PT87394B

PT87394B - Processo para a transformacao de tecidos vegetais

Info

Publication number: PT87394B
Application number: PT87394A
Authority: PT
Inventors: Sharon Clarice Harvey Alfinito; Paul Shartzer Dietrich; Lynn Ellen Murry; Ralph Michael Sinibaldi
Original assignee: Sandoz Sa
Priority date: 1987-05-05
Filing date: 1988-05-03
Publication date: 1992-09-30
Also published as: CA1328236C; ES2061720T3; EP0290395A3; CN1030442A; DK240088D0; ZA883238B; IL86245A0; EP0290395B1; EP0574356A1; IE940815L; IL86245A; DE3887375T2; PL272245A1; IE881323L; DE3887375D1; BR8802175A; EP0290395A2; DK240088A; NZ224470A; JPS63301792A

Description

I I

A invenção refere-se ao processo para transformar material celular de origem vegetal compreendendo fazer-se contactar o referido material com uma solução de transformação compreendendo DNA e um agente que provoca o atravessamento das membranas das células na presença duma corrente eléctrica durante um intervalo de tempo para efectuar a transformação e se obter material celular de origem vegetal transformado e plantas férteis. A invenção proporciona também material celular de origem vegetal, em particular, proveniente de milho.

A presente invenção refere-se a um processo para a introdução de DNA para dentro de células de plantas monoI cotiledóneas (monocot) e dieotiledóneas (dicot) utilizando uma corrente eléctrica para o transporte do DNA. 0 processo proporciona a transferência directa do plasmídio DNA para o tecido de plantas monocotiledóneas e dieotiledóneas intactos

ENQUADRAMENTO GERAI DA INVENÇÃO

A transformação genética das plantas foi conseguida

até hoje de dois modos diferentes. Ambos, no entanto, têm limitações quando sao aplicados a plantas monocotiledóneas e, em particular, no que diz respeito a colheitas de valor comercial, tais como os cereais.

primeiro destes métodos baseia-se na capacidade de uma região do plasmídio de indução de tumor (Ti) de micróbios do solo do género Agrobacterium se fundir com o genoma de uma célula hospedeira a infecção da espécie hospedeira com uma bactéria. No entanto, como as plantas monocotiledóneas são geralmente não susceptíveis a este microrganismo, o método tem-se limitado à transformação de plantas dicotiledóneas. Muito embora a transformação genética do Asparagus usando este método tenha sido descrita ffio 86/ /037767 e Grimsley et al,(Nature 325 (1987) 177) refira a transferência do DNA para cereais por meio de Agrobacterium não tendo sido ainda demonstrado que a transformação real, isto é, a absorção e a integração do DNA exógeno pelo genoma da célula hospedeira ou a expressão de novas características pretendidas possa ocorrer.

segundo método envolve a absorção directa de ácidos nucleicos por protoplastos das plantas. Essa absorção pode ser conseguida, tanto quimicamente, isto é, a absorção estimulada por polietilenoglicol como descrito por Daszkowski et al Meth Enzym 118 (1986) 668, como pelo uso de impulsos de alta tensão eléctrica de duração de microssegundos. Esta última técnica foi descrita ou como electroporação como por electroinjecção e acredita-se actuar por formação de fissuras transientes na membrana de células de origem vegetal através das quais os ácidos externamente forneci dos podem facilmente passar. Ver, por exemplo, Fromm et al, PNAS 82 (1985) 5824, Eromm et al, Nature 319 (1986) 791 e WO 87/06614. No entanto, o sucesso deste método depende da capacidade de se regenerar uma planta fértil madura a partir de um protoplasta, uma característica que nos cereais tem

- 3 sido demonstrada apenas no arroz. Têm sido feitas tentativas no sentido de regenerar protoplastas de milho para obter ção de plantas férteis, por exemplo, Graves et al, Theor App Genet 54 (1979) 209, mas elas têm-se mostrado infrutíferas.

Também se realizaram investigações utilizando o método de electroporação no sentido de transferir o RNA livre para células de plantas dicotiledóneas. Morikava et al, Gene 41 (1986) 121, demonstraram que o RNA proveniente do Virus Mosaico do Tobaco (TMV) pode ser absorvido por todas as células mesofílicas da planta dicotiledónea Nicotiana. Afirma-se que este método, no entanto, utilizado em células individuais produz células com uma baixa taxa de sobrevivência e não foi claramente demonstrado que as células hospedeiras sejam de facto transformadas em vez de infectadas. Posteriormente, mesmo que a electroporação venha a ser bem sucedida em células monocotiledóneas individuais no futuro ainda se mantém o problema de regenerar as plantas completas particularmente plantas de milho férteis, a partir de células individuais.

DEFINIÇÕES

Ao descrever a presente invenção, a terminologia empregada.pretende-se que seja usada de acordo com a sua significação corrente usada na técnica. Tendo em conta que alguns dos termos usados não existem ou são ambíguos, as seguintes definições servem para controlo:

”electrotransformação”: refere-se à utilização de uma corrente eléctrica contínua invariável, de longa duração, para a indução da absorção de DNA numa espécie hospedeira ou células recipientes e a subsequente integração do referido material genético na genoma da espécie hospedeira;

tecido vegetal: refere-se a uma população de células ;

embrião: refere-se à fase de desenvolvimento na qual orgãos específicos ou sistemas de órgãos, tais como raízes e rebentos, não estão visivelmente diferenciados nos compartimentos de células, que darão origem a órgãos diferenciados já estão presentes;

calo: aglomerado de células vegetais resultante da cultura de tecidos a partir de uma única célula vegetal h ou de tecido,

CK(3O): trata-se de um meio artificial para milho, I cuja composição se ilustra na Tabela A;

MTM: trata-se de um meio líquido artificial usado na preparação de culturas de cabelo de milho, cuja composição é descrita por Pareddy, Greyson e Walden; Planta 170 (1987) 141,

BSS é um meio líquido artificial para tiras do caule de Brassica, cuja composição se ilustra na Tabela B;

TMM é um meio artificial para a cultura de embriões de tomateiro cuja composição se ilustra na Tabela B;

um protoplasto é uma célula vegetal de .que a parede celular foi removida, usualmente por digestão enzimática, mas a qual é limitada por uma membrana celular;

meristema ou tecido meristemático é constituído por células completamente capazes de divisão posterior, originando por sua vez tecido embrionário primário ou secundário;

genoma: tal como é usado na presente memória descritiva refere-se ao material genético encontrado na célula, tanto cromossómicos como extracromossómico;

uma célula transformada” por DNA é uma célula que contém o mencionado DNA ou um seu descendente por mitose ou meiose, que ainda retém a sequência do citado DNA no seu genoma;

agentes de atravessamento das membranas são agentes conhecidos tal como os usados nas células de mamíferos.

