PT811165E - Deteccao da producao de anticorpos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "DETECÇÃO DA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS" A presente invenção refere-se à detecção da produção de anticorpos e em particular à detecção da síntese activa de anticorpos em amostras de sangue, como resposta a infecção ou vacinação etc., por meio de um teste imunoadsorvente ligado a enzimas (ELISA), modificado. O teste ELISA tem sido utilizado desde há muito para detectar e medir anticorpos (ou antigénios) (veja-se por exemplo US-A-5188942). Podem também utilizar-se técnicas alternativas para analisar anticorpos ou antigénios, como a citometria de fluxo (veja-se Hetland et al., J. Immunol. Methods 1991, 140, p 167-171). Usualmente, o teste ELISA é utilizado como teste serológico, mas é também utilizado para estudar as propriedades imunoquímicas dos antigénios ou anticorpos, e tem frequentemente também aplicação, por exemplo, na avaliação e caracterização de respostas imunitárias, para investigar a produção de anticorpos por culturas de células, na tecnologia de hibridomas, etc.

Devido à sua sensibilidade, simplicidade, facilidade e rapidez de execução, a técnica tem sido amplamente adoptada como ferramenta de diagnóstico e é actualmente utilizada de forma rotineira em laboratórios clínicos, para detectar anticorpos no soro, ou plasma, em resposta a agentes infecciosos, após infecção ou vacinação. Assim, por exemplo, muitos dos testes para a infecção por HIV dependem da detecção de anticorpos contra o vírus, no soro ou plasma de pacientes, utilizando um teste ELISA convencional. Os testes de diagnóstico alternativos para identificar condições 1 p ^ clínicas envolvem o teste de marcadores que não são anticorpos, tal como o receptor de IL-2 solúvel (veja-se EP-A-526952), ou um marcador de glicoproteínas (veja-se US-A-5019497).

No entanto, uma vez que um teste ELISA serológico simples apenas mede a presença do anticorpo alvo na amostra, este não consegue distinguir entre uma síntese de anticorpos em curso, como resposta ao antigénio, e anticorpos já existentes, devido a uma infecção anterior, ou por transferência passiva, etc. Apesar de nalguns casos poder ser suficiente obter apenas a informação respeitante à presença de anticorpos, noutros casos é desejável determinar se os anticorpos alvo detectados estão ou não a ser sintetizados de forma activa pelos linfócitos na altura do teste, por exemplo no decorrer de uma vacinação, ou no diagnóstico de infecções em crianças, para distinguir de anticorpos maternos transferidos de forma passiva. Esta informação não é possível obter num método ELISA clássico.

No entanto, foram desenvolvidos outros métodos, que permitem a detecção de uma síntese de anticorpos em curso. Pode referir-se em particular, a este respeito, o teste de mancha imuno ligado a enzimas (ELISPOT) (também conhecido como teste ELISA de mancha ("spot") ou teste ELISA de placas) , revisto, por exemplo em Czerkinsky et al. in ELISA and other Solid Phase Immunoassays, Ed. D.M. Kenneny e S. J. Challacombe, 1988, Capítulo 10, 217-239. Esta técnica baseada no método ELISA, permite a enumeração de linfócitos que segregam anticorpos contra um ou mais antigénios alvo. Basicamente, o ELISPOT é uma variante do método ELISA, no qual as células que segregam anticorpos (ASC) podem ser reveladas por cultura de linfócitos em poços ELISA especialmente modificados, revestidos com o antigénio alvo e substituindo os reagentes de ELISA convencionais por complexos enzima-substrato que originam um precipitado corado 2 (manchas), adjacente à célula secretora. As manchas podem então ser contadas para se obter uma medida do número de células produtoras de anticorpo. Podem-se incluir no meio de cultura inibidores de síntese de proteínas, para confirmar que as manchas detectadas são devido a síntese de anticorpos de novo, durante o período de incubação in vitro.

Apesar da técnica ELISPOT ter mostrado ser muito útil no estudo da dinâmica das respostas imunitárias humorais e ter vindo a ser utilizada para detectar ASC espontâneas que surgem de forma transiente na circulação periférica de indivíduos imunizados, algumas características do método trazem limitações à sua utilização num processo de diagnóstico clínico. Em primeiro lugar, uma vez que para cada amostra é necessário contar as manchas individuais, o que pode ser demorado e trabalhoso, o método não é particularmente adequado para a análise de um grande número de amostras, como acontece num laboratório de diagnóstico clínico. Em segundo lugar, apenas é determinado o número de células que segregam anticorpo, em cada amostra, e, de um modo geral, isto requer volumes de amostra consideráveis, eg. alguns mis. As placas de ELISPOT são também de custo elevado e o teste não é ainda facilmente automatizável.

Amadori et al. (1988 Clin. Immunol. Immunopathol., Vol. 26, p 342) descreve um método para determinar a síntese de anticorpos, mas este método utiliza linfócitos purificados e longos períodos de incubação. O estímulo in vitro com um antigénio adequado tem sido utilizado para activar células em amostras de sangue, após o que são identificados os linfócitos activados (i.e. testes de células totais) por propriedades que indicam a sua activação (veja-se US-A-5360719) . Atkinson et al. (1985, J. Immunol. Methods, 76, p 365-373) descrevem um teste para a determinação da produção de anticorpos em suspensões de células imunitárias. No entanto, este método utiliza amostras purificadas e tem um 3 r- L·, ^ nível de sensibilidade que requer a utilização de amostras relativamente grandes.

Verifica-se assim, que apesar dos avanços nas técnicas de detecção de anticorpos, persiste a necessidade de um teste que seja de realização simples, rápida e económica, que permita, com confiança, a quantificação precisa de anticorpos segregados de forma espontânea, que seja capaz de distinguir entre síntese de anticorpos de novo e, em particular, que possa ser realizado em amostras de sangue para fins de diagnóstico. A presente invenção vai ao ancontro desta necessidade.

Num aspecto, a presente invenção proporciona assim um método para detectar a produção activa de anticorpos, como resposta a um antigénio alvo, numa amostra de sangue, em que o referido método compreende: contactar, na presença ou ausência de um inibidor de síntese de proteínas, alíquotas da referida amostra ou opcionalmente, de linfócitos directamente isolados a partir da referida amostra, com uma fase sólida, sob condições que permitam a produção e secreção de anticorpos pelos linfócitos; detectar, em solução, a ligação de anticorpos ao(s) referido(s) antigénio(s) na fase sólida; e comparar a referida ligação de anticorpo na presença ou ausência de um inibidor de síntese de proteínas, de modo a determinar a quantidade de secreção de anticorpos activos em resposta ao(s) referido(s) antigénio(s).

Tal como aqui utilizado, o termo "produção de anticorpos activos" refere-se a ' anticorpos segregados de forma espontânea, produzidos por linfócitos na amostra que estão a produzir activamente anticorpos no decorrer do teste, como consequência de uma resposta imunitária activa em curso. Em todos os casos, os anticorpos são direccionados para 4 p Lc ^ ^ antigénios que são apresentados in vivo e não in vitro, quer antes, quer durante o método de teste de acordo com a invenção.

