos invertebrados. Aqui, "activadores do plasminogénio" são enzimas que activam o plasminogénio do zimógeno para originar a plasmina protease de serina (por clivagem do plasminogénio em Arg -Vai ) que, por sua vez degrada diversas proteínas, incluindo a fibrina. "Activadores do plasminogénio específicos de um sítio" tal como aqui se utiliza, diz respeito â estrepto-quinase (uma proteína bacteriana), à uroquinase (um enzima sinte tizado no rim e noutras partes e originalmente extraído da urina) e do activador do plasminogénio tecidual humano ( um enzima produzido pelas células de revestimento das paredes dos vasos sanguíneos).

Podem, também utilizar-se células de vertebrados C£ mo células hospedeiras,mesmo se elas contiverem activadores endó_ genos do plasminogénio na natureza, desde que se eliminem os genes que codificam tais activadores antes de se utilizarem de acordo com a presente invenção. A propagação das células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de^rotina nos últimos anos. Exemplos de tais linhas de células utilizáveis como hospedeiros que podem sofrer mutações incluem as células VERO e HeLa, linhas de células de ovário de hamsters ctU neses (CHO) e as linhas de células W138, BHK, COS-7, 239 e MDCK.

Os vectores de expressão para essas células incluem vulgarmente (se necessário) uma origem de replicação, um promotor localizado em frente do gene que se pretende exprimir, com quaisquer sítios de ligação ribossómica necessários, sítios de união de ARN, sítios de poliadenilaçlo e sequências de terminação de transcrição.

Para se utilizarem nas células dos mamíferos, as funções de controlo nos vectores de expressão são muitas vezes proporcionadas por materiais virais.Por exemplo, os promotores usualmente utilizados derivam do poliomavírus, do adenovírus 2 e mais frequentemente do vírus de símio 40 (SV40).0 primeiro e o último promotor do vírus SV40 são particularmente úteis, uma vez que se obtêm facilmente a partir do vírus como um fragmento que também contém a origem virai de replicação de SV40 £"Fiers et al-, Nature, 273 (1978) 113 J. Também se podem utilizar fragmentos me nores ou maiores de SV40 desde que incluam a sequência de aproxj^ madamente 250 pb que se estende desde o sítio Hind III até ao s£ tio Bgl I localizado na origem virai de replicação. Alémdisso, também é possível, e muitas vezes desejável, utilizar sequências promotoras ou de controlo nomeadamente associadas com a sequência do gene, desde que estas sequências de controlo sejam compatíveis com os sistemas das células hospedeiras.

Pode proporcionar-se uma origem de replicação por construção do vector a incluir na origem exógena, tal como pode /*-28- \ ser derivado de SV40 ou de outras fontes virais (por exemplo,po-liomavírus, adenovírus, VSV, BPV) ou pode ser proporcionada pelo mecanismo de replicação cromossómico da célula hospedeira. Se o vector se encontrar integrado no cromossoma da célula hospedeira, o último é muitas vezes suficiente.

Na selecção de uma célula hospedeira preferencial por transfecção pelos vectores da presente invenção que compreeii dem as sequências de ADN que codificam Pg e a proteína DHFR, é adequado seleccionar o hospedeiro de acordo com o tipo de prote£ na DHFR empregue. Se se utilizar proteína DHFR de tipo selvagem, é preferível seleccionar uma célula hospedeira com a deficiência de DHFR, permitindo assim, a utilização da sequência de código de DHFR como um indicador para a transfecção bem sucedida num meio selectivo que não possua hipoxantina, glicina e timidina. Nesta caso, uma célula hospedeira adequada consiste na linha de células do ovário do hamster chinês (CHO) que é deficiente em activ_i_ dade de DHFR (preparada e propagada conforme descrito por Urlaub et al., Proc. NatM. Acad. Sei. (USA) ,77/(7) ( 1980) 4216-4220 ) e que produz deficiência na actividade do activador do plasminogé-nio, de acordo com a presente invenção.Pode efectuar-se a eliminação ("deletion") dos genes activadores do plasminogénio, de acordo, geralmente, com os procedimentos de Thomas et al., Natu-re, 324 (1988) 34-38; Sedivy, Bio/Techonology, 6 (1988) 1192-1196; Rauth et al., Proc. NatM. Acad. Sei.(U.'S.A.)83J 1986)5587-5591 ;A.yares et al., Proc. NatM. Acad. Sei. (USA), 83 (1986) 5199-5203;Roiz- -29- man et al., patente de invenção norte-americana N9 4 769 331; e Maniatis, Nature, 317 (1985) 205-206.

Se se utilizar a proteína DHFR com baixa afinidade de ligação para MTX, com a sequência controladora, não se torna necessário utilizar células deficientes em DHFR. Dado que a DHFR mutante é resistente ao metotrexato, pode utilizar-se meio que contenha MTX como uma via de selecção desde que as células hospedeiras sejam por si mesmas sensíveis ao metotrexato. A maioria das células eucariotas que são capazes de absorver MTX parecem ser sensíveis ao metotrexato. Uma linha de células utilizável ê uma linha CHO, CH0-K1, CH0-K1 (ATCC N9 CCL61).

Identificaram-se numerosas estirpes e variantes de buculovirus e as correspondentes células hospedeiras permissivas a partir de hospedeiros tais como Aedess aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito),. Drosphila melanggaster (mosca da fru ta) e células hospedeiras de Bombyx mori. ΖΓ ver, e.g., Luckow et al», Bio/Technology, 6 (1988) 47-55 ; e Maeda et al., Nature,315 (1985) 592-594 J. Encontra-se disponível ao público uma diversidade dessas estirpes virais, por exemplo, a variante L-1 de Auto-grapha califórnica NPV e a estirpe Bm-5 Bombyx mori NPV, e podem utilizar-se tais virus, como o vírus de acordo com a presente iii venção, especialmente para transfecção das células da Spodoptera frugiperda.

Λω-

Podem utilizar-se, como agentes tromboliticos, complexos formados entre os enzimas fibrinolíticos e o plasminogé-nio, de acordo com o descrito em Smith e outros, patente de invenção norte-americana N9 4 808 405, cuja descrição se inclui aqui como referência e que se ilustra no Exemplo 11, adiante. Re sumidamente, pode preparar-se um derivado enzimático que compreende um complexo binário entre estreptoquinase e plasminogénio, cujo complexo possui um sítio catalítico essencial para a activj^ dade fibrinolítica bloqueada por um grupo que é removível por tú drólise, de tal modo que a constante de velocidade de pseudo-pri_ meira ordem para hidrólise do derivado se encontra no intervalo compreendido entre 10~ seg e 10 seg , em meio aquoso isotó^ nico a pH 7,4 a 37°C, desde que o grupo que bloqueia o sítio catalítico não seja um grupo p-guanidino-benzoílo. Exemplos desses grupos adequados incluem grupos acilo, tais como o benzoílo, beii zoílo substituído, acriloílo ou grupos acriloílo substituídos.

Um método para a preparação de complexos inclui a mistura de estreptoquinase com plasminogénio na presença de uma quantidade em excesso de um agente de bloqueio de -fórmula geral A-B ou E-F em que A representa um grupo que é selectivo para o sítio catalítico essencial para a actividade fibrinolítica e que é capaz de transferência do grupo B para o sítio catalítico e em que B Ee-presenta um grupo que facilita a ligação de A ao enzima; E repre senta um grupo de localização que localiza o agente no sítio catalítico e, por isso, pode isolar opcionalmente os derivados assim formados, de preferência,o grupo removível por hidrólise ê 31-

.% um grupo acilo, mais preferencialmente um grupo benzoílo, benzojf lo substituído, acriloílo ou acriloílo substituído, por exemplo benzoílo substituído por átomos de halogéneo, ou por grupos alquilo C^-Cg, alcoxi C^Cg, alcanoiloxi C^-Cg ou alcanoil (C^-Cg)--amino ou acriloílos substituídos com radicais alquilo C^-Cg, fu-rilo, fenilo ou fenilalquilo, C^-C . também, de um modo preferencial, AB ê £-nitrofenil-p_ -guanidinobenzoato, o grupo E é p-ami-dinofenilo ou p-acetamidofenilo e o grupo F é um grupo benzoílo ou acriloílo. 'Também se encontram contempladas como uma parte da presente invenção composições farmacêuticas que contêm plasmino-génio humano. 'Tais composições incluem de um modo preferencial um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico tal como solução-tampão aquosa isotónica ou "água para injectaveis" de grau farmacêutico. Além disso a presente invenção engloba composições farmacêuticas que contêm um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico juntamente com um enzima fibrinolítico, de preferência um complexo do enzima com o plasminogénio e mais pre ferencialmente um complexo binário de estreptoquinase e plasmin£ génio e, ainda de um modo mais preferencial, um complexo jp-ani-soíl-estreptoquinase/plasminogénio sem clivagem da ligação peptí_ dica interna, de acordo com Smith e outros, patente de invenção norte-americana N9 4 808 405. Num outro aspecto, o sítio activo do complexo responsável pela actividade fibrinolítica é bloqueado por um grupo que é removível pela hidrólise de tal modo que a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem para a hidróli- -32- - fi se do complexo se encontra no intervalo compreendido entre 10 seg. e 10 seg. em meio aquoso isotónico a pH 7,4 a 37°c.