A presente invenção refere-se a um método para transformação de um tecido vegetal mediante a introdução de DNA nas células dos referidos tecidos, fazendo-se con' tactar o material das células com uma solução de transformação compreendendo DNA e um agente de atravessamento de membranas na presença duma corrente eléctrica durante um intervalo de tempo suficiente para efectivar a transformação.

método desta invenção tem numerosas vantagens.

Permite a penetração de numerosas camadas de células de tal maneira que se torna possível de preferência o uso de tecidos completos em vez de células individuais. As células não são danificadas; mantêm a sua viabilidade e podem ser usadas na produção de plantas férteis, perfeitamente desenvolvidas. 0 método permite também a transformação de plantas férteis que não tinham sido previamente transformadas com êxito. A invenção também se refere a um método para se produzir uma planta fértil transformada caracterizado por compreender fazer contactar as células vegetais com uma solução de transformação compreendendo DNA e um agente de atravessamento das membranas das células em presença de uma corrente eléctrica durante um intervalo de tempo suficiente para efectuar a transformação e cultivar as células das plantas assim transformadas sob condições de cultura.

No sentido de distinguir o processo de transformação de acordo com a presente invenção das chamadas técnicas de electroporosidade ou electroinjecção, nas quais se usam

curtos impulsos (em geral, da ordem de alguns /us até cerca de 400 milissegundos) de corrente eléctrica, este processo de transformação é definido como electrotransformação.

Consequentemente, a presente invenção usa a aplicação de uma força electromotriz mais constante e longa (tensão), cujo objectivo é conduzir ou transportar o DNA através da membrana celular e para dentro da célula, cuja permeabilidade é suficientemente intensificada pelo agente de atravessamento de membrana.

Para a electrotransformação de acordo com a presente invenção, qualquer material vegetal pode ser utilizado. Assim, por exemplo, a presente invenção pretende levar a cabo a transformação de tecidos vegetais, embriões vegetais, tecidos meristemáticos tais como meristema da cabeleira ou das espigas de milho, botões axilares, troncos desnudados, calos ou suspensões de células. Quando se usa tecido embrio nário de milho, é preferível que o embrião tenha atingido o estágio 3 de desenvolvimento, como é definido por Abbe e Stein em Am J. Botany 41 (1954) 286-287, isto é, num estágio de desenvolvimento entre 22 e 28 dias após a polinização. Um embrião de milho no estágio 3 tem tipicamente cerca de 3 mm de comprimento e o tecido de nódulo lamelar é reconhecido externamente pelas duas constrições que sobressaem. Dentro do coleorrizoma, a raiz principal tornou-se reconhecível e dentro do coleoptilo, a primeira e a segunda folhas aumentaram consideravelmente de tamanho. Este estágio é caracterizado pelo facto de o primórdio da terceira folha ter nascido recentemente. È conveniente que o material vegetal usado esteja convenientemente na forma cortada.

processo da invenção é convenientemente levado a cabo empregando-se um sistema de electroforese em gel horizontal, por exemplo, um sistema de electroforese em gel de agarose, no qual o material vegetal a ser transformado e o

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- 7 DNA gão colocados em compartimentos de tal forma que a corrente eléctrica passe do DNA para o material vegetal.

Quando se usa um tecido embrionário, é preferível que o embrião seja posicionado no compartimento de tal forma que o tecido meristemático fique voltado para os compartimen tos com a solução de transformação. Uma solução contendo o DNA,(que, com o fim de facilitar a selecção num estágio posterior pode compreender, por exemplo, uma sequência de DNA que codifica para a resistência a um antibiótico específico) e um agente de atravessamento de membrana são então posicionados em compartimentos adjacentes aos que contêm o material celular de origem vegetal. Os agentes de atravessamento de membrana preferidos são os polares, de maneira que são trans portados em associação com o DNA, para e através da membrana celular quando a tensão eléctrica é aplicada. Exemplos adequados de agentes de atravessamento de membranas incluem DMSO, lisolecitina e detergentes, tais como dodecil-sulfato de sódio e Triton-Σ, de preferência, usa-se DMSO (sulfóxido de dimetilo). Usam-se concentrações dos agentes de atravessamento das membranas que sejam suficientes para conferir permeabilidade temporária à membrana mas sem destruir a integridade das membranas dos organitos intracelulares. Essas concentrações podem variar dentro de largos intervalos dependendo do material vegetal envolvido. Os materiais celulares de origem vegetal mais resistentes, tais como materiais de células de plantas dicotiledóneas podem, por exemplo, resistir a uma concentração de 10/ de DMSO. Geralmente, obtêm-se bons resultados com o agente de atravessamento de membranas empregado em concentrações de 1/ a 4/, de preferência, 2/ em peso da solução de transformação. Pode opcionalmente incluir-se um corante de rasteamento na solução de transformação com o fim de seguir o progresso dos vectores a serem controlados. Como exemplos de inibidores de rastreamento podem referir-se azul de bromofenol, verde de bromocresol ou xileno-cianol. Esses corantes e o seu uso são bem conhecidos na técnica. É aplicada uma corrente eléctrica de baixa tensão tal que provoca o deslocamento na direcção entre o compartimento que contém os vectores e o compartimento com o material celular. Posteriormente, os tecidos são lavados com um líquido estéril e colocado num meio sólido no sentido de recuperarem de algum trauma que eventualmente esteja associado com o processo de electrotransformação. 0 intervalo de tempo que demora no meio sólido depende da idade e do tamanho dos tecidos tratados e os tecidos mais novos e/ou mais pequenos podem requerer um período de recuperação maior antes de serem submetidos ao processo de selecção. Os tecidos são assim normalmente mantidos no meio durante dois a três dias, após o que se seleccionam os tecidos transformados com sucesso, processo esse que pode, se o vector de transformação contiver uma sequência de DNA que codifica para resistência a um antibiótico específico, consistir na exposição dos tecidos a este antibiótico específico. Os tecidos que germinam (desenvolvem raízes e rebentos, no caso de embriões) ou crescem e desenvolvem clorofila no meio de selecção adquiriram resistência ao antibiótico por absorção e incorporação de DNA transformador.

