PT629238E - Autotaxina: proteina estimuladora da motilidade util no diagnostico e tarapia do cancro - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "AUTOTAXINA: PROTEÍNA ESTIMULADORA DA MOTILIDADE ÚTIL NO DIAGNÓSTICO E TERAPIA DO CANCRO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se, de um modo geral, a um péptido estimulador da motilidade e composições compreendendo o mesmo. Em particular, a presente invenção refere-se a uma forma purificada do péptido, por exemplo, autotaxina (ATX); um segmento de ADN que codifica para autotaxina; moléculas de ADN recombinante contendo o segmento de ADN; células contendo a molécula de ADN recombinante; um método para produzir autotaxina; anticorpos contra autotaxina; e métodos de diagnóstico e terapia de cancro utilizando os péptidos e segmentos de ADN referenciados acima.

Informação Antecedente A motilidade celular desempenha um papel importante em acontecimentos embriónicos, remodelação de tecido adulto, cicatrização de feridas, angiogénese, defesa imunitária e metástases de células tumorais (Singer, S.J. e Kupfer, A. (1986) Ann. Rev. Cell Biol. 2, 337-365). Em processos fisiológicos normais a motilidade está fortemente regulada. Por outro lado, a motilidade de células tumorais pode ser regulada de forma aberrante ou autorregulada. As células tumorais podem responder de uma forma de motilidade a uma variedade de agentes. Estes incluem factores derivados do hospedeiro tais como o factor de dispersão (Rosen, E.M. et al., (1989) In Vitro Cell Devei. Biol. 25, 163-173) e factores de crescimento (Kahan, B.W. et al., (1987) Câncer Res. 47, 6324-6328; Stracke, M.L. et al., Biochem. 1

Biophys. Res. Comm. 153, 1076-1083; Tamm, I., et al.r (1989) J. Exp. Med. 170, 1649-1669; Wang, J.M., et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Comm. 169, 165-170; e Jouanneau, J., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 2893-2897), componentes da matriz extracelular (McCarthy, J.B., et al. (1984) J. Cell Biol. 98, 1474-1480) e factores excretados pelo tumor ou autócrinos (Liotta, L.A., et al. (1988) Câncer Surveys 7, 631-652; Ruff, M., et al. (1985) Clin. Immunol. Immunopath. 37, 387-396; Atnip, K.D., et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 146, 996-1002; Ohnishi, T., et al. , (1990) J. Neurosurg. 73, 881-888; Silletti, S., et al. (1991) Câncer Res. 51, 3507-3511; e Watanabe, H. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 13442-13448).

Muitos tipos de factores solúveis derivados do hospedeiro actuam de um modo parácrino para estimular a locomoção celular. Têm sido identificadas proteínas estimuladoras de motilidade denominadas "factores de dispersão", que são produzidas por fibroblastos embriónicos e por células do músculo liso (Stoker, M. et al. (1987) Nature 327, 239-242). Os factores de dispersão estimulam a motilidade aleatória e dirigida por parte de células epiteliais, queratinócitos, células endoteliais vasculares e células de carcinoma (Stoker, M. et al. (1987) Nature 327, 239-242; Rosen, E.M., et al. (1990) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 195, 34-43; e Weidner, K.M., et al. (1990) J. Cell. Biol. 111, 2097-2108), mas não em fibroblastos. Adicionalmente, um número de factores de crescimento excretados pelo hospedeiro tem sido demonstrado como estimulando a motilidade em células tumorais, incluindo o factor de crescimento do nervo (Kahan, B.W., et al. (1987) Câncer Res. 47, 6324-6328) factor I de crescimento tipo insulina (Stracke, M.L., et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 153, 1076-1083), interleuquina-6 (Tamm, I. et al. (1989) J. Exp. Med. 170, 1649-1669), interleuquina-8 (Wang, J.M., et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Comm. 169, 165-170), .e factor de crescimento de fibroblasto acídico (Jouanneau, J. et al. (1991) Proc.. Natl. Acad. Sei. USA 88, 2893-2897). Estes factores 2

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parácrinos podem influenciar o "regresso ao local de origem" ou o direccionamento da motilidade de células tumorais.

Em contraste a estes factores derivados do hospedeiro, muitos tipos de células tumorais foram verificadas produzir proteínas denominadas "factores de motilidade autócrinos", que estimulam a motilidade pelas mesmas células tumorais que produzem o factor (Liotta, L.A., et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3302-3306). Os factores de motilidade autócrinos não são específicos para um dado tipo de células cancerosas, mas possuem um vasto espectro de actividade em muitos tipos de células do cancro (Kohn, E.C. et al. (1990) Int. J. Câncer 46, 287-292), com pouco efeito em fibroblastos ou leucócitos normais.

Os factores de motilidade autócrinos até agora identificados actuam através de receptores de superfície celular (Stracke, M.L., et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 147, 339-345; Nabi, I.R., et al. (1990) Câncer Res. 50, 409-414;

Watanabe, H., et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 13442-13448) resultando em protrusão pseudopodial (Guirguis, R., et al. (1987) Nature 329, 261-263) levando a ambas as migrações aleatória e directa (Liotta, L.A., et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3302-3306; Atnip, K.D., et al. (1987)

Biochem. Biophys. Res. Comm. 146, 996-1002; Ohnishi, T., et al. (1990) J. Neurosurg. 73, 881-888).

Estudos anteriores de células de melanoma humano A2058 demonstraram que estas células são uma fonte particularmente rica de factores de motilidade autócrinos. Um factor de motilidade autócrino com uma massa molecular de aproximadamente 60 kDa foi previamente isolado a partir do meio condicionado destas células (Liotta, L.A., et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3302-3306). Factores semelhantes derivados ou induzidos por células tumorais, com o mesmo peso molecular, têm sido subsequentemente relatados e purificados por vários investigadores (Atnip, K.D., et al. (1987) Biochem. Biophys. 3

Res. Comm. 146, 996-1002; Schnor, S.L., et al. (1988) J. Cell Sei. 90, 391-399; Onishi, T., et al. (1990) J. Neurosurg. 73, 881-888; Siletti, S., et al. (1991) Câncer Res. 51, 3507-3511; Watanabe, H., et al. (1990) J. Cell Biol. 111, 2097-2108). Pensa-se que tais factores desempenham um papel chave na invasão de células tumorais. A maior parte dos factores de motilidade identificados até à data não foram purificados até à homogeneidade e não foram sequenciados. O novo factor de motilidade tumoral da presente invenção, aqui denominado como autotaxina (ΔΤΧ), foi purificado e verificou-se ser uma amostra homogénea através de electroforese em gel a 2-D. A proteína da presente invenção é única em relação a qualquer factor de motilidade previamente identificado ou purificado. 0 tamanho molecular de ATX é cerca de 125 kDa e possui um ponto isoeléctrico de aproximadamente 7,7. ATX estimula ambas as migrações aleatória e dirigia de células de melanoma humano A2058 a concentrações de pM. A actividade deste factor (ATX) é completamente sensível à inibição por toxina de pertussis. Não se verificou existir homologia significativa entre a proteína da invenção e qualquer proteína de mamífero incluindo factores prévios conhecidos como estimulando a motilidade celular.

Existe uma grande necessidade clínica para prever a agressividade de um tumor individual de um doente, para prever a recorrência local de tumores tratados e para identificar doentes em risco elevado para o desenvolvimento de tumores invasivos. A presente invenção proporciona um marcador funcional que está funcionalmente relacionado com o potencial invasor de cancro humano. A invenção proporciona ainda um ensaio para este marcador excretado em fluidos corporais, ou em tecidos. O ensaio desta invenção pode ser utilizado na detecção, diagnóstico e tratamento de doenças humanas e outras desordens inflamatórias, fibróticas, infecciosas ou de cicatrização. 4

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de um modo geral, a um péptido estimulador de motilidade e a um segmento de ADN codificando o mesmo. É um objectivo especifico da presente invenção proporcionar o péptido estimulador de motilidade, de aqui em diante referido como autotaxina. É ainda um objectivo desta invenção proporcionar um segmento de ADN que codifique autotaxina e uma molécula de ADN recombinante compreendendo o mesmo. É ainda um objectivo da presente invenção proporcionar uma célula que contenha uma tal molécula recombinante e um método de produzir a autotaxina utilizando tal célula. É ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar um método de purificar autotaxina.

