JPH10504441A

JPH10504441A - Ｔｎｆ形成阻害のための組成物およびその使用

Info

Publication number: JPH10504441A
Application number: JP7523506A
Authority: JP
Inventors: ロバートエフ．ハレンバック，; マイケルクリーグラー，; カールペレズ，; デイビットエイ．ジウェリ，; クリストンイー．コーツ，
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-03-02
Publication date: 1998-05-06
Also published as: WO1995024501A1; NO963726L; AU709054B2; US6599706B1; NO963726D0; AU1936495A; EP0749494A1; CA2185162A1

Abstract

(57)【要約】本明細書でproPR-3というpro型の活性化による、精製された、活性型組換えヒト好中球プロテアーゼ、PR-3の生産のための方法および材料について開示する。ヒトPR-3は、成熟、活性型TNFαの過剰放出のインヒビターを見出すのに有用である。TNFαpro型のその成熟活性型への変換のインヒビターを同定するための方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 TNF形成阻害のための組成物およびその使用発明の分野本発明は免疫学/生化学の領域にあり、そして特に、タンパク質ホルモン放出のインヒビターを同定するための組成物および方法の開発および製造に関し、そしてホルモンのレベルの上昇に関連する疾患の処置のためのそのインヒビターの予防的および治療的な使用に関する。より詳細には、本発明は、TNFαコンバターゼのインヒビターを同定するための組成物および方法の同定を促進する。これらのインヒビターは、種々の疾患、特に、敗血症、慢性関節リウマチ、悪液質、 AIDSおよび自己免疫疾患の処置に使用され得、それゆえ医師に代替の処置養生法をもたらす。発明の背景合衆国だけでも、年に約194,000人の院内菌血症(nosocomial bacteremia)患者が発生し、そしてその内、約75,000人が死亡している。Maki，D.G.，1981，Noso comial Infect.，(Dikson，R.E.,編)183頁、Yrke Medical Books，U.S.A.。これらの死亡の多くは６種の主要なグラム陰性桿菌--Pseudomona saeruginosa、Esch erichia coli、Proteus、Klebsiella、EnterobacterおよびSerratia--に起因する。これらの菌血症に対する現在の処置は抗生物質を投与することであるが、抗生物質は細菌感染にしばしば付随する敗血症性ショックの処置においては有効性が限られている。ときとして菌血症に付随する敗血症性ショックの正確な病理学は完全には解明されていない。とはいえ、リポポリサッカリド(LPS)と呼ばれるある種の細菌性エンドトキシンが第１の原因因子であることが知られている。LPSは少なくとも３つの重要な抗原性領域(リピドＡ；コアポリサッカリド；およびO-特異的ポリサッカリド)からなる。後者はまたO-特異鎖または単にO-抗原ともよばれる。O- 特異鎖は繰り返しポリサッカリド単位から構成される長鎖ポリサッカリドである。異なる細菌種間でポリサッカリドの数は異なり、そして１個から多くて６個または７個までのモノサッカリド単位の間で変化し得る。O-特異鎖は異なるグラム陰性細菌の間で変化するが、リピドＡおよびコアポリサッカリドは同一ではないとしても類似している。 LPSは患者を死に至らしめる生化学的事象のカスケードを開始させる。LPSに曝されることによる初期の結果は、マクロファージ細胞の刺激および腫瘍壊死因子 α(TNFα)の産生であると広く考えられている。この考えに基づいて、敗血症性ショックの処置において使用される標準的抗生物質治療の有効な臨床的補助として作用し得る、中和抗体およびTNFαの効果を阻害し得る他の分子を生成するために、少なからぬ努力が繰り広げられている。Traceyら、Nature 330:662(1987) 。例えば、ＴおよびＢリンパ球、線維芽細胞、および内皮細胞を包含する多くの細胞型がTNFαを発現させ得るが、主要な供給源はマクロファージである。TNFα は、膜結合(membrane-bound)形態および可溶性の分泌形態の両方の形態で存在することが報告されている。Deckerら、J．of Immunol.138:957(1987);Krieglerら、Cell 53:45(1988)。ヒトTNFαがクローン化されており、そしてこれは17kDポリペプチドと、それに加えて、proTNFαをII型膜タンパク質として固定する原因となるように思われる残基を含有する76アミノ酸プロ配列からなる。17kD分子は敗血症の原因となる生化学的カスケードの開始に関与する主要な因子である。TN Fαは、膜結合26kD形態、および17kD種に対応する可溶性形態の両方として存在し得る。Kreiglerら、Cell 53:45(1988)。26kD形態は、成熟17kD分子の前駆体、またはプロホルモンである。TNFαの２つの形態は、主として組織分布の差異の結果として、異なる生物学的効果を有し得る。Krieglerら(前出)。 TNFαは、敗血症の後遺症において主要な役割を果たし、そして疾患における炎症因子であると考えられているので、抗TNFα予防剤/治療剤を同定および開発する必要がある。抗TNFα抗体は、ヒヒモデル系を用いた研究において有望であることが示されている。(Hinshawら、Circulatory Shock 30:279(1989))。しかし、これらの研究は、非ヒト抗TNFαおよび非ヒト抗TNFα抗体を使用している。さらに、TNFαは、潜在的にウイルスを有しているヒト細胞におけるヒト免疫不全ウイルス(HIV)の発現の誘導に関与する。Folksら、PNAS(USA)86;2365(1989)。 TNFαはまた、種々の自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチにおいても役割を果たしている。Duffら、International Conference on Tumor Necrosis Factor and Related Cytoxins，175:10(1987)。TNFαの作用を阻害する化合物または方法は、免疫学的起源の種々の疾患の処置についてのかなりの用途を有する。Fier sら、FEBS Lett．285:199(1991)に記載のように、脳性マラリア、移植片対宿主病、および虚血/再灌流(reprefusion)障害を包含する種々の他の深刻なヒトの状態もまたTNFαの生物学的な活性に関連する。抗TNFα抗体に加えて、TNFα阻害活性を有する別の分子が捜し求められている。非抗体TNFαインヒビターは、Seckingerら、Exp．H．Med．167:151(1988)、およびSeckingerら、Biol．Chem．264:11966(1989)、および欧州特許出願第888303 65.8号(発明者Wallachら)に記載されている。インヒビターは発熱患者の尿中に存在し、そして約27,000〜33,000の分子量を有していることが報告されている。これらのインヒビターはTNFαレセプターの可溶性形態であると報告されている。これらの分子はTNFα阻害活性を示すものの、いずれのインヒビターもヒトにおける敗血症性ショックの処置に有効であることは示されていない。 TNFα仲介疾患の処置に有効な、TNFα活性のさらなるモジュレーター(抗体ベースまたはそれ以外のいずれも)を同定および開発する必要性があることが前述の論考から明らかとなる。発明の要旨本発明によるTNFα活性の調節のためのアプローチは、局所的に産生される膜結合proTNFαを敗血症性ショックのような疾患の病理学的プロセスに顕著に寄与するTNFαに変換し得る、TNFαコンバターゼ(例えばPR-3)の阻害を包含し、そして例えば17kD、またはより低分子量の形態のTNFαの形成を妨害または阻害することは、患者および上記の他のものに潜在的なウイルスの発現を妨害することによってHIV陽性患者におけるAIDSの防止のための有効な予防であり得る。その最も一般的な形態において、本明細書に記載される発明は、そのプロホルモン前駆体である26kD形態のproTNFαまたはそのマルチマーおよびその可溶性20 kD形態またはそのマルチマーからの、TNFαの成熟形態の生成を阻害する方法および組成物を提供する。これらの組成物は、成熟TNFαのレベルの上昇に関連する患者における疾患(敗血症性ショック、AIDS、脳性マラリア、移植片対宿主病、虚血/再灌流損傷、慢性関節リウマチ、および悪液質を包含する)の防止または処置に有用である。本発明はまた、TNFαの成熟形態の生成を阻害する分子を同定するための方法(例えば、比色法およびオートラジオグラフィー)に関する。このようなインヒビターは、TNFαに結合することによってTNFα活性をブロックする抗TNFα抗体または可溶性TNFαレセプターとは区別される。この方法は、上記のような成熟TNFαの生成に関連する疾患の処置のための、予防薬および/または治療薬のような医薬の同定に使用され得る。この方法によって同定される医薬は、コンバターゼとよばれる酵素による26kD proTNFαプロホルモンの切断を妨害する。従って、これらの医薬は、敗血症および他の疾患に関連する「敗血症性ショック」の誘導において役割を果たす低分子量分子(すなわち、分子量17kDのサブユニットを有するTNFαの循環する成熟形態)の生成を妨げる。特に、本明細書に記載の好ましいインヒビターはTNFαコンバターゼの活性を妨げて、17kD TNFαのようなTNFαの成熟形態を生成する少なくとも76アミノ酸のシグナル配列を含む26kD分子のN-末端部分の除去を妨害する。本発明はまた、TNFαコンバターゼのインヒビターであり、そして敗血症性ショックの防止および/または処置において有効な化合物のクラスを包含する。このクラスの化合物は、例えば、抗コンバターゼ抗体、プロホルモン形態の変異タンパク質(mut ein)、およびTNFαの26kD形態のコンバターゼへの結合と競合するタンパク質またはペプチドを包含する。TNFαコンバターゼを包含するプロテアーゼのクラスを特異的に阻害し、あるいは好ましくはTNFαコンバターゼの阻害について選択的特異性を示す低分子量化合物もまた本発明の一部である。そのような低分子量化合物としては、ペプチドジフェニルホスホネートBoc-X-p(OPh)₂(ここでXは、V al-Pro-Val、Ala-Pro-Val、およびVal-Pro-Hisからなる群から選択されるペプチドである)のような化合物が例示されるが、これらに限定はされない。さらに、本発明は、均質に近くなるまで精製されたTNFαコンバターゼ、該コンバターゼのアミノ酸配列、およびTNFαコンバターゼの組換え形態を発現するための方法に関する。１つの精製されたヒトTNFαコンバターゼは、同じ分子量を有する既知の好中球プロテアーゼであるヒトPR-3と実質的に同一のN-末端アミノ酸配列を含む。本発明はまた、TNFαコンバターゼの種々のインヒビター、およびインヒビターを検出する方法に関する。より特定すると、本発明はTNFαコンバターゼを特異的に阻害する小分子に関する。本発明はまた敗血症性ショック、脳性マラリア、慢性関節リウマチ、AIDS、悪液質、虚血/再灌流障害、および移植片対宿主病のような疾患の、PR-3インヒビターのようなコンバターゼインヒビターの投与による処置法に関する。本発明のコンバターゼインヒビターを含む薬学的組成物および医薬は、本発明のさらに他の局面を表す。本発明の１つの局面において、上記proTNFαをTNFαコンバターゼにより切断することによってproTNFαから生成される腫瘍壊死因子(TNFα)により引き起こされ、これにより悪化し、またはこれに関連する疾患の予防または治療的処置のための物質を同定するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：(a)proTNFαを、このproTNFαを切断するに有効なある量のTNFαコンバターゼと接触させる工程；(b)工程(a)におけるproTNFαから成熟TNFαへの変換を測定する工程；(c)工程(a)および(b)を反復する工程であって、さらに可溶性TNF αによって引き起こされ、これによって悪化し、またはこれに関連する疾患の予防的または治療的処置のための物質として同定しようとする分子を含む工程；(d )工程(c)におけるproTNFαから成熟TNFαへの変換を測定する工程；および(e)工程(b)で測定された変換と工程(c)で測定された変換とを比較して、この分子が成熟TNFαによって引き起こされる疾患の予防薬または治療薬に適しているかどうかを決定する工程。測定工程は、比色法およびオートラジオグラフ法を包含するがこれらに限定されない。このようなインヒビターの可能性のある供給源は公知のエラスターゼインヒビターのライブラリーである。本発明の他の局面においては、上記proTNFαをTNFαコンバターゼにより切断することによってproTNFαから生成される成熟TNFαにより引き起こされ、これにより悪化し、またはこれに関連する疾患を有しているかあるいはこの疾患にかかりやすい患者を処置する方法が提供される。この方法は、このような処置を必要とする患者にTNFαコンバターゼのインヒビターの有効量を投与する工程を包含する。好ましい実施態様において、この疾患は、敗血症、慢性関節リウマチ、悪液質、脳性マラリア、AIDS、自己免疫疾患、および移植片対宿主病からなる群から選択される。本発明のさらなる局面において、上記proTNFαをTNFαコンバターゼにより切断することによってproTNFαから生成される成熟TNFαにより引き起こされる疾患の処置のための薬学的組成物が提供される。この組成物は、有効量のTNFαコンバターゼのインヒビターと薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含有する。他の局面において、本発明は、ヒト好中球プロテアーゼPR-3のプロ酵素および成熟活性形態に特異的な生物学的/生化学的特性を示す、精製され単離されたポリペプチドおよびその改変体(variant)を提供する。preproPR-3の生物学的/生化学的特性は、成熟した活性PR-3酵素の構造アミノ酸配列と、それに加えて、リーダー配列と成熟した活性PR-3のアミノ酸配列との間にジペプチド(酵素のチモーゲン形態に特徴的である)を含む。本発明のさらに他の局面は、N-末端アミノ酸配列であるX-Eを有するグランザイム(granzyme)のプロ形態を含む、精製されたポリペプチドである。ここでXは、可変のアミノ酸を表し、そしてここでEはグルタミン酸であり、そしてここで上記N-末端配列はグランザイムを触媒的に不活性とし、そしてここで該グランザイムは、活性であるとき、膜結合タンパク質ホルモンまたはレセプターリガンドの切断を触媒し、このリガンドの遊離の可溶性形態を生成する。本発明の他の局面において、preproPR-3およびpreproPR-3の有用な特性を示すその改変体をコードする、単離されたポリヌクレオチド(例えば、そのDNAおよび RNA転写物(transcript))が提供される。本発明の好ましいDNAは、ゲノムDNAおよびcDNA、ならびに全体的または部分的に化学的に合成されたDNAを包含する。最も好ましいポリヌクレオチド配列は配列番号22で示される。本発明の複製物(すなわち、インビボまたはインビトロで作製される単離されたDNA配列のコピー)もまた意図される。preproPR-3配列を組み込んだプラスミドおよびウイルスDNAベクターのような自己複製組換え構築物もまた提供され、そして特に、preproPR-3 またはpreproPR-3改変体をコードするDNAが内因性または外因性発現制御DNA配列に作動可能に連結したベクターが提供される。本発明の他の局面によれば、宿主細胞、好ましくは真核細胞は、所望のポリペプチドが発現され、そしてそこでプロセッシングされそして分泌されるように、本発明のDNAで安定に形質転換される。本発明のPR-3配列を含むウイルスベクターで感染されたTrichoplusia ni(Tn5)昆虫細胞もまた好適である。preproPR-3およびその改変体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルス構築物で感染されたSpodoptera frugiperda昆虫細胞(Sf9)が最も好適である。本発明で意図される他の宿主細胞は、CHO細胞またはヒト293細胞のような哺乳類細胞を包含する。本発明の他の局面は、proPR-3(配列番号20)およびその改変体のようなグランザイムのプロ形態の大規模生産のプロセスに関する。ここで本発明の宿主細胞は適切な培養培地で増殖され、そして所望のポリペプチドがその細胞から、またはその細胞が増殖した培地から単離される。これらの方法で生産されたグランザイムのプロ形態は、ジペプチジルペプチダーゼ、より特定すればジペプチジルペプチダーゼＩのような酵素を用いたN-末端アミノ酸配列の酵素的除去によって活性化され得る。 proPR-3およびその新規PR-3改変体は、天然細胞源からは得られていない。しかし、活性組換えPR-3またはPR-3改変体の生産についての本発明は、TNFαコンバターゼインヒビターの同定のために有用である。本発明はまた、ヒトにおける臨床的使用のための非化膿性形態の組換えPR-3またはPR-3変異タンパク質の有用な量の生産を提供する。本発明の他の局面は、PR-3変異タンパク質であり、ここでN-結合グリコシル化部位での置換によってグリコシル化がブロックされており、その結果、組換えPR-3の均質性およびおそらくは結晶性が向上する。 proPR-3、PR-3、およびPR-3改変体および変異タンパク質に特異的な抗体物質( 例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体など)もまた、本発明に包含される。抗体物質は、単離された天然または組換えproPR-3、PR-3、PR-3改変体またはその変異タンパク質を用いて、惹起され得る。最も好ましくは、プロ形態に特有の残基を含むアミノ酸配列に特異的な抗体物質、例えば、不活性proPR-3のコンホメーションに特異的な抗体である。他の局面において、本発明は、所望されないＢ細胞/Ｔ細胞相互作用の症例の処置に関し、これは、Ｔ細胞を、Ｂ細胞/Ｔ細胞相互作用を媒介する膜結合サイトカインを放出するために有効な治療量のPR-3で処理する工程を包含する。図面の簡単な説明図１Ａは、26kDのTNFαをコードするDNA配列の制限地図である。図１Ｂは、26 kDのTNFαの疎水性プロットを示し、そして図１Ｃは、この分子のDNAおよびアミノ酸配列を示す；図２は、Boriesら、Cell 59:959-968(1989)に記載のようなcDNAクローンのDNA 配列由来の、ヒトPR-3のプロセッシングされていない前駆体の推定アミノ酸配列を示す。図３は、インビトロでのTNFαコンバターゼによる26kD TNFαの変換を示すオートラジオグラムの写真である；図４は、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーで測定された、26kD TNFαからその低分子量形態への変換の潜在的インヒビターの効果を示すオートラジオグラムの写真である；図５は、種々のセリンプロテアーゼインヒビターによる、HL-60細胞からの精製されたヒトPR3による26kD TNFαからその低分子量形態への変換の阻害を示すオートラジオグラムの写真である；図６Ａは、精製された成熟ヒト好中球PR3による26kD TNFαからその低分子量形態への変換に対する、種々のセリンプロテアーゼインヒビターの異なる阻害効果を示す、SDS-PAGEオートラジオグラムの写真である；図６Ｂは、同じ化合物の比色アッセイ試験を用いて得られた同様の結果を示すグラフである。図７は、インヒビターのスクリーニングについて、および/または結晶化についての、精製組換えPR-3(還元および非還元)の、クーマシーブルー染色されたSD S-PAGE分析の写真である。図８は、ヒト単核細胞株であるTHP-1細胞からの放射標識した26kD TNFαに対する、精製組換えPR-3、および天然ヒトエラスターゼの効果のSDS-PAGE分析のオートラジオグラムの写真である。図９は、マウスを、LPSを致死量注射する前にTNFαコンバターゼインヒビターで予防的処置した効果を示すグラフである。循環性血清TNFαレベルが減少する；および図１０は、マウスを、LPSを致死量注射する前にTNFαコンバターゼインヒビターで予防的処置した効果を示すグラフである；生存が延命される。発明の詳細な説明以下の定義は、事実上一般的であり、そしてこの定義内に包含される意味は、当業者に周知である。「敗血症性ショック」は、本明細書で、グラム陽性またはグラム陰性細菌感染の結果生じる疾患として定義され、後者に対する応答は、主に細菌エンドトキシンであるリポポリサッカリド(LPS)に起因する。それは、少なくとも６種の主要なグラム陰性桿菌により誘導され得、そしてこれらは、Pseudomonas aeruginosa 、Escherichia coli、Proteus、Klebsiella、EnterobacterおよびSerratiaである。「プロホルモン」は、ホルモンの「成熟」形態のインビボ産生の間に除去されるペプチドセグメントを含むタンパク質である。26kD TNFαプロホルモン、または「proTNFα」が以下に詳細に論議される。proTNFαは、「成熟TNFα」のＮ末端配列 Val-Arg-Ser-Serを優勢に有する17kDの成熟形態に主に切断される。しかし、「成熟TNFα」は、プロホルモンからまた形成される他の切断産物を含むことが意図される。これらの切断産物は、成熟TNFαの17kD形態の生物学的特徴を実質的に保持し、そしてproTNFαの短縮形態(すなわち、切断形態)であり、ここで少なくとも約55アミノ酸が、Ｎ末端から除去されている。アミノ酸１で始まる成熟TNFα(配列番号17)は可溶性であり、そして三量体形態で会合する17kDのサブユニットから成る。可溶性組換えproTNFαは、配列番号19として示されるプロ配列(-20〜-1)であるさらなる20のアミノ酸を含む。本明細書に用いられる用語「proTNFα」(配列番号２)は、約26,000のサブユニット分子量を有するTNFαをいう。プロホルモンのプロペプチドセグメントは、それが由来する種に依存して長さが変化するが、このセグメントのアミノ酸配列は高度に保存されている。実際、マウスでは、プロホルモンの推定のリーダー配列を構成する79アミノ酸の約86％が、ヒトTNFαの推定のリーダーを構成する76 の既知のアミノ酸と同一である。従って、proTNFαへの参照がなされるとき、その分子は任意の特定の種に由来し得、その結果当該分野で公知であるように、ヒト配列と比較してわずかに改変された配列を有し得ることが意図されると当業者に認識される。同様に、「可溶性proTNFα」は、proTNFαトランスメンブレン領域を欠き、そして推定の天然TNFα Ｎ末端に対して-20位のグリシンから成熟TNFα のカルボキシ末端までを含む約20kDのTNFα分子(配列番号21)をいう。この分子は、約60kDの見かけの天然分子量を有し、可溶性であり、そして三量体であり得る。