í

A força electromotriz (tensão) aplicada deve ser suficiente para ajudar a realizar o transporte do DNA e não exceder uma tensão à qual se dá a danificação substancial das células. A tensão a empregar pode variar dentro de intervalos amplos e depende de vários factores, tais como o tipo e a forma do material de origem vegetal usado e o tempo durante o qual a tensão é aplicada. Assim, 50% dos embriões de milho sobrevivem quando submetidos a uma tensão de 200 V durante 5 minutos num sistema de electroforese em gel horizontal, tal como se descreve no Exemplo 1. (0 milho é praticamente a mais resistente das plantas monocotiledóneas

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- 9 e as dicotiledóneas sobrevivem geralmente melhor do que as monocotiledóneas). Tensões até 110 V podem ser usadas sem que ocorram riscos sérios de danificação dos embriões, muitc embora a germinação possa ser atrasada. Tensões superiores a 200 V devem na generalidade ser evitadas. Por outro lado, a transformação pode ainda ser obtida com tensões tão baixas como 8 V. Geralmente, obtêm-se resultados satisfatórios quando se aplicam tensões eléctricas de 40 V a 140 V, por exemplo, de 50 V a 140 V, de preferência desde cerca de 50 V a 110 V e mais preferivelmente de 52 V a 80 V. No sistema de electroforese em gel usado nos Exemplos, os eléctrodos estão a 18 cm de distância um do outro. Assim, a apli cação de tensão de, por exemplo, 50 V nesse sistema origina uma intensidade de campo eléctrico de 50 V/18 cm ou 2,78 V/ /cm. Este valor dá uma ideia da ordem de grandeza da intensidade do campo eléctrico aplicado. A intensidade de corrente eléctrica produsida nesses sistemas depende, entre outros factores, da solução de transformação (gel, etc.) e das tensões aplicadas. No sistema de electroforese empregado no Exemplo 1, à tensão de 52 V gera-se uma corrente eléctrica de cerca de 25 mA.

intervalo de tempo de exposição à corrente eléctrica depende de vários factores, tais como a distância entre os compartimentos que contêm os tecidos e os compartimentos que contêm a solução de transformação e também do tamanho da amostra de tecido. Assim, o período mínimo de tempo é o necessário para que o DNA existente na solução de transformação, sob a influência do campo eléctrico, se escoe para a área do gel compreendendo as amostras de material vegetal. Dor exemplo, se a distância entre os dois conjuntos de compartimentos fôr igual a 1 mm no início da passagem de corrente, sob uma tensão de 52 V, demora entre 13 a 15 minutos, para que a solução de transformação se desloque para além de um embrião de milho e demora cerca de 20

- 10 minutos para que a solução atravesse um tecido maior tal como uma cabeleira inicial. Geralmente, consegue-se a transformação com bons rendimentos depois de exposição a uma tensão eléctrica durante 5 a 25 minutos, particularmente, durante 10 a 20 minutos.

A distância entre os dois conjuntos de compartimentos, isto é, aqueles que contêm as amostras de tecidos e aqueles que contêm a solução de transformação, depende da concentração de solução de transformação e da concentração do gel de suporte de tal modo que a distância é preferivelmente mais elevada quando o gel é mais diluído.

DNA a ser empregado encontra-se convenientemente sob a forma de vector, de preferência sob a forma de plasmídio. Tal plasmídio é manipulado geneticamente usando técnicas habituais de DNA recombinante, bem conhecidas pelos peritos no assunto,no sentido de conter DNA com o qual se deseje transformar o tecido de origem vegetal.

DNA adequado para uso no processo desta invenção deve incluir qualquer DNA oriundo de uma fonte diferente da espécie hospedeira ou célula recipiente. Como exemplo de DNA que pode ser usado no processo de electrotransformação da presente invenção, pode então incluir DNA que codifica zeína (o armazenamento de proteínas de milho) ou promotores de tecidos específicos tais como os genes de milho, os quais podem ser usados em construções quiméricas. Um exemplo dum promotor pode ser o álcool deshidrogenase (ADH), o qual se pode induzir em raízes.

Uma classe preferida de DNA para uso no processo desta invenção pode ser classificado como DNA estranho. 0 termo ”DNA estranho” tal como é usado na presente memória descritiva, refere-se a um qualquer DNA oriundo de uma fonte diferente da espécie hospedeira ou da espécie recipiente. 0 DNA estranho inclui, por exemplo, DNA de origem vegetal

de plantas não hospedeiras, sequências sintéticas de DNA, sequências produzidas por técnicas de DNA recombinante, sequências de DNA bacterianas, fúngicas, virais e de animais, ou semelhantes.

DNA adequado pode incluir promotores de espécies vegetais não hospedeiras tais como promotores de DNA-T originados a partir de plasmídios Ti e Ri, promotores de vírus vegetais, tais como CáKV, TMV, BMV etc., e semelhantes. 0 DNA estranho adequado pode também incluir sequências estruturais estranhas para os genes, por exemplo, acetiltransferase de cloranfenicol (CAT), fosfotransferase de neomicina II (npt-Il), nopalina-sintase (nos), β-galactonidase (/-gal), o gene de resistência a glifosato (EPSP, que é uma enzima que confere resistência ao glifosato-5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintase) e genes do tipo Bacillus Thuringiensis que codificam uma proteína cristalina de toxi na de insectos. Ver, por exemplo, Adang et al, Gene 36 (1985) 289; Wong et al, Proc 9th Int Spore Cong (Hoch & Setlow Eds, 1985). Os exemplos de genes do tipo de Bacillus thuringiensis que codificam para uma proteína cristalina de toxinas de insectos incluem o gene B.t. var Kurstaki que codifica para uma proteína de toxina tóxica para larvas de lepidópteros particularmente Noctuidea mais especificamente Heliothis e Heliothis virescens e espécies de Spodoptera tais como Spodoptera exigua e Spodoptera frugiperda, e 0 gene B.t. var tenebrionis que codifica para uma toxina proteína tóxica para as pestes de Coleoptera, particularmente Chrysomelidae, mais particularmente espécies de Diabrotica tais como D Dongicornis, D undecimpunetata e D virgifera e espécies de leptinotarsa tal como D decemlineata, As espécies anteriormente mencionadas Heliothis, Spodoptera e Diabrótica são insectos nocivos que infectam culturas como 0 milho. 0 DNA estranho compreende também genes sintéticos, tal como sequências sintéticas de DNA basea· dos em genes de espécies vegetais hospedeiras naturais, por exemplo, um gene de zeína alterado de forma a alterar a composição do aminoácido da proteína de armazenamento no milho. 0 DNA estranho da presente invenção compreende preferivelmente construções quiméricas tais como combinações de promotores heterólogos / sequência estrutural. Os exemplos de tais construções heterólogous compreendem o gene de B.t. toxina sob o controlo do promotor ADH, e marcadores seleccionados com a CAI ou a sequência estrutural npt-II sob o controlo de um promotor de T-DNA ou de um promotor i CaMV. Essas combinações podem ser construídas de acordo com as técnicas recombinantes padrão, como as ilustradas em Maniatis et al, Molecular Gloning: A Daboratory Manual (1982) e DNA Gloning Vol I & II (D Glober, Ed 1985). Outras sequências ou combinações de DNA, que possam eventualmente ser usadas na presente invenção, são facilmente evidentes para um técnico vulgar conhecedor do assunto.

