HU225687B1 - Detection of antibody production - Google Patents
Detection of antibody production Download PDFInfo
- Publication number
- HU225687B1 HU225687B1 HU9801448A HUP9801448A HU225687B1 HU 225687 B1 HU225687 B1 HU 225687B1 HU 9801448 A HU9801448 A HU 9801448A HU P9801448 A HUP9801448 A HU P9801448A HU 225687 B1 HU225687 B1 HU 225687B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibodies
- solid phase
- antibody
- sample
- lymphocytes
- Prior art date
Links
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 title claims description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 89
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 79
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 78
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 78
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 61
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 43
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 41
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 41
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 39
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 37
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 9
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 claims description 8
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical group C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 claims description 8
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 8
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 3
- 239000000362 adenosine triphosphatase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 2
- 229940121819 ATPase inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 41
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 34
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 13
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 11
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 5
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- HRDVWDQQYABHGH-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-N,N-dimethylaniline hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)c1ccc(cc1)-c1ccc(cc1)N(C)C HRDVWDQQYABHGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- -1 sheets Substances 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003622 anti-hsv Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 description 2
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 206010061308 Neonatal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000007819 coupling partner Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány antitesttermelés, különösen fertőzés, védőoltás stb. hatására a vérben bekövetkező aktív antitesttermelődés kimutatására szolgáló eljárásra vonatkozik módosított ELISA módszerrel.
Az ELISA módszer régóta használatos antitestek (vagy antigének) kimutatására és mérésére. Az ELISA legáltalánosabban szerológiai próbaként használatos, és használják az antigének és antitestek immunkémiai tulajdonságainak vizsgálatára is, sőt gyakran használatos még például az immunválaszok kiértékelésére és jellemzésére, valamint az antitesttermelődés kutatására sejtkultúrákban és hibridómatechnológiákban stb.
Érzékenységének, egyszerűségének, könnyű alkalmazhatóságának, valamint gyorsaságának köszönhetően ezt a technikát széles körben adaptálták diagnosztikai célokra, és napjainkban rutinszerűen használják klinikai laboratóriumokban fertőzést vagy védőoltást követően megjelenő antitestek kimutatására a plazmában, szérumban, illetve fertőző anyagokban, (gy például nagyon sok HIV-fertőzés kimutatására szolgáló teszt vírusantitesteknek a beteg szérumában vagy plazmájában hétköznapi ELISA teszttel való kimutatásán alapszik.
Az ilyen egyszerű szerológiai ELISA teszt azonban egyszerűen a mintában jelen lévő, megcélzott antitestet méri, nem tesz különbséget az antigén hatására folyó antitestszintézis, illetve egy korábbi fertőzés hatására már jelen lévő antitestek, valamint passzív immunizálással bekerült antitestek között. Amíg néhány esetben elég lehet egyszerűen meghatározni azt, hogy jelen van-e bizonyos antitest, addig más esetekben azt is szükséges tudni, hogy a kimutatott antitest vajon akut módon termelődik-e a limfocitákban a vizsgálat időpontjában - például védőoltás hatására -, vagy például újszülöttek fertőzöttségének diagnózisánál meg kellene különböztetni a passzív módon továbbadott anyai eredetű antitestektől. Ezt a célt nem lehet elérni a hagyományos ELISA módszerekkel.
Ezért más módszereket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik a folyamatban lévő antitesttermelés kimutatását. Ebben a tekintetben különösen megemlíthető az enzimhez kapcsolt immunospot (ELISPOT) próba (ismeretes még mint spot ELISA vagy ELISA-plak módszer), melyet például Czerkinsky és munkatársai említenek összefoglaló közleményükben (ELISA and other Solid Phase Immunoassays, kiadó: D. M. Kenneny and S. J. Challacombe, 1988, 10. fejezet, 217-239. old.). Ez a technika ELISA módszeren alapszik, és lehetővé teszi olyan limfociták számlálását, amelyek egy vagy több, célzott antigén elleni antitestet termelnek. Az ELISPOT alapvetően az ELISA módszer változata, amelyben az antitestet kiválasztó sejteket láthatóvá teszik azáltal, hogy a limfocitákat speciálisan módosított ELISA lemezben tenyésztik, amelyeknek a fala a célzott antigénnel van borítva, és a hagyományos ELISA reagenst speciális enzim-szubsztrátum komplexszel helyettesítik, amely színes csapadékot képez (spots) az antitestet kiválasztó sejtek (ASC) határánál. A pontokat (spots) megszámlálva kapják a kiválasztósejtek számát. A tápfolyadékhoz adott, fehérjeszintézist gátló szerekkel igazolható, hogy a kimutatott pontok az in vitro inkubálás alatti de novo antitestszintézis következményei.
Amíg az ELISPOT technika nagyon hasznosnak bizonyult a humorális immunválasz dinamikájának tanulmányozása során, és használható a spontán ASC kimutatásában, melyek az immunizált egyed perifériás keringésében tranziens módon jelennek meg, a módszer bizonyos sajátságai korlátozzák használatát a klinikai diagnosztikai környezetben. Először is, mivel minden mintában az egyedi pontokat meg kell számolni, ami nagyon időrabló és munkaigényes, így a módszer nem különösebben alkalmas egy klinikai diagnosztikai laboratóriumban előforduló nagyszámú minta elemzésére. Másodszor, csak az antitestet kiválasztó sejtek számát határozza meg az egyes mintákban, és általánosságban azt mondhatjuk, hogy ez is aránylag nagy mintatérfogatot igényel, nevezetesen néhány millilitert. Az ELISPOT lemezek emellett drágák is, és a módszer megközelítőleg sem automatizálható.
Az antitestkimutatási technika fejlődése ellenére továbbra is igény van olyan gyors, egyszerű és gazdaságos tesztre, amely lehetővé teszi a spontán kiválasztott antitestek megbízható meghatározását, a de novo antitestszintézis megkülönböztetését, és különösen alkalmas vérmintákon végzett diagnosztikai meghatározásokra. A jelen találmány ezt a célt szolgálja.
A találmány tehát egyrészt egy olyan módszerre vonatkozik, amely egy célzott antigénre válaszképpen történő aktív antitesttermelés vérmintából történő kimutatására szolgál, amelynek során a minta aliquot mennyiségét vagy adott esetben az említett mintából közvetlenül izolált limfocitákat fehérjeszintézist gátló anyagok jelenlétében és anélkül szilárd felülettel érintkeztetjük olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a limfociták antitesttermelését és kiválasztását;
az oldatban detektáljuk az antitesteknek az említett antigénekhez a szilárd fázison való kötődését; és a fehérjeszintézist gátló szerek jelenlétében és távollétében végbemenő antitestkötődést összehasonlítjuk, így megkapjuk az említett antigén elleni aktív antitesttermelődés mértékét.
Az „aktív antitesttermelődés kifejezésen a mintában lévő limfociták által spontán kiválasztott antitesteket értjük, mely limfociták aktívan termelnek antitestet a teszt ideje alatt, ami a folyamatban lévő aktív immunválasz következménye. A találmány szerinti teszt során az antitestek minden esetben az in vivő jelen lévő antigének ellen termelődnek, nem pedig az in vitro jelen lévők ellen.
Az „említett antigén elleni aktív antitestkiválasztás” kifejezésen azt értjük, hogy az aktívan kiválasztott antitest kötődik a tesztben használt antigénhez, bár a használt antigénnek nem kell mindenképpen az elsősorban immunválaszt stimuláló immunogénnek lennie, így míg a tesztben használt antigén és az immunogén, amelyik stimulálta vagy stimulálja az antitesttermelődést in vivő, a gyakorlatilag azonos vagy nagyon hasonló epitopok révén egyaránt kötődhet a kimutatandó
HU 225 687 Β1 antitesthez, addig más szempontból az antigén és az immunogén lehet eltérő is. így míg a találmány szerinti módszerben használt antigén olyan anyag lehet, amely a releváns immunogén egészét vagy annak részeit tartalmazza (például fertőzött egyedekből származó vagy tisztított antigént, illetve immunogént, valamint ezek részeit), addig az antigén szintetikusan is előállítható, például kémiai szintézissel vagy rekombináns expresszióval, a natív antigénhez hozzáadott, illetve elvett szekvenciákat alkalmazva. így fúziós fehérjéket vagy csak a megfelelő epitopo(ka)t expresszáló molekulákat is használhatunk.
Általánosságban elmondható, hogy a találmány szerinti eljárás magában foglalja a vérmintából izolált limfociták inkubálását egy, a kimutatandó antitestek immobilizálásához megfelelő szilárd felülettel érintkeztetve - olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a limfociták antitesttermelését és kiválasztását -, és azután a sejtek eltávolítását, majd az antitestek antigénekhez való kötődésének kimutatását a szilárd fázison. Összehasonlítva a fehérjeszintézist gátló szer jelenlétében és távollétében az antitestek kötődésének kimutatott mértékét, a de novo antitesttermelés megkülönböztethető és mennyiségileg meghatározható.