Outros objectivos e vantagens da presente invenção serão claros a partir da descrição que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Fraccionamento de ATX através de interacção hidrofóbica. Uma amostra de 200 ml de meio condicionado de A2058 foi submetida a cromatograf ia numa coluna de 200 ml de fenil Sepharose-4B. O tampão A foi Tris a 50 mM (pH 7,5), metanol a 5% e sulfato de amónio a 1,2 Μ. O tampão B foi Tris a 50 mM (pH 7,5), metanol a 5% e etilenoglicol a 50%. O gradiente (----) representa um gradiente linear duplo com sulfato de amónio decrescente (1,2 até 0,0 M) e etilenoglicol crescente (0 a 50%). A absorvância foi monitorizada a 280 nm (-) e indicou que a maior parte da proteína não se ligou à coluna. Foram ensaiadas fracções de dez ml quanto à capacidade para estimular motilidade, utilizando o ensaio de Câmara de Boyden (o) . O pico 5

de actividade de motilidade ocorreu entre 900 e 1050 minutos, ~ 12% do gradiente.

Figura 2. Isolamento de ATX através de cromatografia de afinidade de lectina. Porções de 20 ml do pico dé actividade em fenil Sepharose foram purificadas por afinidade numa coluna de 40 ml de Concanavalina A Affi-Gel. Os componentes ligados foram eluidos com um gradiente em passo (----) de metil a-D- manopiranósido (0,0 mM, 10 mM e 500 mM) num tampão consistindo em Tris a 0,05 M (pH 7,5), NaCl a 0,1 M, CaCl2 a 0,01 M e etilenoglicol a 20%. A absorvância foi monitorizada a 280 nm (_) e indicou que a maioria dos componentes proteicos não se ligam à coluna. A motilidade foi ensaiada em fracções de 10 mL (...o...) e foi detectada predominantemente na concentração de eluição de 500 mM. É apresentada uma de sete análises cromatográficas.

Figura 3. Purificação de ATX através de cromatografia de troca aniónica fraca. Aproximadamente 30% do pico de actividade eluido da coluna de afinidade em Con A foi aplicado a uma coluna ZORBAX Bioseries-WAX. Os componentes ligados foram eluidos com um gradiente de NaCl (----) num tampão consistindo em Tris a 10 mM (pH 7,5) e etilenoglicol a 30%. A motilidade (o) foi ensaiada em fracções de 1,0 ml. O pico de actividade foi eluido numa

região discreta, mas larga, na parte mais baixa do gradiente. A absorvância foi monitorizada a 230 nm (_) . A maioria dos componentes proteicos não associados com a actividade fortemente ligados à coluna foram eluidos a 1,0 M de NaCl. É apresentada uma de duas análises cromatográficas.

Figura 4. Purificação de ATX através de cromatografia de exclusão em peneira molecular. O pico de actividade inteiro eluido da coluna de troca aniónica fraca foi aplicado numa série de colunas TSK (4000SW, 4000SW, 3000SW, e 2000SW, por esta 6 ^ L-Cj ^==^-—^ \ι ordem). As proteínas foram eluídas num tampão consistindo em NaP04 a 0, 1 M (pH 7,2) com metanol a 10% e etilenoglicol a 10%. Foram evidentes dois picos de proteína principais, através da monitorização da absorvância a 235 nm (_). A motilidade (...o...) foi ensaiada em amostras de 0,4 ml e foi detectada predominantemente no primeiro pico, mais pequeno, de proteína.

Figura 5. Purificação final de ATX através de cromatografia de troca aniónica. Aproximadamente 15% do pico de actividade a partir das séries de exclusão em peneira molecular foi aplicado a uma coluna Pro-Pac PAI. A proteína que se ligou à coluna foi eluída com um gradiente de NaCl (----) num tampão consistindo em

Tris a 10 mM (pH 7,5), metanol a 5% e etilenoglicol a 20%. A absorvância foi monitorizada a 215 nm (_) . A actividade da motilidade foi ensaiada em fracções de 1,0 ml a duas diluições diferentes: 1/5 (...o...), ou 1/15 (._.o._.) . A actividade foi determinada^ corresponder a um pico duplo de proteína na região central do gradiente.

Figura 6. Componentes de proteína associados com os picos de actividade de vários estágios de purificação. Os picos de actividade de cada fraccionamento cromatográfico foram reunidos, concentrados e analisados por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS. Os padrões de peso molecular estão na Pista 1 para cada painel. Painel A) gel em gradiente de 8-16% dos primeiros três passos de purificação, analisados em condições de não redução. A Pista 2 é uma fracção dos picos de actividade reunidos eluídos a partir de fraccionamento com fenil sepharose. A Pista 3 é uma fracção dos picos de actividade reunidos eluídos a partir da purificação de afinidade em Con A. As Pistas 4 e 5 apresentam o "pico" e "ombro" de actividade fraccionados por cromatografia de troca aniónica fraca (FIG. 3). Painel B) gel a 7% do pico de actividade fraccionado através da cromatografia de exclusão em peneira molecular. As Pistas 2 e 3 7

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t apresentam o padrão de separação de proteína do pico de actividade total reunido quando o gel foi realizado em condições de não redução e de redução, respectivamente. Painel C) gel em gradiente de 8-16% da separação final em cromatografia de troca aniónica forte, realizada em condições de não redução. A Pista 2 compreende ~1% do pico de actividade total reunido eluído da coluna.

Figura 7. Electroforese de ATX em gel bi-dimensional. ATX purificado (FIG. 6, Painel C) foi sujeito a focagem isoeléctrica não em equilíbrio (5 h a 500 v) , depois aplicado a gel de poliacrilamida a 7,5% na presença de SDS, para a segunda dimensão. A separação por pH resultante foi medida em amostras de 0,5 cm de géis em tubo analisados concorrentemente e é apresentada no topo. Os padrões de peso molecular para a segunda dimensão são apresentados à direita. Esta análise revela um componente único com pi = 7,7 í 0,2 e Hr = 120 000.

Figura 8. Curva de diluição de ATX. ATX purificado (FIG. 6, Painel C) foi diluído em série e- testado para actividade de estimulação de motilidade. 0 resultado, com a motilidade de fundo não estimulada subtraída, demonstra que a actividade atinge metade do máximo a ~ 500 pM de ATX.

Figura 9. Sensibilidade de ATX a toxina pertussis (PT). Células A2058 foram pré-tratadas durante 1 h antes do início do ensaio de motilidade, com PT a 0,5 μg/ml em BSA-DMEM a 0,1% ou com BSA-DMEM a 0,1% isolado (para controlo sem tratamento). A actividade de motilidade estimulada por ATX purificado (FIG. 6, Painel C) foi então avaliada para os dois grupos de tratamento. O resultado, expresso como células/HPF ± S.E.M. com a motilidade de fundo não estimulada subtraída, revela profunda inibição de células tratadas com PT (às riscas) comparadas com células não 8 p U γ tratadas (a cheio). O PT não teve efeito na viabilidade celular. Os S.E.M.s foram < 10%.

Figura 10. Análise em tabuleiro de xadrez de motilidade estimulada por ATX. Soluções variadas de autotaxina foram adicionadas à câmara superior com as células e/ou à câmara inferior, como apresentado. A resposta à motilidade, expressa como células/HPF ± S.E.M., foi avaliada para cada ponto no tabuleiro de xadrez.