Numa forma de realização preferida, o material de origem vegetal é transformado por um gene marcador seleccionado de forma a que a identificação de tecidos transformados com sucesso seja facilitada. São exemplos de tais genes marcadores, por exemplo, genes que codificam para a resistência a antibióticos, (tais como kanamycin, higromicina, neomicina e cloranfenicol), genes que codificam para a resistência a herbicidas e genes para a cloração (por exemplo, o gene de antocianina). A presença de um gene que codifica para um antibiótico, por exemplo, permite a sobrevivência e o crescimento de células de origem vegetal transformadas num meio contendo o antibiótico selectivo.

Numa outra forma de realização preferida, o matéria, de origem vegetal é transformado por genes que codificam para características que tem um elevado valor comercial ou agrícola, tal como resistência a insectos, resistência a

herbicidas, resistência a vírus, resistência a fungos, ou para enzimas que interferem em particular com os processos bioquímicos, como aqueles que conduzem à síntese de aminoácidos essenciais.

Numa forma de realização particularmente preferida, o material de origem vegetal é transformado por DNA que contém um gene marcador seleccionável e uma ou mais sequências de DNA que codificam para outras propriedades características pretendidas. 0 uso de um gene marcador significa que o material transformado com sucesso pode facilmente dii j ferenciar-se de material não-transformado facilitando assim a escolha posterior do material que incorporou no seu genoma o gene ou genes cotransferidos que podem não ser facilmente seleccionáveis.

material de origem vegetal transformado de acordo com o método da invenção pode crescer e regenerar plantas férteis.

As plantas monocotiledóneas geneticamente transformadas férteis e saudáveis são novas. A invenção, por consequência, proporciona material de plantas monocotiledóneas compreendendo no seu genoma DNA oriundo de uma fonte diferen te da espécie hospedeira ou recipiente e capazes de regenerar plantas férteis saudáveis.

termo saudável, tal como é usado na presente memória descritiva, tem como finalidade distinguir as plantas da invenção das plantas que se encontram infectadas naturalmente por vírus e microrganismos semelhantes.

A invenção além disso proporciona plantas monocotiledóneas férteis saudáveis compreendendo no seu genoma DNA oriundo de uma fonte diferente da espécie hospedeira ou recipiente e respectivas partes particularmente sementes dessas plantas.

- 14 Os materiais de origem vegetal de plantas monocotiledóneas ou as plantas preferidas de acordo com a presente invenção são culturas da família das Gramineae, particularmente cereais incluindo arroz, trigo, painço, cevada, sorgo, centeio, aveia, tritical e milho e, mais particularmente, cereais seleccionados de entre trigo, painço, cevada, sorgo, centeio, aveia, tritical e milho e, mais especialmente, milho.

Deve, no entanto, também assinalar-se o facto de o método de acordo com a presente invenção ser também um método alternativo conveniente para a transformação de plantas dicotiledóneas que incluem as espécies Brassica oleracea, tomateiros, girassol, cenouras, abóboras, batatas, soja, algodão e semelhantes.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção mas não têm como objectivo limitar o seu âmbito.

As temperaturas são expressas em graus Celsius (°C) e as percentagens (%) em peso. A electrotransformação é essencialmente efectuada à temperatura ambiente podendo, no entanto, a temperatura do sistema de electroforese aumentar sob influência da tensão eléctrica.

TABELA. A

Meio CM(3O) (líquido ou sólido) í Sais MS mais importantes:

NH₄NO₃kno₃	1,65 g/1 1,90 g/1
CaCl₂.2H₂0	0,44 g/1
MgS0₄.7H₂0	0,37 g/1
kh₂do₄	0,17 gA

TABELA, A (Continuação)

Sais mínimos MS
h₃bo₃	6,20 mg/1
MnS0₄.H₂0	16,80 mg/1
ZnSO₄.7H₂O	10,60 mg/1
Kl	0,83 mg/1
Na₂Mo0₄.2H₂0	0,25 mg/1
CuSO₄.5H₂O	0,025 mg/1
CoC1₂.6H₂0	0,025 mg/1
Vitaminas
Tiamina HC1	0,25 mg/1
Ii-asparagina	13,2 mg/1
Glicina	7,7 mg/1
Ponte de Carbono
Sacarose	20 g/1
Agar (para sólido)	8 g/1
Água destilada para perfazer 1 litro
MS - Murashige e Skoogs
TABELA B
Meio BSS
Ί Mistura de sais Difco (4X)	500 ml/1
Ácido nicotínico	0,5 mg/1
Piridoxina HC1	0,5 mg/1
Tiamina HC1	1,0 mg/1
Inositol	100 mg/1

Μ^*

TABELA Β (Continuação)

Meio BSS

Ácido naftaleno-acético	0,2 mg/1
Fosfato de benzil-adenina	1,0 mg/1
Sacarose	30 g/1
Agar (para sólido)	16 g/1
Água destilada para perfazer 1	litro
pH ajustado a 5,8
Meio M
1 Mistura de sais Lifco^ (4X)	250 ml
Ácido nicotínico (0,5 mg/ml)	1 ml
Piridoxina HC1 (0,5 mg/ml)	1 ml
Tianina HC1 (0,5 mg/ml)	2 ml
Inositol (100 mg/ml)	1 ml
IAA (0,1 mg/ml)	5 ml
Sacarose	20 g
Agar (para sólido)	8 g

Água destilada até perfazer 1 litro pH ajustado a 6,0

A mistura de sais Difco é uma mistura comercialmente à venda de sais de Murashige e Skoogs (”MS”) mais importantes e mínimos e 4X refere-se à concentração da solução de armazenagem.

EXEMPLO I

Em cada um de oito compartimentos feitos em gel de agarose a 0,7$ coloca-se um embrião de milho (P 3780) cortado no estágio de desenvolvimento 3 (sincronizado em frigorífico durante 7 dias). Em cada um dos oito compartimentos adicionais, a 1 mm de distância e colocados paralelamente aos anteriores 8 compartimentos, coloca-se um volume de

- 17 ixr

15/il (10 >ug) de DNA plasmídio (H83E ou TI83R) com 2 alL de corante de azul de bromofenol e 2% DIASO, sendo o restante água destilada. 0 embrião é colocado no compartimento de tal. forma que o lado do embrião que compreende o tecido meristemático fica próximo do compartimento que contém a solução de transformação. Os plasmídios H83E e H83R contêm, cada um deles, o plasmídio pUC 8 com um promotor 35S do vírus mosaico de couve-flor (CaMV) /nucleotideos 7013 a 7436» ver Hohm et al, Curr Top Kicrobiol. Immunol. 96 (1982) 1937 com uma sequência que codifica a fosfotransferase de higromicina (HPT) Jõ fragmento Bam Hl de plG83> ver Gritz and Davies Gene 25 (1983), 3697 θ um acabador de nopalina-sintase (NOS) /nucleótidos 682 a 437» ver Bevan et al, Nucleic Acids Res 11 (1983) 3697· A sequência HPT está no mesmo sentido de orientação relativamente às sequências do promotor acabador no plasmídio H83E e na orientação em sentido oposto do plasmídio H83R.