Meglepő módon a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi kicsiny vérmintamennyiségek használatát (például μΙ-es vagy 1 ml-nél kisebb térfogatok), a nem stimulált limfociták spontán antitesttermelésének közvetlen detektálását, a limfociták előzetesen, a szilárd fázison való inkubálás előtt végzett tenyésztése nélkül is. Más szavakkal: a mintában lévő limfociták közvetlenül felhasználhatók a találmány szerinti teszteljárásban, minden előzetes kezelés és stimulálás, például antigénnel végzett in vitro stimulálás nélkül. így a limfocitáknak a mintavétel idejében történő antitesttermelése is kimutatható. Ily módon még a kis térfogatok használata esetén is megkülönböztethető az antigén elleni spontán, folyamatban levő antitesttermelése a limfociták „bystander aktiválódásától. Továbbá a limfocitákat olyan körülmények között is vizsgáljuk, amikor spontán választanak ki antitesteket, a sejtek stimulálás nélkül felfedik a memóriájukat. Ebben különbözik más publikált eljárásoktól, amelyek in vitro antigénstimulálást használnak, hogy megnöveljék a tesztérzékenységet. A találmány másrészt kihasználja a spontán antitestkiválasztást arra, hogy lehetővé tegye a vérben lévő olyan antitestek kimutatását, amelyek egy folyamatban levő fertőzést jeleznek, mivel a plazma limfocitái antitesteket választanak ki a tesztelt antigénnel szemben a fertőzés vagy védőoltás stb. utáni néhány első héten. Az ilyen antitestek kimutatása a találmány szerinti módszerrel lehetővé teszi fertőzések diagnosztizálását és meghatározását, illetve a védőoltás hatására bekövetkező antitestválasz nyomon követését stb. Ez különösen hasznos gyermekek és újszülöttek esetében, amikor fontos, hogy megkülönböztessük az újonnan termelődött antitesteket a passzív módon továbbadott anyai eredetű antitestektől. Ugyanabból a vérmintából több, különféle fertőző ágens ellen termelődött antitestet is meghatározhatunk, akár külön tesztekkel, akár ugyanazzal az egy teszttel, több releváns antigén használatával. így lehetővé válik, hogy azt a megfelelő, releváns kontaktantigént használjuk, amely megfelel a betegnél megnyilvánuló klinikai szindrómáknak. Fertőzések diagnosztizálása során az is fontos, hogy meg lehessen különböztetni az éppen termelődő antitesteket a korábbi fertőzések következtében meglévőktől. Az immunológiai memória in vitro antigénstimulációval történő felidézése nem egyeztethető össze egy olyan teszttel, melynek célja az éppen zajló akut fertőzés meghatározása, ezért a korábbi antigénstimulációs módszerek nem nyújtják ezt az előnyt. Az antigénstimulációs lépés beiktatása szintén veszélyeztetné a találmány szerinti módszer előnyös időfaktorát, ami a többi, korábbi módszerhez viszonyított gyorsaságában mutatkozik meg.
A találmány szerinti, antitesteknek antigénekkel történő kimutatására szolgáló módszerben alkalmazhatók mind a virális, mind pedig a bakteriális antigének. Klinikailag fontos antigének például - a korlátozás szándéka nélkül - a Herpes simplex vírus, Cytomegalovirus, humán immunhiány vírus (HÍV) és a Hepatitis vírus antigének. Ezen antigének kimutatása használható annak gyors, például vérvétellel történő eldöntésére, hogy a vizsgált beteg fertőzött-e, valamint a kimutatás alkalmazható a fertőzés megállapítására és nyomon követésére. A módszer különösen hasznos, egyszerűségének köszönhetően, és használható akkor is, ha bonyolult műszerek nem állnak rendelkezésre, például tábori körülmények között.
A „kimutatás” és „mennyiség meghatározása” kifejezések az antitesttermelés szintjének mind minőségi, mind mennyiségi becslésére vonatkoznak, abban az értelemben, hogy egy abszolút értéket kapunk a mintában termelt antitest mennyiségére, míg az „indexarány, százalék vagy hasonló kifejezések félkvantitatív vagy minőségi becsléseket jelentenek.
A találmány szerinti módszer fő előnye, hogy kis mintamennyiséget igényel, például 50-500 μΙ, előnyösen 100-300 μΙ, szokásosan 100-200 μΙ vért vagy vérterméket, ami összemérhető a vérmintaforrással, ellentétben a klasszikus diagnosztikus tesztekkel, amelyek általában néhány ml vérszérum használatán alapulnak. Ez különösen előnyös az újszülöttektől történő vérvétel esetében, mert a találmány szerinti módszer csak néhány μΙ térfogatú mintát igényel.
A vérmita, általában perifériás vérminta, használható közvetlenül, bár tanácsos lehet először limfocitákat izolálni a mintából. Ezt hagyományos technikákkal, ismert módon végezhetjük. így különböző teljesvér-készítmények használhatók, például heparinozott vér vagy EDTA-val kezelt vér stb., ahogyan azokat rutinszerűen előállítják a klinikai laboratóriumok. Bár nem lényeges, a mintában jelen lévő eritrocitákat lizáltathatjuk szokásos módon, például desztillált vízzel vagy ammónium-kloriddal rövid ideig kezelve, vagy más jól ismert hemolizálótechnikát alkalmazva. Nyilvánvaló azonban, hogy a dúsított vagy tisztított készítményeknek tartalmazniuk kell a vizsgálatba vont teljes vérben jelen lévő limfocitákat, hogy a spontán antitestterme3
HU 225 687 Β1 lést kimutathassuk. Kívánt esetben a limfocitákat elkülöníthetjük, például szokásos limfocitaelválasztó médiummal, mint amilyen például a Lymphoprep (Nyegaard Co., Oslo, Norvégia), vagy immunmagnetikus elválasztóeljárással (IMS), vagy hasonló, szilárd fázison alapuló elválasztási eljárásokkal vagy más közönséges technikákkal. Az IMS vagy hasonló szeparálás! technikák esetében a szilárd fázist (például a mágneses gyöngyöcskéket) olyan antitestekkel borítjuk, amelyek specifikusak leukociták néhány sorozatára, és ezt használhatjuk a hasznos leukociták szelektív elkülönítésére. Ha elkülönített limfocitákat használunk, a sejteket hagyományos mosási eljárásokkal moshatjuk felhasználásuk előtt. Megfigyeltük azonban, hogy a sejtek erőteljes mosása nem kívánatos. Amennyiben nem végzünk erőteljes mosást, úgy a sejtek életképessége fokozódik, és így a módszer gyorsabb.
A vérmintát - kívánt esetben a fenti módon történt kezelés után - vagy a hagyományos módon elkülönített limfocitákat azután érintkeztetjük egy olyan alkalmas kapcsolódó partnert hordozó szilárd fázissal, amely megköti a kimutatandó antitestet vagy antitesteket. A kapcsolópartner előnyösen az a tesztantigén vagy -antigének, amelyet vagy amelyeket a kimutatandó antitest vagy antitestek felismernek.
A találmány szerinti módszer egyik foganatosítási módja eljárás aktív antitesttermelés kimutatására, amelynek során (i) az említett minták aliquot mennyiségét vagy adott esetben az említett mintából közvetlenül izolált limfocitákat fehérjeszintézist gátló szerek jelenlétében és anélkül olyan szilárd fázissal érintkeztetjük, amely egy vagy több olyan antigént hordoz, amelyet a kimutatandó antitest vagy antitestek felismernek;
(ii) az oldatban detektáljuk az antitestek antigén(ek)hez való kötődését; és (iii) az említett antitestek fehérjeszintézist gátló szer jelenlétében és anélkül végbemenő kötődését összehasonlítjuk, így a szóban forgó antigén(ek) elleni aktív antitesttermelés mértékét kapjuk.
Eljárhatunk úgy is, hogy olyan kötőpartnert, például A-proteint, G-proteint vagy olyan antitesteket használunk, amelyek felismerik a kimutatni kívánt antitestet, és kötődnek hozzá. Ez utóbbi esetben nem kívánunk meg olyan nagyon specifikus kötődést, mivel a vizsgálati módszernek ebben a megvalósítási módjában specificitást vezetünk be oly módon, hogy az antigéneket, amelyek specifikusan kötődnek a kimutatni kívánt antitesthez, egymás után kötjük meg. (gy minden megvalósítási módban specifikus antigén-antitest komplexet képezünk. Az ilyen, szilárd felülethez rögzített komplexek jelenlétét határozzuk meg a találmány szerinti módszer kimutatási lépésében. A szilárd fázis lehet bármely jól ismert hordozó vagy mátrix, amelyet napjainkban széles körben használnak vagy javasolnak rögzítésre vagy elkülönítésre. Ezek lehetnek diszkrét részecskék, lapok, gélek, filterek, membránok vagy mikrotitrálólemezek, csövek, lapok stb., és alkalmasan valamilyen polimerből készülnek. A könnyű használat és egyszerűség miatt alkalmasan szabványos mikrotitrálólapokat és vályúkat, előnyösen a szabványos ELISA tálcákat használjuk.
