JP6000353B2 - プラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体 - Google Patents
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Description
(i)本発明によるプラスミン変異体を準備すること、および野生型プラスミンを準備することと、
(ii)(i)で準備した変異体プラスミンおよび野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性を比較することと、
(iii)タンパク質分解活性を保持し、かつ野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性と比較して、自己タンパク質分解に対する安定性が増大している変異体を、(ii)から選択することと
を含む方法に関する。
(i)本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
(ii)(i)で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
(iii)(ii)で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと
を含む方法に関する。
(i)本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
(ii)(i)で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
(iii)(ii)で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと、
(iv)(iii)のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化するステップと
を含む方法に関する。
− 疎水性の脂肪族アミノ酸:Met、Ile、Leu、およびVal
− 疎水性の芳香族アミノ酸:Phe
− 親水性の酸性アミノ酸:Asp、Glu、Asn、およびGln
− 親水性の塩基性アミノ酸:Arg、Lys、およびHis
− 中程度疎水性の脂肪族アミノ酸:Gly、Ala、Ser、Thr、Cys、Pro
− 中程度疎水性の芳香族アミノ酸:TyrおよびTrp。
(i)本発明によるプラスミン変異体を準備すること、および野生型プラスミンを準備することと、
(ii)(i)で準備した変異体プラスミンおよび野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性を比較することと、
(iii)タンパク質分解活性を保持し、かつ野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性と比較して、自己タンパク質分解に対する安定性が増大している変異体を、(ii)から選択することと
を含む方法に関する。
(i)本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
(ii)(i)で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
(iii)(ii)で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと
を含む方法に関する。
(i)本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
(ii)(i)で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
(iii)(ii)で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと、
(iv)(iii)のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化するステップと
を含む方法に関する。
発現ベクター
Invitrogen Corporation(Carlsbad,California)から購入したpPICZαA分泌ベクターを、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)において組換えヒトマイクロプラスミノーゲンの発現および分泌を導くために使用した。
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)におけるヒトマイクロプラスミノーゲンの発現を改善するために、ヒトマイクロプラスミノーゲンおよびその変異体をコードする遺伝子を、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)の好ましいコドン使用頻度を考慮して、新たに合成した。
マイクロプラスミノーゲン変異体および活性化されたマイクロプラスミン変異体は、国際公開第02/50290号パンフレットの実施例2に概説される手順に基本的に従って得られる。
配列番号19−野生型ヒトマイクロプラスミノーゲンのアミノ酸配列
APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN
配列番号20−ピチア(Pichia)における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有する人為的な核酸配列核酸配列は、配列番号19の野生型ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列をコードする。
GCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAAGAAGCACAATTACCTGTGATTGAGAACAAGGTTTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTGTTCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGTAACAACTAA
配列番号23−Val1Ile置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体(突然変異したコドンは下線付きの太字イタリック体で示す)
種々のマイクロプラスミン突然変異体について得られたkcatおよびKmを以下の表1に収載する。
2.1 脳梗塞サイズに対するプラスミン変異体の効果
国際公開第00/18436号パンフレットの実施例2に記載されるように、またはWelshら(1987,J Neurochem 49,846−851)に従って、脳梗塞サイズの低減における本発明のプラスミン変異体の有効性を、マウスの脳梗塞モデルで検討することができる。脳梗塞サイズに対する野生型プラスミンの有益な効果は、国際公開第00/18436号パンフレットの実施例5で実証された。同様の実験を本発明の任意のプラスミン変異体を用いて実施し、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定して野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
ウサギの体外ループ血栓溶解モデル(国際公開第02/50290号パンフレットの実施例6;Hotchkiss et al.,1987,Thromb Haemost 58,107−Abstract 377)、イヌの冠動脈回旋枝の銅コイル誘導血栓症モデル(国際公開第02/50290号パンフレットの実施例8;Bergmann et al.,1983,Science 220,1181−1183)、またはウサギの頚静脈血栓症モデル(Collen et al.,1983,J Clin Invest 71,368−376)を、本発明のプラスミン変異体のin vivo血栓溶解活性を実証するために使用することができる。国際公開第00/18436号パンフレットの実施例7および9、ならびにCollenら(1983)により記載されるように、これらのモデルを用いて血栓溶解に対する野生型プラスミンの有益な効果が実証された。同様の実験を本発明の任意のプラスミン変異体を用いて実施し、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定して野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
末梢動脈閉塞(PAO)のin vitroモデルが、国際公開第01/36609号パンフレットの実施例6に記載されており、野生型プラスミンの血栓溶解の有効性がこのモデルで実証された。同様の実験を本発明の任意のプラスミン変異体を用いて実施し、末梢動脈閉塞の血栓溶解に対するこれらのプラスミン変異体の有益な効果を測定して野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