Cada gel é colocado num sistema de electroforese em gel horizontal (BRL Ηβ) com 450 ml de tampão corrente de tris-acetato-EDTA esterilizado (pH 8,0). Os geles são submetidos a uma corrente eléctrica de 52 V, que passa no sentido do DNA para os embriões, durante um período de 10,

12,5 ou 15 minutos. Após a exposição, os embriões são lavados com 01/(30) esterilizado e colocados em meio C?.’(30) sólido durante 3 dias. Os embriões são então transferidos para meio CK(30) contendo. 100 ,ug/ml de higromicina. Os embriões são classificados ao fim de 11 e 14 dias, depois do tratamento de electrotransformação, com os seguintes resultados:

Ao fim de 11 dias todos os embriões tinham germinado (tinharc desenvolvido raízes e rebentos). Ao fim de 11 e 14 dias as plântulas da Tabela C estavam verdes, indicando aquisição de resistência à higromicina por incorporação do gene pLG83. 0 controlo (a) corresponde a tecidos transformados tal como nos ensaios mas depois do crescimento na ausência de higromicina; o controlo (b) corresponde a tecidos expostos à corrente eléctrica mas na ausência de solução de transformação e após crescimento em presença da higromicina. Os controlos seleccionados pela higromicina não transformados tornam-se brancos de giz e cessam de crescer.

TABELA C

Controlo Η83Ξ H83B.

Dia	íâl	íll	10	12,5	15 min	10	12,5	15 min
11	8	0	4	4	4	6	3	3
14	8	0	4	4	4	6	3	3

EXEMPLO 2

Após 14 dias a seguir ao tratamento com DNA plasmídio, as plântulas verdes (de germinação de sementes) de cada grupo de testes do Exemplo 1, são reunidas e moídas e extrai-se o ácido nucleico seguindo as técnicas com brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) descrito por Rogers et al Plant Mol Biol 5: (1985) 69.

tecido das plântulas colectado por cada grupo é moído até se obter um pó fino em azoto líquido ou em gelo seco e colocado num tubo de ensaio. A mistura é aquecida lentamente até 65°0 θ adiciona-se uma solução de CTAB /2% em peso/volume de CTAB, 100 mM de tris (pH 8,0), 20 mM de EDTA (pH 8,0), 1,4 M de NaCl e 1% de PVP (polivinilpirrolidonaj_7 na proporção de 1 /ul/mg, seguida de aquecimento a 65° durante 3 minutos. Um volume igual de sevag (CHCl^: :álcool isoamílico a 24:1) é adicionado e misturado. A mistura é centrifugada a 11 kx durante 30 segundos e a fase superior é transferida para um novo tubo, adicionando-se

- 19 CTAB (10% em peso/volume) e 0,7 M NaCl. Repete-se a centrifugação e a fase superior é novamente separada e diluída com CTAB e NaCl. Um volume de solução de tampão de precipitação CTAB /T% CTAB, 50 mM tris (pH 8,0) e 10 nM EDTA (pH 8,0) e 1M de NaC17 θ aquecido a 65° durante 10 minutos. Após rehidratação completa, os ácidos nucleicos são reprecipitados com dois volumes de etanol e então peletizados por centrifugação durante 13 a 15 minutos, num ambiente frio. Fizeram-se ensaios de todas as amostras em minigeles e evidenciaram a presença de DNA.

Para análises de formação de mancha, o DNA extraído é aquecido a 100°C, adiciona-se 20 x SSPE (3,6M de NaCl, 200 mM de NaHgPO^, pH 7,4, 20 mM EDTA, pH 7,4); a solução é então arrefecida e transferida para uma membrana de nitrocelulose. É hibridizado com DNA transferido por entalhe (BRI lot kit #5210 e H83E). Ver Rigby et al J Mol Biol 113 (1977) 237. A membrana de nitrocelulose é lavada em 2 x SSPE e 0,1% de SDS e então aquecida a 50° durante 1 hora, seguida por agitação em 1 x SSPE e 0,1% de SDS à temperatura ambiente durante 1 hora, e em seguida exposta a película de raios-x. Ver Kaniatis et al Molecular Cloning; A laboratory Manual (1983)· Os resultados indicam uma intensa hibridização e, por consequência, transformação ocorrida em 10% das amostras tratadas para formação de mancha.

EXEMPLO 3

Filamentos iniciais (coir. 1,0 a 1,5 cm de comprimento) de milho (cvx Oh 43 θ Se 6o) são dissecados assepticamente, tal como é descrito por Pareddy and Greyson Plant Cell Tissue Organ Cult 5: (1985) 119 e mantidas em meio MTM do tratamento de electrotransformação. Seguindo a técnica do Exemplo 1, os filamentos de. milho e a solução de transformação compreendendo ou a) 8/11 (10 Mg) de plasmídio

Ηδ3Ε> 2% de DMSO e 29 ,nl de água destilada, ou b) 15 /al (10/ug) de H83R plasmídio, 2% de DMSO e 22/ul de água destilada, são colocadas em 0,7% de gel agarose num dispositivo dum sistema de electroforese e expostas a uma corrente eléctrica provocada por 52 V durante 13 minutos. Em seguida, os filamentos de milho são removidos para meio CM(30) esterilizado com a adição de 50 ug/ml de gentamicina e são enxaguados cuidadosamente durante um pequeno período. A gentamicina actua como um agente anti-bacteriano. São então colocadas em frascos esterilizados compreendendo 50 ml de meio MTM e os francos são colocados num parapeito de janela. Dois dias depois do tratamento, adicionam-se 5 /us/ml de higromicina a cada frasco.

Seis dias depois da adição da higromicina, um em cada três filamentos das plantas de milho tratados com H83R tinha morrido (deixou de crescer e tornou-se esbranquiçada). Dez dias depois da adição, dois em quinze filamentos de milho tratados com H83E tinham morrido. Trinta dias depois da adição, mais dois filamentos tratados com Η83Ξ tinham morrido. Os restantes filamentos continuaram a desenvolver-se e mantiveram-se verdes ao longo de 25 dias após a adição da higromicina. Posteriormente, uma das plantas tratadas com H83E produziu pólen.

EXEMPLO 4

Seguindo a técnica do Exemplo 1, tiras cortadas do caule (com aproximadamente 1x3x4 mm) tomados de entre os dois nós superiores do caule no botão de Brassica oleracea /cv italica, CrGO-9 (Crucifer Genetics Co-operative-9},7 são colocadas em gel de agarose a 0, 7% num dispositivo de um sistema de electroforese juntamente com a solução de transformação compreendendo 15 Ail (10 /Ug) de pZ025 DNA plasmídio, 2 ul de corante azul de bromofenol

e 2% de DMSO e expõe-se a uma corrente eléctrica provocada por 52 V durante 15 minutos.

Seguidamente à exposição, as tiras cortadas do caule são removidas para meio de BSS esterilizado durante um curto período de tempo, depois para um meio de selecção compreendendo 20 ,ug/ml de higromicina durante uma semana e finalmente para um meio contendo 5 /Ug/ml de higromicina durante uma semana. Vinte e quatro tiras produziram calo quando transferidas para meio BSS sem higromicina. Depois de dois meses geraram rebentos e foram transferidos para solo numa câmara de humidade para gerar raízes.

Bolhas de duas plantas Brassica seleccionadas com higromicina foram cortadas em pedaços e submetidas a selecção secundária em meio de BSS compreendendo 25 ,ug/ml de higromicina. Estes pedaços mantiveram-se verdes e formaram rebentos. Quando foram transferidos para meio BSS com metade da concentração de sais e sem higromicina criaram também raízes. Polhas dos mesmos dois transformandos primários foram também analisadas relativamente à presença do gene de higromicina. Cada folha (com aproximadamente 0,2 g) foram congeladas em azoto líquido e transformadas em pó num almofariz. Depois adicionaram-se então 15 ml de tampão de sacarose com gelo (compreendendo 15% de sacarose, 50 mM tris de pH 8,0 e 50 mM de EDTA) e 0,25 M de NaCl ao tecido contido no almofariz e continuou-se a trituração. A suspensão foi vertida para um homogeneizador de vidro esmerilado de Wheaton de 5 ml e moído manualmente durante 5 a 10 passagens. A suspensão foi então transferida para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml e centrifugada durante 3 minutos a 6500 r.p.m.. A pelete nuclear bruta foi então suspensa de novo em 0,5 ml de tampão de sacarose arrefecido com gelo (como acima, mas sem NaCl). Adicionou-se 1 ,ul de procarbonato de distilo e a suspensão foi fortemente agitada à temperatura ambiente. Em seguida adicionaram-se 5 ,ul de

- 22 SDS a 20% e agitou-se energicamente e aqueceu-se depois a 70° durante 10 minutos. Adicionaram-se 50/U1 de acetato de potássio 5 M e novamente agitou-se fortemente a solução. Arrefeceu-se o tubo em gelo durante 30 minutos.

i i

A fracção potássio/SDS foi precipitada e centrifugada durante 15 minutos a 4°C. 0 sobrenadante foi transferido para um tubo de ensaio de 1,5 ml limpo e repetidamente extraído com fenol : clorofórmio até ao desaparecimento de cor e a interface ficar limpa. Executou-se uma precipitação com etanol e centrifuga-se a solução durante l:

jj 5 minutos à temperatura ambiente para recuperar o DNA.

Os transformantes foram analisados relativamente à presença do gene de higromicina introduzido. 0 DNA total foi quantificado e cortado usando a enzima de restrição TAQ 1. Os fragmentos de DNA foram separados usando gel de electroforese horizontal (0,7% de agarose) a 70 V durante cerca de 3 horas e transferido para uma membrana Biorad Zeta Probe usando a técnica de manchamento em meio alcalino para a transferência capilar de DNA como especificado no Manual de Instruções de Biorad Zeta Probe Mer.'branes. Depois de pré-hibridização, hibridizaçao e lavagem, igualmente realizadas de acordo com o manual acima mencionado, as membranas manchadas foram examinadas por auto-radiografia.

Um fragmento isolado do gene de higromicina com '

kb foi marcado com ^J p CTP de acordo com a técnica de agarose de baixo ponto de fusão descrito em Amersham Multiprime DNALabeling Systems Manual, páginas 1 a 28. Nos DNAs transformados encontravam-se presentes os fragmentos de 1,4 kb e de 0,7 kb de diagnóstico e ausentes os do DNA de controlo.

plasmídio pZO25 é o mesmo que H83E Cio Exemplo 1), com a diferença de a sequência que codifica o consistir nos nucleótidos 197 a 1251 modificado pela substituição duma guanina na posição 206 por uma adenina.

ΕΧΕΕΡ10 5

Seguindo a técnica do Exemplo 1, embriões de milho cortados no estágio 3 de desenvolvimento e a solução de transformação compreendendo 15 ,ul (10.ug) de pZO33 DNA plasmídio, 2% de DL'SO e 22 /ul de água destilada são colocados em gel de agarose a 0,7% num dispositivo dum sistema de electroforese e expostos à corrente eléctrica produzida por 52 V durante 13 minutos.

Seguidamente à exposição, os embriões são lavados com meio líquido Clí(30) esterilizado e colocados em meio CM(30) sólido. Não foi feito qualquer esforço para seleccionar o DNA plasmídio. As plantícuias resultantes são desenvolvidas normalmente tornando-se plantas de milho adultas, que são então submetidas a polinização cruzada para obtenção de plantas Fj. Sementes de maçarocas produzidas pelas plantas F·^ são feitas germinar e crescer durante uma semana no sentido de realizar ensaios CAT para estabelecer quais as maçarocas que contêm transformantes. Sementes adicionais das espigas resultantes potencialmente positivas foram semeadas e as raízes das plantas resultantes foram recolhidas e ensaiadas, num ensaio CAT. Das primeiras oito maçarocas potencialmente transformadas, duas evidenciaram transformação.

Folhas de transformantes F^ positivas a CAT foram analisadas relativamente à presença de sequências de gene CAT introduzido. As técnicas para a extracção, corte, separação, manchamento e amostragem são consistentes com as referidas no Exemplo 4. Um fragmento de 1,2 kb de diagnóstico é libertado sempre que o plasmídio pZO33 (35S-CAT-NOS) ou o DNA genómico transformado com o plasmídio é cortado com as enzimas de restrição Hind III e Eco RI e investigado com o gene CAT. Nesta família e descendência, o fragmento de 1,2 kb encontra-se sempre associado com um fragmento de

1,4 kb. 0 DNA extraído das plantas de milho usado para a produção desta família e de todos os indivíduos positivos contêm fragmentos de 1,2 kb e 1,4 kb. Em contraste, todos os controlos (DNA nuclear de 3780, DNA total de 3780 e híbridos F-^ 3780) carecem destes fragmentos.

plasmídio pZ033 compreende um promotor CaFT 3SS (nucleótidos 7069 e 7569) no lugar de SaCI de pTZ19R (comercialmente disponível em Pharmacia e US Biochemical), o gene de 773 bp de acetil cloranfenicol transferase (CAT) do Tu9 #er Álton e Vappnek, Nature 282 (1979) 864.7 cujas terminações TagI são alteradas para PstI, no sítio do Pst e um acabador NOS (nucleótidos 682 a 437) entre os sítios de PstI e de Hind III.

O ensaio CAT é realizado como se segue:

ENSAIO CAT

Extracção de tecido de plantículas ou outros

A 0 tecido de plantículas ou outros é moído em 150,411 (ou múltiplo) de 0,25 M Tris-HCl pH 7,8.

B A amostra é tratada com ultrassons (3 impulsos com a regulação N2. 2) em gelo.

C A amostra é centrifugada durante 3 minutos a 12 kg e o sobrenadante transferido para um tubo de ensaio limpo.

D A amostra é aquecida até 65° em banho de água durante 12 minutos e é então arrefecida até à temperatura ambiente .

Ε A amostra é centrifugada durante 30 segundos, o sobrenadante é recolhido e usado para o ensaio de CAT.

- 25 Usa-se um tubo para cada reacção. Usa-se também um

controlo para o ensaio de CAT com E coli 13 x 100 cm)	(tubos de
	Controlo	Transformante	Controlo de
	u₍	sgativo	Potencial	CAT Positivo
Sobrenadante		100 ,ul	100 ul	-
10 K Tris pH 7,8	-	-	99 /ul
CAT (0,5 unit/ul	-	-	1 ul
^C cloranfenicol	3 Zil	3 ul	3 Ul
h₂o		57 ul	57 Ail	57 ul
Λ 4 mM Acetil CoA	20 /ul	20 ul	20 ul
TOTAI	180 Λ11	180 ,/ul	180 ul

* incubar durante 5 minutos a 37°C para levar a mistura reaccional à temperatura ambiente

Incubam-se as amostras a 37°C durante uma a duas horas.

Interrompe-se a reacção com 2 ml de acetato de etilo saturado com água fria. Adiciona-se 1 ml de HgO no sentido de tornar a interface mais visível.

Cobre-se o tubo com parafilm e roda-se fortemente no ponto 1 durante aproximadamente 1 minuto.

Submete-se a rotação em IEC durante 3 a 5 minutos sob o ponto 5·

Transfere-se o sobrenadante para tubos de pequenas dimensões (13 x 75).

Evapora-se sob passagem de U₂ e em chaminé até secar (aproximadamente 45 minutos, evitar sobressecagem).

²⁶-

Enquanto as amostras secam, prepara-se o depósito do aparelho de cromatografia em camada fina com 10 ml de dissolvente ou clorofórmio : metanol 95:5. Coloca-se um pavio no depósito para todos os lados.

Prepara-se uma placa de cromatografia em camada fina de gel de sílica 60 com 20 x 20 cm. Traça-se uma linha a lápis a 1,5 cm. do fundo do depósito. Marca-se a posição das amostras por intersecção de linhas. A separação é feita por cromatografia ascendente.

Depois de as amostras terem secado, ressuspendem-se em 30 ,ul de acetato não saturado com água.

Colocam-se pequenas manchas de amostras numa pequena área com uma micropipeta de 10 ₇ul. Enquanto se aplica a mancha, faz-se incidir sobre a chapa uma corrente de ar quente proveniente dum secador de cabelo.

Coloca-se a placa no depósito e deixa-se o dissolvente ascender até 5 mm do topo da placa (40 - 50 minutos).

Deixa-se a placa secar ao ar durante 15 a 20 minutos na chaminé, coloca-se entãomma cassete com um pedaço de película (pré-exposta à luz) à temperatura ambiente durante a noite.

Revela-se a película no dia seguinte.

EXEMPLO 6

Seguindo a técnica do Exemplo 1, embriões de tomateiro (Burpees Super Beefsteak VFtT) foram colocados nos compartimentos com gel de agarose 0,7/ num sistema de electroforese em gel horizontal ao lado dos compartimentos contendo a solução de transformação compreendendo 10 ug ρΖΟβΟ ou /Λ//7 * pZ067 de DNA plasmídio, 2% de DMSO e corante azul de bromofenol. Os embriões foram expostos a uma corrente eléctrica provocada por 52 V durante cerca de 15 minutos.

Depois da electrotransformação, os embriões foram transferidos para o meio TMM durante 2 a 3 dias para recuperação. São então colocados em meio selectivo para tomateiros contendo 25 /ig/ml de higromicina durante 10 dias. Nenhuma das plantículas não tratadas sobreviveu a esta selecção. Os transformantes foram então salvos em meio contendo 0,5 mg de IAA e criaram raízes mesmo antes de serem | transplantados para o solo.

ί

As folhas destes transformantes primários foram analisadas em relação à presença de DNA introduzido, especialmente o gene de higromicina. 0 DNA total foi isolado do tecido vegetal, cortado com enzima de restrição TAQ 1, separado, manchado e hibridizado, tal como é descrito no Exemplo 4. Fragmentos de diagnóstico de higromicina (1,4; 0,7; e 0,4 kb) estavam presentes nos DNA transformados e ausentes no DNA de controlo.

plasmídio pZ060 é obtido a partir de plasmídio pUC 8 com o promotor 3ÇS> sequência que codifica para HET e o acabador nos de pZ025 (ver Exemplo 4), imediatamente seguido (em série) por uma segunda cópia do terminador nos.

plasmídio pZOó? é obtido a partir de um plasmídio pUC 8 com o promotor 35S H83E (ver Exemplo 1), da região que codifica para glucuromidase (GNS) um fragmento Pst 1 de RAJ-2Ó0 (Jefferson et al, ENAS 83 (1986), 8447) e os acabadores nos imediatamente seguidos, (em série) pelo promotor 35S, a sequência HET e o acabador nos de pZ025 (ver Exemplo 4).