A szilárd fázis módosítható, hogy lehetővé tegye számos különböző antigénekre specifikus antitestek kimutatását. Így például a lemezek vagy csíkok stb. számára megfelelő anyag, például a nitro-cellulóz vagy hasonló anyagok, különböző antitestekkel boríthatok, illetve egyidejűleg mikrotitermélyedésekbe vagy olyan egyéb alkalmas edényekbe vihetők, amelyek nem tartalmaznak semmilyen kontaktantigént. Antitestkötődés-kimutatási módszereket használva aztán megkülönböztethetjük az egyes antigéneket. A feltételezett betegséget okozó ágens azonosítására olyan korongsorozatokat használhatunk, amelyek mindegyike más-más klinikai tünetnek megfelelő antigénnel van bevonva. A korongok azután egyedileg kezelhetőek elkülönített mélyedésekben. Ez egy különösen anyagtakarékos eljárás, mivel a teszteket egyszerre hajthatjuk végre, egyidejűleg tesztelve számos különböző antigént ugyanabból a kis vérmintából (akár az azonos fertőző anyagból, akár különböző anyagokból, a klinikai szindrómának megfelelően). Eljárhatunk úgy is, hogy többfelé osztott vérmintát használunk, különböző mélyedésekben, amelyek különböző kötődésű ágensekkel, például antigénekkel vagy antitestekkel vannak beborítva, és eszerint folytatjuk le a próbát.
A kötőpartner, például antitest szilárd fázishoz való rögzítésének technikája jól és széleskörűen tárgyalt az irodalomban. Sok antigénrögzftési eljárás van leírva például az ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects című (1988, eds.: D. M. Kémény and S. J. Challachombe, John Wiley & Sons) összefoglaló munkában. Kívánt esetben a lemezek hagyományos eljárással moshatóak és blokkolhatóak. így például szokásos mikrotiterlemezek, például ELISA lemezek, egyszerűen bevonhatók kötőpartnerrel oly módon, hogy a lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on, egy megfelelő pufferben, például PBS-ben inkubáljuk, amely kötőpartnert, például 0,01-150 mg/ml proteint tartalmaz, majd blokkoljuk a kívánt blokkolóanyaggal (általában sejttenyésztő tápfolyadékkal), majd 1-5 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A blokkolóoldat eltávolítása után a lemezek használatra készek.
Előnyös azonban, ha a találmány szerinti módszer végrehajtásához szükséges anyagokat kit formájában készítjük el, ahol a szilárd hordozót a rögzített kötőpartnerrel és megfelelően blokkolva bocsátjuk rendelkezésre.
Amint azt fentebb említettük, az érintkeztetési lépés általában magában foglalja a mintával vagy az elkülönített limfociták inkubálását a szilárd fázis jelenlétében, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik az antitesttermelóst és -kiválasztást. Előnyösen szokásos ELISPOT inkubálási körülményeket alkalmazhatunk, amint azt Czerkinsky és munkatársai (1988, fentebb idézve) leírják. Általában úgy járunk el, hogy a mintát vagy a sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid-tartalmú levegőben inkubáljuk, amikor is a tápfolyadék, amelyben a sejteket inkubáljuk, a szén-dioxidot mint pufferkomponenst tartalmazza. Szén-dioxidtól független tápfolyadé4
HU 225 687 Β1 kot is használhatunk, amelyben alternatív pufferrendszer működik, mint például a jól ismert HEPES adalék. Ilyen esetekben a sejteket egyszerűen 37 °C-on inkubáljuk, ami tovább egyszerűsíti a teszteljárást és a felhasznált készülékeket. Az inkubálási idő változhat, de általában 1-2 óra szükséges. Úgy találtuk, hogy 2-6 óra közötti inkubálási idő, például a 2-4 óra jó eredményt adott, ámbár néhány esetben hosszabb, 12-24 óráig vagy egy éjszakán át történő inkubálás is kívánatos lehet. Az inkubáláshoz alkalmas médiumok jól ismertek a szakmában, ilyenek a szokásos sejttenyésztő tápoldatok, amilyen például a Dulbecco-féle módosított Eagle tápközeg (DMEM), az RPMI tápközeg vagy a jól ismert, HEPES-tartalmú, szén-dioxid-mentesen használható médium, amely a kívánt szérumot, például magzati borjúsavót (FCS) vagy egyéb komponenseket, például glutamint, valamint egyéb szükséges komponenst tartalmaz. A tápközeg adott esetben tartalmazhat további alkotórészeket, például antibiotikumokat, például gentamicint, penicillint, sztreptomicint stb., valamint aminosavakat, növekedési faktorokat stb.
A minta/sejt szuszpenziót az érintkeztetési lépés előtt szükséges lehet hígítani annak érdekében, hogy a megfelelő sejt/minta hígítási tartományt használhassuk. A hígításokhoz általában a sejttenyésztő médiumot használjuk hígítóoldatként.
Annak érdekében, hogy megkülönböztessük a folyamatban levő antitestszintézist, az inkubálás fehérjeszintézist gátló anyagok jelenlétében, illetve távollétében végezzük. Így az inkubálás előtt az inhibitort a minta/sejt egy aliquot részéhez adjuk, hogy blokkoljuk a fehérje-, és egyben az antitestszintézist, egy másik aliquot részt pedig inhibitor nélkül inkubálunk. Bármilyen általánosan ismert inhibitort használhatunk, például a cikloheximidet. A clkloheximidet 10-5000 pg/ml, előnyösen például a 50-500 pg/ml koncentrációban használhatjuk. Előnyös még ATP-áz-inhibitorok használata is, mint például a nátrium-azid és hasonlók, a fehérjeszintézist gátló szer mellett, hogy teljesen és gyorsan megállítsuk a sejt metabolizmusát.
Az inkubálást követően a mintát/sejteket eltávolítjuk a szilárd fázisról. Ezt általában egyszerűen a megfelelő tápfolyadékkal vagy pufferrel, például PBS-sel történő mosással végezhetjük. Úgy találtuk azonban, hogy erőteljes mosás nem szükséges.
A szilárd fázist a következő lépésben az antitestkötődés kimutatására használjuk fel. A detektálási lépés, azaz a jel leolvasása oldatban történik. Bármely olyan ismert antitestkötődést kimutató eszköz felhasználható, amellyel oldatban olvasható jel képezhető, például fluoreszcenciás, kemilumineszcenciás, kolorimetriás vagy enzimreakció, ami érzékelhető jelet ad. Előnyösen immunkimutatást, különösen enzimkapcsolt immunszorbens kimutatást, ELISA-t használhatunk a detektálás eszközeként. Immunkimutatási és különösen az ELISA technikák jól ismertek az irodalomból, lásd például: ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects (Eds.: D. M. Kémény and S. J. Challacombe, 1988, John Wiley & Sons).
A sejtek/minta eltávolítását követően olyan enzim-antitest konjugátumot adagolhatunk, például az
ELISA detektálási mód során, amely kötődik a szilárd fázison kapcsolt antigénhez kötött antitesthez.
Hasonlóképpen, ha a kimutatni kívánt antitest a szilárd fázishoz egy kötőpartneren, például egy más fajból származó antitesten keresztül nemspecifikusan kapcsolódik a szilárd fázishoz, akkor olyan enzim-antigén konjugátumot adagolhatunk, amely specifikusan kötődik a kimutatni kívánt, immobilizált antitesthez. Ezután hozzáadjuk az enzim szubsztrátumát, hogy kifejlesszük a detektálandó jelet. A találmány szerinti módszer kivitelezése során előnyösen oldható szubsztrátumot alkalmazunk, hogy az oldatban detektálható jelet kapjunk. Ez azért előnyös, mert megkönnyíti és egyszerűsíti a nagyszámú minták kezelését és feldolgozását, lehetővé teszi az antitesttermelés meghatározását, jóllehet, amint azt fentebb említettük, az abszolút mennyiségi mérés nem szükséges, és kívánt esetben kvalitatív vagy félkvantitatív eredményeket kaphatunk. Előnyösen olyan szubsztrátumot választhatunk, amely spektrofotométerrel kiértékelhető jelet szolgáltat, amelyet egyszerűen abszorbanciaként olvashatunk le, például hagyományos ELISA tálca leolvasó használatával. Használhatjuk a hagyományos ELISA reagenseket, ami azt az előnyt nyújtja, hogy a találmány szerinti teszt kompatibilis a klinikai laboratóriumokban rutinszerűen használt jelenlegi módszerekkel. Azonban ezenkívül más jelképző és kimutatási módszert is használhatunk, például fluoreszcenciás, kemolumineszcenciás stb. jeleket.
Immunoenzimatikus amplifikáló módszert szintén használhatunk, annak érdekében, hogy növeljük a jelet, és így az érzékenységet, például az avidin-biotin módszer használatával, amilyen például a Sigmától beszerezhető Extravidin rendszer. Ebben biotinezett másodlagos antitestek használatosak mint ELISA reagensek, peroxidáz-avidin rendszerrel kombinálva. Mivel egy molekula avidin több biotinmolekulát képes megkötni, az avidin-biotin-peroxidáz komlexek megnövelik a peroxidáz felületi koncentrációját, ami még nagyobb érzékenységet biztosít a módszernek.
A sejtinkubációs (érintkeztetési) lépéshez és az antitestkötődés detektálásához szükséges anyagok és eszközök, a kötőpartnerrel borított szilárd fázissal együtt, célszerűen szintén kit formájában alakíthatók ki. A találmány szerinti teszttel kapott eredményt kiegészíthetjük más módszer használatával kapottakkal is. További hasznos adatok a már jelen lévő szérum/plazma antitestekről klasszikus ELISA tesztekkel is kaphatók. Emellett a limfociták vérmintából való szeparálása után visszamaradó plazmafolyadékot felhasználhatjuk a már jelen lévő antitestek kimutatására, ugyanazzal a találmány tárgyát szerinti vizsgálatban alkalmazott, szilárd fázison rögzített kötőpartnerrel.