「コンバターゼ」または「TNFαコンバターゼ」は、26kD TNFαを、実施例４に記載のようにヒト単球に産生される26kDTNFαを用いるTNFαの細胞を基礎にしたバイオアッセイにおいて三量体形態でTNFαの生物学的活性を有する成熟TNFα に切断し得る１つ以上の酵素をいう。非刺激細胞では、コンバターゼは、実質的に膜からなる画分に大部分回収され得るが、細胞質ゾルからも幾分活性が回収される。TNFαコンバターゼは、通常、TNFαを産生する細胞に結合している。１つのTNFαコンバターゼであるセリンプロテアーゼ「プロテイナーゼ３」はまた、「 PR-3」、「P-29b」、または「ミエロブラスチン」と呼ばれる。 TNFαコンバターゼに適用される用語「膜結合」は、30,000×gペレット画分中に大部分のコンバターゼ活性が存在することで示されるように、最初実質的に不溶性形態で単離されるコンバターゼの形態を示す。しかし、TNFαの一部分は、塩濃度またはpHのような条件に依存して、好中球顆粒から単離される場合可溶性であり得る。 PR-3は、proTNFαまたは可溶性proTNFαを切断し得、生物学的に活性な成熟TN Fαを生成する活性な成熟セリンプロテアーゼである。PR-3は、25アミノ酸のリーダー配列(プレプロ酵素に特徴的)およびリーダーのすぐ下流にあるジペプチド (Ala-Glu)(プロ酵素形態に特徴的)を有するプレプロ酵素形態で合成され；両配列は活性なプロテアーゼを生成するために切断されねばならない。先の研究は、 PR-3がPR-3⁺産生細胞の培養培地またはPR-3^-産生細胞の不溶性膜画分のいずれかより単離され得ることを示す。従って、そのプロセッシングの少なくともある部分の間では、PR-3は、膜結合であるが、PR-3が細胞のどの膜と結合しているかは明確ではない。組換えproPR-3は、PR-3の分泌可溶性不活性形態として産生され得る。このpro PR-3ポリペプチドは、活性な成熟PR-3のアミノ酸配列のＮ末端に位置する２つのアミノ酸残基、アラニンおよびグルタミン酸(Ala-Glu)を含む。「組換え抗体」は、Ｈ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列の各々の一部分が、特定の種由来または特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同であり、鎖の残りのセグメントが別の種またはクラスにおける対応する配列に相同である抗体をいう。最も通常には、組換え抗体では、Ｌ鎖およびＨ鎖の両方の可変領域は、１つの種の哺乳動物由来の抗体の可変領域をコピーし、定常領域は、別の動物由来の抗体中の配列に相同である。１つの例は「ヒト化」マウス抗体であり、この場合マウス抗体の定常領域はヒト定常領域で置換される。その最も一般的な形態では、本発明は、成熟ホルモンのそれらのプロホルモン形態からの生成に関連する疾患のインヒビターを同定する方法および組成物に関する。プロホルモンの好ましい実施態様は、26kD TNFαであり、それは次いで、その多量体の形態(通常三量体)で、敗血症性ショックに関連する生命を脅かす生理学的変化の生成に実質的に関与する、低分子量の「成熟」形態、好ましくは17 kDに切断される。従って、26kD TNFαの成熟形態への変換を妨害し得る分子は、敗血症性ショック、または成熟TNFαの生成により引き起こされ、関連し、若しくは悪化させられる他の疾患を防止または処置するために有用である。本明細書に記載されるアッセイは、プロホルモンのその成熟ホルモン形態への変換を検出し、この変換の好ましい実施態様は、26kDのサブユニット分子量を有するTNFαの、好ましくは、17kDのサブユニット分子量を有するTNFαへの酵素的変換である。この変換の原因となる酵素は、「TNFαコンバターゼ」と呼ばれる。従って、本発明は、いくつかの部で最も容易に呈示される。第１部では、TNFα の26kD形態または可溶性proTNFαであるproTNFαを実現するための材料および方法が示される。第２部では、TNFαコンバターゼの供給源、およびこの酵素を精製する方法が同定される。第３部は、種々のコンバターゼインヒビターの同定を記載する。本発明の第４部は、敗血症または他の疾患を患う患者を処置するためにインヒビターを用いる方法の説明を呈示する。本発明の第５部は、大量の組換えPR-3およびPR-3変異タンパク質の発現、単離、精製、およびタンパク質分解的活性化に関し、そしてこれは、PR-3の生化学的および結晶学的構造の詳細な研究を促進し、そしてヒトの疾患の治療的処置に価値があり得る。組換えPR-3の特定の不活性変異タンパク質はまた、proTNFαに対して高い親和性を保持し、そしてそれ故TNFαコンバターゼインヒビターを構成する。変異タンパク質の産生方法は、本明細書に参考として援用されるPCT出願第PCT/US93/05548号に記載されている。以下に引用されるすべての参考文献(特許/特許出願および論文)は、本明細書に参考として援用される。Ｉ．proTNF αおよび可溶性TNFαの組換え構築物本発明のTNFα、proTNFα、および可溶性TNFαは、当該分野で公知の方法により、天然、合成または組換え形態で得られ得る。以下に記載される組換え系が26 kD proTNFαおよび20kD可溶性proTNFαを、かなりの量で得られるようにし、そしてTNFαインヒビターのためのアッセイ手順を促進するが、非組換え系もまた用いられ得ることが認識される。例えば、26kD分子が刺激単球中で同定され得ることが示されている。Kreiglerら、Cell 53:45(1988)。従って、適切なアッセイ手順は、26kD proTNFα分子を産生するために単球を刺激し、次いでコンバターゼによる作用の結果としての26kD分子の切断を測定することである。好ましくは、分子量17,000の成熟TNFサブユニットが生成される。 26kD proTNFαは、１つ以上の内部部位でコンバターゼにより切断され「成熟T NFα」を生成する。主要な部位は、リーダー配列からTNFα(17kD種)の分泌形態を分離する接合部である。この接合部の配列は、Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-であると考えられている。主要な推定の切断部位は、アラニンとバリンとの間にある。何故なら、Val-Arg-Ser-Serが17kD TNFα分子(インビトロでヒト細胞培養上清から単離されたときの主要な成熟形態)のアミノ末端配列であると考えられているからである。TNFαの他の種がコンバターゼにより産生され得、そしてこれらは２次切断部位：例えば、上記の配列中のValおよびArgの間、またはアミノ酸配列中の＋12および＋13に位置するProおよびValの間の産物である。本明細書に記載のアッセイは、変換proTNFα種(可溶性proTNFαを含む)の阻害、またはその切断部位に拘わらず成熟TNFα形態の出現をモニターし得る。 proTNFα形態および成熟TNFα形態はクローン化され、そして多くの系で発現されいる。例えば、ウサギTNFαのクローニングか1985年６月26日に公開されたE P146,026(Dainippon Pharmaceutical Co.,Ltd)、および1985年７月17日に公開されたEP 148,311(Asahi Kasei Kogyo Kabushiki)に開示されている。151および15 5アミノ酸(推定の天然成熟形態よりも２および６少ない)を有するヒトTNFαのクローニングが、1985年９月25日に公開されたEP155,549(Dainippon Pharmaceutic al Co.,Ltd)に、そして155アミノ酸を有するヒトTNFα(Val-Argを消失している) が、1985年10月16日に公開されたEP 158,286(Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kai sha)および1985年11月20日に公開された対応のGB 1,158,829Aに開示されている。成熟TNFα(157アミノ酸)およびその種々の改変形態(変異タンパク質)のクローニングが、1986年１月15日に公開されたEP 168,214(Genentech)および1985年10 月３日に出願されたPCT US85/01921(Cetus Corporation)に開示されている。米国特許第4,677,063号および第4,677,064号は、TNFαの26,000および17,000 形態、ならびにこれらの分子の変異タンパク質をコードするcDNA配列を示す。 26kD TNFα種をコードするcDNA配列は、好ましくは、共に所有される同時係属中の出願である1984年11月９日に出願された米国特許出願第670,360号；ならびに米国特許第4,677,063号および第4,677,064号に記載されるプラスミドpB11から得られる。プラスミドpB11は、TNFαコード配列に作動可能に連結されたSV40プロモーターを含み、そしてそれ故、真核生物宿主細胞中で26kD TNFα種を発現するために有用である。さらに、26kD TNFα種をコードする完全配列を含む第２のプラスミドが先行する米国特許出願および特許に記載されている。それはpE4と称される。このプラスミドpE4は、アメリカンタイプカルチャーコレクション，受託番号第39894号で寄託されている。 26kD TNFα種をコードするcDNA配列は、プラスミドpB11中にPstIフラグメントとして存在する。従ってそれは、容易に切り出されそして多くの適切な発現系の任意の１つに挿入される。好ましい発現系は、感染性薬剤送達系と題する、発明者Krieglerらの同時係属中の米国特許出願第855,865号(1990年８月22日に出願された米国特許出願第571,017号のために放棄された)に記載されているプラスミド pFVXMである。pFVXMは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されそして受託番号第67,103号を有する。 pFVXMは、Krieglerら、Cell 38：483(1984)に記載されるプラスミドpEVX由来のレトロウイルスベクターである。pEVXは、モロニーマウス白血病ウイルス由来の5'-長末端反復に対して3'のスプライスドナー部位を有する。このスプライスドナー配列は、レトロウイルス構築物の正確にスプライスされた翻訳テンプレートの生成を減少することが先に示されている。従って、pEVXは加工されてスプライスドナー部位を除去され、そしてモロニーマウス白血病ウイルスのスプライスドナー配列を欠いている類似のHarveyマウス肉腫ウイルスゲノムのSmaIフラグメントで置き換えられた。得られたベクターpFVXMは、モロニーマウス白血病ウイルスのスプライスドナー配列を欠き、そしてウイルスパッケージング配列を保持する。pFVXMは、26kD TNFα種をコードするDNA配列が挿入され得る便利なPstI部位を有する。 II．TNF αコンバターゼ TNFαコンバターゼはタンパク質分解活性を有さなければならない。種々の生物学的材料がTNFαコンバターゼ活性の供給源として利用可能である。これらは、組織、細胞、抽出物、またはそれらに関連する(必ずしもそうである必要はないがしばしば免疫学的起源の)流体を含む。さらに、樹立細胞株がまた利用され得る。適切な供給源は、白血球、または白血球起源の細胞株、好ましくはマクロファージおよび単球のようなヒト末梢血単核細胞を包含し得る。好中球がTNFα コンバターゼの特に有用な供給源である。樹立細胞株を操作する容易さのために、TNFαコンバターゼの１つの好ましい細胞供給源はHL60細胞株である。従って、26kD proTNFα種の成熟TNFαへの変換は、26kD種をHL60細胞由来の抽出物と組み合わせることにより成され得る。さらに、TNFαコンバターゼ活性は特定の条件下で部分的に膜結合であるので、利用され得る膜画分を得ることが可能である。単球を単離するための手順は、HL60のような細胞株を培養するための他の方法のように当該分野で周知である。簡単に述べれば、単球は、末梢血から、標準的手順に従って、Ficoll-hypaqueを用いた遠心分離により調製され得る。これは単球およびリンパ球の濃縮集団を生成し、そして単球は、細胞の混合物を、組織培養ディッシュにプレートしそしてこの細胞を単球がディッシュの表面に壁着させるに十分な時間インキュベートすることによりさらに濃縮され得る。次いでリンパ球をプレートから洗い流し、主に壁着した単球を残す。次いでこれらの細胞はそのまま使用され得るか、または既知の単核アクティベーター、好ましくは、リポポリサッカリドおよびホルボールミリステートアセテートを用いて増大したレベルのTNFαコンバターゼを生成するために刺激され得る。細胞は分画され得、そしてそこから抽出物または膜画分のいずれかが調製され、そして以下に記載のアッセイで用いられる。 TNFαコンバターゼを、細胞膜画分を単離し、それを0.5％のNonidet P-40界面活性剤中に可溶化し、この溶液をアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換-HPLC、アニオン交換-HPLC、および逆相HPLCにかけることにより、12リットルのHL60培養物から単離して、18％の収率で、20μgの1000倍精製TNFαコンバターゼを得た。コンバターゼは、SDS-PAGE分析(銀染色)により約29〜30kDの分子量を有することが見出された。コンバターゼを配列決定し、そして実験誤差内で、第１のアミノ酸が、既知の好中球プロテイナーゼ、PR-3の成熟Ｎ末端配列(Campane lliら、J.Exp.Med．178：1709-1715(1990))に同一であることが見出された。精製コンバターゼは、26kD proTNFαを17kD成熟形態に切断することが示された。 PR-3はまた好中球からも単離され得る。好中球をヒト血液から分離し、次いで顆粒および膜を単離し、そして混合物を、実施例１に記載のように、RP-HPLCで分画する。以下により詳細に記載されるように、cDNAクローンの配列(配列番号22)から推定して、PR-3のアミノ酸配列が解明された。PR-3は、TNFαのプロセッシングに関連しない活性を有するプロテアーゼとして当該分野で公知である。それは、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、およびIV型コラーゲンを分解するヒト多形核白血球セリンプロテイナーゼとして分類される；Raoら、 J.Biol.Chem．266:9540-9548(1991)を参照のこと。ヒト好中球由来の精製PR-3は、SDS-PAGEで分析すると26.8kDの主要なバントを有することが報告されている。おそらく異なるグリコシル化種を示す(Raoら前述参照)僅かにより大きい分子量を有する２つのより小さいバンドもまた観察されている。PR-3は、エラスターゼ、カテプシンＧ、マウスグランザイムＢ、ラット肥満細胞プロテアーゼII、ヒト白血球プロテアーゼ、およびキモトリプシンのような他のセリンプロテアーゼと構造的に類似している(Campanelliら、J.Exp.Med．172：1709-1715(1990)を参照のこと)。PR-3は、α2-マクログロブリン、フェニルメチル-スルホニルフルオリド(PMSF)、およびα1-アンチトリプシンにより阻害される。放射標識26kD TNFα のPR-3切断産物の配列決定は、PR-3がproTNFαを切断してＮ末端Val-Arg-Ser配列(17kD成熟形態のアミノ酸1〜3)を生成し得ることを示す。切断は、Arg-Ser-Se r Ｎ末端またはVal-Ala-His Ｎ末端を生成するように生じ得る。Raoら(前述)は、PR-3がS1切断部位中の小脂肪族アミノ酸を好むことを報告している。カテプシンＧおよびプラスミンのようなヒトセリンプロテアーゼは、26kD proTNFαを効率的には17kD成熟形態に変換しない。エラスターゼは多少のTNFαコンバターゼ活性を有するようであるが、成熟TNFαをも分解する。以下に示されるように、PR-3は、ペプチドジフェニルホスホネートインヒビターであるエラスチナールおよびジクロロ-イソクマリン(DCI)により阻害される。ペプチドジフェニルホスホネートインヒビターは、Boc-Val-Pro-Val-p(OPh)2およびBoc-Ala-Pro-Val-p(OPh)2(BOC-ブトキシカルボニル)を含む。Boc-Ala-Gln-A la-p(OPh)2およびBoc-Leu-Ala-Gln-Ala-p(OPh)2もまた試験されており、かなり少ない阻害活性を有する。「Boc」はN-tert-ブトキシカルボニルを意味し、そして「p(OPh)2」は、ジフェニルホスホネート部分を示し、ここで式-COOH基がP(=O )-(O-フェニル)₂で置換されている。Oleksyszynら、Biochem 30：４85(1991)を参照のこと。他のペプチドジフェニルホスホネート分子がPR-3を阻害し得ることが認識される。潜在的なインヒビターは、Oleksyszynら(前述)で示された手順を用いて(例えば、小脂肪族ペプチドを用いて)構築され得る。潜在的なインヒビターが作製されれば、それらは以下で示されるアッセイで試験され得る。好中球から得られ得る天然PR-3は比較的少ないので、組換えproPR-3を培養で昆虫細胞中で産生した。組換えproPR-3を細胞培養培地から単離し、そしてジペプチジルペプチダーゼI(DPPI)を用いて活性化しＮ末端ALA-GLUジペプチドを取り除いた。これは、明らかに、活性PR-3の最初の組換え調製および組換えグランザイムチモーゲンをインビトロで活性化するための最初のDPPIの使用を表す。 III．TNF αコンバターゼ活性のインヒビターコンバターゼ活性のインヒビターは、敗血症および循環性TNFαが関係する他の疾患の処置において予防的または治療的に使用される。TNFαコンバターゼのインヒビターは、proTNFαまたは可溶性proTNFαの成熟TNFαへの変換を測定し得る手順により同定され得る。そのようなアッセイ手順のいくつかが本明細書、および以下の実施例４に記載される。適切なアッセイは、26kD proTNFα、TNFα コンバターゼ、および推定のインヒビターの組み合わせからなる。コンバターゼがTNFαに添加される前に阻害性物質がコンバターゼに添加され得るか、またはそれはコンバターゼ添加の前若しくは添加直後に添加され得ることが当業者に理解され得る。添加の順序は、インヒビターの同定を容易にし得る。基質が阻害活性を有する場合、これは、コントロール反応に比較して、26kD種の量の増加、および成熟TNFα種のそれに伴う減少を示す溶液の電気泳動分析により示され得る。出願人らはまた、コンバターゼインヒビターを検出するための比色アッセイを同定した。このアッセイは便利であり、そして26kD TNFαの切断に対するオートラジオグラフアッセイと相関する。比色アッセイは実施例４で詳細に記載される。Kamら、FEBS 297(1,2)：119-123(1992)をまた参照のこと。可溶性proTNFαの成熟TNFαへの変換を基礎にした他の細胞ベースのアッセイもまた有用である。抗コンバターゼ活性を有する他の化合物は、ポリクローナルまたはモノクローナルいずれかの抗コンバターゼ抗体、または組換え抗体を含む。好ましくは、これらの抗体はヒト化抗体である。コンバターゼに対するモノクローナル抗体が、 Kohler,G.およびMilstein,C．Nature 256：495(1975)に記載される一般的手順( 長年にわたり当該技術分野で公知なように改変されている)を用いて産生され得る。これら初期の研究は、マウスリンパ球と薬剤選択可能な形質細胞腫とを融合しハイブリドーマを生成する工程を包含していた。次いで、この技術は、ヒトモノクローナル抗体を分泌する細胞株を生成するために適用された。後者の手順は、一般に、Abrams，P．Methods in Enzymology，121：107(1986)に記載されているが、その他の改変法が当該分野で公知である。マウスまたはヒト抗体のいずれが産生されるかにかかわらず、抗体分泌性細胞が融合パートナーと組み合わされ、そして細胞を、適切な融合薬剤(好ましくはポリエチレングリコール、そしてより好ましくはポリエチレングリコール1000)を用いて融合する。後者は、抗体分泌性細胞および融合パートナーを小容量中に含む細胞ペレットに、穏やかに撹拌して短時間で添加される。融合薬剤を添加した後、細胞混合物を洗浄して融合薬剤および任意の細胞残渣を除去し、そして融合および非融合細胞からなる細胞混合物を、選択増殖培地を含む適切な細胞培養チャンバー中に播種する。数週間後、ハイブリッド細胞が出現し、これを抗体産生について同定し得、そしてサブクローン化して安定なハイブリッド細胞株の利用可能性を確実にする。好ましい抗体は、インビボまたはインビトロのいずれかでコンバターゼで感作され、そして抗体産生性ハイブリッド細胞株として不死化され、それによって所望の抗体の更新可能な供給源を利用可能にし得るリンパ球から産生され得る。インビトロ免疫化技術は当該分野で周知であり、そして一般的にLuben,R.およびMo hler,M.，Molecular Immunology 121：635(1980)、Reading,C．Methods in Enzy mology(Part One)：18またはVoss,B.，Methods in Enzymology，124：27(1986) に記載されている。多くのインビトロ免疫系が、ヒトＢ細胞を感作するために効果的であることが示されている。Reading,C.，J.of Immun．Methods，：261(198 2)。 TNFαコンバターゼで直接個体を免疫する代わりに、菌血症攻撃を経験しているかまたは経験した個体からリンパ球が単離され得ることが当業者に明らかである。例えば、Wegenerの肉芽腫症を有するヒト患者は抗PR-3抗体の天然供給源であり、そしてまたヒトモノクローナル抗体を得るための適切なヒト細胞を含む。これらリンパ球の画分は、コンバターゼに感作され、そして永久抗体分泌性ハイブリッド細胞株を生成するために用いられ得る。例えば、免疫無防備状態のヒト患者は、特に種々の悪性疾患、大きなやけどなどを患う患者は、一般に細菌感染を受けやすく、そしてそこから単離したリンパ球は、抗体分泌性細胞の供給源であり得る。感作されたリンパ球はウイルス形質転換により不死化され得る。ヒトリンパ球に対する好ましいウイルス形質転換技術は、エプスタイン-バールウイルスの使用を含む。このウイルスはヒトＢ細胞を形質転換し得、そしてヒトモノクローナル抗体を生成するために使用されている。Crawfordら、J．of General Vjrology 64：697(1983)；Kozbor,V.およびRoder,J.,J．Immun．Today ４：72(1983)。感作リンパ球が不死化され得る別の手順は、上記のウイルス形質転換および細胞融合の２つの技術の組み合わせからなる。好ましい組み合わせは、エプスタイン-バールウイルスでの抗体分泌細胞の形質転換、および次いで形質転換された細胞の適切な融合パートナーとの融合からなる。融合パートナーは、マウスミエローマ細胞株、ヘテロミエローマ株、またはヒトミエローマ株、または他の不死化細胞株であり得る。PCT第81/00957号；Schlomら、PNAS(USA)77：6841(1980)： Croceら、Nature 288：488(1980)。好ましい融合パートナーは、マウス-ヒトヘテロ-ハイブリッドであり、そしてより好ましくは、F3B6と称される細胞株である。この細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、受託番号HB8785 で寄託されている。