Formulam-se as composições de acordo com a presente invenção, segundo procedimentos normalizados para a administração parenteral a seres humanos.

Habitualmente, as composições para administração iji travenosa são soluções do derivado esterilizado em tampão aquoso isotónico esterilizado. Se necessário, a composição também inclui um agente solubilizante do complexo. Geralmente, fornece-se o complexo sob a forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco ou concentrado isento de água, num recipiente selado,tal como uma ampola. Para administração por infusão, administra-se o complexo a partir de um frasco de infusão contendo Agua para Injecção de um grau farmacêuticamente estéril. Para administração por injecção, administra-se o complexo a partir de um pequeno frasco de água esterilizada para injecção. Far-se-à a composição injectável ou de perfusão misturando os ingredientes antes da administração. A quantidade eficaz do complexo administrada dependerá de muitos factores, incluindo a quantidade de fibrinólise requerida e a velocidade que é necessária, a extensão da trombo-embolia e a posição e tamanho do coágulo, mas a quantidade é geralmente determinada pelo resultado que se pretende alcançar,isto é, a lise ou coágulo. Por exemplo, um paciente com embolia pulmonar ou com um trombo que ponha em risco a sua vida, necessj^ tará de uma pílula de um produto de actuação rápida. Por outro lado, se se deseja prevenir a formação de trombos pós-operatórios é particularmente útil uma pequena quantidade de um produto de actuação lenta. A dose precisa a empregar e o método de administração deverão ser decididos de acordo com as circunstâncias verificadas pelo médico. No entanto, de um modo geral, um paciente tratado para um trombo de tamanho médio receberá uma dose diária de 0,10 a 1,0 mg/Kg de peso do corpo ou por injecção (até oito doses) ou por perfusão.

Nos Exemplos que se seguem surgirão descrições mais específicias de métodos, materiais e produtos, de acordo com a presente invenção.

No Exemplo 1, descreve-se a construção de um vector de transferência que contém HPg.

No Exemplo 2, descreve-se um ensaio no qual as célu^ las hospedeiras são co-transferidas com o vector de transferência do Exemplo 1 e um baculovírus de tipo selvagem.

Exemplo 3, o ADN de um vector virai é examinado quaji to à presença de ADN de HPg por análise de mancha de Southern.

Exemplo 4 consiste na descrição de uma cultura de células infectadas com o vector virai que contém HPg e da puriH cação de rec-HPg expresso por essas células. 34-

No Exemplo 5 descreve-se uma experiência de verificação da expressão ao longo do tempo de rec-HPg nas células hospedeiras.

No Exemplo 6, descreve-se uma análise de mancha de Western das células e meios do Exemplo 5. 0 Exemplo 7 é uma descrição de um imuno-ensaio quaji titativo das células e meios do Exemplo 5. 0 Exemplo 8 inclui a descrição de um ensaio de acti vação efectuado em HPg proveniente de materiais de culturas do Exemplo 5.

NoExemplo 9, descreve-se a preparação de rec-HPg em maior escala do que no Exemplo 4. 0 Exemplo 10 é a descrição da activação de Pg, de acordo com a presente invenção, pela uroquinase. 0 Exemplo 11 é a descrição da construção de um complexo estreptoquinase-plasminogénio utilizando o HPg preparado, de acordo com a presente invenção.

No Exemplo 12, divulgam-se métodos para a construção de células que não possuem um activador do plasminogénio específico de um sítio e de células que se podem produzir de acordo com esses métodos. -35-

* .% EXEMPLO 1

Utilizando endonucleases de restrição adquiridas na Promega (Madison, Wisconsin), de acordo com as condições especí-fidas pelo fornecedor, construiu-se um vector baculovírus que continha ADN que codificava HPg.

Preparou-se, conforme se segue, um plasmídio que se designou por pUC119PN127.6. Isolou-se um primeiro cADN a partir de uma biblioteca de cADN n-oligo(dT)-aprontado ("primed")construído a partir do mARN de fígado isolado a partir de cinco indj_ vfduos. £ Okyama et al., Mol. Ce11. Biol., 2 (1982) 161-170 e Gubler et al., Gene, 25,(1983) 263-269J. Ligaram-se os cADNs de tamanhos seleccionados (superior a 600 pares de bases) aos vecto. res do bacteriófago X gt10 (Stratagene, San Diego,, Califórnia) e restreou-se sem amplificação £ Drayna et al., Nature, 327, ( 1987) 632-634/. Ligou-se o cADN ao vector *gt10 utilizando um ligante, conforme se segue.

Eco RI Sac I/SstI Sal I TL gt 10: GAATTCT CGAGCTC GTCGACC: cadn

Recuperou-se um clone de cADN de λ gt10 com uma sonda oligonucleotídica de 75 bases (PL.1), que correspondia aos nucleótidos 1306 a 1308 do cADN do plasminogénio humano C Fors-gren et al., FEBS Lett., 213 (1987) 254-260 Hibridaram-se os -36- -36-

filtros em 5 X SSC (NaCl 150 mM, citrato de tri-sódio 15 mM), fosfato de sódio 50rrM(pH 6,7), 5 X solução de Denhardt, formamida a 20%, sulfato de dextrano a 10% e 20 jug/ml de ADN de esperma de salmão tratado por ultra-sons e fervido, a 42°C durante uma noite e lavou-se durante 1 hora em 2 X SSC, SDS a 0,1% a 55°C e ex-pôs-se a uma película de raios X. Cortou-se com SStI um clone gt 10 (designado por^gt10:pmgn#127) e ligou-se ao pUC 119 cortado em SStI para se obter pUC119PN127.6, cujo mapa de restrição se encontra ilustrado na Figura 1 e cujas sequências nucleo-tídica e de aminoácidos estão ilustradas na· Figura 2.

Efectuou-se a sequência do clone para acabamento. Efectuou-se a análise sequencial do ADN de acordo com o método de terminação da cadeia didesoxi em ambos os cordões do cADN de cadeia dupla subclonado C Sanger et al., Proc., Nat'l. Acad.Sci. (USA), 74 (1977) 5463-5461], quer dtrectamente sobre o ADN de cordão duplo ou sobre matrizesde cordão simples O Chen et al., ADN, 4 (1985) 165-170. após subclonagem no interior do vector p UC119.

Construiu-se um vector de transferência pAV6 para incluir as sequências de ADN que circundavam o gene AcMNPV da p£ liedrina ( PH). 0 plasmídeo pAV6 contém o promotor de poliedrina de 1,8 Kb desde um sítio Xho I localizado na extremidade 5' do g_e ne PH até ao nucleotído -8 do codão de iniciação (ATG) da poliedrina. 0 plasmídeo pAV6 também inclui um fragmento de 1,5 Kb que se estende do sítio Κρη I no gene da poliedrina até ao sítio Bam Hl da extremidade 3* do mesmo gene. Os sítios Xho I e Bam Hl pe_r -37-

deram-se durante a clonagem destes fragmentos.

Construiu-se o vector de transferência pAV6, confor me se segue e, conforme ilustrado na Figura 3. Cortou-se com Xho I e Bam Hl (as digestões com Sal I e Xho I produzem extremidades compatíveis) um fragmento Eco RI de 7,2 Kb de ADN de Autographa californica designado por pEcoRI-I ΖΓ Smith et al., J. Virol,, 45 (1983) 215-225; Smith et al., J. Virol., 46, (1983) 584-593 J, contendo o gene da poliedrina e as sequências de flanco. Ligou--se o fragmento Xho I/Bam Hl resultante no interior dovector mp19 cortado por Sal I e Bam Hl (Bethesda Research Laboratories, Gaitherburg, Maryland) para formar a construção designada por mp19Xho-Bam. Cortou-se o plasmídeo mp19Xho-Bam com Eco RV e Κρη I e ligou-se um primeiro oligonucleótido sintético (construído como todos os ol igonucleótidos referidos adiante, num sintetizador de ADN automático, modelo 380 A, comercializado por Applied Bio-systems, Foster City, Califórnia) no interior do mp19Xho-Bam cor tado para produzir o vector designado por mp19A1D. 0 primeiro oligonucleótido sintético tinha a sequência seguinte, incluindo os sítios de restrição edeúniciação da transcrição indicados. -38- \

X \

iniciação da transcrição

5' -GATTACATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAAGGATCCGAAT 3' -CTATAGTACCTCTATTAATTTTACTATTGGTAGAGCGTTTCCTAGGCTTA

