KR101753580B1 - 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법 - Google Patents

브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 브루셀라 캐니스 항원, 상기 항원을 포함하는 브루셀라증 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 브루셀라증 진단용 키트 및 브루셀라증 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법으로 제조된 브루셀라 캐니스 항원을 이용 시 기존의 HS 방법으로 정제된 항원보다 민감도 및 특이도가 우수하고, 매우 높은 상관관계가 있어, 브루셀라증 진단에 활용할 수 있다.

Description

브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법{Method for Brucella canis antigen}
본 발명은 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 브루셀라 캐니스 항원, 상기 항원을 포함하는 브루셀라증 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 브루셀라증 진단용 키트 및 브루셀라증 진단 방법에 관한 것이다.
브루셀라증은 대표적인 인수공통 전염병(인체; 4군법정전염병, 가축; 2종법정전염병)이며 국내는 물론 전 세계적으로 공중보건학적으로나 경제학적으로 심각한 문제를 야기한다. 최근 국내에서는 개 등 반려동물에 대한 수요가 급증하고 있어 이를 매개로 하는 동물이나 사람으로의 감염가능성이 존재하고 있어 이에 대한 대책이 시급한 실정이다.
브루셀라증을 유발하는 브루셀라균은 부르셀라 아보터스(Brucella abortus)(소), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis)(양, 염소), 부르셀라 캐니스(Brucella canis)(개), 브루셀라 수이스(Brucella suis)(돼지) 등 11종이 알려져 있는데, 상기 4종은 모두 인체에 감염을 일으킬 수 있다. 국내에서는 B. abortus와 B. canis가 분리 보고되었다. 상기 브루셀라증이 발병되면, 인체에 감염될 경우 1 내지 3% 미만의 치사율을 보이고, 지속적 발열, 두통, 식욕부진 및 원기쇠약을 보이다가 심내막염, 뇌척수염 및 관절염 등 중증 질병으로 진행한다. 또한, 감염된 동물에서의 증상은 특별한 외부 증상이 없이 암컷에서는 태반염 및 자궁 내막염 등으로 인한 유산을 일으키고, 수컷에서는 고환염 및 기형 정자 등으로 인한 불임을 유발한다고 알려져 있다. 브루셀라균은 세포내에서 증식하며 발병을 일으키기 때문에 인체 감염의 경우 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하다. 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 등으로 인하여 치료방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발 되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다. 그러나, 동물에서 브루셀라증이 발병된 경우, 유산을 제외하고 특별한 증상 없이 장기간 보균자로 유지하면서, 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출한다. 브루셀라균의 세포 내 기생세균으로 일반적인 항생제에 의한 치료가 어렵고, 세포 내 탐식기 전 및 증식기 전 등 기전에 대한 연구결과가 많지 않다. 또한, 체내에 감염된 경우에도 면역원성이 낮아 면역세포가 형성되기 어렵기 때문에 백신개발에 대한 연구도 성과가 미미한 실정으로 상기 질환의 근절이 매우 어렵다는 문제가 있다.
브루셀라증의 진단은 혈청학적 진단법을 이용하여 스크리닝 및 모니터링하고 있으며 여기에 사용되는 주요 진단법은 LPS(lipopolysaccharide)가 포함된 균체 항원을 이용하여 다양한 응집반응법으로 진단할 수 있다. 또한, 정제된 LPS나 지질(lipid)이 제거된 O-polysaccharide(OPS)를 항원으로 이용하여 indirect 또는 competitive ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용하거나 FPA(fluorescence polarization assay)법을 이용하여 진단할 수 있다. 하지만 개 브루셀라증의 원인체는 B. canis로 균체 표면에 LPS가 결여된 R형주(rough strain)이므로, 기존 브루셀라증 진단에 응용되는 대부분의 진단방법을 사용할 수 없는 실정으로 진단에 큰 어려움을 겪고 있다. 지금까지 알려진 방법으로는 균체를 이용한 RSAT(rapid slide agglutination test)법, HS(hot saline)방법으로 추출한 항원을 이용한 AGID(agar gel immunodiffusion)법이나 ICT(immunochromatography test kit)법을 사용할 수 있는 것으로 알려져 있으나, 이들 방법은 민감도가 낮고 비특이 반응이 많아 검출효율이 낮으므로 새로운 진단법의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 브루셀라증을 효과적으로 진단할 수 있는 방법을 연구한 결과, 브루셀라 캐니스에서 유래하고 R형-LPS를 제거하여 분리 및 정제된 혼합 단백질을 항원으로 이용 시, 기존의 HS 방법으로 정제된 항원보다 민감도 및 특이도가 우수하여 브루셀라증 진단에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 제조 방법에 의해 제조된 브루셀라 캐니스 항원을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 항원을 포함하는 브루셀라증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 브루셀라증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 브루셀라증 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 1) 브루셀라 캐니스(Brucella canis)의 배양액에 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 