Figura 11. Purificação de péptidos de ATX em HPLC. ATX, purificado até à homogeneidade através de cromatografia de troca aniónica forte, foi digerido sequencialmente por brometo de cianogénio, sujeito a redução e piridiletilação e digerido com tripsina. Os péptidos resultantes foram purificados numa coluna de fase reversa Aquapore RP300 C-8, utilizando um gradiente de

acetonitrilo (0-70%) em ácido trifluoroacético a 0,1% (----). A absorvância foi monitorizada a 215 nm (_) e os picos foram recolhidos. Sete picos, seleccionados aleatoriamente para análise de sequência de aminoácidos do terminal N, são apresentados com os números apropriados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A autotaxina é excretada por células de melanoma humano A2058 cultivadas em baixa abundância em meio condicionado sem soro. Crê-se que ATX seja uma proteína glicosilada devido à sua elevada afinidade para ConA e à análise de sequência de aminoácidos dos péptidos de ATX. O tamanho molecular de ATX é cerca de 125 kDa como determinado através de electrof orese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, em condições de redução e possui um ponto isoeléctrico de 7,7 ± 0,2. Estas características distinguem ATX de vários factores de crescimento pequenos e de interleuquinas que estão implicadas na motilidade 9

L·. K de células tumorais (Stracke, M.L., et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 153, 1076-1083; Ruff, M., et al. (1985) Clin. Immunol. Immunopatu. 37, 387-396; Maciag, T., et al. Sei. 225, 932-935; Gospodarowicz, D. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6963-6967; Van Snick, J. (1990) Ann. Rev. Immunol. 8, 253-278; Yoshimura, T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 9233-9237). A proteína da presente invenção, que numa realização é derivada de células de melanoma humano A2058, pode ser preparada substancialmente livre de proteínas com as quais está normalmente associada, sendo o protocolo de purificação aqui revelado. Esse protocolo pode ser descrito de um modo geral como se segue.

Um volume grande de meio condicionado sem soro de células produtoras apropriadas (p.ex., células tumorais) é recolhido e concentrado aproximadamente 500 vezes. Este meio condicionado concentrado é então separado das outras proteínas contaminantes através de técnicas que se baseiam nas características químicas e físicas da proteína. Estas incluem o peso molecular, hidrofobicidade relativa, carga total, ponto de focagem isoeléctrica e a presença na proteína de resíduos de açúcar que se ligam à lectina.

Alternativamente, a proteína, ou uma porção funcional desta, pode ser sintetizada utilizando meios químicos ou de recombinação. A proteína da presente invenção possui uma actividade biológica potente. O ATX purificado é activo no intervalo picomolar e 1 unidade de actividade corresponde a uma concentração de aproximadamente 500 pM como avaliado para o ensaio de motilidade celular aqui descrito e noutras publicações (Stracke, M.L., et al., (1989) J. Biol. Chem. 264, 21544-49). A proteína da presente invenção possui um tamanho molecular, como determinado por electroforese em gel bi-dimensional, de 120 a 130 kDa, ou mais especificamente, cerca de 10 j· ’ L-Cj ^

J 125 kDa. Além disso, a proteína da presente invenção pode possuir um pi no intervalo entre 7,5 e 7,9, preferencialmente, aproximadamente 7,7.

A presente invenção também se refere a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos correspondente a ATX, ou uma porção única de tal sequência (sendo porção única aqui definida como pelo menos 5, 10, 25 ou 50 aminoácidos) . Numa realização, o segmento de ADN codifica qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas

em SEQ ID NO : 1 a SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 33. Noutra realização, a presente invenção refere-se a uma molécula de ADN recombinante compreendendo um vector (por exemplo vector plasmídico ou virai) e um segmento de ADN codificando para um polipéptido correspondendo a ATX, como pode ser preparado por um especialista na técnica. Preferencialmente, o segmento codificante está presente no vector ligado operacionalmente a um promotor.

Noutra realização, a presente invenção refere-se a uma célula contendo a molécula de ADN recombinante acima descrita. Células hospedeiras adequadas incluem células de procariotas (tais como bactérias, incluindo E. coli) e tanto células de eucariotas inferiores (por exemplo, leveduras) como células de eucariotas superiores (por exemplo, células de mamífero). A introdução da molécula recombinante nas células hospedeiras pode ser realizada utilizando métodos conhecidos na arte.

Noutra realização, a presente invenção refere-se a um método para produzir um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos correspondente a ATX. O método compreende cultivar as células acima descritas em condições tais que o segmento de ADN seja expresso, e isolar o ATX assim produzido.

Noutra realização, a presente invenção refere-se a um anticorpo possuindo afinidade para autotaxina ou fragmentos peptídicos deste. A invenção também se refere a fragmentos de ligação de tais anticorpos. Numa realização preferida, os 11

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L-Zi ^^ anticorpos são específicos para péptidos de autotaxina possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada em uma das SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 33.

Os anticorpos podem ser produzidos contra a autotaxina ou seus péptidos fragmento, quer ocorrendo naturalmente ou produzidos por recombinação, utilizando métodos conhecidos na arte.

Os fragmentos de péptidos de ATX acima descritos podem ser ligados a outros materiais, particularmente polipéptidos, como polipéptidos de fusão ou ligados covalentemente, para serem utilizados como proteínas transportadoras. 0 ATX e os seus fragmentos podem ser fundidos ou covalentemente ligados a uma variedade de proteínas transportadoras, tais como a hemocianina de lapa, albumina de soro bovino, toxóide do tétano, etc. Ver, por exemplo, Microbiology, Hoeber Medicai Division (Harper and Row, 1969), Landsteiner, Specificity of Serological Reactions (Dover Publications, Nova Iorque, 1962) e Williams et ai., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol 1 (Academic Press, Nova Iorque, 1967), para descrições de métodos de preparação de anti-soros policlonais. Um método típico envolve hiperimunização de um animal com um antigénio. 0 sangue do animal é então recolhido pouco tempo depois das imunizações repetidas e a gamaglobulina é isolada.

Nalguns casos é desejável preparar anticorpos monoclonais a partir de vários hospedeiros de mamíferos. A descrição de técnicas para preparar tais anticorpos monoclonais pode ser encontrada em Stites et al., editores, Basic and Clinicai Immunology, (Lange Medicai Publications, Los Altos, CA, Quarta edição) e em referências aqui citadas e em particular em Kohler e Milstein em Nature 256:495-497 (1975), que discute um método de criar anticorpos monoclonais.

Noutra realização, a presente invenção refere-se a uma sonda de oligonucleótidos sintetizada de acordo com a sequência 12

degenerativa sentido e anti-sentido apresentada numa de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 33. Não foram encontradas homologias de proteínas conhecidas quando se compararam as sequências apresentadas em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 33 com as das seguintes bases de dados: GenBank (68.0), EMBL (27.0), SWISS-PROT (18.0), e GenPept (64.3). Assim, a autotaxina é uma proteína única não descrita anteriormente.

Noutra realização, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico de metástases do cancro e a um "kit" adequado para utilização num tal método. Preferencialmente, podem ser utilizados anticorpos contra ΔΤΧ em, mas não estando limitado a, configurações de ELISA, RIA ou transferências imunológicas, para detectar a presença de ATX em fluidos corporais de doentes (p.ex. soro, urina, efusões pleurais, etc.). Estes anticorpos podem também ser utilizados em colorações imunológicas de amostras de doentes para detectar a presença de ATX.

Ainda noutra realização, a presente invenção refere-se a diagnósticos in vivo e ín vitro. O ATX pode ser marcado radioactivamente, por meios conhecidos de um especialista na técnica, e injectado em doentes com cancro com substâncias auxiliares apropriadas também conhecidas de um especialista na técnica, de modo a, em última análise, detectar sítios de metástases distantes por sistemas de imagem apropriados. O nível de ATX em tecido ou em fluidos corporais pode ser utilizado para prever o desenvolvimento da doença e/ou a escolha da terapia que pode também incluir inibidores de ATX.