Eco RV Bam Hl Eco RI

TCGTCGACGGTACC AGCAGCTGCCTAGG Sal I Κρη I 0 primeiro oligonucleótido sintético substituiu uma sequência na extremidade 51 do fragmento Xhol/Bam Hl no mp 19Xho -Bam a partir de um sítio Eco RV até um sítio CAP putativo e inclui um sítio de clonagem múltiplo possuindo os sítios Bam Hl, Eco RI, Sal I e Κρη I. A seguir, cortou-se um vector pUC12 (Bethesda Research Laboratories com Hind III e SstI, cortou-se mp 19A1D com Hind III e Κρη I e, isolou-se um fragmento de 1,8 Kb contendo as sequências que flanqueiam a extremidade 5' do gene da poliedrina Cortou-se 0 plasmídeo pEcoRI-I com Bam Hl e Κρη 1 e de entre os produtos da digestão isolou-se um fragmento de 1,5 Kb que se estendia desde 0 sítio Κρη I no gene da pliedrina até ao sítio Bam Hl na sua região que ladeia a extremidade 3' . Ligaram-se estes três fragmentos (pUC12, 1,8 Kb e 1,5 Kb) com um segundo oligonu-cleôtido sintético que possuía a sequência 5* -GATCAGCT, para se

produzir uma construção designada por pAV1. Após ter-se cortado pAV1 com Bam Hl e Κρη I, ligou-se o fragmento resultante a um terceiro oligonucleótido sintético para se produzir uma construção designada por pAV2. 0 terceiro oligonucleótido sintético tinha a sequência nucleótidica seguinte:

Nru I

Bgl II Sst I Bam Hl Bst Eli

Xba I Sma I

5' -GAT CTA GAT CTG AGC TCG CGA TGG ATC CCG GGT AAC 3’ -AT CTA GAC TCG AGC GCT ACC TAG GGC CCA TTG

Κρη I CGG TAC GC

Construiu-se um plasmídeo pDS, cortando pBR322 (o plasmídeo de 4,4 Kb adquirido nos Bethesda Research Laboratories) com Hind III e Sal I, preenchendo-o com o fragmento Klenow e ligando-o. Assim, o plasmídeo pDS não possui as sequências compreendidas entre Hind III e Sal I e perde o sítio Sal I, mas consejr va o sítio Hind III.

Cortou-se o plasmídeo pAV2 com Hind III e Bam Hl e isolou-se um fragmento Hind III/Bam Hi de 1,5 Kb (que continha a -40-

sequência que flanqueia a extremidade 5*). A seguir, cortou-se pAV2 com Bam Hl e Eco RI e isolou-se um fragmento Eco RI/Bam Hl de 1,5 Kb que se estendia desde o sítio bam Hl no sítio de clo-nagem múltipla até ao sítio Eco RI adjacente à sequência que flanqueia a extremidade 31)· Cortou-se o plasmídeo pDS com Hind III e Eco RI e ligaram-se os dois fragmentos originados a partir de pAV2. Designou-se porpAV3 o plasmídeo resultante.

Cortou-se o plasmídeo pAV3 com Bam Hl e Sal I. Cortou-se um vector pAC373 £ Smith et al., Mol. Cell., Biol.,3 (1983) 2156-2165 J (contendo o ADN virai de NPV desde um sítio sal I de cerca de 1 Kb da extremidade 5* do gene da poliedrina até um sítio Bam Hl inserido no nucleótido -8 (sendo o "A" do s_í_ tio de iniciação "ATG" de +1) com bam Hl e SAI I e ligou-se ao pAV3 cortado com Bam ΗΙ/Sal I para se produzir um vector designa_ do por pAV4.

Cortou-se o vector pAV4 com EcoRI, preencheram-se as extremidades com fragmento Klenow e ligaram-se para produzir o vector designado por pAV6 (que não possui o sítio Eco RI de pAV4).

Excisou-se do plasmídeo ρ119PN127.6 um fragmento Bam HI/Nae I contendo um cADN que codifica toda a sequência amino ácida de HPg na forma de (Glu 1) e, inseriu-se nos sítios Bam Hl e Sma I do plasmídeo pAV6. Na Figura 4 encontra-se ilustrado um

mapa de restrição do plasmideo de transferência resultante, desig nado por pAV6HPg, que comanda a expressão de HPg. Na Figura 4, os sítios de restrição encontram-se abreviados conforme se segue:R, Eco RI; X, Xho; V, Eco RV; H, Hind III; S, Sma I; K, Κρη I, e N, Nae I. 0 plasmídeo pAVôPHg contém o promotor AcMNPV da po-1iedrina (PH) ligado à sequência de sinal ("signal") de HPg e à sequência que codifica o C Glu maduro. A inserção HPg conti_ nha ( de 5' a 31 ) 20 bases de pUC119, 38 bases de ligante mais sequências não transferidas de 5* ,57 bases da sequência de sinal de: HPg, 2373 bases da sequência final de HPg transferida e processada, 322 bases das sequências não transferidas de 3.1 mais a sequência de poli-A e um ligante e 367 bases de pUC119. 0 sítio Bam Hl em pAV6 encontrava-se localizado numa posição correspondente ao oligonucleótido -8 do gene de PH (8 nucleótidos localizados na extremidade 51 do resto de metionina de iniciação de PH) Depositou-se o vector de transferência pAVôPHg no hospedeiro E. coli.DH5 oc a 18 de Abril de 1989, na Americam Type Culture Col-lection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, com o número de depósito 67929. EXEMPLO 2 yti1izaram-se a construção pAV6H0g e um ADN virai de tipo selvagem Para contransfectar células de uma cultura de Spodoptera frufliPerda« Numa célula, o "crossover" entre as regiões homóloga5 Pue flanqueiam a poliedrina do vector de transfe rência e do vírus proporciona um vírus recombinante em toda a sua extensão, portador do gene HPg em lugar do gene de PH.

Utilizou-se a estirpe resistente à inactivação pelo calor, AcTR, do vírus da poliedrose nuclear de Autographa cali-fornica (AcMNPV) como o vírus hospedeiro para as construções re combinantes. Pode utilizar-se uma linha de células de Spodoptera frugiperda clonada ('por. exemplo células Sf9, como as que se encon_ tram disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland sob o número de depõsito A.T.C.C. CRL 1711) ou não clonada para proporcionar células hospedeiras para o crescimento e manipulação de todos osvírus C Vaughn et al., In Vitro,13 (1977) 213-217 7- Os procedimentos para a cultura das células de· insec-tos estão descritos em Summers et al., Texas Agricultural Expe-riment Station Bulletin No. 1555, (1987), páginas 10-31 e 38,com excepção de se terem utilizado no procedimento da pág. 38 o meio Anteraea de Grace pulverizado de Gibco o meio de Hink ( em vez do meio TNM-KH) e uma mistura dos antibióticos' penici 1 ina/estreja tomicina/anfotericina B. -43- ./ .%

De um modo específico, deixou-se aderir a um disco g de cultura de 60 mm, as células de Spodoptera frugiperda (3X10 ), em meio de Hink í Hink, Nature, 226,(1970) 466-467 J mais soro de feto de bovino a 10¾ (FBS) [ Smith et al., Mol.· Cel 1. Biol., 3^, (1983) ,2156-21657. Dacorridas duas horas, removeu-se o meio e incubaram-se as células em 0,5 ml de suspensão de ADN de tipo selvagem proveniente de AcMNPV (0,1 ^g) mais o ADN proveniente do plasmídeo de transferência pAV6HPg (1 jjg) em NaCl (0,8 g/1), KC1 (0,37 g/l)/Na2H2P04+2H20(0,125 g/1), dextrose (1 g/1) e Hepes-NaOH (5 g/1) a pH 7,2. Após incubação durante a noite a cerca de 27°C, removeu-se a suspensão de ADN e incubaram-se as células durante 5 dias em meio de Hink mais FBS a 10%.

Podem, também, cultivar-se as células de Spodoptera frugiperda em suspensão, utilizando recipientes de agitação a baixa velocidade Corning (New York, New York) num agitador magné tico a baixa velocidade (Thermolyne Corp., Dubuque, Iowa). A cada recipiente de agitação de 1000 ml adicionaram-se 300 ml de meio incompleto de Hink (enriquecido com FBS a 8,3% e mistura de penici1ina/estreptomicina/anfotericina B, conforme referido an- g tes). Depois inoculou-se o recipiente com 5 X 10 células e agitou-se a 80 rpm. Efectuou-se uma subcultura das células quando g estas atingiram uma densidade de 2-3 X 10 células/ml, removendo 150-250 ml da suspensão celular e substituindo por meio recentemente preparado. As células desenvolvidas em suspensão ligam-se aos frascos e podem depois utilizar-se nos procedimentos em que são necessárias monocamadas. Também se podem desenvolver as célu_

las num meio definido EX-CELL 400 de baixo teor de proteínas ,pro_ duzido por JR. Scientific, Woodland', Califórnia. Pode utilizar--se este meio em substituição do meio completo de Hink para se efectuar a cultura de células em monocamadas, em culturas em sus_ pensão em tubos em agitação ou em bio-reactores de elevação por ar C q.v. Maiorella et al., Biotechonology, 6, (1988) 1406-141®.