それは1985年４月18に寄託された。F3B6を生成するための手順は、欧州特許出願第174,204号に記載されている。エプスタイン-バールウイルス形質転換の使用および不死化抗体分泌細胞株の生成に適用可能な技術は、Roder,Jら、Methods in Enzymology 121：140(1986) に示されている。基本的には、この手順は、エプスタイン-バールウイルスを適切な供給源(一般に感染細胞株)から単離する工程、および標的抗体分泌細胞をウイルスを含む上清に曝す工程からなる。細胞を洗浄し、そして適切な細胞培養培地中で培養する。次いで、細胞培養中に存在するウイルス形質転換細胞は、エプスタイン-バールウイルス核抗原の存在により同定され得、そして形質転換抗体分泌細胞は、当該分野で公知の標準的方法を用いて同定され得る。本発明の好ましい実施態様は中和抗TNFαコンバターゼモノクローナル抗体であるが、単独でも組み合わせでも、この抗体は改変され得、そしてなお生物学的活性を維持することは当業者に明らかである。従って本発明の範囲には、F(ab')₂ 、Fab、Fvなどのような、種々のサイズのフラグメントに減ずることにより改変された抗体が包含される。また、抗体を産生するハイブリッド細胞株は、単離しそして公知の遺伝子的技術により遺伝子操作抗体を産生するために細胞に移入し得る所望の抗体をコードするDNAの供給源であると考えられ得る。後者の例は、本明細書で記載されるハイブリドーマの抗体結合部位を有する単鎖抗体の産生であり得る。単鎖抗体は、米国特許第4,704,692号に記載されている。遺伝子操作抗体の第２の例は、組換えまたはキメラ抗体である。組換え抗体を生成する方法は、Cabillyらによる米国特許第4,816,567号、1984年８月15日に出願された日本国特許出願第84169370号；1984年８月27日に出願された米国特許出願第644,473 号；1984年９月３日に出願された英国特許出願第8422238号；1985年10月28日に出願された日本国特許出願第85239543号；1985年11月１日の米国特許出願第793, 980号；1987年７月24日に出願された米国特許出願第77,528号に示されている。また、1986年３月27日に出願された英国特許出願第867679号は、Ｌ鎖またＨ鎖可変ドメイン中の相補性決定領域(CDR)の少なくとも一部分が異なる特異性の抗体由来のCDRの類似部分により置換された改変抗体を生成する方法を記載する。そこに記載される手順を用いて、そのCDR領域か置換されている第２の種由来の抗体上に接合された１つの種のCDR領域を有する、組換え抗体を構築することが実行可能である。この例における好ましい実施態様は、ヒト抗体のCDR領域を置換するマウス抗コンバターゼ抗体CDR領域である。抗体に加えて、コンバターゼへの結合について26kD proTNFαと競合する化合物が26kD proTNFαの成熟形態への変換を阻害または減少させ、そしてそれ故、敗血症および他の疾患を処置するための有用な医薬であり得る。そのような試薬の１つのクラスは、26kD proTNFαと類似のまたはより良いTNFαコンバターゼ結合活性を有する、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、または合成若しくは天然に存在するその他の化合物からなる。好ましいペプチドまたはタンパク質は、proTNFαの76アミノ酸リーダー配列と17kD成熟形態との間の接合部に見出される配列に類似のアミノ酸配列を含むが、コンバターゼにより効率的に切断されないものである。ペプチド/タンパク質コンバターゼインヒビターの別の実施態様は、(配列番号５)に機能的に類似であるアミノ酸配列を有するものである。このペプチドは、２つのTNFαコンバターゼ切断部位にまたがり、そしてそれ故、とりわけ、17kD 成熟TNFαの形成を妨げ得る。第１のおよび優先的な切断部位は配列番号２の-1 および+1位のアラニンとバリンとの間にあり；そして第２の部位は配列番号２の +1および+2位のバリンとアルギニンとの間、ならびに配列番号２の+12および+13 位のプロリンとバリンとの間にあり、それらのすべてはまた図１(配列番号１)で示されるアミノ酸配列に対応する。第２番目のクラスの競合インヒビターは、上記で示された配列、すなわち(配列番号１)を含む化合物からなるが、ここで特定のアミノ酸が改変されまたは欠失して非切断基質を生成する。このペプチドの好ましい実施態様は、標準的な部位特異的変異誘発技術により生成される26kD proTNFαまたは可溶性proTNFα変異タンパク質である。例えば、-21〜+13位そしてより好ましくは-5〜+13位の領域中の特定アミノ酸の欠失または置換がTNFαコンバターゼのインヒビターを代表し得る。上記のペプチドは、例えば、Science 232：341-347(1985)に記載されるMerrif ield固相法のような、当該分野で周知の技術により作製され得る。この手順は、 Biosearch 9500自動化ペプチドマシンのような市販の合成器を使用し得、ブロックされたアミノ酸の切断はフッ化水素を用いて達成され、そしてペプチドは、Wa ters Delta Prep 3000機器を用いる調製用HPLCにより、15〜20μmのVydac C4 Pr epPAKカラム上で精製される。他の方法は、酵母またはE.coli宿主細胞における可溶性proTNFαの変異タンパク質などのポリペプチドの発現を含む。上記のペプチドジフェニルホスホネートもまたインヒビターとして用いられる。有用なペプチドは、Bocおよびジフェニルホスホネート部分に結合され得(Olek syszynら、Biochem．30：485(1991)を参照のこと)、そしてコンバターゼ阻害アッセイで試験される。好ましいペプチドは、Boc-Val-Pro-Val-p(OPh)、Boc-Ala- Pro-Val-p(OPh)₂、およびBoc-Val-Pro-His-p(OPh)₂である。しかし、他のペプチドジフェニルホスホネートを下記の阻害アッセイで使用してさらなるTNFαコンバターゼインヒビターを同定し得ることが理解される。例が以下に開示され、そしてOleksyszynら、Biochem．30：485(1991)に示されている。同定されたTNFαコンバターゼPR-3の見かけの基質特異性は、バリンまたはアラニン残基のような特定の非極性アミノ酸のすぐ後を代表的には切断するエラスターゼのような酵素の特異性に似ていると考えられている。従って、上で述べたペプチドインヒビターに加えて、エラスターゼを阻害することが知られている種々の他のインヒビターもまた、一般に、26kD proTNFαを切断して可溶性TNFαを形成する酵素を阻害し得る。TNFαコンバターゼを阻害するこれら化合物は、以下に記載のアッセイを用いて同定され得る。種々のエラスターゼインヒビターが、Boehringer Mannheim Biochemicalsのような供給者から入手可能であるか、または当該分野で公知である。Dohertyら、Nature 322：192，(1986)；米国特許第 4,711,886号；第4,797,396号；第4,717,722号；および第4,699,904号。好ましいエラスターゼインヒビターは、Dohertyら(前述)により示されるような改変されたセファロスポリン抗生物質である。より好ましいのは、(1-((3-((アセチルオキシル)-7-メトキシ-8-オキシ-8-オクス-5-チオ-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト- 2-エン-2-イル)カルボニル)モルホリン,S,S-ジオキシド,(6R-シス)である。また、Stetlerら、Nucleic Acids Research ４：7883(1986)は、好中球エラスターゼのインヒビターをコードするcDNAクローンを記載する。さらに、極めて相同性であるヒト好中球エラスターゼ分子について公知の構造を改変することによってPR-3の結晶構造をモデル化することによりインヒビターが見出され得る。そのようなモデルは、PR-3の基質結合部位中の潜在的な重要接触点を予見する。これら接触点の重要性は、部位特異的変異誘発により残基を改変すること、および以下に記載するように、新規な組換え的に発現された酵素の基質およびインヒビタープロフィールに対する影響を測定することにより試験され得る。潜在的インヒビターは、この情報に基づいて設計され得、そして、次いで本願のアッセイ系および敗血症性ショックの相当動物モデルで試験され得る。インヒビター、proTNFα、成熟TNFα、TNFαコンバターゼ、および本明細書で記載されるようなproPR-3のようなTNFαコンバターゼのプロ形態を得るために、組換え技術が使用され得る。本明細書で記載されている組換え技術の大部分は、細胞を形質転換し、ベクターを製造し、メッセンジャーRNAを抽出するためなどに用いられ得るが、これらはバイオテクノロジーで広く実施されており、そして使用される標準的な材料および方法は大部分の実施者に良く知られている。しかし、便宜上、以下のパラグラフがガイドラインとして提供される。 A．一般的なクローニング技術所望のTNFαコード配列を含む適切なベクターの構築は、当該分野で良く理解されている標準の連結および制限技術を用いる。単離されたベクター、DNA配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、切断され、加工され、そして所望の形態に連結される。部位特異的DNA切断は、当該分野で一般に理解され、そしてその詳細はこれら市販の制限酵素の製造者により特定されている条件下で、DNAを適切な制限酵素で処理することにより実施される。例えば、New England Biolabs，Product Cat alogを参照のこと。一般に、約１pgのプラスミドまたはDNA配列が約20μlの緩衝溶液中の１単位の酵素で切断される。本明細書の実施例では、代表的には、過剰の制限酵素を用いてDNA基質の完全消化を確実にしている。約37℃で約１〜２時間のインキュベーション時間が実行可能であるが変更が許容され得る。各インキョベーションの後、タンパク質をフェノール/クロロホルムを用いた抽出により除去し、次にエーテル抽出を行い得、そして核酸を、エタノールを用いた沈殿により、次いでセファデックスG-50スピンカラムを用いるクロマトグラフィーにより水性画分から回収する。所望であれば、切断フラグメントのサイズ分離を、標準的技術を用いてポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行い得る。サイズ分離の一般的説明は、Methods in Enzymology 65:499-560(198 0)中に見出される。制限切断されたフラグメントは、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP) の存在下、20〜25℃で約15〜25分のインキュベーション時間を用いて、50mM Tri s pH7.6、50mM NaCl、6mM MgCl₂、6mM DTT、および10mM dNTP中で、E.coli DNA ポリメラーゼＩのラージフラグメント、すなわち、クレノウフラグメントを用いて処理することにより平滑末端とし得る。クレノウでの処理後、混合液をフェノール/クロロホルムで抽出してエタノール沈殿する。S1ヌクレアーゼを用いた適切な条件下での処理により、分子の一本鎖部分を加水分解する。連結は、15〜30μl容量中、以下の標準条件および温度下で実施される：20mM Tris-Cl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM〜50mM NaCl、および１mM ATP 0.3〜0.6(Weiss)単位T4 DNAリガーゼ、４℃で「付着末端」連結、または「平滑末端」連結のために。分子間「付着末端」連結は、通常、33〜100μg /ml総DNA濃度で実施される。平滑末端連結には、末端の総DNA濃度は約１μMである。「ベクターフラグメント」を用いるベクター構築では、ベクターフラグメントは、一般に、5'リン酸を除去し、そしてベクターの再連結を防ぐために、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)を用いて処理される。BAP切断は、pH８で、約150mM Tris中、Na+およびMg⁺²の存在下、約１単位のBAPをベクター１pgあたり用いて60 ℃で約１時間行う。核酸フラグメントは、フェノール/クロロホルムを用いて調製物を抽出し、次いでエタノール沈殿により回収される。あるいは再連結は、所望でないフラグメントのさらなる制限酵素消化により二重消化されたベクターにおいて防ぎ得る。以下に呈示される構築では、適正な連結は、最初に適切なE.coli株を連結混合物で形質転換することにより確認される。成功した形質転換体は、当該分野で理解され得るように、アンピシリン、テトラサイクリンまたはその他の抗生物質に対する耐性により、あるいは、プラスミド構築の様式に依存してその他のマーカーを用いて選択される。ミニプレップDNAは、Ish-Howowiczら、Nucleic Acids R es.,２：2989(1981)の方法により形質転換体から調製され得、そして制限により分析され、そして/またはSangerら、PNAS(USA)74：5463(1977)、さらにMessing ら、Nucleic Acid sRes．２：309(1981)に記載されるジデオキシ法により、またはMaxamら、Methods in Enzymology 65：499(1980)の方法により配列決定される。PR-3配列決定の場合には、正確な配列を得るために高G/C含有量の領域には特別の注意を払わねばならない。本出願のPR-3配列と先行技術で報告されたいくつかとの間の差異は、部分的には、クローン間変動よりむしろ配列決定エラーに起因し得る。 M13中のクローニングに使用される宿主株は、ファージ感染を受ける、E.coli K12株DG98のようなE.coli株からなる。DG98株は、ATCCに1984年７月13日に寄託され、そして受託番号1965を有する。用いられる宿主細胞に依存して、そのような細胞に適切な標準的技術を用いて形質転換を行う。Cohen、PNAS(USA)69：2110により記載されたような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、またはManiatisら、Molecular Cloning：A Labor atory Manual，Cold Spring Harbor Press、254頁(1984)に記載されるRbCl₂法が原核生物について使用され得る。トランスフェクションがまた、Grahamら、Viro logy 52：456(1973)、またはWiglerら、Cell 14：725(1978)のリン酸カルシウム沈殿技術の改変法を用いて達成され得る。 B．オリゴヌクレオチドプローブ合成オリゴヌクレオチドは、Matteucciら、J.Am Chem.Soc.103：3185(1981)のトリエステル法により、または市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製される。アニーリング前または標識のための一本鎖のキナーゼ処理は、50mM Tris,pH7.6、10mM MgCl₂、５mMジチオトレイトール、１〜２m MATP、1.7pmole の³²P ATP(2.9mCi/mmole)、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAの存在下、0.1nmole の基質に、過剰の、例えば、約10単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて達成される。 C．変異誘発変異誘発は、当該分野で公知の任意の数の手順を用いて実施され得る。これら技術は、Smith、Annual Review of Genetics 19：423(1985)により記載され、そして技術のいくつかの改変は、Methods in Enzymology 154、Ｅ部、WuおよびGro ssman(編)(1987)、17、18、19、および20章に記載されている。好ましい手順は、ギャップ二本鎖(gapped-duplex)部位特異的変異誘発法の改変法である。一般的手順は、Kramer(前述)、Methods in Enzymologyの17章に記載されている。従来のM13変異誘発法は、短い合成オリゴヌクレオチドを、変異誘発されるべきクローン化標的コード配列を有する一本鎖のM13 DNAにアニーリングする工程を包含する。オリゴヌクレオチドは、完全にではないがほとんど、標的配列に相補的であり、そして少なくとも１つの誤対合したヌクレオチドを有する。アニーリング反応の後、一本鎖DNAの残りの部分は変異を発現させる適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ得るヘテロ二本鎖DNAを与えるためにフィルインされねばならない。ギャップ二本鎖法では、標的領域および曝された一本鎖M13 DNAの残りを有する従来法とは異なり、曝された標的領域のみを有する部分的DNA二本鎖が構築される。従来法のように、短いオリゴヌクレオチドは、標的領域にアニールされ、そして伸長されそして連結されてヘテロ二本鎖を生成する。しかし、ギャップ二本鎖法では、一本鎖DNAのほんの小部分がハイブリダイゼーションに利用可能なため、オリゴヌクレオチドは、M13ゲノム内の所望でない部位にはアニールしない。さらに、この方法は、ヘテロ二本鎖の形成の間により少ない誤りが導入されるさらなる利点を有する。何故なら、標的領域のいずれかの側のDNA のほんの小領域がフィルインされなければならないに過ぎないからである。より詳細には、ギャップ二本鎖法は、例えば、終止コドンアンバー変異のような選択マーカーを保持する適切なM13ファージ中に標的DNA配列をクローニングする工程を包含する。後者は、変異の影響を抑制し得ない宿主細胞中でのネガティブ選択を可能にする。好ましくは、ファージは、重要なファージ遺伝子中に２つのアンバーコドンを含むM13mp9である。従って、26kD TNFαをコードする配列は、M13mp9アンバー⁺中にクローン化され、そして一本鎖DNAを標準的技術を用いてそこから調製する。次いで、アンバーコドンを欠く遺伝子操作されたM13誘導体であるM13 GAP由来の二本鎖の複製型DNAを、HincII制限酵素を用いて切断する。 M13 GAPの塩基配列は、アンバーコドンおよび塩基対6172と6323との間の配列の両方を欠くM13mp18に類似している。この欠失は、M13mpシリーズのマルチクローニング部位に隣接し、そして単一のHincII部位を生成する。標準のDNA/DNAハイブリダイゼーション技術を用いて、ギャップ二本鎖DNAが形成され、これはアンバーコドンを有する一本鎖DNA、およびアンバーコドンおよびTNFαコード配列の両方を欠くHincIII消化M13GAP由来のDNAの第２の鎖からなる。従って、曝されているギャップ二本鎖の部分は、26kD TNFα標的配列のみである。所望のオリゴヌクオチドがギャップ二本鎖DNAにアニールされ、そして残存するギャップのすべてがDNAポリメラーゼでフィルインされ、ニックがDNAリガーゼでシールされて、ヘテロ二本鎖を生成する。後者は、好ましくは、ミスマッチ修復欠損宿主中にトランスフェクトされ、そして混合ファージが生成される。混合ファージ集団から、変異していない26kD TNFαDNAを保持し、アンバー変異も有するファージが、アンバー変異を抑制し得ない宿主細胞中に混合ファージ集団を感染することにより選択され得る。次いで、所望のTNFα変異を保持するファージについてクローンがスクリーニングされ得る。 IV．TNF αコンバターゼインヒビターの使用の方法 TNFαコンバターゼ阻害活性を有するとして同定された化合物はまた、敗血症性ショックまたは他のTNFα介在の疾患の処置に予防的または治療的用途を有する。敗血症の発症は、循環性成熟TNFαの増加を伴うので、これらインヒビターは、細菌感染の危険がある、特に手術前環境におけるような場合で予防的に使用され得る。同様に、敗血症の初期診断がある場合、インヒビターは、産生される TNFαの可溶性17kD形態の量を実質的に減少させることにおいて、有益な治療効果を有する。循環性成熟TNFαの増加は、慢性関節リウマチ、悪液質、大脳マラリアおよび対宿主移植片病の疾患にともなう。従って、本発明のインヒビターはまた、これら疾患の処置において有用な予防的または治療的用途を有する。本発明のインヒビターは、敗血症性ショック、AIDSなどの防止に治療的に有効である濃度で投与され得る。これらの目的を達成するために、ペプチド、ペプトイド、または化学的化合物が非経口的に(すなわち血管内[動脈内または静脈内] 、筋肉内、関節内、または皮下ルート経由で)投与される。慢性関節リウマチのような特定の場合には、局所適用(関節内)が有効な治療効果を有し得る。この投与を達成するための方法は当業者に公知である。患者への投与前に、処方剤または薬学的に受容可能な賦形剤が、ペプチドおよび化学的化合物に添加され得る。液体処方物が好ましい。例えば、これらの処方剤は、油、ポリマー、ビタミン、炭化水素、アミノ酸、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、またはバルク剤を包含し得る。好ましくは、炭化水素は、単糖、二糖、若しくは多糖、または水溶性グルカンのような、糖若しくは糖アルコールを包含する。サッカリドまたはグルカンは、フラクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物を包含し得る。糖アルコールは、-OH基を有するC4〜C8 の炭化水素として定義され、そしてガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。上で述べたこれらの糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて用いられ得る。糖または糖アルコールが水性調製物中で可溶性である限り使用量に固定された制限はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、1.0w/v％と7.0w/v％の間、より好ましくは2.0w/v％と6.0w/v％の間である。好ましいアミノ酸は、カルニチン、アルギニン、およびベタインの左旋性(L)形態を包含する；しかし、他のアミノ酸が添加され得る。好ましいポリマーは、2,000と3,000との間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン(PVP) 、または3,000と5,000との間の平均分子量を有するポリエチレングルコール(PEG )を包含する。凍結乾燥前または再構成後の溶液中でのpH変化を最小にするために、組成物中に緩衝液を使用することもまた好ましい。生理学的に適合する緩衝液が用いられ得るが、クエン酸、リン酸、コハク酸、およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が好ましい。クエン酸緩衝液が最も好ましい。好ましくは、濃度は、0.01〜0.3モル濃度である。処方物に添加され得る界面活性剤が、欧州特許第270,799号および第268,110号に示されている。