Noutra realização, a presente invenção refere-se a um tratamento do cancro. Anticorpos contra ATX podem ser utilizados para ligação cruzada com toxinas (p. ex. , Rícino A), por meios conhecidos de um especialista na técnica, em que o complexo de ligação cruzada é administrado a doentes com cancro com agentes auxiliares apropriados, através de meios conhecidos de um 13 especialista na técnica, de modo a que quando o complexo de anticorpo se liga à célula cancerosa a célula é morta pela toxina em ligação cruzada. A presente invenção é descrita em maior detalhe nos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Os seguintes protocolos e detalhes experimentais estão referenciados nos Exemplos que se seguem

Materiais. As membranas de policarbonato Nuclepore e as câmaras de microquimiotaxia de 48 poços foram obtidas de Neuro Probe, Inc. A toxina de Pertussis (PT), etilenoglicol (grau para biotecnologia), metil A-D-manopiranosido foram obtidos de vendedores comerciais. Os anfólitos, pH 3-10 Bio-Lyte e pH 8-10 Bio-Lyte, foram obtidos de Bio-Rad. Fenil Sepharose CL-4B; concavalina A affi-Gel; coluna ZORBAX Bioseries-WAX (troca aniónica baixa) (9,4 mm x 24 cm); colunas Spherogel-TSK 4000SW, 3000SW e 2000SW (cada uma 7,5 mm x 30 cm); a coluna de troca aniónica forte Pro-Pac PAI (4 x 50 mm); a coluna de fase reversa Aquapore RP300 C-8 (220 x 2, 1 mm), e a coluna de fase reversa

AminoQuant C-18 (200 x 2, 1 mm) também foram obtidas a partir de fontes comerciais.

Cultura de Células. A linha de células de mieloma humano A2058, originalmente isolada por Todaro (Todaro, G.J., et al.r (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5258-5262), foi mantida como previamente descrito por Liotta (Liotta, L.A., et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3302-3306).

Produção de Autotaxina. Células A2058 foram crescidas em frascos T-150, tratadas com tripsina, e semeadas em fábricas celulares de 24 000 cm2 a uma densidade celular de lxlO10 células/fábrica. 14

1 I

Após 5-6 dias, o meio contendo soro foi removido e as células foram lavadas com DPBS. As fábricas foram mantidas em DMEM sem vermelho de fenol, suplementado com glutamina a 4 mM, penicilina a 100 unidades/ml, estreptomicina a 100 μς/ιηΐ, albumina de soro bovino cristalizada a 5 μ9/ιη1, insulina bovina a 10 μς/ιηΐ e aprotinina a 1 μΜ. Os sobrenadantes das culturas foram recolhidos de três em três dias, congelados a -40°C e substituídos com meio fresco livre de soro. Cada ciclo de sobrenadante foi testado para a produção de ATX com um ensaio de motilidade celular descrito abaixo. Tipicamente, uma fábrica celular manteve-se produtiva durante 9-11 destes ciclos.

Após acumulação de aproximadamente 45-60 L de sobrenadante, os sobrenadantes da cultura foram descongelados e concentrados para 2-2,5 L utilizando um cartuxo de ultrafiltração com membrana espiral Amicon S10Y30. Este sobrenadante foi ainda mais concentrado numa célula de ultrafiltração de elevado desempenho da Amicon utilizando membranas Diaflo. O volume final alcançado para 100-200 L de meio condicionado foi tipicamente de 250-400 ml. Todas as ultrafiltrações foram realizadas a 4°C.

Ensaios de Motilidade Celular. A purificação de autotaxina foi monitorizada testando a capacidade de estimulação de motilidade das fracções recolhidas das colunas. Estas fracções estavam em tampões inadequados para um ensaio de quimiotaxia de modo que cada fracção teve de ser lavada num tampão apropriado, i.e., BSA a 0,1% (p/v) em DPBS contendo cálcio e magnésio. Esta diálise foi realizada adicionando alíquotas de cada fracção a ser testada em tubos de ultrafiltração Centricon-30, que retém espécies moleculares maiores do que 30 000 daltons. O ensaio para determinar a motilidade foi realizado em triplicado utilizando uma câmara de microquimiotaxia de 40 poços como descrito em detalhe noutra referência (Stracke, M.L., et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 146, 339-345; Stracke, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264, 21544-21549). As membranas 15 1—^

Nuclepore utilizadas nestas câmaras de Boyden modificadas foram fixadas e coradas com Diff-Quik. A quimiotaxia foi quantificada através da leitura das membranas coradas com um densitómetro 2202 Ultroscan laser ou através da contagem de 5 campos de elevada alimentação (HPF) seleccionados aleatoriamente sob microscopia óptica (400 x) para cada réplica. As unidades de densitómetro (comprimento de onda - 633 nm) demonstraram estar linearmente relacionados com o número de células por HPF (Taraboletti, G. (1987) J. Cell Biol. 105, 2409-2415; Stracke, M.L. et ai. (1989) J. Biol. Chem. 264, 21544-2154 9).

Tipicamente, a motilidade não estimulada (ruído de fundo) corresponde a 5-10 células/HPF e as células de resposta elevada a 70-100 células/HPF acima do ruído de fundo não estimulado (i.e., 75-110 células totais/HPF).

Para experiências utilizando PT, a toxina foi pré-incubada com as células durante 1-2 h à temperatura ambiente antes do ensaio e mantida com as células durante o ensaio (Stracke, M.L., et ai. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 146, 339-345). As células tratadas foram testadas quanto à sua resposta de motilidade ao quimioatractivo bem como para motilidade aleatória não estimulada.

Purificação de Autotaxina. Foi adicionado sulfato de amónio para uma concentração final de 1,2 M ao meio condicionado de A2058 concentrado durante 1 h a 4°C. A solução foi centrifugada numa centrífuga Sorvall RC2-B Ultraspeed a 10 000 x g durante 15 min. Apenas o sobrenadante tem a capacidade para estimular motilidade.

No primeiro passo a amostra foi fraccionada através de cromatografia de interacção hidrofóbica utilizando uma coluna de 200 ml de fenil Sepharose C1-4B equilibrada com Tris a 50 mM (pH 7,5), metanol a 5% (v/v) e sulfato de amónio a 1,2 Μ. O sobrenadante do fraccionamento com sulfato de amónio foi adicionado a esta coluna e eluído utilizando gradientes lineares 16 \i de Tris a 50 mM (pH 7,5), metanol a 5% (v/v) , com decréscimo de sulfato de amónio (1,2 - 0,0) Me etilenoglicol crescente (0 -50)% (v/v) a 1 ml/min. O pico activo foi reunido, dialisado contra Tris a 50 mM, NaCl a 0,1 M, CaCl2 a 0,01 M, etilenoglicol a 20% (v/v) e sujeito a um segundo fraccionamento através de cromatografia de afinidade com lectina utilizando uma coluna de 40 ml de concanavalina A Affi-Gel realizada a 1 ml/min. A amostra foi eluida por um processo passo a passo no mesmo tampão com 0, 10, e 500 mM de metil α-manopiranosido adicionado sucessivamente. As fracções de cada passo do gradiente foram reunidas e testadas quanto à sua capacidade para estimular motilidade.

No terceiro passo de purificação, a amostra que eluiu a 500 mM de α-metil-manopiranosido foi dialisada contra Tris a 10 mM (pH 7,5) com etilenolicol a 30% (v/v) e fraccionada por cromatografia de troca aniónica fraca. A cromatografia foi realizada numa coluna ZORBAX Bioseries-WAX utilizando um cromatógrafo Shimadzu BioLiquid e eluida com um gradiente linear de cloreto de sódio (0,0 - 0,4 M) a 3 ml/min. 0 pico de actividade foi reunido, dialisado contra fosfato de sódio a 0,1 M (pH 7,2), metanol a 10% (v/v) e etilenoglicol a 10% (v/v) e sujeito a um quarto fraccionamento numa série de colunas Spherigel TSK (4000SW, 4000SW, 3000SW, 2000SW, nesta ordem). Este passo de peneira molecular foi realizado utilizando o cromatógrafo Shimadzu BioLiquid a 0,4 ml/min. O pico de actividade foi reunido e dialisado contra Tris a 10 mM (pH 7,5), metanol a 5% (v/v), etilenoglicol a 20% (v/v) e sujeito a um quinto passo de cromatografia (troca aniónica forte), uma aplicação em coluna Pro-Pac PAI a 1 ml/min utilizando Dionex BioLC com um programa de computador AI450. A amostra foi eluida com um gradiente linear de NaCl (0,0-0,4 M).