Examinaram-se as placas de ensaio a progénia dos rus de co-transfecção. Escolheram-se e purificaram-se repetindo duas vezes mais os ensaios de placa, os vírus das placas negativas dos corpos de oclusão (0B ), observados ao microscópio de luz. A presença de tais placas indicou que o vírus infectante 1 já não produzia a proteína PH e que o gene C Glu JPg podia ter substituído as sequências de pH virais. EXEMPLO 3

Prepararam-se manchas de Southern a partir de produ_ tos de digestão de Eco RI das preparações de ADN a partir de três vírus 0B~ purificados em placa. g

Deixou-se que as placas (3 X 10 ) se ligassem a caixas de Petri de 60 mm e, depois, infectaram-se com três vírus 0B~ purificados em placa a uma multiplicidade de 10 X. Decorridas 72 horas p.i., efectuou-se a suspensão das células pipetando cuidadosamente e sedimentando a 3500 g, durante 20 minutos a 16° C. -45-

.%

Suspendeu-se o sedimento celular e efectuou-se a sua lise em is£ tiocianato de guanidina 4M/sarcosilo a 0,5%/citrato de sódio 5 mM/ β -mercaptoetanol 0,1 M. Extraiu-se quatro vezes a solução resultante com fenol/clorofórmio e precipitou-se duas vezes o ADN com etanol.

Efectuou-se a digestão com Eco RI das três amostras de ADN de vírus, ADN de vírus de tipo selvagem e do vector de transferência original pAV6HPg e submeteu-se a análise de mancha de Southern. Separaram-se as amostras digeridas sobre um gel de agarose a 0,85¾ e efectuou-se a sua electro-mancha sobre uma membrana de "nylon" utilizando uma unidade de transferência Bio--rad (Bio-rad, Richmond, california) e controlo Bio-rad para os geis não desnaturados. .Marcaram-se as cópias dos plasmídeos ρ119PN127.6 e pUC13 contendo HPg com 32p, por marcação radioactj_ va ("nick translation" )/ciescrita de um modo geral por Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,' Cold Spring Har-bor Laboratory, New York (1982) 109-112, 387-389* a Southern,J. Mol. Biol., 98 (1975) 503-517.7e, utilizaram-se como sondas de hibridação. Incubaram-se os filtros a 37°C durante 3 horas em fluido de pré-hibridação C descrita de um modo geral por Maniatis e outros., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982) 109-112, 387-389 lavaram--se duas vezes com água e depois incubaram-se durante 18 horas a 37°C, tendo sido cada uma das sondas dissolvida em fluído de pré--hibridização. Removeu-se a sonda marcada e eliminou-se a radio- -46- / % actividade não específica agitando lentamente o filtro, durante 45 minutos a 37°C em EDTA 10 mM/NaDodS04 a 0,2%(p/v), a pH 8,0. Mudou-se a solução de lavagem 4 vezes. Visualizaram-se as faixas hibridadas por auto-radiografia.

Uma placa indicou a presença de uma nova banda numa posição que correspondia ao fragmento Eco RI de 2,2 Kb do gene de HPg no vector de transferência ( não se indicam os dados). Utilizou-se este clone virai designado por Pg3A,nos Exemplos seguintes. Análises de mancha de Southern de ADN de Pg3A indicaram que o gene de [ Glu J Pg se encontrava inserido no ADN virai. EXEMPLO 4 5 2

Inocularam-se 2 X 10 células/cm num total de 45 balões de cultura de tecidos (150 cm2) contendo 20 ml de Meio de Hink mais soro de .feto de bovino a 10% e infectaram-se as células com uma multiplicidade de 3 X de vírus Pg3A. Decorridas 48 horas, decantou-se o meio de cultura, adicionaram-se 10 unidades/ /ml de aprotinina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) e removeram-se as células residuais e os fragmentos celulares por centrifugação a 13000 g durante 10 minutos, a 4°C. Salvo indicação em contrário, todos os passos de purificação se efectuaram a 4°C. Conservou-se o sobrenadante e efectuou-se a sua diãlise coii tra 4 mudanças de fosfato de sódio 5mM (pH 8,0) e depois liofiH zou-se. Após ser dissolvido numa quantidade mínima de H^O fez-se passar o sobrenadante por uma coluna de afinidade de 5 ml de Sep-harose-lisina [ Brockway et al., Arch. Biochem. Biophys., 151 (1972) 194-1997 a um débito de 0,5 ml/minuto. Depois, lavou-se a coluna com fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4) e eluiu-se com fosfa_ to de sódio 100 mM/EACA 25 mM (pH 8,0) ou com um gradiente linear (30 ml X 30 ml) de EACA (0 EACA, concentração inicial; EACA 20 mM, concentração-limite) em fosfato de sódio 0,1 M (pH 8,0). As fracções que mostraram conter Pg (por análise de manchas a pontos), agregaram-se dializaram-se contra três mudanças de água, liofilizaram-se e armazenaram-se a -20°C.

Na análise imunológica de mancha a pontos, utilizaram-se membranas de nitrocelulose com um aparelho de micro-filtração BioRad. Adicionaram-se as amostras ( 50 jul ) às cavida des e prosseguiu-se a análise conforme descrito no manual de in_s truções da BioRad.Uti1izou-se anti-HPg de coelho para se dectec-tar a presença de Pg, seguido de anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina. Após ter-se removido as membranas do ap^ relho, visualizaram-se as cavidades positivas, conforme descrito para a análise Western, adiante.

Analisaram-se culturas em pequena escala ( em caixas de petri de 60 mm), das células de insecto infectadas com Pg3A* no que se referia à expressão de rec-HPg, de acordo com ensaios ELISA mancha de Western e de activação. 0 rec-HPg activá-vel observou-se, pelo menos em três ocasiões, conforme se demonstrou pelos resultados positivos alcançados num ensaio antigénico 48- ELISA e pelos resultados positivos num ensaio de activação mas também se observaram as formas degradadas de proteína. Ror esse motivo, se efectuou um estudo da expressão ao longo do tempo. EXEMPLO 5

Numa experiência ao longo do tempo, removeram-se as amostras de células e o sobrenadante celular âs 24, 48, 66, 70, 74, 80 e 93 horas, p.i.. Para cada momento utilizaram-se oito placas de 60 mm: placas infectadas de tipo selvagem (AcMNPV) e c p falsas ("mock") ( 1,8 X 10 células/cm ) ; e duas placas para ca 4 2 5 da uma das três densidades celulares 7 X 10 células/cm ,1,8 X 10 2 5 2 células/cm e 3,5 X 10 células/cm , cada uma delas infectada, conforme anteriormente descrito, com uma multiplicidade de 3 X ou de 10 X de vírus Pg3A.

Quando se removeu a suspensão de vírus, lavaram-se as células com Meio de Insecto de Grace (Gibco, Grand Island,

New York) e prosseguiu-se a incubação em meio de Grace. Nos momentos indicados, obtiveram-se as soluções de^trabalho para cada amostra por suspensão das células relevantes no meio de crescimento onde residiam, por pipetagem cuidadosa, seguida de centrifugação para se separar orneio de sedimento celular. Efectuou-se nova suspensão em PBS do sedimento lavado e efectuou-se a sua li_ se por agitação turbilhonar na presença de contas de vidro. Agre-garam-se, por centrifugação os detritos resultantes e conservou- -49-

-se o sobrenadante. As 24, 48, 66, 70, 74, 80 e 93 horas, p.i., ensaiaram-se quanto à presença do antigénio HPg o meio e o sobrenadante celular sedimentado, de acordo com ensaios ELISA e de mancha Western e quanto ao nível de proteína activãvel segun do um ensaio de activação. EXEMPLO 6

Para a análise Western das células e meios do Exem pio 5, separaram-se as amostras de proteína por NaDodS04/PAGE C Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685 J sobre géis de poliacril_ amida a 9% (p/v) sob condições não redutoras. Transferiram-se as bandas de proteínas separadas para nitrocelulose, de acordo com os princípios gerais de Burnette, Anal. Biochem., 112 (1981) 195-203. As condições de transferência foram a 4°C em Tris-HCl 20 mM/glicina 150mM/metanol a 20% (v/v), a pH 8,3, a 19 volts, durante 18 horas. Lavaram-se os filtros com Tris-HCl 20 mM/NaCl 500 mM a pH 7,5 (TBS) e depois incubaram-se a 37°C durante uma hora em gelatina a 1% (p/v) (grau bio-rad EIA) em TBS (tampão de bloqueio). Substituiu-se esta solução por outra que continha 2 jug/ml de anti-HPg de coelho ( Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) em tampão de bloqueio e incubaram-se à temperatura ambiente durante 90 minutos com agitação. Lavaram-se os filtros

TM com 5 mudanças de Tween-20 a 0,05% (v/v) em TBS (tampão de lavagem), à temperatura ambiente durante 30 minutos. Seguidamente incubaram-se os filtros com anti-IgG de cabra desenvolvida no coelho e conjugada com fosfatos alcalina, em tampão de bloqueio, -50-

durante 90 minutos à temperatura ambiente, com agitação e depois lavaram-se conforme descrito antes. Visualizaram-se as bandas po sitivas após incubações à temperatura ambiente com solução de subs trato (16,5 mg de nitro azul de tetrazólio/0,5 ml de solução aqu£ sa de DMF a 70% (v/v) / 8,5 mg de fosfato de bromocloroindoílo em 1 ml de água a qual se adicionou a 50 ml de Tris/HCl 0,1 M/NaCl 0,1 M/MgC 12 0,005 M a pH 9,5). Interrompeu-se a reacção por lava_ gem com diversas mudanças de água.