Tal como aqui utilizado, o termo "secreção activa de anticorpos em resposta ao referido antigénio" significa que os anticorpos segregados de forma activa se ligam ao antigénio utilizado no teste, embora o antigénio utilizado possa não ter sido o imunogénio que estimulou a resposta imunitária inicial. Assim, apesar de ambos o antigénio utilizado no teste e o imunogénio que estimulou, ou está a estimular, a produção de anticorpos in vivo, se ligarem aos anticorpos a ser detectados, devido a epítopos idênticos ou muito semelhantes, noutros aspectos, o antigénio e imunogénio poderão não ser idênticos. Assim, apesar de o antigénio utilizado no método de acordo com o invento poder ser material que contém todo, ou uma parte do imunogénio relevante, e.g. derivado de indivíduos infectados ou partes purificadas do mesmo material ou semelhante, o antigénio poderá igualmente ser produzido de forma sintética, e.g. por síntese química ou expressão recombinante, com porções adicionadas ou eliminadas, em relação ao antigénio nativo. Deste modo, podem-se utilizar proteínas de fusão, ou moléculas que expressam apenas o(s) epítopò(s) adequado(s).

De um modo geral, o método de acordo com a invenção envolve a incubação de linfócitos a partir de amostras de sangue em contacto com uma superfície sólida adequada, a fim de imobilizar os anticorpos a ser detectados, sob condições que permitam a produção e secreção de anticorpos pelos linfócitos e em seguida a remoção de células e detecção da ligação do anticorpo ao antigénio, na fase sólida. Comparando o nível de ligação de anticorpo detectado, na presença ou ausência de um inibidor de síntese de proteínas, pode-se distinguir e quantificar a síntese de anticorpos de novo. 5 VΓ u

De forma surpreendente, o método de acordo com a invenção permite a utilização de pequenos volumes de amostra (eg. volumes na ordem do μΐ, inferiores a 1 ml), para detectar directamente a produção espontânea de anticorpos por linfócitos não estimulados, ou para preparar linfócitos para utilização no método, sem um passo prévio de pré-cultura de linfócitos antes da incubação com a fase sólida. Por outras palavras, os linfócitos da amostra são utilizados directamente no método de teste de acordo com a invenção, sem qualquer tratamento ou estímulo prévio, e.g. estímulo in vitro por um antigénio. Os anticorpos segregados pelos linfócitos na altura da recolha de amostras podem ser assim detectados. Deste modo, mesmo utilizando estes pequenos volumes de amostra, a síntese espontânea de anticorpos em curso, como resposta ao antigénio teste, pode ser, com vantagem, distinguida da activação secundária de linfócitos. Além disso, os linfócitos são testados numa situação em que segregam espontaneamente anticorpos, sem haver estímulo das células para revelar qualquer memória. Isto é contrário a outros métodos publicados que tiram partido do estímulo antigénico in vitro para aumentar a sensibilidade do teste. A presente invenção, por outro lado, tira vantagem da secreção espontânea de anticorpos para permitir que a detecção de anticorpos no sangue seja indicativa de uma infecção em curso pelo antigénio teste; os linfócitos do plasma irão segregar anticorpos contra o antigénio teste nas primeiras, poucas, semanas após infecção, ou vacinação, etc. A detecção destes anticorpos pelo método de acordo com a presente invenção permite que a infecção seja diagnosticada ou determinada, ou que a resposta de anticorpos à vacinação seja monitorizada, etc. Isto é particularmente útil em crianças e recém--nascidos, onde é importante distinguir entre anticorpos sintetizados de novo e anticorpos maternos transferidos de forma passiva. A mesma amostra de sangue pode ser analisada quanto a anticorpos contra vários agentes infecciosos distintos, quer em testes separados, quer no mesmo teste, 6 V f u.

utilizando múltiplos antigénios relevantes. Assim, é possível a utilização de antigénios de contacto relevantes, consistentes com o síndrome clínico que o paciente apresenta. No diagnóstico de infecções, também é importante conseguir distinguir entre a síntese de anticorpos em curso, de anticorpos já existentes, de uma infecção anterior. 0 reavivar da memória imunológica por estímulo antigénico in vitro não é consistente com um teste que vise identificar uma infecção aguda em curso, e deste modo os métodos anteriores que se baseiam no estímulo antigénico não têm esta vantagem. Além disso, a inclusão do passo de estímulo antigénico iria comprometer o benefício do factor tempo do teste de acordo com a invenção, que é de realização bastante rápida, comparado com os métodos da arte anterior.

Os antigénios para os quais são dirigidos os anticorpos para a detecção de acordo com o método da invenção incluem tanto antigénios bacterianos, como virais. Os antigénios de importância clínica incluem, mas não se limitam a, por exemplo o vírus de Herpes Simplex, citomegalovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV) e quaisquer vírus de hepatite. A detecção destes antigénios poderia ser utilizada para determinar rapidamente se os pacientes estão infectados, e.g. para fins de pesquisa de sangue ou para estabelecer e/ou monitorizar infecções. O método é particularmente útil devido à sua simplicidade e pode ser utilizado sem necessidade de equipamento elaborado, e.g. em situações em campo.

Tal como aqui utilizados, os termos "detectar" e "determinar a quantidade de" incluem tanto determinações quantitativas como qualitativas do nível de produção de anticorpos, no sentido de obter um valor absoluto para a quantidade de anticorpo produzido na amostra, e também um índice, razão, percentagem ou indicação semelhante, do nível de produção de anticorpos, bem como determinações semi--quantitativas ou qualitativas. 7 Γ u

Uma vantagem principal da presente invenção é a de serem necessários apenas pequenos volumes de amostra, e.g. 50-500 μΐ, de preferência 100-300 μΐ e usualmente 100-200 μΐ de sangue ou produto sanguíneo, num volume comparável da fonte de sangue total, ao contrário dos testes de diagnóstico clássicos que normalmente se baseiam em volumes de vários ml de soro. Isto é especialmente útil no caso da amostragem de sangue de recém-nascidos, dado que o método de acordo com a invenção apenas requer volumes da ordem dos μΐ. A amostra de sangue, geralmente uma amostra de sangue periférico, pode ser utilizada directamente, embora possa ser preferível isolar primeiro os linfócitos da amostra. Isto pode ser conseguido utilizando técnicas convencionais, bem conhecidas na arte. Assim, por exemplo, podem-se utilizar convenientemente várias preparações de sangue total, e.g. sangue heparinizado, sangue com EDTA, etc., tal como as que são rotineiramente preparadas em laboratórios clínicos. Embora não seja essencial, os eritrócitos presentes na amostra podem ser lisados, e.g. através de métodos usuais de exposição a curto prazo a água destilada ou cloreto de amónio, ou utilizando outras técnicas de hemólise bem conhecidas. Deverá entender-se que todas as preparações enriquecidas ou purificadas deverão conter os linfócitos presentes no sangue total de que deriva a preparação, de modo a permitir a detecção da produção espontânea de anticorpos. Se desejado, os linfócitos podem ser separados, por exemplo, utilizando meios convencionais de separação de linfócitos , e.g. Lymphoprep (Nyegaard Co. Oslo, Noruega) ou utilizando separação imunomagnética (IMS) ou um sistema de separação semelhante baseado em fase sólida, ou outras técnicas usuais. No caso do IMS, ou técnicas de separação semelhantes, pode-se utilizar uma fase sólida, e.g. esferas magnéticas revestidas com anticorpo específico para alguns conjuntos de leucócitos, para separar selectivamente os linfócitos úteis. Quando se utilizam os linfócitos separados, podem-se lavar as células 8