De modo a calcular rendimentos de actividade após cada passo de purificação, teve de ser derivada uma unidade de actividade. A curva de diluição de autotaxina foi bifásica com 17 L-Cj r ι \ um pico largo e um intervalo linear a concentrações sub-óptimas. Uma unidade ·de actividade/poço (i.e., 40 unidades/ml) foi definida como 50% da actividade máxima numa curva de diluição completa. Isto permitiu o cálculo da actividade contida em qualquer volume da diluição necessária para atingir 1 unidade/poço. Por isso, se uma diluição de 1:10 foi necessária de modo a produzir 1 unidade de actividade/poço, o material continha 10 x 40 = 400 unidades/ml.

Electroforese em Gel. Amostras de proteína foram analisadas através de electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, utilizando as condições de Laemmli (Laemmli U.K. (1970) Nature 227, 680-685). Resumidamente, foram preparados géis de poliacrilamida a 7 ou 8% contendo SDS ou foram obtidos comercialmente géis em gradiente (8-16%) pré-vertidos. As amostras foram preparadas com ou sem condições de redução (β-mercaptoetanol a 5%). Após separação electroforética os géis foram corados utilizando Coomassie Blue G-250 como previamente descrito (Neuhoff, V., et al. (1988) Electrophoresis 9, 255- 262). Neste protocolo de coloração, que normalmente não requer qualquer passo de descoloração, a coloração com Coomassie parece ser capaz de corar apenas 10 ng de proteína.

Para electroforese a duas dimensões a proteína, em etilenoglicol a 20%, foi seca num Speed-vac e redissolvida em solução de aplicação: ureia a 9 M, Bio-Lyte a 1% (v/v) pH 3-10, e Nonidet P40 a 2,5% (v/v). Esta amostra foi então sujeita a focagem isoeléctrica (0'Farrell, P.H. (1975) J. Biol. Chem. 250, 4007-4021) utilizando um tubo de células Bio-Rad em géis em tubo de poliacrilamida de 120 x 3 mm, contendo ureia a 9 M, Bio-Lyte a 2% (v/v) pH 3-10, Bio-Lyte a 0,25% (v/v) pH 8-10 e Nonidet-P40 a 2,5% (v/v). As soluções nos reservatórios foram ácido fosfórico a 0,01 M e NaOH a 0,02 Μ. A focagem isoeléctrica não no equilíbrio (0'Farrell, P.H., et al. (1977) Cell 12, 1133- 1142) foi realizada inicialmente com voltagem constante (500 v) 18

U t durante 5 h. Uma vez que a proteína era básica, o procedimento foi repetido em condições de equilíbrio (500 V durante 17 h) . A electroforese na segunda dimensão foi realizada numa poliacrilamida a 7,5% utilizando as condições de Laemmli (1970). 0 gel foi corado com Coomassie Blue G-250 como acima.

Preparação de péptidos para a sequência interna de autotaxina. ATX homogéneo foi sequencialmente digerido com brometo de cianogénio e, após redução e piridiletilaçâo, com tripsina (Stone, M., et al. (1989) em A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing Matsudaira, P.T., ed.) págs. 33-47, Academic Press, N.Y.). Os fragmentos resultantes foram então separados por eluição em gradiente numa coluna de fase reversa Aquapore RP300 C-8: ácido trifluoroacético a 0,1% (v/v) e acetonitrilo (0-70)% durante 85 min a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min. Foi utilizado um sistema Dionex AI450 BioLC e as fracções foram recolhidas à mão enquanto se monitorizava a absorvância a 215 nm.

Análise de sequências de péptidos. As sequências de aminoácidos dos péptidos resultantes da digestão e purificação de péptidos de ATX #1-7 e 12-18, correspondendo a SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 26 até SEQ ID NO: 32, respectivamente, foram determinadas num Porton Instruments 2020 off-line sequenator utilizando o programa padrão #1. As análises de aminoácidos com feniltiohidantoína do sequenciador foram realizadas num Beckman System Gold HPLC utilizando um programa de gradiente em acetato de sódio modificado e numa coluna Hewlett-Packard C-18. ATX-100 (SEQ ID NO: 8), ATX-101 (SEQ ID NO: 9), ATX-102 (SEQ ID NO: 10), ATX-103 (SEQ ID NO: 11) e ATX 104 (SEQ ID NO: 33) foram sequenciados a partir de ATX purificado em gel.

As bases de dados de proteínas (Pearson, W.R., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 2444-2448) que foram pesquisadas em relação a homologias na sequência de aminoácidos 19

V

com os péptidos de ATX incluem: GenBank (68.0), EMBL (27.0), SWISS-PROT (18.0), e GenPept (64.3). EXEMPLO 1

Purificação de Autotaxina

As células A2058 tinham demonstrado anteriormente produzir factores proteicos que estimulam a motilidade de um modo autócrino (Liotta, L.A., et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3302-3306). O meio condicionado destas células foi por isso utilizado para identificar e purificar um novo factor de estimulação da motilidade, que é aqui denominado autotaxina. Dado que a purificação foi monitorizada com um ensaio biológico, a actividade de estimulação de motilidade teve de ser mantida durante o processo. A actividade mostrou ser lábil em relação à congelação, aos tampões acidicos, proteases (mas não ADNase ou ARNase), redução, agentes caotrópicos fortes (p. ex. > 4 M de ureia) e a uma variedade de solventes orgânicos (isopropanol, etanol, acetonitrilo). Um solvente orgânico, etilenoglicol, que não diminuiu a bioactividade, foi adicionado tanto no armazenamento como na separação cromatográfica.

Foram necessários 100-200 L de meio condicionado sem soro de. modo a produzir suficiente autotaxina para análise de sequência de aminoácidos. O meio continha baixas concentrações tanto de BSA (5 μρ/πιΐ) , que foi necessária como uma proteína transportadora, como de insulina (10 μρ/ιηΐ) , que foi requerida para suportar o crescimento celular em meio de baixo teor proteico. Foi realizada ultrafiltração para concentrar este grande volume, com membranas YM30 de baixa ligação a proteínas, que retêm espécies moleculares com Mr > 30 000. Como observado na Tabela 1, 200 L de meio condicionado preparado deste modo resultaram em 10 x 106 unidades de actividade. Contudo, o meio condicionado não fraccionado inicial continha substâncias adicionais conhecidas como estimuladoras de actividade, 20

t particularmente insulina, que não é completamente eliminada por lavagem no passo de ultrafiltração e que é aditiva à actividade de estimulação de motilidade de uma maneira complexa (Stracke, M.L., et al. (1989) J. Biol. Chem.· 264, 21544-21549). Isto teve que ser tido em conta de modo a determinar rendimentos para passos subsequentes nos quais a insulina foi removida.

