JP2000506371A

JP2000506371A - 成長因子ｈｔｔｅｒ３６

Info

Publication number: JP2000506371A
Application number: JP09522332A
Authority: JP
Inventors: アール．ソペット，ダニエル; リー，ハオドン
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2000-05-30
Also published as: ES2264564T3; EP0891372A1; CA2248318A1; DE69636232T2; EP0891372A4; DE69636232D1; AU5527296A; EP0891372B1; WO1997035870A1

Abstract

(57)【要約】本発明は成長因子HTTER36ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを開示する。さらに、組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するための手順、および細胞の増殖および分化、骨形成、ならびに創傷治療を刺激することを含むポリペプチドの治療的使用が提供される。さらに、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが開示され、そして新生物形成の治療、ならびに肝臓および肺における細胞外マトリックス分子の形成を防止するための治療薬としてのそれらの使用が開示される。さらに、本発明のポリペプチドの変化レベル、および本発明のポリペプチドをコードする核酸配列における変異を検出するための診断アッセイが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】成長因子HTTER36 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発明のポリペプチドは、ヒトトランスフォーミング成長因子として推定的に同定されている。より詳細には、本発明のポリペプチドは、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバーとして推定的に同定され、そして本明細書中以下でときどき「HTTER36」と呼ばれる。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。本発明は、TGF-βに構造的および機能的に関連したポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子に関する。ペプチド成長因子のトランスフォーミング成長因子- βファミリーは、TGF-β１からTGF-β５まで名付けられた５つのメンバーを含み、これらはすべて約25kDのホモニ量体を形成する。TGF-βファミリーは、より大きな、拡張したペプチドシグナル伝達分子のスーパーファミリーに属し、これは、Muellerian阻害物質(Cate，R．L.ら，Cell，45:685-698(1986))、デカペンタプレジック(decapentaplegic;Padgett，R．W.ら，Nature，325:81-84(1987)、骨形成因子(Wozney，J．M.ら，Science，242:1528-1534(1988)、vgl(Weeks，D.L., およびMelton，D．A.，Cell，51:861-867(1987))、アクチビン(Vale，W.ら，Nat ure，321:776-779(1986)、およびインヒビン(Mason，A．J.ら，Nature，318:659 -663(1985)を含む。これらの因子は全体的な構造においてTGF-βに類似しているが、TGF-βタンパク質および互いと約25％のアミノ酸同一しか示さない。これらの分子はすべて、成長、発生および分化の調節において重要な役割を担っていると考えられる。本発明のタンパク質、PGFは、TGF-βの活性ドメインであるC末端に保存された７つのシステイン残基を保有する。 TGF-βは最初、上皮成長因子の存在下でソフトアガーにおいて増殖するために正常なラット腎線維芽細胞を誘導する因子として記載された(Roberts，A．B.ら， PNAS USA，78:5339-5343(1981)。後に、TGF-βは種々の細胞において多数の異なる効果を発揮することが示されている。例えば、TGF-βは、中胚葉を起源の特定の細胞の分化を阻害し(Florini，J．R.ら，J．Biol．Chem.，261:1659-16513(19 86))、他のものの分化を誘導し(Seyedine，S．M.ら，PNAS USA，82:2267-2271(1 985))、そして種々の型の上皮細胞の増殖を強力に阻害し得る(Tucker，R．F.，S cience，226:705-707(1984))。この最後の活性は、TGF-βの１つの重要な生理学的役割が多くの型の細胞の抑制された成長状態を維持することであるという推測を導き出した。従って、TGF-βに応答する能力を失った細胞は、非制御の成長を示し、そして腫瘍化するようである。実際、網膜芽細胞種のような特定の腫瘍は、それらの細胞表面に検出可能なTGF-βレセプターが存在せず、そしてTGF-βに応答し得ない。一方、それらの正常な対応物は自己表面レセプターをそれらの成長において発現し、TGF-βにより強力に阻害される(Kim Chi，A.ら，Science，2 40:196-198(1988))。より詳細には、TGF-β１は、正常ラット腎臓線維芽細胞の足場-非依存性成長を剌激する(Robertら，PNAS USA，78:5339-5343(1981))。それ以来、それは細胞増殖および分化の多機能的な制御因子であることが示されており(Spornら，Scie nce，233:532-534(1986))、いくつかのヒトガン細胞株(Robertsら，PNAS-USA，8 2:119-123(1985))、マウスケラチノサイト(Coffeyら，Cancer，RES.，48:1596-1 602(1988))、ならびにTおよびBリンパ球(Kehrlら，J．Exp．Med.，163:1037-105 0(1986))の増殖を阻害するような多様な効果を発揮し得る。それはまた、初期の造血前駆体細胞増殖を阻害し(Goeyら，J．Immunol.，143:877-880(1989))、ラット筋簡葉細胞の分化の誘導および続いて起こる軟骨特異的マクロ分子の産生を刺激し(Seyedineら，J．Biol．Chem.，262:1946-1949(1986))、コラーゲンの合成および分泌の増加を引き起こし(Ignotzら，J．Biol．Chem.，261:4337-4345(198 6))、骨形成を刺激し(Nodaら，Endocrinology，124:2991-2995(1989))、そして切創の治癒を促進する(Mustoeら，Science，237:1333-1335(1987))。さらに、TGF-β１は肝臓および肺における細胞外マトリックス分子の形成を刺激する。TGF-β１のレベルが正常値よりも高い場合、肝臓および肺の細胞外マトリックスにおける繊維の形成が起こり、これは致死的であり得る。高レベルのTG F-β１は、ガン（例えば乳ガン）を処置する試みとして用いられる化学療法および骨髄移植により起こる。 TGF-β２と呼ばれる第２のタンパク質は、鉱質除去された骨、ヒト前立腺ガン細胞株を含むいくつかの供給源から単離された(Ikedaら，Bio.Chem.，26:2406-2 410(1987))。TGF-β２は、TGF-β１といくつかの機能的な相同性を共有する。これらのタンパク質は、TGF-β３(Ten-Dijkeら，PNAS，USA，85:471-4719(1988)) 、Muellerian阻害物質およびインヒビンを含む関連した成長調節タンパク質のファミリーのメンバーであることが現在公知である。本発明のポリペプチドは、関連した成長調節タンパク質のこのファミリーのメンバーとして推定的に同定されている。本発明の１つの局面によれば、新規の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性で、かつ診断的または治療的に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源である。本発明の別の局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、この核酸分子は、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびにそのアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断的または治療的に有用なフラグメントを含む。本発明の別の局面によれば、ATCC受託番号第97349号に含まれるヒトcDNAにより発現される成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および/または真核生物宿主細胞を培養することを含む組換え技術による、このようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的（例えば、細胞の増殖および分化の刺激、骨形成および創傷治癒の刺激）のために利用するためのプロセスが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするのに充分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明のポリペプチドに対するアゴニストが提供される。本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、これは、例えば、その増殖が本発明のポリペプチドにより刺激される細胞の異常増殖の処置ならびに肝臓および肺における細胞外マトリックス分子の形成を阻止することにおいて、このようなペプチドの作用を阻害するために使用され得る。