처리하여 브루셀라 캐니스 유래 혼합 단백질을 수득하는 단계; 및 2) 상기 1)의 혼합 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 브루셀라 캐니스 항원을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 항원을 포함하는 브루셀라증 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 브루셀라증 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명의 목적은 생물학적 시료로부터 상기 항원을 이용한 항원-항체 반응을 수행하여 브루셀라증 발병 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 브루셀라증 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법으로 제조된 브루셀라 캐니스 항원을 이용 시 기존의 HS 방법으로 정제된 항원보다 민감도 및 특이도가 우수하고, 매우 높은 상관관계가 있어, 브루셀라증 진단에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 TCA 항원의 단백질 분자량 및 면역 반응을 2D SDS-PAGE(A) 및 western blot(B)을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 TCA 항원의 성분을 MALDI-TOF MS로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 1) 브루셀라 캐니스(Brucella canis)의 배양액에 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 처리하여 브루셀라 캐니스 유래 혼합 단백질을 수득하는 단계; 및 2) 상기 1)의 혼합 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "브루셀라 캐니스(Brucella canis)"는 개에 브루셀라증을 일으키는 원인균으로, 응집반응에 의하면 A, M 항원이 없고, R항원은 있다. 따라서, R 형주(rough strain)인 브루셀라 캐니스는 S 형주(smooth strain)인 부르셀라 아보터스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis) 등과 달리 S형-LPS(smooth-lipopolysaccharide)가 결여되어 혈청학적 진단에 많은 어려움이 있다.
상기 브루셀라 캐니스는 M-주(strain)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 브루셀라 캐니스 유래 혼합 단백질은 세포외막단백질 31(outer membrane protein 31, omp31), GroES 단백질, MerR 패밀리 전사 제어인자(MerR family transcriptional regulator), 네스프린-1(nesprin-1), DNA-의존성 RNA 중합효소 서브유닛 베타(DNA-directed RNA polymerase subunit beta) 및 금속 의존성 인산가수분해효소(metal dependent phosphohydrolase)을 포함하며, 상기 혼합 단백질은 R형-LPS(rough-lipopolysaccharide)가 제거되고, 내열성인 특성을 가지고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "LPS(lipopolysaccharide)"는 지질다당류로서 그람음성세균 표층의 펩티드글리칸을 둘러싸는 외막의 중요 구성성분이다. 크게 O 항원(O antigen 또는 O polysaccharide), 코어 올리고당(Core oligosaccharide) 및 지질 A(Lipid A)로 나눌 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 " R형-LPS"는 LPS의 일종으로, LPS의 O 항원의 O-체인의 여부에 따라 R형-LPS 및 S형-LPS로 나눌 수 있다. 전체 길이의 O-체인이 존재 시 S형-LPS이고, O-체인이 부족하거나 결여되었을 때 R형-LPS이다.
본 발명에 있어서, 상기 "세포외막단백질 31(outer membrane protein 31, omp 31)"은 잠재적 면역원성 및 보호 항원으로서의 특징이 있다. 브루셀라 아보터스(Brucella abortus)는 이 부분의 유전자 일부가 결손되어 있고 이를 제외한 모든 브루셀라 종에서 높은 유전자 상동성을 보이고 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 브루셀라 캐니스 M-주(strain)의 배양액을 멸균한 다음 원심하여 상층액을 회수하여 내열성 항원을 추출하고 여기에 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 처리하여 R형-LPS를 제거하였다. 이후, 혼합 단백질을 분리 및 정제하여 브루셀라 캐니스 유래의 단백질을 수득하였으며, 이를 "TCA 항원"이라 명명하였다. 본 발명자들은 상기 과정을 통해 수득된 본 발명의 TCA 항원을 분석한 결과, 세포외막단백질 31(outer membrane protein 31, omp31), GroES 단백질, MerR 패밀리 전사 제어인자(MerR family transcriptional regulator), 네스프린-1(nesprin-1), DNA-의존성 RNA 중합효소 서브유닛 베타(DNA-directed RNA polymerase subunit beta) 및 금속 의존성 인산가수분해효소(metal dependent phosphohydrolase)을 포함하며, 내열성의 특징을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 TCA 항원을 이용하여 Indirect ELISA를 수행하여 개의 브루셀라증을 진단한 결과, 기존의 HS 방법으로 정제 및 분리된 HS 항원과 비교하여 본 발명의 TCA 항원을 이용 시, 민감도 및 특이도가 HS 항원보다 높고, 브루셀라증과 매우 높은 상관관계가 있음을 확인하여, 본 발명에 따른 TCA 항원이 개의 브루셀라증의 진단에 효과적임을 확인하였다.
또한 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 브루셀라 캐니스 항원을 제공한다.