TABELA 1. PURIFICAÇÃO DE AUTOTAXINA

Passo de Proteína Actividade3 Actividade Recu Purificação (mg) (unidades totais) Específica (unidades/mg) (%)b 200 L de Meio Condicionado 33 000 10 000 000c 300 Fenil Sepharose 1 235 460 000 370 100 Concar.avalina A 58 660 000 11 400 100 Troca Jónica Fraca 4,5 490 000 110 000 100 Peneiras Moleculares TSK ~0,4d 220 000 550 000 48 Troca Tónica Forte ~0,04d 24 000e 600 000 5,2 * Actividade calculada a partir do ensaio de câmara de Boyden. A diluição que resultou em 50% da actividade máxima (geralmente aproximadamente 20 unidades de densidade de laser ou -40 células/HPF) foi escolhida para possuir 1 unidade de actividade por poço (equivalente a 40 unidades/ml). 3 A recuperação foi estimada a partir da actividade., após a primeira coluna de purificação (i.e., fenil sepharose). c A actividade inicial no meio condicionado não fraccionado reflectiu o facto de a insulina ter sido utilizada no meio como um factor de crescimento necessário em condições de proteína baixa. d A proteína estimada baseia-se na quantificação por análise de aminoácidos. e Esta actividade específica para a proteína purificada corresponde a -10 fmol ATX/unidade de actividade de motilidade (num poço de câmara de Boyden). O primeiro passo na purificação envolveu fraccionamento por cromatografia de interacção hidrofóbica utilizando uma coluna de fenil Sepharose C1-4B. Os resultados são apresentados na FIG. 1. A maior parte das proteínas, incluindo insulina, foi eluída da coluna em fracções precoces ou volume de exclusão. Contudo, o pico de actividade eluiu relativamente tarde. A actividade que foi purificada foi estimada como 460 000 unidades ± 20% (Tabela 21 p ^^ 1) . Como ο pico de actividade reunido do fraccionamento com fenil Sepharose é considerado como sendo a primeira amostra sem contaminação significativa com insulina, rendimentos subsequentes são medidos contra a sua actividade total. A electroforese em gel de uma pequena porção do pico de actividade reunido (FIG. 6A, coluna 2) revelou um grande número de bandas de proteína com BSA predominante do meio condicionado original.

No segundo passo de purificação, o pico de actividade foi aplicado a coluna de actividade com lectina, concanavalina A Affi-Gel. Como apresentado na FIG. 2, a maior parte da proteína (estimada como sendo 90% da absorvância total a 280 nm) não se conseguiu ligar, de todo, à coluna. A fracção não ligada essencialmente não continha actividade estimuladora de motilidade (ver linha ponteada na FIG. 2) . Quando foi aplicado à coluna um gradiente linear de metil α-D-manopiranosido, a actividade quimiotáctica foi eliminada por eluição numa zona prolongada, começando a uma concentração de aproximadamente 20 mM de açúcar. Consequentemente, foi utilizado um gradiente em passo para eluir. BSA pura não se ligou a con A. A actividade foi detectada principalmente no passo a 500 mM de metil α-D-manopiranosido. Não pareceu existir perda significativa de actividade como observado na Tabela 1; contudo, a actividade específica (actividade/mg de proteína total) aumentou trinta vezes. A electroforese em gel do pico reunido e concentrado (FIG. 6A, coluna 3) revelou que a carga em excesso de BSA já não era evidente e o número de bandas era muito reduzido. Quando a proteína não ligada foi concentrada e aplicada num gel, pareceu idêntica ao pico de actividade de fenil Sepharose-4B com uma banda de BSA grande. 0 terceiro passo de purificação envolveu fraccionar o pico activo prévio através de cromatografia de troca aniónica fraca, como apresentado na FIG. 3. Nas condições prevalentes, a actividade foi eluída num pico-ombro largo ou pico duplo no meio da porção baixa (0,0-0,4 M) do gradiente de NaCl. A maior 22 li

t proporção de proteína, não possuindo capacidade de estimulação de motilidade, ligou-se fortemente à coluna e foi eliminada na eluição em sal elevado (NaCl a 1 M) . Não pareceu existir perda significativa de actividade, embora a actividade específica tenha aumentado em vinte vezes (Tabela 1). A análise por electroforese em gel tanto do pico (28-34 min na FIG. 3) como do ombro (35-45 min na FIG. 3) é apresentada na FIG. 6A (colunas 4 e 5, respectivamente). Resultaram duas bandas de proteína predominantes: um dupleto largo à volta dos 25-35 kDa e um segundo dupleto à volta dos 110-130 kDa.

No quarto passo de purificação, o pico activo foi aplicado a uma série de peneiras moleculares. A monitorização espectrofotométrica do eluído revelou dois picos grandes de proteína (FIG. 4). A actividade correspondia ao primeiro, pico de elevado peso molecular. A recuperação da actividade foi de -48% com um aumento de cinco vezes na actividade específica. A análise por electroforese em gel foi realizada em condições de redução e de não redução como apresentado na FIG. 6B (colunas 2 e 3, respectivamente). Este passo de fraccionamento removeu essencialmente todas as proteínas recombinantes de peso molecular < 55 kDa. A banda predominante permaneceu como um peso molecular de 120 kDa não reduzida e 125 kDa reduzida; há duas bandas menores com pesos moleculares de 85 kDa e 60 kDa. 0 facto de a proteína de 120 kDa se alterar tão pouco na mobilidade electroforética após redução tende a indicar uma escassez de pontes dissulfito. Contudo, as pontes dissulfito existentes possuem significado funcional porque a actividade estimuladora da motilidade é lábil à redução. 0 quinto passo de purificação envolveu o fraccionamento do pico activo através de cromatografia de troca aniónica forte. Como apresentado na FIG. 5, a actividade corresponde a dois picos largos de absorvância óptica no meio do gradiente com as proteínas contaminantes eluindo mais cedo. Estes dois picos foram idênticos através de análise de aminoácidos e através de 23

I separação electroforética em gel ' de poliacrilamida. Presumivelmente, eles representam diferentes estados de glicosilação da mesma proteína parental. A actividade é apresentada na FIG. 5 a duas diluições diferentes da amostra. Várias diluições das amostras fraccionadas foram frequentemente necessárias de modo a resolver o verdadeiro "pico" de actividade dado que a forma da curva de diluição de ATX não era bem definida devido à saturação e regulação a concentrações elevadas. A recuperação deste passo cromatográfico é baixa (5% comparada com fenil Sepharose), como poderia ser esperado quando uma quantidade diminuta de proteína é aplicada a uma coluna; contudo, a actividade específica diminuiu novamente (Tabela 1) . A análise por electroforese em gel revelou uma única banda de proteína a um peso molecular de 120 kDa, não reduzida (FIG. 6C, coluna 2). EXEMPLO 2

Caracterização de Autotaxina A electroforese em gel bi-dimensional da proteína purificada (FIG. 7) revelou uma banda única predominante. A banda descai para baixo levemente em direcção ao lado básico do gel numa maneira que é característica das proteínas glicosiladas. Um pi básico de 7,7 ± 0,2 foi essencialmente o mesmo quer a focagem isòeléctrica tenha decorrido em condições de não equilíbrio (5 h) ou tenha sido deixada alcançar o equilíbrio (17 h).

Uma curva de diluição da proteína purificada é apresentada na FIG. 8. A proteína é activa no intervalo de pM e 1 unidade de actividade parece corresponder a uma concentração de 400-600 pMolar (ou aproximadamente 10 fmol de autotaxina/poço de câmara de Boyden). Quando as diluições se iniciaram a concentrações mais elevadas de ATX, a curva resultante apresentou uma plataforma larga com regulação nas concentrações mais elevadas. 24 r L-Cj A resposta de motilidade à autotaxina purificada é altamente sensível à toxina pertussis (Tabela 2 e FIG. 9) com aproximadamente 95% de inibição de actividade a 0,5 μς/πιΐ de PT. TABELA 2. Efeito da Toxina Pertussis (PT) na motilidade estimulada pela Autotaxina Resposta de Motilidade de A2058 (unidades de densidade1 2) células controlo3 células tratadas com toxina Pertussis4 5 6 25 1

Meio condicionado'2 60,3 0,4

Autotaxina Purificada 38,5 0,0 2

Quimiotaxia quantificada através dê ensaio dê motilidade (Stracke, M.L., et al. (1978) Bíochem. Bíophys. Res. Comm. 146, 339-345) 3 Células A2058 suspendidas a 2 x 107 células/ml em DMEM suplementado com 1 mg/ml de soro bovino e agitado à temperatura ambiente durante 1 h. 4

