JPH03112488A - 調節dna配列 - Google Patents
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- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、植物キチナーゼ遺伝子の51領域から得られ
、そしてあらゆる所望の発現性DNAと操作可能に連結
されて形質転換された植物において非常に高められたレ
ベルの発現を導く、新規で実質的に純粋な調節DNA配
列に関する。
、そしてあらゆる所望の発現性DNAと操作可能に連結
されて形質転換された植物において非常に高められたレ
ベルの発現を導く、新規で実質的に純粋な調節DNA配
列に関する。
本発明はまた、発現可能なDNAと操作可能に連結され
た本発明に係るDNA配列を含む組換えDNA分子、お
よびそれらから誘導されたベクターに関する。本発明は
また、前記組換えDNAまたはそれらから誘導されたベ
クターを含む宿主細胞および/または宿主有機体ならび
にトランスジェニック植物を包含する。
た本発明に係るDNA配列を含む組換えDNA分子、お
よびそれらから誘導されたベクターに関する。本発明は
また、前記組換えDNAまたはそれらから誘導されたベ
クターを含む宿主細胞および/または宿主有機体ならび
にトランスジェニック植物を包含する。
本発明はさらに、ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバ
ナ425 (Nicotiana tabacum L
、c。
ナ425 (Nicotiana tabacum L
、c。
v、Havana 425)植物から得られ、そして5
を非翻訳領域に本発明に係る調節DNA配列を含む新規
キチナーゼ遺伝子を包含する。
を非翻訳領域に本発明に係る調節DNA配列を含む新規
キチナーゼ遺伝子を包含する。
本発明は、本発明に係るDNA配列の作成方法、該DN
A配列を含む組換えDNA分子およびベクターの作成方
法、およびトランスジェニック植物を作出するために前
記DNA配列等を使用する方法にも関する。
A配列を含む組換えDNA分子およびベクターの作成方
法、およびトランスジェニック植物を作出するために前
記DNA配列等を使用する方法にも関する。
新規で有用な特性を有するトランスジェニック植物の作
出における基本的な限定要因の一つは、いくつかの場合
において低い挿入された外来遺伝子の発現のレベルであ
る。外来遺伝子のこの低い発現および植物における関連
した低いタンパク質濃度の結果として、所望の効果はも
しあるとしてもしばしば不満足な程度にしか生じない。
出における基本的な限定要因の一つは、いくつかの場合
において低い挿入された外来遺伝子の発現のレベルであ
る。外来遺伝子のこの低い発現および植物における関連
した低いタンパク質濃度の結果として、所望の効果はも
しあるとしてもしばしば不満足な程度にしか生じない。
細菌の発現系の鋭意研究された分野において、種々の可
能な方法がクローン化された構造遺伝子の転写のレベル
を高めるために利用可能になった。例えば構造遺伝子は
、多くの場合に遺伝子発現のレベルにおける増加を導く
レプリコンの強力なプロモーターの後ろに挿入され得る
。
能な方法がクローン化された構造遺伝子の転写のレベル
を高めるために利用可能になった。例えば構造遺伝子は
、多くの場合に遺伝子発現のレベルにおける増加を導く
レプリコンの強力なプロモーターの後ろに挿入され得る
。
さらに、遺伝子の全体のオペロン単位、すなわちプロモ
ーターならびにオペレーターおよびターミネータ−をマ
ルチコピープラスミド内にスプライシングさせることは
原理的に可能である。
ーターならびにオペレーターおよびターミネータ−をマ
ルチコピープラスミド内にスプライシングさせることは
原理的に可能である。
増加された遺伝子発現の結果として、または第2の場合
においては増加された遺伝子分量の結果として、細胞に
おけるタンパク質濃度の増加が達成されるかもしれない
。
においては増加された遺伝子分量の結果として、細胞に
おけるタンパク質濃度の増加が達成されるかもしれない
。
(発明が解決しようとする課題)
対照的に、植物系のそれほど十分には研究されていない
分野においては転写および翻訳の制御機構は未だ大部分
わかっておらず、転写のレベルを高めるために現在利用
可能な方法は依然として非常に限定されている。また可
能である場合でも、しばしば非常に低い成功のレベルで
適用されるにすぎない。
分野においては転写および翻訳の制御機構は未だ大部分
わかっておらず、転写のレベルを高めるために現在利用
可能な方法は依然として非常に限定されている。また可
能である場合でも、しばしば非常に低い成功のレベルで
適用されるにすぎない。
従って、操作可能に結合された外米遺伝子またはその他
の有用なDNA配列、例えばアンチセンスDNAの発現
を増加させ得る!I節配列を、所望の表現型の効果、例
えばある種の病原体または化学物質に対する耐性の発生
が明確に目視でき、そして当該植物がそれ故にそれらの
有害な影響から有効に保護されるような様式で提供する
ことは本発明の第一の目的とみなされなければならない
。
の有用なDNA配列、例えばアンチセンスDNAの発現
を増加させ得る!I節配列を、所望の表現型の効果、例
えばある種の病原体または化学物質に対する耐性の発生
が明確に目視でき、そして当該植物がそれ故にそれらの
有害な影響から有効に保護されるような様式で提供する
ことは本発明の第一の目的とみなされなければならない
。
本発明の調節DNA配列の適用のその他の分野として、
有用で価値ある化合物の製造のために作出されたトラン
スジェニック植物の合成収量の増加に注意が払われ得る
。
有用で価値ある化合物の製造のために作出されたトラン
スジェニック植物の合成収量の増加に注意が払われ得る
。
驚くべきことに、本発明の範囲内で、い(つかが公知で
ある手段の使用により上記の課題を解決することが今回
能となった。
ある手段の使用により上記の課題を解決することが今回
能となった。
詳しくは本発明は、植物キチナーゼ遺伝子の5′非翻訳
領域から、好ましくはタバコキチナーゼ遺伝子の51非
翻訳領域から得られる調節DNA配列であって、植物細
胞内で活性である適当な発現シグナルおよび構造遺伝子
またはその他の発現性DNA配列に操作可能に連結され
て、植物材料において、操作可能に結合された構造遺伝
子またはその他の操作可能に結合されたDNA配列、例
えばアンチセンスDNAの発現レベルにおける著しい増
加を導く、前記調節DNA配列に関する。
領域から、好ましくはタバコキチナーゼ遺伝子の51非
翻訳領域から得られる調節DNA配列であって、植物細
胞内で活性である適当な発現シグナルおよび構造遺伝子
またはその他の発現性DNA配列に操作可能に連結され
て、植物材料において、操作可能に結合された構造遺伝
子またはその他の操作可能に結合されたDNA配列、例
えばアンチセンスDNAの発現レベルにおける著しい増
加を導く、前記調節DNA配列に関する。
本発明は調節DNA配列、好ましくは実質的に純粋な形
態にある調節DNA配列に関し、それらはニコチアナ・
ツバカムの園芸品種ハバナ425植物の塩基性キチナー
ゼ遺伝子の5′非翻訳領域から得られ、そして以下のD
NA配列:5 ’ −TTGCATTTCACCAGT
TTACTACTACATTAAA−3’ を実質的に有する。
態にある調節DNA配列に関し、それらはニコチアナ・
ツバカムの園芸品種ハバナ425植物の塩基性キチナー
ゼ遺伝子の5′非翻訳領域から得られ、そして以下のD
NA配列:5 ’ −TTGCATTTCACCAGT
TTACTACTACATTAAA−3’ を実質的に有する。
本発明はまた、1個またはそれ以上の塩基の突然変異に
基づいているがしかし依然として上記配列に実質的に相
同であり、そして本発明に必須の特性を依然として有す
る上記DNA配列の全ての誘導体に関する。
基づいているがしかし依然として上記配列に実質的に相
同であり、そして本発明に必須の特性を依然として有す
る上記DNA配列の全ての誘導体に関する。
突然変異は本明細書において、1個またはそれ以上の塩
基の欠失または挿入、そしてまた特に1個またはそれ以
上の塩基の置換を意味するものと理解されるべきである
。
基の欠失または挿入、そしてまた特に1個またはそれ以
上の塩基の置換を意味するものと理解されるべきである
。
本発明の範囲内で、あるDNA配列の活性部分の少なく
とも60%、好ましくは少なくとも80%そして特に好
ましくは少なくとも90%が第2のDNA配列と相同で
ある場合に、それらは実質的に相同である。
とも60%、好ましくは少なくとも80%そして特に好
ましくは少なくとも90%が第2のDNA配列と相同で
ある場合に、それらは実質的に相同である。
本発明はまた、上に非常に詳細に記載したDNA配列か
ら、または該DNA配列の誘導体から得られ、そして出
発配列の特定の特性を依然とし゛て有する断片または部
分配列を包含する。
ら、または該DNA配列の誘導体から得られ、そして出
発配列の特定の特性を依然とし゛て有する断片または部
分配列を包含する。
以下のDNA配列:
5 ’−ACTACTACATTAAA−3’を有する
か、または1個またはそれ以上の塩基の突然変異に基づ
いているがしかし依然として上記配列に実質的に相同で
あり、そして出発配列の特定の調節発現増加特性を依然
として有する上記DNA配列の全ての誘導体である部分
配列が特に好ましい。
か、または1個またはそれ以上の塩基の突然変異に基づ
いているがしかし依然として上記配列に実質的に相同で
あり、そして出発配列の特定の調節発現増加特性を依然
として有する上記DNA配列の全ての誘導体である部分
配列が特に好ましい。
本発明はさらに、本発明に係る調節DNA配列が発現性
DNAおよび植物細胞内で活性なその他の発現シグナル
、例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に連結
され、その結果、植物宿主への形質転換で操作可能に結
合された発現性DNAの発現レベルにおける著しい増加
を導く、キメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA分子に
関する。
DNAおよび植物細胞内で活性なその他の発現シグナル
、例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に連結
され、その結果、植物宿主への形質転換で操作可能に結
合された発現性DNAの発現レベルにおける著しい増加
を導く、キメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA分子に
関する。
カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)からの35
3プロモーターおよびキチナーゼまたはグルカナーゼ構
造遺伝子と操作可能に連結された本発明に係る上記DN
A配列を含む組換えDNA分子が特に好ましい。
3プロモーターおよびキチナーゼまたはグルカナーゼ構
造遺伝子と操作可能に連結された本発明に係る上記DN
A配列を含む組換えDNA分子が特に好ましい。
本発明はまた、本発明に係る上記組換えDNA分子を含
むクローニング、形質転換および発現ベクター、ならび
に該ベクターを用いて形質転換された宿主有機体を包含
する。
むクローニング、形質転換および発現ベクター、ならび
に該ベクターを用いて形質転換された宿主有機体を包含
する。
本発明はさらに、本発明に係る上記組換えDNA分子を
含み、そして大腸菌(E、coli)およびアグロバク
テリウム・チュメファシエンス(Agrobacter
iutm tuaefaciens)の両方において安
定に複製し得るいわゆるシャトルベクターに関する。
含み、そして大腸菌(E、coli)およびアグロバク
テリウム・チュメファシエンス(Agrobacter
iutm tuaefaciens)の両方において安
定に複製し得るいわゆるシャトルベクターに関する。
宿主有機体の中で、植物プロトプラスト、細胞、カルス
、組織、器官、接合子、胚、花粉および/または種子か
らなる群から選択される植物宿主が好ましく、そして上
記組換えDNAを用いて形質転換された全体の、好まし
くは活性の植物が特に好ましい。全体の植物は例えば本
発明に係る組換えDNA分子を用いて直接形質転換され
るか、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞
および/または組織から再生により得ることができる。
、組織、器官、接合子、胚、花粉および/または種子か
らなる群から選択される植物宿主が好ましく、そして上
記組換えDNAを用いて形質転換された全体の、好まし
くは活性の植物が特に好ましい。全体の植物は例えば本
発明に係る組換えDNA分子を用いて直接形質転換され
るか、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞
および/または組織から再生により得ることができる。
野生型に比べ著しく増加されているキチナーゼおよび/
またはグルカナーゼ含量を有するトランスジェニック植
物、侍にトランスジェニック活性植物が非常に好ましい
。
またはグルカナーゼ含量を有するトランスジェニック植
物、侍にトランスジェニック活性植物が非常に好ましい
。
本発明はまた、トランスジェニック植物の全ての増殖材
料を包含し、該トランスジェニック植物は本発明に係る
組換えDNA分子を用いた直接形質転換により形成され
るか、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞
、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉および/また
は種子から再生により得られるが、それらに限定されな
い。
料を包含し、該トランスジェニック植物は本発明に係る
組換えDNA分子を用いた直接形質転換により形成され
るか、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞
、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉および/また
は種子から再生により得られるが、それらに限定されな
い。
本発明の範囲内で、増殖材料は有性的にまたは無性的に
、そして試験管内または生体内で増殖され得るあらゆる
植物材料であるとして理解され、本発明に係るトランス
ジェニック植物から得られるプロトプラスト、細胞、カ
ルス、組織、器官、胚珠、接合子、胚、花粉または種子
が好ましい。本発明はまた、上記植物の後代ならびにそ
れらの突然変異体および変種に関し、体細胞融合、遺伝
子修飾または突然変異選択により得られる植物からの誘
導体を包含する。
、そして試験管内または生体内で増殖され得るあらゆる
植物材料であるとして理解され、本発明に係るトランス
ジェニック植物から得られるプロトプラスト、細胞、カ
ルス、組織、器官、胚珠、接合子、胚、花粉または種子
が好ましい。本発明はまた、上記植物の後代ならびにそ
れらの突然変異体および変種に関し、体細胞融合、遺伝
子修飾または突然変異選択により得られる植物からの誘
導体を包含する。
本発明はさらに以下の方法にも関する。
(a) 本発明に係る調節DNA配列の作成方法(b
) 適当なプロモーターおよび構造遺伝子と操作可能
に連結されている本発明に係る上記DNA配列を含む本
発明に係る組換えDNA分子の作成方法 (CJ 本発明に係る組換えDNA分子を含むクロニ
ング、形質転換および/または発現ベクターの作成方法 (山 形質転換された宿主有機体、特に植物プロトプラ
スト、細胞、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉お
よび/または種子からなる群から選択される植物宿主、
および特に全体の、好ましくは活性の植物の作成方法 (e) 形質転換された植物材料からの増殖材料の作
成方法、特に有性および無性の後代の作成方法 げ) キチン含有病原体、特に病原菌および病原虫から
の植物の保護方法 本発明に係る調節DNA配列の作成方法は、(a)
植物キチナーゼ遺伝子の5′非翻訳領域、好ましくはタ
バコの塩基性キチナーゼ遺伝子の51非翻訳領域から公
知方法を用いて上記配列またはその誘導体を単離するか
、または(b) 化学的操作により上記配列またはそ
の誘導体を合成することから実質的になる。
) 適当なプロモーターおよび構造遺伝子と操作可能
に連結されている本発明に係る上記DNA配列を含む本
発明に係る組換えDNA分子の作成方法 (CJ 本発明に係る組換えDNA分子を含むクロニ
ング、形質転換および/または発現ベクターの作成方法 (山 形質転換された宿主有機体、特に植物プロトプラ
スト、細胞、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉お
よび/または種子からなる群から選択される植物宿主、
および特に全体の、好ましくは活性の植物の作成方法 (e) 形質転換された植物材料からの増殖材料の作
成方法、特に有性および無性の後代の作成方法 げ) キチン含有病原体、特に病原菌および病原虫から
の植物の保護方法 本発明に係る調節DNA配列の作成方法は、(a)
植物キチナーゼ遺伝子の5′非翻訳領域、好ましくはタ
バコの塩基性キチナーゼ遺伝子の51非翻訳領域から公
知方法を用いて上記配列またはその誘導体を単離するか
、または(b) 化学的操作により上記配列またはそ
の誘導体を合成することから実質的になる。
詳しくは、工程段階(a)は、それ自体公知である以下
の段階: (a) キチナーゼを発現し得る組織からのゲノムD
NAの抽出および精製 (b) 抽出および精製されたDNA調製物の、クロ
ーニングベクター中への引き続く挿入に適当な大きさの
断片への切断 (C) 断片化されたDNAのクローニングベクター
内でのクローニングおよび遺伝子ライブラリィの作成 (d) プローブ分子によるキチナーゼ遺伝子または
それらの一部を含むクローンの選択 (e) プローブ分子との強いハイブリダイゼーショ
ンシグナルを示すクローンの単離 (f) (e)において単離されたクローンの生化学
的操作による特徴づけ (g) 発現の増加に関与する調節DNA配列の同定
および単離 からなる。
の段階: (a) キチナーゼを発現し得る組織からのゲノムD
NAの抽出および精製 (b) 抽出および精製されたDNA調製物の、クロ
ーニングベクター中への引き続く挿入に適当な大きさの
断片への切断 (C) 断片化されたDNAのクローニングベクター
内でのクローニングおよび遺伝子ライブラリィの作成 (d) プローブ分子によるキチナーゼ遺伝子または
それらの一部を含むクローンの選択 (e) プローブ分子との強いハイブリダイゼーショ
ンシグナルを示すクローンの単離 (f) (e)において単離されたクローンの生化学
的操作による特徴づけ (g) 発現の増加に関与する調節DNA配列の同定
および単離 からなる。
本発明に係る組換えDNA分子の作成方法は、本発明の
調節DNA配列の一つを所望の発現性DNAの開始コド
ンの前に直接挿入し、そしてその構築物を植物細胞内で
活性な発現シグナルに操作可能な様式で連結することか
ら実質的になる。 本発明の範囲内で、病原体、化学物
質および悪い環境要因に対する保護を形質転換された植
物細胞およびそれから生長する組織、しかし特に植物に
〜付与する構造遺伝子が本発明に係る調節DNA配列に
結合されている組換えDNA分子の作成が特に好ましい
。
調節DNA配列の一つを所望の発現性DNAの開始コド
ンの前に直接挿入し、そしてその構築物を植物細胞内で
活性な発現シグナルに操作可能な様式で連結することか
ら実質的になる。 本発明の範囲内で、病原体、化学物
質および悪い環境要因に対する保護を形質転換された植
物細胞およびそれから生長する組織、しかし特に植物に
〜付与する構造遺伝子が本発明に係る調節DNA配列に
結合されている組換えDNA分子の作成が特に好ましい
。
本発明に係る調節DNAの一つと操作可能に連結されて
いる植物細胞内で発現可能なDNAを含む発現ベクター
の作成方法は、 (a) 所望の発現性DNAの開始コドンの前に直接
、調節DNA配列を挿入し、そして 伽)植物細胞内で活性な発現シグナルの間に形質転換体
選択に適当なマーカー遺伝子を含んでいてよい公知植物
発現ベクター内に(a)の構築物を操作可能な様式でス
プライシングする、ことから実質的になる。
いる植物細胞内で発現可能なDNAを含む発現ベクター
の作成方法は、 (a) 所望の発現性DNAの開始コドンの前に直接
、調節DNA配列を挿入し、そして 伽)植物細胞内で活性な発現シグナルの間に形質転換体
選択に適当なマーカー遺伝子を含んでいてよい公知植物
発現ベクター内に(a)の構築物を操作可能な様式でス
プライシングする、ことから実質的になる。
プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚
、花粉、胚珠、接合子その他からなる群から選択される
植物材料の作成方法は、上記組換えDNA分子の一つを
用いてそれ自体公知の方法により、上記植物材料を形質
転換することから実質的になる。
、花粉、胚珠、接合子その他からなる群から選択される
植物材料の作成方法は、上記組換えDNA分子の一つを
用いてそれ自体公知の方法により、上記植物材料を形質
転換することから実質的になる。
野生型に比べ著しく増加されている形質転換された細胞
および/または組織におけるタンパク質含量を有するト
ランスジェニック植物の作出方法は、上記組換えDNA
分子の一つを用いてそれ自体公知の方法により、上記植
物を形質転換することから実質的になる。
および/または組織におけるタンパク質含量を有するト
ランスジェニック植物の作出方法は、上記組換えDNA
分子の一つを用いてそれ自体公知の方法により、上記植
物を形質転換することから実質的になる。
野生型に比べ著しく増加されているグルカナーゼおよび
/またはキチナーゼ含量を有するトランスジェニック植
物の作出方法が特に好ましい。
/またはキチナーゼ含量を有するトランスジェニック植
物の作出方法が特に好ましい。
植物材料の形質転換は、植物プロトプラストのポリエチ
レングリコール処理、熱シヨツク処理およびエレクトロ
ポレーション;植物プロトプラスト、細胞または胚中へ
のマイクロインジェクション;マイクロプロジェクタイ
ルでの細胞または組織の打ち込み;植物プロトプラスト
、細胞もしくは組織または全体の植物のアグロバクテリ
ウム仲介形質転換;および植物プロトプラスト、細胞も
しくは組織または全体の植物のCaMV仲介形質転換か
らなる群から選択される公知方法により行われるのが好
ましい。
レングリコール処理、熱シヨツク処理およびエレクトロ
ポレーション;植物プロトプラスト、細胞または胚中へ
のマイクロインジェクション;マイクロプロジェクタイ
ルでの細胞または組織の打ち込み;植物プロトプラスト
、細胞もしくは組織または全体の植物のアグロバクテリ
ウム仲介形質転換;および植物プロトプラスト、細胞も
しくは組織または全体の植物のCaMV仲介形質転換か
らなる群から選択される公知方法により行われるのが好
ましい。
トランスジェニック種子の作出方法は上に詳細に記載し
たトランスジェニック植物を有性的に増殖させ、そして
挿入された遺伝物質を依然含有する発生種子を公知方法
により得ることから実質的になる。
たトランスジェニック植物を有性的に増殖させ、そして
挿入された遺伝物質を依然含有する発生種子を公知方法
により得ることから実質的になる。
トランスジェニック植物の形質転換された生育可能な部
分の作出方法は、上に詳細に記載したトランスジェニッ
ク植物から、プロトプラスト、細胞、細胞クローン、細
胞集合体、カルスおよび/または組織培養体、種子、花
粉、胚珠、接合子および胚からなる群から選択される植
物の形質転換された一部を得、そして挿入された遺伝物
質を依然含有するそれらの部分を選択することから実質
的になる。
分の作出方法は、上に詳細に記載したトランスジェニッ
ク植物から、プロトプラスト、細胞、細胞クローン、細
胞集合体、カルスおよび/または組織培養体、種子、花
粉、胚珠、接合子および胚からなる群から選択される植
物の形質転換された一部を得、そして挿入された遺伝物
質を依然含有するそれらの部分を選択することから実質
的になる。
上に非常に詳細に記載したトランスジェニック植物材料
を用いるハイブリダイゼーション物および融合物の作成
方法は、上記植物材料を自体とまたは外来材料とハイブ
リダイゼーションまたは融合させ、そして挿入された遺
伝物質を依然含有しそして本発明に必須の特性を依然有
するそれらのハイブリダイゼーション物および融合物を
選択することから実質的になる。
を用いるハイブリダイゼーション物および融合物の作成
方法は、上記植物材料を自体とまたは外来材料とハイブ
リダイゼーションまたは融合させ、そして挿入された遺
伝物質を依然含有しそして本発明に必須の特性を依然有
するそれらのハイブリダイゼーション物および融合物を
選択することから実質的になる。
上により詳細に記載したトランスジェニック植物の変種
および突然変異体の作成方法は、トランスジェニック植
物またはそれらの生育可能な部分ならびにそれらの有性
および無性の後代を公知方法により突然変異させ、そし
て次に挿入された遺伝物質を依然含有しそして本発明に
必須の特性を依然有するそれらの個体を選択することか
ら実質的になる。
および突然変異体の作成方法は、トランスジェニック植
物またはそれらの生育可能な部分ならびにそれらの有性
および無性の後代を公知方法により突然変異させ、そし
て次に挿入された遺伝物質を依然含有しそして本発明に
必須の特性を依然有するそれらの個体を選択することか
ら実質的になる。
花、茎、果実、葉および根からなる群から選択される植
物のトランスジェニック部分の作出方法は、植物の上記
部分を分離し、そしてそれらの細胞の大部分に挿入され
た遺伝物質を依然含有するそれらの部分を選択すること
から実質的になる。
物のトランスジェニック部分の作出方法は、植物の上記
部分を分離し、そしてそれらの細胞の大部分に挿入され
た遺伝物質を依然含有するそれらの部分を選択すること
から実質的になる。
本発明はまた、本発明に係る調節DNA配列がキチナー
ゼをコードする構造遺伝子および植物細胞内で活性なそ
の他の発現シグナルに操作可能に連結されているキメラ
遺伝子構築物を含む組換えDNA分子を用いて植物を形
質転換し、そしてキチン含有病原体を死滅させるか、ま
たは該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入された
キチナーゼ遺伝子を発現させることからなる、キチン含
有病原体から植物を保護する方法を包含する。
ゼをコードする構造遺伝子および植物細胞内で活性なそ
の他の発現シグナルに操作可能に連結されているキメラ
遺伝子構築物を含む組換えDNA分子を用いて植物を形
質転換し、そしてキチン含有病原体を死滅させるか、ま
たは該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入された
キチナーゼ遺伝子を発現させることからなる、キチン含
有病原体から植物を保護する方法を包含する。
本発明はさらに、本発明に係るDNA配列がキチナーゼ
をコードする構造遺伝子および植物細胞内で活性なその
他の発現シグナルに操作可能に連結されているキメラ遺
伝子構築物を含む組換えDNA分子を用いて形質転換さ
れ、その結果、キチン含有病原体を死滅させるか、また
は該病原体を制御下に保つのに十分な量でトランスジェ
ニック植物またはそれらの一部に挿入されたキチナーゼ
遺伝子を発現させるようなトランスジェニック植物また
はそれらの一部とキチン含有病原体を接触させることか
らなるキチン含有病原体を制御する方法を包含する。
をコードする構造遺伝子および植物細胞内で活性なその
他の発現シグナルに操作可能に連結されているキメラ遺
伝子構築物を含む組換えDNA分子を用いて形質転換さ
れ、その結果、キチン含有病原体を死滅させるか、また
は該病原体を制御下に保つのに十分な量でトランスジェ
ニック植物またはそれらの一部に挿入されたキチナーゼ
遺伝子を発現させるようなトランスジェニック植物また
はそれらの一部とキチン含有病原体を接触させることか
らなるキチン含有病原体を制御する方法を包含する。
本発明はまた、植物材料中に遺伝子発現を増加させるた
めの、および同様の作用を有する相同DNA配列を同定
するための本発明に係る調節DNA配列の使用に関する
。
めの、および同様の作用を有する相同DNA配列を同定
するための本発明に係る調節DNA配列の使用に関する
。
図面
本発明を以下に詳細に記載する前に、ここで図面に関し
て簡単に説明する。
て簡単に説明する。
第1図はプラスミドI)SCH12の特徴的領域および
それらの開始点を示すpscH12の遺伝子地図を示す
。(図中、P35S→CaMV35Sプロモーター;T
85S−”CaMV終結配列;TNO3→ネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の終結配列、PNO3
→ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のプロ
モーター;LB、RB→アグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのTiプラスミドからの左側または右側境界
配列) キチナーゼをコードするキメラ遺伝子横築物の5′領域
の関連部分はヌクレオチド配列により詳細に示されてい
る。
それらの開始点を示すpscH12の遺伝子地図を示す
。(図中、P35S→CaMV35Sプロモーター;T
85S−”CaMV終結配列;TNO3→ネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の終結配列、PNO3
→ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のプロ
モーター;LB、RB→アグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのTiプラスミドからの左側または右側境界
配列) キチナーゼをコードするキメラ遺伝子横築物の5′領域
の関連部分はヌクレオチド配列により詳細に示されてい
る。
第2図はpcIB200の制限地図を示す。
第3図はプラスミドpscH12構築の概略図である。
詳細は実施例8に示されている。
第4図はプラスミド1)SGL7構築の概略図である。
詳細は実施例9に示されている。
第5図はニコチアナ・シルベストリス51(Nicot
iana 5yLvestris Sl)植物(Km”
/Km”)の葉中のキチナーゼ濃度を対照(Km”/K
m”)と比較して一般的方法で示すグラフである。葉に
は下から上へ番号を付す。
iana 5yLvestris Sl)植物(Km”
/Km”)の葉中のキチナーゼ濃度を対照(Km”/K
m”)と比較して一般的方法で示すグラフである。葉に
は下から上へ番号を付す。
定義
以下の記載において組換えDNA技術および植物遺伝学
において慣用である多(の用語が用いられている。発明
の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれらの用
語にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した理解
を確実にするために、以下に定義を記載する。
において慣用である多(の用語が用いられている。発明
の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれらの用
語にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した理解
を確実にするために、以下に定義を記載する。
植物材料:培養液中でまたはそのままで生育可能な植物
の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織、
胚、植物器官、芽、種子等、および全体の植物。
の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織、
胚、植物器官、芽、種子等、および全体の植物。
植物細胞:プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の
構造的および生理学的単位。
構造的および生理学的単位。
ら分離され、そして細胞クローンまたは全体の植物に再
生する能力を有する細胞壁のない「裸の」植物細胞。
生する能力を有する細胞壁のない「裸の」植物細胞。
植物組織:構造的および機能的単位の形態に組織化され
た植物細胞の群。
た植物細胞の群。
植物器官二種々の組織、例えば根、茎、葉または胚から
構成される構造的および機能的単位。
構成される構造的および機能的単位。
表現型の特徴ニー個またはそれ以上の遺伝子の発現に基
づいた認識可能であるか、または少なくとも検出可能で
ある特徴。しかしながら、表現型の特徴は、例えばアン
チセンスDNAが使用される場合に、遺伝子の発現の抑
制を介して発現され得る。
づいた認識可能であるか、または少なくとも検出可能で
ある特徴。しかしながら、表現型の特徴は、例えばアン
チセンスDNAが使用される場合に、遺伝子の発現の抑
制を介して発現され得る。
非相同遺伝子またはDNA :特定の生成物をコードす
るか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が
挿入される種板外の種に由来するDNA配列;該DNA
配列は外来遺伝子または外来DNAとも記載される。
るか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が
挿入される種板外の種に由来するDNA配列;該DNA
配列は外来遺伝子または外来DNAとも記載される。
相同遺伝子またはDNA :特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿
入される種と同一種に由来するDNA配列。
か、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿
入される種と同一種に由来するDNA配列。
合成遺伝子またはDNA :特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段によ
り製造されるDNA配列。
か、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段によ
り製造されるDNA配列。
植物プロモーター:植物内であらゆる所望の相同または
非相同DNA遺伝子配列の転写を確実に行わせるDNA
発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのような
プロモーターと操作可能に結合されている。
非相同DNA遺伝子配列の転写を確実に行わせるDNA
発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのような
プロモーターと操作可能に結合されている。
終結配列:転写工程の終了をシグナルで伝える転写単位
の末端のDNA配列。
の末端のDNA配列。
過産生植物プロモーター(OPP):このOPPで形質
転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察され
るよりも明らかに高い程度まで(RNAの形態またはポ
リペプチドの量で測定される)、操作可能に結合された
機能遺伝子配列のトランスジェニック植物細胞内での発
現を引起し得る植物プロモーター るけれどもポリペプチドに翻訳されないコード領域の上
流/下流に位置するDNA部分。この領域は、調節配列
例えばリポソーム結合部位(51)またはポリアデニル
化シグナル(3′)を含む。
転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察され
るよりも明らかに高い程度まで(RNAの形態またはポ
リペプチドの量で測定される)、操作可能に結合された
機能遺伝子配列のトランスジェニック植物細胞内での発
現を引起し得る植物プロモーター るけれどもポリペプチドに翻訳されないコード領域の上
流/下流に位置するDNA部分。この領域は、調節配列
例えばリポソーム結合部位(51)またはポリアデニル
化シグナル(3′)を含む。
DNAクローニングベクター:適当な宿主細胞内に挿入
されたDNAのクローニングに必要な全てのシグナル配
列を含有するクローニングビヒクル、例えばプラスミド
またはバクテリオファージ。
されたDNAのクローニングに必要な全てのシグナル配
列を含有するクローニングビヒクル、例えばプラスミド
またはバクテリオファージ。
DNA発現ベクター:適当な宿主細胞内に挿入されたD
NAの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ーニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。
NAの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ーニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。
DNA )ランスファーベクター:適当な宿主細胞内へ
の遺伝物質の挿入を可能にするトランスファービヒクル
、例えばTiプラスミドまたはウィルスファージ。
の遺伝物質の挿入を可能にするトランスファービヒクル
、例えばTiプラスミドまたはウィルスファージ。
トランスジェニック植物の突然変異体、変種:自然に、
または公知方法例えば紫外線処理、突然変異誘発剤での
処理その他を用いて人工的に作製され、そして本発明に
必須である出発植物の特徴および特性を依然有するトラ
ンスジェニック植物の誘導体。
または公知方法例えば紫外線処理、突然変異誘発剤での
処理その他を用いて人工的に作製され、そして本発明に
必須である出発植物の特徴および特性を依然有するトラ
ンスジェニック植物の誘導体。
実 的に純粋なDNA配列:天然または非天然源から実
質的に純粋な形態で単離されたDNA配列。そのような
配列は天然系、例えば細菌、ウィルスまたは植物もしく
は動物細胞中に存在していても、また合成DNAまたは
cDNAの形態で利用されてもよい。実質的に純粋なD
NA配列は挿入物として上記DNAを含むベクターの形
態で一般に単離される。実質的に純粋とは、その他のD
NA配列がほんの無視できる量で存在し、そして5%未
満、好ましくは1%未満、そして特に好ましくは0.1
%未満含有されることを意味する。そのような配列およ
び該配列を含むベクターは一般に水溶液中に、すなわち
緩衝液または慣用の培養基の一つの中に存在する。
質的に純粋な形態で単離されたDNA配列。そのような
配列は天然系、例えば細菌、ウィルスまたは植物もしく
は動物細胞中に存在していても、また合成DNAまたは
cDNAの形態で利用されてもよい。実質的に純粋なD
NA配列は挿入物として上記DNAを含むベクターの形
態で一般に単離される。実質的に純粋とは、その他のD
NA配列がほんの無視できる量で存在し、そして5%未
満、好ましくは1%未満、そして特に好ましくは0.1
%未満含有されることを意味する。そのような配列およ
び該配列を含むベクターは一般に水溶液中に、すなわち
緩衝液または慣用の培養基の一つの中に存在する。
本発明は主として、植物キチナーゼ遺伝子の5′非翻訳
領域から得られる調節DNA配列であって、該配列が発
現性DNAおよび植物細胞内で活性な発現シグナルに操
作可能に連結されている場合に、植物宿主への形質転換
で操作可能に結合された発現性DNAの発現レベルにお
ける著しい増加を導く、新規な前記調節DNA配列に関
する。
領域から得られる調節DNA配列であって、該配列が発
現性DNAおよび植物細胞内で活性な発現シグナルに操
作可能に連結されている場合に、植物宿主への形質転換
で操作可能に結合された発現性DNAの発現レベルにお
ける著しい増加を導く、新規な前記調節DNA配列に関
する。
本発明は特に、植物キチナーゼ遺伝子の5′非翻訳領域
から得られ、あらゆる所望の構造遺伝子に操作可能に連
結されて、形質転換された植物材料内で結合された構造
遺伝子の発現のレベルにおける大きな増加を導く、新規
で実質的に純粋な調節DNA配列に関する。
から得られ、あらゆる所望の構造遺伝子に操作可能に連
結されて、形質転換された植物材料内で結合された構造
遺伝子の発現のレベルにおける大きな増加を導く、新規
で実質的に純粋な調節DNA配列に関する。
本発明の範囲内で、タバコからの塩基性キチナーゼ遺伝
子の51非翻訳領域中に存在し、そしてそれ自体公知の