さらに、本発明のペプチド、ペプトイド、または化学的化合物は、ポリマーへの共有結合により化学的に改変され得、例えば、それらの循環半減期を増大させる。好ましいポリマー、およびそれらのペプチドへの結合方法は、米国特許第4, 766,106号、第4,179,337号、第4,495,285号、および第4,609,546号に示されており、それら全体が参考として本明細書に援用される。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリエチレングリコール(PEG)である。PEGは室温で水溶性であり、そして一般式：R(O-CH₂-CH₂-ON-R)を有し、ここでRは、水素、もしくはアルキルまたはアルカノール基のような保護基であり得る。好ましくは、保護基は１〜８個の間の炭素を有し、より好ましくはメチルである。シンボルnは、正の整数であり、好ましくは、１と1,000との間、より好ましくは、２と500との間である。PEGは、好ましくは、1000と40,000との間の、より好ましくは2000と20,000との間の、最も好ましくは3,000と12,000との間の平均分子量を有する。好ましくは、PEGは、少なくとも１つの水酸基を有し、より好ましくはそれは末端水酸基である。優先的に活性化されてインヒビター上の遊離のアミノ基と反応するのはこの水酸基である。水溶性ポリオキシエチル化ポリオールがまた本発明で有用である。それらはポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール(POG)などを包含する。POGが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトにおいて天然に存在するモノ-、ジ-、トリグリセリドと同じ骨格であるからである。POGは、PEGと同じ範囲の好ましい分子量を有する。POGの構造はKnaufら、J.Bi ol.Chem．263：15064-15070(1988)に示され、そしてPOG結合体の議論は、米国特許第4,766,106号に見出され、それら両方の全体が参考として本明細書に援用される。液体薬学的組成物が調製された後、好ましくは凍結乾燥されて分解を防ぎ、そして無菌度を保持する。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に公知である。使用直前に、組成物は、付加的な成分を含み得る無菌の希釈剤(例えば、リンゲル液または滅菌生理食塩水)で再構成され得る。再構成して、組成物は、当業者に公知な方法を用いて被験体に好ましくは投与される。不溶性インヒビターは、１種以上の可溶化剤との組み合わせにより処方され得る。好ましい可溶化剤は：エタノール；コーンオイルなどのオイル；PEG；プロピレングリコール；および非イオン性界面活性剤を包含する。好ましい共溶媒(c o-solvent)は、50と1,000との間の、より好ましくは、100と600との間の分子量を有する。好ましいそれらの濃度は、１％と75％(w/w)との間、より好ましくは1 0％と50％との間である。エタノール濃度は、好ましくは0.1％と20％との間であり、より好ましくは１％と５％との間である。好ましい非イオン性界面活性剤は、14と40との間の、より好ましくは15と20との間の、最も好ましくは17と19との間の親水性-親油性バランスを有する。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、1 00と250,000との間の、より好ましは4,000と200,000との間の、最も好ましくは6 ,0 00と150,000との間の範囲の分子量を有する。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、0.005％〜10％(w/v)の濃度範囲で、より好ましくは、0.01〜５％(w/v)の範囲で、最も好ましくは、0.05％〜2.5％w/vの範囲で有効である。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、製薬、食品、および化粧品産業で一般に用いられるものを包含する。好ましい非イオン性界面活性剤は：ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(例えばTween)、ポリエチレングルコールエステル、ポリエチレン脂肪酸エステル、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマー(例えばPluronic)、エチル化脂肪アルコールエステル(例えばlaureth-12) 、オクチルフェノキシポリエチオキシエタノール化合物(例えばTriton)、およびポリオキシエチル化キャスター油(例えばCremophor)を包含する。これらの非イオン性界面活性剤は当該分野で公知の方法で生成され得、または市販の供給業者から購入され得る。その他の非イオン性界面活性剤は、以下のスクリーニング法を用いることにより決定され得る。この方法では、非イオン界面活性剤が有効濃度の不溶性インヒビターに添加される。得られる溶液は、混合されまたはホモジナイズされ、そして室温で24時間放置させる。インヒビターが、RP-HPLC、GC、または可視若しくは分光測光的清澄度で測定したとき溶液状にある場合、その界面活性剤はインヒビターを可溶化するために有用である。出願人がそれらの発明であると考えるものを一般に記載したが、以下に呈示されるものは、本発明の範囲の例示である実施例である。この実施例は示された材料および方法に本発明を制限して解釈されることは意図されず、本発明の範囲から逸脱することなくその中でなされ得る多くの置換が存在することが当業者に認識され得る。実施例１ TNFαコンバターゼの単離および同定 HL60細胞をAmerica Type Culture Collection(Rockville、MD)から得、そして 20％のウシ胎児血清(GIBCO)およびL-グルタミンを補充したRPMI 1640培地を含む T-175フラスコ中で増殖させた。合計３リットルのHL60細胞のバッチを密集状態になるまで増殖させ、そして採集した。約120mlの低張緩衝液に細胞を再懸濁し、そして窒素キャビテーション(400psi、４℃で30分間)により溶解させた。ホモジネートを10分間10,000×gで遠心分離し、そして上清と細胞破砕物ペレットの両方を−20℃で保存した。 HL60細胞培養物の３つのバッチ由来のHL60細胞の破砕物を、0.5％ NP-40、５m M EDTA、および２μg/mlのロイペプチンを含有する250mlの10mM Tris(pH8.5)(DE AE緩衝液)中で解凍し、そして同じ緩衝液中で４時間透析した。精製の間使用したプロテアーゼインヒビターは、HL60溶解物中で検出されるコンバターゼ活性に測定可能な効果を有さないことが示された。微粒子を遠心分離(10,000×g、10分間)により除去し、そしてDEAE Sepharoseカラム(2.6×21cm、Pharmacia)でのアニオン交換クロマトグラフィーにより画分化したサンプルを、０〜0.8Mの勾配の 680mlのNaClで溶出した。³⁵S-proTNFαオートラジオグラフィックコンバターゼアッセイを用いる精製の間にTNFαコンバターゼ活性を有する画分を同定した。0 .1％ NP-40、１mM EDTA、および１μg/mlのロイペプチンを含有する20mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)中に、プールしたDEAE画分を透析し、３つの等しい部分に分け、そして各部分を、7.5×75mm TSK-SP-5PWカラム(BioRad)でのカチオン交換HPLCにかけ、45分かけて０〜0.6Mの勾配の塩化ナトリウムで溶出した。コンバターゼ活性に富む画分をプールし、そして0.1％ NP-40を含有するDEAE緩衝液に透析した。SPカラムからのプールした材料を３つの部分に分け、そしてそれぞれを、(7.5×75mm)TSK-DEAE-5PWカラム(BioRad)のアニオン交換HPLCにかけて、4 5分かけて０〜0.6Mの勾配の塩化ナトリウムで溶出した。アセトニトリル/0.1％ TFA移動相を用いるVydac C4カラムのRP-HPLCによりコンバターゼ活性のプールをさらに精製した。この処置により1,000倍精製を提供し、20μgのコンバターゼ(約320単位)を18 ％の収率で得た。RP-HPLCからの画分をコンバターゼ活性について試験し、そしてSDS-PAGEにより分析した。コンバターゼ活性を有する画分は、約28〜31kDの分子質量を有するタンパク質を含有していた。プールしたコンバターゼをＮ末端タンパク質配列決定により解析し、そして１つのアミノ酸配列を得た。Ｎ末端の最初の18アミノ酸がセリンプロテアーゼPR-3の最初の18アミノ酸と同一であることを確認した。次いで、公表された手順(Gabay,J.ら、Proc．Nat'l Acad．Sci．US A 86:5610[1989])をわずかに改変した手順を用いて、天然のPR-3をヒト好中球から単離し、そしてそれが、proTNFαオートラジオグラフィックアッセイにおいて、TNFαコンバターゼと同じ活性を有することを見出した。 PR-3をTNFαコンバターゼとする同定は、精製TNFαコンバターゼの臭化シアン切断フラグメントのＮ末端配列決定ならびにアミノ酸組成によりさらに確証された。なぜなら、これらの両方が、公表された成熟活性PR-3のアミノ酸配列(Campa nelliら、J．Exp．Med．172:1709-1715(1990))に一致(実験エラーの範囲内で)したからである。実施例２ヒトPR-3のクローニングおよび組換え発現 HL60細胞からRNAを精製し、そしてプラスミドpGEM(PROMEGA、Madison、Wiscon sin)中にcDNAライブラリーを構築した。cDNAの構築にはcDNAのＣテーリング(C-t ailing)およびベクターのＧテーリング、続いてプラスミドへの連結を用いた(Ge ne Transfer and Expression、1990、114-135頁)。ミエロブラスチン(myeloblas tin)の公知の配列(Boriesら、Cell 59:959-968(1989))由来の固有のオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローンをスクリーニングした。プラスミド二本鎖配列決定およびSequenaseキットおよび自動化Applied Biosy stems(ABI)シークエンサーを用いて、１つのクローンMY17の配列決定を行った。 preproPR-3をコードするMY17中の配列を配列番号22に示す。この配列の新規な特徴は、Boriesら(前出)による最初の発表とは５つのヌクレオチドの差異を有し、そしてCampanelliら、J．Exp．Med．172:1709-1715(1990)の発表とは３つのヌクレオチドの差異を有することである。さらなる5'配列およびさらなる5'メチオニンコード配列を見出した。本明細書に記載のように得た、予測されるPR-3配列中の２つのカルボキシ末端アミノ酸、アルギニンおよびプロリンは、Boriesら(前出)により予測されたアミノ酸と同一であるが、Campanelliら(前出)によるグリシンおよびプロリン配列とは異なる。哺乳動物細胞におけるPR-3の一過性の哺乳動物発現を、MY17由来の1.0kbのHin cIII〜EcoRI PR-3フラグメントをSR-αベクターのPstI部位にクローニングすることにより行った。Kreigler、Gene Transfer and Expression、99-100頁、Stoc kton Press(1990)に記載のDEAE/Dextran法を用いて、COS細胞をトランスフェクトした。一過性の発現は、ウェスタンブロット解析によりCOS細胞における低レベルのPR-3発現を示した。他の組換えタンパク質の発現に効果的であることが当該分野で公知のストラテジー(stratagy)に基づいて、哺乳動物、細菌および昆虫の発現系におけるPR-3の発現を最適化する試みにおいて、PR-3に変異を起こした。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて、pGEMベクター中のPR-3遺伝子に変異を起こした。種々の構築物を作製した。 A)アミノ酸-１位および-２位(それぞれグルタミン酸およびアラニン)のコドンを欠失したオリゴヌクレオチドを用いてprePR-3を作製した。この遺伝子はEcoRI 切断によりpGEMから切り出し得、そしてこの遺伝子は、一過性の哺乳動物発現のためにpCDL-SRα296(Takebeら、Mol．Cell．Biol．8:466[1988])に、そして安定したトランスフェクタントの産生のためにpcDNA Iに移入し得る。 B)リーダーを欠失し、そして成熟タンパク質の１位のイソロイシンの前にATG を付加したオリゴヌクレオチドを用いてMet-PR-3を作製した。この遺伝子はEcoR I切断によりpGEMから切り出し得、そして一過性の哺乳動物発現および安定した哺乳動物発現のためにSR-αプラスミドおよびpcDNA Iに移入し得る。さらに、λ cIベースの細菌性発現ベクターpDG160中のShine-Dalgarnoリボソーム結合部位の８〜12ヌクレオチドにこの構築物を配置した。 C)セクロピンＢについての昆虫リーダーを成熟PR-3タンパク質の１位のイソロイシンの前に配置するように別の構築物、pAcC13:Myo構築物を作製した。これを、Sf9細胞での発現のために昆虫ベクターpAcC13中に配置した。天然のPR-3リーダーを用いて、類似の構築物を作製したが、しかしチモーゲン残基を有さなかった。 D)細菌発現を最適化するために、オーバーラップする合成オリゴヌクレオチド、および合成フラグメントのポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、デルタシグナルPR-3の最初の２〜８アミノ酸のコドン中におけるプリンからピリミジンへの３番目のヌクレオチドの変異誘発を行った。このフラグメントをPR-3の5'SmaI部位にクローニングして5'RNAのGC含有量を減少させて発現を促進した。 E)S.cerevisiaeにおける発現のために、PR-3に関連する配列において上記A)およびB)に記載の構築物に類似の構築物を作製した。予期されなかったことに、これらの構築物はいずれも顕著な量の組換えPR-3を発現せず、そしてウェスタンブロット解析により検出されたいくつかのPR-3を発現した構築物において、PR-3比色プロテアーゼアッセイにおいて活性は認められなかった。いくつかの場合において、微量の不溶性rPR-3を回収したが、不活性なジスルフィド結合した凝集体であった。標準的な再生(refolding)条件を用いて、この材料をインビボで再生し得なかった。 F)有用な形態の組換えPR-3を産生するための好ましい宿主/発現系は、Sf9昆虫細胞において発現させられるチモーゲン残基を含む天然リーダー構築物、または CHO細胞またはヒト293細胞での発現のために設計された類似の構築物を包含した。分泌されたチモーゲンは完全に活性化可能であった(実施例16および18を参照のこと)。実施例３ 26kDのproTNFαの成熟TNFαへの変換 American Type Culture Collectionに受託番号第67,103号で寄託されているベクターpFVXMを用いて、26kD TNFα種をコードするDNA配列を含むベクターpFVXM- TNFα6を作製した。後者のベクターを作製するために、26kDのTNFα種をコードするcDNA配列を含むプラスミドpB11を、コード配列を切除するPstIで処理した。このフラグメントを標準的な電気泳動技術を用いて精製した。次に、ベクターpF VXMをPstIで処理し、そして上記のように標準的な技術を用いて、26kDのコード配列を含むpB11由来のPstIフラグメントを、このベクターのポリリンカー領域に挿入してpFVX-TNFα6を作製した。Krieglerら、1988により記載されるように、または1989年８月16日に出願された「プロホルモンタンパク質に対する切断部位ブロック抗体およびその使用」と題する米国特許出願第395,254号に記載のように、pFVX-TNFα6を用いてTNFα6.8細胞株を作製した。 pFVXMとプラスミドpB11の両方をE.coliのHB101株中で増幅した。標準的な条件を用いてフラグメントの連結を行った。連結手順の後、プラスミドDNAを単離し、そしてTNFαコード配列の適正な方向を制限解析により確立した。 Nucleic Acid Research、1:1513(1979)に記載のBirnboimおよびDotyの手順に従ってプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを塩化セシウム密度勾配中で２回バンド化し、そして10mM Tris(pH8.0)、および１mM EDTAからなるTE緩衝液に対して徹底的に透析した。 TNFα6.8は26kDおよび17kDのTNFαの両方を発現する。図３は、HL60細胞に存在するコンバターゼ活性による26kDのTNFαの変換を示す。図３において、レーンＡ、Ｂ、およびＣは種々のコントロールを示す：TNFα6.8細胞溶解物コントロール(A)、26kDの転写/翻訳コントロール(B)、およびインキュベーションコントロール(C)。レーンＤ、ＥおよびＦは、HL60 S-1細胞質ゾルの非誘導(D)画分および誘導(E)画分、または誘導細胞から調製したP-1ペレット画分のいずれかに存在するコンバターゼにより、転写/翻訳生成26kD TNFαの主に17kD TNFαへの変換を示す。Ｇはブランクレーンである。インビトロ転写/翻訳による標識26kD TNF αの作製、およびゲル電気泳動による解析は下記の実施例４に記載される。S-1 細胞質ゾルまたはペレット画分が26kDのTNFαから17kD種へのほぼ完全な変換を引き起こすことに注意されたい。図３はまた、比較目的のために、TNFα6.8細胞の溶解物中の26kDのTNFαおよび17kDのTNFαを示す。実施例４ TNFαコンバターゼアッセイ A．インビトロ転写/翻訳アッセイ好ましいアッセイの手順は、26kD分子を作製するインビトロの転写/翻訳、続くコンバターゼ阻害活性について試験される化合物の存在または非存在下でのコンバターゼによる処理からなる。この手順はpGEMベクター中に存在するTNFa cDN Aのインビトロでの転写/翻訳を必要とする。従って、PstI切断によりpB11から配列を切り出し、そしてこれをpGEM-3(Promega Biotec、Madison Wisconsinから入手し得る)のPstI部位に挿入した。得られたプラスミドをpGEM-TNFα14と名付け、確立された技術を用いてE.coli中で増幅し、そして上記のBirnboimおよび Dolyの手順に従ってプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAをHjndIIIで直線化することによりインビトロで転写し、そして直線化したプラスミドテンプレートを用いてT7 RNAポリメラーゼおよびPromega Biotec(Madison、Wisconsin)により供給されるインビトロ転写キットでキャップ(capped)転写物を調製した。製造業者の説明書により提示される標準的な技術を用いて転写を行った。上記の作製したmRNAを³⁵S-システインの存在下でインビトロで翻訳し、³⁵S-システインで標識した26kDのTNFαを作製した。これもPromega Biotecにより供給されるウサギ網状赤血球溶解物翻訳キットを用い、そして製造業者により推奨される条件に従った。以下のようなコンバターゼインヒビターについてのアッセイに³⁵S-システインで標識した26kDのTNFαを用いた。25μlのインビトロで転写した材料を、非誘導 HL60細胞から部分的に精製したコンバターゼ活性を有する250μlの溶液および阻害活性についてアッセイされる化合物を組み合わせた。２×10⁹のHL60細胞を採集し、細胞を破壊し、そしてそれぞれ合計18mlおよび６mlのS-1(100,000×gの遠心分離からの上清液)画分およびP-30(30,000×gの遠心分離からのペレット)画分を単離することによりコンバターゼを産生した。S-1画分も使用し得るが、250μ lのP-30画分を用いた。本質的に上記のように、30℃で１時間アッセイを行った。次に、反応混合物をウサギ抗ヒトTNFαポリクローナル抗血清(E.coliで産生したTNFαから作製した)およびプロテインＡ Sepharoseで免疫沈降させ、ペレット化し、そして洗浄した。結合したタンパク質を溶出し、そしてSDS-PAGEを用いて電気泳動した。ゲルを40％メタノール、10％酢酸中で固定し、Enlightening(Dup ont)に浸し、乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝した。続いて、Ｘ線フィルムを現像した。HL60コンバターゼおよび潜在的な阻害化合物の種々の希釈物で処理した 26kDのTNFαのゲル電気泳動プロファイルは、阻害活性を有する化合物を明らかにした。上記のアッセイを用いて、それぞれ100pg/mlおよび５mg/mlの濃度の3,4-ジクロロ-イソクマリンおよびエラスチナル(elastinal)がコンバターゼを阻害することを決定した。(1-((3-((アセチルオキシル)-7-メトキシ-8-オキシ-8-オキソ-5- チオ-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-イル)カルボニル)モルフォリン,S , S-ジオキシド,(6R-シス)が１mMの濃度でコンバターゼ活性を阻害することも示された。これらの結果を図４に示す。図４においてパネル１のレーンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤはそれぞれ、pFVXM-TNFα６トランスフェクト細胞株TNFα6.8(Kriegler ら、Cell 53:45(1988))の細胞溶解物の免疫沈降、インビトロで転写/翻訳した26 kDのTNFαの免疫沈降、(1-((3-((アセチルオキシル)-7-メトキシ-8-オキシ-8-オキソ-5-チオ-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-イル)カルボニル)モルフォリン,S,S-ジオキシド,(6R-シス)の26kDのTNFαの変換に対する効果、および(1 -((3-((アセチルオキシル)-7-メトキシ-8-オキシ-8-オキソ-5-チオ-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-イル)カルボニル)モルフォリン,S,S-ジオキシド， (6R-シス)の非存在下での26kDのTNFαの変換を示す。パネル２のレーンＡおよびＢはそれぞれ、pFVXM-TNFα6トランスフェクト細胞株TNFα6.8(Krieglerら、Cel l 53:45(1988))の細胞溶解物の免疫沈降、およびインビトロで転写/翻訳された2 6kD TNFαの免疫沈降を示す。レーンＣおよびＤは、それぞれ3,4-ジクロロ-イソクマリンの存在下および非存在下での26kDのTNFαの変換を示す。レーンＥおよびＦはそれぞれ、エラスチナルの存在下および非存在下での26kDのTNFαの変換を示す。また、上記アッセイをヒト好中球由来の精製天然PR-3と共に用いて、図５に示すように、種々のプロテイナーゼインヒビターを、TNFαコンバターゼ活性を阻害する能力について試験した。