Como controlo com 0,5 μg/ml de toxina pertussis. 5

Preparado adicionando DMEM sem fenol vermelho suplementado com 0,1 mg/ml de albumina do soro bovino para frascos sub- 6 confluentes de células A2058. O meio foi recolhido após 2 dias de incubação a 37°C numa atmosfera humidificada e concentrada 25-30 vezes utilizando um equipamento de ultrafiltração Amicon com uma membrana YM-30. 7 A análise em tabuleiro de xadrez foi realizada para avaliar a natureza aleatória (quimiocinética) versus dirigida (quimiotáctica) da resposta da motilidade à autotaxina. As câmaras foram montadas com diferentes concentrações de ATX acima e abaixo do filtro, utilizando ATX purificado através de um passo de fraccionamento de troca aniónica fraca. Os quadrados abaixo da diagonal reflectem a resposta a um gradiente positivo, os quadrados acima reflectem a resposta a um gradiente negativo e os quadrados na diagonal reflectem a motilidade aleatória na

ausência de ura gradiente. 0 ATX estimula ambas as respostas quimiotáctica e quimiocinética (FIG. 10), com respostas quimiotácticas tão altas como quinze vezes acima dos valores de ruído de fundo e quimiocinéses tão elevadas como oito vezes acima dos valores de ruído de fundo. A análise de aminoácidos após hidrólise ácida completa foi utilizada para quantificar a proteína purificada. Esta hidrólise foi realizada na proteína excisada a partir de um gel de poliacrilamida e presumida como sendo pura. A análise indicou que 2,7 nmol de proteína estavam presentes após fraccionamento na peneira molecular. Após fraccionamento através de cromatografia de troca aniónica forte, permaneceram aproximadamente ' 300 pmol. Os resultados da análise são apresentados na Tabela 3.

TABELA 3. COMPOSIÇÁO DE AMINOÁCIDOS DE AUTOTAXINA (CYS e TRP não foram determinados nesta análise)

Aminoácidos

Resíduos/100

ASX

THR

SER

GLX

PRO

GLY

ALA

VAL

MET

ILE

LEU

TYR

PHE

HIS

LYS

ARG 12,56, 0 5.7 9.4 7.4 7.0 3,9 6.71,2 4.3 9.0 5.2 5.2 3.8 7.4 5.4 26 r u EXEMPLO 3

Degradação de ATX e Determinação da Sequência de Aminoácidos

As tentativas para obter informação da sequência do terminal N a partir de ATX purificado revelaram-se repetidamente fúteis. A proteína purificada foi por isso digerida sequencialmente e os péptidos resultantes foram fraccionados através de cromatografia de fase reversa. Os resultados são apresentados na FIG. 11. São observados picos múltiplos bem definidos incluindo agrupamentos em ambas as extremidades, hidrofílica e hidrofóbica, do gradiente.

Muitos destes picos de péptidos foram seleccionados aleatoriamente através de degradação de Edman e análise da sequência de aminoácidos do terminal N. Sete dos oito picos escolhidos (apresentados na FIG. 11) forneceram informação de sequência única clara, como observado na Tabela 4. Utilizando material de uma digestão e purificação separadas foram também obtidas as quatro sequências restantes.

Sondas de oligonucleótidos sentido e anti-sentido foram sintetizadas de acordo com as sequências de fragmentos da Tabela 4 através de métodos conhecidos do especialista na arte. São apresentadas sondas representativas na Tabela 5. TABELA 4. Sequências peptidicas para Autotaxina. PÉPTIDO SEQUÊNCIA SEQ ID NOME N° DE AMINOÁCIDOS NO: 1. WHVAAN SEQ ID NO: 1 ATX 18 2. PXLDVYK SEQ ID NO: 2 ATX 19 3. YPAFK SEQ ID NO: 3 ATX 20 4. QAEVS SEQ ID NO: 4 ATX 24 5. PEEVTXPNYL SEQ ID NO: 5 ATX 2 9 6. YDVPWNETI SEQ ID NO: 6 ATX 47 7 . SPPFENINLY SEQ ID NO: 7 ATX 4 8 27

V V I . (------

t 8 . GGQPLWITATK SEQ ID NO: 8 ATX 100 9. VNSMQTVFVGYGPTFK SEQ ID NO: 9 ATX 101 10 . DIEHLTSLDFFR SEQ ID NO: 10 ATX 102 11. TEFLSNYLTNVDD- SEQ ID NO: 11 ATX 103 ITLVPGTLGR 12 . QYLHQYGSS SEQ ID NO: 26 ATX 37 13. VLNYF SEQ ID NO: 27 ATX 39 14 . YLNAT SEQ ID NO: 28 ATX 40 15. HLLYGRPAVLY SEQ ID NO: 29 ATX 41 16. SYPEILTPADN SEQ ID NO: 30 ATX 44 17 . XYGFLFPPYLSSSP SEQ ID NO: 31 ATX 53 18. TFPNLYVF/LAQGLYWS SEQ ID NO: 32 ATX 59 19. VNVISGPIFDYDYDGLH/ SEQ ID NO: 33 ATX 104 ADTEDK Os péptidos números 1-7 referem- -se a picos numerados FIG. 11. Os péptidos números 12-18 referem-se a péptidos purificados da preparação que produziu os péptidos números 1-7.

Os péptidos 8-11 e 19 são de uma purificação separada, não apresentada na FIG. 11. X refere-se a resíduos potencialmente glicosilados. TABELA 5.

Os oligonucleótidos sintetizados a partir de sequências de péptidos de autotaxina (ATX). 0 número do oligonucleótido corresponde ao número do péptido de ATX como na Tabela 4. A letra final do sufixo distingue se o oligonucleótido é uma sequência sentido (S) ou anti-sentido (A).

Oligo Sequência SEQ ID NO: A-18A GTT-GGC-AGC-NAC-RTG-CCA SEQ ID NO: 12 A-18S TGG-CAY-GTN-GCT-GCC-AAC SEQ ID NO: 13 A-20A CTT-GAA-GGC-AGG-GTA SEQ ID NO: 14 28

V A-20S TAY-CCT-GCN-TTY-AAG SEQ ID NO: 15 A-2 9A GGT-NAC-YTC-YTC-AGG SEQ ID NO: 16 A-29S CCT-GAR-GAR-GTN-ACC SEQ ID NO: 17 A-47A NGT-NGC-RTC-RAA-TGG-CAC-RTC SEQ ID NO: 18 A-4 7S GAY-GTG-CCA-TTY-GAY-GCN-ACN SEQ ID NO: 19 A-48A GTT-DAT-RTT-STC-RAA-TGG-GGG SEQ ID NO: 20 A-4 8S CCC-CCA-TTT-GAG-AAC-ATC-AAC SEQ ID NO: 21 A-100A CTT-NGT-NGC-NGT-DAT-CCA-NAR-GGG-YTG-GCC-GCC SEQ ID NO: 22 A-100S GGC-GGC-CAR-CCC-YTN-TGG-ATH- ACN-GCN-ACN-AAG SEQ ID NO: 23 A-101A CTT-RAA-GGT-GGG-GCC-RTA-GCC- CAC-RAA-GAC-TGT-YTG-CAT SEQ ID NO: 24 A-101S ATG-CAR-ACA-GTC-TTY-GTG-GGC- SEQ ID NO: 25 TAY-GGC-CCC-ACC-TTY-AAR EXEMPLO 4