Na Figura 2, encontram-se ilustrados os resultados obtidos a partir da análise de Western a uma multiplicidade virai de 10 X, em cuja figura as manchas Western mostram a evolução ao longo do tempo da secreção de Hpg no meio a partir de três cultu ras respectivas de células de Spodoptera frugiperda infectadas com o vírus recombinante, pAV6HPg, que contém o péptido de sinal ("signal") e a sequência que codifica HPg. Infectaram-se com uma multiplicidade de 10 X de pAV6HPg três densidades celulares (0,7 X 105, 1,8 X 105 e 3,5 X 105 células/cm1).

Na Figura 5, indicam-se as manchas de Western das 5 2 células hospedeiras a uma densidade de 0,7 X 10 células/cm e que segregam HPg, de acordo com a presente invenção, de materiais das células hospedeiras, de acordo com a presente invenção,a uma 5 2 densidade de 1,8 X 10 células/cm e que segregam HPg, de acordo com a presente invenção e, de materiais das células hospedeiras, 5 de acordo com a presente invenção, a uma densidade de 3,5 X 10 1 células/cm e que segregam HPg, de acordo com a presente inven- ção. Nos três casos as pistas 1 e 2 representam, respectivamente, células e meio, a partir de uma infecção virai de tipo selvagem ; as pistas 3 e 4 representam, respectivamente, células e meios 24 horas p.i., com o vírus recombinante pAV6HPg; as pistas 5 e 6 re presentam, respectivamente, células e meios, 48 horas p.i. com pAV6HPg; as pistas 7-11, correspondem respectivamente a amostras de meios provenientes de células infectadas com pAV6HPg às 66 horas, 70 horas, 74 horas, 80' horas e 93 horas, p.i..

Conforme indicado pelos resultados ilustrados na Figura 5, o péptido de sinal ("signal") de HPg é reconhecido pelas células de insecto. Isto pode ser facilmente observado para a densidade de células mais elevada, em que às 24 horas p.i. o antj^ génio rec-HPg se observa na amostra celular. Pelas 48 horas p.i., observa-se que, aproximadamente 90¾ do antigénio rec-HPg se encontra no meio. Em momento algum se observou um resultado positivo tanto para as células falsamente infectadas como para as infec_ tadas por AcMNPV. As duas densidades celulares mais baixas não se observou degradação vísivel de rec-HPg, mesmo 93 horas p.i.. No entanto, à densidade celular mais elevada, em que as células se encontram extremamente aglomeradas a degradação era claramente vísivel, com início às 48 horas p.i..Uma vez descoberta as condições sob as quais rec-PHg permanecia intacto e era segregado no meio, não se realizou a base para esta degradação. A partir dos estudos da expressão ao longo do tempo, ilustrados na Figura 5, é evidente que se podem encontrar facil- 2- mente as condições tais que HPg, susceptível de ser reconhecido pela sua reactividade contra um agregado de anticorpo policlonal originado contra o HPg plasmãtico, seja segregado no meio.

Como se pode também verificar na Figura 5, a banda de rec-HPg consiste num dupleto. No plasminogénio do plasma huma no observa-se um tal dupleto devido à presença de duas formas d_i_ ferencialmente glicosiladas da proteína C Koltringer et al., Atherosclerosis, 58 (1985) 187-198; Rhoads et al., JAMA, 256 2540-2544 (1986); Brown et al., Science, 232, (1986) J EXEMPLO 7

Para determinação dos níveis de rec-HPg presentes nas células e sobrenadantes das culturas do Exemplo 5, utilizou--se um ensaio de imuno-adsorção ligado a um enzima (ELISA) numa variante de um procedimento publicado XTPloplis et al., Bioche-mistry, 21, (1982) 5891-5897J7- Cobriu-se uma placa de polivini-lo com um agregado de anticorpo policlonal anti-HPg de cabra (sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri), adicionou-se a amostra de ensaio e deixou-se prosseguir a incubação à temperatjj ra ambiente durante 1 hora.Após lavagem das placas com fosfato de sódio 10 mM/NaCl 150 mM (PBS) a pH 8,0, adicionou-se um anticorpo anti-HPg de coelho ( 2 jug/ml em BSA-PBS a 1% ). Obteve-se um agregado de anti-HPg de coelho na Boehringer Mannheim (India-napolis, Indiana ). Detectou-se o segundo anticorpo com um anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina, após hidrólise

do indicador, fosfato de p-nitrofenilo, pela fosfatase alcalina adsorvida. 0 limite inferior de detecção foi de aproximadamente 30 ng/ml relativo a Ç Glu J Pg normalizado obtido por purifica_ ção de plasma humano recente sobre Sepharose-lisina, geralmente de acordo com os procedimentos de Brockway et al-, Arch. Biochem Biophys., 151, (1972) 194-199 .

Numa análise quantitativa do nível de antígeno pre sente nas células sobrenadantes destas culturas, conforme ilustrado na Figura 5, descobriu-se pouco antigénio rec-HPg mensurá^ vel nas células em momentos anteriores a 24 horas p.i.. Embora haja alguma dispersão nos resultados obtidos após análise do meio, o antigénio é segregado a níveis de 0,7-1,0 jjg/10^ células, durante aproximadamente 66 horas p.i. Observaram-se pequenas diferenças significativas nos níveis do antigénio rec-HPg em compa_ ração com as infecções das células com multiplicidades de vírus de 3 X e de 10 X. A partir de estudos da expressão ao longo do tempo, torna-se evidente que é possível estabelecer facilmente condições tais que HPg, reconhecível pela sua reactividade em relação a uma mistura ("pool") de anticorpos policlonais gerados contra HPg de plasma, seja segregado no meio a níveis de cerca de 1 ^ig/ml.

EXEMPLO 8

Para determinação da função de rec-HPg para materiais derivados das culturas do Exemplo 5, levaram-se a efeito dois ensaios de activação nos quais se removeu o zimogénio do meio antes da activação por reagentes seguros para a dobragem e_s pecífica da molécula da proteína. No primeiro ensaio, efectuou--se a adsorção nas cavidades de uma placa de polivinilo de um anticorpo monoclonal, região Krigle 1-3, anti-HPg do rato, desi£ nado por 35-J-4, seguindo-se-lhe as amostras de ensaio. No segun_ do ensaio, bloquearam-se as cavidades do aparelho de manchas a pontos com papel 3 MM e adicionaram-se 50 1 de Sepharose-1 isina mais uma vez seguido da amostra de ensaio. Originaram-se linhas de células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais,ra_s trearam-se e estabilizaram-se, conforme descrito por Ploplis e outros, Biochemistry, 21 (1982) 5891-5897.

Lançou-se o anticorpo monoclonal 35-J-4 contra a re gião Kringle 1-3 de HPg e purificou-se por cromatografia de afinidade em HPg-Sepharose. Isolou-se a região Kringle 1-3 de HPg (restos 79-355) por digestão limitada com elastase, seguida de cromatografia de afinidade em Sepharose-lisina. Utilizando ensaios ELISA Z” Ploplis et a 1., Biochemistry, 21 ( 1982) 5891-5897 ^7, de- terminaram-se as seguintes constantes de dissociação (avidez) pa_ 1 -8 ra este anticorpo: £ Glu J Pg, 2 X 10 M; a cadeia pesada da

O 70 _Q plasmina (restos 1-561), 3 X 10 M; [ Lys J Pg, 2,7 X 10 M; ο a região Kringle 1-4 ( restos 80-440), 4,1 X 10 M; e a região o

Kringle 1-3 (restos 80-338/354), 3,9 X 10 M. Não se observou qualquer ligação para o HPg reduzido e carboximetilado, para a região Kringle 4 intacta, para a protrombina ou para o activador do plasminogénio tecidual, todas elas proteínas contendo regiões Kringle.

Em cada ensaio,· após incubação com a amostra, duran_ te 1 hora à temperatura ambiente, lavou-se cada tubo com fosfato de sódio 0,1 M, a pH 8,0, seguido de HEPES- NaOH '10 mM/NaOAc 100 mM, a pH 7,4 ( tampão de reação ) e activou-se com uroquinase (cerca de 100 mM em tampão de reacção). A uroquinase de cadeia dupla de rim humano foi uma oferta dos Abbott Laboratories e encontrava-se na sua maior parte sob a forma de.-baixo peso molecular. Adicionou-se uma solução de substrato cromogénico de plasmi-na, D-val-leu-lys-£-nitroani1 ida (S2251 ) (concentração final de 0,5 mM) e incubou-se durante, pelo menos, 6 horas a 37°C. Mediu--se a absorvância a 405 nm, resultante da libertação de £-nitro-anilida de S2251, e comparou-se com a absorvância produzida por duas diluições em série com C Glu J Pg normalizado em lugar de amostras de ensaio. A Figura 6 ilustra os resultados de um ensaio de aç_ tividade efectuado nas mesmas amostras que se .utilizaram para se obter a Figura 5. Na Figura 5, ensaiou-se a capacidade de activa. çao pela uroquinase das amostras da Figura 5, após interacção das amostras de ensaio com um anticorpo monoclonal para a região 6- V;

Kringle 1-3 de HPg, adsorvidas em cavidades de uma placa de mi-crotitulação de cloreto de polivinilo. As ordenadas representam a hidrólise derrendimento de substrato de plasmina, S2251, medi_ da durante um período de 6 horas após activação como a absorvâji cia a um comprimento de onda de 405 nm. Na Figura 6, os símbolos a cheio representam resultados para amostras de meios, os símb£ los não preenchidos representam resultados para células, os cír culos indicam resultados para células infectadas com uma multiplicidade de vírus de 3 vezes e os quadrados indicam os resultjj dos para as células infectadas com uma multiplicidade de vírus de 10 vezes.