本発明のさらに別の局面によれば、本発明のポリペプチドの過剰発現およびこのようなポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関連した疾患を検出するための治療アッセイが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベクターの製造に関連するインビトロ目的のため、このようなポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲によって包囲される本発明の範囲を限定することを意味しない。図１は、HTTER36のcDNA配列、および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準的な１文字略語を使用する。推定のシグナル配列に下線を付する。図２は、HTTER36（上列）とMus筋推定トランスフォーミング成長因子-β、「G DF-3」（配列番号９）との間のアミノ酸配列相同性の比較を示す。本発明の１つの局面によれば、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト精巣腫瘍cDNAライブラリーにおいて発見された。これは構造的にTGF-β遺伝子スーパーファミリーに関連する。これは、36 4アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。このポリペプチドの最初の16アミノ酸は推定のリーダー配列であり、次の234アミノ酸はプロ配列であり、そして最後の114アミノ酸は活性領域である。HTTER36 はアミノ酸レベルでGDF-３に最も高い程度の相同性を示し、69％の同一性および 80％の類似性を有する。最初の16アミノ酸は、本明細書中以降に記載されている生物学的機能を行うために、ポリペプチドを個々の標的位置に配向するのに必要であると考えられている推定の膜貫通部分を表す。膜貫通部分はまた、ポリペプチドから切断され得る。本発明の別の局面によれば、ATCC受託番号第97349号（1995年11月28日にAmeri can Type Culture Collection，12301 Park Lawn Drive，Rockville．Maryland2 0852，USA,に寄託）に含まれるヒトcDNAにより発現される成熟ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。寄託物質は、HTTER36 cDNA の全長を含むpBluscript SK(+)プラスミドであり、これは、寄託されたときに「 PF230」と呼ばれた。寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に行われる。株は取り消し不可能であり、そして特許の発行の際に公に放出される制限または条件を有さない。寄託は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造、使用、または販売するためには許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示すコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）のDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得るが、これらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/もしくは3'非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。従って、本発明は、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を含む。この改変体は、図１（配列番号２）のポリペプチドのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を含む。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。本発明はまたポリヌクレオチドを含み、ここで、成熟ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を援助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じリーディングフレームで融合され得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そして宿主細胞により切断されるリーダー配列を有し、ポリペプチドの成熟形態を形成し得る。ポリヌクレオチドはまた、付加的な5'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そして不活性形態のタンパク質である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、あるいはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、pQEベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合は、血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37:767(1 984)）。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することにに関連するDNAのセグメントを意味する；これは、コード領域の前および後ろの領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。全長HTTER36遺伝子のフラグメントは、全長の遺伝子を単離するため、およびその遺伝子に高い配列類似性を有するかまたは類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。この型のプローブは、好ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは少なくとも30塩基、そしてなおさらに好ましくは少なくとも50 以上の塩基を有する。プローブはまた、全長の転写物に対応するcDNAクローン、およびゲノムクローンまたは調節およびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを含む完全なHTTER36遺伝子を含むクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの一例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のDNA配列を使用することによって、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドが、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトcDNA、ゲノムDNAまたmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用される。本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、そしてより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）のcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。い。あるいは、このポリヌクレオチドは、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有し得、これは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてそれらに同一性を有し、本明細書中で先に記載されるように、これは活性を保持し得るか、または保持し得ない。例えば、このようなポリヌクレオチドは配列番号１のポリヌクレオチドに対するプローブ（例えば、ポリヌクレオチドの回収のため、または診断プローブもしくはPCRプライマーとして）として使用され得る。従って、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチド、ならびにその部分（これは、少なくとも15個の連続する塩基を有する部分、好ましくは30個の連続する塩基、そして最も好ましくは少なくとも50個の連続する塩基を有する部分）に、少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％の同一性、そしてより好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するセプターポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝的コードによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは(iv)成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために使用されるリーダーまたは分泌配列のようなさらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され得る。本発明のポリペプチドは、配列番号２（詳細には、成熟ポリペプチド）のポリペプチド、ならびに配列番号２のポリペプチドに少なくとも70％の類似性（好ましくは、少なくとも70％の同一性）、およびより好ましくは配列番号２のポリペプチドに少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）、およびなおさらに好ましくは配列番号２のポリペプチドに少なくとも95％の類似性（なおさらに好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そして、一般に、少なくとも30アミノ酸、およびさらに好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するポリペプチドのそのような部分を有するそのようなポリペプチドの部分もまた含む。