Hogy megbizonyosodjunk a találmány szerinti módszer helyes működéséről, megfelelő kontroll használható. Először is, a fehérjeszintézisben gátolt és gátolatlan mintapárhuzamosok összehasonlításának eredménye bizonyítja, hogy a találmány szerinti módszer a
HU 225 687 Β1 tesztelt sejtek akut antitesttermelését mutatja ki, és nem csupán a perifériális vérből származó, már meglévő antitesteket. Tisztított limfocitapreparátumok mintaként való használata bizonyltja, hogy a perifériás vérből származó, nyomokban jelen lévő anitestek nem veszélyeztetik a tesztet. Másrészt annak érdekében, hogy tisztázzuk azt, hogy a fehérjeszintézisben gátolt és nem gátolt minták közti különbség nem a ritka és nemspecifikus limfociták (bystander limfociták) aktiválódásának a következménye, negatív kontrollantigént használunk. Ez az antigén egy olyan fertőző anyagból származó, a páciens betegségéért legkevésbé valószínűen felelős antigén, például tetanusz-toxoid lehet. A találmány szerinti módszert használva az ilyen bystander limfociták számának minden esetben, minden körülmények között kevesebbnek kell lennie, mint amit a pozitív eredményekben megkívánunk. A találmány tervezése ezt a pontot figyelembe veszi.
Amint azt fentebb említettük, a gyorsaságának és egyszerűségének köszönhetően a találmány szerinti módszer nagyon előnyös diagnosztikai vagy más klinikai, állatorvosi célokra, például a haltenyésztésben való alkalmazásra. A kicsiny mintatérfogaton túl további előnye az, hogy csak egyetlen mintát igényel, ellentétben más szerológiai tesztekkel, amelyek 2-3 hetente igényelnek egy-egy szérumpármintát. Bonyolult berendezésekre nincs szükség, a teszt könnyen automatizálható. Ezen túlmenően különböző immunoglobulinizotípusokat is könnyen vizsgálhatunk, ha az szükséges.
A fent említett, a találmány szerinti teszt egy adott antigénre specifikus antitestek spontán expressziójának analízisével a már meglévő vagy folyamatban levő fertőzés becslésére kínál módszert. Az ilyen módszer nyilvánvalóan alkalmazható olyan betegségállapotok megállapítására, amelyek ismertek, és amelyekhez az immunogénnel releváns antitest hozzáférhető, és így a fertőzés specifikus markerét biztosítja. Néhány klinikai esetben azonban az adott betegséget vagy fertőzést nem lehet meghatározni, és/vagy az alkalmas anitest nem hozzáférhető a teszt számára. Ilyen esetekben a tesztet módosíthatjuk úgy, hogy a fertőzés nemspecifikus indikátorának jelenlétét határozzuk meg. így például limfocitatartalmú mintákat, például teljes vért vagy tisztított, illetve dúsított limfocitapreparátumokat vizsgálhatunk fertőzésmarkerek, például citokinek vagy interferonok, például interferon-γ termelésére nézve.
így a találmány tárgya továbbá eljárás nemspecifikus fertözésindikátorok jelenlétének kimutatására vérmintából, melynek során a szóban forgó minták aliquot mennyiségeit vagy adott esetben az említett mintákból közvetlenül izolált limfocitákat fehérjeszintézist gátló szerek jelenlétében és anélkül egy szilárd fázissal olyan körülmények között érintkeztetjük, amelyek lehetővé teszik a limfociták fertőzésindikátorok termelését és kiválasztását;
az oldatban detektáljuk a fertőzésindikátoroknak a szilárd fázison lévő kötőpartnerhez való kapcsolódását; és öszehasonl ltjuk a szóban forgó fertőzésindikátorok fehérjeszintézis-gátló szerek jelenlétében és hiányában végbemenő kapcsolódását, így megkapjuk a mintában a fertőzésindikátor mennyiségét.
A módszer elvégzéséhez a szilárd fázison a detektáláshoz meghatározott befogómolekulákat, például fertőzésindikátorok elleni antitesteket alkalmazhatunk. Az említett, szilárd fázison immobilizált fertőzésindikátorok kimutatásához a fentebb leírt, például jelölt antitestek vagy ligandumok alkalmazásán alapuló módszerek használhatók. Ebben a módszerben a specifikus markerek az immobilizálócsoport vagy detektormolekula megfelelő megválasztásával határozhatók meg. így például a mintában lévő összes fehérjét megköthetjük a szilárd fázison, és a kimutatást jelzett specifikus antitesttel vagy ligandummal végezhetjük. Eljárhatunk úgy is, hogy specifikus kötőpartnert használunk az illető fertőzésindikátor immobilizálására, amelyet aztán megfelelő módon, akár pozitívan, akár negatívan jelölhetünk, például az előbbi esetben a fertőzésindikátoron jelen lévő doménhez, de nem kizárólagosan ahhoz a molekulához történő kötésével, vagy a második esetben, a szilárd fázison meg nem kötött kötőpartner jelölésével.
A módszer elvégzésére szolgáló kitek szintén a találmány tárgyát képezik.
A találmány szerinti módszert a következő példákkal szemléltetjük, anélkül azonban, hogy oltalmi körét bármi módon ezekre korlátoznánk. A jelen találmány szerinti módszert Plasmacute tesztként említjük.
1. példa
Általános eljárás
Sejtek: önként jelentkezőktől, akik influenza elleni inaktivált vakcinát kaptak, az oltást követően különböző időpontokban vért vettünk, és a vért heparinnal kezeltük. A vért azonos térfogatú PBS-sel kevertük. A limfocitákat Lymphoprep (Nyegaard & Co., Oslo, Norvégia) segítségével szeparáltuk. A sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és szuszpendáltuk (hígítottuk) Dulbecco által módosított Eagle-féle tápfolyadékban, amelyet 20% FCS-sel és 2 mM L-glutaminnal, valamint 100 lU/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki (továbbiakban röviden csak MÉDIUM-nak nevezzük).
STOP oldat: 1 mg/ml cikloheximid PBS-ben, amely még 10% nátrium-azidot is tartalmaz.
ELISA- és influenzaantigének: a három, klinikai kísérletekben használt influenza elleni vakcinában alkalmazott influenzavírus-törzs (H3N2; H1N1; és B) tisztított felszíni antigénje.
ELISA tálcák: Greiner EIA plates 655001, F-form vagy Costar EIA plates 3590. Beborítva 10 pg/ml koncentrációjú proteinoldattal, 100 pl folyadék/mélyedés, 4 °C-on tartva egy éjszakán át. Blokkolás: MÉDIUM-mal 1 órán át kezelve, szobahőmérsékleten, utána egyszeri mosás PBS-sel.
Teszt: hígításonként, mindhárom influenzaantigénhez 100 pl MÉDIUM-mal hígított sejtszuszpenziót pipettázunk két lemez három-három mélyedésébe. Az egyik lemezt használjuk gátlószerrel kezelve: 50 pl STOP oldatot mérünk be a mélyedésekbe, és különböző ideig inkubáljuk 37 °C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben.
HU 225 687 Β1
A lemezt PBS-oldattal egyszer leöblítjük, majd kétszer mossuk olyan PBS-sel, amely 0,05% Tween-20 detergenst tartalmaz. Minden mélyedésbe 50 μΙ megfelelően hígított, nyúlban termelt antihumán Ig/peroxidáz konjugátumot (Sigma) pipettázunk, és szobahőmérsékleten 1 órán át állni hagyjuk. A lemezt ezután o-fenilén-diamin (OPD)-szubsztrátummal előhívjuk, majd az abszorpciójukat leolvassuk 492 nm-es hullámhosszon.
Vérminták 11 nappal az oltás után
Sejtek inkubálási ideje: 4 óra, blokkolt sejtek: 0 óra
| Sejtszám | H3N2 | H1N1 | B | |
| 0/4 óra | 6,6*104 | 264/522 | 199/490 | 352/527 |
| 0/4 óra | 6,6*103 | 238/290 | 143/194 | 331/353 |
Mindegyik adat három párhuzamos mélyedés leolvasásának átlaga, az érték az abszorpció ezerszerese. Pontosságul 0%
Konklúzió: 6,6*104=66 ezer sejt 4 órás inkubáció után szignifikáns jelnövekedést eredményez. H3N2-abszorpció 98%-os növekedést, H1N1 153%-os jelnövekedést, a B 50% jelnövekedést mutatott.
Ez egy reprezentatív kísérlet. További kísérletekben a sejtek egy éjszakán át történő inkubálása esetén még tisztább különbség mutatkozott a blokkolt és a nem blokkolt sejtek között, az abszorpciók 1000 fölöttiek voltak. A rendszer rövidebb inkubációs idővel, 2-3 órással, és kevesebb, kb. 0,1-szeres sejtmennyiséggel is tiszta megkülönböztetést mutat, de nem mindig.
2. példa
Általános eljárás
Sejtek: önként jelentkezőktől, akik influenza elleni inaktivált vakcinát kaptak, az oltást követő 7. napon vért vettünk, és a vért heparinnal kezeltük. A vért azonos térfogatú PBS-sel kevertük. A limfocitákat Lymphoprep (Nyegaard & Co., Oslo, Norvégia) segítségével szeparáltuk. A sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és szuszpendáltuk (hígítottuk) Dulbecco által módosított Eagle-féle tápfolyadékban, amelyet 20% FCS-sel és 2 mM L-glutaminnal, valamint 100 lU/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki (továbbiakban röviden csak MÉDIUM-nak nevezzük).