antes da utilização, utilizando métodos de lavagem estabelecidos. Verificou-se, no entanto, que não é necessária uma lavagem extensiva das células. De facto, não lavando de forma extensiva, a viabilidade celular pode ser melhorada e o método acelerado. A amostra de sangue, tratada como acima mencionado se desejado, ou os linfócitos separados, são em seguida contactados, de forma conveniente, com uma fase sólida que transporta um par de ligação adequado, a fim de imobilizar o anticorpo, ou anticorpos a ser detectados. De forma conveniente, o par de ligação é o antigénio ou antigénios teste, reconhecido pelo anticorpo ou anticorpos a ser detectados. Numa forma de concretização, a presente invenção proporciona assim um método para a detecção da produção activa de anticorpos numa amostra de sangue, em que o referido método compreende: contactar, na presença e ausência de um inibidor de síntese de proteínas, alíquotas da referida amostra, ou opcionalmente, de linfócitos directamente isolados a partir da referida amostra, com uma fase sólida que compreende um ou mais antigénios reconhecidos pelo anticorpo ou anticorpos a ser detectados; detectar, em solução, a ligação de anticorpos ao(s) referido(s) antigénio(s); e comparar a referida ligação de anticorpo na presença ou ausência do inibidor de síntese de proteínas, de modo a determinar a quantidade de secreção activa de anticorpos, em resposta ao(s) referido(s) antigénio(s).

Também se podem utilizar pares de ligação alternativos, por exemplo proteína A, proteína G ou anticorpos que reconhecem e se ligam ao anticorpo a ser detectado. No último caso, não é necessária uma ligação específica elevada, dado que a especificidade é introduzida nesta forma de concretização do método de teste, pela subsequente ligação 9

dos antigénios que se ligam especificamente aos anticorpos a ser detectados. Assim, em todas as formas de concretização, é criado um complexo específico antigénio-anticorpo. A presença destes complexos imobilizados no suporte sólido é determinada no passo de detecção do método de acordo com a invenção. A fase sólida pode ser qualquer dos suportes ou matrizes bem conhecidos, usualmente amplamente utilizados ou propostos para imobilização, separação, etc. Estes podem ter a forma de partículas, folhas, geles, filtros, membranas ou tira, tubos ou placas de microtítulo, etc e podem ser convenientemente feitas de um material polimérico. No entanto, para facilidade de operação e simplicidade, podem-se utilizar as placas e poços de microtítulo convencionais, de preferência as placas de ELISA convencional. A fase sólida também pode ser modificada para permitir a detecção de anticorpos específicos para uma gama de diferentes antigénios. Assim, por exemplo, podem-se revestir discos, tiras, etc. de um material de fase sólida adequado, e.g. nitrocelulose ou semelhantes, com diferentes antigénios e adicioná-los em simultâneo a um poço de microtítulo ou outro recipiente adequado, que não contém qualquer antigénio de contacto. Podem-se então utilizar os métodos de ligação de anticorpos para distinguir entre os diferentes antigénios. Pode-se utilizar um conjunto de discos, cada um revestido com antigénios relevantes consistentes com uma determinada condição clínica ou síndrome, de modo a identificar qual dos agentes suspeitos é o causador da doença. O disco seria então processado individualmente em poços separados. Este é um processo que poupa particularmente o material, uma vez que os testes podem ser realizados para o teste simultâneo de uma multiplicidade de antigénios diferentes (quer do mesmo agente infeccioso, quer de agentes diferentes, relevantes para o síndrome ou condição clínica em cada caso), utilizando o mesmo pequeno volume de amostra. Uma alternativa adequada é a utilização de múltiplas amostras de sangue em poços 10

separados, cada um revestido com diferentes pares de ligação, e.g. antigénios ou anticorpos e desenvolver o teste em acordo.

As técnicas para a ligação do par de ligação, e.g. de um antigénio a uma fase sólida, são também bem conhecidas e estão amplamente descritas na literatura. Muitos processos convencionais de revestimento de antigénios são descritos por exemplo em ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Praticai Aspects; 1988, ed. D.M. Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons. Se desejado, as placas podem ser lavadas e bloqueadas, uma vez mais utilizando técnicas convencionais. Assim, por exemplo, podem-se revestir placas de microtítulo convencionais, e.g. placas ELISA com um par de ligação, por incubação das placas durante a noite a 4°C, num tampão adequado, e.g. solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo o par de ligação, e.g. a concentrações de 0,01 a 150 μg/ml de proteína, seguido de bloqueamento utilizando meios de bloqueamento adequados (geralmente um meio de cultura de células) e incubando, e.g. a 37°C, durante 1 a 5 horas. Após remoção da solução bloqueante, as placas estão prontas para ser utilizadas.

De forma conveniente, no entanto, os materiais necessários para realizar o método de acordo com a invenção podem ser proporcionados na forma de um "kit", em que o suporte sólido é fornecido já revestido com o par de ligação, e bloqueado de forma adequada.

Como referido acima, o passo de contacto envolve geralmente a incubação da amostra, ou linfócitos separados na presença da fase sólida, sob condições que permitam a síntese e secreção de anticorpos. De forma conveniente, podem-se utilizar as condições de incubação de ELISPOT convencional, como descrito por exemplo, em Czerkinsky et al., 1988 (supra) . De um modo geral, a amostra, ou células, é incubada 11

V

Γ a 37°C com C02 a 5% em ar, quando o meio em que as células são incubadas requer C02 como parte do sistema tampão. Também se pode utilizar um meio independente de C02, em que operam sistemas tampão alternativos, como os meios que utilizam o constituinte HEPES, bem conhecido. Nestes casos, as células são simplesmente incubadas a 37°C, facilitando deste modo o restante teste e a sua necessidade de equipamento elaborado. Os tempos de incubação podem variar, mas são necessárias geralmente pelo menos 1-2 horas. Verificou-se que tempos de incubação de 2 a 6 horas, e.g. 2 a 4 horas originam bons resultados, embora possam ser desejáveis, nalgumas situações, períodos de incubação mais longos, e.g. até 12 ou 24 horas, ou durante a noite. Os meios adequados para a incubação são bem conhecidos na arte e incluem qualquer meio de cultura de células convencional, e.g. meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) ou RPMI ou meios de cultura de células bem conhecidos que utilizam HEPES como sistema tampão, independente de C02, contendo soros adequados, e.g. soro fetal de vitela (FCS) ou outros componentes, e.g. glutamina, como necessário. Componentes adicionais, opcionais, no meio, podem incluir antibióticos, e.g. gentamicina, penicilina, estreptamicina, etc., outros aminoácidos, factores de crescimento, etc.

Poderá ser desejável diluir a suspensão de amostra/célula antes do passo de contacto, e pode-se utilizar, convenientemente, uma gama de diluições de células/amostra. As diluições serão geralmente realizadas utilizando o meio de cultura como diluente.