当該分野で公知のように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配列に対して一方のポリペプチドの、アミノ酸配列およびそれらの保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって相当する全長ポリペプチドを生成するために使用され得、それゆえ、このフラグメントは、全長ポリペプチドを生成するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれかに含まれ得る。このようなベクターは、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このようなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA;バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E ．coli lacまたはtrp 、λファージP_Lプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばE ．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E ．coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pblues cript SK、pBsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK 223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG4 4、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフエラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特によく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびt rpを包含する。真核生物プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I. ，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。宿主細胞中の構築物を用いて、従来の様式で組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主を用いる使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manua l，第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側の SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevis iae のTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、解糖酵素（例えば、 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプラズム空間または細胞外の培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、そして所望される場合は、宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、E ．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typ himurium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp sala，Sweden)およびGEMI(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を含む。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23:175(1981)に記載されるサル腎臓線維芽細胞のC0S-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列をまた含有する。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され得る。ポリペプチドは、以下を含む方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る：硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPL C)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒト疾患の処置および診断薬の発見のための研究用試薬および物質として使用され得る。 HTTER36の標的細胞への特異性は、標的細胞を破壊する機構として利用され得る。例えば、HTTER36またはその可溶性型は、毒性分子：例えば、標的細胞を不活性化する放射性医薬品に（種々多様な方法によって）結合され得る。これらの増殖因子-毒物融合体は標的細胞（および特定の場合では種々の「傍観者(bystan der)」効果により隣接した細胞）を殺傷する。このような毒物融合遺伝子の最近の例は、Mesriら，J.Blol．Chem．268:4853-62(1993)によって刊行される。HTTE R36およびその可溶性フラグメントならびに関連した分子はまた、リポソーム中びカプセル化され得、および腫瘍または細胞特異的抗原を認識し結合する抗体に結合し得、それによって細胞を「標的化する」手段を提供する。同様に、HTTER36およびこの可溶性フラグメントは、抗新生物化合物として使用され得る。なぜならこのファミリーのメンバーは、形質転換細胞において抗増殖効果を示すからである。インビボ使用のために、本発明のポリペプチドは様々な方法（注射、点滴、局所性、非経口性などを含むが、それらに限定されない）で投与され得る。投与は、リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、滅菌水などを含む、任意の生理学的に受容可能なキャリアにおいてであり得る。 HTTER36およびその可溶性フラグメントを含む主な処置は、創傷治癒に関連する。本発明の組成物は、生体の皮膚創傷、角膜創傷、および上皮で覆われた（ep ithelial-lined）中空器官への障害のすべてを実質的に包含する、種々多様な創傷の処置のために使用され得る。処置に適する創傷は、火傷、擦傷、および切り傷ならびに外科的切開および皮膚移植術のような外科的手順から生じるものを含む。本発明のポリペプチドを用いた処置に適切な他の症状は、慢性潰瘍、糖尿病潰瘍、および他の非治癒（栄養に関する）症状のような慢性症状を含む。 HTTER36およびその可溶性フラグメントは、罹患領域に適用するために生理学的に受容可能なキャリアに組み込まれ得る。キャリアの性質は、広く変化し得、そして意図される適用の場所に依存する。皮膚への適用のために、クリームまたは軟膏基剤が通常好まれる。；適切な基剤は、ラノリン、Silvadene（Marion）（特に火傷の処置のため）、Aquaphor（Duke Laboratories，South Norwalk，Co nn.）などを含む。所望であれば、創傷のペプチドへの連続的な曝露のために、絆創膏および他の創傷包帯中にHTTER36含有組成物を組み入れることが可能である。エアゾール適用もまた使用を見出し得る。処置組成物におけるHTTER36の濃度は重要ではないが、上皮細胞増殖を誘導するのに充分であるべきである。組成物は局所的に罹患領域に適用され、代表的には眼には点眼薬として、または皮膚にはクリーム剤、軟膏剤またはローション剤として適用され得る。眼の場合、頻回の処置が望ましく、通常４時間以内の間隔で適用される。皮膚では、１日に２回〜４回またはより頻繁な処置組成物の適用により、治癒の間、罹患領域に処置組成物を継続的に維持することが望ましい。本発明のポリペプチドの使用量は、投与の様式、他の活性化合物の使用などど共に変化し、一般に約１μg〜100μgの範囲にある。本発明のポリペプチドは生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などのような生理学的に受容可能なキャリアと共に使用され得る。使用される化合物の量は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含む処方物へのインビトロでの細胞応答および実験動物の応答に基づいて経験的に決定され得る。 HTTER36およびその可溶性フラグメントは、正常ラット腎臓線維芽細胞の足場非依存性増殖を刺激するために使用され得る。 HTTER36およびその可溶性フラグメントは、細胞の増殖および分化の多機能的制御因子として使用され得、これはいくつかのヒトガン細胞株、ならびにTおよびBリンパ球の増殖を阻害するこのような多様な効果能力がある。 HTTER36およびその可溶性フラグメントは、初期の造血前駆細胞増殖を阻害し、ラット筋間葉性細胞の分化の誘導を刺激し、そして軟骨特異的マクロ分子の産生を刺激するために（コラーゲンの合成および分泌の増加を引き起こす）使用され得る。 HTTER36およびその可溶性フラグメントはまた、骨形成を刺激するために使用され得る。本発明は、本発明のポリペプチドに対するアゴニスト化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。例として、HTTER36レセプターを発現している哺乳動物細胞または膜調製物が、潜在的な化合物と共にインキュベートされ、そしてレセプターからの２次シグナルを生じるこの化合物の能力が、それが有効なアンタゴニストであるかどうかを決定するために測定される。