EXEMPLO.........7

Seguindo a técnica do Exemplo 1, embriões de milho no estágio de desenvolvimento 3 são colocados nos compartimentos num sistema de electroforese de gel horizontal usando gel de agarose a 0, 7% e ao lado de compartimentos que contêm uma solução de transformação compreendendo 10 ,ug de Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk'¹ /plasmídio HPT (pzo 85-BTK/HPT) DNA, 2% de DESO e corante azul de bromofenol de marcação. Os embriões são submetidos a uma corrente eléctrica contínua provocada por 52 V durante cerca de ι 15 minutos, são depois transferidos para meio 0M(30) e seleccionados para resistência adquirida à higromicina. Tais rebentos genéticos mostram resistência à higromicina são feitos desenvolver e são testados por técnicas padrão de bio-ensaios relativamente à resistência a pestes como a espécie Heliothis tal como espécies Heliothis virescens e Spodoptera. As plantícuias transformadas mostram uma reduzida susceptibilidade às espécies Heliothis e Spodoptera comparando com controlos não tratados.

plasmídio pZ085 é obtido como se segue. 0 fragmento Sall - EcoRI compreendendo B-glucuronidase (GUS) que codifica a sequência de pRAJ 275 (comercialmente disponível em Clontech laboratories) foi modificado no sentido de trocar o sítio do EcoRI na extremidade 3’ para o sítio de PstI. Uma característica deste gene GUS é que um sítio Ncol fica contido no codão iniciador (ATG) da sequência codificadora. pZ085 consiste no promotor 35S e nas sequências nos como se encontra em pZO33 (ver Exemplo 5) e o fragmento Sal-Pst acima descrito (no lugar do gene CAT).

pZ085-BTK-HPT é preparado substituindo o fragmento Nco-Pst do pAMVBTS compreendendo um Btk modificada (Barton et al, Plant Physiol 85 (1937) 1103.7 Ρθΐο fragmento Ncol - PstI de pZ085. Esta sequência é imediatamente seguida (em cadeia) pelo promotor 35 S e acabador nos de pZO33 (ver Exemplo 5) com a sequência HPT de pZO25 (ver Exemplo 4).

EXEMPLO 8

De uma forma análoga à descrita no Exemplo 7, embriões de milho no estágio de desenvolvimento 3 são tratados com o plasmídio compreendendo o gene de Bacillus thuringiensia var gene tenebrionis (DSM 2803) que codifica a proteína tóxica para os Coleoptera tal como Diabrotica undecimpuntacta e um gene marcador que codifica a resistência à higromicina. Os embriões assim transformados são recuperados e são cultivados num meio de cultura como no Exemplo 7. As plantículas transformadas assim obtidas mostram susceptibilidade reduzida à D. undecimpunetata (comparando com os controlos não tratados).

I

Claims

1®. - Processo para a transformação de um tecido vegetal mediante a introdução de DNA nas células dos referidos tecidos, caracterizado pelo facto de compreender fazer-se contactar o material das células com uma solução de transformação compreendendo DNA e um agente de atravessamento das membranas na presença duma corrente eléctrica durante um intervalo de tempo suficiente para se efectuar o transporte do DNA para dentro das células dos tecidos vegetais e provocar a sua transformação.

2§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o DNA ser DNA vector.

3- . - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o DNA ser DNA plasmídio.

4- . - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o DNA derivar de uma origem diferente da espécie hospedeira ou recipiente.

5- . - Processo de acordo com a reivindicação 4> caracterizado pelo facto de o DNA compreender um gene que codifica para a resistência a herbicidas e/ou a insectos.

I

63. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de compreender empregar-se um sistema de electroforese em gel horizontal em que as células vegetais a ser transformadas e o material de DNA são colocados dentro de depressões de tal modo que a corrente eléctrica faça o transporte do DNA para as células vegetais.

7-. - Processo de acordo com a reivindicação S, caracterizado pelo facto de o agente que provoca o atravessamento da membrana ser um agente de atravessamento de membranas escolhido de sulfóxido de dimetilo, lisolecitina, dodecilsulfato de sódio e outros detergentes.

8&. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o agente que provoca o atravessamento de membranas ser sulfóxido de dimetilo.

9^§. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a solução de transformação compreender entre 1 e 4% de sulfóxido de dimetilo.

10?. - Processo de acordo com as reivindicações

1 a 9, caracterizado pelo facto de a tensão da corrente eléctrica estar compreendida dentro do intervalo de cerca de 40 V a cerca de 140 V.

11?. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a tensão estar compreendida dentro do intervalo de cerca de 50 V a 110 V.

122. - Processo de acordo com as reivindicações

1 a 11, caracterizado pelo facto de o tempo mínimo de exposição à passagem da corrente eléctrica ser o necessário para que o DNA da solução de transformação passe para a área do gel que contém as amostras de células vegetais.

132. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de 0 tempo de exposição ser, pelo menos, igual a 5 minutos.

14?. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o tempo de exposição estar compreendido entre 5 e 25 minutos.

15⁵. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o tempo de exposição estar compreendido entre 10 e 20 minutos.

165. - Processo de acordo com as reivindicações

1 a 15, caracterizado pelo facto de o material vegetal ser tecido vegetal, embriões vegetais, tecido meristémico, botões axilares, tiras de caule ou calo.

17-. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o material vegetal ser material proveniente de plantas monocotiledóneas.

185. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o material vegetal ser material proveniente de plantas de cultura da família das gramíneas.

igg. _ Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de 0 material vegetal ser material proveniente de cereais.

205. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de 0 material vegetal ser material proveniente de plantas de trigo, painço, cevada, sorgo, centeio, aveia, tritical ou milho.

21^. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de 0 material vegetal ser material de plantas de milho.

225. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o material vegetal ser material proveniente de plantas dicotiledóneas.

23^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 22,. caracterizado pelo facto de o material vegetal ser material proveniente da espécie Brassica oleracea.

24- · - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o material vegetal ser material proveniente de tomateiros.

25- . - Material celular de origem vegetal, caracterizado pelo facto de compreender no genoma das plantas DNA proveniente de uma origem diferente da espécie hospedeira ou recipiente e capaz de se regenerar e formar plantas férteis saudáveis, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24.

26â. - Material celular de origem vegetal, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de ser proveniente de plantas monocotiledóneas.

27^â. - Material celular de origem vegetal, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de ser proveniente de culturas de plantas da família das gramíneas.

28^. - Material celular de origem vegetal, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de ser proveniente de cereais.

29-. - Material celular de origem vegetal, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de ser proveniente de plantas de trigo, painço, cevada, sorgo, centeio, aveia, tritical ou milho.

- 34 303. - Material celular de origem vegetal, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de ser proveniente de milho.

313. - Processo para a obtenção de sementes de plantas com susceptibilidade reduzida a pestes, nomeadamente insectos como lepidópteros e coleópteros, e a insecticidas, caracterizado pelo facto de se cultivarem plantas contendo no genoma DNA em resultado do processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24.