De modo a distinguir uma síntese de anticorpos em curso, a incubação é realizada na presença e ausência de um inibidor de síntese de proteínas. Assim, antes da incubação, o inibidor é adicionado a parte das alíquotas de amostra/células, para bloquear a síntese de proteínas, e portanto do anticorpo, e outras partes são incubadas sem 12 p L·, ^ ^ inibidor. Pode-se utilizar qualquer dos inibidores de síntese de proteínas vulgarmente conhecidos, e.g. cicloheximida. Podem-se utilizar concentrações de 10-5000 μ9/ιτι1, e.g. 50-500 μ9/τη1 de cicloheximida. É preferível incluir também um inibidor de ATPase como azida de sódio, ou outro inibidor semelhante com o inibidor de síntese de proteínas, de modo a parar rápida e completamente o metabolismo celular.

Após a incubação, as amostras/células são removidas da fase sólida. Isto pode ser conseguido de modo geral simplesmente por lavagem, utilizando um meio adequado, e.g. um tampão como PBS. Verificou-se, no entanto, que não é necessária uma lavagem extensiva. A fase sólida é então submetida ao passo de detecção da ligação do anticorpo. 0 passo de detecção, em termos de leitura do sinal, é realizado em solução. Pode-se utilizar qualquer dos meios conhecidos para a detecção da ligação de anticorpos, desde que seja gerado um sinal que possa ser lido em solução; por exemplo dependente de fluorescência, quimioluminescência, colorimetria ou uma reacção enzimática que produz um sinal detectável. De forma conveniente, no entanto, pode-se utilizar um imunoensaio como meio de detecção e de preferência um teste imunoadsorvente ligado a enzimas (ELISA).

As técnicas de imunoensaio, e particularmente a técnica ELISA, são bem conhecidas na arte e estão descritas na literatura (veja-se por exemplo ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Praticai Aspects; 1988, ed. D.M. Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons).

Após a remoção da amostra/células, pode-se adicionar um conjugado enzima-anticorpo, por exemplo no método de detecção 13

Γ u ELISA, que se liga ao anticorpo ligado ao antigénio na fase sólida. De modo semelhante, se o anticorpo a ser detectado está ligado à fase sólida de forma não específica através de um par de ligação, por exemplo por um anticorpo contra anticorpos de uma espécie diferente, pode-se adicionar um conjugado enzima-antigénio que se irá ligar especificamente ao anticorpo imobilizado a ser detectado. Adiciona-se então um substrato enzimático de modo a desenvolver o sinal detectável. Na presente invenção, utiliza-se de forma conveniente um substrato solúvel, que origina um sinal detectável em solução. Isto é vantajoso, uma vez que facilita e simplifica o manuseamento e processamento de um grande número de amostras e permite estimar a produção de anticorpos, embora como acima mencionado, não seja necessária uma quantificação absoluta, podendo-se obter, se desejado, um resultado qualitativo ou semi-quantitativo. Para conveniência, o substrato pode ser seleccionado para originar um sinal detectável por espectrofotometria, que pode ser simplesmente determinado por leitura de absorvância, e.g. utilizando um leitor de placas ELISA convencional. De facto, podem-se utilizar os reagentes ELISA convencionais, o que tem a vantagem de tornar o teste de acordo com a invenção compatível com métodos e técnicas existentes, utilizadas rotineiramente em laboratórios clínicos. No entanto, podem-se utilizar outros sistemas de detecção/produção de sinal, que originam sinais detectáveis por fluorescência, quimioluminescência, etc.

Também se podem utilizar métodos de amplificação imuno--enzimáticos, para melhorar o sinal e aumentar a sensibilidade, por exemplo utilizando métodos de avidina--biotina, como o sistema Extravidin, disponível da Sigma. Os anticorpos secundários biotinilados são utilizados como reagentes ELISA, em combinação com um complexo peroxidase avidina. Uma vez que uma molécula de avidina e capaz de se ligar a várias moléculas de biotina, a utilização de 14 complexos avidina-biotina aumenta a concentração na superfície de moléculas de peroxidase, dando ao método uma sensibilidade ainda maior.

Os materiais e meios necessários para o passo de incubação (contacto) das células e o passo de detecção da ligação de anticorpo podem também ser convenientemente fornecidos na forma de "kit”, juntamente com a fase sólida revestida com o par de ligação. A informação obtida a partir do teste de acordo com a invenção pode ser suplementada utilizando outros métodos de teste. Podem-se obter dados adicionais e úteis sobre anticorpos do soro/plasma já existentes num teste ELISA clássico. Além disso, após separação dos linfócitos da amostra de sangue, quando esta é realizada, o fluido plasmático remanescente pode ser utilizado para detectar anticorpos pré-existentes, utilizando a mesma fase sólida revestida com o par de ligação, no teste de acordo com a invenção.

De modo a assegurar que o método de teste de acordo com a invenção é realizado com confiança, podem-se incluir controlos adequados. Em primeiro lugar, a comparação entre poços com síntese de proteínas bloqueada e poços não bloqueados irá assegurar que a invenção está a registar uma produção aguda de anticorpos pelas células teste, e não apenas a registar anticorpos pré-existentes no sangue periférico. No caso de utiliar preparações de linfócitos purificados como amostra, isto irá assegurar que a existência de quantidades vestigiais de anticorpos do sangue periférico retidos na amostra de linfócitos não irá comprometer o teste. Em segundo lugar, de modo a determinar que a diferença registada entre sinais de poços bloqueados e não bloqueados não é devida a linfócitos activados de forma esporádica e não especifica (secundários), utiliza-se um antigénio controlo negativo. Este antigénio seria de um agente infeccioso pouco provavelmente responsável pela doença aguda 15

V do paciente, e.g. ο toxóide de tétano. 0 némero destes linfócitos secundários activados será, em qualquer caso, muito inferior ao necessário para um resultado positivo no teste, utilizando o método de acordo com a invenção. A concepção da invenção tem este ponto em consideração.

Como acima referido, devido à sua facilidade e rapidez de execução e simplicidade, o teste de acordo com a invenção tende, por si, para a utilização em diagnóstico ou outras utilizações clínicas ou veterinárias, e.g. o cultivo de peixes. Para além dos pequenos volumes de amostra, uma outra vantagem é a de que apenas é necessária uma amostra, em vez de pares de soro recolhidos a intervalos de 2 a 3 semanas, tal como é necessário em muitos testes serológicos convencionais. Não é necessária uma instrumentação elaborada e o teste é facilmente automatizado. Para além disso, é possível testar rapidamente diferentes isotipos de imunoglobulina, se necessário. O método de teste acima mencionado, de acordo com a invenção, proporciona um método para determinar a presença ou extensão de uma infecção em curso, devido à análise da expressão espontânea de anticorpos específicos a um antigénio definido. Este método é claramente aplicável à determinação de condições de doença que são conhecidas e para as quais estão disponíveis os antigénios relacionados com o imunogénio relevante, proporcionando assim um marcador específico da infecção. Nalgumas situações clínicas, no entanto, a doença ou infecção específica pode não ser identificada e/ou o antigénio adequado pode não estar disponível para utilização no teste. Nestes casos, o teste pode ser modificado para determinar a presença ou extensão de indicadores não específicos da infecção. Assim, por exemplo, as amostras que contêm linfócitos, e.g. sangue total ou preparações de linfócitos purificadas ou enriquecidas suas derivadas, podem ser examinadas no que respeita à sua produção de marcadores 16 ç-' U. ^ de infecção, e.g. citoquinas ou interferões, por exemplo o interferão-γ.