このような２次メッセンジャー系はcAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解を含むが、これらに限定されない。有効なアンタゴニストはまた、上記の方法によって決定され、ここでレセプターに結合するが２次メッセンジャー応答を誘発せず、それによってHTTER36からレセプターをブロックするアンタゴニスト化合物が検出される。本発明のポリペプチドに対するレセプターに特異的な、潜在的なアンタゴニストを同定するための別のアッセイは、競合アッセイである。このアッセイは本発明のポリペプチドに対するレセプターを過剰発現する原形質膜（例えばヒトA431 ガン細胞）を単離する工程を含む。培地（容量は約10マイクロリットル）中の連続的に希釈された10nM¹²⁵I-HTTER36を含む試験試料が、潜在的なアンタゴニスト化合物の存在下で５マイクログラムの原形質膜に添加され、そして４時間４℃でインキュベートされる。反応溶液は希釈され、直ちにミリポア(millipore)フィルターに通された。次いでフィルターを迅速に洗浄し、そして結合放射活性をガンマカウンターにおいて測定した。次いで、結合HTTER36の量を測定した。コントロールアッセイもまた化合物の非存在下で行われ、アンタゴニストが結合HTTE R36の量を減少させるかどうか決定する。潜在的なアンタゴニスト化合物は、ポリペプチドに結合する、抗体または場合によってはオリゴペプチドを含む。あるいは、潜在的なアンタゴニストはレセプター（ポリペプチドの非活性型であり、それにより本発明のポリペプチドの作用を阻害する）に結合するタンパク質に密接に関連し得る。別のアンタゴニスト化合物は、アンチセンス技術を用いて調製したアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、三重らせん構造またはアンチセンスDNA もしくはRNAを介して遺伝子発現をコントロールするために使用され、両方法はD NAまたはRNAへのポリヌクレオチド結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード部分は、約10〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。DNA オリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（triple helix Leeら，Nucl．Acids Res.，6:3073(1979);Cooneyら，Science ，241:456(1988);およびDervanら，Science，251:1360(1991)を参照のこと）、それによって本発明のポリペプチドの転写および産生を妨げる。アンチセンスRN AオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、本発明のポリペプチドへのmRNA分子の翻訳をブロックする(Antisense‐Okano，J．Neuroche m.，56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene E xpression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。上記のオリゴヌクレオチドもまた、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現されて、本発明のポリペプチドの産生を阻害し得るように、細胞に送達される。アンタゴニスト化合物は、本発明のポリペプチドに結合する微小分子を含み、そしてレセプターでその作用をブロックし、その結果正常な生物学的活性が妨げられる。微小分子はまた、結合を妨げるためにポリペプチドに結合し得る。微小分子の例は小ペプチドまたはペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。アンタゴニストは、その増殖が本発明のポリペプチドにより刺激される細胞における新生物形成（例えば、ガンおよび腫瘍）の処置に使用され得る。アンタゴニストはまた、肝および肺における細胞外マトリックス分子の形成の刺激を妨げるために使用され得る。本発明のポリペプチドまたはアンタゴニスト化合物は、適切な薬学的キャリアと組合わせて使用され得る。このような組成物は、ポリペプチドまたは化合物の治療的有効量および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。処方物は、投与の方法に適するはずである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的なパックまたはキットを提供する。このような容器（単数または複数）に付随するものは、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形態の表示であり得、この表示は、ヒトの投与のための製造、使用、または販売のその機関による認可を表す。さらに、本発明のポリペプチドまたは化合物は、他の治療的化合物と併用して用いられ得る。この薬学的組成物は、例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路による簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の症状の処置および／または予防に効果的な量で投与される。一般に、それらは少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約8mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約10 μg/kg体重から約1mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。ポリペプチドおよびポリペプチドであるアンタゴニストはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により本発明に従って使用され得、これはしばしば「遺伝子治療」として言われる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知であり、本明細書中の教示から明らかである。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターの使用により操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質転換され、このようにパッケージング細胞は今や目的の遺伝子を含む感染性のウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために、患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかなはずである。レトロウイルス（これ由来のレトロウイルスプラスミドベクターを本明細書中で先に言及した）は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓懐死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、ギボンサル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖肉腫ウイルス、および乳ガンウイルスのようなレトロウイルスに由来し得るが、これらに限定されない。一つの実施態様において、このレトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス由来である。このベクターは１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスLTR;SV40プロモーター；およびMillerら、Biotechniq ues７巻、第９号、980-990(1989)に記載されるヒトサイトメガロウイルス（CMV ）プロモーターまたは任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、pol IIIおよびβアクチンプロモーターを含む（これらに限定されない）、真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター）を含むが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルス性プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示により、当業者にとって明らかである。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーター制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターのような異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモーター；MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR（本明細書中上記の修飾型レトロウイルスLTRを含む）；βアクチンプロモーター；ならびにヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターあり得る。レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入してプロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-1 9-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびMiller，Human Gene Th erapy,１巻、５〜14頁(1990)（これは、本明細書中で全文が参照として援用される）に記載されたDAN細胞株を含むが、これらに限定されない。