STOP oldat: 1 mg/ml cikloheximid PBS-ben, amely még 10% nátrium-azidot is tartalmaz.
Tesztantigének: három, klinikai kísérletben influenza elleni vakcinában használt influenzavírus-törzs (H3N2; H1N1; és B) tisztított felszíni antigénje.
Kontrollantigén: Tetanusz-toxoid (nem alumí10 nium-oxidon adszorbeált, Lederle gyárim.)
ELISA tálcák: Greiner EIA plates 655001, F-form vagy Costar EIA plates 3590. Beborítva 10 pg/ml koncentrációjú proteinoldattal, 100 pl folyadék/mélyedés, 4 °C-on tartva egy éjszakán át, tetanusz-toxoid: 15 10 Lf/mé. Blokkolás: MÉDIUM-mal 1 órán át kezelve, szobahőmérsékleten, utána egyszeri mosás PBS-sel.
Teszt: hígításonként, mindhárom influenzaantigénhez és tetanusz-kontrollantigénhez 100 pl MÉDIUM-mal hígított sejtszuszpenziót pipettázunk két le20 mez három-három mélyedésébe. Az egyik lemezt használjuk gátlószerrel kezelve: 50 pl STOP oldatot mérünk be a mélyedésekbe, és 3 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben. A lemezt PBS-oldattal egyszer leöblítjük, majd kétszer 25 mossuk olyan PBS-sel, amely 0,05% Tween-20 detergenst tartalmaz. Minden mélyedésbe 50 pl megfelelően hígított, nyúlban termelt antihumán Ig/peroxidáz konjugátumot (Sigma) pipettázunk, és szobahőmérsékleten 1 órán át állni hagyjuk. A lemezt ezután o-feni30 lén-diamin (OPD)-szubsztrátummal előhívjuk, és abszorpciójukat leolvassuk 492 nm-es hullámhosszon.
[A tesztet módosíthatjuk, hogy növekedjen az érzékenység: az előhívás előtt egy óra hosszat extravidin-peroxidáz komplexszel (Sigma) kezeljük, de ekkor az eredeti peroxidázkomplex helyett biotinilkonjugátumot (Sigma) kell használnunk.]
Reprezentatív kísérleti eredmények (extravidin nélkül)
Vérminták 7 nappal az oltás után: (2 eset, #1 és #2) Sejtek inkubálási ideje: 3 óra, blokkolt sejtek: 0 óra
| Sejtszám | H3N2 | H1N1 | B | Tetanusz | |
| 0/3 óra | 105 #1 | 063/410 | 055/269 | 206/258 | 046/050 |
| #2 | 045/077 | 048/242 | 182/207 | 040/046 |
Mindegyik adat három párhuzamos mélyedés leolvasásának átlaga, az érték az abszorpció ezerszerese. 50 Pontosság:! 16%
A vizsgált személyek tinédzserek (16 évesek) voltak. Ismeretes, hogy a fiatalok jól reagálnak az A/H1N1 influenzavakcinára. Ez látszik a fenti adatokból is, mindkét alany jól reagált. Azonban az oltottak külön- 55 bözőképpen reagálnak az oltóanyag komponenseire, így várható volt különbség az abszorpciókban. Ezt mutatja az is, hogy az #1 személy gyengébben reagált a B vírusra, mint a #2, aki csak a H1N1-re adott szignifikáns reakciót. Amint az várható volt, egyikük sem reá- 60 gált a tetanusz-toxoidra. Ha azonban a sejteket néhány napig in vitro stimuláljuk a toxoiddal, akkor a korábbi immunológiai memóriájuk (tudván gyerekkori oltásukról) tetanuszantitest-termeléssel válaszolhat. Valóságos fertőzési esetben, amit diagnosztikai laborban végeztek a jelen találmány szerinti teszttel, csak egy tesztágens/antigén adott pozitív jelet.
3. példa
Általános eljárás
Sejtek: Inaktivált influenzaalegység-vakcinával végzett oltás után 6 nappal egy felnőttől (24 éves férfi) és
HU 225 687 Β1 egy gyerektől (3 éves fiú) vett és heparinnal kezelt vérből a limfocitákat az 1. és 2. példában leírt módon izoláltuk. A sejteket 37 °C-on, 3 órán át érintkeztettük olyan szilárd fázissal, amelyik H3N2, H1N1 és B antigéneket hordozott, amint azt az 1. és 2. példában ismertettük. A tesztet előhívtuk, az ismertetett módon, STOP oldatot és kontrollantigént nem alkalmaztunk.
Az 1. táblázat a két személy eredményeit mutatja, ami három párhuzamos középértéke (abszorp5 cióxlOOO).
1. táblázat
| Felnőtt | I Gyermek | ||||||
| Sejtszám *1000 | A/H3N2 | A/H1N1 | B | Sejtszám *1000 | A/H3N2 | A/H1N1 | B |
| 224 | 475 | 322 | 913 | 275 | 1268 | 97 | 10 |
| 112 | 189 | 193 | 567 | 138 | 951 | 65 | 10 |
| 56 | 93 | 62 | 162 | 69 | 672 | 51 | 20 |
Az eredmények azt mutatják, hogy a gyermeknek volt korábban egy influenzafertőzése, ezért erős reak- 20 ciót ad a trivalens vakcina A/H3N2 komponensére. Amint az várható volt, nem adott reakciót a A/H1N1 és B komponensre. Az ilyen kis gyerekek általában két oltást kell kapjanak, néhány hét különbséggel, hogy megfelelő immunválaszt kapjunk. Körülbelül 70 ezer limfocita, ami mintegy 70 pl vérnek felel meg, elegendő volt, hogy határozottan pozitív reakciót adjon. A felnőtt egyénnek többféle influenzafertőzése volt, a reakciói nem nagyon erőteljesek, de kétségtelenül szignifikánsak a vakcina mindhárom komponensére, noha külön- 30 böző mértékben. Hogy a B komponensre pozitív jelet kapjunk, 100 ezer limfocitára volt szükség, amíg a két A vírus komponensre pozitív reakció legkevesebb 100 ezer, de tipikusan 200 ezer limfocitát igényel.
4. példa
Herpes simplex tip.2 kimutatása hagyományos és
Plasmacute teszt módszerekkel
Általános eljárás
Sejtkultúra és szerológiai analízisek
Öt betegtől vett genitális eredetű mintákat, akiknél a tünetek alapján genitális herpeszvírus-fertőzés volt feltételezhető, rutin-szövettenyésztéssel replikálódó vírusokra nézve vizsgáltunk (Vírus Laboratory, Haukeland University Hospital, Bergen intézetben). Ugyanebben a laborban rutin szerológiai vizsgálatokat végeztünk a szérummintákból kereskedelmi ELISA kittel (Boehringer Enzygnost, Boehringer, Mannheim, Németország), amely HSV-antigéneket tartalmazott az IgG és az IgM kimutatására.
Limfociták szeparálása
A limfocitákat Lymphoprep (Nycomed) sűrűséggradiens-centrifugálással különítettük el heparinozott vérből, amit az öt, genitális herpeszvírus-fertőzés szimptómákat mutató egyéntől párhuzamosan vettünk. A sejteket há- 55 romszor mostuk PBS-sel, és sejttenyésztő tápfolyadékban szuszpendáltuk (DMEM, 20% FCS, valamint 1 mM L-glutamin, 50 IU penicillin, 50 mg/ml sztreptomicin adalékkal, a továbbiakban DMEM/FCS). Az élő sejtek számát tripánkék- (0,2%) kizárással állapítottuk meg.
Plasmacute teszt Boehringer Enzygnost anti-HSV
IgM és IgG ELISA alkalmazásával
A Boehringer Enzygnost anti-HSV IgM és IgG olyan, mélyedésekkel ellátott lemez, ahol 8 mélyedés herpeszvírussal fertőzött majom állandó vesesejtekből származó antigénnel van bevonva, míg másik 8 mélye25 dés nem fertőzött sejtekből származó antigénekkel. A lemezeket mélyedésenként 200 μΙ DMEM/FCS tápfolyadékkal blokkoljuk 37 °C-on, 1 órán keresztül, 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben. A megfelelő hígítású sejtszuszpenzióból 100 μΙ-t adunk minden mélyedésbe, és 3 órán át 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben inkubáljuk. Minden további műveletet szigorúan a gyártó által mellékelt utasítás alapján végzünk. A lemezeket a konjugátumok, reagensek, pufferek használatával hívjuk elő, amelyeket ugyanaz a cég szállít. 35 A szubsztrát, tetrametil-benzidin-hidroklorid (TMB) abszorpcióját 450 nm-en olvassuk le, Titertek Multiskan MCC/340 (Flow Laboratories) lemezleolvasóval.
Plasmacute teszt Bioelisa HSV-2 IgG alkalmazásával
Bioelisa IgG HSV-2 ELISA (BIOKIT, Spain) egy olyan lemez, amelyen 8 mélyedés HSV-2 antigénnel van bevonva. A lemezeket mélyedésenként 200 μΙ DMEM/FCS tápfolyadékkal blokkoljuk 37 °C-on, 1 órán keresztül, 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben.