Assim, ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método para detectar a presença de indicadores de infecção não específicos numa amostra de sangue, em que o referido método compreende: contactar, na presença ou ausência de um inibidor de síntese de proteínas, alíquotas da referida amostra, ou opcionalmente, de linfócitos directamente isolados a partir da referida amostra, com uma fase sólida, sob condições que permitam a produção e secreção de indicadores de infecção pelos linfócitos; detectar, em solução, a ligação de indicadores de infecção a um par de ligação na fase sólida; e comparar a referida ligação do indicador de infecção na presença ou ausência de inibidor de síntese de proteínas, de modo a determinar a quantidade de indicadores de infecção na referida amostra.

Para realizar este método, a fase sólida pode ser proporcionada com as moléculas de captura adequadas, por exemplo anticorpos contra os indicadores de infecção, para detecção. Para a detecção da presença dos referidos indicadores de infecção imobilizados na fase sólida, podem-se utilizar métodos como acima descritos, por exemplo utilizando anticorpos ou ligandos marcados. Neste método, os marcadores específicos podem ser identificados pela escolha adequada da porção imobilizadora ou molécula de detecção. Assim, por exemplo, toda a proteína na amostra pode ser imobilizada no suporte sólido e a detecção pode ser realizada utilizando um anticorpo ou ligando especificamente marcado.

Alternativamente, pode-se utilizar um par de ligação específico para imobilizar os indicadores de infecção pertinentes que podem então ser marcados de forma adequada, quer positiva, quer negativamente, por exemplo no primeiro 17 caso por ligação a um domínio presente no indicador de infecção, mas não exclusivo dessa molécula, ou no segundo caso por marcação de um par de ligação não ligado na fase sólida. A invenção será em seguida descrita em maior pormenor com referência aos Exemplos seguintes, não limitantes, em que o método de teste de acordo com a invenção é referido como teste "Plasmacute".

Exemplo 1

Procedimento geral Células: Sangue heparinizado recolhido a vários tempos após a vacinação de voluntários a que foi dada a vacina da gripe inactivada. 0 sangue foi misturado com um volume igual de PBS. Os linfócitos foram separados por Lymphoprep (Nyegaard & Co., Oslo) . As células foram lavadas duas vezes em PBS, resuspendidas (diluições) em meio de Eagle modificado da Dulbecco com FCS a 20%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 IU/ml e estreptomicina 100 μg/ml (Pen + Strep) = MEIO.

Solução STOP: cicloheximida 1 mg/ml em PBS contendo azida de sódio a 10%. ELISA e antigénios de gripe: Antigénios de superfície purificados de três estirpes de vírus da vacina da gripe utilizados num teste clínico, aqui designados por H3N2, H1N1 e B.

Placas ELISA: Placas EIA Greiner 655001 forma F ou placas EIA Costar 3590. Revestimento com 100 μΐ/poço com uma solução de 10 μg/ml de proteína em PBS durante a noite a 4°C. Bloqueamento com MEIO durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar uma vez com PBS. 18 TESTE: Diluições de 100 μΐ de suspensões de células em MEIO adicionadas a poços em triplicado, em dois conjuntos paralelos para cada um dos três antigénios da gripe: Um conjunto de poços triplicados é bloqueado no passo inicial por adição de 50 μΐ de solução STOP. Incubação a vários tempos a 37°C num incubador com C02 a 5% em ar. A placa ELISA é lavada uma vez com PBS, em seguida duas vezes com PBS com Tween 20 a 0,05%. Adicionam-se 50 μΐ/poço de Ig anti-humana de coelho conjugada com peroxidase, diluída de forma adequada (Sigma) e deixa-se à temperatura ambiente durante 1 hora. A placa é subsequentemente desenvolvida utilizando o substrato o-fenilenodiamina (OPD) e a absorvância é lida a 492 nm.

Amostragem de sangue 11 dias após a vacinação

Tempo de incubação das células: 4 horas, 0 horas = poços bloqueados

No de células H3N2 H1N1

B 199/490 352/527 143/194 331/353 0/4 horas 6,6 104 264/522 0/4 horas 6,6 103 238/290

Todos os valores são médias de poços em triplicado, expressos como absorvância x 1000. Gama ± 10%

Conclusão: 6,6 104 = 66.000 células originaram um aumento significativo do sinal a 4 horas de incubação. A absorvância de H3N2 sobe até 98%, de H1N1 até 153% e de B até 50%.

Esta é uma experiência representativa. Testes adicionais mostraram que a incubação das células durante a noite origina uma distinção ainda mais clara entre os poços bloqueados e não bloqueados, com absorvâncias acima de 1000. 0 sistema também funciona por períodos de incubação mais curtos, e.g. 2-3- horas. 10 vezes mais células, e.g. 6,6 103 células/poço poderão também, mas não sempre, originar uma distinção mais clara. 19

Exemplo 2

Procedimento geral Células: Sangue heparinizado recolhido 7 dias após vacinação de voluntários a que foi dada vacina de gripe inactivada. O sangue é misturado com um volume igual de PBS. Os linfócitos são separados por Lymphoprep (Nyegaard & co. , Oslo) . As células são lavadas duas vezes em PBS, resuspendidas em meio de Eagle modificado da Dulbecco, suplementado com FCS a 20%, L-glutamina 2 mM, Pen+Strep (como anteriormente) = MEIO.

Solução STOP: cicloheximida 1 mg/ml em PBS contendo azida de sódio a 10%.

Antigénios teste: antigénios de superfície purificados de três estirpes de vírus na vacina de gripe utilizada no teste clínico, aqui designados por H3N2, H1N1 e B.

Antigénio controlo: toxóide do tétano (não adsorvido em alumínio, Lederle).

Placas ELISA: Placas EIA Greiner 655001 forma F ou placas EIA Costar 3590. Revestimento com 100 μΐ/poço com uma solução de 10 pg/ml de proteína em PBS durante a noite a 4°C, tétano: 10 Lf/ml. Bloqueamento com MEIO durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar uma vez com PBS. TESTE: Diluições de 100 μΐ de suspensões de células em MEIO adicionadas a poços em triplicado em dois conjuntos paralelos para cada um dos três antigénios da gripe e antigénio de tétano controlo. Um conjunto de poços é bloqueado no passo inicial por adição de 50 μΐ de solução STOP. Incubação a 3 7°C num incubador com C02 a 5% em ar, durante 3 horas. Após incubação a placa ELISA é lavada uma vez com PBS, em seguida duas vezes com PBS com Tween 20 a 0,05%. Adicionam-se 50 μΐ/poço de Ig anti-humana de coelho conjugada com peroxidase 20

Lc, ^ (Sigma), diluída de forma adequada e deixa-se à temperatura ambiente durante 1 hora. A placa é subsequentemente desenvolvida utilizando o substrato o-fenilenodiamina (OPD) e a absorvância é lida a 4 92 nm. [O teste pode ser modificado para aumentar a sensibilidade, por um passo adicional antes do substrato, utilizando um passo de 1 hora de extravidina/peroxidase (Sigma). Isto requer a utilização de conjugado biotinilado, em vez do conjugado de peroxidase (Sigma)].