このベクターは、パッケージング細胞を当業者にとって公知の任意の手段で形質導入し得る。そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO₄沈降を含むが、これらに限定されない。一つの代替手段において、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され得るか、または脂質に結合されて、そして次いで宿主に投与され得る。プロデューサー細胞株は、このポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子は、真核生物細胞をインビトロまたはインビボのいずれかで形質導入するのに、使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚幹細胞、胚ガン細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支上皮細胞を含むが、これらに限定されない。本発明はまた、診断の場合の本発明の遺伝子の使用に関連している。本発明の遺伝子の変異型の検出は、本発明のポリペプチドの過小発現により起こる疾患（例えば、不適切な創傷の治癒および不適切な神経学的機能）または感受性の診断を可能にする。本発明のヒト遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検物質由来）より得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析前にPCR（Saikiら、Nature、324:163-166(19 86)）を用いることにより酵素的に増幅され得る。RNAあるいはcDNAもまた、また同じ目的のために使用され得る。例として、本発明のポリペプチドをコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、その変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、放射性標識されたRNAまたは、あるいは放射性標識されたアンチセンスDNA配列に、増幅されたDNAをハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全にマッチした配列は、RNaseＡ消化または融解温度の差により、ミスマッチした二重鎖と区別され得る。参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の差異は、直接DNA配列決定法により明らかにされ得る。さらに、クローン化されたDNAセグメントは、特定のD NAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の感度は、PCRと組み合わされた場合に、非常に増強される。例えば、配列プライマーは、二重鎖のPCR産物または改変PCRにより生成された一重鎖テンプレート分子とともに使用される。この配列決定は、放射標識されたヌクレオチドを用いる従来の手順によるか、または蛍光タグを用いる自動配列決定手順により実行される。 DNA配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動的移動度の変化の検出により達成され得る。高分解能ゲル電気泳動により微小配列の欠如または挿入が明らかになり得る。異なった配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにより識別され得、そこでは異なったDNAフラグメントの移動が、それらの特定の融解温度または部分的な融解温度に依存してゲルの異なった位置で、遅延する(例えば、Myers ら，Science，230:1242(1985)を参照のこと)。特定の位置での配列変化もまた、核酸分解酵素保護アッセイ（例えば、RNase およびS1保護）または化学的開裂方法によって明らかになり得る(例えば、Cotto nら，PNAS，USA，85:4397-4401(1985))。従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的開裂、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用(例えば、制限酵素断片長多型 (RFLP))、およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。より従来型のゲル-電気泳動およびDNA配列決定に加えて、インサイチュ分析により変異が検出され得る。本発明はまた、種々の組織において本発明のポリペプチドの変化したレベルを検出するための診断的アッセイに関連する。なぜなら、正常のコントロール組織と比較されるタンパク質の過剰発現が、新生物形成、皮膚障害、眼球障害および炎症などの特定の疾患症状の存在を検出し得るからである。宿主由来の試料における本発明のポリペプチドのレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、そして好ましくは、ELISAアッセイを含む。ELISAアッセイは、最初に本発明のポリペプチドの抗原に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を調製する工程を含む。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調製される。レポーター抗体に対して、放射活性、蛍光、または本実施例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出試薬を結合させる。ここで、試料を宿主から取り出し、固体支持体（例えば、試料中のタンパク質に結合するポリスチレンディッシュ）上でインキュベートする。次いで、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質とともにインキュベートすることにより覆う。次に、モノクローナル抗体をディッシュ中でインキュベートし、その間にモノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに結合している任意の本発明のポリペプチドに対して結合する。全ての未結合のモノクローナル抗体は緩衝液で洗浄除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体を、ここで、ディッシュ中に入れ、本発明のポリペプチドに結合した任意のモノクローナル抗体に対してレポーター抗体の結合を生じさせる。次いで、未結合のレポーター抗体を洗浄除去する。次いで、ペルオキシダーゼ基質をディッシュに加え、そして所定の時間に発色した量を、標準曲線と比較した場合の患者試料の所定の容量中に存在するタンパク質の量の尺度とする。競合アッセイもまた、宿主由来の試料において本発明のポリペプチドのレベルを決定するために使用され得る。このようなアッセイは、本発明のポリペプチドのレセプターを過剰発現する原形質膜を単離する工程を含む。次いで、標識された本発明のポリペプチドを含む試験試料を原形質膜に加え、次いで、決められた時間までインキュベートする。また、本発明のペプチドを含むと考えられる宿主由来の試料を反応混合物に加える。次いで、反応混合物をフィルターを通して迅速に洗浄し、次いでレセプターの競合量（従って、試料中の本発明のポリペプチド量）を決定するために結合放射活性を測定する。 HTTER36に特異的な抗体は、ガンの診断および治療に使用され得る。なぜなら、多くのガン細胞の型が、新生物形成または過形成のプロセスの間、このスーパーファミリーの種々のメンバーをアップレギュレートするためである。これらの抗体はHTTER36に結合し、そして不活性化する。HTTER36（および／またはそのファミリーメンバー）に対するモノクローナル抗体は、過形成および新生物形成増殖異常を含む（しかし、これらに限定されない）特定の疾患の診断および治療の両方について、臨床で使用される。新生物形成組織による増殖因子発現のアップレギュレーションは、罹患した患者の血液中の増殖因子の増加を検出する種々の血清アッセイのための基礎を形成する。これらのアッセイは、代表的に診断的状況で使用されるだけでなく、予後の状況でも同様に（手術、化学療法の後の潜在性の腫瘍細胞の存在を検出するために）使用される。さらに、HTTER36レセプターを発現している悪性の細胞は、レセプター結合アッセイにおける標識されたHTTER36の使用により、またはHTTER36レセプター自体に対する抗体の使用により、検出され得る。細胞は、HTTER36のレセプターの存在および密度に一致して識別され得、それによって、このような細胞の、HTTER3 6の生物学的活性に対する感受性を予想する手段を提供する。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置のマーキング（marking）に利用可能な、実際の配列データ（反復多型）に基づく染色体マーキング試薬はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化することのないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを類似の様式で用いて、下位の位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、フロー選別した(flow-sorte d)標識染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色***置を提供するために使用され得る。この技術は、50または60塩基程度の短いcDNAを用いて使用され得る。この技術の総説としては、Vermaら，Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques，Per gamon Press，New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色***置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．