Encontra-se presente alguma actividade nas amostras de células âs 24 horas, p.i., que decresce para zero, pelas 66 horas, p.i.. Ao mesmo tempo, a maior parte do rec-HPg activável ê segregada no meio, o que aumenta levemente das 70 horas até às 90 horas. Obtiveram-se resultados qualitativamente semelhantes sem se ter em conta se se tinha utilizado anticorpos monoclonais 35-J-4 (Kringle 1-3} de anti-HPg humano desenvolvido no rato ou um suporte de afinidade Sepharose-lisina, para se remover de modo selectivo rec-Hpg da amostra de ensaio antes da activação.

Nos ensaios de activação, determinou-se um nível mjí ximo de actividade do plasminogénio entre as 66 e as 72 horas,A£ tualmente, prefere-se que o meio seja recolhido entre as 48 e as 54 horas. 57-

Vr 0 rec-HPg é susceptível de ser activado para plasnn na, após a sua remoção do meio, segundo dois métodos específicos, isto é, reactividade contra um anticorpo monoclonal que é confo_r macionalmente dirigido para as regiões do domínio Kringle 1-3 da molécula (Figura 6) e pela afinidade de HPg para o ligando EACA (dados não apresentados), que também se encontra dependente da integridade das conformações das regiões Kringle de Hpg. Deste modo, não só o rec-HPg é segregado pelas células do insecto numa conformação adequada para a sua activação, como também é dobrado de modo adequado pela interacção com um anticorpo monoclonal específico, bem como de um pequeno ligando, que exerce uma função reguladora importante na activação de HPg. EXEMPLO 9

Levou-se a efeito uma preparação de re'c-HPg em lar- q ga escala, na qual se infectou um total de 1,4 X 10 células com uma multiplicidade de 3 X do gene de HPg codificado pelo vírus. Decorridas 48 horas p.i., decantou-se um total de 1300 ml de meio a partir das células e ensaiou-se quanto à presença de rec-HPg. Após diálise extensiva contra fosfato de sódio 5 mM (pH 8,0) e concentração do meio por liofilização, voltou a dissolver-se amostra em água e efectuou-se a percolação numa coluna de Sepha-rose-lisina, conforme descrito antes e eluiu-se o rec-HPg com um gradiente 0-20 mM de EACA. Identificou-se o rec-HPg por um ensaio de mancha imunológica por pontos ("immunodot") com anticorpos po- -58-

liclonais anti-HPg humano desenvolvido no coelho. A Figura 7 ilustra os resultados de um ensaio de mancha imunológica por pontos para se detectar a presença de HPg nas fracções recuperadas a partir da separação por cromatografia de afinidade numa coluna de Sepharose-1isina ( após eluição com um gradiente de EACA dos meios de cultura recolhidos a partir das células de insecto infectadas com pAV6HPg. Adsorveram-se sobre papel de nitrocelulose alíquotas das fracções obtidas a partir da coluna através das cavidades de um aparelho de manchapon-tos. Detectou-se a presença de HPg no papel por análise de mancha imunológica, após a adição de anti-HPg de coelho seguida de anti-IgG no coelho desenvolvida na cabra e conjugada com fosfata^ se alcalina. Adquiriu-se uma mistura ("pool") de anticorpos polj_ clonais de cabra anti-HPg plasmâtico humano, na "Sigma Chemical Company" e uma mistura ("pool") semelhante de anticorpos policl£ nais de coelho anti-seres humanos obteve-se na Boehringer-Mannheim

Na Figura 7, o início do gradiente de EACA (0-20 mM) encontra-se indicado por um símbolo ny". A concentração de EACA no início e no fim de fracções consecutivas contendo rec-HPg indica-se lesquerda, respectivamente, de 2F e 4 E. As manchas por pontos 5A-E são de uma coluna de lavagem de EACA 100 mM e 5F e G não apresentam resultados. A última mancha indicada é um HPg plasmâtico normalizado a uma concentração de cerca de 200 ng/ml. Pode seguir-se o progresso da eluição a partir da coluna, pela

leitura da placa da parte superior para a parte inferior (A-H) e da esquerda para a direita (1-5).

Os resultados que se indicam na Figura 7, demonstram que se eluiu o antigénio rec-HPg a concentrações de EACA compreendidas entre 8 mM e -12 mM que é, aproxinradamente, a me_s ma posição da cromatografia de afinidade da variante 1 de HPg do plasma humano C Brockway e outro., Arch. Biochem. Biophys. 151 ( 19 7 2) 194-1997- A intensidade da interacção de rec-HPg segregado pela células de insectos com EACA é semelhante ao de HPg plasmático nativo, uma vez que se eluiu o rec-HPg num intervalo de EACA con_ centração semelhante ao que é necessária para se eluir especifi-camente o HPg plasmático a partir desta mesma coluna de cromato-grafia de afinidade (Figura 7). Assim, em combinação com os resultados dos Exemplos anteriores, estes dados sugerem fortemente que o rec-HPg detectável segregado pelas células de invertebrados existe numa conformação muito semelhante à do HPg nativo. A Figura 8 ilustra uma mancha de Western de amostra obtidas de diversas etapas de procedimentos em larga escala purificado pela cromatografia de afinidade em coluna, descrita na Figura 7. As amostras, transferidas electroforeticamente a partir de gel de NaDodSO^/PAGE para papel de nitrocelulose, foram coradas para proteína total (Janssen Auro Dye forte stain) ou úe tectadas por ensaio imunológico para HPg, conforme se descreveu antes para as Figuras 5 e 7. A pista 1 corresponde a uma mistura -60- / >r normalizada de variantes de afinidade I e II de HPg. A pista 2 corresponde aos meios de cultura das células de insecto infecta^ das por pAV6HPg, coradas para proteína total. A pista 3 corresponde ao HPg purificado a partir de meios de cultura representa_ dos pela pista 2, corados para proteína total. As pistas 4-6 são tal como nas pistas 1-3, respectivamente imunocoradas, conforme anteriormente descrito em conexão com as Figuras 5 e 8.

Na Figura 8, a colaração de proteína total indica que o fluído da cultura condicionada das células de insectos coii tém três bandas principais de proteína (pista 2), uma das quais se identifica como HPg, por coloração imunológica (pista 5).Idein tificou-se o material eluído a partir da coluna de Sepharose-1i-sina como HPg pela coloração de proteína total (pista 3) e por coloração imunológica (pista 6).

Os géis da Figura 8 (pista 3 e 6) demonstraram que o HPg isolado possui aproximadamente o mesmo peso molecular da cromatografia de afinidade da variante 1 de HPg plasmático que é a sua forma mais glicosilada. De facto, os dados da Figura 8 (pista 2 e 5) indicam que HPg é um dos três produtos principais segregados pelas células infectadas por pAV6HPg, sob as condições dadas. EXEMPLO 10

Examinou-se a activação de rec-HPg por um activador do plasminogénio. Prepararam-se duas misturas reaccionais, con- 61-

Sc tendo 100 jjg/ml de rec-HPg ou 100 jig/ml de HPg plasmático em He-pes-Na-OH 10 mM, pH 7,4. No tempo 0, removeu-se uma alíquota de 30 jul de cada reacção e adicionou-se a 15 jul de tampão de carga NaDodSO^/PAGE ^Laemnili, Nature, 227 (1970) 680-685.7» contendo -mercaptoetanol. Depois adicionou-se uroquinase (UK) às misturas reaccionais até uma concentração final de 2 nM. Duas cadeias de uroquinase de rim humano foram uma oferta dos Abbot Laboratories e existiam em grande parte na forma de baixo peso molecular.

Removeram-se as alíquotas aos 10, 20, 30, 60, 90 e 120 minutos e terminou-se a activação pela adição imediata de 15 jul de gel tampão de carga, como anteriormente. Separaram-se as amostras sobre um gel NaDodSO^/PAGE a 9% (p/v) sob condições redutoras e visualizaram-se corando com prata.