Resultado das experiências representativas (Sem extravidina): 7 dias após vacinação (2 indivíduos; #1 e #2)

Tempo de incubação das células: 3 horas, 0 horas = poços bloqueados

No de células H3N2 H1N1 B Tétano 0/3 horas 105 #1 063/410 055/269 206/258 046/050 #2 045/077 048/242 182/207 040/046

Todos os valores são a média de poços em triplicado, expressos como absorvância x 1000. Gama + 16%

Os indivíduos são adolescentes (16 anos). É bem conhecido que os mais novos respondem particularmente bem à vacina da gripe A/H1N1. Isto pode-se ver claramente acima, em que os dois indivíduos #1 e #2 respondem bem. No entanto, normalmente os vacinados respondem de forma diferente aos vários componentes da vacina, pelo que deverão ser esperadas diferenças no aumento de absorvância. Isto é demonstrado aqui pelo facto de o indivíduo #1 responder fracamente ao vírus B, enquanto que o #2 apenas respondeu significativamente ao vírus H1N1. Tal como esperado, nenhum deles respondeu ao toxóide do tétano. Se, no entanto, as células foram 21 V Γ u

estimuladas in vitro com o toxóide durante um período de tempo de alguns dias, a sua memória imunológica mais remota (ao longo da vacinação durante a infância) poderá ter resultado na produção de anticorpos contra o tétano. Num caso infèccioso real, testado num laboratório de diagnóstico utilizando a invenção, -apenas um agente/antigénio teste dará um sinal positivo.

Exemplo 3

Procedimento geral Células: Sangue heparinizado recolhido 6 dias após vacinação de um adulto (macho com 24 anos de idade) e de uma criança (macho de 3 anos de idade) que receberam uma subunidade da vacina de gripe inactivada. Os linfócitos foram separados como descrito nos exemplos 1 e 2. As células foram contactadas com a fase sólida que transporta o antigénio H3N2, H1N1 e B, como descrito nos Exemplos 1 e 2, durante 3 horas a 3 7°C e o teste desenvolveu como descrito (não se utilizou solução STOP, nem antigénio controlo nesta experiência). A tabela 1 mostra os resultados de dois indivíduos em que a leitura para cada antigénio é a média de poços em triplicado, expressos como absorvância x 1000

Tabela 1

Indivíduo adulto Indivíduo criança Número de células (milhares) A/H3N2 A/H1N1 B Número de células (milhares) A/H3N2 A/H1N1 B 224 475 322 913 275 1268 97 10 112 189 193 567 138 951 65 10 56 93 62 162 69 672 51 20 22

Os resultados mostram que a criança pequena, que apenas teve um episódio anterior de gripe, uma infecção por A/H3N2, teve uma resposta imunitária forte ao componente A/H3N2 na vacina trivalente. Tal como esperado para esta criança, não houve resposta aos componentes A/H1N1 e B. Estas crianças pequenas requerem normalmente 2 doses de vacina com algumas semanas de intervalo, a fim de se obter uma resposta imunitária satisfatória. Cerca de 70.000 linfócitos, o que corresponde a um volume de cerca de 70 μΐ de sangue total, foram suficientes para se obter um resultado positivo definitivo. Para o indivíduo adulto, que teve múltiplos episódios de gripe, a resposta não foi tão vigorosa, mas apesar de tudo foi significativa para todos os três componentes da vacina, embora com diferentes graus. Para o componente B, foram necessários aproximadamente 100.000 linfócitos para originar uma resposta positiva, enquanto que os dois componentes A necessitaram de um mínimo de 100.000 células, de preferência 200.000 células.

Experiência 4: Detecção de Herpes simplex tipo 2 por métodos de teste clássico e Plasmacute

Procedimento geral

Cultura de tecidos e análises serolóqicas O material da genitalia de cinco indivíduos que apresentaram sintomas sugestivos de infecção pelo vírus de herpes genital foi submetido a procedimentos de rotina de cultura de tecidos, na tentativa de detectar vírus em replicação a partir dos espécimes (realizado pelo Laboratório de vírus, Hospital da Universidade de Haukeland, Bergen). O mesmo laboratório realizou análises serológicas de rotina em amostras de soro utilizando kits ELISA comerciais (Behringer Enzygnost da Behringer, Alemanha) que contêm antigénios HSV, para detectar IgG e IgM. 23

V

I--^ ^

Separação de linfócitos

Os linfócitos foram isolados por centrifugação em gradiente de densidade de Lymphoprep (Nycomed) do sangue heparinizado de cinco indivíduos que apresentaram sintomas sugestivos de uma infecção pelo vírus de herpes genital, recolhido em simultâneo com as amostras do hospital. As células foram lavadas três vezes em PBS e resuspendidas em meio de cultura de DMEM contendo FCS a 2 0%, L-glutamina lmM, penicilina 50 IU/ml e estreptomicina 50 μg/ml (DMEM/FCS). As células viáveis foram contadas por exclusão com azul de tripano (0,2 %).

Teste Plasmacute utilizando ELISA de IgM e IqG anti-HSV Enzygnost da Behringer

As IgM e IgG anti-HSV Enzygnost da Behringer são fornecidas na forma de tiras contendo 8 poços revestidos com antigénio derivado a partir de células de rim de símio permanentes, infectadas com HSV e 8 poços revestidos com antigénio controlo de células não infectadas. As tiras são bloqueadas com 2 00 μΐ/poço de DMEM/FCS a 3 7°C em C02 a 5% durante 1 hora. Adicionaram-se 100 μΐ por poço da diluição adequada de linfócitos e incubou-se durante 3 horas, a 37°C em C02 a 5%. Todos os procedimentos seguintes foram realizados estritamente de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do "kit". As placas foram desenvolvidas utilizando conjugados, reagentes e tampões fornecidos pelo mesmo fabricante. O substrato, cloridrato de tetrametilbenzidina (TMB), requer leituras de DO a 450 nm, utilizando o leitor de placas disponível Titertek Multiskan MCC/340 (Laboratórios Flow).

Teste Plasmacute utilizando IgG de HSV-2 Bioleisa 24 0 ELISA de IgG de HSV-2 Biolelisa (BIOKIT, Espanha) é fornecido na forma de tiras contendo 8 poços revestidos com antigénio HSV-2 inactivado. As tiras são bloqueadas com 200 μΐ/poço de DMEM/FCS a 37°C em C02 a 5% durante 1 hora. Adicionaram-se 100 μΐ por poço da diluição adequada de linfócitos e incubou-se durante 3 horas a 37°C em C02 a 5%. Todos os restantes procedimentos foram realizados estritamente de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do "kit". As placas foram desenvolvidas utilizando conjugados, reagentes e tampões fornecidos pelo mesmo fabricante. O substrato, cloridrato de tetrametilbenzidina (TMB), requer leituras de DO a 450 nm, utilizando o leitor de placas disponível Titertek Multiskan MCC/340 (Laboratórios Flow).

Teste Plasmacute utilizando o teste de IgM de HSV Bioelisa (Imunocaptura) O teste de IgM de HSV Biolelisa (imunocaptura) (BIOKIT, Espanha) é fornecido na forma de tiras contendo 8 poços revestidos com anticorpos IgM anti-humano de coelho. As tiras foram bloqueadas com 2 00 μΐ/poço de DMEM/FCS a 3 7°C em C02 a 5% durante 1 hora. Adicionaram-se 100 μΐ por poço da diluição adequada de linfócitos e incubou-se durante 3 horas a 37°C em C02 a 5%. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Especificamente, o anticorpo ligado foi detectado com 100 μΐ/poço de antigénio HSV marcado com peroxidase de rábano (HSV purificado e inactivado que foi propagado in vitro em fibroblastos humanos) e para minimizar as reacções não específicas, antigénio controlo não marcado, que consiste de componentes celulares não infectados (fornecido com o kit) , 10 μΐ de antigénio HSV e 10 0 μΐ de antigénio controlo por tira. As placas foram lidas no leitor de placas disponível Titertek Multiskan MCC/340 (Laboratórios Flow) a 450 nm. 25 2 .

Os resultados da experiência são apresentados na Tabela 26

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Tabela Γ <L) fd CQ 4-> 0 fd (ϋ £ £ a CQ O o U 4J u [gM *H O o CQ <U fd a (U 0 0) 1 1 IIo LO ε fd Tí O rH CQ u Ή ’ 1 o co o fd 4-> •H V rH ω £ m PC Ti fd O tn fd CQ o o o <D 4-1 £ u fd B CQ fd rH a* CQ <υ 4-> CO d)

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Para o teste Plasmacute utilizou-se a D. O. > 0,2 como positivo e tabularam-se os números de linfócitos necessários para originar essa resposta.

Apenas o teste de IgG Bioleisa diz identificar anticorpos HSV2, enquanto que os outros irão indicar infecção com HSV (1 e/ou 2).

Resultados O paciente 1 tinha sintomas clínicos de uma infecção primária por HSV-2. Os testes do hospital não permitiram isolar o vírus a partir da amostra clínica e não se encontrou nenhum IgM pelos testes ELISA convencionais. Observou-se anticorpo IgG no soro em quantidades limiares pelos testes ELISA convencionais do hospital. Em concordância com estes resultados, não foram encontradas células que produzissem anticorpo IgM no teste Plasmacute. Ambos os testes

Plasmacute, de IgG da Behringer como de IgG Biolelisa detectaram células que produzem o anticorpo IgG contra HSV. Foram necessários 205000 linfócitos para se obter a absorvância limite no teste Plasmacute da Behringer e foram necessários 103 000 linfócitos no teste IgG Biolelisa para atingir a absorvância limite. 28 Γ u Ο paciente 2 estava a desenvolver uma infecção primária que foi confirmada por isolamento do vírus HSV do tipo-1. Não foi detectada IgM no soro pelo laboratório do hospital, mas detectou-se anticorpo IgG. No teste Plasmacute não foram detectadas nenhumas células que produzisem IgM, embora tanto o teste Plasmacute Behringer e Bioleisa detectaram células que produzem IgG, sendo necessárias 223 000 e 111 000 células, respectivamente. 0 paciente 3 tinha uma infecção por HSV-2 recorrente, que foi confirmada por isolamento do vírus HSV-2 a partir de espécimes clínicos. A IgG estava presente numa amostra de soro recolhida 2 dias após o início dos sintomas clínicos, no entanto não foi detectada nenhuma IgM no soro a esta altura. No teste Plasmacute não foi detectada nenhuma IgM aos 2 dias após o início dos sintomas clínicos, no entanto ambos os testes Plasmacute, Behringer e Biolelisa detectaram células que produzem IgG (são necessárias 48 000 - 96 000 células) . foram detectados anticorpos IgM no soro pelo hospital numa amostra de soro recolhida 2 0 dias após o início dos sintomas clínicos. Foram necessárias 182 000 células para produzir uma absorvância limite no teste Plasmacute de IgM da Behringer, no entanto não foram detectadas nenhumas células pelo teste Plasmacute de IgM Biolelisa. 0 paciente 4 tinha uma infecção primária por HSV. Não foram detectados nenhuns vírus na amostra clínica enviada para o laboratório do hospital. Foram detectados anticorpos IgM no soro em quantidades limiares e níveis positivos de anticorpos IgG no soro. Tanto os anticorpos IgM como IgG foram detectados no teste Plasmacute utilizando ambos os "kits" Behringer e Biolelisa em amostras de sangue recolhidas 5 e 19 dias (nenhuma IgM Behringer detectada) após o início dos sintomas clínicos. No teste Plasmacute, foram necessárias menos de 8000 células para o teste de IgM Biolelisa e 60 500 29

V

V

u ^ células para o teste de IgM Behringer, sendo necessário para cada um menos de 100 μΐ de sangue heparinizado.

Suspeitava-se que o paciente 5 tivesse uma infecção primária por HSV. No entanto, não foi isolado nenhum vírus pelo laboratório e não foram detectados nenhuns anticorpos no soro. No teste Plasmacute não foram detectadas nenhumas células que produzissem quer anticorpo IgG, quer IgM, contra HSV.

Discussão

Ficou demonstrado que o teste Plasmacute funciona tanto para infecções pelo vírus de herpes primárias, como recorrentes. Em todos os casos, o teste Plasmacute funcionou pelo menos tão bem quanto os procedimentos ELISA convencionais aqui utilizados. Em particular, para o paciente 1, embora não fosse isolado nenhum vírus a partir da amostra clínica e a determinação apenas fosse positiva no limiar (i.e. não conclusivo) pelo teste de rotina do hospital, o teste Plasmacute (IgG Bioleisa e IgG Behringer) mostrou que aproximadamente 100.000 células e 200.000 células, respectivamente, originaram um resultado positivo inequívoco. É possível que este paciente tivesse uma infecção dupla (HSV1 e HSV2) , da qual apenas o HSV1 foi recuperado do local por isolamento do vírus. Não se pode excluir a hipótese, no entanto, de o resultado HSV2 positivo (IgG Bioelisa) ser causado por uma reacção serológica cruzada. Para as duas amostras espaçadas no tempo para o paciente 4, a partir do qual não foram isolados vírus, o teste Plasmacute mostrou o desvio do número de linfócitos que produzem IgM e IgG específicos de herpes da fase anterior, em relação à fase posterior da infecção, o que é consistente com a dinâmica bem conhecida a seguir a uma infecção primária, confirmando claramente uma resposta imunitária activa. O teste Plasmacute de IgM Biolelisa era particularmente sensível, dado que eram 30 V ^^

necessários menos de 8.000 linfócitos para se obter um sinal positivo na primeira de duas amostras.

Os requerentes mostraram nesta experiência que o método Plasmacute funciona em casos clínicos de infecções virais no homem.

Experiência 5: Discos múltiplos - Revestimento de discos de nitrocelulose com anticorpos de captura específicos para anticorpos IgG, IgA e IgM

Esta experiência foi realizada a fim de estabelecer se um sistema de discos múltiplos poderia ser utilizado no teste Plasmacute para detectar anticorpos de diferentes especificidades.

Procedimento geral

Recolheram-se amostras de sangue total de dois indivíduos adultos saudáveis. Uma vez que estes indivíduos não estavam numa fase aguda de qualquer infecção, os requerentes visaram analisar a secreção espontânea de anticorpos IgG, IgM e IgA, independentemente da sua especificidade antigénica (desconhecida). O indivíduo 1 foi utilizado para estabelecer se um sistema que utiliza discos revestidos com 3 antigénios diferentes poderia ser utilizado num único poço no teste Plasmacute. Um poço (No. 1) O indivíduo 2 foi utilizado para estabelecer se existia um enfraquecimento do sinal na presença de vários discos revestidos com o mesmo antigénio. Três poços separados no teste Plasmacute (poços No. 2, 3 e 4).