技術によりそれらから得ることができるDNA配列が特
に好ましい。
子の51非翻訳領域中に存在し、そしてそれ自体公知の
技術によりそれらから得ることができるDNA配列が特
に好ましい。
本発明はまた、本発明に係る調節DNA配列を得るため
の出発材料として作用し得、モして51非翻訳領域に以
下の特定の構造的特徴:(a)1967ないし1971
位のCTACT配列内に転写開始部位 ら)該転写開始部位の11bpT流1980位に第1の
可能な開始コドン (C) 転写開始部位の上流で、5′フランキング領
域の−28ないし一23位にTAAATA配列(TAT
Aボックス) (d)−114位にCCAATT配列 (e)−140位に6bpからなる不完全逆方向反復配
列(GCCGAATTCGAGC)げ) −152位
と一228位に10bpからなる完全反復配列(ATG
TCCAAAC)(掲 −166位と一569位に20
bpからなる不完全直接反復配列(TTTTAACTA
AATCTATGTCC) (h) −191位と一217位に25bpからなる不
完全直接反復配列(CAACTTTCAAAAATTA
TTTTTTAAA) (i)−2a9位に20bpからなるパリンドローム(
TAAAATATGAITCATGTTTTA) (j)−435位と一480位に11bpからなる完全
直接反復配列(TAAGAGCCGCC)(k) −
514位と一644位に15bpからなる不完全直接反
復配列(TAAAATACACGTCGA) (1)3’フランキング領域内の翻訳停止配列TAAの
下流で、52位と120位に2個のAATAAA配列 を有するタバコからの塩基性キチナーゼ遺伝子を包含す
る。
の出発材料として作用し得、モして51非翻訳領域に以
下の特定の構造的特徴:(a)1967ないし1971
位のCTACT配列内に転写開始部位 ら)該転写開始部位の11bpT流1980位に第1の
可能な開始コドン (C) 転写開始部位の上流で、5′フランキング領
域の−28ないし一23位にTAAATA配列(TAT
Aボックス) (d)−114位にCCAATT配列 (e)−140位に6bpからなる不完全逆方向反復配
列(GCCGAATTCGAGC)げ) −152位
と一228位に10bpからなる完全反復配列(ATG
TCCAAAC)(掲 −166位と一569位に20
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AATCTATGTCC) (h) −191位と一217位に25bpからなる不
完全直接反復配列(CAACTTTCAAAAATTA
TTTTTTAAA) (i)−2a9位に20bpからなるパリンドローム(
TAAAATATGAITCATGTTTTA) (j)−435位と一480位に11bpからなる完全
直接反復配列(TAAGAGCCGCC)(k) −
514位と一644位に15bpからなる不完全直接反
復配列(TAAAATACACGTCGA) (1)3’フランキング領域内の翻訳停止配列TAAの
下流で、52位と120位に2個のAATAAA配列 を有するタバコからの塩基性キチナーゼ遺伝子を包含す
る。
本発明の範囲内で、ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハ
バナ425植物から得られ、そして下に示すDNA配列
にニコチアナ・ツバカムの塩基性キチナーゼ遺伝子であ
る遺伝子48)を含む塩基性キチナーゼ遺伝子が特に好
ましい。
バナ425植物から得られ、そして下に示すDNA配列
にニコチアナ・ツバカムの塩基性キチナーゼ遺伝子であ
る遺伝子48)を含む塩基性キチナーゼ遺伝子が特に好
ましい。
?へパ〕++ナーt”逢イ云主+2の77しオ÷1−1
tIz月5゜ 10り0 139゜ 14フO 10フ0 T入AGAAAGATATGACTGAGCTCCGG
T167゜ 19フO 2290231G CiCCAAGGAAAGGGATTCTACAGTT
’ACAATGCCTTrATC入入o10 237゜ 239゜ 245゜ 2フ50 B10 o70 3フ30 375゜ CGAGCTGC入G 適当なキチナーゼ遺伝子の単離のために、当業者には十
分に公知の慣用の一般的方法により創生され得るゲノム
またはcDNA遺伝子ライブラリィを出発材料として使
用するのが好ましい。ゲノムまたはcDNA遺伝子ライ
ブラリィの基本的創生方法は、例えば、Maniati
s et al (1982)に詳細に記載され、また
植物系への導入およびそれらの方法の応用は、例えばM
ohnen (1979)に記載されている。
tIz月5゜ 10り0 139゜ 14フO 10フ0 T入AGAAAGATATGACTGAGCTCCGG
T167゜ 19フO 2290231G CiCCAAGGAAAGGGATTCTACAGTT
’ACAATGCCTTrATC入入o10 237゜ 239゜ 245゜ 2フ50 B10 o70 3フ30 375゜ CGAGCTGC入G 適当なキチナーゼ遺伝子の単離のために、当業者には十
分に公知の慣用の一般的方法により創生され得るゲノム
またはcDNA遺伝子ライブラリィを出発材料として使
用するのが好ましい。ゲノムまたはcDNA遺伝子ライ
ブラリィの基本的創生方法は、例えば、Maniati
s et al (1982)に詳細に記載され、また
植物系への導入およびそれらの方法の応用は、例えばM
ohnen (1979)に記載されている。
ゲノムDNAおよびcDNAは種々の方法で入手され得
る。ゲノムDNAは、例えば公知方法を用いて適当な細
胞から抽出され、そして精製され得る。cDNAの作成
のために、選択された細胞または組織から、しかし特に
高いキチナーゼ濃度を有することが知られている細胞ま
たは組織から単離され得るmRNAが出発材料として一
般的に使用される。単離されたmRNAは次に相当する
CDNA作成のためのマトリックスとして逆転写におい
て使用され得る。CDNA作成のための出発材料として
特に好ましいのは、適当な手段により予め刺激され高レ
ベルでキチナーゼを産生する植物細胞もしくは組織また
はその他の適当な植物材料である。これは、例えば培養
された細胞もしくは組織またはその他の適当な植物材料
を無ホルモン培地上に接種し、そして高キチナーゼレベ
ルの誘導に十分な期間それらを培養することにより達成
され得る。発明の範囲内で、Linsmaier an
d Skoog(1965)により提案された塩および
チアミンHCI濃度を含有する基本培地(LS培地)が
特に好ましい。
る。ゲノムDNAは、例えば公知方法を用いて適当な細
胞から抽出され、そして精製され得る。cDNAの作成
のために、選択された細胞または組織から、しかし特に
高いキチナーゼ濃度を有することが知られている細胞ま
たは組織から単離され得るmRNAが出発材料として一
般的に使用される。単離されたmRNAは次に相当する
CDNA作成のためのマトリックスとして逆転写におい
て使用され得る。CDNA作成のための出発材料として
特に好ましいのは、適当な手段により予め刺激され高レ
ベルでキチナーゼを産生する植物細胞もしくは組織また
はその他の適当な植物材料である。これは、例えば培養
された細胞もしくは組織またはその他の適当な植物材料
を無ホルモン培地上に接種し、そして高キチナーゼレベ
ルの誘導に十分な期間それらを培養することにより達成
され得る。発明の範囲内で、Linsmaier an
d Skoog(1965)により提案された塩および
チアミンHCI濃度を含有する基本培地(LS培地)が
特に好ましい。
ポリ(A”)RNAを単離する方法およびCDNAを作
成する方法は当業者に公知であり、そして実施例におい
て以下に詳細に記載されている。
成する方法は当業者に公知であり、そして実施例におい
て以下に詳細に記載されている。
抽出され、そして精製されたDNA調製物は次に引き続
くクローニングのための断片に切断される。クローン化
されるべきゲノムDNAまたはcDNAは、機械的切断
または好ましくは適当な制限酵素での切断により、クロ
ーニングベクター内への挿入に適当な大きさに断片化さ
れ得る。ゲノムおよび/またはcDNA遺伝子ライブラ
リィの創生のための一般的物質として既に使用されてい
る適当なりローニングベクターは例えば、ファージベク
ター例えばλシャロンファージ、または細菌ベクター例
えば大腸菌プラスミドpBR322を包含する。その他
の適当なりローニングベクターは当業者に公知である。
くクローニングのための断片に切断される。クローン化
されるべきゲノムDNAまたはcDNAは、機械的切断
または好ましくは適当な制限酵素での切断により、クロ
ーニングベクター内への挿入に適当な大きさに断片化さ
れ得る。ゲノムおよび/またはcDNA遺伝子ライブラ
リィの創生のための一般的物質として既に使用されてい
る適当なりローニングベクターは例えば、ファージベク
ター例えばλシャロンファージ、または細菌ベクター例
えば大腸菌プラスミドpBR322を包含する。その他
の適当なりローニングベクターは当業者に公知である。
上記方法で創生された遺伝子ライブラリィから、キチナ
ーゼ遺伝子またはそれらの部分を含む適当なりローンが
スクリーニングプログラム、例えば適当なオリゴヌクレ
オチドプローブ(プローブ分子)を用いて同定され、そ
して次に単離され得る。種々の方法、例えば分別コロニ
ハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼ
ーションが適当なりローンを同定するために利用可能で
ある。特有の翻訳産物の同定に基づいた免疫学的検出方
法が使用されてもよい。
ーゼ遺伝子またはそれらの部分を含む適当なりローンが
スクリーニングプログラム、例えば適当なオリゴヌクレ
オチドプローブ(プローブ分子)を用いて同定され、そ
して次に単離され得る。種々の方法、例えば分別コロニ
ハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼ
ーションが適当なりローンを同定するために利用可能で
ある。特有の翻訳産物の同定に基づいた免疫学的検出方
法が使用されてもよい。
プローブ分子として、例えば同一のキチナーゼ遺伝子ま
たは構造的に関連するキチナーゼ遺伝子から予め単離さ
れ、そして本発明に係るキチナーゼ遺伝子内の配列の相
当する部分とハイブリダイゼーションし得るDNA断片
が使用され得る。
たは構造的に関連するキチナーゼ遺伝子から予め単離さ
れ、そして本発明に係るキチナーゼ遺伝子内の配列の相
当する部分とハイブリダイゼーションし得るDNA断片
が使用され得る。
単離されるべき遺伝子のアミノ酸配列または該配列の少
なくとも一部が公知であれば、その配列情報に基づいて
相当するDNA配列は引き出され得る。遺伝コードは縮
重していることが知られているから、異なるコドンが大
部分の場合、一つおよび同じアミノ酸のために使用され
得る。結果として、い(っかの例外を別にして、特定の
アミノ酸配列が、互いに類似しているオリゴヌクレオチ
ドの全体の系により一般にコード化され得る。しかしな
がら、オリゴヌクレオチドの系の一つだけが検索されて
いる遺伝子内の相当する配列に実際に相当することを確
認することに注意が払われなければならない。可能性の
あるオリゴヌクレオチドの数を始めから制限するために
、特定のコドンが真核細胞において実際に使用されてい
る頻度を考慮するLathe Ret at (198
5)により主張されたコドンの使用に関する規則が例え
ば適用され得る。
なくとも一部が公知であれば、その配列情報に基づいて
相当するDNA配列は引き出され得る。遺伝コードは縮
重していることが知られているから、異なるコドンが大
部分の場合、一つおよび同じアミノ酸のために使用され
得る。結果として、い(っかの例外を別にして、特定の
アミノ酸配列が、互いに類似しているオリゴヌクレオチ
ドの全体の系により一般にコード化され得る。しかしな
がら、オリゴヌクレオチドの系の一つだけが検索されて
いる遺伝子内の相当する配列に実際に相当することを確
認することに注意が払われなければならない。可能性の
あるオリゴヌクレオチドの数を始めから制限するために
、特定のコドンが真核細胞において実際に使用されてい
る頻度を考慮するLathe Ret at (198
5)により主張されたコドンの使用に関する規則が例え
ば適用され得る。
その情報に基づいて、プローブ分子をゲノムDNAまた
はcDNAと上記方法の一つにおいてハイブリダイゼー
ションさせることにより、適当なりローンの同定および
単離のためのプローブ分子として使用され得るオリゴヌ
クレオチド分子を引き出すことも可能である。
はcDNAと上記方法の一つにおいてハイブリダイゼー
ションさせることにより、適当なりローンの同定および
単離のためのプローブ分子として使用され得るオリゴヌ
クレオチド分子を引き出すことも可能である。
キチナーゼをコードする所望の遺伝子の検出を促進する
ために、上記のDNAプローブ分子が適当な容易に検出
可能な群で標識され得る。
ために、上記のDNAプローブ分子が適当な容易に検出
可能な群で標識され得る。
本発明の範囲内で、検出可能な群は特に容易に同定可能
な物理的または化学的特性を有するあらゆる物質として
理解されるべきである。そのような物質は特にイムノア
ッセイの分野で広く使用されており、そしてそれらの大
部分は本発明において使用され得る。酵素的に活性な群
、例えば酵素、酵素基質、補酵素および酵素阻害剤、お
よび蛍光剤および発色剤、発色団および放射性同位元素
、例えばIH,IIS、 l″P。
な物理的または化学的特性を有するあらゆる物質として
理解されるべきである。そのような物質は特にイムノア
ッセイの分野で広く使用されており、そしてそれらの大
部分は本発明において使用され得る。酵素的に活性な群
、例えば酵素、酵素基質、補酵素および酵素阻害剤、お
よび蛍光剤および発色剤、発色団および放射性同位元素
、例えばIH,IIS、 l″P。
1217および14Cがこの点で特別な記載がなされ得
る。これらの標識の容易な検出性は、一方で固有の物理
的特性(例えば蛍光標識、発色団、放射性同位元素)、
そして他方でそれらの反応および結合特性(例えば酵素
、基質、補酵素、阻害剤)に基づいている。
る。これらの標識の容易な検出性は、一方で固有の物理
的特性(例えば蛍光標識、発色団、放射性同位元素)、
そして他方でそれらの反応および結合特性(例えば酵素
、基質、補酵素、阻害剤)に基づいている。
高いキチナーゼレベルの産生のために誘導された組織ま
たは細胞から順に単離されるポリ(A”)RNAから誘
導された一本鎖c DNAがプローブ分子として適当で
ある。キチナーゼをコードするDNA配列を含むけれど
も、N末端シグナルペプチドをコードするDNA配列を
含まない、そして5hinshi et aL (19
87)に記載されているキチナーゼcDNAクローンp
CHN50が本発明の範囲内で特に好ましい。
たは細胞から順に単離されるポリ(A”)RNAから誘
導された一本鎖c DNAがプローブ分子として適当で
ある。キチナーゼをコードするDNA配列を含むけれど
も、N末端シグナルペプチドをコードするDNA配列を
含まない、そして5hinshi et aL (19
87)に記載されているキチナーゼcDNAクローンp
CHN50が本発明の範囲内で特に好ましい。
ハイブリダイゼーションに関する一般的記載は、例えば
Maniatis T et at(1982)および
Haymes BT et al (1985)に記載
されている。
Maniatis T et at(1982)および
Haymes BT et al (1985)に記載
されている。
プローブ分子とハイブリダイゼーションし得、そして上
記の検出方法の一つにより同定され得る上記遺伝子ライ
ブラリィ内のそれらのクローンは、キチナーゼをコード
する配列の範囲および性質を詳細にさらに決定するため
に次に分析され得る。
記の検出方法の一つにより同定され得る上記遺伝子ライ
ブラリィ内のそれらのクローンは、キチナーゼをコード
する配列の範囲および性質を詳細にさらに決定するため
に次に分析され得る。
キチナーゼ遺伝子をクローニングする別の方法は発現ベ
クターからなる遺伝子ライブラリィの創生に基づいてい
る。その方法において、上記方法と同様に、ゲノムDN
A、Lかし好ましくはcDNAがキチナーゼを発現し得
る細胞または組織からまず分離され、そして次に適当な
発現ベクター内にスプライシングされる。そのようにし
て創生された遺伝子ライブラリィは次いで適当な手段を
用いて、好ましくは抗キチナーゼ抗体を用いてスクリー
ニングされ、そして挿入物として所望の遺伝子または少
なくともその一部を含むクローンが選択され得る。
クターからなる遺伝子ライブラリィの創生に基づいてい
る。その方法において、上記方法と同様に、ゲノムDN
A、Lかし好ましくはcDNAがキチナーゼを発現し得
る細胞または組織からまず分離され、そして次に適当な
発現ベクター内にスプライシングされる。そのようにし
て創生された遺伝子ライブラリィは次いで適当な手段を
用いて、好ましくは抗キチナーゼ抗体を用いてスクリー
ニングされ、そして挿入物として所望の遺伝子または少
なくともその一部を含むクローンが選択され得る。
上記方法を用いて、あらゆる所望の構造遺伝子と操作可
能に連結して、形質転換された植物材料において発現の
非常に増加されたレベルを導く調節DNA配列を51領
域に有する植物キチナーゼ遺伝子、しかし特にタバコか
らの塩基性キチナーゼ遺伝子を単離することが可能であ
る。
能に連結して、形質転換された植物材料において発現の
非常に増加されたレベルを導く調節DNA配列を51領
域に有する植物キチナーゼ遺伝子、しかし特にタバコか
らの塩基性キチナーゼ遺伝子を単離することが可能であ
る。
キチナーゼ遺伝子のその他の特徴づけのために、上記の
ように精製および単離されたDNA配列を配列分析に供
する。予め単離されたキチナーゼ遺伝子を最初に適当な
制限酵素により断片に切断し、そして次に適当なりロー
ニングベクター、例えばM18ベクターmp18および
mp19内にクローン化する。配列決定は51→31方
向に行われ、好ましくはSanger[Sangere
t at、19771によるジデオキシヌクレオチド鎖
停止法またはMaxam and G11bert[M
axam andGilbert、 19801による
方法が用いられる。配列決定におけるエラーを防止する
ために、同時に2本のDNA鎖の配列を決定することが
有利である。ヌクレオチド配列および相当するアミノ酸
配列の分析は適当なコンピュータソフトウェアを用いて
有利にコンピュータアシストされている。
ように精製および単離されたDNA配列を配列分析に供
する。予め単離されたキチナーゼ遺伝子を最初に適当な
制限酵素により断片に切断し、そして次に適当なりロー
ニングベクター、例えばM18ベクターmp18および
mp19内にクローン化する。配列決定は51→31方
向に行われ、好ましくはSanger[Sangere
t at、19771によるジデオキシヌクレオチド鎖
停止法またはMaxam and G11bert[M
axam andGilbert、 19801による
方法が用いられる。配列決定におけるエラーを防止する
ために、同時に2本のDNA鎖の配列を決定することが
有利である。ヌクレオチド配列および相当するアミノ酸
配列の分析は適当なコンピュータソフトウェアを用いて
有利にコンピュータアシストされている。
下の実施例において詳細に記載されている本発明の好ま
しい態様において、染色体タバコDNAのゲノム遺伝子
ライブラリィは最初に創生され、そして予め単離された
cDNAクローン(pCHN 5 Q、 5hinsh
i gt aL、1987に記載)をプローブ分子とし
て用いるプラークハイブリダイゼーションによりスクリ
ーニングされる。
しい態様において、染色体タバコDNAのゲノム遺伝子
ライブラリィは最初に創生され、そして予め単離された
cDNAクローン(pCHN 5 Q、 5hinsh
i gt aL、1987に記載)をプローブ分子とし
て用いるプラークハイブリダイゼーションによりスクリ
ーニングされる。
総計で5X10’個のプラークの実験の後、10個の組
換え体が得られ、これらは最初に精製され、次にサザン
プロット分析により部分的に特徴づけられる。これらの
クローンのうちの2個(λCHN14およびλCHN1
7)がゲノム内の異なる領域から誘導され、完全なキチ
ナーゼ遺伝子を含む。クローンλCHN17がプローブ
分子として作用するcDNAクローンpcHN50およ
びpCHN48(実施例4.4に記載)と非常に強いハ
イブリダイゼーションシグナルを生じるから、その他の
特徴づけのためにクローンλCHN17が選択される。
換え体が得られ、これらは最初に精製され、次にサザン
プロット分析により部分的に特徴づけられる。これらの
クローンのうちの2個(λCHN14およびλCHN1
7)がゲノム内の異なる領域から誘導され、完全なキチ
ナーゼ遺伝子を含む。クローンλCHN17がプローブ
分子として作用するcDNAクローンpcHN50およ
びpCHN48(実施例4.4に記載)と非常に強いハ
イブリダイゼーションシグナルを生じるから、その他の
特徴づけのためにクローンλCHN17が選択される。
HindII[制限酵素との消化の後、5.4kbDN
A断片が得られ、これは完全キチナーゼ遺伝子を含み、
そしてタバコDNAからの同じ大きさの断片と関連する
。!3850bpからなり、そして全体のコード配列を
含む該断片の一部を次に配列決定する。タバコからの塩
基性キチナーゼ遺伝子の完全なDNA配列は遺伝子48
として上に示した。
A断片が得られ、これは完全キチナーゼ遺伝子を含み、
そしてタバコDNAからの同じ大きさの断片と関連する
。!3850bpからなり、そして全体のコード配列を
含む該断片の一部を次に配列決定する。タバコからの塩
基性キチナーゼ遺伝子の完全なDNA配列は遺伝子48
として上に示した。
タバコからの塩基性キチナーゼ遺伝子の5vおよび31
−フランキング領域は、その他の真核遺伝子に類似の調
節機能と直接連結され得る種々の領域を示す。例えばm
RNAの転写開始部位はSlヌクレアーゼマツピングに
より決定され得る。全体で2本のバンドが見られ、これ
は種々の開始部位がキチナーゼ遺伝子上に存在するとい
う予測を導く。当該バンドの強度を根拠とすれば、主要
転写開始部位はCTACT配列内の1969位にあるA
と同一である。第1の可能性のある開始シグナルは上記
転写開始部位の11bp下流の1980位にある、塩基
配列TAAAATGAG内に見出され、これは植物遺伝
子のその他の翻訳開始部位と並んでおり、コンセンサス
配列と呼ばれる。
−フランキング領域は、その他の真核遺伝子に類似の調
節機能と直接連結され得る種々の領域を示す。例えばm
RNAの転写開始部位はSlヌクレアーゼマツピングに
より決定され得る。全体で2本のバンドが見られ、これ
は種々の開始部位がキチナーゼ遺伝子上に存在するとい
う予測を導く。当該バンドの強度を根拠とすれば、主要
転写開始部位はCTACT配列内の1969位にあるA
と同一である。第1の可能性のある開始シグナルは上記
転写開始部位の11bp下流の1980位にある、塩基
配列TAAAATGAG内に見出され、これは植物遺伝
子のその他の翻訳開始部位と並んでおり、コンセンサス
配列と呼ばれる。
5′フランキング領域は以下の塩基配列:(a) 転
写開始部位の上流で、5′フランキング領域の−28な
いし一23位にTAAATA配列(TATAボックス) (b)TATAボックスの上流で動物遺伝子にときどき
見出されるCAATボックスに類似している、−114
位のCCAATT配列 (C) 動物遺伝子の調節熱シヨツクコンセンサスエ
レメントに類似している、−140位に6bpからなる
不完全逆方向反復配列(GCCGAATTCGAGC) (d)−152位と一228位に10bpからなる完全
反復配列(ATGTCCAAAC)(e)−168位と
一569位に20bpからなる(f)−191位と一2
17位に25bpからなる(□□□ −289位に20
bpからなるパリンドローム(TAAAATATGAI
TCATGTTTTA) (h) −435位と一480位に11bpからなる
完全直接反復配列(TAAGAGCCGCC)(i)
−514位と一644位に15bpからなる不完全直
接反復配列(TAAAATACACGTCGA) によりさらに特徴づけられる。
写開始部位の上流で、5′フランキング領域の−28な
いし一23位にTAAATA配列(TATAボックス) (b)TATAボックスの上流で動物遺伝子にときどき
見出されるCAATボックスに類似している、−114
位のCCAATT配列 (C) 動物遺伝子の調節熱シヨツクコンセンサスエ
レメントに類似している、−140位に6bpからなる
不完全逆方向反復配列(GCCGAATTCGAGC) (d)−152位と一228位に10bpからなる完全
反復配列(ATGTCCAAAC)(e)−168位と
一569位に20bpからなる(f)−191位と一2
17位に25bpからなる(□□□ −289位に20
bpからなるパリンドローム(TAAAATATGAI
TCATGTTTTA) (h) −435位と一480位に11bpからなる
完全直接反復配列(TAAGAGCCGCC)(i)
−514位と一644位に15bpからなる不完全直
接反復配列(TAAAATACACGTCGA) によりさらに特徴づけられる。
3′フランキング領域は、翻訳停止配列TAAの下流で
、52位と120位の2個のAATAAA配列により特
徴づけられる。
、52位と120位の2個のAATAAA配列により特
徴づけられる。
本発明に係る調節DNAは、当業者には十分公知である
適当な方法により予め単離されたキチナーゼ遺伝子の5
′領域から得ることができる。ニコチアナ・ツバカムの
塩基性キチナーゼ遺伝子の5′領域からの調節DNA配
列が本発明の範囲内で特に好ましい。配列のこの部分は
、少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、そ
して特に少なくとも70%の範囲までA/Tを含み、そ
して少なくとも100塩基対、好ましくは少なくとも4
0塩基対、そして特に少なくとも31塩基対からなるA
/Tに富んだ領域である。
適当な方法により予め単離されたキチナーゼ遺伝子の5
′領域から得ることができる。ニコチアナ・ツバカムの
塩基性キチナーゼ遺伝子の5′領域からの調節DNA配
列が本発明の範囲内で特に好ましい。配列のこの部分は
、少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、そ
して特に少なくとも70%の範囲までA/Tを含み、そ
して少なくとも100塩基対、好ましくは少なくとも4
0塩基対、そして特に少なくとも31塩基対からなるA
/Tに富んだ領域である。
ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ425植物[B
ichholz et al、1983]の柔細胞髄組
織のクローン化系列から単離された塩基性キチナーゼ遺
伝子の場合、上記配列は一31位から翻訳開始点の始ま
りである一1位に延びている。
ichholz et al、1983]の柔細胞髄組
織のクローン化系列から単離された塩基性キチナーゼ遺
伝子の場合、上記配列は一31位から翻訳開始点の始ま
りである一1位に延びている。
配列分析を用いて、以下のヌクレオチド配列が配列の当
該部位に対して決定され得る:5 ’ −TTGCAT
TTCACCAGTTTACTACTACATTAAA
−3” この調節DNA配列は公知の塩基配列であり、適当なキ
チナーゼ遺伝子から各同断たに単離される必要はなく、
もちろんいつでも化学的操作により非常に容易に合成さ
れ得る。短いDNAオリゴヌクレオチドの合成に適当な
方法、例えばホスホトリエステル法またはホスフィツト
法は当業者には公知である。今日、多くのオリゴヌクレ
オチド合成は機械化され、そして自動化されており、そ
のため短いDNA断片は短時間で製造され得る。
該部位に対して決定され得る:5 ’ −TTGCAT
TTCACCAGTTTACTACTACATTAAA
−3” この調節DNA配列は公知の塩基配列であり、適当なキ
チナーゼ遺伝子から各同断たに単離される必要はなく、
もちろんいつでも化学的操作により非常に容易に合成さ
れ得る。短いDNAオリゴヌクレオチドの合成に適当な
方法、例えばホスホトリエステル法またはホスフィツト
法は当業者には公知である。今日、多くのオリゴヌクレ
オチド合成は機械化され、そして自動化されており、そ
のため短いDNA断片は短時間で製造され得る。
それ故に、1個またはそれ以上の塩基対の欠失、挿入ま
たは置換による、上で非常に詳細に記載されたDNA配
列の変種または突然変異体は容易に製造され得、そして
それらの適性が検査され得る。
たは置換による、上で非常に詳細に記載されたDNA配
列の変種または突然変異体は容易に製造され得、そして
それらの適性が検査され得る。
詳しくは、操作は、本発明に係る調節DNA配列の一つ
を含む遺伝子を最初に同定および単離することであって
よい。適当なりローニングベクター内にスプライシング
させた後、上記遺伝子、特に51調節配列は次に公知工
程手段により変性され得る。特定の突然変異体を作成す
る特に適した方法はいわゆるオリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発である。その方法において、野生型配列に実
質的に相同であるけれども、個々のヌクレオチドにおい
て相違する短いオリゴヌクレオチド断片が合成される。
を含む遺伝子を最初に同定および単離することであって
よい。適当なりローニングベクター内にスプライシング
させた後、上記遺伝子、特に51調節配列は次に公知工
程手段により変性され得る。特定の突然変異体を作成す
る特に適した方法はいわゆるオリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発である。その方法において、野生型配列に実
質的に相同であるけれども、個々のヌクレオチドにおい
て相違する短いオリゴヌクレオチド断片が合成される。
上記相違は1個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、
欠失または置換であってよい。これらの突然変異された
断片は次に一般的公知方法により野生型遺伝子の相同対
と置換される。最終構築物は次いで、以下に詳細に記載
されるように、適当な植物発現ベクターにクローン化さ
れ、そして植物内に形質転換され得る。
欠失または置換であってよい。これらの突然変異された
断片は次に一般的公知方法により野生型遺伝子の相同対
と置換される。最終構築物は次いで、以下に詳細に記載
されるように、適当な植物発現ベクターにクローン化さ
れ、そして植物内に形質転換され得る。
それ故に、本発明は上に非常に詳細に記載された塩基配
列に制限されず、1個またはそれ以上の塩基の欠失もし
くは挿入または特に1個またはそれ以上の塩基の置換に
より形成されており、そして出発配列の特定の調節発現
増加特性を依然として有する上記DNA配列の全ての突
然変異体および/または誘導体をも包含する。
列に制限されず、1個またはそれ以上の塩基の欠失もし
くは挿入または特に1個またはそれ以上の塩基の置換に
より形成されており、そして出発配列の特定の調節発現
増加特性を依然として有する上記DNA配列の全ての突
然変異体および/または誘導体をも包含する。
本発明はまた、上に非常に詳細に記載されたDNA配列
から、または出発配列の特定の調節発現増加特性を依然
として有する上記DNA配列の誘導体から得られる断片
または部分配列を包含する。
から、または出発配列の特定の調節発現増加特性を依然
として有する上記DNA配列の誘導体から得られる断片
または部分配列を包含する。
以下のDNA配列:
5 ’−ACTACTACATTAAA−3’を有する
部分配列が特に好ましい。
部分配列が特に好ましい。
上記したように単離され得る調節DNA配列またはそれ
らの部分配列は、同じ作用を有する相同DNA配列を同
定するために今使用され得る。それは、例えば最初にゲ
ノム遺伝子ライブラリィを創生じ、そしてプローブ分子
とハイブリダイゼーションし得る相同DNAの存在のた
めに該プローブ分子として本発明に係る調節DNAの一
つを用いて上記の方法で上記ライブラリィを調べること
により行われる。
らの部分配列は、同じ作用を有する相同DNA配列を同
定するために今使用され得る。それは、例えば最初にゲ
ノム遺伝子ライブラリィを創生じ、そしてプローブ分子
とハイブリダイゼーションし得る相同DNAの存在のた
めに該プローブ分子として本発明に係る調節DNAの一
つを用いて上記の方法で上記ライブラリィを調べること
により行われる。
本発明はまた、本発明に係るDNA配列の一つを用いて
同じ作用を有する相同DNA配列を同定するための方法
に関する。
同じ作用を有する相同DNA配列を同定するための方法
に関する。
本発明はさらに、本発明に係る調節DNA配列が構造遺
伝子および植物細胞内で活性なその他の発現シグナル、
例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に連結さ
れているキメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA分子の
横築に関する。
伝子および植物細胞内で活性なその他の発現シグナル、
例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に連結さ
れているキメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA分子の
横築に関する。
プロモーター配列と本発明に係る隣接調節DNA配列と
の間にスペーサー配列を含むことはしばしば有利であり
、前記スペーサー配列の長さは該プロモーター配列と本
発明に係る調節DNA配列との間の距離が結合された構
造遺伝子の発現に対して最適な距離であるように選択さ
れる。lbpないし100bp、好ましくは2bpない
し46bpからなるスペーサー配列が本発明の範囲内で
特に好ましい。
の間にスペーサー配列を含むことはしばしば有利であり
、前記スペーサー配列の長さは該プロモーター配列と本
発明に係る調節DNA配列との間の距離が結合された構
造遺伝子の発現に対して最適な距離であるように選択さ
れる。lbpないし100bp、好ましくは2bpない
し46bpからなるスペーサー配列が本発明の範囲内で
特に好ましい。
構造遺伝子および植物細胞内で活性なその他の発現シグ
ナル、例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に
連結される場合、本発明に係る調節DNA配列は、発現
のレベルにおいて著しい増加を導くが、それは400倍
まで、またはそれ以上の増加であり得る。従って、遺伝
子の発現があまりに低く、そのため細胞中のタンパク質
濃度が低かったから、これまで達成できなかったか、ま
たは不満足な範囲までしが達成できなかった植物におけ
る特定の特徴の表現型発現、例えばある種の病原体また
は化学物質に対する耐性を十分に改善することが、本発
明の範囲内で初めて可能である。このことは特徴の発現
が細胞内のタンパク質濃度と直接関係する場合に特に重
要である。
ナル、例えばプロモーターおよび終結配列に操作可能に
連結される場合、本発明に係る調節DNA配列は、発現
のレベルにおいて著しい増加を導くが、それは400倍
まで、またはそれ以上の増加であり得る。従って、遺伝
子の発現があまりに低く、そのため細胞中のタンパク質
濃度が低かったから、これまで達成できなかったか、ま
たは不満足な範囲までしが達成できなかった植物におけ
る特定の特徴の表現型発現、例えばある種の病原体また
は化学物質に対する耐性を十分に改善することが、本発
明の範囲内で初めて可能である。このことは特徴の発現
が細胞内のタンパク質濃度と直接関係する場合に特に重
要である。
細胞毒素に対する耐性は、例えば細胞毒素を解毒する酵
素、例えばカナマイシン、ハイグロマイシンおよびその
他のアミノグリコシド抗生物質を解毒するように作用す
るネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■型もしくは
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ■型、また
はグルタチオン−3−)ランスフェラーゼもしくはチト
クロームP−450、またはトリアジン、スルホニル尿
素もしくはその他の除草剤を解毒することが知られてい
るその他の異化的に活性な酵素をコードし、そして植物
細胞内に発現する遺伝子を導入することにより与えられ
てもよい。細胞毒素に対する耐性はまた、細胞毒素の活
性に対して耐性である「標的酵素」の特定の形態(細胞
毒素活性の作用部位)、例えばスルホニル尿素もしくは
イミダゾリノン、またはこの特定の異化段階で相互作用
するその他の除草剤による阻害に対して感受性でないア
セトヒドロキシ酸シンターゼの変形、またはグリホセー
トによる阻害に対して感受性でないことがわかっている
EPSPシンターゼの変形を植物内に発現する遺伝子に
より与えられてもよい。
素、例えばカナマイシン、ハイグロマイシンおよびその
他のアミノグリコシド抗生物質を解毒するように作用す
るネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■型もしくは
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ■型、また
はグルタチオン−3−)ランスフェラーゼもしくはチト
クロームP−450、またはトリアジン、スルホニル尿
素もしくはその他の除草剤を解毒することが知られてい
るその他の異化的に活性な酵素をコードし、そして植物
細胞内に発現する遺伝子を導入することにより与えられ
てもよい。細胞毒素に対する耐性はまた、細胞毒素の活
性に対して耐性である「標的酵素」の特定の形態(細胞
毒素活性の作用部位)、例えばスルホニル尿素もしくは
イミダゾリノン、またはこの特定の異化段階で相互作用
するその他の除草剤による阻害に対して感受性でないア
セトヒドロキシ酸シンターゼの変形、またはグリホセー
トによる阻害に対して感受性でないことがわかっている
EPSPシンターゼの変形を植物内に発現する遺伝子に
より与えられてもよい。
植物細胞での正確な細胞内小器官、例えば上記の例にお
ける葉緑体内へそれらを移送させる形態にあるこれらの
改変された標的酵素を発現することは有利であり得る。
ける葉緑体内へそれらを移送させる形態にあるこれらの
改変された標的酵素を発現することは有利であり得る。
さらにある場合には、ミトコンドリア、液胞、細胞質内
部の小胞もしくはその他の細胞領域内に、または細胞間
空間(アポブラスト)内にも遺伝子産物を導くことは有
利である。
部の小胞もしくはその他の細胞領域内に、または細胞間
空間(アポブラスト)内にも遺伝子産物を導くことは有
利である。
ある種の菌類に対する耐性は、例えば植物組織内にキチ
ナーゼを発現する遺伝子の挿入により与えられてもよい
。非常に多(の植物病原性菌類は、菌糸および胞子構造
の欠(ことのできない成分としてキチンを含有し、例え
ば担子菌類(黒穂菌およびサビ菌)および子のう菌類お
よび不完全菌類〔アルテルナリア(Alternari
a)およびビボラリス(Bipolaris) 、エク
セロフィラム・タルシカム(ExerophiLurn
turcicua)、コレトラトリカム(Colle
10tricua) 、グレオセルコスボラ(GLeo
cercospora)およびセルコスポラ(Cerc
ospora)〕を包含する。キチナーゼは試験管内で
ある種の病原体の菌糸体の増殖を阻害し得る。構造的に
、または病原体侵入に応じてキチナーゼを発現する植物
の葉または根は、非常に多(の異なる菌類の攻撃から保
護される。キチナーゼは最初に新たな合成のための誘発
剤を待つ必要なしに高い濃度ですぐに存在するから、特
別な状態に応じて、構造的な発現は、多(の植物におい
て病原体攻撃に対する正常な応答として起こる誘導性発
現より有利であるかもしれない。
ナーゼを発現する遺伝子の挿入により与えられてもよい
。非常に多(の植物病原性菌類は、菌糸および胞子構造
の欠(ことのできない成分としてキチンを含有し、例え
ば担子菌類(黒穂菌およびサビ菌)および子のう菌類お
よび不完全菌類〔アルテルナリア(Alternari
a)およびビボラリス(Bipolaris) 、エク
セロフィラム・タルシカム(ExerophiLurn
turcicua)、コレトラトリカム(Colle
10tricua) 、グレオセルコスボラ(GLeo
cercospora)およびセルコスポラ(Cerc
ospora)〕を包含する。キチナーゼは試験管内で
ある種の病原体の菌糸体の増殖を阻害し得る。構造的に