McK usick，Mendelian Inheritance in Manに見出される(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には全く観察されない場合、この変異はおそらく疾患の原因因子である。物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の分解能では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50〜500の可能性のある原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング分解能で、そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、ネイティブなポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられる。単鎖抗体を産生するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適用させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載される。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または数字により明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり、制限無く公然と入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントが、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜50μgのDNAが、20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にて約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の指示に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８:40 57(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。他に記載しない限り、形質転換は、Graham,F.およびVan der Eb，A.，Virolog y，52:456-457(1973)の方法に記載のように実施された。実施例１成熟HTTER36の細菌発現および精製 HTTER36をコードするDNA配列（ATCC第97349号）を、プロセスされているHTTER 36タンパク質の５'配列およびHTTER36遺伝子に対して３'側のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅した。HTTER36に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５'配列および３'配列に付加した。５ 'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５'GAAAGGATCCGCAGCCATCCCTGTCCCCAAAC TTTCTTGT３'（配列番号３）を有し、これはBam HI制限酵素部位（太字）、続く図１（配列番号１）のヌクレオチド791から始まるHTTER36コード配列の18のヌクレオチドを含む。３'配列、５'TCCTTCTATTCAAGCTTCTGACATCCTACCCACACCCACA３' （配列番号４）は、Hind III部位に相補的な配列を含み、そして続いてヌクレオチド1121から始まるHTTER36の15ヌクレオチドおよび終止コドンを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA、91311）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をBamHI およびHind IIIで消化した。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とインフレームで挿入した。次いで、連結混合物を用いて、E．coliDH5α株（Gibco BRL）をSambrook，J.ら、Molecular Coning:A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換した。形質転換体をLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDN Aを単離し、制限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Amp（10 0μg/ml）およびKan（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させた。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大規模な培養物に接種した。細胞を、光学密度600（O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にした。IPTGは、lacIリプレッサーを不活化することにより、 P/Oを解放（clear）し遺伝子発現の増加を誘導した。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック薬剤６ＭグアニジンH自中で可溶化した。明澄化後、可溶化HTTER36を、6-Hi sタグを含有するタンパク質が強固に結合することを可能とする条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した（ Hochuli，Eら、J．Chromatography 411:177-184(1984)）。HTTER36（純度 85％）を６MグアニジンHCl(pH5.0)中でカラムから溶出し、そして再生の目的で、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10Mグルタチオン（還元型）、および２Mグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での12時間のインキュベーションの後、タンパク質を10Mリン酸ナトリウムに対して透析した。実施例２バキュロウイルス発現系を用いるHTTER36のクローニングおよび発現 HTTER36タンパク質をコードするDNA配列（ATCC第97349号）を、この遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：使用されたプライマーは：５'CAGGGATCCGCCATCATGCTTCGTTTCTTGCCAGA３'（配列番号５）であり、これは下線を引いたBamHI部位、真核生物細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルである開始コドン（太字）およびHTTER36コード配列の17bpを含む。３'プライマーは、配列５’CTTCGGTACCCATTTCTGACATCCTACCCACAC３’（配列番号６）を有し、これは、下線を引いたAsp718部位、およびヌクレオチド1126で始まるHTTER36 配列の３’末端に相補的な23ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718で消化し、次いで再度１％アガロースにおいて精製する。このフラグメントを、F2と称する。ベクターpA2（pVL941ベクターの改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を用いるHTTER36タンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D. およびSmith，G.E．1987，Amanual of methods for baculovirus vectors and i nsect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station B ulletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californi ca核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。シミアンウイルス(SV)40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列には、同時トランスフェクトした野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列が両端で隣接する。多くの他のバキュロウイルスベクターが、用いられ得る。例えば、pAc373、pRG1、pV L941、およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSummers，M.D.、Virology，170 :31-39）。プラスミドを制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、次いで当該分野で公知の手順によりウシ小腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いてDNAを１％アガロースゲルより単離した。このベクターDNAをV2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結する。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして制限酵素BamHIおよび Asp718を用いて、HTTER36遺伝子を有するプラスミド（pBacHTTER36）を含んだ細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。５μgのプラスミドpBacHTTER36を、リポフェクション法（Felgnerら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウイルス（「BaculoGold^TMbaculovirus DNA」，Pharmingen，San D iego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacHTTER36を、50 μlの無血清グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地1mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。プレートを、新たに加えられた溶液を混台するために、前後に振盪する。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充したmlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc．Gaithersburgにより配布される昆虫細胞培養法およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加え、そして青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、手短な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35 mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させるために用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存する。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウイルスV-HTTER36に感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II 培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換える。42時間後、５μ Ciの³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加する。細胞をさらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により収集し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。実施例３ CHO 細胞における組換えHTTER36の発現ベクターpC1を、HTTER36タンパク質の発現のために使用する。プラスミドpC1 はプラスミドpSV2-dhfr[ATCC受託番号第37146号]の誘導体である。両プラスミドはSV40初期プロモーターの制御下のマウスdhfr遺伝子を含む。これらのプラスミドで形質転換されたジヒドロ葉酸活性を欠如したチャイニーズハムスターの卵巣または他の細胞を、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地(alpha mi nus MEM，Lift Technologies)で細胞を増殖させることにより選択し得る。メトトレキサート（MTX）耐性の細胞におけるDHFR遺伝子の増殖は十分に考証されている(例えば、Alt，F.W.，Kellems,R.M.，Bertino，J.R.,およびSchimke，R.T. ，1978，J．Biol．Chem．253:1357-1370，Hamlin，J.L.およびMa，C．1990，Bio chem．et Biophys．Acta，1097:107-143，頁，M.J.およびSydenham，M.A．1991 ，Biotechnology第9巻:64-68を参照のこと)。漸増濃度のMTXにおいて増殖した細胞は、DHFR遺伝子の増幅により、標的酵素、DHFRを過剰産生することにより薬剤耐性となる。第２の遺伝子がdhfr遺伝子に結合される場合、それは通常、同時に増幅されそして過剰発現される。細胞株が1,000コピーを超える遺伝子を保有するように発育させることは、当該分野の状況である。次いで、メトトレキサートが除去される場合、細胞株は１つまたはそれ以上の染色体に組み込まれた増殖した遺伝子を含む。目的の遺伝子の発現のためのプラスミドpN346は、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)の強力なプロモーター(Cullenら，Molecular and Cellular Biology ，March 1985，438-447)およびヒトサイトメガロウイルス(CMV)の即時初期遺伝子のエンハンサーから単離したフラグメント(Boshartら，Cell 41:521-530，198 5))を含む。プロモーターの下流は遺伝子の組み込みが可能な以下の１つの制限酵素切断部位である：BamHI、PvuIIおよびNrul。これらのクローニングサイトに続いて、プラスミドは、３つのリーディングフレーム全ての中に翻訳終止コドンを含み、続いて３’イントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含む。他の効率の高いプロモーター、例えば、ヒトβ-アクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーターまたは他のレトロウイルス（例えば、HIVおよびHTLVI）からの超末端反復もまた発現に使用され得る。mRNAのポリアデニル化のために他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子）がまた同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定した細胞株はまた、gpt，G 418またはハイグロマイシンのような選択マーカーの同時トランスフェクションにより、選択され得る。最初に１つより多い選択マーカー（例えばG418およびメトトレキサート）を使用することは好都合である。プラスミドpN346を制限酵素BamHIで消化し、次いで、当該分野で公知の手順でウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化した。次いでベクターを１％アガロースゲルから単離した。 HTTER36をコードするDNA配列（ATCC第97349号）を遺伝子の５’および３’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した：５’プライマーは配列５’ACAGCGGATCCAGCCACCATGCTTCGTTTCTTGCCA３’（配列番号７）を有し、そしてBamHI制限酵素部位（太字）続いて翻訳のための効率なシグナル(Kozak，M.,上記)および遺伝子の最初の18ヌクレオチド(翻訳のための開始コドン「ATG」に下線力が引かれる)を含む。３’プライマーは配列５’TCCTTCGGATCCCATTTCTGACATCCTACCCACACCCACA３’（配列番号８）を有し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位ならびに遺伝子の３’翻訳および非翻訳配列に相補的な29ヌクレオチドを含む。増幅したフラグメントを上記のように１％アガロースゲルから単離し、次いでエンドヌクレアーゼBglIIにより消化し、次いで再度１％アガロースゲルで精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼにより連結した。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして制限酵素BamHI を使用して正方向に挿入されたプラスミドpN346を含んだ細菌を同定した。 CHO-dhfr-細胞のトランスフェクション活性DHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェクションに使用した。５μgの発現プラスミドN346を、0.5μgのプラスミドpSVneoと共にリポフェクション法（Felgnerら,上記）を用いて同時トランスフェクトした。プラスミドpSV2-neoは優位な選択マーカー、G418を含む抗生物質群に耐性を与える酵素をコードするTn５からのneo遺伝子を含む細胞を、１mg/ml G418を補充したalpha minusMEMに播種した。２日後、細胞をトリプシン処理し、そしてハイブリドーマクローニングプレート(Greiner，Germany)に播種し、そして10〜14日培養した。この期間の後、１つのクローンをトリプシン処理し、次いで種々の濃度(25，50nm，100nm，200nm，400nm)のメトトレキサートを使用して、６ウェルペトリディッシュに播種した。最も高濃度のメトトレキサートで増殖したクローンを、次いでさらに高い濃度のメトトレキサート(500nM，1μM，2μM，5μM)を含む新しい６ウェルプレートに移した。クローンが100μM濃度に増殖するまで同じ手順を繰り返した。所望の遺伝子産物の発現をウエスタンブロット分析およびSDS-PAGEにより分析した。実施例４遺伝子治療を介した発現線維芽細胞を皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を組織培養培地におき、そして小片に分離する。組織の小さな塊を、組織培養フラスコの湿った表面におき、それぞれのフラスコには約10片をおく。フラスコを逆さまにし、きつく閉め、そして室温に一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを逆さまにし、組織の塊をフラスコの底に固定したまま、そして新鮮な培地（例えば、10％FBS 、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むHamのF12培地）を加える。次に、これを37℃で約一週間インキュベートする。この時、新鮮な培地を添加し、続いて数日おきに交換する。さらに約２週間の培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコに入れる。モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復によって隣接されているpMV-7（Kir schmeier，P,T,ら、DNA、7:219-25(1988)）を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、次いでウシ小腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをアガロースで分画化し、そしてガラスビーズを用いて精製する。本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、おのおの５’末端配列および３’ 末端配列に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。５’プライマーはEcoRI部位を含み、そして３’プライマーはHindIII部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線形骨格および増幅したEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、T4 D NAリガーゼの存在下一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物は、細菌HB 101を形質転換するために使用される。この細菌は、次にベクターが目的の遺伝子を適切に挿入したことを確認する目的で、カナマイシン含有寒天にプレートされる。両種向性pA317またはGP+am12パッケージング細胞を、組織培養で、10％ウシ血清（CS）、ペニシリン、およびストレプトマイシン添加のDulbecco改変Eagle培地（DMEM）中、コンフルエントな密度にまで増殖させる。次に、この遺伝子を含むMSVベクターを培地に加え、パッケージング細胞をこのベクターで形質転換する。パッケージング細胞は、ここで、この遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージング細胞をここでプロデューサー細胞という）。新鮮な培地を形質転換プロデューサー細胞に加え、続いて、培地をコンフルエントなプロデューサー細胞の10cmプレートから回収する。感染性ウイルス粒子を含む消費培地を、ミリポアフィルターを通じて濾過し、剥離したプロデューサー細胞を除去し、そして、次にこの培地を、線維芽細胞を感染させるために使用する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去し、そして即座にプロデューサー細胞由来の培地と交換する。この培地を除去し新鮮な培地と交換する。ウイルス力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は必要ない。力価が非常に低い場合は、neoやhisのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。次に操作された線維芽細胞を、単独またはcytodex 3 microcarrier beads上でコンフルエンスに増殖させた後、宿主に注入する。ここで、線維芽細胞はタンパク質産物を生成する。本発明の多くの改変および変形が上記の教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載された以外にも、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 39/395 45/00 48/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/495 48/00 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/495 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 16/22 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 21/08 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/68 37/24

Claims

【特許請求の範囲】１．以下からなる群から選択されるメンバーと少なくとも75％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド：（a）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（b）配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸348の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（c）配列番号２のアミノ酸235〜348を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（d）（a）、(b)または(c)のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；および（e）（a）、(b)、(c)または（d）のポリヌクレオチドの少なくとも15塩基を含むポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．配列番号１のヌクレオチド１〜ヌクレオチド1213を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。６．配列番号１のヌクレオチド89〜ヌクレオチド1213を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。７．配列番号１のヌクレオチド791〜ヌクレオチド1213を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．配列番号２のアミノ酸235〜348を含む、ポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．以下からなる群から選択されるメンバーと少なくとも75％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド：（a）ATCC受託番号97349号に含まれるヒトcDNAにより発現される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（b）ATCC受託番号97349号に含まれるヒトcDNAにより発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（c）（a）または（b）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；および（d）（a）、（b）または(c)のポリヌクレオチドの少なくとも15塩基を含むポリヌクレオチド。１０．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号97349号に含まれるポリヌクレオチドであり、これが成熟HTTER36を発現する、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。１１．請求項２に記載のDNAを含むベクター。１２．請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。１３．ポリペプチドを産生するためのプロセスであって：請求項１２に記載の宿主細胞から前記DNAによってコードされるポリペプチドを発現させる工程、を包含する、プロセス。１４．請求項１１に記載のベクターを前記細胞に導入する工程を包含する、ポリペプチドを発現する細胞を産生するためのプロセス。１５．以下からなる群から選択されるメンバーを含むポリペプチド：（a）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（b）配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸348を含むポリペプチド（c）配列番号２のアミノ酸235〜アミノ酸348を含むポリペプチド；および（d）（a）、（b）または（c）のポリペプチドに少なくとも70％同一であるポリペプチド。１６．請求項１５に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１５に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。１８．請求項１５に記載のポリペプチドに対するアゴニスト。１９．前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸235〜アミノ酸348を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。２０．HTTER36の必要性を有する患者の処置のための方法であって：請求項１５に記載のポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。２１．前記ポリペプチドの治療的有効量が、前記患者に該ポリペプチドをコードするDNAを提供し、そしてインビボで該ポリペプチドを発現させることにより投与される、請求項２０に記載の方法。２２．HTTER36を阻害する必要性を有する患者の処置のための方法であって：請求項１７に記載のアンタゴニストの治療的有効量を該患者に投与する工程、を包含する、方法。２３．宿主由来の試料中の請求項１５に記載のポリペプチドの存在を分析する工程を包含する、診断プロセス。