Clonagem molecular de ADNc de autotaxina Foi preparada uma biblioteca de ADNc em fago (λζ3ρ) a partir das mesmas células tumorais A2058 conhecidas como sintetizando ATX. Esta biblioteca foi pesquisada quanto à presença da sequência ATX através dos seguintes métodos. Primeiro, foi preparada uma sequência de ADN de 200 pares de bases (pb) utilizando a tecnologia da PCR (reacção da polimerase em cadeia) com a mesma biblioteca em λΖ5ρ como molde e os oligonucleótidos derivados A-48S (SEQ ID NO:21) e A-100A (SEQ ID NO:22) como sequências iniciadoras. Esta sequência de 200 pb do ARNm de ATX foi utilizada para realizar pesquisas iniciais da biblioteca completa. Alternativamente, foi também utilizada uma mistura de oligonucleótidos derivados para pesquisar a biblioteca de ADNc completa. Ambos os métodos de pesquisa produziram clones de ADNc positivos. EXEMPLO 5 29

V

L· t

Anticorpos Anti-péptido

Foram injectados coelhos com ATX-101 (SEQ ID NO:10) que tinha sido ligado em ligação cruzada a albumina do soro bovino. Os anti-soros destes coelhos foram sujeitos a precipitação salina seguida de purificação utilizando cromatografia de afinidade com esferas de Affi-Gel 10, ligadas covalentemente ao péptido, ATX-101 (SEQ ID NO:10). Este anticorpo purificado por afinidade reagiu com a proteína parcialmente purificada em transferências imunológicas. Este mesmo anticorpo foi utilizado para realizar colorações imunohistoquímicas em tecido humano. 30

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: STRACKE, MARY

LIOTTA, LANCE SCHIFFMANN, ELLIOTT KRUTZSCH, HENRY

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PROTEÍNA ESTIMULADORA DE

MOTILIDADE ÚTIL EM DIAGNÓSTICO E TERAPIA DE CANCRO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 33 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) ENDEREÇADO: CUSHMAN DARBY AND CUSHMAN (B) RUA: 1615 L STREET, N.W.

(C) CIDADE: WASHINGTON (D) ESTADO: D.C. (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 20036 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Fita (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DO FICHEIRO: (C) CLASSIFICAÇÃO: 31 (viii) ADVOGADO/INFORMAÇÃO DO AGENTE:

(A) NOME: SCOTT, WATSON T (B) NÚMERO DE REGISTO: 26581 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (202)-861-3000 (B) TELEFAX: (202) 822-0944

(C) TELEX: 6714627CUSH (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

Trp His Vai Ala Ala Asn 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Pro Xaa Leu Asp Vai Tyr Lys 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA.SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 32 \ y

(C) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Tyr Pro Ala Phe Lys 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Gin Ala Glu Vai Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍ STICAS. DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5 Pro Glu Glu Vai Thr Xaa Pro Asn Tyr Leu 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6 33

V

Tyr Asp Vai Pro Trp Asn Glu Thr Ile 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: Ser Pro Pro Phe Glu Asn Ile Asn Leu Tyr 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: Gly Gly Gin Pro Leu Trp Ile Thr Ala Thr Lys 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 34

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Vai Asn Ser Met Gin Thr Vai Phe Vai Gly Tyr Gly Pro Thr Phe Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Asp Ile Glu His Leu Thr Ser Leu Asp Phe Phe Arg 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11:

Thr Glu Phe Leu Ser Asn Tyr Leu Thr Asn Vai Asp Asp Ile Thr Leu 1 5 .10 15

Vai Pro Gly Thr Leu Gly Arg 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 35

V ι t (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

GTTGGCAGCN ACRTGCCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:

TGGCAYGTNG CTGCCAAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:

CTTGAAGGCA GGGTA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 36 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15

TAYCCTGCNT TYAAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16 GGTNACYTCY TCAGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17

CCTGARGARG TNACC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

NGTNGCRTCR AATGGCACRT C (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19:

GAYGTGCCAT TYGAYGCNAC N (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20:

GTTDATRTTS TCRAATGGGG G (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 38

(D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

CCCCCATTTG AGAACATCAA C (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22:

CTTNGTNGCN GTDATCCANA RGGGYTGGCC GCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23:

GGCGGCCARC CCYTNTGGAT HACNGCNACN AAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 39 \

(D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24:

CTTRAAGGTG GGGCCRTAGC CCACRAAGAC TGTYTGCAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25:

ATGCARACAG TCTTYGTGGG CTAYGGCCCC ACCTTYAAR (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26:

Gin Tyr Leu His Gin Tyr Gly Ser Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 40 π Lc 'ύ (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27:

Vai Leu Asn Tyr Phe 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28:

Tyr Leu Asn Ala Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29:

His Leu Leu Tyr Gly Arg Pro Ala Vai Leu Tyr (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:30: 41 Γ (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:30:

Ser Tyr Pro Glu Ile Leu Thr Pro Ala Asp Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:31:

Xaa Tyr Gly Phe Leu Phe Pro Pro Tyr Leu Ser Ser Ser Pro 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 42 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32:

Thr Phe Pro Asn Leu Tyr Vai Xaa Ala Gin Gly Leu Tyr Trp Ser 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:33:

Vai Asn Vai Ile Ser Gly Pro Ile Phe Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Leu 1 .5 10 15

Xaa Asp Thr Glu Asp Lys 20

Lisboa, 16 de Outubro de 2000

O AGENTE OEICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRJAL

43

Claims (17)

1. i-c, REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido seleccionado a partir de proteína autotaxina humana numa forma homogénea ou um fragmento da referida proteína, em que: (A) a referida proteína possui um ponto isoeléctrico de cerca de 7,7, um peso molecular de cerca de 125 kDa, como determinado por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS em condições de redução e induz a motilidade em células de melanoma humano A2508, que é inibida pela toxina pertussis; e (B) o anticorpo adequado para coloração imunohistoquímica de tecido humano canceroso pode ser produzido para cada um da referida proteína e do referido fragmento.
2. 2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polipéptido é proteína autotaxina humana.
3. 3. Polipéptido de acordo com a reivindicação 2, em que a referida proteína autotaxina humana possui a sequência de aminoácidos de uma proteína autotaxina isolada a partir de células de melanoma humano A2508.
4. 4. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polipéptido é um fragmento' da referida proteína autotaxina humana.
5. 5. Polipéptido de acordo com a reivindicação 4, em que o referido fragmento compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1-11 e 26-33.
6. 6. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ligado a um suporte sólido. 1 V L-Cj ^
7. 7. Polinucleótido codificando um fragmento de proteína autotaxina humana, em que o referido polinucleótido codifica para um aminoácido que compreende uma sequência seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1-11 e 26-33.
8. 8. Polinucleótido codificando um fragmento de proteína autotaxina humana, compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 12-25.
9. 9. Molécula de ADN recombinante compreendendo o polinucleótido de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8 e um vector.
10. 10. Célula compreendendo a molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 9.
11. 11. Anticorpo possuindo afinidade de ligação para um polipéptido de acordo com a reivindicação 1.
12. 12. Método de purificação do polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, compreendendo os passos de: (i) recolher e concentrar o sobrenadante a partir de células de melanoma humano A2508 cultivadas, em que é produzida uma primeira preparação do referido péptido; (ii) fraccionamento em sal da referida primeira preparação para produzir uma segunda preparação do péptido; (iii) isolar o referido péptido da referida segunda preparação, de modo a que o referido péptido seja obtido numa forma substancialmente pura. 2
13. 13. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 12, em que o referido passo de isolamento é efectuado por cromatografia em coluna.
14. 14. Polipéptido de acordo com o reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5 para utilização em terapia e/ou diagnóstico do cancro.
15. 15. Utilização do polipéptido de acordo com o reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, no fabrico de um agente para utilização na detecção, terapia e diagnóstico de doenças humanas malignas.
16. 16. Método in vitro de diagnóstico de condições de doenças malignas, em que no referido método um anticorpo como reivindicado na reivindicação 11 é utilizado para detectar a presença de autotaxina numa amostra humana de fluidos ou tecidos corporais ou uma coloração imunológica de amostras de doentes.
17. 17. Utilização de um anticorpo de acordo com o reivindicado na reivindicação 11, ligado por ligação cruzada a uma toxina, no fabrico de um agente para utilização no tratamento do cancro. Lisboa, 16 de Outubro de 2000 O AGENTE OEICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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