³⁵Sで標識した26kDのTNFαの添加の前に、精製PR -3(0.3μg/ml)を以下のインヒビターと共に30分間プレインキュベートし、次いで上記のようにアッセイした：DCI(45μM)、α-2-マクログロブリン(1mg/ml)、P MSF(20μM)、ロイペプチン(２μg/ml)、EDTA(10mM)、またはペプスタチン(２μg /ml)。これらのインヒビターの内の最初の３つが顕著な阻害活性を示した。 B．細胞ベースアッセイ 26kD形態のTNFαはまた、Krieglerら、Cell 53:45(1988)により記載されるように、刺激した単球により作製し得る。簡単に述べると、ヒト単球を遠心分離によりヒト血液から精製し、続いて単球の細胞培養ディッシュへの接着に基づいて富化する。遠心分離は、Pharmaciaから入手可能なFicoll-hypaqueおよびパーコール(49.2％)により単球を精製することからなる。製造業者の推奨する手順に従った。次に、遠心分離工程から得られる、単球およびリンパ球からなる細胞の混合物を、20％のウシ胎児血清を補充したRPMI培地を含む組織培養ディッシュ上にプレートする。このディッシュを30分間37℃でインキュベートし、その後同じ培地で十分にリンスする。この処理により非接着性のリンパ球を除去し、そして接着性の単球のみを残す。単球の26kDのTNFαを以下のように放射性標識する。20％のウシ胎児血清を補充したRPMI培地中で３時間37℃で単球をインキュベートする。次いでこの培地をシステイン欠乏培地(５％ v/vの透析したウシ胎児血清を含有するRPMI)に置き換え、そして100ng/mlのリポポリサッカリドおよび10pg/mlのフォルボールミリステートアセテートで、細胞を30分間37℃で誘導する。後者の２つの化合物はTNF αの発現を誘導する。血清を使用前に透析し、存在するすべてのシステインを除去する。30分のインキュベーションの期間の後、100μCiの³⁵Sシステインを添加し、そして３時間37℃で細胞を放射性標識し、この後細胞を溶解してコンバターゼ活性についてのアッセイに用いる。アッセイを行うための工程、ならびにコンバターゼのインヒビターを同定する工程は上記の工程と同様である。THP-1ヒト単球細胞のような他の細胞株をこのようなアッセイに用い得る。アッセイシグナルは内因性のTNFαコンバターゼ活性に基づき得るか、または組換えTNFαコンバターゼで補充され得る。 C．コンバターゼ阻害についての比色アッセイ TNFαコンバターゼ阻害はまた、比色アッセイにより測定し得る。このタイプのアッセイにおいては、比色TNFαコンバターゼ基質を用いてTNFαコンバターゼの実際の活性を直接測定する。「比色TNFαコンバターゼ基質」とは、TNFαコンバターゼにより切断されて特定の波長の光の吸光度の増加を提示する化合物を放出する化合物を意味する。このような基質の１つは、Boc-Ala-ONp(Bachem Biosc ience、Inc.、Philadelphia、PA)である。他の潜在的に有用な基質は、TNFαコンバターゼおよび他のセリンプロテアーゼの構造から予測され得る。本明細書の実施例は精製された天然のPR-3をTNFαコンバターゼとして使用するが、このアッセイにおいて組換えPR-3または他のTNFαコンバターゼも同様に使用され得ることが意図される。 OleksyszynおよびPowers、Biochem 30:485-493(1991)に記載のように、ペプチドジフェニルホスホネートインヒビターを合成し、そして凍結乾燥した固体として保存した。インヒビター溶液(10mg/ml)を、100％のジメチルスルホキシド(DMS O)中で調製し、そして実験の開始時に水性緩衝液中に希釈した。3,4,ジクロロ- イソクマリンをCalBiochemから購入した。精製PR-3(10μl、0.1mg/ml)を、0.1M 塩化ナトリウムを含有する20mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中の種々の濃度のプロテアーゼインヒビターと混合した(400μlの最終容量)。アリコート(40μl )を選択した時間に取り出し、そして0.02M リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、0. 1Mの塩化ナトリウム中の0.5〜１mM Boc-Ala-ONp(100％メタノール中の50mMのストックから新たに調製した)を含有する、コンバターゼについての比色アッセイ中に1/10に希釈した。347nmの吸光度の増加をHewlet tPackard 8450A分光光度計でモニターし、そして5.5×10³M^-1cm^-1の吸光係数を用いて酵素活性の単位を算出した。実施例５ TNFαコンバターゼのペプチドジフェニルホスファターゼインヒビター次のいくつかのペプチドジフェニルホスホネート：Boc-Val-Pro-Val-po(Ph)₂( VPV)、Boc-Ala-Pro-Val-p(OPh)₂(APV)、Boc-Ala-Gln-Ala-p(OPh)₂(AQA)、および Boc-Leu-Ala-Gln-Ala-p(OPh)₂(LAQA)を阻害活性について試験した。このペプチドを上記のMerrifieldの方法を用いて化学合成することにより調製し、およびジフェニルホスホネートをOleksyszynら(前出)に示される同様の方法に従って調製した。ペプチドジフェニルホスホネートを、TNFαコンバターゼ/PR-3活性の阻害について、実施例３において記載した比色アッセイで試験した。結果を図６に示す。 35μMでのVPVおよびAPVは阻害活性を示した。試験した濃度で活性が認められる場合でも、35μMでのAQAおよびLAQAは下限を示した。95μMでのジクロロイソクマリン(DCI)は、アッセイにおいて100％の阻害を示した。実施例６ TNFα変異タンパク質/抗体/コンバターゼ活性のペプチドインヒビター以下の化合物は、コンバターゼ阻害活性を有し、以下のように調製し得る。これらの化合物を上記の実施例４において記載したように、阻害活性について試験し得る。Ａ．抗コンバターゼ抗体コンバターゼに結合して、それゆえコンバターゼの26kDのTNFαへの結合を立体的に阻害するか、またはそうでなければコンバターゼの酵素活性を中和するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を調製する。抗体の生産についての手順は、適切な宿主動物をTNFαコンバターゼを生産するHL60細胞の膜画分で免疫する工程からなる。あるいは、精製されたTNFαコンバターゼを天然供給源または組換え供給源から使用し得る。例えば、ヒト好中球に由来するPR-3は、抗TN Fαコンバターゼ抗体を誘導し得る。免疫応答を誘導するために、十分量の物質を使用するべきであり、そして通常は十分量の物質は１kg体重当たり10pgと10mg との間のからなる。免疫は、アジュバント(例えば、当該分野において公知であるような、例えば、生物学的に受容可能な緩衝液中の不完全フロイントアジュバント)とともに行われ得る。抗体を生成するための方法は、Harlowら、Antibodie s，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbo r，NY(1988)において見出される。最も良い免疫経路は実験的に決定され得、そして一次免疫後に、初回の免疫化に対する免疫応答の強度に依存して、１回以上の二次免疫が行われ得る。血清中の中和抗コンバターゼ抗体の存在は、上記のコンバターゼアッセイを使用して検出され得、ここで抗血清がアッセイ混合物中に存在する。26kD TNFα種の成熟TNFαの分子量を有する種への変換の阻害は、中和抗体が存在することを示す。コントロールを非免疫動物に由来する抗血清が阻害的ではないことを保証するために行う。ポリクローナル抗体は、下記のように精製し得る。コンバターゼに対するモノクローナル抗体をインビボ免疫技術か、またはインビトロ免疫技術のいずれかを用いて精製し得、そしてそれにより得られる感作されたリンパ球を、適切なモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞株を調製するために使用し得る。げっ歯動物、好ましくはマウス起源の抗体またはヒト抗体が、最も好ましい。インビトロでの免疫手順は、マウスまたはヒトのいずれかを免疫することによりコンバターゼに対してリンパ球を感作する工程、および抗体を分泌する細胞画分をそれから単離する工程、ならびにいくつかの手順の１つによりそこの細胞を固定する工程を包含する。別の実施態様は、上記のように敗血症の患者またはウェジナー肉芽腫症の患者由来のコンバターゼにすでに感作されたリンパ球を単離することである。 (ｉ) マウス抗体マウスのインビボでの免疫のために、Nature 256:495(1975)において記載されているKohlerおよびMilsteinの手順に従い得るか、またはFendlyら、Hybridoma 6:359(1987)；Buckら、In Vitro J1:377(1988)において示される手順のように手順を改変し得る。インビトロでの技術は、一般的にLuben，R.およびMohler,M.， Molecular Immunology 17:635(1980)；Reading，Methods in Enzymology 121(第１部): 18、またはVoss，Methods in Enzymology 121:27(1986)により記載されている。マウスを以前にコンバターゼ活性について陽性であることが示された１mg/ml のHL60細胞の膜画分で免疫する。あるいは、少量の精製TNFαコンバターゼを使用し得る。免疫を完全フロイントアジュバントにおいて行う。２回のさらなる免疫、またはブーストをアジュバントを使用しないで月間隔行い、そして最後のブーストから１ヶ月後、マウスに10pgの膜性物質のI.V.ブーストを与える。I.V.ブーストの３日後、マウスを屠殺し、それらの脾臓を取り出し、そして脾細胞を単離し、免疫された薬物選択性のミエローマパートナー細胞株に融合する。多くのこのようなミエローマ細胞株が当該分野において公知であり、これらのほとんどが、HAT補充細胞培養培地において増殖できない。代表的なミエローマ細胞株はS P-2/OAg 14である。したがって、ハイブリドーマは脾細胞とミエローマ細胞とを５：１の比率(一般的に１×10⁷脾細胞に対して、２×10⁶ミエローマ細胞からなる)で混合することにより、形成される。細胞混合物をペレット化し、培地を除去し、1.0mlのポリエチレングリコール1500の40％(v/v)溶液を室温で60秒間にわたって滴下することにより融合を引き起こした後、37℃で60秒間インキュベートした。９mlのDulbeccoの改変イーグル培地を、５分間にわたって細胞懸濁液に穏やかに振とうしながら添加した。混合物中の細胞塊を穏やかに再懸濁し、細胞を洗浄して全ての残余PEGを除去し、そして20％のウシ胎児血清を補充したDMEM中、約２×10⁵細胞/ウェルでマイクロタイタープレートに置く。24時間後、細胞をヒポキサンチンおよびアザセリンの選択培地の２×溶液を与える。陽性細胞の増殖を示すウェルに由来する培地を、コンバターゼに対する中和モノクローナル抗体についてスクリーニングし得る。好ましいアッセイは、上記のコンバターゼアッセイであり、ここで抗コンバターゼ抗体活性について試験しようとする培地がアッセイ中に存在する。３〜８マイクロタイターウェル由来の培養上清を合わせて、混合物をアッセイすることがより好ましい。混合物が陽性である場合、各ウェル由来の培地を独立してアッセイし、分泌するハイブリドーマ (１つまたは複数)を同定し得る。当該分野において多くのアッセイが公知であり、そして可溶性抗原または不溶性抗原を検出し得、そしてLangone,JおよびVan V inakis，H.，Methods in Enzymology，92 Part E(1983)により示される。抗体がポリクローナルであるかまたはモノクローナルであるかにかかわらず、抗体を当該分野で公知の標準的な技術またはSpringer Monoclonal Antibodies 1 94(1980)，(Kennett,T.McKeamおよびK.Bechtol編、Plenum Press，New York)により記載されている標準的な技術により抗体を精製することが望ましい。一般に、これは50％の硫酸アンモニウム溶液を用いる、少なくとも１回の抗体の硫酸アンモニウム沈澱からなる。抗体アフィニティーカラムもまた使用され得る。 (ｉｉ) ヒトモノクローナル抗体末梢血リンパ球を敗血症患者から単離し、次いでエプスタインバールウイルスで感染する。次いで、感染されたリンパ球を選択可能なミエローマ細胞株に融合させることにより固定化し、そしてハイブリッド細胞株が抗体を産生するように生成され、単離され、そして特徴づけされる。より具体的には、単核細胞がFicoll-hypaque(Pharmacia)上で分離され、そして単球がプラスチックに対して接着することにより混合物から減少する。標準的な実験室の技術が、これらの手順を達成するために利用された。次いで、非接着細胞を抗原生産者のために抗原特異的パンニングにより富化する。パンニングは当該分野において一般的に公知の技術であり、そして適切な抗原でコートしたプラスチック表面上での抗体スクリーニング細胞の集団のインキュベーションを包含する。細胞表面上て抗体を発現するそれらの細胞は、抗原を結合し、それゆえプラスチックの表面に接着するが、その一方で細胞表面抗体を発現しない細胞は、接着しないので洗浄により除去され得る。したがって、特異的な抗体分泌細胞はこの技術により富化される。より具体的には、６ウェルプレート(Coster)を、精製TNFαコンバターゼ、あるいは誘導HL60細胞または非誘導HL60細胞のいずれかから調製されるコンバターゼを含有する膜画分で上記のようにコートする。これにより、１ウェル当たり15 0pgの膜物質を、リン酸緩衝化生理食塩水中、40℃で一晩コートする。一晩のインキュベーション期間後、ウェルを１％のウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で、少なくとも１時間40℃でブロックし、続いてリン酸緩衝化生理食塩水/BSAで洗浄する。次に、１mlのPBS-BSA中の10⁷個のリンパ球を６ウェルプレートの各ウェルに添加する。全ての非接着細胞を吸引により除去した後、リンパ球を70分間プレート上でインキュベートする。接着細胞を10％のウシ胎児血清を含有する細胞培養培地(IMDM)(Sigma Chemical Co.,St.Louis，Missouri) を用いてインキュベートする。接着細胞は、エプスタインバールウイルスに感染したキヌザル細胞株B95-8の増殖から得られる培養培地(すなわちウイルスを含む)を接着細胞が漬かっている培地に等量添加することにより、エプスタインバールウイルスの形質転換を受ける。細胞をこの環境で37℃で３時間培養し、そしてこの方法により接着細胞中のリンパ球が、エプスタインバールの感染を受ける。感染期間後、細胞を洗浄し、そして約10⁴〜10⁵細胞/ウェルの密度で、IMDM培地(＋10％ウシ胎児血清)、および30％馴化培地中で96ウェルマイクロタイタープレート上に置いた。後者はリンパ芽球症細胞株、好ましくはW5に由来する。培地はまた、５×10^-5M 2-メルカプトエタノール、50μg/ml硫酸ゲンタマイシン(Sigma)、および600ng/mlシクロスポリンＡ(Sandimmun，Sandoz，Basel，Switzerland)も含む。 14日〜21日間インキュベーションした後、上記のように細胞培養上清を合わせ、TNFαコンバターゼ中和活性についてスクリーニングする。ポジティブなハイブリドーマを低密度で継代培養し、中和抗体について再試験し、そして増殖させ、ポリエチレングリコールを用いて細胞株F3B6に融合させた。プレート融合技術は、Larrick，Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies(1985)，E.G．Engl eman，S.K.H.Foung,J.W.，Larrick,およびA.A．Raubitschek，編集者、Plenum P ress，New York，446頁により記載されている。F3B6はヘテロミエローマ細胞株であり、100μM ヒポキサンチン、５μg/ml アゾセリン、および５μM ウアバインを含有する培地中での増殖に感受性である。最後に、得られるハイブリッドを、それらが中和抗コンバターゼ抗体を産生することを確認するために、再びスクリーニングする。Ｂ．26kD 変異タンパク質 26kD TNFα変異タンパク質は、コンバターゼに対する結合について競争し得ることが記載されており、それゆえその活性を阻害または減少する。好ましい変異タンパク質の実施態様は、１位および/または13位にバリンを有し；または−１位でアラニンをおよび/または12位でプロリンを置換または欠失する変異タンパク質である。変異体は部位特異的突然変異誘発ギャップ化二本鎖(gapped-duplex )方法の改変方法または下記のPCR方法を用いることにより、構築される。以下の溶液/緩衝液は所望の手順を行うために使用される：0.938M KCl、0.063 M Tris、pH7.5からなる５×ギャップ化二本鎖緩衝液(GDB)；1.0M KCl、0.30M Tr is、0.15M MgCl₂、0.02M DTT、pH7.5からなる10×PEL；0.50M Tris、0.10M MgCl₂ 、0.05M DTT、0.001M EDTA、pH8.0からなる10×KB；10mMストックから新しく作成した0.25mM dCTP、dATP、dGTP、dTTPを含有する溶液；60mgのATPを0.80mlのH₂ Oに溶解して0.1M NaOHでpH7.0に調製し、H₂Oで1.0mlの最終容量にすることにより作製した0.1M ATPからなるATP溶液；20％PEG/2.5M NaCl；3.0M NaOAc；および TE飽和フェノール。所望の変異タンパク質を生じるために、種々の細菌株およびファージを用い、これらはファージ株を増殖するためのBMH71-18、JM103である；HB2154：MutL、S uをDNAの形質転換に対してコンピテントであるように作製する；およびHB2151： Suを形質転換の間のローン(lawn)細胞として使用する；M13 GAP(２本鎖DNA)をギャップ化二本鎖形成のために使用する；そしてM13mp 19アンバー(26kD TNFα標的DNA)をこのベクター中にクローニングし、そして１本鎖ssDNAをギャップ化二本鎖の形成のために単離する。ファージを適切な細菌株に感染し、増殖させ、そして以下のように力価を測定する。ssDNAのためのファージまたはdsDNAもしくはRF DNAのための細胞のいずれかの大規模調製物を作製するにおいて同様の感染プロトコルを使用する。プラーク精製したファージを標準的な技術を用いて生成する。簡略に述べると、これは寒天プレート上にファージ上清を画線する工程に続いて、4.0mlの軟寒天および100μlの新鮮なBMH71-18の一晩培養物を注意深く重層する工程からなる。次いで、単離したプラークを拾い、そしてR26またはR17中のBMH71-18＋10mM M gC₂の1:50希釈の新鮮一晩培養物とともに37℃で4.5〜６時間振とうしながらインキュベートする。R17(N-Zアミンブロス)は、水で１リットルにした10gのNZアミンＡ型、５gのNaClからなり、一方R26は、水で11にした８gのトリプトン、５gのイーストイクストラクト、５gのNaClからなる(YTブロス)。ファージスットックの力価を測定し、そしてファージを10の感染多重度(MOI)で細菌に感染する。培養物を37℃で５時間、振とうしながらインキュベートした後、細胞懸濁物をペレット化し、そして上清をssDNA単離物のためにとっておき、そして細胞をRF単離物のためにとっておく。RF DNAを、確立されているプラスミドDNA単離技術を用いて単離し、一方ssDNAを以下のようにして単離する。 250mlのファージ上清を10,000×gで30分間遠心分離する。その後、200mlの上清をデカントし、続いて50mlの20％PEG/2.5M NaClを上清液に添加し、そして一晩４℃でインキュベートするかまたは氷上に30分間置く。この混合物を上記のように遠心分離して上清をデカントして棄てる。ボトルを再びスピンしてファージ沈殿物をボトルの側面側にペレット化して残りの液をパスツールピペットで吸引する。ペレットを5.0mlの１×TEに再懸濁して、４℃で保存する。その後、この内の0.5mlを0.5mlのTE飽和フェノールで２回抽出する。水層に、0.050mlの3.0M NaOAcおよび1.0mlの95％エタノールを添加する。混合物をドライアイス浴に10分間置き、そしてマイクロ遠心器において４℃で10分間遠心分離する。ペレットを乾燥し、そして200μlの１×TE中に再懸濁する。この物質は、26kD TNFαの変異誘発に使用するまで、0.05mlのアリコート中、-20℃で保存し得る。以下の表１における欠失および置換は、好ましいproTNFα変異タンパク質である。これらの変異タンパク質は、当該分野において公知の方法により適切なオリゴヌクレオチドを用いて調製し得る。オリゴヌクレオチドを以下の反応溶液および条件を用いてリン酸化する(kinas e)：３μlの10×KB緩衝液、３μlの10mM ATP(１：10希釈の0.1M ATPストック)、２μlの変異誘発オリゴヌクレオチド(100ピコモル/μl)、21μlのH₂O、および１ μlのポリヌクレオチドキナーゼ(10単位/μl)。反応を37℃で45分間、次いで65 ℃〜68℃で５分間行う。次に、24μlのリン酸化されたオリゴヌクレオチドを56 μlのH₂Oで希釈して、２ピコモル/μlにする。ギャップ化二本鎖を下記のように形成し、続いてオリゴヌクレオチドをアニールする。以下の試薬を全容量40μl中で合わせる：８μlの５×GDB緩衝液、0.5ピコモルのssDNA、および0.10ピコモルのHindIIで鎖状化したM13 GAP RF DNA。10 μをさらなる使用のために取り出し、そして残りの30μlを続いて以下のように処理する：100℃で30分間おき、60℃で５分間おき、続いて30分間で室温まで冷却し、次いで反応混合物を氷上におく。次に、10μlのギャップ化二本鎖および1 0μlのコントロールのギャップされていない物質をアガロースゲル上で電気泳動してギャップ化二本鎖の形成を確認する。ゲルが第３のバンドを示す場合は、ギャップ化二本鎖が形成されており、そしてリン酸化されたオリゴヌクレオチドは、16μlのギャップ化二本鎖反応混合物および４μlの希釈されたリン酸化オリゴヌクレオチドを合わせることにより、二本鎖にアニールリングし得る。次いで混合物を65℃で３分間加熱し、続いて、20分間で室温まで冷却する。ヘテロ二本鎖を、適切な伸長、および全容量40μl中に以下の試薬を合わせる工程からなる連結反応により完結する：10μlのギャップ化二本鎖およびプライマー、４μlの10×PEL緩衝液、４μlのdNTP(10mMストックから作製される0.25mM 溶液、３μlのATP(10μlの0.1MATPストック＋1490μlのH₂O＝0.662mM)、17μlの H₂O、１μlのKlenow(５U/μl)、および１μlのT4 DNAリガーゼ(0.6Weiss U/μl 、１×PELによる希釈ストック)。反応を16℃で２時間行い、続いて10μlの伸長/ 連結混合液を200μlの溶解したコンピテントHB2151細胞に形質転換する。