、または病原体侵入に応じてキチナーゼを発現する植物
の葉または根は、非常に多(の異なる菌類の攻撃から保
護される。キチナーゼは最初に新たな合成のための誘発
剤を待つ必要なしに高い濃度ですぐに存在するから、特
別な状態に応じて、構造的な発現は、多(の植物におい
て病原体攻撃に対する正常な応答として起こる誘導性発
現より有利であるかもしれない。
タバコから得られる塩基性キチナーゼ遺伝子、特にニコ
チアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ425植物[Bic
hholz et at、1983]の柔細胞髄組織の
クローン化系列から得られ、そして上に示した遺伝子4
8の配列を有する塩基性キチナーゼ遺伝子が本発明の範
囲内で特に好ましい。
チアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ425植物[Bic
hholz et at、1983]の柔細胞髄組織の
クローン化系列から得られ、そして上に示した遺伝子4
8の配列を有する塩基性キチナーゼ遺伝子が本発明の範
囲内で特に好ましい。
昆虫耐性は、例えば昆虫および/またはそれらの幼虫に
対して毒性であるポリペプチド、例えばバチラス・スリ
ンギエンシス(Bacillusthllringie
nsis)の結晶性タンパク質をコードしている遺伝子
により付与され得る。昆虫耐性を与える第二類のタンパ
ク質はプロテアーゼインヒビターである。プロテアーゼ
インヒビターは植物貯蔵構造体の通常の構成要素である
。ダイズから単離・精製されたボウマン−パーク(Bo
wman−Birk)プロテアーゼインヒビターは、テ
ネブリオ幼虫の内蔵プロテアーゼを阻害することが示さ
れた[Birk et aL (1963)] 、ササ
ゲトリブシンインヒビターをコードしている遺伝子は、
Hilder et al (1987)に記載されて
いる。
対して毒性であるポリペプチド、例えばバチラス・スリ
ンギエンシス(Bacillusthllringie
nsis)の結晶性タンパク質をコードしている遺伝子
により付与され得る。昆虫耐性を与える第二類のタンパ
ク質はプロテアーゼインヒビターである。プロテアーゼ
インヒビターは植物貯蔵構造体の通常の構成要素である
。ダイズから単離・精製されたボウマン−パーク(Bo
wman−Birk)プロテアーゼインヒビターは、テ
ネブリオ幼虫の内蔵プロテアーゼを阻害することが示さ
れた[Birk et aL (1963)] 、ササ
ゲトリブシンインヒビターをコードしている遺伝子は、
Hilder et al (1987)に記載されて
いる。
プロテアーゼインヒビターをコードしている遺伝子は、
植物プロモーター、例えばCaMV85Sプロモーター
のような構造的なプロモーターの制御下で適当なベクタ
ー内に導かれていてもよい。遺伝子、例えばダイズボウ
マンーバークブロテアーゼインヒビターのコード配列は
、cDNAクローニング方法を用いて得ることができる
。100個より少ないアミノ酸を有するプロテアーゼイ
ンヒビター、例えばリママメトリブシンインヒビターを
得る方法は、それを合成することである。コード配列は
アミノ酸配列のバックトランスレーションにより予測さ
れ得る。さらに、所望の特定のベクターに対して適当な
制限部位は両端部に包含される。合成遺伝子は30ない
し60塩基対の重複オリゴヌクレオチド断片を合成し、
それらの断片にリン酸転移し、次に互いを連結し[Ma
niatis et aL。
植物プロモーター、例えばCaMV85Sプロモーター
のような構造的なプロモーターの制御下で適当なベクタ
ー内に導かれていてもよい。遺伝子、例えばダイズボウ
マンーバークブロテアーゼインヒビターのコード配列は
、cDNAクローニング方法を用いて得ることができる
。100個より少ないアミノ酸を有するプロテアーゼイ
ンヒビター、例えばリママメトリブシンインヒビターを
得る方法は、それを合成することである。コード配列は
アミノ酸配列のバックトランスレーションにより予測さ
れ得る。さらに、所望の特定のベクターに対して適当な
制限部位は両端部に包含される。合成遺伝子は30ない
し60塩基対の重複オリゴヌクレオチド断片を合成し、
それらの断片にリン酸転移し、次に互いを連結し[Ma
niatis et aL。
(1982)] 、そして最後に適当なベクター内にク
ローン化することにより製造される。その挿入が正確な
配向にあるクローンは、配列決定により同定され得る。
ローン化することにより製造される。その挿入が正確な
配向にあるクローンは、配列決定により同定され得る。
プロトプラスト内への挿入のために、単離されたプラス
ミドDNAが使用され得る。
ミドDNAが使用され得る。
多(の昆虫は、ラメラ層中のキチンミセルが基質内に埋
め込まれているクチクラ骨格を有する。それ故に、病原
虫に対する耐性または少なくとも許容性を生じさせるそ
の他の考えられる方法は、キチナーゼ酵素をコードする
遺伝子の使用であり、そして植物中への挿入の後、それ
をそこで発現させることである。タバコから得られる塩
基性キチナーゼ遺伝子、特にニコチアナ・ツバカムの園
芸品種ハバナ425植物[Bichholz et a
l、1983]の柔細胞髄組織のクローン化系列から得
られ、そして上に示した遺伝子48の配列を有する塩基
性キチナーゼ遺伝子が本発明の範囲内で特に好ましい。
め込まれているクチクラ骨格を有する。それ故に、病原
虫に対する耐性または少なくとも許容性を生じさせるそ
の他の考えられる方法は、キチナーゼ酵素をコードする
遺伝子の使用であり、そして植物中への挿入の後、それ
をそこで発現させることである。タバコから得られる塩
基性キチナーゼ遺伝子、特にニコチアナ・ツバカムの園
芸品種ハバナ425植物[Bichholz et a
l、1983]の柔細胞髄組織のクローン化系列から得
られ、そして上に示した遺伝子48の配列を有する塩基
性キチナーゼ遺伝子が本発明の範囲内で特に好ましい。
病原体に対する植物の保護機構において中心的な役割を
おそら(演じるその他の酵素はβ−1,8−グルカナー
ゼであり、それ故に、この酵素もまた本発明の範囲内で
好ましい。
おそら(演じるその他の酵素はβ−1,8−グルカナー
ゼであり、それ故に、この酵素もまた本発明の範囲内で
好ましい。
上記全ての場合において、挿入された遺伝子の発現が増
加し、そしてその結果としてタンパク質(酵素)a度が
高まるので、植物に対する保護作用が高まるであろうこ
とが期待されるべきである。
加し、そしてその結果としてタンパク質(酵素)a度が
高まるので、植物に対する保護作用が高まるであろうこ
とが期待されるべきである。
驚(べきことに、本発明の範囲内で、植物内で発現して
該植物に対して保護作用を導く構造遺伝子を本発明に係
る調節DNA配列に、そして所望によりさらに発現に必
要な配列部位ならびに転写や翻訳の制御に必要な配列部
位(なお、これらの配列部位は標的植物に関して相同お
よび非相同の起源であってよい)に操作可能に連結し、
そして生成するキメラ遺伝子構築物をそれ自体公知の方
法により標的植物内に挿入することにより挿入された外
来遺伝子の発現のレベルにおける増加を達成することが
今回能となった。
該植物に対して保護作用を導く構造遺伝子を本発明に係
る調節DNA配列に、そして所望によりさらに発現に必
要な配列部位ならびに転写や翻訳の制御に必要な配列部
位(なお、これらの配列部位は標的植物に関して相同お
よび非相同の起源であってよい)に操作可能に連結し、
そして生成するキメラ遺伝子構築物をそれ自体公知の方
法により標的植物内に挿入することにより挿入された外
来遺伝子の発現のレベルにおける増加を達成することが
今回能となった。
形質転換された植物細胞およびそれらから発生する組織
、そして特に植物に保護作用、例えば病原体(例えば植
物病原性菌類、バクテリア、ウィルスその他)に対する
増加した耐性:化学物質〔例えば除草剤(例えばトリア
ジン、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾール
ピリミジン、ビアラホス、グリホセートその他)、殺虫
剤もしくはその他の殺生物剤〕に対する耐性;不利な環
境要因(例えば暑さ、寒さ、風、不利な土壌条件、湿気
、乾燥その他)に対する耐性を導く全ての遺伝子が本発
明の方法における使用に特に適している。
、そして特に植物に保護作用、例えば病原体(例えば植
物病原性菌類、バクテリア、ウィルスその他)に対する
増加した耐性:化学物質〔例えば除草剤(例えばトリア
ジン、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾール
ピリミジン、ビアラホス、グリホセートその他)、殺虫
剤もしくはその他の殺生物剤〕に対する耐性;不利な環
境要因(例えば暑さ、寒さ、風、不利な土壌条件、湿気
、乾燥その他)に対する耐性を導く全ての遺伝子が本発
明の方法における使用に特に適している。
本発明に係るDNA配列はまた、植物細胞自体またはよ
り高度なオーガナイゼーション単位、例えば組織、カル
ス、器官、胚または全体の植物の一部に望ましく有用な
化合物の産生における可能な増加を生じさせるために理
想的な様式で使用され得る。本発明のI!!囲内で使用
され得る遺伝子は、例えば、葉、種子、塊茎、根、茎そ
の他における保存物質または貯蔵物質の増加した形成を
導く遺伝子を包含する。トランスジェニック植物により
産生され得る望ましい物質は、例えばタンパク質、デン
プン、糖、アミノ酸、ビタミン、アルカロイド、フラビ
ン、芳香剤および色素、脂肪その他を包含する。
り高度なオーガナイゼーション単位、例えば組織、カル
ス、器官、胚または全体の植物の一部に望ましく有用な
化合物の産生における可能な増加を生じさせるために理
想的な様式で使用され得る。本発明のI!!囲内で使用
され得る遺伝子は、例えば、葉、種子、塊茎、根、茎そ
の他における保存物質または貯蔵物質の増加した形成を
導く遺伝子を包含する。トランスジェニック植物により
産生され得る望ましい物質は、例えばタンパク質、デン
プン、糖、アミノ酸、ビタミン、アルカロイド、フラビ
ン、芳香剤および色素、脂肪その他を包含する。
薬学的に活性な物質、例えばある種のアルカロイド、ス
テロイド、ホルモン、免疫モジュレータ−およびその他
の生理学的に活性な物質をコードする構造遺伝子もまた
、本発明に係る調節DNA配列に結合され得る。
テロイド、ホルモン、免疫モジュレータ−およびその他
の生理学的に活性な物質をコードする構造遺伝子もまた
、本発明に係る調節DNA配列に結合され得る。
それ故に、本発明範囲内で考慮され得る遺伝子は公知遺
伝子、例えば植物に特有の遺伝子、例えばトウモロコシ
からのゼイン遺伝子、オート麦からのアペニン遺伝子、
イネからのグルテリン遺伝子等、哺乳類特有の遺伝子、
例えばインシュリン遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、イ
ンターロイキン遺伝子、t−PA−遺伝子等、または微
生物起源の遺伝子、例えばNPTI[遺伝子等ならびに
合成遺伝子、例えばインシュリン遺伝子等を包含するが
、しかしこれに限定されない。
伝子、例えば植物に特有の遺伝子、例えばトウモロコシ
からのゼイン遺伝子、オート麦からのアペニン遺伝子、
イネからのグルテリン遺伝子等、哺乳類特有の遺伝子、
例えばインシュリン遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、イ
ンターロイキン遺伝子、t−PA−遺伝子等、または微
生物起源の遺伝子、例えばNPTI[遺伝子等ならびに
合成遺伝子、例えばインシュリン遺伝子等を包含するが
、しかしこれに限定されない。
有用でそして望ましい特性をコードする天然に生じる構
造遺伝子を別にして、本発明の範囲内で、化学的方法ま
たは遺伝子操作方法を用いる特定の方法で予め変形した
遺伝子を使用することも可能である。
造遺伝子を別にして、本発明の範囲内で、化学的方法ま
たは遺伝子操作方法を用いる特定の方法で予め変形した
遺伝子を使用することも可能である。
さらに、本発明の広い概念はまた、化学合成により全体
が製造される遺伝子も包含する。それ故に、本発明の範
囲内で使用され得る遺伝子またはDNA配列は、本発明
の範囲内で与えられた定義に従う、相同および非相同遺
伝子またはDNAおよび合成遺伝子またはDNAである
。
が製造される遺伝子も包含する。それ故に、本発明の範
囲内で使用され得る遺伝子またはDNA配列は、本発明
の範囲内で与えられた定義に従う、相同および非相同遺
伝子またはDNAおよび合成遺伝子またはDNAである
。
インシュリン遺伝子がこの点で合成遺伝子の例として記
載され得る。
載され得る。
本発明の範囲内で、植物細胞内で活性な発現シグナルと
操作可能に連結されて、センスDNAによりコードされ
たmRNAの少なくとも一部に相補的であり、それ故に
該mRNAを結合し得るRNA分子の産生を導くいわゆ
るアンチセンスDNAを使用することも可能である。こ
の様式で、特定のmRNAの相当するタンパク質への翻
訳は防止されるか、または少なくとも制限され得、その
結果、ある手段が植物において選択された遺伝子の遺伝
子発現を有効に制御するために利用可能である。
操作可能に連結されて、センスDNAによりコードされ
たmRNAの少なくとも一部に相補的であり、それ故に
該mRNAを結合し得るRNA分子の産生を導くいわゆ
るアンチセンスDNAを使用することも可能である。こ
の様式で、特定のmRNAの相当するタンパク質への翻
訳は防止されるか、または少なくとも制限され得、その
結果、ある手段が植物において選択された遺伝子の遺伝
子発現を有効に制御するために利用可能である。
本発明の範囲内で使用され得るDNA配列は、ゲノムD
NAから、cDNAから、または合成DNAから排他的
に構築される得る。もう一つの可能性は、cDNAおよ
びゲノムDNAおよび/または合成DNAからなるハイ
ブリッドDNA配列の構築である。
NAから、cDNAから、または合成DNAから排他的
に構築される得る。もう一つの可能性は、cDNAおよ
びゲノムDNAおよび/または合成DNAからなるハイ
ブリッドDNA配列の構築である。
その場合、cDNAはゲノムDNAと同じ遺伝子から生
じてもよく、またcDNAとゲノムDNAの両方が異な
る遺伝子から生じてもよい。
じてもよく、またcDNAとゲノムDNAの両方が異な
る遺伝子から生じてもよい。
しかしながら、あらゆる場合において、ゲノムDNAお
よび/またはcDNAは同一遺伝子または異なる遺伝子
から個々に各々製造されてもよい。
よび/またはcDNAは同一遺伝子または異なる遺伝子
から個々に各々製造されてもよい。
DNA配列が1以上の遺伝子の部分を含む場合には、こ
れらの遺伝子は1種そして同一個体に由来しても、また
は同−属の同一種もしくは様々な種の種々の株もしくは
変種に属する種々の個体に由来しても、また同一もしく
は異なる分類学上の単位(門)の1以上の属に属する個
体に由来してもよい。
れらの遺伝子は1種そして同一個体に由来しても、また
は同−属の同一種もしくは様々な種の種々の株もしくは
変種に属する種々の個体に由来しても、また同一もしく
は異なる分類学上の単位(門)の1以上の属に属する個
体に由来してもよい。
植物細胞中の上記構造遺伝子の発現を確実にするために
、コード遺伝子配列は植物細胞内で機能し得る発現配列
に操作可能な様式で最初に連結されることが有利である
。
、コード遺伝子配列は植物細胞内で機能し得る発現配列
に操作可能な様式で最初に連結されることが有利である
。
従って、本発明の範囲内のハイブリッド遺伝子構築物は
、本発明に係る調節liDNA配列に加えて、1種また
はそれ以上の構造遺伝子ならびにプロモーターおよびタ
ーミネータ−配列の両方および31および51非翻訳領
域のその他の調節配列を包含する発現シグナルを含有す
る。
、本発明に係る調節liDNA配列に加えて、1種また
はそれ以上の構造遺伝子ならびにプロモーターおよびタ
ーミネータ−配列の両方および31および51非翻訳領
域のその他の調節配列を包含する発現シグナルを含有す
る。
コードDNA配列(構造遺伝子)の発現の誘導を引き起
こし得るあらゆるプロモーターおよびあらゆるターミネ
ータ−をハイブリッド遺伝子配列の成分として使用し得
る。植物または植物ウィルスの遺伝子に由来する発現シ
グナルは特に適当である。適当なプロモーターおよびタ
ーミネータ−の例は、カリフラワーモザイクウィルス遺
伝子(CaMV)のもの、または記載した発現シグナル
の特徴的な特性を依然有する相同DNA配列である。細
菌の発現シグナル、特にアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのTiプラスミドからのツバリンシンターゼ
遺伝子(nos)またはオクトピンシンターゼ遺伝子(
OCS)もまた適当である。
こし得るあらゆるプロモーターおよびあらゆるターミネ
ータ−をハイブリッド遺伝子配列の成分として使用し得
る。植物または植物ウィルスの遺伝子に由来する発現シ
グナルは特に適当である。適当なプロモーターおよびタ
ーミネータ−の例は、カリフラワーモザイクウィルス遺
伝子(CaMV)のもの、または記載した発現シグナル
の特徴的な特性を依然有する相同DNA配列である。細
菌の発現シグナル、特にアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのTiプラスミドからのツバリンシンターゼ
遺伝子(nos)またはオクトピンシンターゼ遺伝子(
OCS)もまた適当である。
CaMVゲノムの353および193発現シグナルまた
はそれらの相同物が本発明の範囲内で好ましく、例えば
Maniatis et at、 (1982)に記載
されるような分子生物学的方法を用いて前記ゲノムから
単離され、そしてコードDNA配列に結合され得る。
はそれらの相同物が本発明の範囲内で好ましく、例えば
Maniatis et at、 (1982)に記載
されるような分子生物学的方法を用いて前記ゲノムから
単離され、そしてコードDNA配列に結合され得る。
35Sおよび193発現シグナルの相同物は、本発明の
範囲内で、わずかな配列の相違があっても実質的に出発
配列と実質的に相同であり、そしてそれらの出発配列と
同一の機能を依然有する配列を意味するものとして理解
されるべきである。
範囲内で、わずかな配列の相違があっても実質的に出発
配列と実質的に相同であり、そしてそれらの出発配列と
同一の機能を依然有する配列を意味するものとして理解
されるべきである。
本発明に従って、35S転写制御配列に使用される出発
材料は、例えば遺伝子地図[Frank Get aL
、 (1980)]の]ヌクレオチド6808−763
を包含するCaMV“S“株のSca I断片であって
よい。
材料は、例えば遺伝子地図[Frank Get aL
、 (1980)]の]ヌクレオチド6808−763
を包含するCaMV“S“株のSca I断片であって
よい。
19Sプロモーターおよび51非翻訳領域は、CaMV
遺伝子地図[Hohn et at、 (1982)]
のPSt1部位(5386位)とHindI[I部位(
5850位)との間のゲノム断片上に位置する。相当す
るターミネータ−および3′非翻訳領域は、CaMVゲ
ノムの7342位と7643位との間の8coRV/
BglII断片上に位置する。
遺伝子地図[Hohn et at、 (1982)]
のPSt1部位(5386位)とHindI[I部位(
5850位)との間のゲノム断片上に位置する。相当す
るターミネータ−および3′非翻訳領域は、CaMVゲ
ノムの7342位と7643位との間の8coRV/
BglII断片上に位置する。
完全なヌクレオチド配列がGardner RCet
al。
al。
(1981)に記載されているCaMV CMI 84
1株の発現シグナルが本発明の範囲内で好ましい。
1株の発現シグナルが本発明の範囲内で好ましい。
使用し得る効果的な植物プロモーターのもう1つの例は
、過産生植物プロモーターである。
、過産生植物プロモーターである。
この種のプロモーターは、所望の遺伝子産物をコードす
る遺伝子配列に操作可能に連結されているならば、前記
遺伝子配列の発現を仲介可能であるべきでる。
る遺伝子配列に操作可能に連結されているならば、前記
遺伝子配列の発現を仲介可能であるべきでる。
本発明の範囲内で使用し得る過産生植物プロモータは、
ダイズからのりブロース−1,5ビスホスフエートカル
ボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターおよびク
ロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーターを包含
する。
ダイズからのりブロース−1,5ビスホスフエートカル
ボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターおよびク
ロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーターを包含
する。
これらの2種のプロモーターは、それらが真核植物細胞
において光により誘導されるという事実で知られている
〔例えば、Genetic Engineering
of Plants、 An Agricultura
l Perspective。
において光により誘導されるという事実で知られている
〔例えば、Genetic Engineering
of Plants、 An Agricultura
l Perspective。
Cashmore A(1983)参照)。
それ故に、本発明は、本発明に係る調節発現増加性DN
A配列が発現性DNAおよび植物細胞内で活性なその他
の発現性シグナルに操作可能に連結され、その結果植物
宿主内での形質転換で前記の操作可能に結合された発現
性DNAの発現のレベルにおける著しい増加が得られる
キメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA分子に関する。
A配列が発現性DNAおよび植物細胞内で活性なその他
の発現性シグナルに操作可能に連結され、その結果植物
宿主内での形質転換で前記の操作可能に結合された発現
性DNAの発現のレベルにおける著しい増加が得られる
キメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA分子に関する。
本発明に係る調節発現増加性DNA配列が形質転換され
た植物細胞およびそれらから発生する組織、特に植物に
、病原体、化学物質および不利な(土壌または大気の)
環境要因に対する保護作用を付与する構造遺伝子と操作
可能に連結されているキメラ遺伝子構築物を含む組換え
DNA分子が特に好ましい。
た植物細胞およびそれらから発生する組織、特に植物に
、病原体、化学物質および不利な(土壌または大気の)
環境要因に対する保護作用を付与する構造遺伝子と操作
可能に連結されているキメラ遺伝子構築物を含む組換え
DNA分子が特に好ましい。
本発明に係る調節発現増加性DNAが植物細胞内でキチ
ナーゼまたはグルカナーゼを発現する構造遺伝子と操作
可能に結合されているキメラ遺伝子構築物を含む組換え
DNA分子が本発明の範囲内でとりわけ好ましい。
ナーゼまたはグルカナーゼを発現する構造遺伝子と操作
可能に結合されているキメラ遺伝子構築物を含む組換え
DNA分子が本発明の範囲内でとりわけ好ましい。
本発明はまた、形質転換された植物細胞自体または組織
、器官、カルス、胚および全体の植物からなる群から選
択されるより高度なオーガナイゼーション単位の部分に
おいて発現して、望ましく有用な化合物の産生の増加を
導く、構造遺伝子と本発明に係る調節発現増加性DNA
配列が操作可能に結合されているキメラ遺伝子構築物を
含む組換えDNA分子を包含する。
、器官、カルス、胚および全体の植物からなる群から選
択されるより高度なオーガナイゼーション単位の部分に
おいて発現して、望ましく有用な化合物の産生の増加を
導く、構造遺伝子と本発明に係る調節発現増加性DNA
配列が操作可能に結合されているキメラ遺伝子構築物を
含む組換えDNA分子を包含する。
キメラ遺伝子の横築に使用され得るその他の調節DNA
配列は、例えば誘導または抑制によって植物組織内で結
合DNA配列の転写を制御し得る配列を包含する。
配列は、例えば誘導または抑制によって植物組織内で結
合DNA配列の転写を制御し得る配列を包含する。
種々の内部および外部要因、例えば植物ホルモン、熱シ
ョック、化学物質、病原体、酸素不足、光その他により
誘導されることが知られている個々の植物遺伝子が例と
して挙げられる。
ョック、化学物質、病原体、酸素不足、光その他により
誘導されることが知られている個々の植物遺伝子が例と
して挙げられる。
植物ホルモンによる遺伝子調節の例として、ワタの後胚
期の間に生じる過剰のmRNAを誘導することが知られ
ているアブシジン酸(ABS)が言及されるべきである
。その他の例は、ヒマの実におけるマレートシンターゼ
転写物および大麦の糊粉層におけるα−アミラーゼのイ
ソ酵素を誘導するジベレリン酸(GA3)である。
期の間に生じる過剰のmRNAを誘導することが知られ
ているアブシジン酸(ABS)が言及されるべきである
。その他の例は、ヒマの実におけるマレートシンターゼ
転写物および大麦の糊粉層におけるα−アミラーゼのイ
ソ酵素を誘導するジベレリン酸(GA3)である。
マメの葉におけるグルカナーゼおよびキチナーゼの活性
はストレスホルモンエチレンとの処理により著しく高め
られ得る。キチナーゼの場合、誘導作用はキチナーゼ遺
伝子のプロモーターを介して制御され、そしてマメ〔フ
ァセオルス・ヴアルガリス(Phaseolus vu
lgaris))のキチナーゼ遺伝子からのプロモータ
ーを用いるリポータ−遺伝子試験により、これを示すこ
とが可能だった。
はストレスホルモンエチレンとの処理により著しく高め
られ得る。キチナーゼの場合、誘導作用はキチナーゼ遺
伝子のプロモーターを介して制御され、そしてマメ〔フ
ァセオルス・ヴアルガリス(Phaseolus vu
lgaris))のキチナーゼ遺伝子からのプロモータ
ーを用いるリポータ−遺伝子試験により、これを示すこ
とが可能だった。
ダイズの熱ショック感受性タンパク質遺伝子の調節は詳
細に研究されてきた。40℃の温度で数時間植物を処理
すると、いわゆる熱シヨツクタンパク質の新たな合成を
生じる。これまで非常に多くの遺伝子が単離され、そし
てそれらの調節が詳細に分析された。それらの遺伝子の
発現は転写段階で主として制御される。例えば、hps
70遺伝子のプロモーターがネ、9オマイシンホスホト
ランスフェラーゼI[(NPTII)遺伝子と融合され
る場合、その様にして形成されたキメラ遺伝子は熱ショ
ックにより誘導され得る(Spena et aL、
1985)。
細に研究されてきた。40℃の温度で数時間植物を処理
すると、いわゆる熱シヨツクタンパク質の新たな合成を
生じる。これまで非常に多くの遺伝子が単離され、そし
てそれらの調節が詳細に分析された。それらの遺伝子の
発現は転写段階で主として制御される。例えば、hps
70遺伝子のプロモーターがネ、9オマイシンホスホト
ランスフェラーゼI[(NPTII)遺伝子と融合され
る場合、その様にして形成されたキメラ遺伝子は熱ショ
ックにより誘導され得る(Spena et aL、
1985)。
植物内に誘導可能な遺伝子のもう一つのクラスは、光誘
導化遺伝子、特にリブロース1. 5=ビスホスフエー
トカルボキシラーゼ(RUBISCO)の小サブユニッ
トの核コード化遺伝子からなる。Morelli et
aL (1985)は、リポータ−遺伝子がエントウ
からのRUB I 5COa伝子の51−フランキング
配列にキメラの形態で連結される場合に、該5′一フラ
ンキング配列がリポータ−遺伝子に光誘導性を導入し得
ることを示した。この観察をその他の光誘導化遺伝子、
例えばクロロフィルa / b結合タンパク質に広げる
ことも可能となった。
導化遺伝子、特にリブロース1. 5=ビスホスフエー
トカルボキシラーゼ(RUBISCO)の小サブユニッ
トの核コード化遺伝子からなる。Morelli et
aL (1985)は、リポータ−遺伝子がエントウ
からのRUB I 5COa伝子の51−フランキング
配列にキメラの形態で連結される場合に、該5′一フラ
ンキング配列がリポータ−遺伝子に光誘導性を導入し得
ることを示した。この観察をその他の光誘導化遺伝子、
例えばクロロフィルa / b結合タンパク質に広げる
ことも可能となった。
トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(a
dh遺伝子)が鋭意研究の対象だった。トウモロコシか
らadhl−s遺伝子が単離され、そして−時的に形質
転換された組織が嫌気条件下に暴露されたとき51−フ
ランキングDNAがキメラリポータ−遺伝子(例えばク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、CA
T)の発現を誘導し得ることが示された[Howard
et at (1987)]。
dh遺伝子)が鋭意研究の対象だった。トウモロコシか
らadhl−s遺伝子が単離され、そして−時的に形質
転換された組織が嫌気条件下に暴露されたとき51−フ
ランキングDNAがキメラリポータ−遺伝子(例えばク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、CA
T)の発現を誘導し得ることが示された[Howard
et at (1987)]。
制御可能なDNA配列のその他の群は化学的に制御可能
な配列であり、それは例えばタバコのPR(病原体関連
)タンパク質遺伝子内に存在し、そして化学調節剤によ
り誘導され得る。
な配列であり、それは例えばタバコのPR(病原体関連
)タンパク質遺伝子内に存在し、そして化学調節剤によ
り誘導され得る。
上に例示した調節性DNA配列は、天然起源または合成
起源であってよく、また天然および合成DNA配列の混
合物からなっていてよい。
起源であってよく、また天然および合成DNA配列の混
合物からなっていてよい。
それ故に、本発明は本発明に係る調節DNA配列の他に
、構造遺伝子、そして例えば遺伝子発現の特異的に制御
された誘導または抑制を可能にするDNA配列のその他
の調節部位を操作可能に連結されて含むキメラ遺伝子構
築物を包含する。
、構造遺伝子、そして例えば遺伝子発現の特異的に制御
された誘導または抑制を可能にするDNA配列のその他
の調節部位を操作可能に連結されて含むキメラ遺伝子構
築物を包含する。
配列の種々の部位はそれ自体公知の方法により互いに連
結されて、植物細胞内で発現可能な完全なDNA配列を
形成する。適当な方法は、例えば相同部位を有するDN
A配列の生体内組換えおよび制限断片の試験管内連結を
包含する。
結されて、植物細胞内で発現可能な完全なDNA配列を
形成する。適当な方法は、例えば相同部位を有するDN
A配列の生体内組換えおよび制限断片の試験管内連結を
包含する。
一般的に使用されるクローニングベクターは宿主細胞に
適合する種起源の、複製および制御配列を有するプラス
ミドまたはウィルス(バクテリオファージ)ベクターで
ある。
適合する種起源の、複製および制御配列を有するプラス
ミドまたはウィルス(バクテリオファージ)ベクターで
ある。
クローニングベクターは一般的に、一つの複製開始点、
そしてさらに形質転換された宿主細胞内で表現型の選択
特性、特に抗生物質またはある種の除草剤に対する耐性
を導く特有の遺伝子を有する。宿主細胞内で形質転換後
、形質転換されたベクターはこれらの表現型マーカーに
より選択され得る。
そしてさらに形質転換された宿主細胞内で表現型の選択
特性、特に抗生物質またはある種の除草剤に対する耐性
を導く特有の遺伝子を有する。宿主細胞内で形質転換後
、形質転換されたベクターはこれらの表現型マーカーに
より選択され得る。
本発明の範囲内で使用され得る選択可能な表現型マーカ
ーは、例えばこれが本発明の主題を限定することな(ア
ンピシリン、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、カ
ナマイシン、メトトレキサート、0418およびネオマ
イシンに対する耐性を包含する。
ーは、例えばこれが本発明の主題を限定することな(ア
ンピシリン、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、カ
ナマイシン、メトトレキサート、0418およびネオマ
イシンに対する耐性を包含する。
本発明の範囲内の適当な宿主細胞は、原核生物であり、
細菌宿主、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス(A、tumefaciens) 、大腸菌(E、
coLi) 、ニス、・チフイムリウム(S、 typ
himuriua)およびセルラチア・マルセッセンス
(Serratia aarcescens)およびシ
アノバクテリアを含む。真核生物宿主、例えば酵母、菌
糸体形成菌および植物細胞も本発明の範囲内で使用でき
る。
細菌宿主、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス(A、tumefaciens) 、大腸菌(E、
coLi) 、ニス、・チフイムリウム(S、 typ
himuriua)およびセルラチア・マルセッセンス
(Serratia aarcescens)およびシ
アノバクテリアを含む。真核生物宿主、例えば酵母、菌
糸体形成菌および植物細胞も本発明の範囲内で使用でき
る。
本発明に係るハイブリッド遺伝子構築物の適当なりロー
ニングベクター内へのスプライシングは、例えばMan
iatis et aL、 (1982)に記載された
標準法を用いて行われる。
ニングベクター内へのスプライシングは、例えばMan
iatis et aL、 (1982)に記載された
標準法を用いて行われる。
一般的に、スプライシングされるべきベクターおよびD
NA配列をまず最初に適当な制限酵素で切断する。適当
な制限酵素は、例えばプラント末端を有する断片を生じ
るもの、例えばSma I、Hpa IおよびBcoR
V、または粘着端を形成する酵素、例えばBcoRl、
Sac IおよびBam旧である。
NA配列をまず最初に適当な制限酵素で切断する。適当
な制限酵素は、例えばプラント末端を有する断片を生じ
るもの、例えばSma I、Hpa IおよびBcoR
V、または粘着端を形成する酵素、例えばBcoRl、
Sac IおよびBam旧である。
プラント末端を有する断片と互いに相補的である粘着端
を有する断片の両方を、適当なDNAリガーゼにより再
び連結し、連続的で均一なDNA分子を形成することが
できる。
を有する断片の両方を、適当なDNAリガーゼにより再
び連結し、連続的で均一なDNA分子を形成することが
できる。
突出する粘着端を有するDNA断片を大腸菌DNAポリ
メラーゼのフレノウ断片と処理して、相当する相補的ヌ
クレオチドで空隙を充填することによりプラント末端を
製造することもできる。
メラーゼのフレノウ断片と処理して、相当する相補的ヌ
クレオチドで空隙を充填することによりプラント末端を
製造することもできる。
他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを用いて所望のDNA配列および切断されたベ
クター分子の端部に相補的ホモポリマー足部を添加する
か、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチ
ド配列(リンカ−)を添加し、そして次に適当な酵素で
切断することにより、粘着端を人工的に製造することも
できる。
ェラーゼを用いて所望のDNA配列および切断されたベ
クター分子の端部に相補的ホモポリマー足部を添加する
か、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチ
ド配列(リンカ−)を添加し、そして次に適当な酵素で
切断することにより、粘着端を人工的に製造することも
できる。
クローニングベクターおよび該ベクターで形質転換され
た宿主細胞は、一般にベクターのコピー数を増やすため
に使用される。増加したコピー数によって、ハイプツト
遺伝子構築物を有するベクターを単離すること、そして
例えばキメラ遺伝子配列を植物細胞内に挿入するために
前記ベクターを使用することが可能となる。
た宿主細胞は、一般にベクターのコピー数を増やすため
に使用される。増加したコピー数によって、ハイプツト
遺伝子構築物を有するベクターを単離すること、そして
例えばキメラ遺伝子配列を植物細胞内に挿入するために
前記ベクターを使用することが可能となる。
その他の操作段階において、所望の遺伝子産物をコード
する構造遺伝子または制御機能を有する非コードDNA
配列、例えばアンチセンスDNAを植物細胞内に挿入し
、そして場合によってはそれを植物ゲノム内に組み込む
ために上記プラスミドを使用することができる。
する構造遺伝子または制御機能を有する非コードDNA
配列、例えばアンチセンスDNAを植物細胞内に挿入し
、そして場合によってはそれを植物ゲノム内に組み込む
ために上記プラスミドを使用することができる。
本発明はそれ故に、構造遺伝子またはその他の望ましい
遺伝子または遺伝子断片またはそれらのゲノム内に含ま
れるその他の有用なDNA配列を含む受容性植物細胞の
作成にも関する。
遺伝子または遺伝子断片またはそれらのゲノム内に含ま
れるその他の有用なDNA配列を含む受容性植物細胞の
作成にも関する。
キメラ遺伝子構築物の挿入は公知の遺伝子導入方法を用
いて植物プロトプラスト中で行われるのが好ましい。
いて植物プロトプラスト中で行われるのが好ましい。
多くの非常に有効な方法が植物細胞中にDNAを導くた
めに存在しており、該方法は遺伝子導入ベクターの使用
または直接遺伝子導入方法に基づいている。
めに存在しており、該方法は遺伝子導入ベクターの使用
または直接遺伝子導入方法に基づいている。
一つの可能な方法は、例えば植物細胞をウィルスまたは
アグロバクテリウムと接触させることからなる。これは
、感受性植物細胞を感染させるか、または該植物細胞か
ら誘導されたプロトプラストを共培養することにより達
成され得る。本発明の範囲内でカリフラワーモザイクウ
ィルス(CaMV)が植物内への本発明に係るキメラ遺
伝子構築物の挿入のためのベクターとして使用されても
よい。CaM’Vの全ウイルスDNAゲノムが細菌親プ
ラスミド内に組み込まれ、細菌中で増殖され得る組換え
DNA分子を形成する。クローニングが行われた後、組
換えプラスミドは制限酵素を用いて無作為にまたは該組
換えプラスミドのウィルス部分、例えばアフィドにより
ウィルスの移動性をコードする遺伝子内の非常に特異的
な非必須部位で切断し、そしてハイブリッド遺伝子構築
物が切断部位中にクローン化される。
アグロバクテリウムと接触させることからなる。これは
、感受性植物細胞を感染させるか、または該植物細胞か
ら誘導されたプロトプラストを共培養することにより達
成され得る。本発明の範囲内でカリフラワーモザイクウ
ィルス(CaMV)が植物内への本発明に係るキメラ遺
伝子構築物の挿入のためのベクターとして使用されても
よい。CaM’Vの全ウイルスDNAゲノムが細菌親プ
ラスミド内に組み込まれ、細菌中で増殖され得る組換え
DNA分子を形成する。クローニングが行われた後、組
換えプラスミドは制限酵素を用いて無作為にまたは該組
換えプラスミドのウィルス部分、例えばアフィドにより
ウィルスの移動性をコードする遺伝子内の非常に特異的
な非必須部位で切断し、そしてハイブリッド遺伝子構築
物が切断部位中にクローン化される。
単一の特定の制限認識部位を有する小さいオリゴヌクレ
オチド、いわゆるリンカ−もまた組み込まれ得る。その
ようにして変形された組換えプラスミドは再びクローン
化され、そしてハイブリッド遺伝子構築物をたった一度
出現する制限部位中にスプライシングさせることにより
さらに変形される。
オチド、いわゆるリンカ−もまた組み込まれ得る。その
ようにして変形された組換えプラスミドは再びクローン
化され、そしてハイブリッド遺伝子構築物をたった一度
出現する制限部位中にスプライシングさせることにより
さらに変形される。
組換えプラスミドの変形ウィルス部分は次いで細菌の親
プラスミドから切り出され、そして植物細胞または全体
の植物の接種のために使用される。
プラスミドから切り出され、そして植物細胞または全体
の植物の接種のために使用される。
キメラ遺伝子構築物を細胞中に挿入するもう一つの方法
は、該遺伝子構築物を用いて形質転換されたアグロバク
テリウム・チュメファシエンスおよび/またはアグロバ
クテリウム・リゾゲネスでの植物細胞の感染を利用する
。トランスジェニック植物細胞は次に当業者には公知の
適当な培養条件下で培養され、その結果それらは苗条お