Efectuou-se um ensaio duplo contínuo para determina^ ção da velocidade de activação de rec-HPg, de um modo geral, tal como em C Urano et al., J. Biol. Chem., 262 (1987) 15959-15964 7 em Hepes-NaOH 10 mM, a pH 7,4/NaOAC 100 rrM a-37¾ os componentes do ensaio foram rec-HPg (0,22-0,66 mM), 0,5 mM de substrato HPm, D--Val-Leu-Lys-p-nitroani1 ida ($2251 ) e EACA 2mM, num volume final de 0,8 ml.Iniciou-se a reacção pela adição de UK até uma concentração final de 2 nM. A Figura 9, indica uma análise reduzida NaDodSO^-PAGE da activação de HPg plasmático e de rec-Pg pela uroquinase de baixo peso molecular. Ambas as formas de Pg indicam uma conversão dependente do tempo a partir de uma forma de uma cadeia (Pg) até

uma forma de duas cadeias (Pm). A análise Western desta mesma ex. periência demonstra que todas as bandas da mesma proteína se encontram presentes ( não se apresentam os dados ), indicando que todas têm origem em HPg. Observou-se um número superior de HPg de baixo peso molecular ( e das suas correspondentes cadeias pesadas) com o material recombinante do que com o HPg plasmático. também se observaram estas bandas em numerosos laboratórios como HPg do plasma humano, dependendo as suas quantidades relativas das condições de activação e resultando de retorno limitado e de proteólise especifica de HPg pelo HPm gerado na activação. No en. tanto, as cadeias finais de HPm das duas preparações eram as me_s mas.Observaram-se algumas cadeias pesadas de HPm de-peso molecular mais baixo que eram semelhantes nos dois plasminogé.nios e re_ sultavam da activação das formas de baixo peso molecular de HPg.

Também se analisou a activação de rec-Pg pela uro- quinase utilizando um ensaio duplo contínuo no qual se seguiu o

movimento do substrato de plasmina S2251. Com UK 2,5 nM e 0,33 M de Hpg plasmático, verificou-se que a velocidade de activação -12 era de 7 X 10 M/segundo. Empregaram-se NaOAc e EACA como com- Ί

ponentes tampão pelo que as velocidades de activação de Γ Glu J 78

Pg igualavam funcionalmente da activação mais rápida de ζ Lys ]

Pg.Isto garantiu que as diferenças na velocidade de activação en- tre [ Glu J Pg do plasma e rec-HPg não se deviam à possível in- 78 fluência da presença actual ou funcional de [ Lys J Pg. Os dados cinéticos obtidos indicam que UK activa rec-HPg numa veloci- / -63-

dade semelhante e aparentemente ligeiramente superior à observada para o HPg do plasma C Burnette, Anal. Biochem., 112 (1981) 195-203 7· Na Figura 9 indicam-se os resultados das análises de activação. Na Figura 9, as pistas 1-7 são amostras de HPg plasmá_ tico e as pistas 8-14 são amostras de rec-HPg. Na Figura 9 indicam-se os seguintes tempos: Os minutos, pistas 1 e 8; 10 minutos, pistas 2 e 9; 20 minutos, pistas 3 e 10; 30 minutos, pistas 4 e 11; 60 minutos, pistas 5 e 12; 90 minutos, pistas 6 e 13; 120 minutos, pistas 7 e 14. As cadeias pesadas e leves das formas de duas cadeias indicam-se, respectivamente por H e L.

Os resultados apresentados na Figura 9 indicam que se pode converter rec-HPg numa forma de duas cadeias com uma quajn tidade catalítica de UK a uma velocidade semelhante ou mesma superior à do HPg do plasma. Existem provavelmente algumas diferen_ ças na proteína recombinante e na sua correspondente plasmática humana, que se indicam na Figura 9 pela presença de HPg de mais baixo peso molecular nos primeiros tempos de activação, que são totalmente activáveis para HPm. Referiram-se, isolaram-se e ca_ racterizaram-se idênticas formas de baixo peso molecular de HPg plasmático Z Sottrup-Jensen et al., Prog. Chem. Fibrinolysis Thromobolysis, 3 (1977) 191-209; Paoni et al., J. Biol. Chem., 252, ( 1977) 7725-7732 e Powell et al., Biochem. Biophys. Res.Carm., 102 ( 1981 ) 46-52 7, o que indica que apenas as velocidades de processos intermédios que conduzem à sua formação podem ser diferen_ tes nas duas preparações de HPg. isto sugere que existem peque- -64-

nas diferenças na conformação dos HPagsdevido, talvez, a diferenças na glicosilação, cujo resultado consiste em permitir que ocor. ra mais facilmente a proteólise limitada de retorno de HPm. EXEMPLO 11

Podem utilizar-se complexos formados entre enzimas e plasminogénio como agentes trombolíticos. 0 sítio catalítico dos enzimas fibrinolíticos pode ser bloqueado por um grupo que seja removível por hidrólise sob determinadas condições.Tsmith e outros, patente de invenção norte-americana N9 4 808 405;e Smith e outros., Nature, 290, (1981) 505-508 J.

Deste modo, pode utilizar-se o HPg, de acordo com a presente invenção, isoladamente como um agente trombolítico,como um complexo com um enzima fibrinolítico, como um complexo com enzima fibrinolítico acilado, como um pró-enzima acilado ou como um pró-enzima acilado num complexo com um enzima fibrinolítico ou com um enzima fibrinolítico acilado. pode preparar-se um complexo estreptoquinase acilada/plasminogénio acilado, de acordo com a presente invenção, conforme se segue.

Pode misturar-se a estreptoquinase (cerca de 451 mg disponível na AB Kabi, Estocolmo, suécia ) com o tampão lisina/ /manitol (cerca de 110 ml ) a pH 7,0 e glicerol esterilizado (cerca de 60 ml ) e agitar durante 5 minutos a 7°C. Pode adicionar-se durante 2 minutos uma solução esterilizada filtrada de £- -65-

-amidinofeni 1-ρ_λ -anisato em DMSO (cerca de 15 ml, cerca de 20 mM) e agitar-se a mistura durante 5 minutos a 4°C. Pode adicionar-se durante 2 minutos o HPg (cerca de 809 mg) de acordo com a presen_ te invenção e agitar-se a mistura durante 60 minutos a 4°C.

Pode preparar-se a partir do antecedente uma composição farmacêutica, de acordo com a presente invençHo, do modo indicado a seguir.

Pode adicionar-se, depois, à mistura albumina de soro humano (grau clínico) (18,9 ml, 20% p/v) com agitação durante 2 minutos a 4°c. Pode adicionar-se tampão de lisina/manitol para ajustar o volume até cerca de 400 ml. Pode depois efectuar-se a diafiltração do fluido, durante cerca de 2 e 30 minutos a 18°C, até se recolherem cerca de 2400 ml de diafiltrado. Pode então, filtrar-se o fluído através de um filtro esterilizado de 0,22 μ e transferir-se para um reservatório esterilizado a partir do qual se podem administrar alíquotas em frascos esterilizados p^ ra produtos 1iofi1izados, efectuando-se, a seguir, a liofiliza-ção. EXEMPLO 12

Podem construir-se as células que não possuem acti-vadores do plasminogénio por aplicação de irradiação UV às células que expressam tais activadores e seleccionando os descendentes das células que não produzem produtos que apresentem propri^ dades imunológicas ou biológicas ( por exemplo fibrinolíticas) -66, de um activador do plasminogénio nos testes de rastreio deste U po, que são do conhecimento do especialista.

Podem construir-se as células que não possuem acti-vadores do plasminogénio específicos de um sítio, segundo diversas técnicas baseadas na recombinação homóloga, ver, por exemplo Roizman e outros., U.S. Patent N9 4 769 331; Smithies et al.,., Nature, 317, (1985) 230; Maniatis, Nature, 317 (1985) 205-206; Ayares et al., Proc. Natl.Acad. Sei. (USA), 83 (1986) 5199-5203; Rath et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 83 (1986) 5587-5591 e Thomas, Nature, 324 (1986) 34-38

Por transfecção de uma célula com oligonucleotidos ou construções recombinantes sintetizadas para incluírem extremos homólogos das porções conhecidas ou das sequências nucleoti-dicas(para UK, Heynecker et al., publicação EPO N9 92 182; e para TPA, Goeddel et al., publicação EPO N9 93 619) de parte ou da totalidade dos activadores do plasminogénio específicos de um sítio, tais porções dos genes que codificam esses activadores ejn tre as regiões homólogas devem ser eliminadas ou inactivadas.Pode utilizar-se uma célula na qual se eliminou ou inactivou um tal activador do plasminogénio específico de um sítio como uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção e dá-se preferência a uma célula de mamífero na qual se eliminaram ou inac-tivaram parcial ou totalmente os genes UK e TPA.

Embora a presente invenção tenha sido descrita nos seus aspectos preferidos supõe-se que ocorrerão ao especialista modificações e alterações, após consideração da presente invenção. Por isso, considera-se que todas essas modificações e varia, ções abrangidas pelo âmbito da presente invenção, de acordo com as reivindicações.

Claims (51)

1. A ' REIVINDICAÇÕES 1. - Vector de expressão de célula eucariõtica, caracteri-zado pelo facto de incluir um gene que codifica um plasminogénio.
2. 2. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o vector de expressão referido ser um vector de expressão de célula de invertebrado.
3. 3. - Vector de expressão de célula eucariõtica de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o vector de expressão de célula de invertebrado referido ser um vector de expressão de célula de insecto. 9-
4. 4. - Vector de expressão de célula eucariótica de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o vector de expressão de célula de insecto ser um vector baculovirus.
5. 5. - Vector de expressão de célula eucariótica de acordo com a reivindicação 4» caracterizado pelo facto de o vector baculovirus ser seleccionado entre o grupo constituído pelos vectors de virus de poli-hedrose nuclear Autographa californica e Bombyx mori.
6. 6. - Vector de expressão de célula eucariótica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido gene codificar plasminogênio humano.
7. 7. - Vector de expressão de célula eucariótica de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o vector de expressão de célula de invertebrado ser um vector de virus de poli-hedrose nuclear Autographa californica.
8. 8. - Vector de expressão de célula eucariótica de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido vector ser constituído por uma sequência de nucleõtidos que codifica plasminogênio humano como se indica a seguir.