細胞を氷上に30分間、次いで42℃で1.5分間おき、続いて種々の容量(例えば、50μl、1 0μlなど)の形質転換混合物をHB2151細胞の新鮮な一晩培養物＋3.0mlの軟寒天を用いてプレートする。得られるプラークをプラークハイブリダーゼーション手順を用いてスクリーニングする。このような種々の手順が公知であるが、好ましい手順を以下に記載する。プレートを複製用ニトロセルロースフィルター紙(S & S BA85型)にレプリケートし、そして0.5N NaOH＋1.5M NaCl；1.0M NaCl＋0.5M Tris-HCl pH7.4；および２×SSC(標準クエン酸生理食塩水)で連続５分間処置することにより、フィルターにDNAを固定する。フィルターを空気乾燥し、そして真空中、80℃で２時間、処置する。二重に複製した(duplicate)フィルターを55℃で２時間、フィルター当たり10m lのDNAハイブリダイゼーション緩衝液(５×SSC、pH7.0、５×デンハルト溶液(ポリビニルピロリドン、＋フィコールおよびウシ血清アルブミン；各0.1％)、50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、５mM EDTA、0.1％SDS、および100pg/ml酵母RN A)を用いてプレハイブリダイゼーションする。プレハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、そしてサンプルを適切にリン酸化したプローブ(具体的には上記のリン酸化プローブ)と、所望のストリンジェンシーに依存する条件下でハイブリダイズさせる。全部で約２×10⁶cpm/mlを使用する。代表的に適度なストリンジェント条件では、プローブを含有する１〜５ml/フィルターのDNAハイブリダイゼーション緩衝液で、24〜36時間、42℃の温度＋50％ホルムアミドを用いる。より高いストリンジェンシーの場合は、高温およびより短い時間を用いる。好ましいハイブリダイゼーション条件は、５×SSC、デンハルト溶液、50mM NaPO₄(pH7.0) 、5mM EDTA、0.1％SDS、および100mg/ml酵母RNA中、スクリーニングにおいて使用したオリゴヌクレオチドの融点(Tm)より10℃低い温度で、プローブをフィルターにハイブリダイズさせる工程からなる。次いで、フィルターを、各洗浄30分間、２×SSC、0.1％SDSを用いて室温で２回洗浄し、次いで、スクリーニングするために使用したオリゴヌクレオチドのTmより５℃低い温度で２×SSC、0.1％SDS を用いて１回洗浄し、そして空気乾燥させる。最後に、フィルターを、-70℃で3 6時間オートラジオグラフィーする。オートラジオグラフィーは、目的の変異タンパク質を有するウイルスを含有するプラークを示す。変異タンパク質の構築(ここで、１位および/または13位のバリンが欠失または置換されている)に加えて、26kD TNFαの２つの主要な切断部位を含む大きな欠失変異タンパク質が生産され得る。このような変異タンパク質の１つは、図１に示すように、領域-９〜+14にかかるアミノ酸を欠く。この変異タンパク質は上記の材料および方法、ならびに以下の配列であり配列番号18として記載されるオリゴヌクレオチドCP375を用いて構築した。Ｃ．タンパク質/ペプチドインヒビター配列番号５、６、７、および８において記載されるアミノ酸配列を有するペプチドを固相法(Merrifield Science 232:341-347(1985)において詳細に記載されている)により合成する。フッ化水素切断、および15〜20mmのVydac C4 PrepPAK カラム上、WatersDelta Prep 3000器を用いる予備HPLCによる精製を伴うBiosear ch95000自動ペプチド合成機を使用する。これらのペプチドのTNFαコンバターゼ阻害活性は、種々の容量のそれぞれのペプチドの存在下で上記の任意の種々のアッセイのいずれかを行うことにより示される。反応混合物のゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングは、26kD p roTNFαから17kD成熟型への変換の阻害を示す。別の例として、Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Serを上記のように合成し、PR- 3を用いてBoc-Ala-ONp比色アッセイで試験した。しかし、このペプチドは、50μ Mでもコンバターゼ活性を有意に阻害しなかった。実施例７ L929マウスにおけるDCIのTNFαコンバターゼ阻害活性以下のように、3,4ジクロロイソクマリン(DCI)は、特異的にTNFαの放出を抑制するが、マウスマクロファージからのIL-6の放出を抑制しない。 LPSで刺激後のマクロファージによるTNFαの放出は、宿主におけるTNFαの主要な供給源である。これらの研究において腹膜マクロファージを接着により精製し、24ウェルプレート内で培養し、そしてLPSを添加してTNFαの分泌を誘導した。TNFα放出の動態の解析は、３時間で最大ピークを示した。次いで、DCIをジメチルスルホキシドのビヒクル中、培養物に添加した。コントロール培養物は等濃度で添加されたDMSOのみを有した。上清を採取し、そしてTNFαおよびIL-6についてアッセイした。結果は、TNFα分泌はDCIで顕著に抑制されるが、コントロールはビヒクルで抑制されないことを示す。対照的にIL-6の応答は顕著に変化せずしたがって非特異的毒性効果は除外された(表２を参照)。接着腹膜マクロファージ(10⁶/ml)を、LPSならびにDMSOまたはDCI DMSOのいずれかを用いて培養した。細胞を３時間培養し、そして上清を採取した。TNFαをELI SAにより測定し、そしてIL-6をB9バイオアッセイにより測定した。 DCIは、マウスマクロファージにおいて、LPSで誘導されるTNFα分泌を特異的に抑制し得るので、LPSを注射されたマウスへのDCI投与の治療効果を試験した。安定性の研究および処方の研究は、DCIがコーンオイル中に溶解された場合、安定であり、そしてセリンプロテアーゼ活性を保持したことを示した。DCI/オイルのマウスへの注射は、１mg/mlの用量でLD50％を示した。これは、投与され得るDCIの最大耐性用量を示した。致死用量のLPSを注射されたマウスにおけるTNFαおよびIL-6の誘導の動態を研究した。TNFαは、２時間で鋭いピークを示し、数時間でベースラインに戻った。IL-6は、よりゆっくりとした緩やかな増加を示した。LPSを投与の１時間前にD CIを注射すると、血清TNFαの分泌を顕著に阻害した(図９を参照のこと)。また、測定したTNFαは６時間の時点まで遅れて増加した。これはELISAにより測定された免疫反応性マウスTNFαおよびL929細胞の溶解により測定された生物活性なT NFαでも同様であった。IL-6レベルはこの治療法により減少しなかった。 24時間までに動物の100％致死を生じる用量のLPSを注射したマウスの生存率に対するDCIの効果もまた、研究した。結果は、DCIを用いる予防治療がマウスの生存期間を延長し得ることを示す(図10を参照のこと)。0.75mgのDCIが0.5mgのDCI よりも効果的であることから、用量応答関係が認められた。要約すると、これらの研究は、DCIがインビトロでマウスマクロファージによりLPSで誘導されるTNFα産生を阻害し得ることを示唆している。このTNFαの阻害の特異性はまた、致死用量のLPSを注射した動物においても見られ得た。さらに、用量関連性の方法におけるDCI治療で動物の生存期間が延長した。これらの研究はDCI(セリンプロテアーゼインヒビター)が、TNFαの全身性放出を抑制することにより生存期間を延長する点で敗血症モデルに有益であり得ることを示唆する。実施例８敗血症性ショックの処置におけるTNFαコンバターゼインヒビターの防御効果コンバターゼ活性の効果的なインヒビターである化合物が、以下のようにヒヒモデル系において敗血症を防止することを示す。動物を致死用量のE.coliでチャレンジする60分前に単回のI.V.ボーラスで、抗TNFαコンバターゼ抗体(マウス、ヒト、または組換え体)を５mg/kgの濃度で投与し、ならびにE.coliのチャレンジと同時に２mg/kgの抗TNFαコンバターゼ抗体を投与する。抗体を生理学的に平衡化した塩溶液中で投与し、そして約４×10¹⁰個のE.coli菌体を使用する。E.coli の用量を２時間の期間にわたって注入する。抗体を投与された動物は、少なくとも７日間防御されるが、一方平衡化塩溶液のみを投与された動物は約16時間〜32 時間以内に死亡する。同様の防御も、実施例６に示すコンバターゼインヒビターとして作用するTNF α変異タンパク質が原因であると考えられ得る。動物を４×10¹⁰個のE.coli菌体でチャレンジする60分前に単回のI.V.ボーラスで、変異タンパク質を５mg/kgの濃度で投与する。ヒヒはまた、E.coliのチャレンジと同時に２mg/kgの変異タンパク質を投与される。最後に、ペプチド(例えば、配列番号５に記載されるペプチド)を上記のように試験し、そして同様の防御効果を生じることが予想される。ヒヒ系は特に、TNFαコンバターゼでのスクリーニングにおいて同定される低分子量の経口的に活性なインヒビターを試験するために有用である。ヒヒ系は前臨床の結果の確認として好ましい動物モデルである。なぜならproTNFαが、推定の切断でヒトproTNFαに極めて類似している唯一の26kD proTNFαであるからである。実施例９ヒトエラスターゼ３次元構造におけるヒトPR-3のモデリングおよび新規PR-3インヒビターを予測するためのインヒビター−酵素複合体モデルの使用 TNFαコンバターゼであるPR-3のモデルを、PR-3と他のセリンプロテイナーゼとの間で有する構造的類似性を決定することにより構築した。酵素の3-Dモデルを、PR-3配列がヒト好中球エラスターゼ(HNE)との高度の配列相同性を有することをまず決定することにより生成した。HNEの３次元構造(Naviaら、PNAS(USA)86 :7(1989))を、コンピュータプログラムHomology(Biosym、San Diego)を用いてPR -3タンパク質の３次元表示を組み立てるための足場として用いた。このモデルを、コンピュータプログラムDiscover(Biosym、San Diego)を用いて２回の最小化によりさらに厳密化した。PR-3に特異的な可能なインヒビターの設計は、これらの酵素の活性部位にまたはその近くに見られる独特かつ類似のアミノ酸により決定される。最も明確には、このクラスのプロテイナーゼに共通の触媒の３部分が空間的に保存される。P1残基(S1部位)の結合ポケット内で、アミノ酸側鎖のいくつかの顕著な差が、このモデルにより提案される。以下に記載の本発明の目的の化合物は、PR-3モデルのS1ポケット内で見られる独特のアスパラギン酸およびイソロイシンのアミノ酸を考慮し、そして以下の一般式により示され得る：ここで R1、R2は、低級アルキル、任意に置換されたアル(低級)アルキル(ar(lower)al kyl)、シクロ(低級)アルキル(低級)アルキルまたは任意に置換されたヘテロ環状 (低級)アルキル、天然アミノ酸、-OH、-NH₂、低級アルキルイミノまたは低級アルキレンであり； R³は、ピロイル、イミダゾイル、ブチルアミン、またはエチル-エポキシドであり；そして R⁴は、アルデヒド、ジホスホニレート、エトキシクマリニル、クロロメチルおよびジフルオロメチルケトニルである。このモデルに基づくPR-3インヒビターの例は、Boc-Val-Pro-His-p(OPh)₂である。このような化合物によるPR-3活性の阻害は、エラスターゼとPR-3とが選択的に結合してヒスチジンとは全く異なる残基、すなわち、アラニンのような短い脂肪族側鎖を有する残基の後で切断するという一般的に受け入れられている考えを考慮すると、予想されない。実施例１０ pAcC13preproPR-3の構築プラスミドpAcC13preproPR-3を、Sf9昆虫細胞からproPR-3分泌するために構築した。このプラスミドは、バキュロウイルスポリヘドロンプロモーターの制御下に、天然のPR-3リーダー、プロ配列、およびPro229コドンの後で終わる全長成熟ヒトPR-3遺伝子コード配列を有する(配列番号22を参照のこと)。天然のリーダー (プレ)およびプロ配列を含むPR-3遺伝子の5'末端は、PCR変異誘発を介して、プラスミドpGEMpreproPR-3-19から誘導した。PR-3遺伝子の3'末端は、中間のプラスミドpGEM-metPR-3、pCDNA1-metPR-3、およびpBS-metPR-3を介して、プラスミドpGEMpreproPR-3-17(MY17として実施例２に記載されている)から誘導した。プラスミドpGEMpreproPR-3-17およびpGEMpreproPR-3-19を、実施例２に記載のようにcDNAライブラリーから単離した。RNAを当業者に周知の方法によりHL60細胞から精製し、そしてcDNAライブラリーをプラスミドpGEM(PROMEGA、Madison、W isconsin)中に構築した。このcDNAライブラリーの構築は、cDNAのＣテーリングおよびベクターのＧテーリングを用い、次いで連結した(Gene Transfer and Exp ression、1990、114-135頁)。クローンを、ミエロブラスチンの公表された配列中のBoriesら、Cell 59:959-968(1989)に記載の独特のオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーンニングした。pGEMpreproPR-3-17およびpGEMpreproPR-3- 19を有するクローンはこのプローブにハイブリダイズした。プラスミドpGEMprep roPR-3-17(MY17)は、８bpの非翻訳配列5'のPR-3リーダー開始コドンを有し；プラスミドpGEMpreproPR-3-19(MY19)は、56bpの非翻訳配列5'のPR-3リーダー開始コドンを有する。実施例２に概説するように、プラスミドpGEM-metPR-3を、OlsenおよびEckstei n(PNAS 87:1451-1455)に記載されたオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発法を用いてpGEMpreproPR-3-17から誘導した。オリゴヌクレオチドDA403(リーダーを欠失し、そして成熟タンパク質の１位のイソロイシンの前にATGを付加した)およびDA385(クローニングの目的でPR-3遺伝子の3'にEcoRI部位を付加した)を、変異誘発に用いた。これらのプライマーの配列は以下のとおりである：ここでx＝5'リン酸基。この改変遺伝子を、EcoRI消化によりpGEMmetPR-3から除去し、そしてpCDNA1のEc oRI部位にクローニングしてpCDNA1-metPR-3を生成した。プラスミドpBSmetPR-3 をpcDNA1metPR-3から誘導した。metPR-3遺伝子を含む約830bp XbaI-EcoRIフラグメントを、New England Biolabs(Beverly、MA)のXbaIおよびEcoRIでpcDNA1metPR -3から切り出し、そしてpBSIIKS+(Stratagene、La Jolla、CA)のXbaIおよびEcoR I部位に挿入した。得られたプラスミドを、pBSmetPR-3と命名し、そしてpAcC13p reproPR-3でのPR-3配列の3'末端のソースとして用いた。 pAcC13preproPR-3を、pGEMpreproPR-3-19をテンプレートとして用いるPCR変異誘発により構築した。PR-3遺伝子の5'部分をpGEMpreproPR-3-19から増幅し、次いでpBSmetPR-3の5'末端に置換した。予測されたPCR産物を天然のPR-3リーダー配列(アミノ酸-27〜-3)、天然のプロ配列(アミノ酸-1および-2)のコード配列、ならびにPR-3から内部SmaI部位までのコード配列を含むように設計した。さらに、XbaI部位をクローニングの目的で天然のPR-3リーダー(プレ)配列の5'に導入した。オリゴヌクレオチドTS06を上流プライマー：5'-TTTTCTAGATCTAAGCTTATAAATG GCTCACCGGCCC-3'(配列番号11)として用い；そしてオリゴヌクレオチドDA491を下流プライマー：5'-CTGCCCGGGTTCCCCGCATCTGCAGGGAGGCCATGTAGGGCCGGGAGTGTGGCTG CGCCTCGTGCCCGCCCACGATCTCCGC-3'(配列番号12)として用いた。 PCR増幅を、95℃の変性温度まで１分で上げて、95℃で30秒間変性させ；55℃のアニール温度まで２分30秒で下げて、55℃で30秒間アニールし；72℃の伸長温度まで１分で上げて、72℃で１分30秒間伸長させることを35サイクル行った。最終伸長を72℃で10分間行った。PCRの詳細は、Mullis，K.ら、米国特許第4,683,202 号；Ehrlich，H.、米国特許第4,582,788号およびSaikiら、米国特許第4,683,195 号により提供される。Mullis，K.B．Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．5 1:263-273(1986)。PCR産物をXbaIおよびSmaI部位で切断し、そして得られた153b pフラグメントをベクターpBS-metPR-3のXbaIおよびSmaI部位に連結した。ベクターpBS-metPR-3をXbaIおよびSmaIで切断し、次いで仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ(NEB、Beverly、MA)を用いて50℃で１時間処理し、次いでホスファターゼを５mM Na EDTA、pH8.0で75℃にて10分間不活性化した。挿入物およびベクターの両方を、BIO 101のGENECLEAN^TMキット(La Jolla、CA)を用いて精製した。連結混合物を、E．coli DH5α株(GIBCO、BRL、Gaithersberg、MD)に形質転換した。プラスミドpBSpreproPR-3(pTS12-22)を、Qiagen Midiprepカラム(Qiagen、Chats worth、CA)を用いてアンピシリン耐性形質転換体から単離した。このプラスミド中の１つの153bp挿入物の存在が制限分析により示され、配列決定により確認された。配列を確認した後、約850bpのBglII-EcoRIフラグメント(これはプレおよびプロ配列を含む全長PR-3コード配列を有する)を、pBSpreproPR-3から切断し、そしてpAcC13(pVL941に由来、Max Summers、Texas A&M、Munemitsuら、Mol．Cel l Biol．10:5977-5982[1988])のBglIIおよびEcoRI部位に連結して、pAcC13prepr oPR-3(pTS1-8-10)を生成した。実施例１１ TAF-166-7およびpAcC13preproPR-3 C_Δ221の構築成熟PR-3配列のアミノ酸221で終わるPR-3タンパク質をコードするDNAを、プラスミドTAF166-7(pAcC13 cecropin leader PR-3 C_Δ221)中に構築して昆虫細胞由来の短縮型組換えPR-3をこの形態での分泌を可能にした。PCRプライマー部位特異的変異誘発を用いて、PR-3の８つのＣ末端アミノ酸のcDNAコード配列を、プラスミドpAcC13:Myo(実施例２を参照のこと)から欠失させ、そしてTGA終止コドンをarg221コドンの後に付加した。 PR-3のコード配列を、SalIおよびEcoRVでの切断により、上記のプラスミドpBS metPR-3から切り出した。PR-3をコードする750bpフラグメントをゲル電気泳動により分離し、そして-20℃で20分間ゲルスライスを凍結させることによりこのフラグメントを回収し、次いでSpin-X^TMカラム(Costar、Cambridge MA)を用いてアガロースを除去した。このフラグメントをPCR用のテンプレートとして用いた。 PR-3遺伝子の3'部分を、プライマーLF69およびLF71を用いてPCR反応で、750bp フラグメントから増幅した。プライマーの配列は以下のとおりである：予想されるPCR産物を、内部SstI部位からarg221のコドンまでのPR-3コード配列を含むように設計し、コード配列中のarg221の直後にTGA終止コドン、次いでクローニング用にSstIを含む制限部位を付加した。この産物を、100μl容量中に約25ngのテンプレートDNA、50pmol LF69、50pmol LF71、37.5μM dNTP、５％グリセロール、１×Perkin-Elmer Cetus PCR Buffer、および2.5単位のPerkin-Elm で１秒で上げて、95℃で１分間変性させ；68℃のアニール温度まで１秒で下げて、68℃で１分間アニールし；72℃の伸長温度まで30秒で上げて、72℃で１分30秒間伸長させることを25サイクル行った。最終伸長を72℃で10分間行った。２つの反応物をプールし、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱し、そしてDNAをSstI(Bethesda Research Laboratories、Gaithersburg MD)で切断した。約244bpの切断したPCR産物をQiaexビーズ(Qiagen、Chatsworth CA)を用いてゲル精製し、そしてベクターpAcC13:Myo(セクロピンリーダーPR-3)中に含まれるPR-3遺伝子の5'末端に連結した。ベクターDNAを、SstIでpAC13:Myo(実施例２を参照のこと)を切断することにより調製し、仔ウシ小腸アルカリホスファターゼで56℃にて１時間処理した。pAcC 13配列、セクロピンリーダー配列、およびPR-3配列の5'末端を有する9.5kbフラグメントをゲル精製し、電気溶出し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱し、そして蒸留水で再懸濁した。SstI切断したPCR産物をこのベクターに連結した。連結物をDH5αコンピテント細胞(Bethesda Research Labo ratories、Gaithersburg MD)中に形質転換した。プラスミドTAF166-7を、この連結物から得たアンピシリン耐性形質転換体から単離し、そしてこれが、制限分析およびDNA配列決定により、調製したベクター［すなわち、天然のPR-3配列の後にセクロピンリーダーを有するpAcC13(ile-val-gly...からアミノ酸arg221次いでTGA終止コドン)］中に予想されるPCR産物の１つの挿入物が期待される配列を有することを示した。プラスミドpAcC13preproPR-3 C_Δ221を、pAcC13セクロピンリーダー構築物である上記のTAF166-7(pAcC13 cecropin leaderPR-3C_Δ221)の5'部分をKpnIおよび NcoIで切り出し、そしてそれをpAcC13preproPR-3(pTS1-8-18)の5'部分由来の対応するKpnI-NcoIフラグメントで置換することにより構築した。これにより、全長PR-3のプレおよびプロ配列次いでアミノ酸arg221で終止するPR-3の成熟Ｎ末端配列をコードするプラスミドを得る。実施例１２ pAcC13FLAの構築プラスミドpAcC13FLAを、Sf9昆虫細胞由来のPR-3変異タンパク質PR-3 V213A I 216A L220Aを分泌するように構築した。