よび根を形成し、そして全体の植物が最終的に形成され
る。
は、該遺伝子構築物を用いて形質転換されたアグロバク
テリウム・チュメファシエンスおよび/またはアグロバ
クテリウム・リゾゲネスでの植物細胞の感染を利用する
。トランスジェニック植物細胞は次に当業者には公知の
適当な培養条件下で培養され、その結果それらは苗条お
よび根を形成し、そして全体の植物が最終的に形成され
る。
′植物材料を形質転換するもう一つの可能な方法は、P
etit et aL (1986)にニンジンの形質
転換のために記載されたように、アグロバクテリウム・
リゾゲネスおよび形質転換されたアグロバクテリウム・
チュメファシエンスの両方を用いる混合感染からなる。
etit et aL (1986)にニンジンの形質
転換のために記載されたように、アグロバクテリウム・
リゾゲネスおよび形質転換されたアグロバクテリウム・
チュメファシエンスの両方を用いる混合感染からなる。
混合比率は、アグロバクテリウム・リゾゲネスの形質転
換に基づいて形成された根コロニーが高比率のアグロバ
クテリウム・チュメファシエンスTiプラスミドを含む
ようでなければならない。このことは、例えば、アグロ
バクテリウム・リゾゲネスおよびアグロバクテリウム・
チュメファシエンスを一緒に植物材料に公知方法により
混合比率1:1ないしl:100で、好ましくは1:l
Oで適用することにより達成され得る。トランスジェニ
ック植物は次に当業者には公知の適当な培養条件下で培
養され、その結果それらは苗条および根を形成し、そし
て全体の植物が最終的に形成される。2つのアグロバク
テリウム種は、形質転換されるべき植物材料の実際の接
種直前に混合されるのが有利である。
換に基づいて形成された根コロニーが高比率のアグロバ
クテリウム・チュメファシエンスTiプラスミドを含む
ようでなければならない。このことは、例えば、アグロ
バクテリウム・リゾゲネスおよびアグロバクテリウム・
チュメファシエンスを一緒に植物材料に公知方法により
混合比率1:1ないしl:100で、好ましくは1:l
Oで適用することにより達成され得る。トランスジェニ
ック植物は次に当業者には公知の適当な培養条件下で培
養され、その結果それらは苗条および根を形成し、そし
て全体の植物が最終的に形成される。2つのアグロバク
テリウム種は、形質転換されるべき植物材料の実際の接
種直前に混合されるのが有利である。
本発明に係るキメラ遺伝子構築物は、それ故に、例えば
アグロバクテリウム・チュメファシエンスのTiプラス
ミドまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスのRiプラ
スミドにより適当な植物細胞内に形質転換され得る。T
iプラスミドまたはRiプラスミドはアグロバクテリウ
ムによる感染を介して植物に導入され、そして適当な様
式で植物ゲノム内に組み込まれる。
アグロバクテリウム・チュメファシエンスのTiプラス
ミドまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスのRiプラ
スミドにより適当な植物細胞内に形質転換され得る。T
iプラスミドまたはRiプラスミドはアグロバクテリウ
ムによる感染を介して植物に導入され、そして適当な様
式で植物ゲノム内に組み込まれる。
TiプラスミドおよびRiプラスミドの両方は形質転換
された細胞の産生に必須である2つの領域を有する。そ
れらの領域の1つ、トランスファーDNA (T−DN
A)領域は植物に導入され、そして腫瘍の誘導を導く。
された細胞の産生に必須である2つの領域を有する。そ
れらの領域の1つ、トランスファーDNA (T−DN
A)領域は植物に導入され、そして腫瘍の誘導を導く。
その他の領域、毒性付与(v i r)領域は、腫瘍の
維持のためでな(、腫瘍形成のためにだけ必要である。
維持のためでな(、腫瘍形成のためにだけ必要である。
トランスファーDNA領域の大きさは移動性を損傷する
ことな(キメラ遺伝子構築物の組み込みにより大型化さ
れ得る。腫瘍誘導遺伝子を除去し、そして選択性マーカ
ーを組み込むことにより、変形されたTiプラスミドま
たはRiプラスミドは適当な植物細胞内への本発明に係
る遺伝子構築物の導入のためのベクターとして使用され
る得る。
ことな(キメラ遺伝子構築物の組み込みにより大型化さ
れ得る。腫瘍誘導遺伝子を除去し、そして選択性マーカ
ーを組み込むことにより、変形されたTiプラスミドま
たはRiプラスミドは適当な植物細胞内への本発明に係
る遺伝子構築物の導入のためのベクターとして使用され
る得る。
vir領域は、T−DNA領域およびvir領域が同一
アグロバクテリウム細胞内の同一ベクターに存在するか
、または異なるベクターに存在するかに関係なく植や細
胞のゲノムに、アグロバクテリウムのT−DNAの導入
を引き起こす。染色体上のvir領域はまた、ベクター
から植物細胞へのT−DNAの移動を誘導する。
アグロバクテリウム細胞内の同一ベクターに存在するか
、または異なるベクターに存在するかに関係なく植や細
胞のゲノムに、アグロバクテリウムのT−DNAの導入
を引き起こす。染色体上のvir領域はまた、ベクター
から植物細胞へのT−DNAの移動を誘導する。
それ故に本発明の範囲内で、植物細胞内にアグロバクテ
リウムのT−DNA領域を導入するための系が好ましく
使用されるが、該系においてvir領域およびT−DN
A領域は異なるベクターに位置している。そのような系
は[二元ベクター系」として知られており、そしてT−
DNAを含むベクターは二元ベクターと呼ばれる。
リウムのT−DNA領域を導入するための系が好ましく
使用されるが、該系においてvir領域およびT−DN
A領域は異なるベクターに位置している。そのような系
は[二元ベクター系」として知られており、そしてT−
DNAを含むベクターは二元ベクターと呼ばれる。
植物細胞内に形質転換され得、そして形質転換された細
胞の選択を可能にするあらゆるT−DNA含有ベクター
は本発明の範囲内での使用に適している。
胞の選択を可能にするあらゆるT−DNA含有ベクター
は本発明の範囲内での使用に適している。
左側境界配列(LB)と右側境界配列(RB)との間に
クローン化された本発明に係るキメラ遺伝子横築物を含
み、そして大腸菌およびアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスの両方で安定に複製可能であるシャトルベク
ターが本発明の範囲内で特に好ましい。
クローン化された本発明に係るキメラ遺伝子横築物を含
み、そして大腸菌およびアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスの両方で安定に複製可能であるシャトルベク
ターが本発明の範囲内で特に好ましい。
新規に開発された形質転換技術を用いて、アグロバクテ
リウムの天然の宿主植物でない植物種を試験管内で形質
転換することが可能となった。例えば、単子葉植物、特
に穀類の種および種々のグラス類はアグロバクテリウム
の天然の宿主ではない。
リウムの天然の宿主植物でない植物種を試験管内で形質
転換することが可能となった。例えば、単子葉植物、特
に穀類の種および種々のグラス類はアグロバクテリウム
の天然の宿主ではない。
しかしながら、単子葉類はアグロバクテリウムを用いて
形質転換され得ることが徐々に明らかになってきており
、その結果、現在利用可能である新規実験方式を用いて
、穀類およびグラス類の種もまた形質転換されやすい[
GrimsleyNHet aE(1987)]。
形質転換され得ることが徐々に明らかになってきており
、その結果、現在利用可能である新規実験方式を用いて
、穀類およびグラス類の種もまた形質転換されやすい[
GrimsleyNHet aE(1987)]。
アグロバクテリウムを用いるいわゆる葉ディスク形質転
換[Horsch et aL(1985)]が本発
明の範囲内で好ましい。適当な標的植物からの滅菌葉デ
ィスクを本発明に係るキメラ遺伝子横築物の一つを含有
するアグロバクテリウム細胞と培養し、そして次に適当
な栄養培地中または該培地上に移す。それ故に、本発明
の範囲内では、寒天の添加により固化され、そして慣用
の植物生長調節剤、特にα−ナフト酢酸、ビクロラム、
2.4.5−1リクロロフエノキシ酢酸、2゜4−ジク
ロロフェノキシ酢酸、インドール−3−酪酸、インドー
ル−3−乳酸、インドール3−コハク酸、インドール−
3−酢酸およびp−クロロフェノキシ酢酸からなるオー
キシンの群、カイネチン、6−ベンジルアデニン、2−
イソペンテニルアデニンおよびゼアチンからなるサイト
カイニンの群から選択されるもの1種またはそれ以上で
富化されたLS培地が特に適当である。オーキシンおよ
びサイトカイニンの好ましい濃度は0.1■/lないし
lO■/!の範囲内である。
換[Horsch et aL(1985)]が本発
明の範囲内で好ましい。適当な標的植物からの滅菌葉デ
ィスクを本発明に係るキメラ遺伝子横築物の一つを含有
するアグロバクテリウム細胞と培養し、そして次に適当
な栄養培地中または該培地上に移す。それ故に、本発明
の範囲内では、寒天の添加により固化され、そして慣用
の植物生長調節剤、特にα−ナフト酢酸、ビクロラム、
2.4.5−1リクロロフエノキシ酢酸、2゜4−ジク
ロロフェノキシ酢酸、インドール−3−酪酸、インドー
ル−3−乳酸、インドール3−コハク酸、インドール−
3−酢酸およびp−クロロフェノキシ酢酸からなるオー
キシンの群、カイネチン、6−ベンジルアデニン、2−
イソペンテニルアデニンおよびゼアチンからなるサイト
カイニンの群から選択されるもの1種またはそれ以上で
富化されたLS培地が特に適当である。オーキシンおよ
びサイトカイニンの好ましい濃度は0.1■/lないし
lO■/!の範囲内である。
20℃ないし40℃、好ましくは23℃ないし35℃、
特に25℃の温度および散光下で、数日間、しかし好ま
しくは2ないし3日間の培養後、葉ディスクを苗条誘導
のために適当な培地に移す。本発明の範囲内では、オー
キシンを含有しないが、形質転換体の選択のための選択
物質を含有するLS培地が特に好ましい。培養物は光の
中に保持され、適当な間隔で、しかし好ましくは1週間
の間隔で新鮮培地に移される。
特に25℃の温度および散光下で、数日間、しかし好ま
しくは2ないし3日間の培養後、葉ディスクを苗条誘導
のために適当な培地に移す。本発明の範囲内では、オー
キシンを含有しないが、形質転換体の選択のための選択
物質を含有するLS培地が特に好ましい。培養物は光の
中に保持され、適当な間隔で、しかし好ましくは1週間
の間隔で新鮮培地に移される。
発生する未熟苗条が切り取られ、モして苗条を誘導する
培地中でさらに培養されて根を形成する。本発明の範囲
内では、オーキシンまたはサイトカイニンを含有しない
が、形質転換体の選択のだめの選択物質を含有するLS
培地が特に好ましい。
培地中でさらに培養されて根を形成する。本発明の範囲
内では、オーキシンまたはサイトカイニンを含有しない
が、形質転換体の選択のだめの選択物質を含有するLS
培地が特に好ましい。
アグロバクテリウム介在形質転換の他に、本発明の範囲
内では、植物材料内に本発明に係る遺伝子構築物を挿入
するための直接形質転換法を用いることも可能である。
内では、植物材料内に本発明に係る遺伝子構築物を挿入
するための直接形質転換法を用いることも可能である。
例えば、ベクター内に包含された遺伝物質は、純粋な物
理的方法、例えば細く引き伸ばされたマイクロピペット
を用いるマイクロインジェクションtNeuhaus
et at(19B?)]または形質転換性DNAで被
覆されているマイクロプロジェクタイルでの細胞の砲撃
ドMiCrOprOjeCtileBombardme
nt”;Wang Y−Cet at (1988)]
により、植物細胞内に直接挿入され得る。
理的方法、例えば細く引き伸ばされたマイクロピペット
を用いるマイクロインジェクションtNeuhaus
et at(19B?)]または形質転換性DNAで被
覆されているマイクロプロジェクタイルでの細胞の砲撃
ドMiCrOprOjeCtileBombardme
nt”;Wang Y−Cet at (1988)]
により、植物細胞内に直接挿入され得る。
植物細胞内への遺伝物質の直接導入のその他の可能な方
法は、原形質膜を変性する操作、例えばポリエチレング
リコール処理、熱シヨツク処理もしくはエレクトロポレ
ーションまたはそれらの組合せ[5hilli10 e
t aL (1985)]を用いるプロトプラストの処
理からなる。
法は、原形質膜を変性する操作、例えばポリエチレング
リコール処理、熱シヨツク処理もしくはエレクトロポレ
ーションまたはそれらの組合せ[5hilli10 e
t aL (1985)]を用いるプロトプラストの処
理からなる。
エレクトロポレーション技術において、植物プロトプラ
ストはハイブリッド遺伝子構築物を含むプラスミドと共
に高電圧の電気パルスに晒される。これは生体膜の透過
性に可逆的増加をもたらし、そしてプラスミドの挿入を
可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロト
プラストはそれらの細胞壁を新たに作り、分化し、モし
てカルス組織を形成する。形質転換された植物細胞の選
択は上記の表現型マーカーを用いて行われ得る。
ストはハイブリッド遺伝子構築物を含むプラスミドと共
に高電圧の電気パルスに晒される。これは生体膜の透過
性に可逆的増加をもたらし、そしてプラスミドの挿入を
可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロト
プラストはそれらの細胞壁を新たに作り、分化し、モし
てカルス組織を形成する。形質転換された植物細胞の選
択は上記の表現型マーカーを用いて行われ得る。
植物細胞への遺伝物質の直接導入のその他の方法は、純
粋に化学的な方法に基づき、形質転換が非常に効率良く
そして迅速に行われることを可能にするものであり、N
egrutiu I et aL(1987)に記載さ
れている。
粋に化学的な方法に基づき、形質転換が非常に効率良く
そして迅速に行われることを可能にするものであり、N
egrutiu I et aL(1987)に記載さ
れている。
共形質転換を用いる直接遺伝子導入(Schocher
et aL 1986)は植物材料の形質転換に適当で
ある。
et aL 1986)は植物材料の形質転換に適当で
ある。
共形質転換は植物ゲノム内への種々のDNA分子(非選
択性および選択性遺伝子)の同時取り込みおよび組み込
みに基づいており、そしてそれ故に非選択性遺伝子で形
質転換された細胞の検出を可能にする方法である。
択性および選択性遺伝子)の同時取り込みおよび組み込
みに基づいており、そしてそれ故に非選択性遺伝子で形
質転換された細胞の検出を可能にする方法である。
例として上に挙げた可能な形質転換法のリストは完全で
あると主張するものでな(、そして本発明の対象をなん
ら制限するものでもない。
あると主張するものでな(、そして本発明の対象をなん
ら制限するものでもない。
それらのゲノム内に組み込まれたハイブリッド遺伝子構
築物を含む細胞クローンは通常の選択、スクリーニング
および検出を用いて選択され、そしてトランスジェニッ
ク植物の再生のために使用される。
築物を含む細胞クローンは通常の選択、スクリーニング
および検出を用いて選択され、そしてトランスジェニッ
ク植物の再生のために使用される。
全体の植物を形成するために培養液中に保持されたプロ
トプラストの再生は、例えばPotrykusI an
d 5hilli10 RD(1986)に記載されて
いる。
トプラストの再生は、例えばPotrykusI an
d 5hilli10 RD(1986)に記載されて
いる。
再生方法は植物の種によって異なる。しかしながら、一
般的に、公知の培養培地の一つにおいてプロトプラスト
が分化しそして細胞壁を形成するように刺激される。特
定の活性剤、例えばオーキシンおよびサイトカイニンと
の処理により根または苗条を形成するように誘導され得
るカルス培養物が最終的に形成される。
般的に、公知の培養培地の一つにおいてプロトプラスト
が分化しそして細胞壁を形成するように刺激される。特
定の活性剤、例えばオーキシンおよびサイトカイニンと
の処理により根または苗条を形成するように誘導され得
るカルス培養物が最終的に形成される。
そのようにして得られた小植物は土壌に移され、そして
通常の実生と同様にさらに栽培され得る。
通常の実生と同様にさらに栽培され得る。
効率的な再生は培地、遺伝子型およびこれまでの培養層
に特に依存する。これらの3つの変数が適当に制御され
る場合、再生は完全に再現および反復可能である。
に特に依存する。これらの3つの変数が適当に制御され
る場合、再生は完全に再現および反復可能である。
植物ゲノムの組み込み成分として上記のハイブリッド遺
伝子構築物の植物細胞内で発現可能な構造遺伝子を含む
再生されたトランスジェニック植物は、好ましくは滅菌
苗条培養体の形態で、活発に増殖させることができる。
伝子構築物の植物細胞内で発現可能な構造遺伝子を含む
再生されたトランスジェニック植物は、好ましくは滅菌
苗条培養体の形態で、活発に増殖させることができる。
再生されたトランスジェニック植物の植物ゲノム内への
操作上の発現性遺伝子の安定な組み込みは、組み込まれ
た遺伝子の有糸***安定性との関係により、モして有糸
***の間のメンデル形質としてのふるまいに基づいて、
さらにサザンプロット分析(Southern BM、
1975)を用いて変更される。
操作上の発現性遺伝子の安定な組み込みは、組み込まれ
た遺伝子の有糸***安定性との関係により、モして有糸
***の間のメンデル形質としてのふるまいに基づいて、
さらにサザンプロット分析(Southern BM、
1975)を用いて変更される。
それ故に本発明の広い概念は、上記方法により形質転換
され、そして発現可能な形態で本発明に係る組換えDN
Aを含むプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、
種子、胚、花粉、胚珠、接合子および全体の植物、特に
全体の稔性植物からなる群から選択されるトランスジェ
ニック植物材料ならびに該トランスジェニック植物材料
の製造方法を包含する。
され、そして発現可能な形態で本発明に係る組換えDN
Aを含むプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、
種子、胚、花粉、胚珠、接合子および全体の植物、特に
全体の稔性植物からなる群から選択されるトランスジェ
ニック植物材料ならびに該トランスジェニック植物材料
の製造方法を包含する。
本発明に係る組換えDNA分子の一つを細胞の少なくと
もいくつかに含有する形質転換された植物材料の作出方
法は、 (a) まず最初に適当な供給源から過剰発現に関す
るDNA配列を単離するか、または該配列を公知方法を
用いて合成し、 ら)前記DNA配列を発現性DNA配列の5+末端内に
操作可能な様式で挿入し、 (C) 生成した構築物を植物発現ベクターにおいて
植物内で活性な発現シグナルの制御下にクロニングし、 (d) 前記発現ベクターを植物材料に公知方法によ
り形質転換し、そしてそれをその中で発現させる、 ことから実質的になる。
もいくつかに含有する形質転換された植物材料の作出方
法は、 (a) まず最初に適当な供給源から過剰発現に関す
るDNA配列を単離するか、または該配列を公知方法を
用いて合成し、 ら)前記DNA配列を発現性DNA配列の5+末端内に
操作可能な様式で挿入し、 (C) 生成した構築物を植物発現ベクターにおいて
植物内で活性な発現シグナルの制御下にクロニングし、 (d) 前記発現ベクターを植物材料に公知方法によ
り形質転換し、そしてそれをその中で発現させる、 ことから実質的になる。
それ故に、本発明の広い概念は、本発明の上記の方法を
用いて形質転換されたトランスジェニック植物、特別に
はトランスジェニック活性植物、および新規でそして望
ましい特性または親植物の形質転換から生じる特性を依
然として有する無性および/または有性の後代をも包含
する。
用いて形質転換されたトランスジェニック植物、特別に
はトランスジェニック活性植物、および新規でそして望
ましい特性または親植物の形質転換から生じる特性を依
然として有する無性および/または有性の後代をも包含
する。
「トランスジェニック植物の無性および/または有性の
後代」という本発明の範囲内で定義されたような表現は
それ故に、公知方法、例えば細胞融合または突然変異選
択により得られ、そして形質転換された出発植物体の特
徴的な特性を依然有するあらゆる突然変異体および変種
を含み、そして形質転換された植物材料を用いて得られ
る全てのハイブリッド形成体および融合産生物をも包含
する。
後代」という本発明の範囲内で定義されたような表現は
それ故に、公知方法、例えば細胞融合または突然変異選
択により得られ、そして形質転換された出発植物体の特
徴的な特性を依然有するあらゆる突然変異体および変種
を含み、そして形質転換された植物材料を用いて得られ
る全てのハイブリッド形成体および融合産生物をも包含
する。
野生型と比較して高められたタンパク質含量を示すトラ
ンスジェニック植物、特に活性トランスジェニック植物
、形質転換された細胞および/または組織、さらにはそ
れらの有性および無性の後代が本発明の範囲内で好まし
い。
ンスジェニック植物、特に活性トランスジェニック植物
、形質転換された細胞および/または組織、さらにはそ
れらの有性および無性の後代が本発明の範囲内で好まし
い。
本発明に係る調節DNA配列がキチナーゼおよび/また
はグルカナーゼをコードする構造遺伝子および植物細胞
内で活性なその他の発現シグナルに操作可能に連結され
て、そのため結合された構造遺伝子の非常に高められた
発現レベルの結果として、植物におけるキチナーゼおよ
び/またはグルカナーゼ含量が野生型と比較して著しく
高められているキメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA
分子で形質転換されたトランスジェニック植物、特に活
性トランスジェニック植物が本発明の範囲内で好ましい
。
はグルカナーゼをコードする構造遺伝子および植物細胞
内で活性なその他の発現シグナルに操作可能に連結され
て、そのため結合された構造遺伝子の非常に高められた
発現レベルの結果として、植物におけるキチナーゼおよ
び/またはグルカナーゼ含量が野生型と比較して著しく
高められているキメラ遺伝子構築物を含む組換えDNA
分子で形質転換されたトランスジェニック植物、特に活
性トランスジェニック植物が本発明の範囲内で好ましい
。
乾燥重量(FW)400μg/gないし1200μg/
gのキチナーゼ含量を有するトランスジェニック植物、
特に活性トランスジェニック植物が特に好ましい。乾燥
重量(FW)20μg/gないし130μg/gのグル
カナーゼ含量を有するトランスジェニック植物、特に活
性トランスジェニック植物もまた特に好ましい。
gのキチナーゼ含量を有するトランスジェニック植物、
特に活性トランスジェニック植物が特に好ましい。乾燥
重量(FW)20μg/gないし130μg/gのグル
カナーゼ含量を有するトランスジェニック植物、特に活
性トランスジェニック植物もまた特に好ましい。
本発明はまたトランスジェニック植物の増殖材料に関す
る。
る。
本発明の範囲内で、トランスジェニック植物の増殖材料
とは、生体内または試験管内で有性的にまたは無性的に
増殖され得るあらゆる植物材料であると理解されるべき
である。本発明の範囲内で特に好ましいとみなされるべ
きである植物増殖材料は、特にプロトプラスト、細胞、
カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠および接合
子、ならびにトランスジェニック植物から得ることがで
きるあらゆるその他の増殖材料である。
とは、生体内または試験管内で有性的にまたは無性的に
増殖され得るあらゆる植物材料であると理解されるべき
である。本発明の範囲内で特に好ましいとみなされるべ
きである植物増殖材料は、特にプロトプラスト、細胞、
カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠および接合
子、ならびにトランスジェニック植物から得ることがで
きるあらゆるその他の増殖材料である。
本発明はまた植物の部分、例えば本発明の方法を用いて
予め形質転換され、それ故に少なくとも一部はトランス
ジェニック細胞からなるトランスジェニック植物または
それらの後代から生じる花、茎、果実、葉および根にも
関する。
予め形質転換され、それ故に少なくとも一部はトランス
ジェニック細胞からなるトランスジェニック植物または
それらの後代から生じる花、茎、果実、葉および根にも
関する。
本発明の方法は、全ての植物、特に被子植物西門および
裸子植物西門の体系的な群に属するものの形質転換に適
当である。
裸子植物西門の体系的な群に属するものの形質転換に適
当である。
裸子植物西門の中では球果植物綱の植物が特に興味深い
。
。
被子植物西門の中では落葉樹および潅木に加えて、ナス
科、ジュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカ
ザ科、マツカゼソウ科、アリアセアエ科、ヒガンバナ科
、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、アナナス科、
アカネ科、ツバキ科、バショウ科、アオイ科またはホモ
ノ科、およびマメ目、および特にパビリオナセアエ科の
植物が特に興味深い。ナス科、ジュウジバナ科およびホ
モノ科の代表種が好ましい。
科、ジュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカ
ザ科、マツカゼソウ科、アリアセアエ科、ヒガンバナ科
、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、アナナス科、
アカネ科、ツバキ科、バショウ科、アオイ科またはホモ
ノ科、およびマメ目、および特にパビリオナセアエ科の
植物が特に興味深い。ナス科、ジュウジバナ科およびホ
モノ科の代表種が好ましい。
本発明の範囲内の標的作物は、例えばフラガリア(Fr
agaria)、ロータス(Lotus) 、メディケ
−ゴ(Medicago)、オノブリイキス(Onob
rychis)、トリホリウム(TrifoLium)
、トリゴネラ(TrigonelLa)、ビグナ(Vi
gna) 、シトラス(Citrus)、リナム(Li
nua) 、ゼラニウム(Geranium)、マニホ
ット(Manihot)、ドーカス(Daucus)、
アラビトブシス(Arabidopsis) 、ブラッ
シカ(Brassica)、ラファヌス(Raphan
us )、シナビス(Sinapis)、アトロバ(A
tropa)、カブシカム((:apsicum)、ダ
チュラ(Datura)、ハイオシアムス(Hyosc
yaaus)、リコペルシコン(L”)COperSi
COn)、ニコチアナ(Nicotiana)、ソラヌ
ム(Sotanum) 、ペチュニア(Pentuni
a)、ジギタリス(Digitalis) 、マジョラ
ナ(Majorana)、シコリウム(Cichori
um) 、へりアンラス(HeLianthus)、ラ
クチュカ(Lactuca) 、ブロムス(Bromu
s)、ゴツシピウム(Gossypiura) 、アス
パラガス(Asparagus) 、アンチリヌム(A
ntirrhinum) 、ヘメロカリス(Heaer
ocaLLis)、ネメシア(Nemesla) 、ベ
ラゴニウム(Pelagonium)、バニカム(Pa
nicuttr) 、ペンニセタム(Penniset
um)、ラヌンクルス(RanuncuLus)、セネ
シオ(Senet10) 、サルビグロツシス(Sal
piglossis)、ククミス(Cucurnts)
、ブロワリナ(BrowaLlia) 、グリシン(
Gtycine) 、ロリウム(Lolium)、ゼア
(Zea) 、)リチカム(Triticum)、ツル
ガム(Sorghum)、イボモニア(Ipoaoea
) 、パッジフローラ(Passiflora)、シク
ラメン(CycLamen)、マルス(MaLus)、
プルナス(Prunus)、ローザ(Rosa)、ルブ
ス(Rabus)、ボブラス(PopuLus) 、サ
ンタラム(Sanialurn)、アリウム(ALLi
um)、リリウム(Lilium)、ナルシサス(Na
rcissus)、アナナス(Ananas)、アラキ
ス(Arachis) 、ファセオルス(Phaseo
lus)およびピサム(Pisum)からなる群から選
択されるものを含む。
agaria)、ロータス(Lotus) 、メディケ
−ゴ(Medicago)、オノブリイキス(Onob
rychis)、トリホリウム(TrifoLium)
、トリゴネラ(TrigonelLa)、ビグナ(Vi
gna) 、シトラス(Citrus)、リナム(Li
nua) 、ゼラニウム(Geranium)、マニホ
ット(Manihot)、ドーカス(Daucus)、
アラビトブシス(Arabidopsis) 、ブラッ
シカ(Brassica)、ラファヌス(Raphan
us )、シナビス(Sinapis)、アトロバ(A
tropa)、カブシカム((:apsicum)、ダ
チュラ(Datura)、ハイオシアムス(Hyosc
yaaus)、リコペルシコン(L”)COperSi
COn)、ニコチアナ(Nicotiana)、ソラヌ
ム(Sotanum) 、ペチュニア(Pentuni
a)、ジギタリス(Digitalis) 、マジョラ
ナ(Majorana)、シコリウム(Cichori
um) 、へりアンラス(HeLianthus)、ラ
クチュカ(Lactuca) 、ブロムス(Bromu
s)、ゴツシピウム(Gossypiura) 、アス
パラガス(Asparagus) 、アンチリヌム(A
ntirrhinum) 、ヘメロカリス(Heaer
ocaLLis)、ネメシア(Nemesla) 、ベ
ラゴニウム(Pelagonium)、バニカム(Pa
nicuttr) 、ペンニセタム(Penniset
um)、ラヌンクルス(RanuncuLus)、セネ
シオ(Senet10) 、サルビグロツシス(Sal
piglossis)、ククミス(Cucurnts)
、ブロワリナ(BrowaLlia) 、グリシン(
Gtycine) 、ロリウム(Lolium)、ゼア
(Zea) 、)リチカム(Triticum)、ツル
ガム(Sorghum)、イボモニア(Ipoaoea
) 、パッジフローラ(Passiflora)、シク
ラメン(CycLamen)、マルス(MaLus)、
プルナス(Prunus)、ローザ(Rosa)、ルブ
ス(Rabus)、ボブラス(PopuLus) 、サ
ンタラム(Sanialurn)、アリウム(ALLi
um)、リリウム(Lilium)、ナルシサス(Na
rcissus)、アナナス(Ananas)、アラキ
ス(Arachis) 、ファセオルス(Phaseo
lus)およびピサム(Pisum)からなる群から選
択されるものを含む。
植物の試験管内培養の分野、特に植物再生の分野におけ
る新しい発展によって、ホモノ科の代表種でさえも、植
物プロトプラストから出発して全体の植物を再生するこ
とが今可能となった。ホモノ科での再生実験の成功の例
は、イネのプロトプラストに対してYamada Y
et aL(1986)に、トウモロコシのプロトプラ
ストに対してRhodes et al(1986)お
よび5hilli10 RD etaL (1989)
に、ダクチリス・グロメラタ(DactyLis gL
omerata)のプロトプラストに対してHorn
et aL(198B>に特に記載されている。
る新しい発展によって、ホモノ科の代表種でさえも、植
物プロトプラストから出発して全体の植物を再生するこ
とが今可能となった。ホモノ科での再生実験の成功の例
は、イネのプロトプラストに対してYamada Y
et aL(1986)に、トウモロコシのプロトプラ
ストに対してRhodes et al(1986)お
よび5hilli10 RD etaL (1989)
に、ダクチリス・グロメラタ(DactyLis gL
omerata)のプロトプラストに対してHorn
et aL(198B>に特に記載されている。
それ故に本発明の範囲内で、以下の植物:ロリウム、ゼ
ア、トリチカム、ツルガム、サッカラム(Saccha
ruす、ブロムス、オリザエ(Oryzae)、アベナ
(Avena) 、ホルデウム(Hordeum) 、
セカーレ(SecaLe)およびセタリア(Setar
ia)を使用することも可能である。
ア、トリチカム、ツルガム、サッカラム(Saccha
ruす、ブロムス、オリザエ(Oryzae)、アベナ
(Avena) 、ホルデウム(Hordeum) 、
セカーレ(SecaLe)およびセタリア(Setar
ia)を使用することも可能である。
形質転換された植物細胞から得られた成熟植物はそれ自
体交雑され種子を生じる。種子のい(つかは遺伝学の確
立された法則に正確に従う比率でもって有用で望ましい
特性をコードする遺伝子を含有する。これらの種子はト
ランスジェニック植物の作出のために使用され得る。
体交雑され種子を生じる。種子のい(つかは遺伝学の確
立された法則に正確に従う比率でもって有用で望ましい
特性をコードする遺伝子を含有する。これらの種子はト
ランスジェニック植物の作出のために使用され得る。
ホモ接合系は繰り返し自家受粉により、および通交系の
作出により得ることができる。これらの通交系は順に雑
種の発生のために使用され得る。この操作において、上
記外来遺伝子を含む通交系は繁殖のためにもう一つの通
交系と交雑される。
作出により得ることができる。これらの通交系は順に雑
種の発生のために使用され得る。この操作において、上
記外来遺伝子を含む通交系は繁殖のためにもう一つの通
交系と交雑される。
本発明に関する一般的な説明をした後に、本発明のより
よい理解のために次に実施例を記載するが、これは説明
のためだけのものであり、特記しない限り本発明を制限
するものではない。
よい理解のために次に実施例を記載するが、これは説明
のためだけのものであり、特記しない限り本発明を制限
するものではない。
一般的な組換えDNA技術
本発明において用いられる組換えDNA技術の多くは当
業者にとって一般的なものであるので、それらが出現す
る度に記載するよりもむしろ通常用いられる技術に関し
てここで簡潔に記載してお(方がよい。別に特記したこ
とを除いて、これらの全ての操作はManiatfs
et at(1982)の参考文献に記載されている。
業者にとって一般的なものであるので、それらが出現す
る度に記載するよりもむしろ通常用いられる技術に関し
てここで簡潔に記載してお(方がよい。別に特記したこ
とを除いて、これらの全ての操作はManiatfs
et at(1982)の参考文献に記載されている。
A、制限エンドヌクレアーゼでの切断
反応バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリー
のニュー・イングランド・パイオラブス(New En
gland Biolabs)により推奨される緩衝溶
液中に約50ないし500μg/−のDNAを含む。制
限エンドヌクレアーゼ2ないし5単位をDNA1μgに
つき添加し、そして反応バッチを上記の会社により推奨
される温度で1ないし8時間保温する。65℃で10分
間加熱するか、またはフェノールでの抽出により反応を
終結させ、エタノールでDNAを沈澱させる。この方法
はManiatis et aLc1’a82’)の文
献の第104ないし106頁にも記載されている。
のニュー・イングランド・パイオラブス(New En
gland Biolabs)により推奨される緩衝溶
液中に約50ないし500μg/−のDNAを含む。制
限エンドヌクレアーゼ2ないし5単位をDNA1μgに
つき添加し、そして反応バッチを上記の会社により推奨
される温度で1ないし8時間保温する。65℃で10分
間加熱するか、またはフェノールでの抽出により反応を
終結させ、エタノールでDNAを沈澱させる。この方法
はManiatis et aLc1’a82’)の文
献の第104ないし106頁にも記載されている。
B、プラント末端を製造するためのDNAのポリメラー
ゼでの処理 DNA断片50ないし500μg/−を、製造会社ニュ
ー・イングランド・バイオラプスにより推奨される緩衝
液中の反応バッチに添加する。反応バッチは全4種のデ
オキシヌクレオチド三リン酸を0.2 mMの濃度で含
有する。反応は15℃で30分間の期間に起こり、次い
で65℃で10分間加熱することにより終結される。
ゼでの処理 DNA断片50ないし500μg/−を、製造会社ニュ
ー・イングランド・バイオラプスにより推奨される緩衝
液中の反応バッチに添加する。反応バッチは全4種のデ
オキシヌクレオチド三リン酸を0.2 mMの濃度で含
有する。反応は15℃で30分間の期間に起こり、次い
で65℃で10分間加熱することにより終結される。
5′突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えば
BcoRIおよびBamH[で切断することにより得ら
れる断片のためには、DNAポリメラーゼの大断片また
はフレノウ断片が使用される。
BcoRIおよびBamH[で切断することにより得ら
れる断片のためには、DNAポリメラーゼの大断片また
はフレノウ断片が使用される。
31突出末端を製造するエンドヌクレアーゼ例えばPs
tlIおよび5aclにより製造される断片のためには
、T4DNAポリメラーゼが使用される。これらの2つ
の酵素の使用はMantattset al(1982
)の文献の第113ないし121頁に記載されている。
tlIおよび5aclにより製造される断片のためには
、T4DNAポリメラーゼが使用される。これらの2つ
の酵素の使用はMantattset al(1982
)の文献の第113ないし121頁に記載されている。
C,アガロースゲル電気泳動およびゲルからのDNA断
片の精製 アガロースゲル電気泳動をManiatis et a
L(1982)の文献の第150ないし163頁に記載
のように水平型装置で行う。使用される緩衝液はその中
に記載されているトリス−ホウ酸塩緩衝液である。DN
A断片は、電気泳動の間にゲルまたはタンク緩衝液に存
在するか、または電気泳動の後に添加されるいずれかの
0.5■/−臭化エチジウムを用いて染色される。DN
Aを曇波長の紫外線の照射により視覚化する。断片をゲ
ルから分離する場合には、使用されるアガロースは低い
ゲル化温度のものであり、これはミズーリ州セントルイ
スのシグマ・ケミカル(Sigma Chemical
)から入手できる。電気泳動後、望ましい断片を削り取
り、プラスチック管内に入れ、65℃で約15分間加熱
し、次いでフェノールで3回抽出し、そしてエタノール
で2回沈澱させる。この操作はManiatis et
aLc1982)の文献の第170頁の記載とはわず
かに異なっている。
片の精製 アガロースゲル電気泳動をManiatis et a
L(1982)の文献の第150ないし163頁に記載
のように水平型装置で行う。使用される緩衝液はその中
に記載されているトリス−ホウ酸塩緩衝液である。DN
A断片は、電気泳動の間にゲルまたはタンク緩衝液に存
在するか、または電気泳動の後に添加されるいずれかの
0.5■/−臭化エチジウムを用いて染色される。DN
Aを曇波長の紫外線の照射により視覚化する。断片をゲ
ルから分離する場合には、使用されるアガロースは低い
ゲル化温度のものであり、これはミズーリ州セントルイ
スのシグマ・ケミカル(Sigma Chemical
)から入手できる。電気泳動後、望ましい断片を削り取
り、プラスチック管内に入れ、65℃で約15分間加熱
し、次いでフェノールで3回抽出し、そしてエタノール
で2回沈澱させる。この操作はManiatis et
aLc1982)の文献の第170頁の記載とはわず
かに異なっている。
変法として、DNAはジェネクリーンパキッ) (Ge
neclean kit)[米国カリフォルニア州う・
ジョラのバイ第101社(Bio 1011nc、)]
を用いてアガロースから単離され得る。
neclean kit)[米国カリフォルニア州う・
ジョラのバイ第101社(Bio 1011nc、)]
を用いてアガロースから単離され得る。
D、DNA末端への合成リンカ−断片の付加DNA分子
末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を添加するこ
とが望ましい場合、上の項に記載されているように、プ
ラント末端を製造するために、場合によってはこの分子
をまずDNAポリメラーゼで処理する。この断片的0.
1ないし1.0μgを、二ニー・イングランド・バイオ
ラプスから得られるホスホリル化リンカ−DNA約10
nHに、同社のT4DNAリガーゼ2μ!および同社に
より推奨される緩衝液中の1mMATPを含有する20
ないし30μ!容量中で添加する。15℃で一晩保温後
、65℃で10分間加熱することにより反応を終結させ
る。反応バッチを次に、合成リンカ−配列で切断する制
限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約100μl
に希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約50ないし
200単位を添加する。混合物を適温で2ないし6時間
保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動に供し、そ
して上記Cのように断片を精製する。精製した断片は今
では制限エンドヌクレアーゼでの切断により製造された
終端を有するであろう。これらの終端は通常粘着性であ
り、その結果、精製断片は同じような粘着端を有するそ
の他の断片に容易に連結され得る。
末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を添加するこ
とが望ましい場合、上の項に記載されているように、プ
ラント末端を製造するために、場合によってはこの分子
をまずDNAポリメラーゼで処理する。この断片的0.
1ないし1.0μgを、二ニー・イングランド・バイオ
ラプスから得られるホスホリル化リンカ−DNA約10
nHに、同社のT4DNAリガーゼ2μ!および同社に
より推奨される緩衝液中の1mMATPを含有する20
ないし30μ!容量中で添加する。15℃で一晩保温後
、65℃で10分間加熱することにより反応を終結させ
る。反応バッチを次に、合成リンカ−配列で切断する制
限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約100μl
に希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約50ないし
200単位を添加する。混合物を適温で2ないし6時間
保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動に供し、そ
して上記Cのように断片を精製する。精製した断片は今
では制限エンドヌクレアーゼでの切断により製造された
終端を有するであろう。これらの終端は通常粘着性であ
り、その結果、精製断片は同じような粘着端を有するそ
の他の断片に容易に連結され得る。
E、DNA断片からの5′末端ホスフエートの除去
プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミ
ドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減
少させる(Maniatis et at(19B2)
の文献の第13頁に記載されている)。
ドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減
少させる(Maniatis et at(19B2)
の文献の第13頁に記載されている)。
正しい制限エンドヌクレアーゼでのDNAの切断の後、
ベーリンガーーマンハイム(Boehrfnger−M
annheim)から得られる子ウシ消化管のアルカリ
ホスファターゼ1単位を添加する。DNAを37℃で1
時間保温し、次にフェノールで2回抽出し、そしてエタ
ノールで沈澱させる。
ベーリンガーーマンハイム(Boehrfnger−M
annheim)から得られる子ウシ消化管のアルカリ
ホスファターゼ1単位を添加する。DNAを37℃で1
時間保温し、次にフェノールで2回抽出し、そしてエタ
ノールで沈澱させる。
F、DNA断片の連結
相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、
各々の断片的1100nは、ニュー・イングランド・バ
イオラプスからのT4DNAリガーゼ約0.2単位をこ
の会社により推奨される緩衝液中に含有する20ないし
40μlの反応混合物中で保温される。保温は15℃で
1ないし20時間行われる。プラント末端を有するDN
A断片が結合される場合、それらはT4DNAリガーゼ
の量を2ないし4単位に増加させる以外は上記と同様に
保温される。
各々の断片的1100nは、ニュー・イングランド・バ
イオラプスからのT4DNAリガーゼ約0.2単位をこ
の会社により推奨される緩衝液中に含有する20ないし
40μlの反応混合物中で保温される。保温は15℃で
1ないし20時間行われる。プラント末端を有するDN
A断片が結合される場合、それらはT4DNAリガーゼ
の量を2ないし4単位に増加させる以外は上記と同様に
保温される。
G、DNAの大腸菌内への形質転換
大腸菌HBIOI株がほとんどの実験において使用され
るo Maniatis et al(1982)の文
献の第250および251頁に記載されているように、
塩化カルシウム法を用いてDNAが大腸菌内に導入され
る。
るo Maniatis et al(1982)の文
献の第250および251頁に記載されているように、
塩化カルシウム法を用いてDNAが大腸菌内に導入され
る。
H,プラスミドのための大腸菌のスクリーニング
形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニは迅速プラス
ミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験される
。2種の慣用の方法は、Maniatis et aL
<1’J82”)の文献の第366ないし369頁に記
載されている。
ミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験される
。2種の慣用の方法は、Maniatis et aL
<1’J82”)の文献の第366ないし369頁に記
載されている。
■、プラスミドDNAの大規模な分離
大腸菌からプラスミドを大規模に分離する方法はMan
iatis et at(19B2’)の文献の第88
ないし94頁に記載されている。
iatis et at(19B2’)の文献の第88
ないし94頁に記載されている。
J、M13ファージベクターにおけるクローニング
以下の記載においてファージM13誘導体の二重鎖複製
体は決まりきった操作、例えば制限エンドヌクレアーゼ
での切断、連結その他のために用いられることが理解さ
れるべきである。
体は決まりきった操作、例えば制限エンドヌクレアーゼ
での切断、連結その他のために用いられることが理解さ
れるべきである。
特記しない限り、酵素はベーリンガー・バイオラプス[
Boehringer、 Biolabs(BRL)]
から入手できる。それらはことわらない限り製造会社の
指示に従って使用される。
Boehringer、 Biolabs(BRL)]
から入手できる。それらはことわらない限り製造会社の
指示に従って使用される。
K、サザンプロット分析
抽出したDNAを最初に制限酵素で処理し、次いで0.
8%ないし1%のアガロースゲル中で電気泳動し、ニト
ロセルロース膜に移し[5outhern BM(19
75)] 、そして予めニック−トランスレーションに
供された検出されるべきDNA CDNA比活性5 X
l O” ナイシl Oxl 0Ac、p、m、/μ
g)とハイブリッド形成させる。
8%ないし1%のアガロースゲル中で電気泳動し、ニト
ロセルロース膜に移し[5outhern BM(19
75)] 、そして予めニック−トランスレーションに
供された検出されるべきDNA CDNA比活性5 X
l O” ナイシl Oxl 0Ac、p、m、/μ
g)とハイブリッド形成させる。
この場合には、「ランダムブライマー」標識用キット〔
ベーリンガー・マンハイム〕を用いて1!P標識され得
るタバコキチナーゼc DNAクローンp CHN 5
0 [5hinshi et aE(1987)]の3
’ Alul−Pstl t!jr片をハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いる。フィルターを各回1
時間3回65℃で0.03 Mクエン酸ナトリウムと0
,3M塩化ナトリウムの水溶液を用いて洗浄する。ハイ
ブリッド形成したDNAはX線フィルムを24ないし4
8時間黒化することにより可視化される。
ベーリンガー・マンハイム〕を用いて1!P標識され得
るタバコキチナーゼc DNAクローンp CHN 5
0 [5hinshi et aE(1987)]の3
’ Alul−Pstl t!jr片をハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いる。フィルターを各回1
時間3回65℃で0.03 Mクエン酸ナトリウムと0
,3M塩化ナトリウムの水溶液を用いて洗浄する。ハイ
ブリッド形成したDNAはX線フィルムを24ないし4
8時間黒化することにより可視化される。
L、ウェスタンプロット分析
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、タンパク
質をニトロセルロースまたはナイロンフィルターに電気
泳動で移す。このフィルターを次にブロック剤(例えば
PBS中の5%スキムミルク粉末;以下ミルク/PBS
と記載する)で前処理する。フィルターを次に検出され
るべき化合物と反応する抗血清(今回の場合、ウサギ抗
タバコキチナーゼIgG)と数時間保温する。このよう
にして前処理したフィルターをミルク/PBSで数回洗
浄し、次いで酵素と結合している市販の第2の抗体〔例
えばパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体〔バイオラ
ッド(BrORAD)) 、ミルク/PBS中に希釈1
:2000)と保温する。フィルターを再0PBS中で
洗浄し、次に製造会社(バイオラッド)の指示に従って
クロロナフトールおよび過酸化水素で染色する。さらに
詳しい記載はSambrooket alc1989>
にされている。
質をニトロセルロースまたはナイロンフィルターに電気
泳動で移す。このフィルターを次にブロック剤(例えば
PBS中の5%スキムミルク粉末;以下ミルク/PBS
と記載する)で前処理する。フィルターを次に検出され
るべき化合物と反応する抗血清(今回の場合、ウサギ抗
タバコキチナーゼIgG)と数時間保温する。このよう
にして前処理したフィルターをミルク/PBSで数回洗
浄し、次いで酵素と結合している市販の第2の抗体〔例
えばパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体〔バイオラ
ッド(BrORAD)) 、ミルク/PBS中に希釈1
:2000)と保温する。フィルターを再0PBS中で
洗浄し、次に製造会社(バイオラッド)の指示に従って
クロロナフトールおよび過酸化水素で染色する。さらに
詳しい記載はSambrooket alc1989>
にされている。
M、ノーザンプロット分析
全体のRNAはLogemann et aL (19
87) ニ記載された方法に従って調製され得るが、し
かし混入DNAのあらゆる残渣を解消するために2Mの
LiC1での付加的な沈澱段階を導入することが有利で
ある。RNA(0,4■または4■)を次に6.7%ホ
ルムアルデヒド含有の1%アガロースゲル中での電気泳
動により分画する[Maniatis et at (
1982)] o個々の画分を「ゼータ−プローブJI
!(バイオラッド)に移し、モしてタバコキチナーゼc
DNAクローンpCHN47からのstp標識されたp
st I挿入物とハイプツト形成させる。ハイプツト形
成するDNAの大きさは同時に標準の移動距離を参照し
て概算され得る。
87) ニ記載された方法に従って調製され得るが、し
かし混入DNAのあらゆる残渣を解消するために2Mの
LiC1での付加的な沈澱段階を導入することが有利で
ある。RNA(0,4■または4■)を次に6.7%ホ
ルムアルデヒド含有の1%アガロースゲル中での電気泳
動により分画する[Maniatis et at (
1982)] o個々の画分を「ゼータ−プローブJI
!(バイオラッド)に移し、モしてタバコキチナーゼc
DNAクローンpCHN47からのstp標識されたp
st I挿入物とハイプツト形成させる。ハイプツト形
成するDNAの大きさは同時に標準の移動距離を参照し
て概算され得る。
N、酵素活性の測定
酵素活性は基質として”H標識キチン〔比活性4.93
X 10 ydpm/molN−アセチルグルコサミ
ン〕を用いて放射線測定により決定される[Bolle
r et at (1983)] o (X−マンノシ
ダーゼ活性は基質としてp−ニトロフェノールを用いる
マイクロタイタープレート中で決定される[Bolle
r and Kende(1979)]。
X 10 ydpm/molN−アセチルグルコサミ
ン〕を用いて放射線測定により決定される[Bolle
r et at (1983)] o (X−マンノシ
ダーゼ活性は基質としてp−ニトロフェノールを用いる
マイクロタイタープレート中で決定される[Bolle
r and Kende(1979)]。
パーオキシダーゼ活性は基質としてグアイアコールを用
いて決定される[Siege and Ga1s10n
(1967)]。
いて決定される[Siege and Ga1s10n
(1967)]。
かなり一般的な記載を説明するために、そして本発明の
よりよい理解のために、特定の実施例を記載するが、特
記しない限り本発明はこれらに限定されない。同様のこ
とが上記の例示にも当てはまる。
よりよい理解のために、特定の実施例を記載するが、特
記しない限り本発明はこれらに限定されない。同様のこ
とが上記の例示にも当てはまる。
1、cDN人およびゲノム遺伝子ライブラリィの作成
実施例1:植物材料
ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ425植物を温
室中で、または表面滅菌種子から出発して生長させる。
室中で、または表面滅菌種子から出発して生長させる。
種子の表面滅菌は以下のように行われる:種子20ない
し30個を約200μmの孔径を有するふるいに通し、
そして市販の10%漂白液(NaOCl)10−中で保
温する。次いで種子を滅菌蒸留水で繰り返しすすぐ。
し30個を約200μmの孔径を有するふるいに通し、
そして市販の10%漂白液(NaOCl)10−中で保
温する。次いで種子を滅菌蒸留水で繰り返しすすぐ。
以下の実施例において、Bichholz et al
(1983)に従ってニコチアナ・ツバカムの園芸品種
ハバナ425植物から分離され得る柔細胞髄組a (N
)のクローン化系列を用いることが好ましい。
(1983)に従ってニコチアナ・ツバカムの園芸品種
ハバナ425植物から分離され得る柔細胞髄組a (N
)のクローン化系列を用いることが好ましい。
実施例2:組織培養
Linsmeier and Skoog(1965)
による塩およびチアミン−MCI濃度を含有し、10.
g/lの寒天の添加により固化された基本培地(LS)
上でタバコ組織を培養する。その他の添加剤としてこの
基本培地はpH指示剤例えばクロロフェノールレッド5
■/lを含有する。このLS基本培地を基にし、そして
引き続く実施例において使用されるその他の培地はその
他の添加剤として、例えばカイネチン(1,4μM)(
サイトカイニン培地)またはα−ナフチル酢酸(lO0
7μM)(オーキシン培地〕またはカイネチンおよびα
−ナフチル酢酸の混合物〔オーキシン/サイトカイニン
培地(培地A))を含有する。
による塩およびチアミン−MCI濃度を含有し、10.
g/lの寒天の添加により固化された基本培地(LS)
上でタバコ組織を培養する。その他の添加剤としてこの
基本培地はpH指示剤例えばクロロフェノールレッド5
■/lを含有する。このLS基本培地を基にし、そして
引き続く実施例において使用されるその他の培地はその
他の添加剤として、例えばカイネチン(1,4μM)(
サイトカイニン培地)またはα−ナフチル酢酸(lO0
7μM)(オーキシン培地〕またはカイネチンおよびα
−ナフチル酢酸の混合物〔オーキシン/サイトカイニン
培地(培地A))を含有する。
選択培地BおよびCはα−ナフチル酢酸を含有しないが
、その代わりにその物質により形質転換体が大量の非形
質転換細胞および組織から選択され得るような選択物質
を含有する。これらの選択培地の正確な組成は1項(培
地)に示しである。
、その代わりにその物質により形質転換体が大量の非形
質転換細胞および組織から選択され得るような選択物質
を含有する。これらの選択培地の正確な組成は1項(培
地)に示しである。
ニコチアナ・ツバカムの園芸品種ハバナ425植物から
分離された貯蔵系列(275N)はオーキシン/サイト
カイニン培地(10d)上で21日間隔で継代培養され
る。すなわち、それらは各同断しい培地(10mj)上
に接種され、そして明所25℃で培養される。
分離された貯蔵系列(275N)はオーキシン/サイト
カイニン培地(10d)上で21日間隔で継代培養され
る。すなわち、それらは各同断しい培地(10mj)上
に接種され、そして明所25℃で培養される。
培養組織中に高レベルのキチナーゼの誘導のために、組
織はオーキシン/サイトカイニン培地から無ホルモン基
本培地上に接種される。植物組織の培養およびキチナー
ゼ誘導に関するその他の詳細はFe1ix and M
eins(1985)に記載されている。
織はオーキシン/サイトカイニン培地から無ホルモン基
本培地上に接種される。植物組織の培養およびキチナー
ゼ誘導に関するその他の詳細はFe1ix and M
eins(1985)に記載されている。
実施例3:タバコプロトプラストの作成実施例1による
2日令のタバコ細胞懸濁液100−を等量の2倍濃厚酵
素溶液と混合する。
2日令のタバコ細胞懸濁液100−を等量の2倍濃厚酵
素溶液と混合する。
該酵素溶液は以下の成分:
Ca NOs ・ 4 H! O
M g S O4・ 7H1O
NH,H,PO。
N0s
1.45g/f
O,5g/I!
0.28g/7
1.2 g/f
を含有する。
上記酵素溶液を遠心分離し、そして0.2μmフィルタ
ーを通して滅菌する。タバコ懸濁培養液と酵素溶液から
なるバッチをロータリーシェーカー上(40rpm)室
温で5時間注意深くかきまぜる。特定の時間間隔で、試
料をこのバッチから採取し、そして顕微鏡で分析する。
ーを通して滅菌する。タバコ懸濁培養液と酵素溶液から
なるバッチをロータリーシェーカー上(40rpm)室
温で5時間注意深くかきまぜる。特定の時間間隔で、試
料をこのバッチから採取し、そして顕微鏡で分析する。
細胞の約80%が球形のプロトプラストに変化するまで
酵素消化を続ける。次に保温容器をシェーカーから取り
出す。細胞/プロトプラスト懸濁液を静置し、そして細
胞およびプロトプラストを含まない培地の上半分をピペ
ットで吸い上げて除き、それを廃棄する。残部を5〇−
遠心管に移し、臨床用遠心分離機(HN−3n型、1E
C)内500 rpmで10分間遠心分離する。
酵素消化を続ける。次に保温容器をシェーカーから取り
出す。細胞/プロトプラスト懸濁液を静置し、そして細
胞およびプロトプラストを含まない培地の上半分をピペ
ットで吸い上げて除き、それを廃棄する。残部を5〇−
遠心管に移し、臨床用遠心分離機(HN−3n型、1E
C)内500 rpmで10分間遠心分離する。
プロトプラスト含有ペレットはすすぎ溶液I(■項参照
)中に再懸濁され、そして次に1100Orpで10分
間再び遠心分離する。
)中に再懸濁され、そして次に1100Orpで10分
間再び遠心分離する。
プロトプラストを含有するバンドは遠心管の上端部に位
置する。プロトプラスト画分を集め、次にすすぎ溶液I
で再びすすぐ。プロトプラストを遠心管に戻し、そして
次の使用のために必要となるまで水中に保存する。
置する。プロトプラスト画分を集め、次にすすぎ溶液I
で再びすすぐ。プロトプラストを遠心管に戻し、そして
次の使用のために必要となるまで水中に保存する。
実施例4 : cDNA遺伝子ライブラリィの横築cD
NA遺伝子ライブラリィは、ニコチアナ・ツバカムの園
芸品種ハバナ425植物の柔細胞様組織のクローン化系
列(実施例1参照)から得ることができるポリ(A)+
RNAから出発して作成される。タバコ組織は、無ホル
モンLS基本培地上で組織を培養することにより実施例
2に記載したように高レベルのキチナーゼを産生ずるよ
うに最初に刺激される。
NA遺伝子ライブラリィは、ニコチアナ・ツバカムの園
芸品種ハバナ425植物の柔細胞様組織のクローン化系
列(実施例1参照)から得ることができるポリ(A)+
RNAから出発して作成される。タバコ組織は、無ホル
モンLS基本培地上で組織を培養することにより実施例
2に記載したように高レベルのキチナーゼを産生ずるよ
うに最初に刺激される。
4.1.全RNAの単離
全RNAの調製はLagrimini LM gt a
l(1987)に記載された方法に実質的に従って行わ
れる。
l(1987)に記載された方法に実質的に従って行わ
れる。
液体窒素で急速冷凍されたタバコ組織を乳鉢中で最初に
粗く粉末化し、次に適当なホモジナイザー緩衝液中に入
れる(組織1gあたり緩衝液z5−)。該緩衝液は(1
)7.56 MグアニジンHCI、0.73Mメルカプ
トエタノール、18、9 mM酢酸ナトリウムpH5,
0、(2)4%(W/v)SDS、0.1MトリスHC
lpH7,8(1容量)+80%(v / v )フェ
ノール、0、1%(w / v )ヒドロキシキノリン
、0.1MトリスHe1pH7,8(1容量)または(
3)Lagrimini LM et aL(1981
”)に準拠したもノノイずれかである。等量のフェノー
ルを添加した後、バッチを例えばポリトロンホモジナイ
ゼーションでホモジナイズする。半容量のクロロホルム
を次に添加し、そしてエマルジョンを約15分間注意深
(混合する。次に遠心分離(10400gで10分間)
により様々な相に分け、水相を廃棄する。この時点で所
望するならば、さらに抽出段階を加えることも可能であ
るが、これは例えば付加的なフェノール/クロロホルム
抽出またはフェノール:クロロホルム:イソアミルアル
コール(25: 24 : 1)の混合物での抽出2回
の形態で行われる。
粗く粉末化し、次に適当なホモジナイザー緩衝液中に入
れる(組織1gあたり緩衝液z5−)。該緩衝液は(1
)7.56 MグアニジンHCI、0.73Mメルカプ
トエタノール、18、9 mM酢酸ナトリウムpH5,
0、(2)4%(W/v)SDS、0.1MトリスHC
lpH7,8(1容量)+80%(v / v )フェ
ノール、0、1%(w / v )ヒドロキシキノリン
、0.1MトリスHe1pH7,8(1容量)または(
3)Lagrimini LM et aL(1981
”)に準拠したもノノイずれかである。等量のフェノー
ルを添加した後、バッチを例えばポリトロンホモジナイ
ゼーションでホモジナイズする。半容量のクロロホルム
を次に添加し、そしてエマルジョンを約15分間注意深
(混合する。次に遠心分離(10400gで10分間)
により様々な相に分け、水相を廃棄する。この時点で所
望するならば、さらに抽出段階を加えることも可能であ
るが、これは例えば付加的なフェノール/クロロホルム
抽出またはフェノール:クロロホルム:イソアミルアル
コール(25: 24 : 1)の混合物での抽出2回
の形態で行われる。
抽出の次は沈澱工程が行われる。これは0.3M酢酸ナ
トリウムおよびエタノール2.5容量部の添加により行
われる。沈澱物を遠心分離(10400gで15分間)
により集め、そして滅菌水2mN’中に再懸濁させる。
トリウムおよびエタノール2.5容量部の添加により行
われる。沈澱物を遠心分離(10400gで15分間)
により集め、そして滅菌水2mN’中に再懸濁させる。
塩化リチウムを最終濃度3Mに添加した後、全体のバッ
チを4℃で一晩保温する。沈澱を次に遠心分離により再
び集め、そして形成されたペレットを水冷エタノールで
洗浄する。ペレットを次に乾燥させ、そして滅菌水50
0μ!中に再懸濁させる。
チを4℃で一晩保温する。沈澱を次に遠心分離により再
び集め、そして形成されたペレットを水冷エタノールで
洗浄する。ペレットを次に乾燥させ、そして滅菌水50
0μ!中に再懸濁させる。
この沈澱物中の全RNAの濃度は分光分析により決定さ
れる。
れる。
上記方法の変法として、全RNAはカルス組織から単離
され得る。この場合もまた、上記の工程段階が使用され
るが、使用される出発材料は立方体(約811I+)に
切断されたカルス組織であり、これはホモジナイゼーシ
ョン段階の前にまず液体窒素での急速冷凍を行い、次に
予め冷却された乳鉢中で微粉末に粉砕される。
され得る。この場合もまた、上記の工程段階が使用され
るが、使用される出発材料は立方体(約811I+)に
切断されたカルス組織であり、これはホモジナイゼーシ
ョン段階の前にまず液体窒素での急速冷凍を行い、次に
予め冷却された乳鉢中で微粉末に粉砕される。
4.2.ポリアデニル化RNAの単離
ポリ(A)+RNAはそれ自体公知の方法(Mohne
n(1979)参照)に従って、オリゴ−d(T)セル
ロースクロマトグラフィー〔米国マサチューセッツ州レ
キシントンのコラボラティブ・リサーチ(Collab
orative Re5earch))により単離され
る。
n(1979)参照)に従って、オリゴ−d(T)セル
ロースクロマトグラフィー〔米国マサチューセッツ州レ
キシントンのコラボラティブ・リサーチ(Collab
orative Re5earch))により単離され
る。
オリゴ−d (T)セルロースを最初に2.0MのNa
Cl20容量中で15分間洗浄し、次に滅菌水中に懸濁
し、モしてカラム(直径1.5 am 。
Cl20容量中で15分間洗浄し、次に滅菌水中に懸濁
し、モしてカラム(直径1.5 am 。
長さ20C11+)中に充填する。カラムを次に緩衝液
(440mMNaC1,0,9mMEDTA、 9mM
トリス−MCI、pH7,5、またハ0.5M(7)N
aC1,10mM)リス−HCl、pH7,5)で、溶
出液のpHが7.0ないし7.6になるまで洗浄する。
(440mMNaC1,0,9mMEDTA、 9mM
トリス−MCI、pH7,5、またハ0.5M(7)N
aC1,10mM)リス−HCl、pH7,5)で、溶
出液のpHが7.0ないし7.6になるまで洗浄する。
4.0−の容量中のRNA含量が0.6■ないし6.0
■のRNA溶液を、最終濃度EDTAが1 mM、そし
てピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)
が10mM1pH7,5に調整する。RNAを70”C
で5分間加熱することにより変性させ、そして氷上で冷
却する。
■のRNA溶液を、最終濃度EDTAが1 mM、そし
てピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)
が10mM1pH7,5に調整する。RNAを70”C
で5分間加熱することにより変性させ、そして氷上で冷
却する。
全体の緋液を次に4MのN a C10,1容量部で0
、36 MのNaC1の値に調整する。RNA溶液をカ
ラムに入れ、そして非ポリアデニル化RNA(ポリ(A
)+RNA)を上記緩衝液で溶出させる。溶出液の吸光
度は分光光度計(日立100−40型)およびそれに連
結されたW+Wレコーダー〔スイス国バーゼルのサイエ
ンティフィック・インストルメンツ(Scientif
icInstruments))により決定される。吸
光度が基底状態に達したらすぐに、カラムに結合されて
いるポリ(A)+RNAを1mMEDTA、10mM)
リス−HC1pH7,5で溶出させる。溶出液を0.5
mMEDTAおよび0.3M酢酸ナトリウムp H5,
0の溶液中に導入し、そしてエタノールz5容量部の添
加により沈澱させる。次に83000Xg(30ないし
45分)の遠心分離によりRNAを集め、窒素下で乾燥
させ、そして1mMEDTA、10mM)リス−Hel
pH7,5または水中に再懸濁させる。
、36 MのNaC1の値に調整する。RNA溶液をカ
ラムに入れ、そして非ポリアデニル化RNA(ポリ(A
)+RNA)を上記緩衝液で溶出させる。溶出液の吸光
度は分光光度計(日立100−40型)およびそれに連
結されたW+Wレコーダー〔スイス国バーゼルのサイエ
ンティフィック・インストルメンツ(Scientif
icInstruments))により決定される。吸
光度が基底状態に達したらすぐに、カラムに結合されて
いるポリ(A)+RNAを1mMEDTA、10mM)
リス−HC1pH7,5で溶出させる。溶出液を0.5
mMEDTAおよび0.3M酢酸ナトリウムp H5,
0の溶液中に導入し、そしてエタノールz5容量部の添
加により沈澱させる。次に83000Xg(30ないし
45分)の遠心分離によりRNAを集め、窒素下で乾燥
させ、そして1mMEDTA、10mM)リス−Hel
pH7,5または水中に再懸濁させる。
4、3. c D N Aクローンの構築および選択5
−25%(w/v)ショ糖グラジェント(1mMEDT
A ; 10mM)リス−HCl、pH7,5)上での
調製超遠心分離(57000gで17時間)によりポリ
(A)+RNAを個々の両分に分離する。キチナーゼに
対する情報を含有する画分は抗キチナーゼ抗体による試
験管内での翻訳の後に同定され得る。これらの両分を次
に一緒にし、そしてさらに仕上げのために使用する。
−25%(w/v)ショ糖グラジェント(1mMEDT
A ; 10mM)リス−HCl、pH7,5)上での
調製超遠心分離(57000gで17時間)によりポリ
(A)+RNAを個々の両分に分離する。キチナーゼに
対する情報を含有する画分は抗キチナーゼ抗体による試
験管内での翻訳の後に同定され得る。これらの両分を次
に一緒にし、そしてさらに仕上げのために使用する。
抗キチナーゼ抗体作成の操作は当業者には公知であり、
そして例えば5hinshi et aL (1985
)およびMohnen(1985)に記載された方法に
従って実施され得る。その方法において、完全フロイン
トのアジュバント中の精製キチナーゼ調製物を含む実質
的なエマルジョンは3力月令のメスウサギにュージーラ
ンド白色ウサギ)に注射される。さらに1週間後および
2週間後そしてその後1カ月間隔で注射を行う。血液は
各注射の7ないし10日後に採取され、血清試料を一2
0℃で保存する。免疫グロブリンGはプロティンA−セ
ファロースCI 47カラム〔)アルマシア(Pha
rmacia) )上のアフィニティクロマトグラフィ
ーにより精製され、次いで凍結乾燥され、そして−20
℃で保存される。
そして例えば5hinshi et aL (1985
)およびMohnen(1985)に記載された方法に
従って実施され得る。その方法において、完全フロイン
トのアジュバント中の精製キチナーゼ調製物を含む実質
的なエマルジョンは3力月令のメスウサギにュージーラ
ンド白色ウサギ)に注射される。さらに1週間後および
2週間後そしてその後1カ月間隔で注射を行う。血液は
各注射の7ないし10日後に採取され、血清試料を一2
0℃で保存する。免疫グロブリンGはプロティンA−セ
ファロースCI 47カラム〔)アルマシア(Pha
rmacia) )上のアフィニティクロマトグラフィ
ーにより精製され、次いで凍結乾燥され、そして−20
℃で保存される。
ポリ(A)+RNAマトリックスから出発する二重鎖D
NAの合成、pBR322内での該二重鎖DNAのクロ
ーニング、分別コロニーハイブリダイゼーションおよび
プラスミドの分離は、Maniatis et aL
(1982)の指示および記載に実質的に従って行われ
る。
NAの合成、pBR322内での該二重鎖DNAのクロ
ーニング、分別コロニーハイブリダイゼーションおよび
プラスミドの分離は、Maniatis et aL
(1982)の指示および記載に実質的に従って行われ
る。
二重鎖DNA約0.8μgの合成のために、予め単離さ
れ、そしてキチナーゼmRNAで富化されたポリ(A)
+RNA3μgを逆転写酵素(フロリダ州すンペテルス
ブルクのライフ・サイエンセズ(Life 5cien
ces) )およびDNAポリメラーゼI(マサチュー
セッツ州ビバリーの二ニー・イングランド・バイオラプ
ス)と保温する。生成するcDNAをホモポリマーdC
−dGテーリングによりpBR822のPstl切断部
位内にスプライシングさせる。該テーリングはcDNA
とベクターDNAに相補的な粘着端を付与することを可
能にし、そしてManiatiset aL (198
2)[217−219頁]に記載されている。
れ、そしてキチナーゼmRNAで富化されたポリ(A)
+RNA3μgを逆転写酵素(フロリダ州すンペテルス
ブルクのライフ・サイエンセズ(Life 5cien
ces) )およびDNAポリメラーゼI(マサチュー
セッツ州ビバリーの二ニー・イングランド・バイオラプ
ス)と保温する。生成するcDNAをホモポリマーdC
−dGテーリングによりpBR822のPstl切断部
位内にスプライシングさせる。該テーリングはcDNA
とベクターDNAに相補的な粘着端を付与することを可
能にし、そしてManiatiset aL (198
2)[217−219頁]に記載されている。
オリゴ−dC末端を有するPstl直線化ベクターpB
R322は市販されている。
R322は市販されている。
生成する組換えプラスミドは次にコンピテント大腸菌D
HI細胞の形質転換のために使用される。プラスミド内
でのクローニングはManiatiSet aL (1
982)の242−246頁および391頁に記載され
ている。
HI細胞の形質転換のために使用される。プラスミド内
でのクローニングはManiatiSet aL (1
982)の242−246頁および391頁に記載され
ている。
寒天プレート上の細菌コロニーの形態にあるこのように
して構築されたcDNAライブラリィはまず最初に放射
活性標識cDNAを用いる分別コロニーハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングされる。
して構築されたcDNAライブラリィはまず最初に放射
活性標識cDNAを用いる分別コロニーハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングされる。
分別コロニーハイブリダイゼーションにおいて、細菌コ
ロニーの複製は寒天プレート上にフィルターを置き、次
にそれらを再び注意深(取り除−(ことにより、ニトロ
セルロースフィルターで行われる。最初の寒天プレート
は陽性コロニーの後の同定のために保存される。細菌コ
ロニーを付着しているフィルターを次に栄養培地上に置
き、そしてコロニーが約2mg+の大きさに成長するま
で放置する。フィルターを次に、細菌細胞の溶解および
フィルター上の細菌DNAの変性および固定を導く水酸
化ナトリウム溶液で処理する。pHを中和した後、フィ
ルターを繰り返し洗浄し、乾燥し、そして最後に真空中
80℃の温度で[黒化Jし、その結果DNAをフィルタ
ーに共有結合させる。
ロニーの複製は寒天プレート上にフィルターを置き、次
にそれらを再び注意深(取り除−(ことにより、ニトロ
セルロースフィルターで行われる。最初の寒天プレート
は陽性コロニーの後の同定のために保存される。細菌コ
ロニーを付着しているフィルターを次に栄養培地上に置
き、そしてコロニーが約2mg+の大きさに成長するま
で放置する。フィルターを次に、細菌細胞の溶解および
フィルター上の細菌DNAの変性および固定を導く水酸
化ナトリウム溶液で処理する。pHを中和した後、フィ
ルターを繰り返し洗浄し、乾燥し、そして最後に真空中
80℃の温度で[黒化Jし、その結果DNAをフィルタ
ーに共有結合させる。
フィルターを放射標識(非クローン化)cDNAプロー
ブと順番に2回ハイプツト形成させる。これらのcDN
Aプローブは、キチナーゼを産生ずるように予め誘導さ
れた(ホルモンを添加しない基本培地で7日間の保温)
タバコ組織からのポリ(A)+RNAおよび非誘導化タ
バコ組織からのポリ(A)+RNA (オーキシン/サ
イトカイニン上で7日間の保温)である。
ブと順番に2回ハイプツト形成させる。これらのcDN
Aプローブは、キチナーゼを産生ずるように予め誘導さ
れた(ホルモンを添加しない基本培地で7日間の保温)
タバコ組織からのポリ(A)+RNAおよび非誘導化タ
バコ組織からのポリ(A)+RNA (オーキシン/サ
イトカイニン上で7日間の保温)である。
非誘導化組織からの対照DNAと反応するよりも、誘導
化組織からのcDNAとより強く反応する有望cDNA
クローンはMohnen et al(1985)およ
びMohnen(1985)に記載された方法に従う「
ハイブリッド選択」翻訳法を用いるその他の分析に供さ
れる。プラスミドDNAを0.2Mないし0.3MのN
aOH,3MのNaC1中で1分間煮沸することにより
変性させ、そして氷上で冷却させる。ハイブリダイゼー
ション反応はフィルターあたり200μgないし250
μgの全RNAを用いて、スクエアBA/85ニトロセ
ルロースフィルター〔西ドイツ国ダッセルのシュライヒ
ャー・ラント・シューエル(Schleicher u
nd 5chuell))上で行われる。フィルター上
でハイプツト形成されたRNAを溶出させ、エタノール
で沈澱させ、そして水10μ!中に溶解させ、試験管内
翻訳(市販の小麦麦芽抽出物を用いる)により分析され
る。放射標識された生成物は所望のタンパク質に対する
抗体と沈澱し、モしてSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析される。
化組織からのcDNAとより強く反応する有望cDNA
クローンはMohnen et al(1985)およ
びMohnen(1985)に記載された方法に従う「
ハイブリッド選択」翻訳法を用いるその他の分析に供さ
れる。プラスミドDNAを0.2Mないし0.3MのN
aOH,3MのNaC1中で1分間煮沸することにより
変性させ、そして氷上で冷却させる。ハイブリダイゼー
ション反応はフィルターあたり200μgないし250
μgの全RNAを用いて、スクエアBA/85ニトロセ
ルロースフィルター〔西ドイツ国ダッセルのシュライヒ
ャー・ラント・シューエル(Schleicher u
nd 5chuell))上で行われる。フィルター上
でハイプツト形成されたRNAを溶出させ、エタノール
で沈澱させ、そして水10μ!中に溶解させ、試験管内
翻訳(市販の小麦麦芽抽出物を用いる)により分析され
る。放射標識された生成物は所望のタンパク質に対する
抗体と沈澱し、モしてSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析される。
4、4. c D N AクローンpCHN48cDN
A遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハイブ
リダイゼーションを用いてManiatis et a
t (1982)に従ってスクリーニングされる。DN
Aプローブとして、成熟タンパク質をコードする全体の
DNA配列を含むが完全なN末端シグナルペプチド配列
を欠いている5hinshi et aL (1987
)に記載されたcDNAクローンpcHN50が用いら
れている。このようにして異なる長さを有する種々のク
ローンが得られる。これらのクローンの最長のものが選
択され、そしてヌクレオチド配列分析に供される。pC
HN48と記載されるこのクローンは1.14 kbか
らなり、そしてポリ(A)末端に7個のアデノシン、3
29個のアミノ酸からなるポリペプチドに相当する単一
の大きな読み枠(読み取り可能枠)長さ987ヌクレオ
チド、および51非翻訳領域からのヌクレオチドを有す
る挿入物を有する。コード領域のDNA配列から誘導可
能なアミノ酸配列は、タバコからの公知キチナーゼの2
0個の最初のN末端アミノ酸に対する配列に一致する。
A遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハイブ
リダイゼーションを用いてManiatis et a
t (1982)に従ってスクリーニングされる。DN
Aプローブとして、成熟タンパク質をコードする全体の
DNA配列を含むが完全なN末端シグナルペプチド配列
を欠いている5hinshi et aL (1987
)に記載されたcDNAクローンpcHN50が用いら
れている。このようにして異なる長さを有する種々のク
ローンが得られる。これらのクローンの最長のものが選
択され、そしてヌクレオチド配列分析に供される。pC
HN48と記載されるこのクローンは1.14 kbか
らなり、そしてポリ(A)末端に7個のアデノシン、3
29個のアミノ酸からなるポリペプチドに相当する単一
の大きな読み枠(読み取り可能枠)長さ987ヌクレオ
チド、および51非翻訳領域からのヌクレオチドを有す
る挿入物を有する。コード領域のDNA配列から誘導可
能なアミノ酸配列は、タバコからの公知キチナーゼの2
0個の最初のN末端アミノ酸に対する配列に一致する。
実施例5ニゲツム遺伝子ライブラリイの構築プロトプラ
ストの溶菌のために、水冷プロトプラスト懸濁液100
−を氷冷TENP緩衝液(1項参照)400−と混合す
る。IEC臨床用遠心分離機中200 Orpmで10
分間遠心分離することによりこの溶菌物から核を分離す
る。
ストの溶菌のために、水冷プロトプラスト懸濁液100
−を氷冷TENP緩衝液(1項参照)400−と混合す
る。IEC臨床用遠心分離機中200 Orpmで10
分間遠心分離することによりこの溶菌物から核を分離す
る。
そのように得られるペレットを水冷TENP緩衝液緩衝
液500中t’中濁し、そして上記のように再びペレッ
ト化する。次いでCsC1グラジェント試験管8本を準
備し、各試験管中のプロトプラスト懸濁液約IZ5−を
含む細胞ペレットを10倍濃厚TE緩衝液(1項参照)
26−に添加する。細胞核を溶菌するために、20%(
W/V)ナトリウムラウリルサルコシン溶液5−および
CCsC13Z2および臭化エチジウム溶液(E t
B r ; 10mg/i) Z 89rId!をバッ
チに添加する。全体のバッチをゆっ(りかきまぜ、Cs
C1を溶解させる。
液500中t’中濁し、そして上記のように再びペレッ
ト化する。次いでCsC1グラジェント試験管8本を準
備し、各試験管中のプロトプラスト懸濁液約IZ5−を
含む細胞ペレットを10倍濃厚TE緩衝液(1項参照)
26−に添加する。細胞核を溶菌するために、20%(
W/V)ナトリウムラウリルサルコシン溶液5−および
CCsC13Z2および臭化エチジウム溶液(E t
B r ; 10mg/i) Z 89rId!をバッ
チに添加する。全体のバッチをゆっ(りかきまぜ、Cs
C1を溶解させる。
このようにして得られた溶菌物をポリアロマ−試験管(
ベックマンVTi50,39m1試験管)に移し、そし
て45000 rpmおよび20℃で16時間VTi5
0ローター(ベックマン(Beckman) )中で遠
心分離する。紫外線で蛍光性であるバンドが16ゲージ
の針を付けた3−のシリンジによりグラジェントから除
去され、そして集められる。さらにDNAの仕上げが上
記のCs C1/ B t B r平衡遠心分離の反復
により行われる。蛍光性バンドが再び集められ、付着す
るEtBrが20XSSC(1項参照)で飽和されたイ
ソプロパツール(等量)を用いる6回の連続抽出段階で
除去される。DNAがグラジェント溶液から沈澱され、
そして蒸留水2容量、&OM酢酸ナトリウム(pH5,
4)0゜1容量およびごタノール2容量を連続的に添加
することにより上記のように精製される。フィラメント
状のDNAをパスツールピペットにより溶液から巻き取
り、70%エタノールで洗浄し、そしてさらに等量のク
ロロホルムで抽出する。3M酢酸ナトリウム(pH5,
4)0.1容量およびエタノール2.0容量を添加する
ことによりDNAを沈澱させる。DNAフィラメントを
再び巻き取り、70%エタノールで洗浄し、そして5分
間風乾する。これを次に全量71nlのTE緩衝液(1
項参照)中に溶解し、そして次の使用まで4℃で保存す
る。
ベックマンVTi50,39m1試験管)に移し、そし
て45000 rpmおよび20℃で16時間VTi5
0ローター(ベックマン(Beckman) )中で遠
心分離する。紫外線で蛍光性であるバンドが16ゲージ
の針を付けた3−のシリンジによりグラジェントから除
去され、そして集められる。さらにDNAの仕上げが上
記のCs C1/ B t B r平衡遠心分離の反復
により行われる。蛍光性バンドが再び集められ、付着す
るEtBrが20XSSC(1項参照)で飽和されたイ
ソプロパツール(等量)を用いる6回の連続抽出段階で
除去される。DNAがグラジェント溶液から沈澱され、
そして蒸留水2容量、&OM酢酸ナトリウム(pH5,
4)0゜1容量およびごタノール2容量を連続的に添加
することにより上記のように精製される。フィラメント
状のDNAをパスツールピペットにより溶液から巻き取
り、70%エタノールで洗浄し、そしてさらに等量のク
ロロホルムで抽出する。3M酢酸ナトリウム(pH5,
4)0.1容量およびエタノール2.0容量を添加する
ことによりDNAを沈澱させる。DNAフィラメントを
再び巻き取り、70%エタノールで洗浄し、そして5分
間風乾する。これを次に全量71nlのTE緩衝液(1
項参照)中に溶解し、そして次の使用まで4℃で保存す
る。
翫Zゲノムλ遺伝子ライブラリィの構築予め単離された
タバコDNAを制限酵素5au3Aで消化し、SW41
0−ター(ベックマン)内20000 rpmでの10
%−40%ショ糖グラジェントにより20時間分離する
。グラジェントから得られる画分をゲル電気泳動(TB
E緩衝液中0.5%のアガロースゲル)により分析する
。正しい大きさの断片を有する画分を貯める。
タバコDNAを制限酵素5au3Aで消化し、SW41
0−ター(ベックマン)内20000 rpmでの10
%−40%ショ糖グラジェントにより20時間分離する
。グラジェントから得られる画分をゲル電気泳動(TB
E緩衝液中0.5%のアガロースゲル)により分析する
。正しい大きさの断片を有する画分を貯める。
3M酢酸ナトリウム(1)H4,8)0.1容量および
エタノール2容量を用いてDNAを沈澱させ、そしてB
amHI (カリフォルニア州う・ジヨウのストラタゲ
ン(Stratagen) )で消化されたホスファタ
ーゼ処理されたλEMBL3DNAと連結させる。連結
反応は製造会社の指示に従って行われ、λベクターDN
A1 ugおよび組み入れられるべきタバコDNA0.
1μgを含有する5μ!の反応バッチが使用される。こ
の連結反応から生じるDNAのλファージの頭部への組
入れはストラタゲンによるギガパック・プラス・キット
を用い、製造会社の指示に従って行われる。大腸菌CE
3201 (Glover DM)の感染後に得られ
たファージは挿入されたDNA1μgあたり約2×10
・ファージである。
エタノール2容量を用いてDNAを沈澱させ、そしてB
amHI (カリフォルニア州う・ジヨウのストラタゲ
ン(Stratagen) )で消化されたホスファタ
ーゼ処理されたλEMBL3DNAと連結させる。連結
反応は製造会社の指示に従って行われ、λベクターDN
A1 ugおよび組み入れられるべきタバコDNA0.
1μgを含有する5μ!の反応バッチが使用される。こ
の連結反応から生じるDNAのλファージの頭部への組
入れはストラタゲンによるギガパック・プラス・キット
を用い、製造会社の指示に従って行われる。大腸菌CE
3201 (Glover DM)の感染後に得られ
たファージは挿入されたDNA1μgあたり約2×10
・ファージである。
ゲノム遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハ
イブリダイゼーションを用いてManfatis et
aLc1982>に従ってスクリーニングされるo
5hinslti et at (1987)に記載さ
れたCDNAクローンpcHN50および4.40項で
単離されたクローンpCHN48がDNAプローブとし
て使用される。
イブリダイゼーションを用いてManfatis et
aLc1982>に従ってスクリーニングされるo
5hinslti et at (1987)に記載さ
れたCDNAクローンpcHN50および4.40項で
単離されたクローンpCHN48がDNAプローブとし
て使用される。
この方法で得られる組換え体は精製され、モしてサザン
プロット分析を用いて部分的に特徴づけられる。これら
のクローンの一つはcDNAプローブ分子pcHN50
およびp CHN 48との非常に強いハイブリダイゼ
ーションシグナルを示し、モしてサザンプロット分析に
従って完全なキチナーゼ遺伝子を含有するが、さらに試
験のために選択され、そしてλCHN17と記載される
。
プロット分析を用いて部分的に特徴づけられる。これら
のクローンの一つはcDNAプローブ分子pcHN50
およびp CHN 48との非常に強いハイブリダイゼ
ーションシグナルを示し、モしてサザンプロット分析に
従って完全なキチナーゼ遺伝子を含有するが、さらに試
験のために選択され、そしてλCHN17と記載される
。
制限酵素H3ndllIでの消化の後、完全なキチナー
ゼ遺伝子を含有し、そしてタバコDNAからの同様の大
きさの断片に関連する5、4kbDNA断片が得られる
。3850bpからなり、そして全体のコード配列を含
むこの断片の一部を次に配列決定する。
ゼ遺伝子を含有し、そしてタバコDNAからの同様の大
きさの断片に関連する5、4kbDNA断片が得られる
。3850bpからなり、そして全体のコード配列を含
むこの断片の一部を次に配列決定する。
制限断片を適当なりローニングベクター、例えばMl
amp 18またはM13mp19[Yanisch−
Perron et at (1985)]内にクロー
ン化し、ジデオキシヌクレオチド法〔「ジデオキシヌク
レオチド鎖停止法J ; Sanger et at
(1977)]により両方の開始部位の配列決定を行う
。
amp 18またはM13mp19[Yanisch−
Perron et at (1985)]内にクロー
ン化し、ジデオキシヌクレオチド法〔「ジデオキシヌク
レオチド鎖停止法J ; Sanger et at
(1977)]により両方の開始部位の配列決定を行う
。
決定されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列はジェネテ
ィクス・コンピューター−グループ・ソフトウェア[D
evereux et aL (1985)]を用いて
コンピュータによりさらに分析される。
ィクス・コンピューター−グループ・ソフトウェア[D
evereux et aL (1985)]を用いて
コンピュータによりさらに分析される。
遺伝子48と命名されるタバコからの塩基性キチナーゼ
遺伝子の完全なDNA配列は上に示されているとおりで
ある。
遺伝子の完全なDNA配列は上に示されているとおりで
ある。
cDNAクローンpCHN48とpCHN50との配列
比較は、遺伝子47のコード領域内に2か所の介在配列
部位(イントロン)があることを明らかにしている。こ
れらのイントロンの最初のものは274bpからなり、
そしてグリシンをコードするコドン14.8の第一ヌク
レオチドと第二ヌクレオチドとの間に位置する。
比較は、遺伝子47のコード領域内に2か所の介在配列
部位(イントロン)があることを明らかにしている。こ
れらのイントロンの最初のものは274bpからなり、
そしてグリシンをコードするコドン14.8の第一ヌク
レオチドと第二ヌクレオチドとの間に位置する。
第二のイントロンは長さ269bpであり、ヒスチジン
をコードするコドン199の第二ヌクレオチドと第三ヌ
クレオチドとの間に位置する。
をコードするコドン199の第二ヌクレオチドと第三ヌ
クレオチドとの間に位置する。
両方のイントロンは、公知のその他の公知植物および動
物イントロンと一致して、ドナーおよびアクセプター配
列(GTAAGTCおよびACAG)を有するコンセン
サススプライシング部位を有する。さらに、両方のイン
トロンは配列CT (G/A)A (C/T) 、動物
コンセンサス配列(PyTPuAPy)と類似性を有す
る31境界からの33ヌクレオチドを有する。
物イントロンと一致して、ドナーおよびアクセプター配
列(GTAAGTCおよびACAG)を有するコンセン
サススプライシング部位を有する。さらに、両方のイン
トロンは配列CT (G/A)A (C/T) 、動物
コンセンサス配列(PyTPuAPy)と類似性を有す
る31境界からの33ヌクレオチドを有する。
これらのコンセンサス配列は切除における投げなわ中間
体の形成に関与する。
体の形成に関与する。
遺伝子48のエキソンのヌクレオチド配列はクリーンp
CHN48のコード領域のDNA配列と同一である。
CHN48のコード領域のDNA配列と同一である。
予め単離された全RNA501gを500μlのエッペ
ンドルフチューブ中で凍結乾燥させる。次いでRNAを
放射標識されたプローブ分子を含む溶液30μ!中に再
懸濁し、そして70℃で10分間加熱する。チューブを
水浴中37℃の温度ま′でゆっくり冷却し、そして−晩
保温する。37℃の水浴からチューブを取り出さずに、
以下の溶液および試薬: ウシ血清アルブミン 5■/1nIジチオ
トレイトール(100mM) 5μ1H808
μ1 RNasin(80単位) 2μm逆転写酵
素(400単位) 2μlを添加する。
ンドルフチューブ中で凍結乾燥させる。次いでRNAを
放射標識されたプローブ分子を含む溶液30μ!中に再
懸濁し、そして70℃で10分間加熱する。チューブを
水浴中37℃の温度ま′でゆっくり冷却し、そして−晩
保温する。37℃の水浴からチューブを取り出さずに、
以下の溶液および試薬: ウシ血清アルブミン 5■/1nIジチオ
トレイトール(100mM) 5μ1H808
μ1 RNasin(80単位) 2μm逆転写酵
素(400単位) 2μlを添加する。
この反応バッチは37℃の温度で30分間保温される。
反応は3M酢酸ナトリウム(pH5)5μlおよび無水
エタノール150μlの添加により停止される。試験管
を次に一20℃で30分間放置した後に、遠心分離によ
り沈澱を得る。次に洗浄(80%エタノール)および乾
燥(風乾)を行う。得られた沈澱を染料含有溶液(90
%ホルムアミド、0.05%ブロモフェノールブルー、
0.05%キシレンシアツール、1mMEDTA)10
μlないし20μm!中に再懸濁する。伸長物を6%配
列決定用ゲル[Maniatis et aL (19
82)]上で分離し、そしてオートラジオグラフィーに
より可視化する。
エタノール150μlの添加により停止される。試験管
を次に一20℃で30分間放置した後に、遠心分離によ
り沈澱を得る。次に洗浄(80%エタノール)および乾
燥(風乾)を行う。得られた沈澱を染料含有溶液(90
%ホルムアミド、0.05%ブロモフェノールブルー、
0.05%キシレンシアツール、1mMEDTA)10
μlないし20μm!中に再懸濁する。伸長物を6%配
列決定用ゲル[Maniatis et aL (19
82)]上で分離し、そしてオートラジオグラフィーに
より可視化する。
7、ZSlマツピング
mRNAの転写開始部位の分析はManiatiSet
aL (1982)における記載に実質的に基づいて
いるS1マツピングにより行われる。
aL (1982)における記載に実質的に基づいて
いるS1マツピングにより行われる。
全体の51非翻訳領域を含むゲノムクローンλCHN1
7を5au3A/Pstlで切断し、モして5フランキ
ング領域の一部およびコード配列の短い部分を含む0.
3kbからなる断片をMllベクター内にサブクローン
化する。このサブクローニング段階から得られた一本鎖
DNAは次に引き続くブライマー伸長のための鋳型とし
て使用される。生成する5tp−標識DNA試料をSs
t■およびPstlで切断する。伸長されたDNA鎖を
次に変性させ、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離する。DNA試料を次いでポリ(A)+RN
A3μgと共に52℃で16時間保温し、次に81ヌク
レアーゼ(約400単位/−)により30℃で消化する
。最適S1ヌクレア一ゼ濃度は前試験により決定され得
る。
7を5au3A/Pstlで切断し、モして5フランキ
ング領域の一部およびコード配列の短い部分を含む0.
3kbからなる断片をMllベクター内にサブクローン
化する。このサブクローニング段階から得られた一本鎖
DNAは次に引き続くブライマー伸長のための鋳型とし
て使用される。生成する5tp−標識DNA試料をSs
t■およびPstlで切断する。伸長されたDNA鎖を
次に変性させ、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離する。DNA試料を次いでポリ(A)+RN
A3μgと共に52℃で16時間保温し、次に81ヌク
レアーゼ(約400単位/−)により30℃で消化する
。最適S1ヌクレア一ゼ濃度は前試験により決定され得
る。
消化産物を次に6%配列決定用ゲルで分離する。
ポリ(A)+RNAは、高レベルのキチナーゼを産生ず
るように予め誘導された培養タバコ組織から上の記載に
従って単離される。
るように予め誘導された培養タバコ組織から上の記載に
従って単離される。
消化産物の長さはサイズ比較マーカーにより決定される
。適当なサイズ比較マーカーは、−重鎖DNAでの配列
決定反応を行い、そして電気泳動前にPStlで反応物
を消化することにより得られる。この方法において、ジ
デオキシ末端を有する異なる長さの断片が得られ、該断
片はマツピングされるべき保護断片として同一の51末
端を有する。
。適当なサイズ比較マーカーは、−重鎖DNAでの配列
決定反応を行い、そして電気泳動前にPStlで反応物
を消化することにより得られる。この方法において、ジ
デオキシ末端を有する異なる長さの断片が得られ、該断
片はマツピングされるべき保護断片として同一の51末
端を有する。
Slヌクレアーゼマツピングを用いると、全体で2本の
バンドを検出することが可能であり、これは種々の開始
部位がキチナーゼ遺伝子上に存在するという予測を導く
。当該バンドの強度を根拠とすれば、主要転写開始部位
はCTACT配列内の1969位にあるAと同一である
。
バンドを検出することが可能であり、これは種々の開始
部位がキチナーゼ遺伝子上に存在するという予測を導く
。当該バンドの強度を根拠とすれば、主要転写開始部位
はCTACT配列内の1969位にあるAと同一である
。
第1の可能性のある開始シグナルは上記転写開始部位の
11bpT流の1980位にある、塩基配列TAAAA
TGAG内に見出され、これは植物遺伝子のその他の翻
訳開始部位と並んでおり、コンセンサス配列と呼ばれる
。
11bpT流の1980位にある、塩基配列TAAAA
TGAG内に見出され、これは植物遺伝子のその他の翻
訳開始部位と並んでおり、コンセンサス配列と呼ばれる
。
51フランキング領域はその他の真核遺伝子と同様に調
節機能に直接連結され得る以下の多(の塩基配列: (a) 翻訳開始部位の上流で、5fフランキング領
域の−28ないし一23位にTAAATA配列(TAT
Aボックスと予想される) (b)TATAボックスの上流で動物遺伝子にときどき
見出されるCAATボックスに類似している、−114
位にCCAATT配列 (C) 動物遺伝子の調節熱シヨツクコンセンサスエ
レメントに類似している、−140位に6bpからなる
不完全逆方向反復配列(GCCGAATTCGAGC) (d) −152位と一228位に10bpからなる
完全反復配列(ATGTCCAAAC)(e)−166
位と一569位に20bpからなるげ) −191位
と一217位に25bpからなる(g)−289位に2
0bpからなるパリンドローム(TAAAATAT()
AITCATGTTTTA) (h) −435位と一480位にttbpからなる完
全直接反復配列(TAAGAGCCGCC)(i)
−514位と一644位に15bpからなる不完全直接
反復配列(TAAAATACACGTCGA) により特徴づけられる。
節機能に直接連結され得る以下の多(の塩基配列: (a) 翻訳開始部位の上流で、5fフランキング領
域の−28ないし一23位にTAAATA配列(TAT
Aボックスと予想される) (b)TATAボックスの上流で動物遺伝子にときどき
見出されるCAATボックスに類似している、−114
位にCCAATT配列 (C) 動物遺伝子の調節熱シヨツクコンセンサスエ
レメントに類似している、−140位に6bpからなる
不完全逆方向反復配列(GCCGAATTCGAGC) (d) −152位と一228位に10bpからなる
完全反復配列(ATGTCCAAAC)(e)−166
位と一569位に20bpからなるげ) −191位
と一217位に25bpからなる(g)−289位に2
0bpからなるパリンドローム(TAAAATAT()
AITCATGTTTTA) (h) −435位と一480位にttbpからなる完
全直接反復配列(TAAGAGCCGCC)(i)
−514位と一644位に15bpからなる不完全直接
反復配列(TAAAATACACGTCGA) により特徴づけられる。
31フランキング領域は、翻訳停止配列TAAの下流で
、52位と120位に2個のAATAAA配列により特
徴づけられる。
、52位と120位に2個のAATAAA配列により特
徴づけられる。
列の連結
& 1.プラスミド GYIの構築
プラスミドpGY1はPietrzak et aL
(1986)に記載された植物発現ベクターpDH51
から誘導される。プラスミドpGY1では出発プラスミ
ドpDH51のNcol切断部位がXhol切断部位に
置換されていた。
(1986)に記載された植物発現ベクターpDH51
から誘導される。プラスミドpGY1では出発プラスミ
ドpDH51のNcol切断部位がXhol切断部位に
置換されていた。
プラスミドpDH51がNcolで切断され、そして突
出末端がクレノウボリメラーゼを用いて充填される。こ
のときプラントである末端はXholリンカ−(CCT
CGAGG)と連結される。
出末端がクレノウボリメラーゼを用いて充填される。こ
のときプラントである末端はXholリンカ−(CCT
CGAGG)と連結される。
&2プラスミド ClB200の構築
この二元ベクターの構築は、PK2(AnGgtaL、
1985)の誘導体であるSchmfdhauser
gndHelinski(1985)に記載されたプ
ラスミドpTJS75を基にしており、該二元ベクター
は広い宿主範囲を有し、そしてテトラサイクリン耐性遺
伝子を有する。このプラスミドを制限酵素Narlで切
断し、そして次にNptt遺伝子を有するp U C4
K [Vierra and Messing(198
2)]のAceI断片に連結される。この方法で形成さ
れたプラスミドpTJ375kanはこのときテトラサ
イクリン耐性遺伝子の他にN1)t[遺伝子を含み、次
に制限酵素5ailで消化される。
1985)の誘導体であるSchmfdhauser
gndHelinski(1985)に記載されたプ
ラスミドpTJS75を基にしており、該二元ベクター
は広い宿主範囲を有し、そしてテトラサイクリン耐性遺
伝子を有する。このプラスミドを制限酵素Narlで切
断し、そして次にNptt遺伝子を有するp U C4
K [Vierra and Messing(198
2)]のAceI断片に連結される。この方法で形成さ
れたプラスミドpTJ375kanはこのときテトラサ
イクリン耐性遺伝子の他にN1)t[遺伝子を含み、次
に制限酵素5ailで消化される。
同時に、Rothstein SJ et al (1
987)に記載されているプラスミドpcIB7をBc
oRVで切断し、そしてアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのTiプラスミドからの左側および右側のT
−DNA境界配列ならびにキメラNos/N1)iff
遺伝子およびpUCポリリンカー領域を含む生成りco
RV断片をXholリンカ−と連結する。
987)に記載されているプラスミドpcIB7をBc
oRVで切断し、そしてアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのTiプラスミドからの左側および右側のT
−DNA境界配列ならびにキメラNos/N1)iff
遺伝子およびpUCポリリンカー領域を含む生成りco
RV断片をXholリンカ−と連結する。
生成する構築物は次にXho[で消化され、そしてプラ
スミドpTJs75kanの5ail切断部位にクロー
ン化される。遺伝子地図が第2図に示される生成するプ
ラスミドをpcIB200と記載する。
スミドpTJs75kanの5ail切断部位にクロー
ン化される。遺伝子地図が第2図に示される生成するプ
ラスミドをpcIB200と記載する。
&3プラスミド 5CHIOの構築
プラスミドpscH10はキチナーゼをコードする配列
、51の転写される非コード性配列(転写開始部位の上
流に位置するキチナーゼ遺伝子4817)21塩基対)
おJ:びCaMV85S植物発現ベクター1)GYIの
BamHI/PStlクローニング部位内にスプライシ
ングされた3′の転写される非コード性配列を含む。
、51の転写される非コード性配列(転写開始部位の上
流に位置するキチナーゼ遺伝子4817)21塩基対)
おJ:びCaMV85S植物発現ベクター1)GYIの
BamHI/PStlクローニング部位内にスプライシ
ングされた3′の転写される非コード性配列を含む。
pscHloの作成に必要な工程段階は第3図に示され
、そして以下にさらに詳細に記載される: (1) キチナーゼ遺伝子48を含むゲノムクローン
λCHN17をHindll[で切断する。生成する5
、8kbのHindI[断片を単離し、そしてプラスミ
ドI)UC8の旧ndllIクローニング部位内にスプ
ライシングし、プラスミドpCHN65を形成する。
、そして以下にさらに詳細に記載される: (1) キチナーゼ遺伝子48を含むゲノムクローン
λCHN17をHindll[で切断する。生成する5
、8kbのHindI[断片を単離し、そしてプラスミ
ドI)UC8の旧ndllIクローニング部位内にスプ
ライシングし、プラスミドpCHN65を形成する。
(2) プラスミドpCHN65をf!coRIで切
断し、キチナーゼコード化領域の51末端を含む生成す
るZ5kb断片を同様にpUC8にクローン化する。生
成するプラスミドをpcHN68と記載する。
断し、キチナーゼコード化領域の51末端を含む生成す
るZ5kb断片を同様にpUC8にクローン化する。生
成するプラスミドをpcHN68と記載する。
(3) プラスミドpcHN6BをPstlで消化し
、そして0.5 kbPstl/ BcoRI断片を失
って再び連結する(それ自体に連結する)。生成するプ
ラスミドをpCHN74と記載する。
、そして0.5 kbPstl/ BcoRI断片を失
って再び連結する(それ自体に連結する)。生成するプ
ラスミドをpCHN74と記載する。
(4)遺伝子48の転写の5を非コード領域をBamH
I切断部位の後方にクローン化するために、プラスミド
pCHN74を最初にHph[で消化し、次に74DN
Aポリメラーゼの作用によりプラント末端を付与し、そ
して最後にPSt[で切断する。Hphl/Pstl断
片を単離し、そしてH3ncll/Pstl[Viei
ra & Messing(1982)]で消化された
プラスミドpUCa内にスプライシングし、pCHN8
7を形成する。
I切断部位の後方にクローン化するために、プラスミド
pCHN74を最初にHph[で消化し、次に74DN
Aポリメラーゼの作用によりプラント末端を付与し、そ
して最後にPSt[で切断する。Hphl/Pstl断
片を単離し、そしてH3ncll/Pstl[Viei
ra & Messing(1982)]で消化された
プラスミドpUCa内にスプライシングし、pCHN8
7を形成する。
配列決定の後、最後の工程段階の間に1/2Hincl
l切断部位の塩基が失われたことをDNA配列に対する
参照により見ることができる。
l切断部位の塩基が失われたことをDNA配列に対する
参照により見ることができる。
(5) 1)CHN87をBcoR[およびHind
l[で消化し、そしてクローニングベクターpUC9[
Vieira & Messing(1982)]内に
スプライシングする。生成するプラスミドはpCHN8
Bと記載される。
l[で消化し、そしてクローニングベクターpUC9[
Vieira & Messing(1982)]内に
スプライシングする。生成するプラスミドはpCHN8
Bと記載される。
(6) タバコcDNAクローン48(pCHN48
)の1 kbPstl断片をプラスミドpUC8のPS
t[クローニング部位内にスプライシングし、pCHN
78を形成する。
)の1 kbPstl断片をプラスミドpUC8のPS
t[クローニング部位内にスプライシングし、pCHN
78を形成する。
(7)プラスミドpCHN78のPstl挿入物を制限
酵素PStlでプラスミドを切断することにより外し、
そしてpcH1?88のPst1部位にスプライシング
し、結果としてキチナーゼをコードする完全なDNA配
列を再構築する。生成するプラスミドはpCHN89と
記載される。
酵素PStlでプラスミドを切断することにより外し、
そしてpcH1?88のPst1部位にスプライシング
し、結果としてキチナーゼをコードする完全なDNA配
列を再構築する。生成するプラスミドはpCHN89と
記載される。
(8) プラスミドpCHN89を次にBamHIで
完全に消化し、そしてPstlで部分的に消化する。
完全に消化し、そしてPstlで部分的に消化する。
生成する1、 5 kb断片を、同様にBamHIおよ
びPStlで予め切断された植物発現ベクターpGYl
内にクローン化し、pscHlGを形成する。
びPStlで予め切断された植物発現ベクターpGYl
内にクローン化し、pscHlGを形成する。
このクローニング段階の結果として、キチナーゼをコー
ドするDNA配列はCaMVプロモーターとCaMV終
結配列との間に位置している。
ドするDNA配列はCaMVプロモーターとCaMV終
結配列との間に位置している。
8.4.プラスミド 5CH12の構築プラスミドpS
CH12は、その構造のために大腸菌およびアグロバク
テリウム・チュメファシエンスの両方で安定に複製可能
であるいわゆるシャトルベクターである。
CH12は、その構造のために大腸菌およびアグロバク
テリウム・チュメファシエンスの両方で安定に複製可能
であるいわゆるシャトルベクターである。
pscH12の構築のために、まず上記のプラスミドp
scH10をBcoR[で切断し、そして二元ベクター
pcIB20G内にスプライシングする。所望のプラス
ミドpSCH12がこのようにして構築される。
scH10をBcoR[で切断し、そして二元ベクター
pcIB20G内にスプライシングする。所望のプラス
ミドpSCH12がこのようにして構築される。
二元TiプラスミドベクターpscH12は、ATGR
始コドンからの31bp5”、コード配列およびタバコ
キチナーゼ遺伝子48の3マ非コード領域145bpを
含み、CaMV35SプロモーターとpGYlのターミ
ネータ−との間のポリリンカー領域内にスプライシング
する。
始コドンからの31bp5”、コード配列およびタバコ
キチナーゼ遺伝子48の3マ非コード領域145bpを
含み、CaMV35SプロモーターとpGYlのターミ
ネータ−との間のポリリンカー領域内にスプライシング
する。
このベクターはまた、ツバリンシンターゼ発現シグナル
の調節制御下にあり、そして形質転換された細胞にカナ
マイシン耐性を付与するTn5NPTI[遺伝子を含む
。
の調節制御下にあり、そして形質転換された細胞にカナ
マイシン耐性を付与するTn5NPTI[遺伝子を含む
。
連結
9.1.プラスミド 5GL4の構築
(a) 5hinshi et at (1988)
に記載されているツバ:IcDNAクローンI)GL3
6を制限酵素Pstlで切断し、そしてプラスミドpU
C8にクローン化する。生成するプラスミドをpGLN
12と記載する。
に記載されているツバ:IcDNAクローンI)GL3
6を制限酵素Pstlで切断し、そしてプラスミドpU
C8にクローン化する。生成するプラスミドをpGLN
12と記載する。
伽) タバコからの第2のcDNAクローンpGL 8
1 [5hinshi et at (1988)]を
AcclおよびPStlで消化し、そしてグルカナーゼ
をコードする配列の31部分を含む0.85 kb断片
を単離する。
1 [5hinshi et at (1988)]を
AcclおよびPStlで消化し、そしてグルカナーゼ
をコードする配列の31部分を含む0.85 kb断片
を単離する。
(C) 段階(alからのpGLN12をAcclお
よびPstrで消化する。グルカナーゼをコードする配
列の51部分を含む0.5 kb断片を単離する。
よびPstrで消化する。グルカナーゼをコードする配
列の51部分を含む0.5 kb断片を単離する。
(d) 段階ら)および(C)からの断片を、前もっ
てPstrで切断したプラスミドpUC8に一緒にクロ
ーン化し、グルカナーゼをコードする完全な配列を再構
築する。生成するプラスミドをpGLN13と記載する
。
てPstrで切断したプラスミドpUC8に一緒にクロ
ーン化し、グルカナーゼをコードする完全な配列を再構
築する。生成するプラスミドをpGLN13と記載する
。
(e) CD N Aの5’G付加物を削除し、そし
て同時にグルカナーゼをコードする配列の51側上のB
amHI切断部位を付加するために、5’G付加物がc
DNAの最初の2個の塩基と共にHaem切断部位を形
成するという事実が利用される。それ故にpGL12が
Haell[で切断され、そして0.3kb断片がpU
C9の旧ndlI部位にクローン化され、pGLN16
を形成する。
て同時にグルカナーゼをコードする配列の51側上のB
amHI切断部位を付加するために、5’G付加物がc
DNAの最初の2個の塩基と共にHaem切断部位を形
成するという事実が利用される。それ故にpGL12が
Haell[で切断され、そして0.3kb断片がpU
C9の旧ndlI部位にクローン化され、pGLN16
を形成する。
(f) 1)GLN16をC1alおよびPStlで
消化し、0.25kb断片がプラスミドpGLN13の
C1a1/PStl断片により置換され、その結果グル
カナーゼのコード配列が再構築される。生成するプラス
ミドをpGLN17と記載する。
消化し、0.25kb断片がプラスミドpGLN13の
C1a1/PStl断片により置換され、その結果グル
カナーゼのコード配列が再構築される。生成するプラス
ミドをpGLN17と記載する。
(g) pGLN17をBamHIおよびPstlで
消化する。このようにして得られるBam旧/Pstl
断片を、予めBamH[およびPStlで切断されたベ
クターpGYI内にスプライシングし、グルカナーゼを
コードする配列は、CaMVの853プロモーターとそ
の終結配列との間に位置している。生成するプラスミド
をpSGL2と記載する。
消化する。このようにして得られるBam旧/Pstl
断片を、予めBamH[およびPStlで切断されたベ
クターpGYI内にスプライシングし、グルカナーゼを
コードする配列は、CaMVの853プロモーターとそ
の終結配列との間に位置している。生成するプラスミド
をpSGL2と記載する。
(h) pSGL2のBcoRI断片を二元ベクター
pCIB200内にスプライシングし、pSGL4を形
成する。
pCIB200内にスプライシングし、pSGL4を形
成する。
グルカナーゼをコードする配列の直前にキチナーゼ遺伝
子の51非コ一ド配列を位置させるために、オリゴヌク
レオチド介在突然変異誘発が使用される。
子の51非コ一ド配列を位置させるために、オリゴヌク
レオチド介在突然変異誘発が使用される。
プラスミドpSGL2のBcoRI断片をクローニング
ベクターM18mp19内にクローン化し、m5GL
1を形成する。次にm5GL1をXholで切断し、そ
して再連結する。挿入物の部分が失われている。m5G
L5が形成される。
ベクターM18mp19内にクローン化し、m5GL
1を形成する。次にm5GL1をXholで切断し、そ
して再連結する。挿入物の部分が失われている。m5G
L5が形成される。
E、colid a m−株〔例えばE、coliGM
1674〕上でのm5GL1の増殖により産生された
一本鎖DNAを、dam”株(例えばE、coLiHB
IOI)からのXholで切断されたm5GL5DNA
とハイブリッド形成させ、−重鎖ギャップにより中断さ
れた二本鎖DNA (二重らせん)を形成する。これを
以下の塩基配列=5 ’TCATTTGGAGAGGA
CTACTACATTAAAATGGCTGCTATC
A3’0 を有する突然変異させたオリゴヌクレオチドと塩基対合
(「アニーリングJ)により連結させる。BamHIお
よびSma Iの両方の切断部位を失った突然変異させ
たクローンを同定し、そして分離する。それをm5GL
7と記載する。
1674〕上でのm5GL1の増殖により産生された
一本鎖DNAを、dam”株(例えばE、coLiHB
IOI)からのXholで切断されたm5GL5DNA
とハイブリッド形成させ、−重鎖ギャップにより中断さ
れた二本鎖DNA (二重らせん)を形成する。これを
以下の塩基配列=5 ’TCATTTGGAGAGGA
CTACTACATTAAAATGGCTGCTATC
A3’0 を有する突然変異させたオリゴヌクレオチドと塩基対合
(「アニーリングJ)により連結させる。BamHIお
よびSma Iの両方の切断部位を失った突然変異させ
たクローンを同定し、そして分離する。それをm5GL
7と記載する。
突然変異させた配列を含有するm5GL7からのAcc
l/C1al断片を次いでI)SCl2からのAccl
/C1al切断部位にクローン化し、pSGL2/9を
形成する。
l/C1al断片を次いでI)SCl2からのAccl
/C1al切断部位にクローン化し、pSGL2/9を
形成する。
pSGL2/9を制限酵素BcoRVおよびPstlで
消化し、そして突然変異させた配列を含有するBcoR
V/Pstl断片をpSGL2からのBcoRV/Ps
tl切断部位にスプライシングし、pSGL6を形成す
る。
消化し、そして突然変異させた配列を含有するBcoR
V/Pstl断片をpSGL2からのBcoRV/Ps
tl切断部位にスプライシングし、pSGL6を形成す
る。
それ故に、突然変異誘発において存在していた全ての配
列は、BcoR’/切断部位とC1al切断部位との間
の配列の短い部位を除いて、置換される。
列は、BcoR’/切断部位とC1al切断部位との間
の配列の短い部位を除いて、置換される。
最後に、psct、aをBcoRIで消化し、モしてB
coRI断片を二元ベクターpcIB200内にクロー
ン化する。生成するプラスミドをpSGL7と記載する
。
coRI断片を二元ベクターpcIB200内にクロー
ン化する。生成するプラスミドをpSGL7と記載する
。
このキメラ構策物は、
1、51末端で切断され、そして+84位の開始コドン
ATGで始まるβ−1,3−グルカナーゼ Z −14位ないし一1位(ATG=0)l:伸び、
モしてCaMV35Sプロモーターに連結されているク
ローンCHN17からの調節配列から構成される装 +34(ATG) Accl 1111 129
4対照として、1)SCl2と記載されるキチナーゼク
ローンCHN17からの調節配列のない相当する構築物
が使用される。
ATGで始まるβ−1,3−グルカナーゼ Z −14位ないし一1位(ATG=0)l:伸び、
モしてCaMV35Sプロモーターに連結されているク
ローンCHN17からの調節配列から構成される装 +34(ATG) Accl 1111 129
4対照として、1)SCl2と記載されるキチナーゼク
ローンCHN17からの調節配列のない相当する構築物
が使用される。
キチナーゼ構築物を含有しない、いわゆる空のベクター
(pcIB200)がその他の対照として使用される。
(pcIB200)がその他の対照として使用される。
■、形質転換およびトランスジェニック植物の作出
上の実施例8および9に記載された二元ベクターを以下
の方法に従ってアグロバクテリウム・チュメファシエン
スLB4404株内に形質転換する。アグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスLBA4404株はT−DNA
領域を欠いているが、完全なりir領領域依然として有
する欠失Tiプラスミドを含む[Hoekema et
at(1983)]。
の方法に従ってアグロバクテリウム・チュメファシエン
スLB4404株内に形質転換する。アグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスLBA4404株はT−DNA
領域を欠いているが、完全なりir領領域依然として有
する欠失Tiプラスミドを含む[Hoekema et
at(1983)]。
アグロバクテリウム・チュメファシエンスLB4404
株をMG/L培地〔■項参照) 5mI中の一晩培養液
中30℃の温度で培養する。MG/L培地250rnI
をこれらの51nIの一晩培養液中に添加し、そして全
体のバッチを光学密度0D=0.6 (600nm)が
得られるまで十分に混合する。次いで細胞を8000X
gでの遠心分離により集め、そしてMG/L培地5−中
に再懸濁する。この細胞懸濁液200μlをMG/L培
地中の二元プラスミドDNA0.2μgないし1μgと
保温し、モしてゆっ(り混合した後、バッチをすぐにド
ライアイス/エタノール洛中で急速冷凍する。5分後、
試験管を37℃の水浴中に置き、そこに5分間放置する
。MG/L培地2rdを次に添加する。この懸濁液を次
に30℃の水浴で2ないし3時間保温する。
株をMG/L培地〔■項参照) 5mI中の一晩培養液
中30℃の温度で培養する。MG/L培地250rnI
をこれらの51nIの一晩培養液中に添加し、そして全
体のバッチを光学密度0D=0.6 (600nm)が
得られるまで十分に混合する。次いで細胞を8000X
gでの遠心分離により集め、そしてMG/L培地5−中
に再懸濁する。この細胞懸濁液200μlをMG/L培
地中の二元プラスミドDNA0.2μgないし1μgと
保温し、モしてゆっ(り混合した後、バッチをすぐにド
ライアイス/エタノール洛中で急速冷凍する。5分後、
試験管を37℃の水浴中に置き、そこに5分間放置する
。MG/L培地2rdを次に添加する。この懸濁液を次
に30℃の水浴で2ないし3時間保温する。
細胞を次に遠心分離により集める。細胞を少量のMG/
L培地に再懸濁し、次に選択培地(ゲンタマイシン10
0μg/−を含むMG/Lプレート)上に置く。最初の
コロニーは30”Cで2ないし3日後に現れる。
L培地に再懸濁し、次に選択培地(ゲンタマイシン10
0μg/−を含むMG/Lプレート)上に置く。最初の
コロニーは30”Cで2ないし3日後に現れる。
別の実施態様において、上の実施例Bおよび9に記載さ
れた二元ベクターを、tra機能を備えたプラスミドを
有するE、coliヘルパー株を用いて三親交雑法[R
ogers SG et aE(1986)]によりア
グロバクテリウム・チュメファシェンスLBA4404
株内に導入する。使用されるE。
れた二元ベクターを、tra機能を備えたプラスミドを
有するE、coliヘルパー株を用いて三親交雑法[R
ogers SG et aE(1986)]によりア
グロバクテリウム・チュメファシェンスLBA4404
株内に導入する。使用されるE。
coLiヘルパー株は、例えば二元ベクターの導入に必
要なtra機能を有するプラスミドpRK2013をを
含むE、coLiB HB 1011であってよい。
要なtra機能を有するプラスミドpRK2013をを
含むE、coLiB HB 1011であってよい。
アグロバクテリウム・チュメファシェンスLBA440
4株はりファムビシン20■/!およびストレプトマイ
シン500■/lを含むLBB地中28℃で一晩培養さ
れる。E、coLiBHBIOIIおよび二元ベクター
を存するE、coLi株はカナマイシン25■/Eを含
むLB培培地中子7℃一晩培養される。
4株はりファムビシン20■/!およびストレプトマイ
シン500■/lを含むLBB地中28℃で一晩培養さ
れる。E、coLiBHBIOIIおよび二元ベクター
を存するE、coLi株はカナマイシン25■/Eを含
むLB培培地中子7℃一晩培養される。
これらの培養液各1−を8000Xgで遠心分離し、1
mjの滅菌水または10mMMgSO4で洗浄し、再び
遠心分離し、そして100μ!の水またはM g S
Os溶液中に再懸濁する。LBB体培地を含むプレート
を4区画に分ける。
mjの滅菌水または10mMMgSO4で洗浄し、再び
遠心分離し、そして100μ!の水またはM g S
Os溶液中に再懸濁する。LBB体培地を含むプレート
を4区画に分ける。
これらの4区画のうちの3区画において2つの培養液か
らなる3種の可能な組合せが混合されるように、3つの
細菌培養液の滴を前記区画に載せる。これらは対照とし
て作用する。しかしながら第4の区画では3つの培養液
全てが一緒に混合される。滴が乾燥した後、プレートを
28℃で一晩保温する。次に試料を各区画から採取し;
そして水またはM g S Oa溶液中に懸濁する。こ
れらの懸濁液の希釈物を調製し、そしてリファムビシン
20■/I!、ストレブトマイシン500■/iおよび
カナマイシン25■/lを含むLB培地にブレーティン
グし、そして約28℃で2ないし3日培養する。高希釈
の二親ハイブリッド〔同様の希釈の対照ハイブリッドで
は何も増殖しない〕で増殖するコロニーは個々のコロニ
ーのブレーティングを繰り返すことにより依然として存
在し得る親細菌が除去される。
らなる3種の可能な組合せが混合されるように、3つの
細菌培養液の滴を前記区画に載せる。これらは対照とし
て作用する。しかしながら第4の区画では3つの培養液
全てが一緒に混合される。滴が乾燥した後、プレートを
28℃で一晩保温する。次に試料を各区画から採取し;
そして水またはM g S Oa溶液中に懸濁する。こ
れらの懸濁液の希釈物を調製し、そしてリファムビシン
20■/I!、ストレブトマイシン500■/iおよび
カナマイシン25■/lを含むLB培地にブレーティン
グし、そして約28℃で2ないし3日培養する。高希釈
の二親ハイブリッド〔同様の希釈の対照ハイブリッドで
は何も増殖しない〕で増殖するコロニーは個々のコロニ
ーのブレーティングを繰り返すことにより依然として存
在し得る親細菌が除去される。
葉ディスク形質転換はHorsh et at (19
85)に記載された方法に従って実質的に行われる。
85)に記載された方法に従って実質的に行われる。
アグロバクテリウム・チュメファシェンスLBA440
4株(1)SCHI2;psGL7)をリファムビシン
20■/11ストレプトマイシン500■/lおよびカ
ナマイシン25■/lで富化され、pH5,6に調整さ
れたグルタミン酸塩培地中28℃で一晩培養する。約3
.3×10”細胞を含有するこの一晩培養液中で、ニコ
チアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ツバカムの
園芸品種ハバナ425の滅菌葉ディスク(直径5」ない
し10mm)が5分間培養される。
4株(1)SCHI2;psGL7)をリファムビシン
20■/11ストレプトマイシン500■/lおよびカ
ナマイシン25■/lで富化され、pH5,6に調整さ
れたグルタミン酸塩培地中28℃で一晩培養する。約3
.3×10”細胞を含有するこの一晩培養液中で、ニコ
チアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ツバカムの
園芸品種ハバナ425の滅菌葉ディスク(直径5」ない
し10mm)が5分間培養される。
ディスクを次に培養液から除去し、滅菌ペーパータオル
で軽くたたいて乾燥させ、その後栄養培地を含む直径1
00mのペトリ皿に移す。
で軽くたたいて乾燥させ、その後栄養培地を含む直径1
00mのペトリ皿に移す。
この栄養培地は、1%寒天(D I FCO)で固化さ
れ、そしてその他の添加剤としてpH指示剤(クロロフ
ェノールレッド;5■/Iりおよび植物生長剤カイネチ
ン(0,3■A0およびα−ナフチル酢酸(2■/Iり
を含有するLinsmeier and Skoog(
1965)による基本培地(301nI)からなる。こ
の寒天培地(培地A)はニコチアナ・ツバカムの園芸品
種ハバナ425 (Bichholz et at、1
983)の髄組織から誘導された3275N細胞の2週
令懸濁培養液!−ないし2−の層で覆われており、そし
て口紙(Nα1ホワットマンロ紙)で覆われている。上
記のように前処理した葉ディスクを次に口紙上に載せる
。
れ、そしてその他の添加剤としてpH指示剤(クロロフ
ェノールレッド;5■/Iりおよび植物生長剤カイネチ
ン(0,3■A0およびα−ナフチル酢酸(2■/Iり
を含有するLinsmeier and Skoog(
1965)による基本培地(301nI)からなる。こ
の寒天培地(培地A)はニコチアナ・ツバカムの園芸品
種ハバナ425 (Bichholz et at、1
983)の髄組織から誘導された3275N細胞の2週
令懸濁培養液!−ないし2−の層で覆われており、そし
て口紙(Nα1ホワットマンロ紙)で覆われている。上
記のように前処理した葉ディスクを次に口紙上に載せる
。
48時間後、苗条誘導のために、同一組成を有するがセ
フォタキシム350■/lおよびカナマイシン100■
/!を含有する選択培地(培地B)上に載せ、25℃お
よび散光(80ないし100μアインシユタイン)中で
外植片を培養する。共培養された対照組織はカナマイシ
ンを含まない同様の培地上に接種される。外植片は1週
間間隔で新鮮な培地Bに移される。
フォタキシム350■/lおよびカナマイシン100■
/!を含有する選択培地(培地B)上に載せ、25℃お
よび散光(80ないし100μアインシユタイン)中で
外植片を培養する。共培養された対照組織はカナマイシ
ンを含まない同様の培地上に接種される。外植片は1週
間間隔で新鮮な培地Bに移される。
4ないし8週の共培養後、外植片から発生する未熟苗条
を収穫し、そして50rdの容器中の培地C(0,6%
フィトアガーを含有する固体地)25mt’上に移す。
を収穫し、そして50rdの容器中の培地C(0,6%
フィトアガーを含有する固体地)25mt’上に移す。
全体の組織を24℃ないし28℃の温度、80ないし1
00μアインシユタインの光強度で培養する。1ないし
2週間後苗条は根を形成する。
00μアインシユタインの光強度で培養する。1ないし
2週間後苗条は根を形成する。
種々の形質転換方法から得られる小植物が異なる2つの
方法により形質転換に対して試験され得る。
方法により形質転換に対して試験され得る。
l)ベクター特異的カナマイシン耐性マーカーが形質転
換の成功の基準として作用する。予め形質転換された小
植物の菜の外植片(直径的5B)はカナマイシン50■
/lを含有するオーキシン/サイトカイニン培地(培地
A)上で継代培養される。選択マーカーを含まないオー
キシン/サイトカイニン培地(培地A)上で培養された
同様の植物の外植片が対照として使用される。菜の外植
片をMeins & Lutz(1979)の記載に従
って21日の期間培養する。カナマイシン培地および対
照培地の両方で生長する小植物がカナマイシン耐性であ
ると推定される。
換の成功の基準として作用する。予め形質転換された小
植物の菜の外植片(直径的5B)はカナマイシン50■
/lを含有するオーキシン/サイトカイニン培地(培地
A)上で継代培養される。選択マーカーを含まないオー
キシン/サイトカイニン培地(培地A)上で培養された
同様の植物の外植片が対照として使用される。菜の外植
片をMeins & Lutz(1979)の記載に従
って21日の期間培養する。カナマイシン培地および対
照培地の両方で生長する小植物がカナマイシン耐性であ
ると推定される。
2)形質転換に対する第2の試験はキチナーゼおよびβ
−1,3−グルカナーゼの過剰発現を検出する目的を有
する。精製された抗タバコキチナーゼまたはグルカナー
ゼIgG抗体[5hinshi et aL、 198
7]を用いる「ロケット」、免疫電気泳動[Laure
ll and McKay(1981)]によって葉内
のキチナーゼまたはグルカナーゼ含量を測定することに
より過剰発現が検出され得る。
−1,3−グルカナーゼの過剰発現を検出する目的を有
する。精製された抗タバコキチナーゼまたはグルカナー
ゼIgG抗体[5hinshi et aL、 198
7]を用いる「ロケット」、免疫電気泳動[Laure
ll and McKay(1981)]によって葉内
のキチナーゼまたはグルカナーゼ含量を測定することに
より過剰発現が検出され得る。
抽出緩衝液(0,mMエチレンジアミン四酢酸、1mM
ジチオトレイトール、1mMフェニルメチルスルホニル
フルオリドおよび200mM2−アミノ−2−(ヒドロ
キシメチル)−1,!3−プロパンジオール、pH8,
0)2ないし5容量中に最初に葉組織をホモジナイゼー
ションする。可溶性タンパク質画分が6℃での遠心分離
(10oooxgで15分)により得られる。
ジチオトレイトール、1mMフェニルメチルスルホニル
フルオリドおよび200mM2−アミノ−2−(ヒドロ
キシメチル)−1,!3−プロパンジオール、pH8,
0)2ないし5容量中に最初に葉組織をホモジナイゼー
ションする。可溶性タンパク質画分が6℃での遠心分離
(10oooxgで15分)により得られる。
キチナーゼおよびβ−1,3−グルカナーゼの含量は、
抗タバコキチナーゼまたはβ−1゜3−グルカナーゼI
gGを用いる「ロケット」免疫電気泳動によって決定さ
れる。キチナーゼまたはβ−1,3−グルカナーゼを含
有する試料は、抗タバコキチナーゼまたはβ−1,3一
グルカナーゼIgGを最終濃度10μg/mlで含有す
る1%(W/V)の低m1アガロースゲル(バイオラッ
ド)により最大200Vおよび15mAで12ないし1
6時間分離される。乾燥ゲルをクーマシーブルーで染色
し、そしてキチナーゼまたはβ−1,3−グルカナーゼ
の含量が決定される。
抗タバコキチナーゼまたはβ−1゜3−グルカナーゼI
gGを用いる「ロケット」免疫電気泳動によって決定さ
れる。キチナーゼまたはβ−1,3−グルカナーゼを含
有する試料は、抗タバコキチナーゼまたはβ−1,3一
グルカナーゼIgGを最終濃度10μg/mlで含有す
る1%(W/V)の低m1アガロースゲル(バイオラッ
ド)により最大200Vおよび15mAで12ないし1
6時間分離される。乾燥ゲルをクーマシーブルーで染色
し、そしてキチナーゼまたはβ−1,3−グルカナーゼ
の含量が決定される。
標準としてハバナ425タバコ組織から直接分離された
正確な酵素試料が使用される。
正確な酵素試料が使用される。
3)キチナーゼ活性は基質としてIH標識キチン〔比活
性4.93 x 10 @dpm/mol N−アセチ
ルグルコサミン〕を用いて放射線計測で決定される[B
oller et al (1983)]。
性4.93 x 10 @dpm/mol N−アセチ
ルグルコサミン〕を用いて放射線計測で決定される[B
oller et al (1983)]。
実施例12.2:細胞内液(ICF)の抽出植物組織か
ら細胞内液の抽出は、Parent andAssel
in(1984)に記載された方法に従って行われ得る
。
ら細胞内液の抽出は、Parent andAssel
in(1984)に記載された方法に従って行われ得る
。
この方法において再生されたトランスジェニック植物の
葉は最初に集められ、そして4ないし5cofの小片に
切断され、そしてゆっくりかきまぜながら大過剰の冷緩
衝液(約4℃)に各々30秒間真空下で浸漬する。該緩
衝液は以下の組成: M g C1* CaC1* 1 0、0 mM 1 0、0 mM 2−メルカプトエタノール 5.0mMを有する
ことが有利である。
葉は最初に集められ、そして4ないし5cofの小片に
切断され、そしてゆっくりかきまぜながら大過剰の冷緩
衝液(約4℃)に各々30秒間真空下で浸漬する。該緩
衝液は以下の組成: M g C1* CaC1* 1 0、0 mM 1 0、0 mM 2−メルカプトエタノール 5.0mMを有する
ことが有利である。
また、50mMクエン酸緩衝液(pH5,5)を使用す
ることも可能である。操作は室温で行われてもよい。
ることも可能である。操作は室温で行われてもよい。
真空を解除すると緩衝液は葉を貫通する。葉片を次に注
意深く乾燥し、そして20−のシリンジに移す。シリン
ジは遠心管内で懸濁され、そして低速(約10100O
xおよび低温(4℃)で10分間遠心分離される。
意深く乾燥し、そして20−のシリンジに移す。シリン
ジは遠心管内で懸濁され、そして低速(約10100O
xおよび低温(4℃)で10分間遠心分離される。
実施例IZ3:細胞内細胞内タンパ分質画分順IZ2に
従って処理された葉片を次に同様の緩衝液中でホモジナ
イゼーションする。粗い粒子を遠心分離により除去する
。
従って処理された葉片を次に同様の緩衝液中でホモジナ
イゼーションする。粗い粒子を遠心分離により除去する
。
実施例13ニドランスジ工ニツクホモ接合Sl植物の生
長 カナマイシン耐性組織を含み、そして高められたレベル
のキチナーゼまたはグルカナーゼを有する80世代の小
植物を土壌に移し、そして自家受粉の後、放置して温室
で種子を形成させる。種子を表面殺菌し、そして培地D
(カイネチンおよびα−ナフチル酢酸を含まず、カナマ
イシン400■/1を添加した)30mtlを含有する
ベトリ皿中で二次的な混入なしに発芽させろ。カナマイ
シン耐性実生が温室で生長して成熟しくS1世代)、そ
して同様に種子を形成する。
長 カナマイシン耐性組織を含み、そして高められたレベル
のキチナーゼまたはグルカナーゼを有する80世代の小
植物を土壌に移し、そして自家受粉の後、放置して温室
で種子を形成させる。種子を表面殺菌し、そして培地D
(カイネチンおよびα−ナフチル酢酸を含まず、カナマ
イシン400■/1を添加した)30mtlを含有する
ベトリ皿中で二次的な混入なしに発芽させろ。カナマイ
シン耐性実生が温室で生長して成熟しくS1世代)、そ
して同様に種子を形成する。
81世代内の種々の植物の種子が上記の方法でカナマイ
シン耐性に対して試験される。S1植物の100個の被
試験種子の全てがカナマイシン耐性の特徴を有していれ
ば、そのとき植物は抗生物質耐性マーカーに関してホモ
接合であると考えられる。形質転換されたニコチアナ・
シルベストリス植物(SSC2,3)からのホモ接合性
Km’/Km’種子を次に生物学的試験のために使用す
る。
シン耐性に対して試験される。S1植物の100個の被
試験種子の全てがカナマイシン耐性の特徴を有していれ
ば、そのとき植物は抗生物質耐性マーカーに関してホモ
接合であると考えられる。形質転換されたニコチアナ・
シルベストリス植物(SSC2,3)からのホモ接合性
Km’/Km’種子を次に生物学的試験のために使用す
る。
使用される対照は、(a)非形質転換の非処理葉ディス
クから再生される植物および(b)前もってベクターp
cIB200 (SCIB2)で形質転換された葉ディ
スクから出発して再生される植物である。
クから再生される植物および(b)前もってベクターp
cIB200 (SCIB2)で形質転換された葉ディ
スクから出発して再生される植物である。
形質転換された植物および対照植物の81世代の種子を
発芽させる。菓組織をカナマイシン耐性、キチナーゼま
たはグルカナーゼ含量(rロケット」免疫電気泳動)お
よびキチナーゼまたはグルカナーゼ活性に対して試験す
る。
発芽させる。菓組織をカナマイシン耐性、キチナーゼま
たはグルカナーゼ含量(rロケット」免疫電気泳動)お
よびキチナーゼまたはグルカナーゼ活性に対して試験す
る。
キチナーゼ活性は、Boiler et al (19
83)の記載に従ってトリチウム化されたキチナーゼを
用いて放射線計測検定でもって決定される。グルカナー
ゼ活性は、基質としての還元ラミナリンとで形成される
非還元糖の生成率に基づいて決定される[Pe1ix
G and Meins FJr(1985)]。
83)の記載に従ってトリチウム化されたキチナーゼを
用いて放射線計測検定でもって決定される。グルカナー
ゼ活性は、基質としての還元ラミナリンとで形成される
非還元糖の生成率に基づいて決定される[Pe1ix
G and Meins FJr(1985)]。
■、結果
レベル)
第1表および第5図に示された結果は以下のことを示す
。
。
(1) S I S S CZ 3植物からの葉組
織は、ベクターで形質転換された対照(SCIB2)の
キチナーゼ含量に比し400倍まで高いキチナーゼ含量
を有する。
織は、ベクターで形質転換された対照(SCIB2)の
キチナーゼ含量に比し400倍まで高いキチナーゼ含量
を有する。
(2)キチナーゼの過剰発現とカナマイシン耐性マーカ
ー(Km’ )の発生との間に絶対的な相関関係がある
。
ー(Km’ )の発生との間に絶対的な相関関係がある
。
(3)カナマイシン耐性およびキチナーゼの過剰発現の
特徴は無性のメンデル形質に予想されるような様式で分
離する。
特徴は無性のメンデル形質に予想されるような様式で分
離する。
(4)形質転換された植物におけるキチナーゼ活性およ
びキチナーゼ抗原の含量は明らかに互いに相関する。こ
のことは、挿入されたキチナーゼ遺伝子が転写され、そ
して酵素的に活性なタンパク質に翻訳されることを明ら
かに示す。
びキチナーゼ抗原の含量は明らかに互いに相関する。こ
のことは、挿入されたキチナーゼ遺伝子が転写され、そ
して酵素的に活性なタンパク質に翻訳されることを明ら
かに示す。
キチナーゼの塩基性イソ酵素がストレスホルモンである
エチレンで処理された葉内にかなりの範囲まで誘導され
ることは知られている。第2表はホモ接合性5SC21
植物および対照植物におけるエチレン誘導を行ったもの
、および行わなかったもののキチナーゼタンパク質分布
の比較を示す。結果は、試験された全ての組織および器
官におけるキチナーゼ含量が対照と比較して劇的に増加
していたことを示す。キチナーゼ遺伝子は構造性のプロ
モーターの制御下にあるけれども、それにもかかわらず
いくつかの場合において高められたキチナーゼレベルが
エチレン誘導の後に測定され得る。
エチレンで処理された葉内にかなりの範囲まで誘導され
ることは知られている。第2表はホモ接合性5SC21
植物および対照植物におけるエチレン誘導を行ったもの
、および行わなかったもののキチナーゼタンパク質分布
の比較を示す。結果は、試験された全ての組織および器
官におけるキチナーゼ含量が対照と比較して劇的に増加
していたことを示す。キチナーゼ遺伝子は構造性のプロ
モーターの制御下にあるけれども、それにもかかわらず
いくつかの場合において高められたキチナーゼレベルが
エチレン誘導の後に測定され得る。
著しく高められたキチナーゼレベルにもかかわらず、形
質転換されたトランスジェニック植物は通常の生長およ
び生長態様を示す。
質転換されたトランスジェニック植物は通常の生長およ
び生長態様を示す。
(5)対照植物および形質転換された植物の葉抽出物か
らのキチナーゼは5DS−PAGEにより分画され、ニ
トロセルロース紙に移され、そして−次抗体として抗タ
バコキチナーゼIgGを用いて染色される。参考として
精製されたタバコキチナーゼは、キチナーゼA(約34
kD)およびキチナ゛−ゼB(約32kD)に相当する
[5hinshi et aj(1987)] 2本の
バンドを与える。
らのキチナーゼは5DS−PAGEにより分画され、ニ
トロセルロース紙に移され、そして−次抗体として抗タ
バコキチナーゼIgGを用いて染色される。参考として
精製されたタバコキチナーゼは、キチナーゼA(約34
kD)およびキチナ゛−ゼB(約32kD)に相当する
[5hinshi et aj(1987)] 2本の
バンドを与える。
各列に等量のキチナーゼ抗原が載置されるゲルのプロッ
トは非形質転換ニコチアナ・シルベストリス植物の抽出
物では約82kDの単一バンド、そして5S(43形質
転換体の抽出物では約34kDの単一バンドを与える。
トは非形質転換ニコチアナ・シルベストリス植物の抽出
物では約82kDの単一バンド、そして5S(43形質
転換体の抽出物では約34kDの単一バンドを与える。
SSC形質転換体の場合、著しく過剰載置したゲルから
生じるプロットは、さらにニコチアナ・シルベストリス
キチナーゼに相当する約32kDに弱いバンドを示す。
生じるプロットは、さらにニコチアナ・シルベストリス
キチナーゼに相当する約32kDに弱いバンドを示す。
混合試験は、5S(43植物の抽出物中のキチナーゼが
形質転換に使用される遺伝子48の発現産物であるタバ
コキチナーゼとほぼ同じ分子量を存する。
形質転換に使用される遺伝子48の発現産物であるタバ
コキチナーゼとほぼ同じ分子量を存する。
それ故に、この結果は、本発明に係るキメラであるタバ
コキチナーゼ遺伝子がニコチアナ・シルベストリス植物
に発現され、そして遺伝子産物が成熟キチナーゼ遺伝子
の大きさを有するポリペプチドに正確にプロセシングさ
れることを明示する。
コキチナーゼ遺伝子がニコチアナ・シルベストリス植物
に発現され、そして遺伝子産物が成熟キチナーゼ遺伝子
の大きさを有するポリペプチドに正確にプロセシングさ
れることを明示する。
RNA含最の測定(RNAレベル)
RNA含量はノーザンプロット分析により測定される。
低いキチナーゼレベル(15’3.0μg/gFW)を
有する8種のホモ接合性対照植物および高いキチナーゼ
レベル(827マ66μg/gFW)を有する3種のホ
モ接合性キチナーゼ形質転換体の下方の葉から全RNA
が単離され、そして分析される。タバコからのキチナー
ゼ配列およびニコチアナ・シルベストリスからのキチナ
ーゼ配列の両方とハイブリッド形成するキチナーゼcD
NAクローンp CHN47のPstl挿入物がプロー
ブとして使用される。
有する8種のホモ接合性対照植物および高いキチナーゼ
レベル(827マ66μg/gFW)を有する3種のホ
モ接合性キチナーゼ形質転換体の下方の葉から全RNA
が単離され、そして分析される。タバコからのキチナー
ゼ配列およびニコチアナ・シルベストリスからのキチナ
ーゼ配列の両方とハイブリッド形成するキチナーゼcD
NAクローンp CHN47のPstl挿入物がプロー
ブとして使用される。
対照植物からの全RNAは約1.2ないし1.3kbの
バンドを与える。一方、5SC2,3植物からのRNA
の相当量は2本のハイブリダイゼーションバンドを与え
、それらは対照のものに比べ少なくとも10倍高い強度
である。それらの大きさに関しては、2本のバンドが、
CaMV35S転写開始部位、タバコキチナーゼをコー
ドするDNA配列およびCaMVターミネータ−からな
るキメラキチナーゼ遺伝子の転写に予測され得る1、1
98kbおよび1.41 kbに相当する。2本のバン
ドはほぼ同等の強度であり、これはタバコ遺伝子が使用
されるターミネータ−に関係なくほぼ同じ効果で転写さ
れるという結論を導く。
バンドを与える。一方、5SC2,3植物からのRNA
の相当量は2本のハイブリダイゼーションバンドを与え
、それらは対照のものに比べ少なくとも10倍高い強度
である。それらの大きさに関しては、2本のバンドが、
CaMV35S転写開始部位、タバコキチナーゼをコー
ドするDNA配列およびCaMVターミネータ−からな
るキメラキチナーゼ遺伝子の転写に予測され得る1、1
98kbおよび1.41 kbに相当する。2本のバン
ドはほぼ同等の強度であり、これはタバコ遺伝子が使用
されるターミネータ−に関係なくほぼ同じ効果で転写さ
れるという結論を導く。
正しい区画における発現産物の局在
一般に塩基性キチナーゼは細胞内区画に局在する。トラ
ンスジェニックニコチアナ・シルベストリス植物におけ
る遺伝子48によりコード化されたキチナーゼの位置を
決めるために、無傷の組織のキチナーゼ含量が高い塩濃
度を有する緩衝液を用いて葉の真空浸漬により得られる
細胞内洗浄液(IWF)のものと比較されるされる。こ
れらの条件下で、間質の液体に見出されるタンパク質と
細胞壁にゆるく結合したタンパク質とを主として含有す
るIWFが得られることが確認される。対照として中央
の液胞のマーカーである[Boller and Ke
nde(1979)] a −マンノシダーゼおよび中
央の液胞にも細胞内区画にも見出されるペルオキシダー
ゼが使用される。
ンスジェニックニコチアナ・シルベストリス植物におけ
る遺伝子48によりコード化されたキチナーゼの位置を
決めるために、無傷の組織のキチナーゼ含量が高い塩濃
度を有する緩衝液を用いて葉の真空浸漬により得られる
細胞内洗浄液(IWF)のものと比較されるされる。こ
れらの条件下で、間質の液体に見出されるタンパク質と
細胞壁にゆるく結合したタンパク質とを主として含有す
るIWFが得られることが確認される。対照として中央
の液胞のマーカーである[Boller and Ke
nde(1979)] a −マンノシダーゼおよび中
央の液胞にも細胞内区画にも見出されるペルオキシダー
ゼが使用される。
第5表は非形質転換および5S(43の葉からの葉組織
のIWFii分における上記酵素の%を示す。1%未満
のα−マンノシダーゼマーカー酵素がIWF画分に見出
され、このことは、上記のIWFli製方法が用いられ
たとき、液胞に局在する酵素が容易に感知できる量で抽
出されないことを示す。一方、約30%のペルオキシダ
ーゼ活性はIWF画分に見出される。5SC2,3植物
の葉中のキチナーゼ抗原の濃度は対照植物におけるもの
の20倍高い。しかしながら、両方の場合、IWFにお
けるキチナーゼ濃度は2%未満である。
のIWFii分における上記酵素の%を示す。1%未満
のα−マンノシダーゼマーカー酵素がIWF画分に見出
され、このことは、上記のIWFli製方法が用いられ
たとき、液胞に局在する酵素が容易に感知できる量で抽
出されないことを示す。一方、約30%のペルオキシダ
ーゼ活性はIWF画分に見出される。5SC2,3植物
の葉中のキチナーゼ抗原の濃度は対照植物におけるもの
の20倍高い。しかしながら、両方の場合、IWFにお
けるキチナーゼ濃度は2%未満である。
これらの結果は、本発明に係るキメラ構築物により作出
されるようなニコチアナ・シルベストリスの葉の細胞区
画において非常に高いキチナーゼレベルでさえもキチナ
ーゼが正しく局在していることを示す。
されるようなニコチアナ・シルベストリスの葉の細胞区
画において非常に高いキチナーゼレベルでさえもキチナ
ーゼが正しく局在していることを示す。
(B)β−1,3−グルカナーゼ形質転換独立に処理さ
れた2つの形質転換(S S G 7゜1およびS S
G 7.2 )の結果は第3表に示されている。形質
転換された植物はそれらの葉組織に対照に比べ100倍
まで高いβ−1,3−グルカナーゼ濃度を有する。対照
植物は対照プラスミドpSGL5(9,,2項参照)を
用いて形質転換された。このpSGL5はキチナーゼ遺
伝子の51非翻訳領域からの本発明に係る配列がグルカ
ナーゼ構造遺伝子に連結されていない遺伝子構築物を含
む。
れた2つの形質転換(S S G 7゜1およびS S
G 7.2 )の結果は第3表に示されている。形質
転換された植物はそれらの葉組織に対照に比べ100倍
まで高いβ−1,3−グルカナーゼ濃度を有する。対照
植物は対照プラスミドpSGL5(9,,2項参照)を
用いて形質転換された。このpSGL5はキチナーゼ遺
伝子の51非翻訳領域からの本発明に係る配列がグルカ
ナーゼ構造遺伝子に連結されていない遺伝子構築物を含
む。
(C)表
11.*: 1)SCHI Oで形質転換されたニコチ
アナ・シルベストリス植物(Km’/Km’; Km“
/Km’)と対照(Km’/Kmつのキチナーゼ活性(
nKat/g)の比較 被試験 β−1,3−グルカナーゼ キチ
ナーゼSO植物 〔μg/g抗原〕 Km’/Km’ 18.7+0.2 (3)Km’/
にm’ 15.8+2.17(8)Km’/Km’
19.9+2.33(3)45、7+1.64 559、0+78.4 750、0+22.5 キチナーゼ [nKat/g] 22.4+2.58 149、0+17.3 312、0+46.0 夏至産:エチレン処理した場合(20ppmで4日〕お
よびエチレン処理をしなかった場合の、pSCHIOで
形質転換されたニコチアナ・シルベストリス植物と対照
の種々の組織におけるキチナーゼ濃度〔μg/g新鮮重
量(FW))の比較形質転換体 組織 ベクター (SrB2) 上方の葉 下方の葉 無傷 表皮 除去した 下側表皮 茎 根 キチナーゼ (SSe2.3) 上方の葉 下方の葉 無傷 表皮 除去した 下側表皮 茎 根 キチナーゼ[μg/gFW] 一エチレン +エチレン 10.4 10.0 90.8 9.8 8.4 58.8 452、0 520、0 756、0 652、0 161、0 1200、0 53.2 42.8 104、0 38.8 14.0 148、0 704、0 760、0 828、0 1116.0 1200、0 1200、0 13!E:形質転換されたニコチアナ・シルベストリス
S1植物と対照(SYL3)の葉組織におけるβ−1,
3−グルカナーゼ濃度〔μg/g新鮮重量(FW))の
比較 植物 上方の葉 下方の葉グルカt
−ゼ キチナーゼ 5SG7.1−I SSG7.1−4 【μg/gFW] 128 11.4 93.9 21.9 SSG7.2−23 SSG7.2−24 93.9 15.0 100.8 13.5 グルht−ゼ キチナーゼ [μg/gPW] 74.1 54.6 90.3 51.0 5.4 46.5 0.0 41.7 YL3 1.2 6.3 3.0 15.6 L!j!: S 1世代のニコチアナ・シルペストリス
Km”植物と空のベクター(pcIB200)を用いて
形質転換された対照におけるβ−1,3−グルカナーゼ
濃度の比較 植 物 上方の葉中のキチナーゼ濃度【μg/
gFW] 5CIB (対照)1.5±1.5”(4)’5SG7
.1 77.0±6.4 (20)SS
G7.2 63.4±1.0 (20)1
5青:対照植物および形質転換されたニコチアナ・シル
ベストリス植物の葉内の細胞外区画と細胞内区画との間
のキチナーゼ分布 植物 twp@中の% ベルオキシダーゼ α−マンノシダーゼキチナー
ゼ 5CZ3 30、5+6.2 0、89+0.16 1.78+0.65 b=4回の独立した試験の平均値士SEM■、培地およ
び緩衝液 培地A NH4Not K N O5 CaC1t ・2J O M g S Oa ・7H8O KH,PO。
アナ・シルベストリス植物(Km’/Km’; Km“
/Km’)と対照(Km’/Kmつのキチナーゼ活性(
nKat/g)の比較 被試験 β−1,3−グルカナーゼ キチ
ナーゼSO植物 〔μg/g抗原〕 Km’/Km’ 18.7+0.2 (3)Km’/
にm’ 15.8+2.17(8)Km’/Km’
19.9+2.33(3)45、7+1.64 559、0+78.4 750、0+22.5 キチナーゼ [nKat/g] 22.4+2.58 149、0+17.3 312、0+46.0 夏至産:エチレン処理した場合(20ppmで4日〕お
よびエチレン処理をしなかった場合の、pSCHIOで
形質転換されたニコチアナ・シルベストリス植物と対照
の種々の組織におけるキチナーゼ濃度〔μg/g新鮮重
量(FW))の比較形質転換体 組織 ベクター (SrB2) 上方の葉 下方の葉 無傷 表皮 除去した 下側表皮 茎 根 キチナーゼ (SSe2.3) 上方の葉 下方の葉 無傷 表皮 除去した 下側表皮 茎 根 キチナーゼ[μg/gFW] 一エチレン +エチレン 10.4 10.0 90.8 9.8 8.4 58.8 452、0 520、0 756、0 652、0 161、0 1200、0 53.2 42.8 104、0 38.8 14.0 148、0 704、0 760、0 828、0 1116.0 1200、0 1200、0 13!E:形質転換されたニコチアナ・シルベストリス
S1植物と対照(SYL3)の葉組織におけるβ−1,
3−グルカナーゼ濃度〔μg/g新鮮重量(FW))の
比較 植物 上方の葉 下方の葉グルカt
−ゼ キチナーゼ 5SG7.1−I SSG7.1−4 【μg/gFW] 128 11.4 93.9 21.9 SSG7.2−23 SSG7.2−24 93.9 15.0 100.8 13.5 グルht−ゼ キチナーゼ [μg/gPW] 74.1 54.6 90.3 51.0 5.4 46.5 0.0 41.7 YL3 1.2 6.3 3.0 15.6 L!j!: S 1世代のニコチアナ・シルペストリス
Km”植物と空のベクター(pcIB200)を用いて
形質転換された対照におけるβ−1,3−グルカナーゼ
濃度の比較 植 物 上方の葉中のキチナーゼ濃度【μg/
gFW] 5CIB (対照)1.5±1.5”(4)’5SG7
.1 77.0±6.4 (20)SS
G7.2 63.4±1.0 (20)1
5青:対照植物および形質転換されたニコチアナ・シル
ベストリス植物の葉内の細胞外区画と細胞内区画との間
のキチナーゼ分布 植物 twp@中の% ベルオキシダーゼ α−マンノシダーゼキチナー
ゼ 5CZ3 30、5+6.2 0、89+0.16 1.78+0.65 b=4回の独立した試験の平均値士SEM■、培地およ
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N a t E D T A
F e S Oa ・7 H20
Hz B O5
MTlSO4・4H* 0
ZnSO4・7Hx O
I
N a z MO04・2 Ho 0
CuSOn −5Hz 0
CoCL ” 68! 0
ショ糖
チアミンHCI
ミオイノシトール
カイネチン
α−ナフチル酢酸
クロロフェノールレッド
寒天
1650■/1
1900■/1
440■/1
370■/It
170■/1
37.3■/1
27.8■/1
6.2■/!
2Z3■/!
&6■/1
0.83■/1
0.25■/1
0、025■/I!
0、025■/1
30、Og/I!
0、400■/1
100.0■/1
O03■/1
2、O■/1
5、θ■/1
10.0g/f
培地B
培地Aと同じ組成であるが、α−ナフチル酢酸を含まず
、以下の追加の成分を含む。
、以下の追加の成分を含む。
セファタキシム 500■/1カナマイ
シン 75■/!培地C 培地Bと同じ組成であるが、 ない。
シン 75■/!培地C 培地Bと同じ組成であるが、 ない。
カイネチンを含ま
アグロバクテリウム用のMG/L培地
L−ブロス
マンニトール−グルタメート培地
(Holsters et at 1978)50%
50%
W5塩溶液
aCI
CaC1* ・2Hz O
CI
ブドウ糖
pH5,6−6,0
54mM
25mM
5mM
5mM
すすぎ溶液■
ショ糖
ES
K N Os
NH,N0I
NaH,PO4”Hz 0
CaC1t @ 2Ht O
M g S Oa ・7H80
(NH,)! 5Oa
154、0 g/f
O,59g//
250、0■/I!
25.0■/1
15.0■/1
90.0■/I!
25.0■/!
1&4■/I!
TBNP緩衝液
トリスHCI (pH8,0)
DTA
NP−40(シグマ・ケミカル)
00mM
0mM
1%(V/V)
THE緩衝液
トリス−ホウ酸塩
DTA
9mM
5mM
TE緩衝液
トリスHCI (pH8,0)
DTA
0mM
5mM
SC
aC1
クエン酸ナトリウム
(pH7,0)
1.54mM
0.154mM
狸キ刈E紅′
Afl G ee al、 EMBΩムム、」ユ27
7−284 +19851 。
7−284 +19851 。
11Lrk y ee al、 Bi
、 Acta 67・326−328 +19
631゜Roller at al、 Planta、
ユQ 22−31 (19831。
、 Acta 67・326−328 +19
631゜Roller at al、 Planta、
ユQ 22−31 (19831。
Roller T md Kende H,P
a h s ol、 3・ 1123
−1132 (19791Cashmors A、
釦□迄江Ena” f Pi s an 酌ワ
工蝕以mハカ工舵紐工斂シP1enum、 NewYo
rk1983. pp、29−38゜Davar*ux
at al、 Nucl、Ac ds R
es 12: 387−395 (1984
1゜ff1ichholz Ret air 因1m徂
、ユ58−410−415 +19831゜Tacc
iOtti and Pilet+ P
Lett : 1−7 +19791゜
T@ux G and Meins FJr、 因1m
諺、ユ64− 423−428 +19851゜Fr
ank G et al、 化1L、ηユ285−29
4 +19801 。
a h s ol、 3・ 1123
−1132 (19791Cashmors A、
釦□迄江Ena” f Pi s an 酌ワ
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at al、 Nucl、Ac ds R
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1゜ff1ichholz Ret air 因1m徂
、ユ58−410−415 +19831゜Tacc
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Lett : 1−7 +19791゜
T@ux G and Meins FJr、 因1m
諺、ユ64− 423−428 +19851゜Fr
ank G et al、 化1L、ηユ285−29
4 +19801 。
Gatdn@x RCat al、 邑二り1層違錘触
五ユ」狂2871−2.88[1(191111。
五ユ」狂2871−2.88[1(191111。
Garfink*l and Ne5ter、
ac 、 144: 732−743 11980
1゜GloverDM、 DNA vol
ume : a ora 1cal at+oro
ach; DMGlovared、、 IRL Pre
ss、 0xford and Washing10n
DC,p、 33 (1981Ormsl*yNH
et al、 ル圓扛シ」z江177−179 +19
871−1aym*s BT at al、
e d tio
n a Pra calトw匹4±、 X
RLPI:La5s、 0xford、 Englan
d +19851 。
ac 、 144: 732−743 11980
1゜GloverDM、 DNA vol
ume : a ora 1cal at+oro
ach; DMGlovared、、 IRL Pre
ss、 0xford and Washing10n
DC,p、 33 (1981Ormsl*yNH
et al、 ル圓扛シ」z江177−179 +19
871−1aym*s BT at al、
e d tio
n a Pra calトw匹4±、 X
RLPI:La5s、 0xford、 Englan
d +19851 。
m11d@r at al、 N山m鼾、ユニ狂160
−163 +19871 。
−163 +19871 。
1o@kam at al、 脳1思罎、ユ乞)H17
9−1110+19831゜io−テme al、 i
n: ユ位v匹シ扛B Oof Plan Tum
ors”。
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n: ユ位v匹シ扛B Oof Plan Tum
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入eademic Press、New York、p
p、549−560 +19821 。
p、549−560 +19821 。
Horn at al、 lan Ce
Re ort 7: 469−472 +
19881゜1orseh at al、 L(1肋」
!」z■1229 (19851゜mowardat
al、 Planta 170: 535 (198
71。
Re ort 7: 469−472 +
19881゜1orseh at al、 L(1肋」
!」z■1229 (19851゜mowardat
al、 Planta 170: 535 (198
71。
Lin5m@ier and Skoog、 L
hy且1911P1」工l−、ニーLジL 101−1
2] (19651。
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Logamann J 6e aL Anal 、
BloChem−163・16−20 +198万Ma
niatis et al、Mo1ecular C1
on ALabOratOr Manual、C
oldSpring Harbor Labora10
ry、 1982゜499−560.Academi
c Press、New York、LOndOn、+
19801゜Mems& Lutz、 Differ
n 1ation 1 : 1−6 (197
91。
BloChem−163・16−20 +198万Ma
niatis et al、Mo1ecular C1
on ALabOratOr Manual、C
oldSpring Harbor Labora10
ry、 1982゜499−560.Academi
c Press、New York、LOndOn、+
19801゜Mems& Lutz、 Differ
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Mohnen、 二迫四シ迄オm!QfGl
1ases in N1cotianaしabac
umon the 煕y旦逸肛RNA 1evelこ、
Dissertation IJniversity
ofllllnois at tlrbana−Ch
ampaign、 1985゜Mohnen et
al、 EMBOJ、、 4: 1631−163
5 +19851 。
1ases in N1cotianaしabac
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ofllllnois at tlrbana−Ch
ampaign、 1985゜Mohnen et
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More工1i et al、 述ル旦匹工ユ襲工20
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Murashiga and Skoog、 Ph 5
io1. Plant、 15: 473−497
(19621゜Nagrutiu 1 et al、
PIMol、 Biol、 8: 363−373
+198力。
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(19621゜Nagrutiu 1 et al、
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Nauhaus at al、 l
、 74: 30−36 +198刀。
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Par@nt JG and As5elin A、
Ca 、 Bo 、 62: 564−569
+191141゜P*tit at al、
l 、 Genet、 202: 3BB
(19861゜Pi*trzak et al、 小
コL」YL銚シ狙、1νl: 5857−5868
+19861゜Potrykus X and 5hi
lli10 RD、 Me in Enz
I Vo 118PlantMolecul
arBiology、eds、A and )lWei
ssbach、ACademiCPreSSIOrla
ndo、1986゜ Rhodas et al、 Biotechnolo
gy、 6: 56−60 +19881゜Ro
g*rs SG et al、 in E
nz l 1111: 630−63311
9861Rothst*in SJ at al、 G
g3g、 53: 153−161 (19[171。
Ca 、 Bo 、 62: 564−569
+191141゜P*tit at al、
l 、 Genet、 202: 3BB
(19861゜Pi*trzak et al、 小
コL」YL銚シ狙、1νl: 5857−5868
+19861゜Potrykus X and 5hi
lli10 RD、 Me in Enz
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arBiology、eds、A and )lWei
ssbach、ACademiCPreSSIOrla
ndo、1986゜ Rhodas et al、 Biotechnolo
gy、 6: 56−60 +19881゜Ro
g*rs SG et al、 in E
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9861Rothst*in SJ at al、 G
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Sambrook et al、 Mo1ecular
Ooning、 A Labora10ry Man
ual、 5econd E山tion (1989)
。
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Sang@r et al、 ム交う」旭C2Acad
、 8沫、−μ5L74−5463−5467+197
7) 。
、 8沫、−μ5L74−5463−5467+197
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Schmidhausar and He1inski
、 Bacheriol、 164: 44
6−455(1985)。
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5choch*r RJ6e al、Bio Tech
noloa 4: 1093−1096(1986
)。
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5hilli10 RD et al、 Biote
chnology、 1: 581−587 (
1989) 。
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5hinshieeau、Proc、Na 、
d、Sci、 USA B4・ 89−93(19
871゜5hinshi et al、Pla広旦、ユ
64: 423−428 +19851゜5hLn
sbL et al、Proc Natl Aca
d 、 tlsA 85: 5541−5
545(19881゜ 5hilli10eeau、 i nolo
: 1099−1103+1985);Si
*g@lBZlndGals10nAw、PlantP
hsio142:221−226+19671Sout
hern EM、 M 1.Bi 1 8:
503−517 (1975)−8pana eむ
al、 EMBO≦T、 4− 2736 +1
9851゜Vierra and Messing、
ΩJK1」J土259−268 +19821 。
d、Sci、 USA B4・ 89−93(19
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sbL et al、Proc Natl Aca
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ΩJK1」J土259−268 +19821 。
賛ang Y−Cet al、 Pi Mol
Biol、 11・433−439 +19881
゜YamadaYetal、PlantCellRe、
5二85−88f19861゜Yanisch−P@r
ron et al、 QmシーΣ■103−119
+19851゜
Biol、 11・433−439 +19881
゜YamadaYetal、PlantCellRe、
5二85−88f19861゜Yanisch−P@r
ron et al、 QmシーΣ■103−119
+19851゜
第1図はプラスミドpscH12の特徴的領域およびそ
れらの開始点を示すpscH12の遺伝子地図を示す。 (図中、P35S→CaMV35Sプロモーター;T3
5S−”CaMV終結配列、TNO8→ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子の終結配列、PNO3→
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のプロモ
ーター;LB、RB→アグロバクテリウム・チュメファ
シエンスのTiプラスミドからの左側または右側境界配
列) キチナーゼをコードするキメラ遺伝子構築物の5v領域
の関連部分はヌクレオチド配列により詳細に示されてい
る。 第2図はpcIB200の制限地図を示す。 第3図はプラスミドpscH12構築の概略図である。 詳細は実施例8に示されている。 第4図はプラスミドI)SGL7構築の概略図である。 詳細は実施例9に示されている。 第5図はニコチアナ・シルベストリス51(Nicot
iana 5yLvestris Sl)植物(Km”
/Km”)の葉中のキチナーゼ濃度を対照(Km”/K
m”)と比較して一般的方法で示すグラフである。 には下から上へ番号を付す。 葉 特許出願人 チバーガイギー アクチェンゲゼルシャフ
ト代 理 人 弁理士 萼 優美(ほか2名)第 図 5′ま福俳分 第 図 第 図 Ec@RV &4tp−PstI JZ tηji第 図 塵、lミラ
れらの開始点を示すpscH12の遺伝子地図を示す。 (図中、P35S→CaMV35Sプロモーター;T3
5S−”CaMV終結配列、TNO8→ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子の終結配列、PNO3→
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のプロモ
ーター;LB、RB→アグロバクテリウム・チュメファ
シエンスのTiプラスミドからの左側または右側境界配
列) キチナーゼをコードするキメラ遺伝子構築物の5v領域
の関連部分はヌクレオチド配列により詳細に示されてい
る。 第2図はpcIB200の制限地図を示す。 第3図はプラスミドpscH12構築の概略図である。 詳細は実施例8に示されている。 第4図はプラスミドI)SGL7構築の概略図である。 詳細は実施例9に示されている。 第5図はニコチアナ・シルベストリス51(Nicot
iana 5yLvestris Sl)植物(Km”
/Km”)の葉中のキチナーゼ濃度を対照(Km”/K
m”)と比較して一般的方法で示すグラフである。 には下から上へ番号を付す。 葉 特許出願人 チバーガイギー アクチェンゲゼルシャフ
ト代 理 人 弁理士 萼 優美(ほか2名)第 図 5′ま福俳分 第 図 第 図 Ec@RV &4tp−PstI JZ tηji第 図 塵、lミラ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)植物キチナーゼ遺伝子の5′非翻訳領域から得ら
れる調節DNA配列であって、該配列が発現性DNAお
よび植物細胞内で活性な発現シグナルに操作可能に連結
されている場合に、植物宿主への形質転換で操作可能に
結合された発現性DNAの発現レベルにおける著しい増
加を導く、前記調節DNA配列。 (2)塩基性タバコキチナーゼ遺伝子の5′非翻訳領域
から得られる請求項1記載の調節DNA配列。 (3)配列のこの部分が少なくとも55%の範囲までA
/Tを含むA/Tに富んだ領域である請求項2記載の調
節DNA配列。 (4)配列のこの部分が少なくとも70%の範囲までA
/Tを含むA/Tに富んだ領域である請求項2記載の調
節DNA配列。 (5)ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ425植
物の塩基性キチナーゼ遺伝子の5′非翻訳領域から得ら
れ、そして以下のDNA配列:【遺伝子配列があります
】 を実質的に有するか、または1個またはそれ以上の塩基
の突然変異に基づいているがしかし依然として上記配列
に実質的に相同であり、そして出発配列の特定の調節発
現増加特性を依然として有する上記DNA配列の全ての
誘導体である請求項2記載の調節DNA配列。 (6)DNA配列が実質的に純粋な形態にある請求項1
ないし5のいずれか1項に記載の調節DNA配列。 (7)請求項1ないし6のいずれか1項に記載の調節D
NA配列の1つから、または該調節DNA配列の誘導体
から得られ、そして出発配列の特定の調節発現増加特性
を依然として有する断片または部分配列。 (8)以下のDNA配列: 【遺伝子配列があります】 を有するか、または1個またはそれ以上の塩基の突然変
異に基づいているがしかし依然として上記配列に実質的
に相同であり、そして出発配列の特定の調節発現増加特
性を依然として有する上記DNA配列の全ての誘導体で
ある請求項7記載の部分配列。 (9)5′非翻訳領域に以下の特定の構造的特徴: (a)1967ないし1971位のCTACT配列内に
転写開始部位 (b)該転写開始部位の11bp下流1980位に第1
の可能な開始コドン (c)転写開始部位の上流で、5′フランキング領域の
−28ないし−23位にTAAATA配列(TATAボ
ックス) (d)−114位にCCAATT配列 (e)−140位に6bpからなる不完全逆方向反復配
列(GCCGAATTCGAGC) (f)−152位と−228位に10bpからなる完全
反復配列(ATGTCCAAAC) (g)−166位と−569位に20bpからなる不完
全直接反復配列(TTTTAACTAAATCTATG
TCC) (h)−191位と−217位に25bpからなる不完
全直接反復配列(CAACTTTCAAAAATTAT
TTTTTAAA) (i)−289位に20bpからなるパリンドローム(
TAAAATATGA|TCATGTTTTA) (j)−435位と−480位に11bPからなる完全
直接反復配列(TAAGAGCCGCC)(k)−51
4位と−644位に15bpからなる不完全直接反復配
列(TAAAATACACGTCGA) (l)3′フランキング領域内の翻訳停止配列TAAの
下流で、52位と120位に2個のAATAAA配列 を有するニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ425
植物から得られる塩基性キチナーゼ遺伝子。 10)以下のヌクレオチド配列: 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 を有するニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ425
植物から得られる塩基性キチナーゼ遺伝子。 (11)請求項1ないし8のいずれか1項に記載の調節
DNA配列が発現性DNAおよび植物細胞内で活性なそ
の他の発現シグナルに操作可能に連結され、その結果、
植物宿主への形質転換で操作可能に結合された発現性D
NAの発現レベルにおける著しい増加が得られる、キメ
ラ遺伝子構築物である組換えDNA分子。 (12)スペーサー配列がプロモーター配列と隣接調節
DNA配列との間に挿入され、プロモーター配列と隣接
調節DNA配列との間の距離が結合された構造遺伝子の
発現に対して最適な距離であるように前記スペーサー配
列の長さが選択される請求項11記載の組換えDNA分
子。 (13)スペーサー配列が1bPないし100bpから
なる請求項12記載の組換えDNA分子。 (14)発現シグナルが植物または植物ウィルスの遺伝
子に由来する請求項11記載の組換えDNA分子。 (15)発現シグナルが細菌の発現シグナルである請求
項11記載の組換えDNA分子。(16)発現シグナル
がカリフラワーモザイクウイルス遺伝子(CaMV)の
プロモーターおよび/または終結シグナルである請求項
14記載の組換えDNA分子。 (17)発現シグナルがアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのTiプラスミドからのノパリンシンターゼ
遺伝子(nos)および/またはオクトピンシンターゼ
遺伝子(ocs)の発現シグナルである請求項15記載
の組換えDNA分子。 (18)誘導または抑制の意味において、植物組織内で
、結合されたDNA配列の転写を調節し得る追加的な調
節DNAを含む請求項11記載の組換えDNA分子。 (19)前記調節DNA配列が、植物ホルモン、熱ショ
ック、化学物質、病原体、酸素不足および光からなる群
から選択される種々の内部および/または外部要因によ
り誘導される請求項18記載の組換えDNA分子。 (20)調節DNA配列に結合された発現性DNAが、
形質転換された植物細胞およびまたそれらから生長する
組織に、そして特に植物に、病原体、化学物質および環
境の悪要因に対する保護作用を付与する構造遺伝子であ
る請求項11記載の組換えDNA分子。 (21)前記構造遺伝子が植物細胞内にキチナーゼを発
現する遺伝子である請求項20記載の組換えDNA分子
。 (22)前記構造遺伝子が植物細胞内にグルカナーゼを
発現する遺伝子である請求項20記載の組換えDNA分
子。 (23)前記構造遺伝子が植物細胞内にプロテアーゼイ
ンヒビターを発現する遺伝子である請求項20記載の組
換えDNA分子。 (24)前記構造遺伝子が除草剤耐性遺伝子である請求
項20記載の組換えDNA分子。(25)前記構造遺伝
子が植物細胞内にバチラス・スリンギエンシスからのd
−エンドトキシンを発現する遺伝子である請求項20記
載の組換えDNA分子。 (26)調節DNA配列に結合された構造DNAが、形
質転換された植物細胞自体または組織、器官、カルス、
胚および植物全体からなる群から選択されるより高度な
オーガナイゼーションの単位の部分における発現で、望
ましくそして有用な化合物の産生における増加を導く請
求項11記載の組換えDNA分子。 (27)前記発現性DNA配列がアンチセンスDNAで
ある請求項11記載の組換えDNA分子。 (28)選択性表現型マーカーをコードするDNA配列
をさらに含む請求項11記載の組換えDNA分子。 (29)前記選択性表現型マーカーが、アンピシリン、
テトラサイクリン、ヒグロマイシン、カナマイシン、メ
トトレキセート、G418およびネオマイシンからなる
群から選択される抗生物質に対する耐性である請求項2
8記載の組換えDNA分子。 (30)微生物中での複製を可能にする複製の開始点を
さらに含む請求項11記載の組換えDNA分子。 (31)複製の開始点が大腸菌、アグロバクテリウムま
たはそれらの両方において機能し得る請求項30記載の
組換えDNA分子。 (32)請求項11ないし31のいずれか1項に記載の
組換えDNA分子を含むクローニングベクター。 (33)請求項11ないし31のいずれか1項に記載の
組換えDNA分子を含む形質転換ベクター。 (34)大腸菌およびアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスの両方において安定に複製し得る請求項31記
載の組換えDNA分子を含むシャトルベクター。 (35)キメラ遺伝子構築物が左側境界配列(LB)と
右側境界配列(RB)との間にクローン化されている、
アグロバクテリウム・チュメファシエンスのTiプラス
ミドから得られる請求項34記載のシャトルベクター。 (36)請求項11ないし31のいずれか1項に記載の
組換えDNA分子を含む宿主有機体。 (37)請求項32ないし35のいずれか1項に記載の
ベクターを含む宿主有機体。 (38)前記宿主有機体が細菌である請求項36または
37記載の宿主有機体。 (39)前記宿主有機体が、プロトプラスト、細胞、カ
ルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠、接合子その
他からなる群から選択される植物材料である請求項36
または37記載の宿主有機体。 (40)請求項11ないし31のいずれか1項に記載の
組換えDNA分子を含む、トランスジェニック植物なら
びにそれらの有性および無性の後代。 (41)野生型に比べ著しく増加されている形質転換さ
れた細胞および/または組織におけるタンパク質含量を
有する、トランスジェニック植物ならびにそれらの有性
および無性の後代。 (42)野生型に比べ著しく増加されているキチナーゼ
含量を有する、請求項41記載のトランスジェニック植
物ならびにそれらの有性および無性の後代。 (43)野生型に比べ著しく増加されているグルカナー
ゼ含量を有する、請求項41記載のトランスジェニック
植物ならびにそれらの有性および無性の後代。 (44)請求項39記載の形質転換された植物材料から
再生されたトランスジェニック植物。 (45)トランスジェニック植物が稔性植物である請求
項40ないし44のいずれか1項に記載のトランスジェ
ニック植物。 (46)請求項40ないし45のいずれか1項に記載の
トランスジェニック植物の増殖材料。 (47)請求項40ないし45のいずれか1項に記載の
トランスジェニック植物の部分。(48)請求項1記載
の調節発現増加性DNA配列を塩基性キチナーゼ遺伝子
の5′非翻訳領域から単離するか、または公知方法を用
いて前記配列を合成することからなる前記配列の調製方
法。 (49)前記調節DNA配列が実質的に以下のヌクレオ
チド配列: 【遺伝子配列があります】 であるか、または1個またはそれ以上の塩基の突然変異
に基づいているがしかし依然として上記配列に実質的に
相同であり、そして出発配列の特定の調節発現増加特性
を依然として有する上記DNA配列の全ての誘導体であ
る請求項48記載の方法。 (50)以下の工程手段: (a)キチナーゼを発現し得る組織からのゲノムDNA
の抽出および精製 (b)抽出および精製されたDNA調製物の、クローニ
ングベクター中への引き続く挿入に適当な大きさの断片
への切断 (c)断片化されたDNAのクローニングベクター内で
のクローニングおよび遺伝子ライブラリィの作成 (d)プローブ分子によるキチナーゼ遺伝子またはそれ
らの一部を含むクローンの選択 (e)プローブ分子との強いハイブリダイゼーションシ
グナルを示すクローンの単離 (f)(e)において単離されたクローンの生化学的操
作による特徴づけ (g)発現の増加に関与する調節DNA配列の同定およ
び単離 からなる請求項48記載の方法。 (51)発現ベクターがゲノム遺伝子ライブラリィの作
成のために使用される請求項50記載の方法。 (52)公知キチナーゼクローンまたはそれらの一部が
プローブ分子として使用される請求項50記載の方法。 (53)前記調節DNA配列およびそれらから誘導され
た同様の機能を有する誘導体が化学的操作により合成さ
れる請求項48記載の方法。 (54)請求項1記載の調節DNA配列を所望の構造遺
伝子の開始コドンの前に直接挿入し、そしてその構築物
を植物細胞内で活性な発現シグナルに操作可能な様式で
連結することからなる請求項11記載の組換えDNA分
子の作成方法。 (55)スペーサー配列がプロモーターと調節DNA配
列との間に挿入されている請求項54記載の方法。 (56)前記構造遺伝子がキチナーゼまたはグルカナー
ゼ遺伝子である請求項54記載の方法。 (57)前記構造遺伝子がプロテアーゼインヒビターを
コードする遺伝子である請求項54記載の方法。 (58)前記構造遺伝子が除草剤耐性遺伝子である請求
項54記載の方法。 (59)前記構造遺伝子がバチラス・スリンギエンシス
からのd−エンドトキシン遺伝子である請求項54記載
の方法。 (60)以下の工程: (a)所望の発現性DNAの開始コドンの前に直接、調
節DNA配列を挿入し、 (b)植物細胞内で活性な発現シグナルの間に形質転換
体選択に適当なマーカー遺伝子を含んでいてよい公知植
物発現ベクター内に(a)の構築物を操作可能な様式で
スプライシングする、 ことからなる請求項1記載の調節DNA配列と操作可能
に連結されて植物細胞内で発現可能なDNAを含む発現
ベクターの作成方法。 (61)前記構築物が植物発現ベクターのポリリンカー
領域にスプライシングされ、該領域がプロモーターとタ
ーミネーターとの間に位置している請求項60記載の方
法。 (62)請求項11ないし31のいずれか1項に記載の
組換えDNA分子を用いて公知方法により植物を形質転
換することからなる、野生型と比較して増加されている
形質転換された細胞および/または組織におけるタンパ
ク質含量を有するトランスジェニック植物の作出方法。 (63)請求項21記載の組換えDNA分子を用いて植
物を形質転換し、そして挿入されたキチナーゼ遺伝子を
発現させることからなる、野生型と比較して著しく増加
されているキチナーゼ含量を有する請求項62記載のト
ランスジェニック植物の作出方法。 (64)請求項22記載の組換えDNA分子を用いて植
物を形質転換し、そして挿入されたグルカナーゼ遺伝子
を発現させることからなる、野生型と比較して著しく増
加されているグルカナーゼ含量を有する請求項62記載
のトランスジェニック植物の作出方法。 (65)請求項21記載の組換えDNA分子を用いて植
物を形質転換し、そしてキチン含有病原体を死滅させる
か、または該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入
されたキチナーゼ遺伝子を発現させることからなる、キ
チン含有病原体から植物を保護する方法。 (66)請求項22記載の組換えDNA分子を用いて植
物を形質転換し、そしてキチン含有病原体を死滅させる
か、または該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入
されたグルカナーゼ遺伝子を発現させることからなる、
キチン含有病原体から植物を保護する方法。(67)請
求項21または22記載の組換えDNA分子を用いて形
質転換され、そしてキチン含有病原体を死滅させるか、
または該病原体を制御下に保つのに十分な量で挿入され
たキチナーゼ遺伝子またはグルカナーゼ遺伝子を発現す
るトランスジェニック植物またはそれらの一部とキチン
含有病原体を接触させることからなるキチン含有病原体
を制御する方法。 (68)以下の工程手段: (1)キチナーゼを発現し得る組織からのゲノムDNA
の抽出および精製 (2)抽出および精製されたDNA調製物の、クローニ
ングベクター中への引き続く挿入に適当な大きさの断片
への切断 (3)断片化されたDNAのクローニングベクター内で
のクローニングおよび遺伝子ライブラリィの作成 (4)プローブ分子によるキチナーゼ遺伝子またはそれ
らの一部を含むクローンの選択 (5)プローブ分子との強いハイブリダイゼーションシ
グナルを示すクローンの単離 (6)(5)において単離されたクローンの生化学的操
作による特徴づけ からなる請求項9記載の塩基性キチナーゼ遺伝子の作成
方法。 (69)発現ベクターがゲノム遺伝子ライブラリィの作
成のために使用される請求項68記載の方法。 (70)予め単離されたcDNAクローンをプローブ分
子として用いるか、または特有の翻訳産物の同定に基づ
いた免疫学的検出方法を用いる、プラークハイブリダイ
ゼーションまたは分別コロニーハイブリダイゼーション
によりゲノム遺伝子ライブラリィがスクリーニングされ
る請求項68または69記載の方法。 (71)前記cDNAクローンがpCHN48もしくは
pCHN50またはそれらの機能的同等物である請求項
70記載の方法。 (72)最初にゲノムまたはcDNA遺伝子ライブラリ
ィを作成し、そして調節DNA配列をプローブ分子とし
て使用して該プローブ分子とハイブリダイゼーションし
得る相同DNA配列の存在に関して前記ライブラリィを
調べることにより、同様の機能を有する相同DNA配列
を同定するために請求項1ないし8のいずれか1項に記
載の調節DNA配列またはそれらの部分配列を使用する
ことからなる、新規調節DNA配列の同定方法。 (73)植物材料において遺伝子発現を増加させるため
に請求項1記載の調節DNA配列を使用する方法。 (74)ゲノム遺伝子ライブラリィを作成し、そして調
節DNA配列をプローブ分子として使用して該プローブ
分子とハイブリダイゼーションし得る相同DNA配列の
存在に関して前記ライブラリィを調べることからなる、
同様の機能を有する相同DNA配列を同定するために請
求項1記載の調節DNA配列を使用する方法。
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