A megfelelő hígítású sejtszuszpenzióból 100 μΙ-t adunk minden mélyedésbe, és 3 órán át 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben inkubáljuk. Minden további műveletet szigorúan a gyártó által mellékelt utasítás alapján végzünk. A lemezeket a konjugátumok, reagensek, pufferek használatával hívjuk elő, amelyeket ugyanaz a cég szállít. A szubsztrátum, tetrametilbenzidin-hidroklorid (TMB) abszorpcióját 450 nm-en olvassuk le, Titertek Multiskan MCC/340 (Flow Laboratories) lemezleolvasóval.
Plasmacute teszt Bioelisa HSV IgM (Immunocapture) alkalmazásával
A Bioelisa HSV IgM (Immunocapture) kit (BIOKIT, Spain) egy olyan lemez, amelyen 8 mélyedés nyúlban termelt antihumán IgG nyúl antitesttel van bevonva. 60 A lemezeket mélyedésenként 200 μΙ DMEM/FCS táp8
HU 225 687 Β1 folyadékkal blokkoljuk 37 °C-on, 1 órán keresztül, 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben. A megfelelő hígítású sejtszuszpenzióból 100 μΙ-t adunk minden mélyedésbe, és 3 órán át 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben inkubáljuk. Minden további műveletet szigorúan a gyártó által mellékelt utasítás alapján végzünk. A lemezeket a konjugátumok, reagensek, pufferek használatával hívjuk elő, amelyeket ugyanaz a cég szállít. Közelebbről: a megkötött antitestet 100 μΙ/mélyedés torma-peroxidázzal jelölt HSV-antigénnel mutatjuk ki (in vitro emberi fibroblaszttenyészetből tisztított és inaktivált HSV), valamint hogy a minimumra csökkentsük a nemspecifikus reakciókat, jelöletlen kontroliantigént és nem fertőzött sejtkomponenseket (amelyeket a kithez mellékelnek), valamint 10 μΙ HSV-antigént és 10 μΙ kontroliantigént is adunk hozzá. A lemezeket 450 nm-en olvassuk le, Titertek Multiskan MCC/340 (Flow Laboratories) lemezleolvasóval.
A kísérlet eredményét a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. táblázat
| Eset | A tünetek megjelenésétől eltelt idő (nap) | Nem és életkor | Feltétele- zett elsődle- ges, illetve vissza- térő fertőzés | Vírusizo- lálás | Szérumantitestek (Boehringer ELISA) | Plasmacute tesztek | Plasma- cute immun- capture assay | |||
| IgM | IgG | Boehrin- ger IgM | Boehrin- ger IgG | Bioelisa IgG | Bioelisa IgM | |||||
| 1 | 6 | nő/40 | Elsődle- ges fertőzés | ± | — | 205 000 | 103 000 | |||
| 2 | 6 | nő/21 | Elsődle- ges fertőzés | HSV-1 | + | 223 000 | 111 000 | - | ||
| 3 | 2 20 | férfi/47 | Vissza- térő fertőzés | HSV-2 HSV-2 | ± | Μη. t. | 182 000 | 48 000 n. t. | 96 000 | |
| 4 | 5 19 | nő/22 | Elsődle- ges fertőzés | ± n. t. | + n. t. | 60 500 | 15 000 40 500 | 121 000 20 250 | <8 000 40 500 | |
| 5 | 7 | nő/21 | Elsődle- ges fertőzés |
n. t.=nem tesztelve
A 2. táblázat az 1-5 esetek adatait összegzi.
A Haukeland University Hospital víruslaboratóriuma klinikai mintákból izolált vírusokat, és rutin ELISA teszteket is végzett szérum IgG és IgM kimutatására a Boehringer Enzygnost ELISA kitjét használva. A sikeres ví- 45 rusizolálás a vírus típusával van jelezve, a sikertelen jellel. A szérum ELISA határértékét értékét a gyártó határozta meg; pozitív (+) a reakció, ha az abszorpció nagyobb, mint 0,2; határeset (±) 0,1-0,2 között és negatív (-) 0,1 OD érték alatt. 50
A Plasmacute teszt során mi a 0,2 OD értéknél magasabb értéket fogadtuk el pozitívnak, és a táblázatban megjelöltük azt a limfocitaszámot, ami ahhoz szükséges, hogy ezt elérjük.
Csak a Bioelisa IgG teszt képes azonosítani a 55 HSV-2 antitestet, amíg a többi csak a HSV-fertőzöttséget jelzi (HSV1 és/vagy HSV2).
Eredmények
1. eset: Primer HSV-2 fertőzés klinikai tüneteit mutatja. 60
A kórházi vizsgálat nem tudott vírust kimutatni a mintából, és a standard ELISA teszttel nem találtak IgM-et. A szérum IgG antitest szintje határérték volt a standard ELISA teszttel. Megegyezően ezekkel a tesztekkel a Plasmacute módszer sem tudott IgM-termelést kimutatni. Mind a Boehringer, mind pedig a Bioelisa IgG Plasmacute teszt IgG-antitestet termelő sejteket mutatott ki. A Boehringer Plasmacute teszt során a határérték eléréséhez 205 ezer limfocita volt szükséges, míg a Bioelisa Plasmacute teszt során 103 ezer limfocita szükséges a határérték eléréséhez.
2. eset: A primer infekciót igazolták a HSV type-1 vírus izolálásával. A kórházi labor nem tudott a szérumban IgM-et kimutatni, de IgG antitest jelenlétét igazolta. A Plasmacute teszttel nem sikerült IgM antitestet kimutatni, azonban mind a Boehringer, mind pedig a Bioelisa IgG Plasmacute teszt IgG antitestet termelő sejteket mutatott ki. A Boehringer Plasmacute teszt során a határérték eléréséhez 223 ezer limfocita volt szükséges, míg a Bioelisa Plasmacute teszt so9
HU 225 687 Β1 rán 111 ezer limfocita szükséges a határérték eléréséhez.
3. eset: A betegnek visszatérő HSV-2-fertőzése volt, amit a klinikai mintából történt vírusizolálással igazoltak. A klinikai tünetek jelentkezése után két nappal vett vérmintában az IgG jelen volt, az IgM-et azonban nem lehetett kimutatni akkor. A klinikai tünetek megjelenése után két nappal a Plasmacute teszt sem jelzett IgM-et, azonban mind a Boehringer, mind a Bioelisa Plasmacute teszttel IgG-termelő sejteket lehetett kimutatni (48 ezer - 96 ezer sejtet igényelt). A klinikai tünetek megjelenése után 20 nappal mutatták ki az IgM szérumantitestet a kórházban, szérummintából. A Plasmacute Boehringer IgM teszt 182 ezer sejtet igényelt ahhoz, hogy a határértéknek megfelelő abszorpciót produkáljon, azonban a Bioelisa Plasmacute IgM teszttel nem tudunk (termelő-) sejtet kimutatni.
4. eset: A betegnek elsődleges HSV-fertőzése volt. A kórházi laborba beküldött mintában nem tudtak vírust kimutatni. A szérum IgM szintje határértéken volt, az IgG antitest szintre pozitív választ kaptak. Mind az IgM, mind az IgG antitestet kimutattuk a Plasmacute teszttel, mind a Boehringer, mind pedig a Bioelisa kitjének használatával a klinikai tünetek megjelenése után az 5. és a 19. napon vett vérmintákban (a Boehringer kittel nem detektáltak IgM-et). Kevesebb mint 8 ezer sejt volt szükséges a Plasmacute Bioelisa IgM teszthez, és 65 ezer sejtet igényelt a Bioelisa IgM teszt. Mindkét teszt kivitelezéséhez kevesebb mint 100 μΙ heparinozott vér kellett.
5. eset: Feltételezett elsődleges HSV-fertőzés volt, azonban nem volt sikeres a vírusizolálás, és nem mutattak ki szérumantitesteket. A Plasmacute teszt segítségével sem detektáltunk HSV-vírus elleni IgG- és IgM-termelő sejteket.
Értékelés
A Plasmacute tesztről igazolódott, hogy működőképes mind az elsődleges, mind pedig a visszatérő herpeszvírus-fertőzések esetében. A Plasmacute teszt minden esetben legalább a tradicionális ELISA eljárásokkal egyenértékűen működik. Ez különösen az 1. eset kapcsán látszik, amikor a vírusizolálás nem volt sikeres, és a kórházi rutinteszt sem adott egyértelműen pozitív eredményt (határeset), akkor a Plasmacute teszt (Bioelisa IgG és Boehringer IgG) kimutatta, hogy 100 ezer, illetve 200 ezer sejt vitathatatlanul pozitív eredmény ad. Lehetséges, hogy a betegnek kettős fertőzése (HSV-1 és HSV-2) volt, amikor is csak a HSV-1 vírust sikerül kimutatni a fertőzés helyéről történt izolálással. Nem lehet számításon kívül hagyni azonban, hogy a pozitív HSV-2 eredményt (Bioelisa IgG) szerológiai keresztreakció is okozhatta. A negyedik esetben, amikor nem sikerült ugyan vírust izolálni, a két időpontban vett mintából a Plasmacute teszt kimutatta a herpesz specifikus IgM- és IgG-termelő limfociták számának eltolódását a fertőzés korai szakaszától a kései szakaszig, ami megegyezik az elsődleges fertőzések jól ismert dinamikájával; tisztán igazolva az aktív immunválaszt. A Bioelisa IgM Plasmacute teszt különösen érzékeny volt, csak 8 ezer limfocitát igényelt a pozitív válaszhoz a két minta közül az elsőnél.