このプラスミドは、天然のPR-3リーダーおよびプロ配列ならびにPro229コドンの後で終止する全長PR-3遺伝子を３つの疎水性残基のコドンとともに含み、この残基はalaコドンに変異した両親媒性ヘリックスの疎水性面を含み得る。プラスミドpAcC13FLAを、PCR変異誘発およびプラスミドpAcC13preproPR-3(実施例１０を参照のこと)内のPR-3遺伝子全体の置換を用いて構築した。ベクターDNAを、BglIIおよびEcoRIを用いてプラスミドpAcC13preproPR-3を切断し、そして仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim、Indian apolis、IN)を用いて37℃にて２時間処理することにより調製した。pAcC13ベクター配列［RAF104］を有する9.2kbフラグメントを、Qiaexビーズ(Qiagen、Chats worth CA)を用いてゲル精製した。 PR-3遺伝子をオリゴヌクレオチドプライマーLF96およびLF97を用いてpAcC13pr eproPR-3から増幅した。これらのプライマーの配列は以下のとおりである：予想されるPCR産物を、Pro229の後で終止する全体のPR-3コード配列を含むように設計し、これは天然のPR-3リーダーおよびプロ配列を、alaコドンに変異したコドンVal213、Ile216、およびLeu220とともに含んでいた。予想されるPCR産物はまた、クローニング用に、リーダー配列の5'にBglII部位およびTGA終止コドンの3'にEcoRI部位を含む。この産物を、合計100μl中に約200ngのテンプレート DNA、50pmol LF96、50pmol LF97、27.5μM dNTP、５％グリセロール、１×Perki Aポリメラーゼを含む、４つの別のPCR反応物(PCR TNFα68-71)中で増幅した。Am に25サイクル行った。４つの反応物をプールし、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱し、そしてDNAをEcoRIおよびBglIIで切断した。約8 50bpの切断したPCR産物を、Qiaexビーズ(Qiagen、Chatsworth CA)［RAF105］を用いてゲル精製し、約3:1のベクター比になるような挿入物でEcoRI-BglII pAcC1 3ベクターに連結した。この連結物をDH5αコンピテント細胞(Bethesda Research Laboratories、Gaithersburg、MD)中に形質転換した。プラスミドpAcA13FLAを、この連結物から得たアンピシリン耐性形質転換体から単離し、そしてこれが、制限分析およびDNA配列決定により、調製したベクター(すなわち、PR-3リーダーおよびプロ配列を含み、そしてコドンPro229の後で終止するが、変異V213A、121 6A、L220Aを含む天然のPR-3遺伝子を有するpAcC13)中に予想されるPCR産物の１つの挿入物が期待される配列を有することを示した。実施例１３ preproPR-3 N102Q N147Qの構築両親媒性ヘリックスPR-3変異タンパク質および炭水化物PR-3変異タンパク質( Ｎ結合グリコシル化がない)を提供して産物の不均一性を減少するために、以下のプラスミドを構築する。プラスミドpAcC13preproPR-3 C_Δ221(前出)を、上記の方法の変法を用いる部位特異的変異誘発により改変する。詳細には、アスパラギン102および104のコドンが成熟PR-3配列中でのこれらの位置でグルタミンをコードするように改変される。次いで、この構築物が、上記のようなSf9細胞中で、または発現を可能にする他の細胞培養系で発現される。次いで、分泌されたタンパク質は精製され、活性化され、そして以下の実施例に記載されるように結晶学的グレードのPR-3に、記載のように処方される。実施例１４ Sf9細胞におけるproPR-3の発現種々のpAcC13に基づくPR-3発現プラスミド(Munemitsuら、Mol．Cell Biol．10 :5977-5982[1988])を、２μgのトランスファーベクターと0.5μgの直線化した野生型のウイルスDNAとを記載されている(Kittsら、Nucleic Acids Res．18:5667- 5672)ようにSf9細胞中に同時トランスフェクトすることにより、Autographa cal iforniciaバキュロウイルス(AcNPV)中に組み換えた。組換えバキュロウイルスをプラーク精製により単離した(Smithら、Mol．Cell Biol．3:2156-2165)。１ml 当たり1.5×10⁶Sf9細胞の懸濁培養物を、無血清培地中で２〜10の感染多重度で関連のバキュロウイルスで感染した48〜72時間後に、タンパク質の精製および分析のために採取した(Maiorellaら、BioTechnology 6:1406-1510)。実施例１５組換えproPR-3の調製組換えproPR-3を、実施例１０に記載のヒトpreproPR-3クローンを含むpAcC13p reproPR-3構築物を用いて、実施例１４に記載のように調製されたバキュロウイルスで感染した1.4リットルの昆虫Sf9細胞培養物(Maiorellaら、Bio/Technology 6:1406[1988]に記載されているように無血清培地を含む４×350ml培養物)中で生成した。30℃にて72時間後、培養物を採取し、そして上清を3000×gで10分間遠心分離した後保持した。上清液を0.8ミクロンフィルターを通して濾過し、そしてフロースルー物質をAmicon YM-10スパイラルカートリッジを用いて350mlまで濃縮し、ローディング緩衝液Ａ(0.5mM EDTAおよび10％グリセロールを含む10m Mリン酸ナトリウム、pH7.0)に対して透析した。proPR-3をMono-S-Sepharoseカラム(2.6×15cm)にかけ、ローディング緩衝液で洗浄し、そしてローディング緩衝液中０〜0.8Ｍの塩化ナトリウムグラジエント400mlで溶出した。 proPR-3タンパク質を含む画分を、実施例４に記載のように、ジペプチダーゼ- I(DPPI)を用いてproPR-3を活性化し、次いでPR-3基質であるBoc-Ala-ONpの添加後にPR-3活性を比色分析で測定することにより同定した。25μlの各S-Sepharose 画分を、75μlの50mMリン酸ナトリウム、pH6.5に加え、次いで0.56μl(0.011単位)のウシDPPI(Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN)を加えた。37℃で30分後、10％アセトニトリルおよび0.5mM Boc-Ala-ONpを含む300μlの100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5を加えた。サンプルを室温で10〜30分間放置し、産物の形成を402nmの吸光度により分光光度的に測定した。このDPPI活性化アッセイを用いて測定したようなproPR-3の豊富な画分をプールし、そしてYM-10膜で限外濾過して280nmで1.9単位の最終吸光度になるまで濃縮した。実施例１６活性組換えPR-3の調製プールしたproPR-3から調製規模で活性PR-3を得るために、小規模の活性化実験を、プールしたproPR-3の一部で行って、定量的にproPR-3を活性化するために必要とされる最適なDPPI量を決定した。10μlの濃縮したMono-S-Sepharose精製p roPR-3を含む５つの各反応物に、1.5μlの746μMクエン酸ナトリウム、pH4.0を加えた。DPPIの希釈物を100mMクエン酸ナトリウム緩衝液、pH4.0中で調製し、そしてproPR-3反応物に加えて、プールしたproPR-3/DPPI(wt/wt)の最終濃度を20％、10％、５％、2.5％、および0.6％にした。３時間後、活性化したPR-3の生物反応性を、５μlの各反応物を10％アセトニトリルおよび0.5mM Boc-Ala-ONpを含む 100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5の400μlの溶液に移すことにより測定した。約10分後、各サンプルの402nmでの吸光度を測定した。これらのデータに基づき、調製規模の活性化のために添加すべきDPPIの有効量を決定した。DPPIはproP R-3のＮ末端を過剰に切断しないようなので、DPPIの有効量を、割り当てられたインキュベーション時間内で100％活性化を得る最低濃度にするように選択した。proPR-3調製物中の総タンパク質に対して約２％(w/w)DPPIの比が、一般的に有効量であり、これは使用されるproPR-3調製物に依存する。次いで、調製規模の活性化反応物をproPR-3のMono-S-Sepharoseプール全体を用いて調製した。クエン酸ナトリウム、pH4.0を、プールしたproPR-3画分に添加して、最終濃度を100mMにし、次いで有効量のDPPIを添加した。37℃で３時間後、活性化proPR-3を、予め0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)で平衡化したVydac C4カラム(25×0.46cm)にかけた。PR-3を、TFA中０〜60％アセトニトリルの45分の直線グラジエントで溶出した。PR-3は、クロマトグラフでタンパク質の単一ピークとして遅れて溶出された。逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)画分を、2 0μlの各画分を10％アセトニトリルおよび0.5mM Boc-Ala-ONpを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5の380μl中に希釈することによりアッセイした。約10 分後、アッセイサンプルの402nmでの吸光度を測定した。比色アッセイで測定した活性のピークは、PR-3タンパク質の遅延溶出ピークに対応した。精製PR-3のＮ末端配列分析は、85％を超えるPR-3が成熟PR-3と予想されるＮ末端配列を有することを示した。実施例１７活性組換えPR-3の代替調製 RP-HPLCの酸性条件を使用しない代替方法を、活性PR-3の精製のために開発した。proPR-3を、Mono-S-Sepharose工程およびDPPI活性化を通して上記のように精製した。活性化反応の最後に、PR-3を脱イオン化水を用いて３倍に希釈し、そして予めローディング緩衝液Ｂ(0.1％(v/v)Triton X-100を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0)で平衡化したPharmacia Mono-Sカラムにかけた。３ベッド容量のローディング緩衝液Ｂでカラムを洗浄した後、カラムを０〜0.8M塩化ナトリウムグラジエントで１ml/分の流速にて20分で溶出した。PR-3は、グラジエントでタンパク質の唯一の主要ピークとして溶出された。PR-3活性を、10μlの各画分を10％アセトニトリルおよび0.5mM Boc-Ala-ONpを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液中に希釈することにより、カラムにわたって測定した。約10分後、各アッセイサンプルの402nmでの吸光度を測定した。活性化PR-3を含む画分をプールし、そして４℃で保存した。精製PR-3のSDS-PAGE分析は、80％を超える純度であることを示した。活性PR-3はこれらの条件下で４℃にて１カ月以上安定であった。実施例18 rPR-3の大量精製および活性化天然PR-3のインヒビターのスクリーニングに使用するためまたは変異タンパク質を設計するための活性な組換えPR-3をより大量に産生するために、以下の方法を開発した。実施例10に記載の組換えpreproPR-3を含むウイルスで感染させたSf 9昆虫細胞由来の48時間無血清馴化培地６リットルを使用してPR-3を産生した。これらの細胞は、培地１リットルあたり約１〜約２mgのproPR-3を分泌した。この馴化培地を実施例15に記載のように遠心分離し、次いでSIY10 Spiral Ultrafi ltration Cartridge(Amicon，MA)を使用して20倍に濃縮し、Triton X-100中に0. 1％とし、そして１mM EDTAおよび0.1％ Triton X-100を含有する10mM NaPO₄(pH6 .5)中に４℃にて透析した。透析保持物質(retentate)を透析緩衝液中で平衡化したS-セファロースカラム(2.6×20cm，Pharmacia Biotechnology，Inc.，NJ)にロードし、洗浄し、そして同じ緩衝液における600mlの０〜１M NaClの勾配で溶出した。proPR-3富化画分を、以下の改変以外は実施例４、15、および16に記載のように活性化した後、酵素活性により検出した：96ウェルプレート形式で、0.1 ％ Triton X-100含有PBSで0.66mg/mlまで希釈した５μlのDPPIを各画分100μlに添加し、37℃にて0.5時間インキュベートし、５％DMSOを含有する100mM NaPO₄(p H7.0)中の0.8mM Boc-Ala-ONpで最終容量を200μlとし、そして405nmの吸光度をプレートリーダーでモニターした。proPR-3の富化画分をプールし、Amicon YM10 限外濾過により10倍に濃縮し、そして４℃にて貯蔵した。濃縮物のタンパク質濃度を、BCA Protein Assay Reagent(Pierce Chemical Co.,Rockford，IL)を使用して精製ウシ血清アルブミンのスタンダードと比較することにより、３mg/mlと決定した。この工程でのproPR-3の収率は、10倍精製で約50〜約60％であった。 proPR-3を完全に活性化するために必要なDPPIの最少量を決定するために、拡大規模に予備的な活性化工程を行った。部分精製proPR-3のアリコートを、1/10 容量の１Ｍクエン酸ナトリウム(pH4.0)の添加によりクエン酸ナトリウム(pH4.0) 中で0.1Ｍとした。２μl中の12μgのDPPIを20μlのこのアリコートに添加し、全タンパク質に対するDPPIの最終濃度を20％(wt/wt)にした。この混合液10μlをpH 調整アリコート10μl中に２倍連続希釈をし、最終混合液が0.313％(wt/wt)のDPP Iを含有するようにした。サンプルを37℃にて３時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを0.1％ Triton X-100含有PBSで１：50希釈し、そして希釈サンプルの8.5μlを、実施例４に記載のように0.4mM Boc-Ala-ONpを使用してPR-3活性についてアッセイした。放出されたONpの速度対添加DPPIのWt/Wt 百分率の比較に基づき、このproPR-3の調製物については、37℃にて３時間にPR- 3の完全な活性化を得るために必要とされる最小量のDPPIは、1.25％(wt/wt)であると決定した。部分精製proPR-3の予備活性化のために、残留濃縮SP-セファロースプールのpH を上記のように調整し、全タンパク質に対するDPPIを２％(wt/wt)とし、そして3 7℃にてインキュベートした。インキュベーションの間、どの時点で活性化が完了するか決定するためにアリコートを取り出し、PR-3の活性をアッセイした。9. 5時間後、サンプルを水で１：４希釈し、そして10mM NaPO₄(pH6.5)、１mM EDTA および0.1％ Triton X-100^TM中で平衡化した無発熱物質Mono-S HR 10/10 カラム (Pharmacia Biotechnology，Inc.,NJ)にロードした。75mlの同じ緩衝液における０〜0.6Ｍ NaClの勾配でタンパク質を溶出し、そして酵素活性をアッセイすることおよびクーマシーブルー染色によるSDS-PAGEでの分析によりPR-3富化画分を検出した。図７はこの手順により産生された(還元または非還元)組換えPR-3のSDS- PAGE分析の結果を示す。ピーク画分をプールし、そしてフィルター滅菌後に４℃ にて貯蔵した。プールのタンパク質濃度を上記のように決定した。このようにして得られたPR-3は約100倍精製され、純度80％以上であり、そして馴化培地から回収したproPR-3の量の約40％であることが示された。図８は、精製組換えPR-3 および天然ヒトエラスターゼの、実施例４に記載されたように調製されたTHP-1 細胞由来の放射性標識26kD TNFαに対する効果のSDS-PAGEオートラジオグラフィー分析の結果を示す。この活性化rPR-3をアッセイに使用して、rPR-3が天然PR-3 の公知のインヒビターに応答して産生され、従って、インビトロでPR-3のインヒビターを同定するのに有用であることを確認した。組換えPR-3活性のc-ANCA抗体での中和 c-ANCAは、ヴェーゲナー肉芽腫症患者に由来するヒトポリクローナル抗体である。多くのc-ANCA調製物がグランザイム(granzyme)ファミリーの他のメンバーの活性と比較して、優先的にPR-3のタンパク質溶解活性を中和することが示されている。プロテインＡ精製ヒトc-ANCA(オランダのErik Hack博士より供給された) と、上記のように調製された精製組換えPR-3とを抗体対酵素の種々のモル比で混合し、そして37℃にて１時間インキュベーション後、実施例４に記載のようにBo c-Ala-ONp基質を使用して残りの酵素活性を測定した。従って、PR-3のインヒビターの同定は、記載の純度の組換えPR-3を利用するスクリーニングにおいて充分に達成され得る。精製組換えPR-3の酵素活性は、PR-3に特異的な50倍モル過剰のプロテインA精製c-ANCA抗体により完全に阻害された。組換えPR-3の触媒特異性を天然PR-3を、以前に同定された２つのペプチドジホスホネートインヒビターに対する感受性を比較することにより試験した。２つのペプチドジホスホネートインヒビター(Boc-Ala-Pro-Val-(OPh)₂およびB oc-Val-Pro-Val-(OPh)₂)を、種々の濃度で125ngのrPR-3(上記のように調製された)と混合し、25％にて１時間インキュベートした。残りの酵素活性をBoc-Ala-O Np基質を使用して測定し、そしてインヒビター非存在下でインキュベートした同量の酵素と比較した。これらの条件下では、Boc-Ala-Pro-Val-(OPh)₂は約10μM のIC₅₀でPR-3を阻害し、そしてBoc-Val-Pro-Val-(OPh)₂は約0.4μMのIC₅₀でPR-3 を阻害した。これらの結果は、HL60細胞由来の天然TNFαコンバターゼの活性および精製天然PR-3の活性を阻害する同じインヒビターの能力と一致する。従って、組換えPR-3は、天然PR-3の有用なインヒビターの検出に用いられ得る。実施例19 rPR-3のインヒビターのアッセイ PR-3のインヒビターをスクリーニングするために、マイクロタイタープレートインヒビターアッセイを行った。潜在的な阻害化合物を100％ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、最終濃度を400μMとした。各溶解化合物10μlをマイクロタイタープレートのそれぞれ４ウェルにおいた。それぞれのウェルに、120μlの 100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を添加した。活性化精製組換えPR-3を、0. 2％ Triton X-100を含有する100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中に最終濃度 0.125mg/mlまで希釈し、そしてこの溶液20μlを、潜在的なインヒビターを含む４つのウェルのうち２つに添加した。PR-3を含まないコントロール溶液を他の２つのウェルに添加した。室温にて30分後、5.5％ DMSOを含有する100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中に新たに調製した0.8mMのPR-3基質50μlを、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、最終基質濃度を0.2mMとした。基質を最初に100％ DMSO中に溶解して最終濃度を40mMとし、次いで3.5％ DMSO中0.8mMまで希釈した。各ウェルの吸光度の変化をプレートリーダーの使用により405nmで測定した。Boc-Ala-ニトロフェニルエステル基質(Sigma，St．Louis，Missouri) を使用して、アッセイを10〜15分間の反応時間にわたって連続的にモニターした。0.2mMのMeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-ニトロアニリド基質(Sigma)を用いて、このアッセイを数時間にわたって連続的にモニターした。１プレートあたり８個のコントロールウェルが含まれており、４つのウェルはDMSOおよび基質を含むが酵素も潜在的インヒビターも有さず(バックグランドコントロール)、４つのウェルは DM SO、基質および酵素を有するが潜在的なインヒビター化合物を有さない(最大活性コントロール)。Triton X-100(0.02％)をアッセイに含み、おそらくタンパク質の溶解度の低さから生じるPR-3活性の非特異的阻害を減少させた。このアッセイによりPR-3を阻害することが見出された化合物をさらに分析し、当該分野で周知の方法を使用するが、PR-3についてのアッセイおよび約0.05mMから約0.5mMまで変化する基質濃度を用いてインヒビターのＫ_iを決定し、阻害様式を決定した。実施例20 治療および結晶グレードのPR-3の産生治療グレードのPR-3を生成するために、Mono-S精製組換えPR-3(実施例16に記載のように得られた)をサイズ排除クロマトグラフィーに供した。Mono-Sプールのタンパク質0.8mgをAmicon YM10限外濾過により２mg/mlに濃縮し、S-300 HRカラム(1.6×60cm．Pharmacia Biotechnology，Inc.,NJ)にロードし、そして0.04 ％ Triton X-100を含有するPBSの移動相でクロマトグラフィーを行った。PR-3富化画分を酵素活性についてアッセイ(Boc-Ala-ONPアッセイ)し、そしてクーマシーブルー染色によりSDS-PAGE上で分析することにより検出した。28kDの１つのバンドが観察された。PR-3は、同じ緩衝液中でクロマトグラフィーを行ったBSAおよびキモトリプシノーゲンＡと比較して見かけの分子質量35kDに相関する保持時間に溶出した。このプロセスにより、Limulus Amoebocyte Lysate Assay(Associ ates of Cape Cod，Inc.,Woods Hole,MA)を使用して測定した場合に、全体として約25％の回収率でそしてリポポリサッカリド含量がタンパク質１mgあたり約10 ng以下である、純度95％以上のPR-3が産生された。精製酵素は、１mgあたり約30 単位の比活性および１秒あたり約12のＫ_catを有する。ここで、１単位は25℃、p H7.5にて１分あたりにBoc-Ala-ONPの切断から生成される１μモルの産物と定義される。タンパク質の結晶化は、Ｘ線回折によるタンパク質の結晶構造の決定において決定的な工程である。