Separação de linfócitos 31

V I—^ ^

Os linfócitos foram separados por centrifugação em gradiente de densidade de Lymphoprep (Nycomed) de sangue heparinizado. As células foram lavadas três vezes em PBS e resuspendidas em meio de cultura DMEM contendo FCS a 20%, L--glutamina 1 mM, penicilina 50IU/ml e estreptomicina 50 μ9/πι1 (DMEM/FCS). As células viáveis foram contadas por exclusão com azul de tripano (0,2 %)

Teste Plasmacute utilizando discos como fase sólida

Revestiram-se discos de ésteres mistos de celulose com um tamanho de poro de 8 μιτι (Millipore SCWP 013 00) com 10 μg/ml de anticorpos de cabra anti-humanos, específicos de classe (Sigma anti-IgG 1-3382; anti-IgA 1-0884; anti-IgM 1-0759) diluídos em PBS azida (0,001%), durante a noite à temperatura ambiente. Os discos foram bloqueados com DMEM/FCS a 37°C em C02 5%, durante 1 hora. Adicionaram-se os linfócitos a um poço translúcido claro com um tamanho de poro de 0,4 μΜ (Costar 3460), colocando os discos por baixo, e incubou-se durante 3 horas a 37°C em C02 a 5 %. Transferiram-se os discos individuais para poços separados de uma placa de 24 poços (Costar) e lavou-se 3 x com PBS e 3 x com PBS Tween (0,05 %). 0 anticorpo ligado foi detectado com 200 μΐ/poço de anticorpos de cabra anti-humanos específicos de classe, conjugados com peroxidase (Sigma IgG A-6029, IgA A-4165, IgM A-4290) diluído em DMEM/FCS e incubado durante 2 horas à temperatura ambiente. Os discos foram lavados para remover o anticorpo não ligado, como descrito anteriormente e desenvolvido utilizando 200 μΐ/poço de dicloridrato de o--fenilenodiamina (OPD) (Sigma P-7288) em tampão fosfato citrato 0,05 M (pH 5,0) . Trinta minutos após a adição de substrato o desenvolvimento foi parado utilizando 100 μΐ/poço de H2S04 1 M. Transferiram-se 100 μΐ por poço para uma placa ELISA de 96 poços (Placas EIA Greiner 655001 forma-F) e fez--se a leitura da D.O. num leitor de placas Titertek Multiskan MCC/340 (Laboratórios Flow) a 492 nm. 32

V

Os resultados da experiência são apresentados na Tabela 3, em que a leitura para cada anticorpo cativo é a média de poços em triplicado, expressa como absorvância x 1000. 33 Γ

U

Tabela

34 0 poço 1 continha 2 milhões de linfócitos, os poços 2-4 continham 1 milhão de linfócitos. A referência "célula" serve para indicar qual o número de disco que estava mais próximo da camada de células.

Resultados: O teste com o indivíduo 1 mostrou que mesmo 9 discos podiam ser facilmente utilizados no poço que contém os linfócitos. A resposta para os três discos de IgG, os três discos de IgA e os três discos de IgA era para todos os efeitos idêntica para cada conjunto, mostrando assim que a posição actual de um disco, relativamente aos linfócitos que segregam o anticorpo não é crítica. O teste com os linfócitos do indivíduo 2 mostrou que pelo menos 8 poços revestidos de forma idêntica podiam ser colocados num poço contendo linfócitos, para originar leituras praticamente idênticas. Assim, a invenção permite testes múltiplos para a mesma preparação de linfócitos num poço.

Lisboa, 25 de Janeiro de 2000. AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

35

Claims (19)

1. J Γ : u

   REIVINDICAÇÕES 1. Método para detectar a produção activa de anticorpos em resposta a um antigénio alvo numa amostra de sangue, em que o referido método compreende: a) contactar, na presença e ausência de um inibidor de síntese de proteínas, alíquotas da referida amostra, ou opcionalmente, de linfócitos directamente isolados a partir da referida amostra, com uma fase sólida, sob condições que permitam a produção e secreção de anticorpos pelos linfócitos; b) detectar, em solução, a ligação de anticorpos ao(s) referido(s) antigénio(s) na fase sólida; e c) comparar a referida ligação do anticorpo na presença ou ausência de inibidor de síntese de proteínas, de modo a determinar a quantidade de secreção activa de anticorpos em resposta ao(s) referido(s) antigénio(s).
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida fase sólida transporta um ou mais antigénios reconhecidos pelo anticorpo, ou anticorpos a ser detectados.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a fase sólida transporta um ou mais anticorpos que reconhecem o anticorpo ou anticorpos a ser detectados.
4. 4. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida amostra de sangue para utilização no método, ou para a preparação de linfócitos para utilização no método, tem um volume inferior a 1 ml.
5. 5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o método é realizado em amostras de sangue de recém-nascidos ou crianças, para distinguir entre 1 V

   Li —ç. anticorpos sintetizados de novo e anticorpos maternos transferidos de forma passiva.
6. 6. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a referida amostra de sangue é obtida por processos de purificação ou enriquecimento de sangue, recolhido directamente de um paciente.
7. 7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que os linfócitos isolados directamente a partir da referida amostra são utilizados no método.
8. 8. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que antes do passo de contacto de acordo com a reivindicação 1, o suporte sólido é bloqueado.
9. 9. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o inibidor de síntese de proteínas é cicloheximida utilizada a uma concentração de 50-500 pg/ml.
10. 10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que é utilizado o inibidor de ATPase em conjunção com 0 inibidor de síntese de proteínas.
11. 11. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que o passo de detecção de acordo com a reivindicação 1 é realizado por imunoensaio.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o imunoensaio é ELISA.
13. 13. Método de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 12, em que um ou mais antigénios reconhecidos pelo anticorpo ou anticorpos a ser detectados imobilizados na referida fase sólida são contactados com a referida fase sólida. 2
14. 14. Método de acordo com qualquer das reivindicações 2 e 4 a 12, em que um ou mais anticorpos que reconhecem o anticorpo ou anticorpos imobilizados na referida fase sólida são contactados com a referida fase sólida.
15. 15. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, em que se utiliza um substrato solúvel para o passo de detecção de acordo com a reivindicação 1 e se obtém um sinal detectável por espectrofotometria.
16. 16. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15, em que se utiliza um antigénio de controlo negativo.
17. 17. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, em que é detectada a produção activa de anticorpos contra o vírus de Herpes.
18. 18. Método de acordo com qualquer das reivindicações 2 e 4 a 17, em que se utilizam fases sólidas múltiplas, tendo cada uma um antigénio alvo diferente.
19. 19. Método para detectar a presença de indicadores de infecção não específicos numa amostra de sangue, em que o referido método compreende: contactar, na presença e ausência de um inibidor de síntese de proteínas, alíquotas da referida amostra, ou opcionalmente, de linfócitos directamente isolados a partir da referida amostra, com uma fase sólida, sob condições que permitam a produção e secreção de indicadores de infecção pelos linfócitos; detectar, em solução, a ligação de indicadores de infecção a um par de ligação na fase sólida; e comparar a referida ligação do indicador de infecção na presença ou ausência de inibidor de síntese de 3 proteínas, de modo a determinar a quantidade de indicadores de infecção na referida amostra. Lisboa, 25 de Janeiro de 2000 agente oficial da propriedade industrial Ir ^ M 4