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9. 9. - Vector de expressão de célula eucariõtica de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de ter sido depositado com o Ns 67929.
10. 10. - Vector de expressão de célula eucariõtica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido vector de expressão de célula eucariõtica ser seleccionado entre o grupo constituído por virus SV40, poliomavirus, adenovirus, VSV e BPV.
11. 11. - Célula eucariõtica â qual falta um activador de piais minoçénio de sítio específico, caracterizada pelo facto incluir um vector de acordo com a reivindicação 1.
12. 12. - Célula eucariõtica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo facto de a referida célula ser uma célula de invertebrado que compreende um vector de acordo com a reivindicação 2. -113-
13. 13. - Célula de invertebrado de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de a referida célula ser uma célula de Spodoptera frugiperda.
14. 14. - Célula de invertebrado de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de o vector ser um vírus de poli--hedrose nuclear de Autograpfra1 callfornica.
15. 15. - Processo para a preparação de um plasminogênio, carac terizado pelo facto de se exprimir um plasminogênio em uma célula de acordo com a reivindicação 1, diferindo o referido plasmi-noginio de um plasminogênio circulante numa modificação de post--translação.
16. 16.- Processo de acordo com a reivindicação 15, caracteri-zado pelo facto de a referida célula ser uma célula Spodoptera frugiperda.
17. 17.- Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri-zado pelo facto de o referido plasminogênio ser um plasminogênio humano.
18. 18.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas que incluem um plasminogênio obtido pelo processo de acordo com a reivin—Lcaçao lo, caractenzado pelo facro de incluir as fases que consistem em: - exprimir um plasminogênio que difere do plasminogê-nio circulante numa modificação post-translação em uma célula eucariõtica de um vector de expressão; - purificar o referido plasminogênio; e - combinar o plasminogênio purificado com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
19. 19.- Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri-zado pelo facto de se incorporar adicionalmente uma enzima fibri-nolítica.
20. 20. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteri-zado pelo facto de o sítio activo da enzima fibrinolítica referida estar acilado.
21. 21. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteri-zado pelo facto de a referida enzima fibrinolítica estar comple-xada com plasminogênio humano.
22. 22. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteri-zado pelo facto de a enzima fibrinolítica ser seleccionada entre o grupo constituído por estreptoquinase, uroquinase, activador de plasminogênio de tecido ou uma sua combinação. -115-
23. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri zado pelo facto de a enzima fibrinolítica ser um complexo de p--anisoíl-estreptoquinase/plasminogénio sem clivagem da ligação peptldica interna.
24. 24. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri zado pelo facto de a composição farmacêutica obtida ser isotõni-ca.
25. 25.- Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri zado pelo facto de se filtrar a composição obtida em condições estéreis.
26. 26. - Método para produzir plasminogênio, caracterizado pelo facto de se cultivar uma célula eucariõtica â qual falta _um activador de sítio específico de plasminogênio.
27. 27. - Método para produzir plasminogênio de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de a referida cultura incluir a manutenção de células de invertebrado contendo um gene que codifica um plasminogênio humano sob condições que permitem a expressão do gene e adicionalmente se recuperar o plas-minogénio a partir da cultura da célula.
28. 28.- Método para produzir plasminogênio de acordo com a -116- "-/Ç reivindicação 27, caracterizado pelo facto de as células de inver tebrado serem células Spodoptera frugiperda, e por o referido método adicionalmente incluir a infecção de célula de Spodoptera frugiperda com um vírus Autographa californica compreendendo um gene que codifica um plasminoginio humano.
29. 29.- Método para produzir plasminogenio de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de adicionalmente se cotransfectar uma célula Spodoptera frugiperda com um vector de transferência que compreende um gene que codifica um plasminoginio humano e um ADN virai Autographa californica do tipo selvagem.
30. 30.- Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de o referido plasminogenio diferir do plasminogé-nio circulante numa modificação de post-translação.
31. 31. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de incluir ainda o passo que consiste em isolar um produto plasminogénico.
32. 32. - Método para produzir plasminogênio, caracterizado pelo facto de compreender o passo que consiste em isolar ADN que codifica um plasminogênio e inclui um promotor eucariõtico ligado funcionalmente ao referido ADN. /-117-
33. 33. - Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza do pelo facto de o referido ADN isolado incluir adicionalmente uma sequência sinal ligada funcionalmente ao referido ADN para secreção do plasminoginio fora da célula.
34. 34. - Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza do pelo facto de a sequência sinal ser reconhecida pelas células hospedeiras do invertebrado.
35. 35. - Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza do pelo facto de o referido ADN ser ADN genSmico.
36. 36. - Método de acordo com a .reivindicação 34, caracteriza-do pelo facto de o referido ADN ter uma sequência nucleotídica de acordo com a Figura 2 indicada anteriormente.
37. 37. - Método para terapia trombolítica, caracterizado pelo facto de se administrar a um paciente com necessidade de terapia trombolítica uma quantidade eficaz de uma composição preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 18 em uma dosagem compreendida entre cerca de 0,10 e cerca de 1,0 mg/Kg de peso do corpo ou por infusão.
38. 38. - Método para terapia trombolítica, caracterizado pelo facto de se administrar a um paciente com necessidade de terapia -118-

    trombolítica uma quantidade eficaz de uma composição preparada pe lo processo de acordo com a reivindicação 22 em uma dosagem compreendida entre cerca de 0,10 e cerca de 1,0 mg/Kg de peso do corpo ou por infusão.
39. 39, - Método para terapia trombolxtica de acordo com a rejl vindicação 38, caracterizado pelo facto de a composição incorporar um complexo de p-anisoxlo-estreptoquinase/plasminogénio sem clivagem da ligação peptídica interna.
40. 40. - Método para preparar um complexo binário entre enzima fibrinolítico e plasminogénio, tendo o complexo um sítio catalí- . tico essencial para actividade fibrinolítica bloqueada por um grupo removível por hidrólise, caracterizado pelo-facto de: se cultivar células de invertebrado ãs quais faltam activa-dores de plasminogénio de sítio específico, estando as referidas células de invertebrado transformadas com um vector de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica plasminogénio sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico; recuperação do plasminogénio a partir da cultura de células; e se misturar um enzima fibrinolítico com o plasminogénio para formar um complexo binário na presença de um excesso de um agente de bloqueio de fórmula seleccionado entre o grupo que consiste em A-B e E-F, em que A é um grupo de bloqueio hidroilitica- -119

    mente lãbil o qual e selectivo para o sítio catalítico essencial para a actividade fibrinolítica e susceptível de transferência a partir do grupo B para o sítio catalítico, e B i o grupo que facilita a ligação de A ao enzima, E i um grupo de localização que localiza o agente no sítio catalítico e F ê o grupo de bloqueio hidroliticamente lãbil que é susceptível de transferência a partir do grupo de localização para o sitio catalítico.
41. 41. - Método de acordo com a reivindicação 39, caracteriza do pelo facto de adicionalmente se isolar o complexo binário.
42. 42. - Método de acordo com a reivindicação 39, caracteriza do pelo facto de o plasminogénio ser plasminogénio humano e o enzima fibrinolítico ser estreptoquinase.
43. 43. - Método de acordo com a reivindicação 40, caracteriza * * -- - do pelo facto de o grupo de bloqueio hidroliticamente lãbil ser um grupo acilo.
44. 44. - Método de acordo com a reivindicação 42, caracteriza do pelo facto de o grupo acilo ser um grupo benzoílo, benzoílo substituído, acriloílo, ou acriloílo substituído.
45. 45. - Método de acordo com a reivindicação 42, caracteri-zado pelo facto de AB ser p-nitro-fenil-p'-guanidino-benzoato. 120-
46. 46. - Método de acordo com a reivindicação 42, caracteriza-do pelo facto de E ser um grupo p-amidino-fenilo ou um p-acetami-do-fenilo.
47. 47. - Método de acordo com a reivindicação 42, caracteriza-do pelo facto de F ser um grupo benzoílo ou acriloílo.
48. 48. - Método para a produção de um plasminogênio de mamífero, caracterizado pelo facto de compreender a fase que consiste em exprimir o referido plasminogênio que tem uma conformação ac-tiva e i substancialmente isento de activador de plasminogênio.
49. 49. - Método de acordo com a reivindicação 48, caracteriza-do pelo facto de o referido plasminogênio ser completamente isen to de uroquinase, estreptoquinase e activador de plasminogênio de tecido.
50. 50. - Método de acordo com a reivindicação 48, caracteriza-do pelo facto de o referido plasminogênio de mamífero ser isento de outras proteínas de mamífero.
51. 51. - Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo facto do referido plasminogênio de mamífero ser um plas-minogénio humano. Lisboa, 29 de Agosto de 1990 O Agsifs Oficial da Prcprisdode Industrial