水溶液に溶解させ続けるために界面活性剤が必要なタンパク質では、結晶化はしばしば界面活性剤の存在下で起こり、そしてオクチルグルコシドが好ましい界面活性剤である。実施例16に記載のように「スクリーニンググレード」の品質の精製組換えPR-3の２mgを、10mM PO₄(pH6.5)、１mM EDTA、１％(wt/wt)オクチルグルコシド中に透析し、そして同じ緩衝液において平衡化したMono-Sカラム(Pharmacia)にロードした。このカラムをカラムの約10倍量で洗浄し、Triton X-100をオクチルグルコシドと交換し、次いで同じ緩衝液中の0. 6M NaClまで増加する10分/勾配で溶出した。PR-3富化画分を実施例４に記載の比色Boc-Ala-ONp酵素アッセイにより検出し、プールし、そしてCentricon 10(Amic on)で２倍に濃縮した。濃縮したプールを、1.6×60cmの寸法(dimension)のS300 HRサイズ排除カラム(Pharmacia)で１％(wt/wt)オクチルグルコシド含有PBSの移動相を使用するクロマトグラフィーにかけた。PR-3富化画分を、Boc-Ala-ONpを使用する同じ比色酵素アッセイにより検出し、そしてクーマシー染色を用いるSD S-PAGEにより分析した。このプロセスにより約1.5mgのPR-3が得られ、このPR-3 は純度95％以上であった。この物質のＮ末端配列決定により、単一の配列が検出され、これは、成熟活性PR-3の予想されるＮ末端(Ile、Val、Gly、Gly...)に対応した。あるいは、反復Mono-S工程の１つは、結晶グレードのPR-3の収率を最適にするために、0.1％ Triton X-100の代わりに１％オクチルグルコシドを使用してDPPIでproPR-3を活性化した後にMono-S工程を行うことにより、削除され得る。次いで、部分精製活性PR-3が上記のSECにより均一に精製される。実施例21 組換えプロエラスターゼの産生組換えヒト好中球エラスターゼ(Takahashiら、J.Biol.Chem．263: 14739-1474 7(1988))もまた、活性な組換えPR-3の産生のための上記の方法を用いてそのpro 形態から産生され得る。活性な組換えヒトエラスターゼの産生を容易にするために、天然エラスターゼリーダーpro配列およびバキュロウイルス多角体プロモーターの制御下のコード配列を有するプラスミドを構築する。このようなプラスミドを構築するための一般的方法は、実施例10、11、および12に例示されている。次いで、このプラスミドは、当該分野に周知の方法(SummersおよびSmith，Tex .Agric.Expt.Stat.Bull．1555[1983]; Smithら，Mol.Cell Biol．3: 2156[1983] ; およびMaiorellaら，Bio/Technology 6: 1406[1988]を参照のこと)によりヒトプロエラスターゼ配列を含有する組換えバキュロウイルスの作成に使用される。いったん組換えウイルスが作成されると、それが約５〜10プラーク形成単位の組換えウイルス/細胞の多重感染でSf9細胞に感染させるために使用される。培養物は、代表的にはMaiorellaらに記載のような無タンパク質培地で増殖させる。組換えプロエラスターゼは、実施例15に記載の方法を使用して産生および精製される。例えば、感染細胞を30℃にて48〜72時間増殖後、細胞を約3000×ｇで10 分間の遠心分離により培養培地から除去し、そして得られた上清液を0.8ミクロンフィルターで濾過する。次いで、プロエラスターゼ含有培養培地をAmicon YM- 10スパイラルカートリッジの使用により濃縮し、そして実施例15に記載のローディング緩衝液Ａに対して透析する。次いで、濃縮プロエラスターゼをS-セファロースカラムにロードし、ローディング緩衝液Ａで洗浄し、そしてローディング緩衝液の塩化ナトリウム勾配で溶出する。プロエラスターゼを含有する画分は、Ｎ末端のアミノ酸SerおよびGluを除去するためにDPPI切断を使用して同定され得る。活性化は、発色団を含有するエラスターゼ基質を切断する活性化エラスターゼの能力によりモニターされる。活性化は、PR-3について上述した比色アッセイのような比色アッセイを使用してモニターされる。プロエラスターゼは、実施例16および実施例17に記載のようにDPPIを使用して活性化され得る。カテプシンＤのような他のジペプチダーゼもまた、プロエラスターゼのＮ末端ジペプチドを取り除くために使用され得る。グルタミン酸のＣ末端側の切断に特異的なエンドペプチダーゼもまた、プロエラスターゼまたはproP R-3の活性化に有用であり得る。本明細書中に記載の方法により産生されるヒトプロエラスターゼおよびエラスターゼは、エラスターゼインヒビターのスクリーニングに有用である。さらに、本発明の方法は、単独またはエラスターゼインヒビターとの複合体のエラスターゼの結晶化および３次元構造の研究を可能にする充分な質の大量の組換えエラスターゼならびにエラスターゼ変異タンパク質を提供する。このような情報は、エラスターゼインヒビターの合理的設計または改変エラスターゼ活性を有するエラスターゼ分子の設計に有用である。実施例22 TNFαコンバターゼおよびそのインヒビターのアッセイとしての 20kD組換え可溶性proTNFαの17kD TNFαへの変換可溶性形態の組換えproTNFαをコードする構築物を酵母細胞での細胞内発現のために構築した。これは、推定の天然TNFαのＮ末端に対して、-20位のグリシンから天然TNFαの末端まで伸長するように設計されている。ヒトproTNFαをコードするcDNAが、成熟TNFαアミノ酸番号に基づく-21位にメチオニンを含むように操作した。Met_-21proTNFα配列を、S.cerevisiaeで発現させるためにプラスミド pBS24に導入した。最終構築物p21METproTNF/BS24は、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターに連結したアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターの上流活性化配列を利用して、酵母細胞内でMet_-21proTNFの効率的な発現を導く。Met_-21proTNFタンパク質を産生させるために、５リットルの操作した酵母細胞を、２％グルコース含有YPD培地中で72時間増殖させ、そして細胞を5,000×ｇで30分間遠心分離することにより収集した。細胞を10mM EDTA、20 0μM PMSF、および２μg/mlロイペプチンを含有する25mM Tris(pH8.3)の200mlに再懸濁し、そしてDynamillを３回使用してホモジェネートした。ホモジェネートは、10,000×ｇで30分間遠心分離することにより清澄化し、蒸留脱イオン化Ｈ₂ Ｏを使用して３倍に希釈し、そして１mM EDTA、１μg/mlロイペプチン、および2 00μM PMSFを含有する25mM Tris(pH8.5)で平衡化したDEAE-セファロースカラム( ５×15cm，Pharmacia，NJ)にロードした。proTNFαを、上記のTris緩衝液中でランした1.3リットルの０〜0.8Ｍ塩化ナトリウム勾配で溶出した。proTNF富化画分を、E.coli中で発現させたrTNFに対して調製されたウサギ抗ヒトTNFポリクローナル抗体を使用して、ウェスタンブロット解析により同定した。 proTNFαをプールし、１mM EDTA、１μg/mlロイペプチン、および100μM PMSF を含有する10mMリン酸ナトリウム(pH7.0)中に透析し、そしてpH7.0の透析緩衝液中で平衡化したS-セファロースカラムに通した。S-セファロースを通り抜けた(f all-through)画分を、１Ｍ水酸化ナトリウムを使用してpH8.5に調整し、そして5 PW-DEAE-TSK HPLCカラム(21.5×150mm)(BioRad，CA)を使用するクロマトグラフィーを上記の同じpH8.5のTris緩衝液中で５回繰り返して行うことにより精製した。DEAE-TSK-HPLCカラムを３ml/分でランし、そして０〜0.8Ｍ NaCl勾配で60分間にわたり溶出した。Met_-21proTNFα富化画分をSDS-PAGE分析により同定した。 proTNFαのDEAE-HPLCプールをYM-10メンブレン(Amicon)での限外濾過により５倍に濃縮し、次いて、150mM NaClを含有する15mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4 )中３ml/分でZorbax GF-250XLカラム(Dupont，de Nemours，Wilmington，Delawa re)でランする反復SE-HPLCにより分画した。20kD Met_-21proTNFα富化画分をプールし、SE-HPLC緩衝液で４倍に希釈し、そして固体を添加することにより1.0Ｍ硫酸アンモニウムに調整した。 proTNFを、1.0Ｍ硫酸アンモニウムを含有する10mMリン酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化した5PW-Phenyl-TSKカラム(7.5×75mm)(Biorad)での疎水性相互作用クロマトグラフィーによりさらに精製した。proTNFαを１ml/分で30分間の1.0〜０Ｍ硫酸アンモニウムと０〜30％エチレングリコールの十字交差(criss-crossing)勾配を使用して溶出した。proTNFαは、クロマトグラフィーの初期の主要なピーク (ピークＩ)として溶出し、そして後期に溶出する小さなピーク(ピークII)として溶出した。ピークＩのproTNFαをプールし、150mM塩化ナトリウムを含有する15m Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中に透析し、YM-10メンブレンでの限外濾過により濃縮し、フィルター滅菌し、小分けにし、そして−70℃にて貯蔵した。可溶性proTNFαは、TNFαの生物学的アッセイにおいて生物活性を有すること( Carswellら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72: 3666[1975])、３量体構造と一致する見かけの天然分子量(60kD)を有すること、そして20kDの還元前駆体から成熟TNF αの特性の分子量17kDに変換され得ることが示された。 TNFαコンバターゼのインヒビターは、可溶性proTNF切断アッセイの前または間に、PR-3酵素とインキュベートすることにより同定され得る。可溶性proTNF切断アッセイは、以下のように行われる：Met_-21proTNFα(５μM最終濃度)を、0.0 2％ Triton X-100を含有する100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中で潜在的な TNFαコンバターゼインヒビターの存在下または非存在下でTNFαコンバターゼ(0 .05μM最終濃度)と組み合わせる。反応を、20kD可溶性proTNFαの17kD成熟TNFα への変換について、クーマシー染色、銀染色、またはウサギ抗ヒトTNFα抗体を使用するウェスタンブロットにより検出するSDS-PAGE分析により時間に対して分析した。クーマシー染色を使用するSDS-PAGE分析は、サンプルあたり最小で0.2 〜２μgのMet_-21proTNFαを必要とする。銀染色SDS-PAGE分析またはウェスタンブロット解析は、サンプルあたり最小で0.01〜0.2μgのMet_-21proTNFを必要とする。TNFαコンバターゼの活性は、走査型デンシトメトリーを使用して定量化し、時間に対して17kD TNF生成物の出現または20kD proTNF基質の消失を測定され得る。インヒビターは、可溶性proTNF切断アッセイの前または間に、PR-3とインキュベートされ、そしてその阻害活性はそれらのIC₅₀値(このアッセイにおいてT NFαコンバターゼ活性の50％を阻害するインヒビターの濃度)に基づいて比較される。別のアッセイは、TNFαコンバターゼによるMet_-21proTNFαの切断を検出するために２つの異なるポリクローナル抗体調製物を利用する。このアッセイはELIS A形式において、17kD TNFαに対するポリクローナル抗体でproTNFα基質を固定化し、そして20アミノ酸Ｎ末端proTNFαペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体を使用して20アミノ酸proTNFαＮ末端フラグメントの放出を検出することによりランされ得る。本発明は特定の実施態様について記載している。しかし、この出願は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく当業者によりなされ得る変更および置換を含むことを意図する。寄託情報以下の物質がアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された：上記の物質は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の取り決めの下にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)，12301 Pa rklawn Drive，Rockville，Marylandに本発明の承継人であるCetus Oncology Co rporationにより寄託された。受託番号は、ATCCから電話番号(301)881-2600で入手可能である。これらの寄託物は当業者に便宜のために提供され、そして寄託が米国特許法第 112条により必要とされることを認めたわけではない。これら寄託物の核酸配列ならびにそれらによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、万一本明細書中に記載された配列に誤りがある場合には参考にされるべきである。寄託された物質の製造、使用、または販売には認可が必要とされ得、このような認可は本明細書によっては許可されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/46 ＡＢＮＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＧＣ１２Ｎ 9/64 ＡＢＣＣ１２Ｑ 1/37 37/54 ＡＢＮ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91 (31)優先権主張番号０８／３９４，６００ (32)優先日 1995年２月27日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／３９５，４５６ (32)優先日 1995年２月28日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＮＯ (72)発明者ペレズ，カールアメリカ合衆国カリフォルニア 92122, サンディエゴ，チャーハントドライブナンバー236 7275 (72)発明者ジウェリ，デイビットエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94065, サウサリート，シャーウッドドライブナンバー307 427 (72)発明者コーツ，クリストンイー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94530, エルセリートミラビスタドライブ 2646

Claims

【特許請求の範囲】１．成熟腫瘍壊死因子(TNFα)の生産により引き起こされるか、増悪するか、または関連する疾患のための予防薬または治療薬を同定する方法であって、該成熟 TNFαがproTNFαから、TNFαコンバターゼにより該proTNFαの切断によって生産され、該方法が、以下の工程を包含する、方法：（ａ）proTNFαまたはそのタンパク質分解的に切断可能なフラグメントを、該 proTNFαまたはタンパク質分解的に切断可能なフラグメントを切断するのに有効な量の該TNAαコンバターゼに接触させる工程であって、該proTNFαまたはタンパク質分解可能なフラグメントが配列：Gln-Ala-Arg-Ser-Serを有し、この配列内でTNFコンバターゼによるタンパク質分解的切断が生じる、工程；（ｂ）工程(ａ)の該proTNFαの成熟TNFαへの変換または該切断可能なフラグメントの切断のいずれかを測定する工程；（ｃ）工程(ａ)および工程(ｂ)を反復する工程であって、該成熟TNFαによって引き起こされる疾患のための予防薬または治療薬として同定しようする分子をさらに含む、工程。（ｄ）工程(ｃ)の該proTNFαの成熟TNFαへの変換または該切断可能なフラグメントの切断を測定する工程；および（ｅ）工程(ｂ)で測定された変換または切断と、工程(ｃ)で測定された変換または切断とを比較して、該分子が潜在的に成熟TNFαによって引き起こされる疾患のための予防薬または治療薬であるかどうかを決定する、工程。２．前記proTNFαが26kDのproTNFαまたはその切断可能なフラグメントである、請求項１に記載の方法。３．前記proTNFαが約26kDのサブユニットを有するマルチマーである、請求項１に記載の方法。４．前記proTNFαがトリマーである、請求項３に記載の方法。５．前記proTNFαが可溶性であり、そして約20kDのサブユニットを有するマルチマーである、請求項１に記載の方法。６．前記疾患が、敗血症性ショック、慢性関節リュウマチ、悪液質、脳性マラリア、虚血/再灌流障害、および移植片対宿主病からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。７．前記疾患が敗血症性ショックである、請求項６に記載の方法。８．前記TNFコンバターゼが、proTNFαをタンパク質分解的に切断して成熟TNFα を形成可能であるか、またはタンパク質分解的に切断可能なproTNFαのフラグメントをタンパク質分解的に切断可能な組換えタンパク質であり、該proTNFαまたは該タンパク質分解的に切断可能なフラグメントが配列：Gln-Ala-Val-Arg-Ser- Serを有し、この配列内でTNFコンバターゼによるタンパク質分解的切断が生じる、請求項１に記載の方法。９．前記TNFαコンバターゼが、proTNFαをタンパク質分解的に切断して成熟TNF αを形成可能であるか、または切断可能なproTNFαのフラグメントをタンパク質分解的に切断可能な天然のタンパク質であって、該proTNFαまたは該タンパク質分解的に切断可能なフラグメントが配列：Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Serを有し、この配列内でTNFコンバターゼによるタンパク質分解的切断が生じる、請求項１に記載の方法。１０．前記TNFコンバターゼがプロテイナーゼ-３(PR-3)である、請求項１に記載の方法。１１．前記PR-3が天然のPR-3である、請求項１０に記載の方法。１２．前記PR-3が組換えPR-3である、請求項１０に記載の方法。１３．前記工程(ｂ)および工程(ｄ)の変換または切断が、発色TNFαコンバターゼ基質のTNFαコンバターゼ切断を測定する比色アッセイによって概算される、請求項１に記載の方法。１４．成熟TNFαにより引き起こされるか、悪化するか、または関連する疾患を有する患者または疾患受けやすい患者を処置する方法であって、該TNFαはTNFα コンバターゼによるproTNFαの切断によって生産され、該方法が、このような処置を必要とする患者に有効量のTNFαコンバターゼインヒビターを投与する工程を包含する、方法。１５．前記インヒビターが式Boc-Val-Pro-Val-p(OH)₂を有するペプチド性ジフェニルホスホネートである、請求項１４に記載の方法。１６．前記proTNFαが26kDのproTNFαまたはそのタンパク質分解的に切断可能なフラグメントである、請求項１４に記載の方法。１７．前記proTNFαが約26kDのサブユニットを有するマルチマーである、請求項１４に記載の方法。１８．前記疾患が、敗血症性ショック、慢性関節リュウマチ、悪液質、脳性マラリア、虚血/再灌流障害、および移植片対宿主病からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。１９．前記疾患が敗血症性ショックである、請求項１８に記載の方法。２０．前記TNFコンバターゼが、proTNFαをタンパク質分解的に切断して成熟TNF αを形成可能であるか、またはタンパク質分解的に切断可能なproTNFαのフラグメントをタンパク質分解的に切断可能である組換えタンパク質であり、該proT NFαまたは該タンパク質分解的に切断可能なフラグメントが配列：Gln-Ala-Val- Arg-Ser-Serを有し、この配列内でTNFコンバターゼによるタンパク質分解的切断が生じる、請求項１４に記載の方法。２１．前記TNFαコンバターゼが、proTNFαをタンパク質分解的に切断して成熟T NFαを形成可能であるか、または切断可能なproTNFαのフラグメントをタンパク質分解的に切断可能な天然のタンパク質であって、該proTNFαまたは該タンパク質分解的に切断可能なフラグメントが配列：Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Serを有し、この配列内でTNFコンバターゼによるタンパク質分解的切断が生じる、請求項１４に記載の方法。２２．前記TNFαコンバターゼがプロテイナーゼ-３(PR-3)である、請求項１４に記載の方法。２３．前記PR-3が天然のPR-3である、請求項２２に記載の方法。２４．前記PR-3が組換えPR-3である、請求項２２に記載の方法。２５．前記インヒビターが式：Boc-Ｘ-p(OPh)₂を有するペプチド性ジフェニルホスホネートを含み、ここでＸがAla-Pro-ValおよびVal-Pro-Hisからなる群より選択されるペプチドである、請求項１４に記載の方法。２６．ＸがVal-Pro-Hisである、請求項２５に記載の方法。２７．前記インヒビターが該TNFコンバターゼに対するモノクローナル中和抗体を含む、請求項１４に記載の方法。２８．患者の自己免疫疾患の処置方法であって、該方法が、このような処置を必要とする患者に有効量のTNFαコンバターゼインヒビターを投与する工程を包含し、該インヒビターが式：Boc-Ｘ-p(OPh)₂の化合物であり、ここでＸがAla-Pr o-ValおよびVal-Pro-Hisからなる群より選択される、方法。２９．単離され、精製された組換えPR-3。３０．請求項２９に記載の単離され、精製された組換えPR-3を約90重量％から約 99重量％含有する組換えタンパク質調製物。３１．単離され、精製された組換えPR-3を約90重量％から約95重量％含有する、請求項３０に記載の組換えタンパク質調製物。３２．単離され、精製された組換えPR-3を約95重量％を超えて含有する、請求項３０に記載の組換えタンパク質調製物。３３．請求項２９に記載の組換えPR-3を含有する組換えタンパク質調製物であって、ここで該調製物が１μg/mg PR-3未満のエンドトキシン含量を有する、組換えタンパク質調製物。３４．請求項２９に記載の組換えPR-3を含有する組換えタンパク質調製物であって、ここで該調製物が20ng/mg PR-3未満のエンドトキシン含量を有する、組換えタンパク質調製物。３５．pH7.5、25℃でのBoc-Ala-ONPのアッセイで約30マイクロモル/分/mg PR-3 の比活性を有する、請求項２９に記載の単離され、精製された組換えPR-3。