国際公開第2004/052228号パンフレットの実施例5は、死後のブタの眼における硝子体液化に関するマイクロプラスミンの効果と、その効果を測定するためのアッセイについて開示している。国際公開第2004/052228号パンフレットの実施例6は、死後のヒトの眼における後部硝子体剥離(PVD)の誘導に関するマイクロプラスミンの効果と、その効果を測定するためのアッセイについて開示している。本発明のプラスミン変異体による硝子体液化およびPVDの誘導を、同様の死後モデルで実証する。
国際公開第2004/052228号パンフレットの実施例7は、in vivoネコモデルにおけるPVD誘導に関するマイクロプラスミンの効果と、その効果を測定するためのアッセイについて開示している。本発明のプラスミン変異体によるPVD誘導を、同様のin vivoモデルで実証する。
後部硝子体剥離(PVD)に対するV1Iマイクロプラスミン変異体の効果を、硝子体内注射の後に調べた。手短に言えば、成体C57BL/6マウスをネンブタール(0.6mg/kgの体重)で麻酔した。硝子体内注射は、眼内注射キット、35G斜角注射針を備えた10μl注射器、およびマイクロポンプ注射装置を使用して行った。野生型マイクロスプラスミンまたはV1Iミルコプラスミン変異体のいずれかを種々の濃度で含有するビヒクル1μlの各注射を、足踏スイッチを踏みながら解剖顕微鏡下で実施した。針先を強膜後部から縁郭に通して、水晶体に接触しない位置に置いた。足踏スイッチを踏むことにより、硝子体中央の腔に注射される製品を噴出させた。
注射5日後における、V1Iを注射した眼の代表的な光学顕微鏡画像を図3に示す。PAS染色した眼球切片では、V1Iの注射後における、網膜表面からの硝子体の剥離が示された。マイクロプラスミンを注射した動物では、V1I注射後の約50%のPVD誘導と比較して、約20%のPVD誘導が示された(表2)。PVD誘導における、この2倍〜3倍の明らかな増大は、試験したすべての濃度で観察された。
Claims (20)
- 単離プラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られるプラスミン変異体、または単離プラスミン変異体、であって、前記変異体は、配列番号19に示される配列(配列中のプラスミン触媒ドメインが、位置1のアミノ酸バリンのアミノ酸イソロイシンへの変異を含む)を含み、該プラスミン触媒ドメインは、ヒトプラスミン触媒ドメインであり、ヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562に存在するバリンアミノ酸と同じである、位置1のアミノ酸バリンから始まるものである、プラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。
- (i)プラスミン触媒ドメインに対して位置−1にあるアミノ酸が、アルギニン、リジン、または活性部位の機能性を維持する他のアミノ酸であり、かつ(ii)前記ヒトプラスミン触媒ドメインの位置24にあるアミノ酸が、メチオニンである、請求項1に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。
- 前記ヒトプラスミン触媒ドメインの位置24にあるアミノ酸が、メチオニンである、請求項1に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。
- 前記突然変異が、発色性基質または生物学的基質による活性アッセイで測定すると、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度を、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度に比較して低減する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。
- 自己分解速度定数が、野生型プラスミンの自己分解速度定数の最大で95%であることをさらに特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプラスミン変異体。
- 触媒定数kcatが、野生型プラスミンのkcatの10%〜200%の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプラスミン変異体。
- 自己分解速度定数が野生型プラスミンの自己分解速度定数の最大で95%であり、触媒定数kcatが野生型プラスミンのkcatの10%〜200%の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプラスミン変異体。
- 前記プラスミン触媒ドメインの位置147のアミノ酸リジンの、アミノ酸グルタミンへの変異をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。
- プラスミンタンパク質分解活性を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のプラスミンの誘導体であって、前記プラスミンが、1つまたは複数のクリングルドメインを欠く短縮プラスミンおよび/または1つまたは複数のクリングルドメインの一部を欠く短縮プラスミンであり、該プラスミン誘導体の触媒ドメインの機能が保持される、プラスミン誘導体。
- プラスミンタンパク質分解活性を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のプラスミンの誘導体、または請求項9に記載のプラスミン誘導体であって、該プラスミンが標識化もしくはペグ化されているか、または、該誘導体がハイブリッドもしくはキメラ分子に含まれるものである、誘導体。
- 可逆的に不活性な、請求項1〜8のいずれか一項に記載のプラスミンの誘導体であって、該可逆的な不活性化が、アシル化または非最適pHによって起こる、プラスミン誘導体。
- 前記プラスミノーゲンまたはプラスミンが、Glu−プラスミノーゲンまたはGlu−プラスミン、Lys−プラスミノーゲンまたはLys−プラスミン、ミディプラスミノーゲンまたはミディプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンである、請求項1〜11のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
- 薬剤として使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはそれらの任意の組合せ。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはそれらの任意の組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体、または補助剤の少なくとも1つを含む組成物。
- 抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、有糸***阻害剤、抗ヒスタミン剤、または麻酔剤の少なくとも1つをさらに含む、請求項14に記載の組成物。
- 請求項1〜8、12および13のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
(i)請求項1〜8、12および13のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
(ii)(i)で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
(iii)(ii)で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと
を含む方法。 - 請求項1〜8、12および13のいずれか一項に記載のプラスミン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
(i)請求項1〜8、12および13のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
(ii)(i)で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
(iii)(ii)で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと、
(iv)(iii)の前記プラスミノーゲンをプラスミンに活性化するステップと
を含む方法。 - 請求項1〜8、12および13のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離した核酸。
- 請求項18に記載の核酸を含む組換えベクター。
- 請求項18に記載の核酸または請求項19に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
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