Ezekben a kísérletekben bemutattuk, hogy a Plasmacute módszer az emberi virális fertőzések klinikai eseteiben is működőképes.
5. példa
Többszörös korong teszt - IgG, IgA és IgM antitestekre specifikus kötőantitestekkel bevont nitro-cellulóz-korongok
Ez a kísérlet azért történt, hogy megállapítsuk, vajon a többszörös korongok módszere a Plasmacute teszt során használva alkalmas-e különböző specifikus antitestek kimutatására.
Általános eljárás
Két egészséges felnőtt egyedből teljesvér-mintát vettünk, amit heparinnal kezeltünk. Minthogy ezek a személyek nem voltak semmilyen fertőzés akut fázisában, az IgG, IgM és IgA spontán antitesttermelést analizáltuk, amely független az antitestek (ismeretlen) antigénspecificitásától.
Az 1. személy mintáját arra használtuk, hogy megállapítsuk, a korongrendszer, amelyben 3 különböző antigénnel borított korongot alkalmazunk, használható-e egy mélyedésben történő Plasmacute tesztben (1. mélyedés).
A 2. személy mintáját arra használtuk, hogy megállapítsuk, gyengül-e a jel, ha több, azonos antigénnel bevont korong van jelen. Három külön mélyedésben történt a Plasmacute teszt kivitelezése (2., 3. és 4. mélyedés).
A limfociták elválasztása
A limfocitákat lymphoprep (Nycomed) sűrűséggradiens-centrifugálással különítettük el heparinozott vérből. A sejteket háromszor mostuk PBS-sel és 20% FCS-t, 1 mM L-glutamint, 50 IU penicillint, 50 pg/ml sztreptomicint tartalmazó DMEM tápfolyadékban (DMEM/FCS) szuszpendáltuk. Az élő sejtek számát tripánkék- (0,2%) kizárással állapítottuk meg.
Plasmacute teszt, szilárd fázisként korongok alkalmazásával
Cellulóz-vegyesészter, 8 pm pórusméretű korongokat (Millipore SCWP 013 00) 10 pg/ml koncentrációjú, 0,001% azidtartalmú PBS-ben hígított, kecskében termelt antihumán antitestek (Sigma anti-IgG I-3382, anti-lgA I—0884, anti-lgM I—0759) oldatában áztattuk egy éjszakán át (bevonás). A korongokat DMEM/FCS médiumban 37 °C-on 1 órán át blokkoltuk, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában. A limfocitákat egy 12 mm átmérőjű, 0,4 pm pórusú transzfercsőbe tettük (Costar 3460), és az alájuk tett korongokkal 3 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában. Az egyes korongokat külön mélyedésekbe tettük át (24 mélyedéses Costar lemez), és háromszor PBS-sel, majd háromszor 0,05% Tween-tartalmú BPS-sel mostuk. A megkötődött antitesteket 200 pl, kecskében termelt antihumán antitest/peroxidáz konjugátummal mutattuk ki (Sigma IgG A-6029, IgA A-4165, IgM A-4290), amelyet DMEM/FCS-ben hígítottunk, és szobahőmérsékleten
HU 225 687 Β1
100 μΙ-t átvittünk egy 96 mélyedéses ELISA lemezre (Greiner EIA plates 655001 F formájú), és abszorpciójukat leolvastuk 492 nm-en (Titertek Multiskan
MCC/340 plate reader).
A kísérlet eredménye a 3. táblázatban látható, ahol is minden érték 3 párhuzamos mérés középértéke, és az érték a leolvasott abszorpció ezerszerese.
órán keresztül inkubáltunk. A korongokról lemostuk a meg nem kötött antitesteket a korábban leírt módszerrel, majd 200 pl o-fenilén-diamin-dihidrokloriddal (OPD, Sigma P-7288) 0,05 M koncentrációjú, pH=5,0 értékű citrát-foszfát-pufferben hívtuk elő. A szubsztrátum hoz- 5 záadása után 30 perccel az előhívást 100 μΙ 1M H2SO4 hozzáadásával megállítottuk. A reakcióelegyből
3. táblázat
| 1. személy | 2. személy | ||||||||||
| 1. mélyedés | 2. mélyedés | 3. mélyedés | 4. mélyedés | ||||||||
| Korong száma | Antihu- mán kötőanti- test | O. D. (492 nm) | Korong száma | Antihu- mán kötőanti- test | O. D. (492 nm) | Korong száma | Antihu- mán kötőanti- test | O.D. (492 nm) | Korong száma | Antíhu- mán kötőanti- test | O. D. (492 nm) |
| 1 | IgG | 405 | 1 | IgG | 148 | 1 | IgA | 182 | 1 | IgM | 82 |
| 2 | IgA | 140 | 2 | IgG | 182 | 2 | IgA | 202 | 2 | IgM | 107 |
| 3 | IgM | 85 | 3 | IgG | 112 | 3 | IgA | 221 | 3 | IgM | 124 |
| 4 | IgG | 410 | 4 | IgG | 157 | 4 | IgA | 263 | 4 | IgM | 145 |
| 5 | IgA | 125 | 5 | IgG | 142 | 5 | IgA | 190 | 5 | IgM | 119 |
| 6 | IgM | 64 | 6 | IgG | 123 | 6 | IgA | 209 | 6 | IgM | 127 |
| 7 | IgG | 375 | 7 | IgG | 144 | 7 | IgA | 172 | 7 | IgM | 138 |
| 8 | IgA | 168 | 8 | IgG | 125 | 8 | IgA | 151 | 8 | IgM | 134 |
| 9 | IgM | 61 | |||||||||
| SEJT | SEJT | SEJT | SEJT |
Az 1. mélyedés 2 millió limfocitát tartalmazott, a 2-4. mélyedések 1 millió limfocitát tartalmaztak.
A „SEJT” jelzet azt mutatja, melyik korong volt legközelebb a sejtek rétegéhez.
Eredmények
Az 1. mintával lefolytatott teszt eredménye azt mutatja, hogy akár még 9 korong is könnyedén használható a limfocitákat tartalmazó mélyedésben. A három IgG, három lg A és három IgM korongra adott válasz minden esetben gyakorlatilag azonos értékűnek tekinthető mindegyik sorozatban, azt mutatván, hogy az antitestkiválasztó limfocitákhoz viszonyított aktuális helyzetük nem kritikus. A 2. személyből származó limfocitákkal végzett teszt azt mutatja, hogy legkevesebb 8 azonosan borított korongot téve egy limfocitatartalmú mélyedésbe, ugyanazt a leolvasást kapjuk. így a találmány lehetővé teszi a többszörös teszteket ugyanazt a limfocitapreparátumot használva, egyazon mélyedésben.
Claims (19)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás célantigén elleni aktív antitesttermelés kimutatására vérmintában, azzal jellemezve, hogy (i) a minta aliquot mennyiségét vagy adott esetben az említett mintából közvetlenül izolált limfocitákat fehérjeszintézist gátló anyagok jelenlétében és anélkül szilárd felülettel érintkeztetjük olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a limfociták antitesttermelését és kiválasztását;35 (ii) az oldatban detektáljuk az antitesteknek az említett antigénekhez a szilárd fázison való kötődését; és (iii) a fehérjeszintézist gátló szerek jelenlétében és távollétében végbemenő antitestkötődést összehason40 Htjuk, így megkapjuk az említett antigén elleni aktív antitesttermelődés mértékét.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó szilárd fázis egy vagy több olyan antigént hordoz, amelyet a kimutatni kívánt antitest45 vagy antitestek felismernek.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó szilárd fázis egy vagy több olyan antitestet hordoz, amelyek felismerik a kimutatni kívánt antitestet vagy antitesteket.50
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kimutatás céljára vagy a kimutatáshoz használt limfociták előállítására 1 milliliternél kevesebb vérmintát alkalmazunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,55 azzal jellemezve, hogy mintaként gyermekek vagy újszülöttek vérmintáit alkalmazzuk, az újonnan szintetizálódó antitestek és a passzívan bekerült, anyai antitestek megkülönböztetésére.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,60 azzal jellemezve, hogy a szóban forgó vérmintát tisztí11HU 225 687 Β1 tási és dúsítási eljárásokkal nyerjük, a betegtől közvetlenül származó vérmintából.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó vérmintából közvetlenül izolált limfocitákat használunk mintaként.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti érintkeztetési lépés előtt a szilárd fázist blokkoljuk.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fehérjeszintézist gátló szerként cikloheximidet alkalmazunk, 50-500 pg/ml koncentrációban.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjeszintézist gátló szerrel egyidejűleg ATP-áz-inhibitort is használunk.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti kimutatási lépésben immunkimutatást végzünk.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunkimutatásí módszerként enzimkapcsolt immunszorbens kimutatást (ELISA) végzünk.
- 13. A 3-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd fázison immobilizált kimutatni kívánt antitest vagy antitestek által felismert egy vagy több antigént érintkeztetjük a szilárd fázissal.