본 발명에 있어서, "항원"은 생체에 면역 반응을 일으키게 하는 물질로서, 항원과 대응하는 항체와 결합한다.
또한 본 발명은 상기 항원을 포함하는 브루셀라증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "브루셀라증(brucellosis)"은, 다양한 브루셀라균의 감염에 의하여 발병되는 전염병을 의미하며, 인체에 감염될 경우 1-3% 미만의 치사율을 보이고, 지속적 발열, 두통, 식욕부진, 원기쇠약을 보이다가 심내막염, 뇌척수염 및 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 된다. 감염된 동물에서 보이는 증상은 특별한 외부 증상이 없으나, 암컷에서는 태반염 및 자궁 내막염 등으로 인한 유산을 유발하고, 수컷에서는 고환염 및 기형정자 등으로 인한 불임을 유발한다.
본 발명에서 있어서, 상기 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 브루셀라증의 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 진단용 조성물은 브루셀라증 진단용 항원 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함할 수 있다.또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위 원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane;Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 브루셀라증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한 본 발명의 목적은 생물학적 시료로부터 상기 항원을 이용한 항원-항체 반응을 수행하여 브루셀라증 발병 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 브루셀라증 진단방법을 제공한다.
상기 진단 방법은 Indirect ELISA(Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), Direct ELISA, Sandwich ELISA, competitive ELISA, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법으로 이루어진 군에서 선택할 수 있으며, 바람직하게는 Indirect ELISA를 이용하나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 브루셀라 캐니스( Brucella canis )의 단백질 추출 및 정제
브루셀라 캐니스 배양액에서 R형-LPS(rough-lipopolysaccharide)를 제거한 단백질을 추출하고 이를 정제한 항원을 수득하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 브루셀라 캐니스 M-주(strain)를 5% 소태아혈청(bovine serum)이 첨가된 브루셀라 아가(brucella agar)에 48시간 배양한 후 0.85% 생리식염수(saline)로 균을 회수하였다. 그 후, 8,000g로 3회 원심 침전하여 세척하고 D.W에 희석(wet g당 5ml)하여 오토클레이브(autoclave)한 다음 15,000g, 20분조건으로 원심 분리하여 상층액을 회수하고 0.45㎛ 공극의 크기를 갖는 막에 여과하였다.
상기 여과하여 회수된 상층액은 각각 다른 두가지 방법으로 정제하여 그 항원성을 평가하였다. 첫번째 방법은 기존에 알려져 있는 HS(hot saline) 방법으로서, 상층액을 100,000g 및 6시간 조건으로 다시 원심침전하고 침전된 단백질을 1/10으로 농축하였다. 그 후, D.W로 부유시키고 초음파 분해기(sonicator)로 균질화하여 수득한 단배질을 HS 항원(HS antigen)으로 사용하였다. 두번째 방법은 R형-LPS를 제거하는 방법으로, 상층액에 약 5% 농도의 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 추가하여 잔존하는 단백질을 침전시킨 후 15,000g, 20분 조건으로 원심 분리하여 상층액을 제거하는 것으로 R형-LPS를 제거하였다. 그 후, 원래의 용량(wet g당 5ml)으로 침전물을 회수한 다음 약 100배 용량의 PBS로 3~5회 교환하면서 48~72 시간 동안 투석(MWCO 10,000)하여 TCA를 제거였고 그 후 투석막 내의 R형-LPS가 제거된 단백질을 회수하여, TCA 항원(TCA antigen)으로 사용하였다.
실시예 2. 신규한 TCA 항원의 성분 분석
상기 실시예 1에서 수득한 TCA 항원의 성분을 분석하였다.
구체적으로, 2D SDS-PAGE(pH 4-7 nonlinear gradient strip, 9-16% linear gradient polyacrylamide gels)를 수행하여 TCA 항원을 전개하고 CBB G-250으로 염색하여 TCA 항원의 단백질 분자량을 관찰하였다(도 1의 (A)). 또한, TCA 항원을 PVDF 멤브레인(GE healthcare, USA)으로 옮겨 2% 스킴밀크(skim milk)로 처리한 다음 양성 또는 음성혈청을 반응시켰다. 그 후, 항-개 IgG 컨쥬게이트(anti-dog IgG conjugate, KPL, USA)를 넣고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit(Gendepot, USA)로 처리한 후, 웨스턴 블랏을 수행한 후 Chemi-doc(FluroChem Q, USA)을 이용하여 면역반응을 분석하였다(도 1의 (B)).
상기 분석을 통하여, 면역반응을 보이는 스팟을 염색된 겔의 항원과 대조한 후, 총 23개의 단백질 스팟을 추출하여 MALDI-TOF MS로 분석한 후 단백질을 동정하였다(도 2). 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 총 23개의 단백질 스팟이 면역원성이 있음을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 도 1에서 면역원성을 갖는 23개 스팟 중 17개의 스팟의 대략적인 분자량이 25.2 kDa이고, pI값이 5.22임을 확인하여, 본 발명의 TCA 항원의 성분은 Omp31(Outer membrane protein 31)이 주요 항원임을 확인하였다. 이 밖에 GroES 단백질, MerR 패밀리 전사 제어인자(MerR family transcriptional regulator), 네스프린-1(nesprin-1), DNA-의존성 RNA 중합효소 서브유닛 베타(DNA-directed RNA polymerase subunit beta), 금속 의존성 인산가수분해효소(metal dependent phosphohydrolase)등의 성분이 확인되었다.
실시예 3. Indirect ELISA를 이용한 TCA 항원의 브루셀라증 진단
실시예 1의 종래의 HS 방법으로 정제된 HS 항원과 본 발명의 신규한 방법으로 정제된 TCA항원을 이용하여 브루셀라증의 진단능을 비교 평가하기 위해, Indirect ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에 따라 종래의 HS 방법으로 정제된 HS 항원과 본 발명의 신규한 방법으로 정제된 TCA항원 각각을 코팅 버퍼(coating buffer)을 이용하여 1:1000으로 희석하였다. 그 후 100ul씩 웰에 분주하여 4℃로 밤새도록 부착시키고 2% 스킴밀크 로 차단(blocking)하였다. 그 후 1:100으로 희석된 혈청을 넣은 뒤, 항-개 IgG 컨쥬게이트하고 ABTS 기질(substrate)을 넣어 10분 후에 405nm에서 OD값을 측정하였다. 매 단계마다 0.05% tween 20이 함유된 PBS로 3-4회 세척하고 다음 단계를 수행하였다. 본 발명의 TCA항원 및 HS 항원을 비교하기 위하여, 균 분리가 확인된 개 브루셀라증 양성혈청(n=52) 및 음성혈청(n=131)(사육중인 모든 개가 혈청학적으로 음성(RSAT/Dip-stick)이며 균 분리 음성)을 사용하였다. indirect-ELISA 결과는 음성혈청 평균에 3배의 표준편차를 더한 값을 컷-오프(Cut-off)로 활용하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112015081862544-pat00001
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 TCA 항원은 86.5%의 민감도 및 99.2%의 특이도가 나타남을 확인하였다. 또한, 본 발명의 TCA 항원은 일치율이 0.96으로 브루셀라 균 분리 여부와 매우 높은 상관관계가 있음을 확인하였다. 따라서, 기존의 방법으로 정제한 HS 항원보다 R형-LPS를 제거한 본 발명의 TCA 항원은 브루셀라증의 진단에 효과적임을 확인하였다.

Claims (10)

1) 브루셀라 캐니스(Brucella canis)의 배양액에 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 처리하여 R형-LPS(rough-lipopolysaccharide)가 제거된 브루셀라 캐니스 유래 혼합 단백질을 수득하는 단계;
2) 상기 1)의 혼합 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 브루셀라 캐니스 항원을 제조하는 단계; 및
3) 상기 항원을 이용한 항원-항체 반응을 수행하여 브루셀라 캐니스 감염 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 브루셀라 캐니스 감염 여부 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 1)의 브루셀라 캐니스는 M-주(strain)인 것을 특징으로 하는, 브루셀라 캐니스 감염 여부 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 2)의 혼합 단백질은 세포외막단백질 31(outer membrane protein 31, omp31), GroES 단백질, MerR 패밀리 전사 제어인자(MerR family transcriptional regulator), 네스프린-1(nesprin-1), DNA-의존성 RNA 중합효소 서브유닛 베타(DNA-directed RNA polymerase subunit beta) 및 금속 의존성 인산가수분해효소(metal dependent phosphohydrolase)을 포함하는 것을 특징으로 하는 브루셀라 캐니스 감염 여부 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 항원-항체 반응은 Indirect ELISA(Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), Direct ELISA, Sandwich ELISA, competitive ELISA, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분석법을 이용하는 것을 특징으로 하는 브루셀라 캐니스 감염 여부 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 2)의 혼합 단백질은 내열성을 갖는 것을 특징으로 하는 브루셀라 캐니스 감염 여부 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
삭제
1) 브루셀라 캐니스(Brucella canis)의 배양액에 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 처리하여 R형-LPS(rough-lipopolysaccharide)가 제거된 브루셀라 캐니스 유래 혼합 단백질을 수득하는 단계; 및
2) 상기 1)의 혼합 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 브루셀라 캐니스 항원을 제조하는 단계; 를 통해 제조되는 브루셀라 캐니스 항원을 포함하는 브루셀라 캐니스 진단용 조성물.
제7항의 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 진단용 키트.
삭제
삭제
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