- 14. A 2. vagy 4-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd fázison immobilizált antitest vagy antitestek által felismert egy vagy több antitestet érintkeztetjük a szilárd fázissal.
- 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti kimutatási lépésben oldható szubsztrátumot használunk, és spektrofotometriásán kimutatható jelet kapunk.
- 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy negatív kontrollantigént használunk.
- 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy herpeszvírus elleni aktív antitesttermelést mutatunk ki.
- 18. A 2. és 4-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy több szilárd fázist alkalmazunk, amelyek mindegyike más-más célantigént hordoz.
- 19. Eljárás nemspecifikus fertőzésindikátorok jelenlétének kimutatására vérmintában, azzal jellemezve, hogy (i) a szóban forgó minták aliquot mennyiségeit vagy adott esetben az említett mintákból közvetlenül izolált limfocitákat fehérjeszintézist gátló szerek jelenlétében és anélkül egy szilárd fázissal olyan körülmények között érintkeztetjük, amelyek lehetővé teszik a limfociták fertőzésindikátorok termelését és kiválasztását;(ii) az oldatban detektáljuk a fertőzésindikátoroknak a szilárd fázison lévő kötőpartnerhez való kapcsolódását; és (iii) összehasonlítjuk a szóban forgó fertőzésindikátorok fehérjeszintézis-gátló szerek jelenlétében és hiányában végbemenő kapcsolódását, így megkapjuk a mintában a fertőzésindikátor mennyiségét.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9503406.2A GB9503406D0 (en) | 1995-02-21 | 1995-02-21 | Detection of antibody production |
| PCT/GB1996/000392 WO1996026443A1 (en) | 1995-02-21 | 1996-02-21 | Detection of antibody production |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9801448A2 HUP9801448A2 (hu) | 1998-10-28 |
| HUP9801448A3 HUP9801448A3 (en) | 2000-09-28 |
| HU225687B1 true HU225687B1 (en) | 2007-06-28 |
Family
ID=10769981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9801448A HU225687B1 (en) | 1995-02-21 | 1996-02-21 | Detection of antibody production |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6080552A (hu) |
| EP (1) | EP0811165B1 (hu) |
| JP (1) | JP3472929B2 (hu) |
| CN (1) | CN1098460C (hu) |
| AT (1) | ATE188551T1 (hu) |
| AU (1) | AU709591B2 (hu) |
| CA (1) | CA2213083C (hu) |
| CZ (1) | CZ289582B6 (hu) |
| DE (1) | DE69606024T2 (hu) |
| DK (1) | DK0811165T3 (hu) |
| ES (1) | ES2140821T3 (hu) |
| FI (1) | FI117911B (hu) |
| GB (1) | GB9503406D0 (hu) |
| GR (1) | GR3032740T3 (hu) |
| HU (1) | HU225687B1 (hu) |
| NO (1) | NO317151B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ301770A (hu) |
| PL (1) | PL182061B1 (hu) |
| PT (1) | PT811165E (hu) |
| RU (1) | RU2197733C2 (hu) |
| WO (1) | WO1996026443A1 (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0955544A1 (de) * | 1998-05-06 | 1999-11-10 | Hölzel Diagnostika Handels GmbH | Verfahren zum Erfassen von Primärsignalen bei der Zellkommunikation von Zellen des Immunsystems |
| GB9913819D0 (en) * | 1999-06-14 | 1999-08-11 | Plasmacute As | Assay |
| GB0325483D0 (en) * | 2003-10-31 | 2003-12-03 | Plasmacute As | Assay |
| US20050240353A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Hoffmann Technologies Corporation | Reagents, devices and methods for proteomic analysis with applications including diagnostics, vaccines, quality control and research |
| JP4412732B2 (ja) * | 2005-04-19 | 2010-02-10 | 独立行政法人国立高等専門学校機構 | リンパ球を利用した抗体検査方法および病原体特定方法 |
| DE102007052518A1 (de) * | 2007-10-29 | 2009-04-30 | Autoimmun Diagnostika Gmbh | Verfahren zur in vitro-Diagnose und/oder in vitro- Therapieverfolgung von Infektionen |
| AU2015257417A1 (en) | 2014-05-05 | 2016-11-03 | Cembre S.P.A. | Machine for the application and / or removal of connecting fasteners for rails |
| RU2756764C1 (ru) * | 2021-06-09 | 2021-10-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России) | Способ определения функциональной активности системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019497A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Lennart Olsson | Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies |
| US4707443A (en) * | 1985-04-19 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Soluble interleukin-2 receptor as a disease indicator and a method of assaying the same |
| CA2011099A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-10-19 | Stephen C. Wardlaw | Determination of lymphocyte reactivity to specific antigens in blood |
| US5188942A (en) * | 1990-10-09 | 1993-02-23 | Consultants For Applied Biosciences, Inc. | Method for determining bluetongue virus antibodies in serum |
-
1995
- 1995-02-21 GB GBGB9503406.2A patent/GB9503406D0/en active Pending
-
1996
- 1996-02-21 PT PT96903122T patent/PT811165E/pt unknown
- 1996-02-21 AU AU47268/96A patent/AU709591B2/en not_active Ceased
- 1996-02-21 RU RU97115554/13A patent/RU2197733C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 EP EP96903122A patent/EP0811165B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-21 HU HU9801448A patent/HU225687B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 CZ CZ19972634A patent/CZ289582B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 CA CA002213083A patent/CA2213083C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-21 NZ NZ301770A patent/NZ301770A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 US US08/913,137 patent/US6080552A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-21 DE DE69606024T patent/DE69606024T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-21 CN CN96192047A patent/CN1098460C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-21 AT AT96903122T patent/ATE188551T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-21 ES ES96903122T patent/ES2140821T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-21 DK DK96903122T patent/DK0811165T3/da active
- 1996-02-21 WO PCT/GB1996/000392 patent/WO1996026443A1/en active IP Right Grant
- 1996-02-21 JP JP52549296A patent/JP3472929B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-08-14 PL PL96322209A patent/PL182061B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-08-20 NO NO19973823A patent/NO317151B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-08-20 FI FI973418A patent/FI117911B/fi not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-02-23 GR GR20000400440T patent/GR3032740T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1176000A (zh) | 1998-03-11 |
| PL182061B1 (pl) | 2001-10-31 |
| FI117911B (fi) | 2007-04-13 |
| CZ289582B6 (cs) | 2002-02-13 |
| NO973823L (no) | 1997-10-20 |
| CA2213083A1 (en) | 1996-08-29 |
| GR3032740T3 (en) | 2000-06-30 |
| RU2197733C2 (ru) | 2003-01-27 |
| FI973418A (fi) | 1997-08-20 |
| US6080552A (en) | 2000-06-27 |
| CN1098460C (zh) | 2003-01-08 |
| NZ301770A (en) | 1999-04-29 |
| PT811165E (pt) | 2000-04-28 |
| EP0811165B1 (en) | 2000-01-05 |
| JPH11500226A (ja) | 1999-01-06 |
| DE69606024D1 (de) | 2000-02-10 |
| DE69606024T2 (de) | 2000-09-14 |
| CZ263497A3 (cs) | 1998-02-18 |
| HUP9801448A2 (hu) | 1998-10-28 |
| JP3472929B2 (ja) | 2003-12-02 |
| FI973418A0 (fi) | 1997-08-20 |
| NO317151B1 (no) | 2004-08-30 |
| AU4726896A (en) | 1996-09-11 |
| ES2140821T3 (es) | 2000-03-01 |
| GB9503406D0 (en) | 1995-04-12 |
| ATE188551T1 (de) | 2000-01-15 |
| HUP9801448A3 (en) | 2000-09-28 |
| WO1996026443A1 (en) | 1996-08-29 |
| NO973823D0 (no) | 1997-08-20 |
| CA2213083C (en) | 2007-12-04 |
| PL322209A1 (en) | 1998-01-19 |
| AU709591B2 (en) | 1999-09-02 |
| DK0811165T3 (da) | 2000-05-08 |
| EP0811165A1 (en) | 1997-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0216191B1 (en) | Immunoassay for htlv-iii antigens | |
| JPH0731199B2 (ja) | 低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法 | |
| KR19980703302A (ko) | 글루타치온 s-트랜스퍼라제의 하나 또는 그 이상의 아이소엔자임 검출에 기초한 장기 상태 평가를 위한 쾌속 검정법 | |
| HU225687B1 (en) | Detection of antibody production | |
| US20080206790A1 (en) | Assay for determining the presence or amount of newly synthesized antibodies | |
| US5641624A (en) | Method for measuring anti-HIV-1 p24 antibody and use thereof | |
| Van der Sluis | Laboratory techniques in the diagnosis of syphilis: a review. | |
| US20070292839A1 (en) | Assay | |
| JPS60205367A (ja) | 抗‐エプスタイン‐バールビールス抗体の酵素‐免疫螢光試験法 | |
| JPH02503951A (ja) | アッセイ | |
| WO1995002186A1 (en) | New diagnostic assay for detection of syphilis | |
| KR920007205B1 (ko) | 단순 포진 비루스 항원 측정용 세정 조성물, 테스트 키트 및 그 사용법 | |
| JPS62860A (ja) | 微生物診断用テスト方法 | |
| Quasim et al. | Sero-epidemiological studies of infectious disease in Iraq and England. 4. Mumps virus infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |