PT94754B - Processo de obtencao de inibidor de factor de necrose tumoral e de isolamento de genes que codificam o referido inibidor - Google Patents

Description

PATENTE DE INVENÇÃO No 94 754

NOME:_{synergen> inc>}

EPÍGRAFE: Processo de obtenção de inibidor de factor de necrose tumoral e de isolamento de gertes que codificam o referido inibidor

INVENTORESzMichael T. Brewer, Karin K. Hale, Michael W. King, Tadahiko Kohno, Charles Squires, Robert C. Thompson, Rebecca W. Vanderslice e James Vannice.

Reivindicação do direito de prioridade (ao abrigo do artigo 4q da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883):

País: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA

Data: 18 de Julho de 1989 de Dezembro de 1989 7 de Fevereiro de 1990

N9 07/381.080, 07/450.329 e 07/479.661

271

Processo de obtenção de inibidor de fac tor de necrose tumoral e de isolamento de genes que codificam o referido inibi dor

Ref: SYN02/P0RTUGAL PATENTE N9 94 754

para que

SYNERGEN, INC., pretende obter privilégi de invenção em Portugal

RESUMO

O presente invento refere-se ao processo de produção de um inibidor de factor de necrose tumoral (TNF), o qual compreende:

(a) preparar uma sequência de ADN capaz de dirigir a célula hospedeira para a produção de uma proteína possuindo as actividades do inibidor de TNF;

(b) clonar a sequência de ADN num vector capaz de ser transferido para, e replicado numa célula inteira, contendo, o refe rido vector, elementos operacionais necessários para expressar a se quência de ADN;

(c) transferir o vector contendo a sequência de ADN sintético e os elementos operacionais num hospedeiro capaz de expressar o ADN codificando o inibidor de TNF;

(d) cultivar as células hospedeiras sob condições apropriadas para amplificação do vector e expressão do inibidor;

(e) colheita do inibidor; e (f) permitir que o inibidor assuma uma estrutura terciária activa com a qual ele possui uma actividade inibitória de TNF.

invento refere-se ainda ao processo de isolamento de genes que codificam um inibidor de TNF.

271

Ref: SYN02/PÒRTUGAL

- 2 MEMÓRIA descritiva

Referência a Pedidos Relacionados

Esta é uma continuação em parte do pedido co-pendente n9 07/479 661, depositado em 7 de Fevereiro de 1990, o qual, por sua vez, ê uma continuação em parte dos pedidos n9s 07/381 080, depositado em 18 de Julho de 1989, e 07/450 329, depositado em 11 de Dezembro de 1989, relativos a Inibidor de factor da necrose tumoral (TNF) e processo para a sua obtenção.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Os factores de necrose tumoral são uma classe de proteínas produzidas por numerosos tipos de células, incluindo monõcitos e macrófagos. Já foram descritos anteriormente, pelo menos dois TNF, especificamente, o TNF alfa e o TNF beta (linfotoxina).

Esses TNF já conhecidos, têm efeitos fisiológicos importan tes sobre diversas células-alvo envolvidas na resposta inflamatória As proteínas, provocara a segregação de prostaglandina E2 e colagenase latentes, pelas células sinoviais e fibroblastos e provocam a ressorção dos ossos pelas células osteoblãsticas. Essas proteínas, aumentam as propriedades de aderência superficial, das células endo teliais, em relação aos neutrófilos. Também induzem, nas células endoteliais, a produção de actividade coagulante e reduzem a sua capacidade de lisar coágulos. Para além disso, reorientam a actividade dos adipõcitos, desviando-os da armazenagem de lípidos, inibindo a expressão da enzima lipoproteína-lipase. Os TNF provocam, nos hepatõcitos, a síntese de uma classe de proteínas, conhecida por reagentes da fase aguda, e actuam no hipotálamo, como pirogénios. Através destas actividades, concluiu-se que os TNF desempenham um papel importante, na resposta de um organismo a estados de tensão, a infecções e a lesões . Vejam-se, por exemplo, os artigos de

P.J. Selby et al, em Lancet, 27 de Fevereiro, 1988, pg. 483; H.F. Starnes, Jr. et al, em J. Clin. Invest. 82: 1321 (1988); A. Oliff et al, em Cell 50:555 (1987); e A. Waage et al, em Lancet, 14 de Fevereiro, 1987, pg. 355.

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

No entanto, não obstante os seus efeitos normalmente benéficos, têm sido descobertas situações em que as acções dos TNF são prejudiciais. Por exemplo, a injecção do TNF alfa em animais, provoca os sintomas de choque séptico; verificou-se que os níveis endógenos de TNF aumentam, a seguir à injecção de bactérias ou paredes celulares de bactérias. Os TNF também provocam necrose do intestino e lesão pulmonar aguda, e estimulam o catabolismo da proteína muscular. Para além disso, a capacidade que os TNF têm, de aumentar o nível de colagenase numa articulação artrítica e de dirigirem a quimiotaxia e a migração de leucócitos e de linfócitos, também pode ser responsável pela degradação de cartilagens e pela proliferação de tecido sinovial, nesta doença. Portanto, os TNF podem servir de mediadores, na fase aguda, e na fase crónica de imunopatologia, na artrite reumatõide. Os TNF, também podem ser responsáveis por algumas perturbações na coagulação do sangue, atra vês de alterações na função das células endoteliais. Para além disso, demonstrou-se que existe uma produção excessiva de TNF em pacientes com SIDA, podendo ser responsável por algumas das febres, respostas de fase aguda e caquexia, que são observadas nesta doença e nas leucemias.

Nestas e noutras circunstâncias, em que o TNF tem um efeito prejudicial, existe claramente uma utilização clínica para um ini bidor da acção de TNF. Administrados sistemicamente , os inibidores de TNF serão terapêuticos úteis, contra choque séptico e caquexia. Aplicados localmente, esses inbidores de TNF servirão para prevenir a destruição de tecidos numa articulação inflamada ou noutros locais de inflamação. Na realidade, esses inibidores de TNF poderão ser ainda mais efectivos quando forem administrados em associação com inibidores da interleucina-I (IL-1).

Uma possibilidade de intervenção terapêutica contra a acção do TNF, situa-se ao nível da resposta das células-alvo às proteínas. 0 TNF parece actuar sobre as células, através de um percurso clássico, mediado por um receptor. Assim, qualquer molécula que interfira com a capacidade do TNF se ligar aos seus receptores, seja por bloqueamento do receptor, seja por bloqueamento do TNF, irá

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

regular a acção do TNF. Por estes motivos, os presentes inventores têm procurado encontrar proteínas e pequenas moléculas, capazes de inibir o TNF deste modo.

SUMÃRIO DO INVENTO

Tal como se referiu acima, este invento diz respeito a ini bidores de TNF, em geral, e, mais especificamente, a um inibidor de TNF obtido da urina. Adicionalrnente, o presente invento diz respeito a análogos biologicamente activos desse inibidor.

Um dos propósitos do presente invento, é proporcionar formas purificadas do inibidor de TNF, que sejam activas contra o TNF alfa. Um objecto adicional do presente invento, é proporcionar esses inibidores em formas purificadas, para permitir a determinação da sua sequência de aminoãcidos. Um propósito ulterior, é fornecer as sequências de aminoãcidos de certos inibidores de TNF. Para além disso, é propósito deste invento garantir uma fonte celular de ARNm que codifique os inibidores de TNF, e uma biblioteca de ADNc, que contenha um ADNc para os inibidores. Mais ainda, é objectivo deste invento proporcionar um clone genómico de ADN que codifique os inibidores do TNF, bem como as sequências de codificação desse ADN.

Também é propósito do invento, a identificação de análogos biologicamente activos desses inibidores de TNF, com propriedades intensificadas ou equivalentes.

Adicionalrnente, é propósito deste invento, proporcionar um sistema de ADN recombinante, para a produção do inibidor de TNF aqui descrito. Outro propósito do presente invento, inclui proporcionar formas purificadas do inibidor de TNF, que possam ser úteis como preparações farmacêuticas que exibam actividade contra o TNF. Um outro propósito do presente invento, inclui proporcionar combinações purificadas de inibidores de TNF e de inibidores da IL-1, que sejam úteis como preparações farmacêuticas que exibem actividade quer contra a IL-1, quer contra o TNF.

Os inventores do presente invento isolaram, pelo menos,

2 71

Ref: SYNO2/PORTUGAL

duas proteínas do inibidor de TNF, com propriedades inibidoras de TNF. Obtiveram-se uma proteína com 30 kDa e uma proteína com 40 kDa, nas suas formas purificadas. Obteve-se a sequência de aminoãcidos, da proteína com 30 kDa do inibidor de TNF. Também foi obtida informação relativa â sequência de aminoãcidos da proteína com 40 kDa do inibidor de TNF. Quer a proteína com 30 kDa, do inibidor de TNF, quer a proteína com 40 kDa, do inibidor de TNF, são proteínas novas, nunca antes descritas.

Obteve-se um clone de ADN genómico humano, que contém o gene da proteína de 30 kDa. Identificou-se uma fonte celular desta proteína, e obteve-se um clone do ADNc e determinou-se a sequência do ãcido nucleico, do gene relativo à proteína. Adicionalmente, o clone do gene foi implantado num vector, que se verificou expressar a proteína em células-hospedeiras. Também se desenvolveu um pro cesso para purificar a proteína, obtendo-a numa forma activa.

Identificou-se uma fonte celular, que produz a proteína de 40 kDa, e obteve-se um clone do ADNc e determinou-se a sequência do ãcido nucleico do gene relativo à proteína de 40 kDa. Expressaram-se em células de mamíferos, os clones de ADNc completos que codificam, quer o precursor do inibidor de TNF, com 30 kDa, quer o precursor do inibidor de TNF, com 4 0 kDa, para se obter um acréscimo no número de locais de ligação a TNF, sobre a superfície da célula.

Expressou-se em E. Coli, um gene, que codifica a forma madura da proteína com 30 kDa. Também se expressaram em E. Coli, três genes independentes, que codificam a totalidade ou da pro teína madura com 40 kDa. Cada uma das três proteínas com 40 kDa do inibidor, que foram expressas - o inibidor de TNF, com 40 kDa, maduro; o inibidor de TNF de 40 kDa Δ51, e o inibidor de TNF de 40 kDa Ó53 —, exibem actividade inibidora sobre o TNF. O inibidor com 40 kDa maduro do inibidor de TNF, tal como foi isolado, a par tir de meio condicionado pelas células U937, humanas, _o inibidor de TNF de 40 kDa,8 51, θ o inibior de TNF, de 40 kDa,Δ 53, serão referidas, .colectivamente, por inibidor de TNF, com 40 kDa.

/ 1 2/1

Ref: SYN02/PORTUGAL

O inibidor de TNF de 30 kDa, mostrou actividade inibidora sobre o TNF alfa. O inibidor de TNF, de 40 kDa, mostrou acção inibidora contra o TNF alfa e contra o TNF beta.

Será agora possível, executar uma produção em grande escala destes inibidores de TNF, através da tecnologia do ADN recombinante. Estes inibidores deverão ser apropriados para utilização em formulações farmacêuticas úteis no tratamento de estados patofisiológicos, mediados pelo TNF.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra um teste de citotoxicidade do TNF, na ausência (-.-.) e na presença (-x-x) do inibidor de TNF (30 kDa). Incubaram-se diversas concentrações de TNF, com e sem o inibidor de TNF (30 kDa), e o teste de citotoxicidade foi conduzido tal como se descreve no Exemplo 1.

A Figura 2 ilustra um teste de deslocamento em gel nativo, onde a se refere ao TNF isolado, e b se refere ao TNF + inibidor de TNF (30 kDa).

A Figura 3 mostra a coloração, com Con A-Peroxidase, do inibidor de TNF (30 kDa). Submeteram-se cerca de 200 ng de cada proteína, a uma SDS-PAGE a 14%,após o que se transferiram para um filtro de nitrocelulose. Identificaram-se as glicoproteínas, uti lizando a coloração com Con A-peroxidase. Nesta figura, o a representa um marcador da massa molecular, o b representa ovalbumina, o c representa albumina do soro de bovino, e o d representa o inibidor de TNF (30 kDa).

A Figura 4 refere-se à desglicosação química do inibidor de TNF (30 kDa). Desglicosaram-se cerca de 200 ng do inibidor de TNF (30 kDa), (faixa c) tal como se descreve no Exemplo 1.

A Figura 5 refere-se ao tratamento do inibidor de TNF (30 kDa), com N-glicanase. Iodou-se inibidor de TNF (30 kDa), purificado, com reagente de Bolton-Hunter, e tratou-se o inibidor de TNF (30 kDa) iodado e desnaturado, com N-glicanase, durante 6 horas, a 37°C. Nesta figura, o a representa o inibidor de TNF (30 kDa),

271

Ref: -SYN02/PÒRTUGAL

nativo, e o b representa o inibidor de TNF (30 kDa) desglicosado.

A Figura 6A representa um perfil de ϋθ₂θθ, ^croraat°9^raf^ia de 20 litros de urina, com DEAE-Sepharose CL-6B.

A Figura 6B representa uma auto-radiografia, do teste de deslocamento em gel nativo correspondente, que assinala um pico de inibidor de TNF (30 kDa), na fracção 57-63, que é, aproximadamente, 80 mM em NaCl.

A Figura 7 descreve um perfil de °θ280' ^^a eluição com fosfato de sódio 0,05 M, pH = 2,5, da coluna de afinidade para o TNF.

As Figuras 8A e 8C descrevem perfis cromatográficos (^DO2i5 e ^Οθ₂80^ Purificação, RP8, do inibidor de TNF (30 kDa), revelando, o bioteste em células L929, de fracções provenientes da coluna RP8, um pico, do inibidor de TNF (30kDa), para as fracções 28-31, que é, aproximadamente, 18% em acetonitrilo; e para as fracções 35 e 36, que é, aproximadamente, 21% em acetonitrilo.

A Figura 8B ilustra uma SDS-PAGE a 15%, corada com prata, do conjunto das fracções da RP8, mostrando uma banda única a 30kDa.

A Figura 9A descreve uma purificação peptídica da digestão, com Lis-C, do inibidor de TNF (30 kDa).

A Figura 9B descreve uma purificação peptídica de digeridos, com Lis-C (*) alquilados do inibidor de TNF (30 kDa).

A Figura 10 descreve uma purificação peptídica de dois digeridos, com Asp-N (*) alquilados depois do inibidor de TNF (30 kDa).

As Figuras 11A e 11B descrevem purificações peptídicas de um, digerido,com endopeptidase V8, do inibidor do TNF (30 kDa), carboximetilado e reduzido.

A Figura 12 apresenta sequências de aminoácidos presentes no inibidor de TNF (30 kDa). Os espaços em branco na sequência indicam que o resíduo não foi identificado, inequivocamente, por sequenciação de proteínas. O C* indica a identificação de carboximetilcisteína, pela presença de no resíduo.

Ref: SYN02/P0RTUGAL

A Figura 13 representa a sequência de ADN de um clone genõmico que codifica, pelo menos, uma porção de um inibidor de TNF (30 kDa).

A Figura 14 descreve, pelo menos, 70%, da sequência madura de aminoácidos, de um inibidor de TNF preferido.

A Figura 15 ilustra a detecção do inibidor de TNF no sobrenadante das U937, através do teste de deslocamento em gel.

A Figura 16 ilustra a detecção do inibidor de TNF em fracções recolhidas por hplc, do sobrenadante das U937.

A Figura 17, representa a mancha Northern, de acordo com o Exemplo 4.

A Figura 18 representa a ligação do inibidor de TNF (30 kDa), desglicosilado, ao TNF. Incubaram-se inibidor de TNF glicosilado e desglicosilado, TNF em affigel, e analisaram-se as substâncias que atravessaram os materais e os eluatos do gel, por SDS-PAGE. Nesta figura, (11) indica a passagem do inibidor de TNF, reduzido e oxidado, (21) indica a passagem do inibidor de TNF, desglicosilado, re duzido e oxidado, (51) indica a passagem do inibidor nativo, de TNF (12) indica o eluato do inibidor do TNF, reduzido e oxidado, (22) indica o eluato do inibidor do TNF, desglicosilado, reduzido e oxidado, e (52) indica o eluato do inibidor nativo de TNF.

A Figura 19, representa a sequência de aminoácidos completa, do inibidor de TNF (30kDa).

A Figura 20 representa a sequência do ADNc que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 19.

A Figura 21, representa a sequência completa, do ADNc para o percursor do inibidor de TNF (30 kDa).

A Figura 22 representa a sequência do ADN, próxima do começo do gene do inibidor de TNF (30 kDa), no plasmideo pTNFIX-1.

A Figura 23 representa o palsmídeo pCMVXV beta TNFBP paragem A .

A Figura 24 representa o plasmideo pVSXVTNFBP paragem A.

A Figura 25 ilustra um perfil cromatografico de ^D°₂i5' ^a coluna de RP8, do inibidor de TNF com 30 kDa, obtido de E. Coli.

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

Também se mostram os resultados do bioteste com as L929 (-x-x).

A Figura 26 ilustra uma SDS-PAGE, a 14%, corada com prata, das fracções de RP8 da Figura 25.

A Figura 27, ilustra um perfil cromatografico de ^DO215' purificação por RP8 dos inibidores de TNF, obtidos de células U937. Também se mostram os resultados do bio-teste com as L929, na forma de um gráfico de barras. Notam-se dois picos distintivos do ini bidor de TNF.

A Figura 28, ilustrauma SDS-PAGE, a 14%, corada com prata, das fracções da RP8. A fracção com o numero 30, contém o inibidor de TNF com 30 kDa, e a fracção com o numero 35, contém o inibidor de TNF com 40 kDa.

A Figura 29 ilustra um perfil cromatografico de °θ215 purificação do inibidor de TNF com 40 kDa, obtido da urina. Combinaram-se os segundos picos dos inibidores de TNF, de diversas cromatograf ias de RP8 e submeteram-se a reanãlise numa coluna de RP8.

A actividade inibidora de TNF, é apresentada na forma de um gráfico de barras. A diferença entre o pico da °θ₂ΐ5 ^e ° Pi^co da actividade, reflecte o volume morto entre o detector e o colector de frac ções.

A Figura 30 ilustra uma SDS-PAGE, a 14%, corada com prata, das fracções de RP8, de urina. A fracção com o número 32, contém o inibidor de TNF de 40 kDa.

A Figura 31 representa as sequências amino terminais, de inibidores obtidos das U937 (30 kDa e 40 kDa), e do inibidor de TNF, de 40 kDa, obtido da urina.

A Figura 32 ilustra uma purificação peptidica do inibidor de TNF de 40 kDa digerido pela endopeptidase V8.

A Figura 33 ilustra uma purificação peptidica do inibidor de TNF com 40 kDa digerido pela endopeptidase Arg-C.

A Figura 34 ilustra uma purificação peptidica do péptido Arg-C16, digerido pela tripsina.

A Figura 35, ilustra uma purificação peptiidca do péptido Arg-ClO , digerido pela quimotripsina.

A Figura 36 representa uma estrutura primária do inibidor de TNF de 40 kDa.

A Figura 37 representa uma parte da sequência, do ADNc, do

271

Ref: SYNO2/PORTUGAL

inibidor de TNF de 40 kDa, juntamente com o produto previsto da tradução em aminoãcidos.

A Figura 38, representa a sequência completa de aminoãcidos, do inibidor de TNF de 40 kDa.

A Figura 39, representa toda a sequência, do ADNc para o precursor do inibidor de TNF de 40 kDa, juntamente com o seu produto de tradução, deduzido.

A Figura 40 ilustra um teste de citotoxicidade, do TNF beta (linfotoxina), na presença do inibidor de TNF de 40 kDa (o-o), na presença do inibidor de TNF de 30 kDa (·-·), e sem nenhum inibidor (x-x).

A Figura 41 refere-se à expressão da sequência, do ADNc, do inibidor de TNF 30 kDa, apresentadas na Figura 21, em células

COS7. As células COS foram transfectadas com plasmideos, usando o procedimento com lipofectina de Feigner et al. (Proc. Natl. Acad.

Sei.(USA) 84, 7413-1987). Incubaram-se 3,4 x 10$ células, com as -125 quantidades indicadas de J_ I_/TNFa, com uma actividade específica4 ~ - da de 5,6 x 10 cpm/ng, determinando-se a quantidade ligada as células. Os símbolos abertos, representam a cpm total, associado às células depois de uma incubação de 4 horas, a 4°C. Os símbolos -125 a cheio, representam o / I_/TNFa ligado, na presença de um excesso de 180 vezes de TNFa não marcado, frio.

A Figura 42 refere-se à expressão da sequência do ADNc, do inibidor de TNF com 40 kDa, apresentada na Figura 39, em células

COS7. As condições do teste, eram idênticas às que foram descritas * -125 — para a Figura 41. Os símbolos a cheio, representam o / I_/TNFa ligado, na presença de um excesso de 180 vezes, de TNFa não marcado, frio.

A Figura 43 ilustra o teste de citotoxicidade, de uma fracção de monócitos humanos, obtida por HPLC RPC-8, os quais foram tratados com PMA e PHA durante 24 horas.

A Figura 44 representa o padrão cromatogrãfico de RPC-8, do inibidor de TNF de 40 kDa,Δ51 (A), a anãlise por SDS-gel de poli-acrilamida, das fracções, (Β), e o teste de citotoxicidade, em células L929, (C).

A Figura 45 representa o padrão cromatogrãfico de RPC-8, do inibidor de TNF de 40 kDa,Δ 53, (A), a anãlise SDS-gel de poliRe f: SYN02/PORTUGAL

-acrilamida, das fracçoes, (Β), e o teste de citotoxicidade, em células L929, (C).

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Far-se-à, agora, referência detalhada, às concretizações presentemente preferidas, do invento, as quais, juntamente com os exemplos seguintes, sevirão para explicar os princípios do invento.

1. Inibidor isolado a partir da urina

Tal como já -se referiu acima, o presente invento diz respeito a inibidores de TNF que foram isolados numa forma purificada. Numa das concretizações deste invento, os inibidores de TNF são obtidos, preferencialmente, da urina. Adicionalmente, o invento abarca inibidores de TNF, substancialmente purificados, de qualquer origem, que sejam biologicamente equivalentes, ao inibidor isolado da urina. Ao longo desta especificação, qualquer referência a um inibidor de TNF ou, simplesmente, a um inibidor, deve ser entendida como referindo-se a cada um dos inibidores, aqui identificados e descritos.

A expressão biologicamente equivalente, na acepção usada ao longo da especificação e das reivindicações, pretende significar composições do presente invento, que sejam capazes de evitar a acção do TNF, de um modo semelhante ao que é exercido pelo inibidor nativo, de TNF, isolado a partir da. urina, mas não necessariamente no mesmo grau. A expressão substancialmente homólogo, na acepção usada ao longo da especificação e das reivindicações seguintes, pretende significar um grau de homologia com o inibidor de TNF nativo, isolado a partir da urina, que exceda o apresentado por qualquer outro inibidor do TNF, relatado anteriormente. De preferência, o grau de homologia cifra-se em mais de 70%, mais pre ferivelmente, em mais de 80%, e, ainda mais preferivelmente, em mais de 90%, 95% ou 99%. Um grupo particularmente preferido, de inibidores de TNF, possui um grau de homologia que excede 95%, o do inibidor nativo. A percentagem de homologia, tal como se descreve aqui, calcula-se na forma da percentagem de resíduos de /1 Ζ /1

Ref: SYN02/P0RTUGAL

aminoácido, encontrados na menor das duas sequências, que se alinham com resíduos de aminoácido idênticos, da sequência com a qual está a ser comparada, quando podem introduzir-se 4 lacunas, numa extensão de 100 aminoácidos, para auxiliar esse alinhamento, tal como foi demonstrado por Dayhoff, no Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, p. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., aqui especificamente incorporado para referência. Os inibidores de TNF, que podem ser isolados devido a reactividade cruzada com anticorpos do inibidor descrito, ou cujos genes podem ser isolados através de hibridação com o gene, ou com segmentos, do inibidor descrito, também estão incluídos na designação de substancialmente homólogos.

Os inibidores de TNF preferidos, no presente invento, foram obtidos da urina e, pela primeira vez, foram isolados,. numa forma purificada. No âmbito da presente patente, as designações forma pura ou forma purificada, quando forem usadas em relação aos inibidores do TNF aqui descritos, devem ser entendidas como significando uma preparação praticamente isenta de proteínas que não sejam as proteínas do inibidor de TNF. De preferência, os inibidores de TNF, do presente invento, são, pelo menos, 50% puros, preferencialmente, 75% puros e, muito preferivelmente, 80%, 95% ou 99% puros. Numa concretização do presente invento, a preparação da proteína do inibidor de TNF, é suficientemente pura, para possibilitar que, um vulgar entendido na arte, possa determinar a sua sequência de aminoácidos, sem que haja necessidade de efectuar outras etapas de purificação, prévias.

Foram isolados, pelo menos dois inibidores de TNF, através dos métodos descritos nos exemplos. Os dois inibidores, são moléculas com 30 kDa e 40 kDa, aproximadamente, sobre SDS-PAGE. O inibidor com 30 kDa, é eluído de uma coluna DEAE CL6B, de tampão Tris e pH = 7,5, a 80 mM de NaCl. A sequência de aminoácidos, do inibidor com 30 kDa, é apresentada na Figura 19 e a sequência de aminoácidos, do inibidor com 40 kDa é apresentada na Figura 38. Mos trou-se que o inibidor de TNF de 30 kDa inibe a actividade de TNF alfa e tem pouca influência na actividade do TNF beta. Mostrou-se

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

que o inibidor de TNF de 40 kDa, exibe um efeito inibidor significativo, quer contra o TNF alfa, quer contra o TNF beta (linfotoxina) .

2. Inibidor isolado a partir de meio condicionado por U937

Numa concretização alternativa do presente invento, os inibidores de TNF são isolados a partir de um meio condicionado por células U937 humanas. Isolaram-se e identificaram-se duas proteínas do inibidor de TNF, a partir deste meio condicionado. Os dois inibidores de TNF, são proteínas com 30 kDa e com 40 kDa, que são substancialmente homologas aos inibidores de 30 kDa e de 40 kDa, isolados da urina, e são biologicamente equivalentes a essas proteínas.

3. Estrutura do inibidor de TNF de 30 kDa

O inibidor de TNF de 30 kDa, isolado da urina, é uma glicoproteína, que contém pelo menos uma porção hidrato de carbono. Numa das concretizações deste invento, o inibidor natural de TNF de 30 kDa, é desglicosilado. O inibidor de TNF, desglicosilado, que conserva a sua capacidade de se ligar ao TNF, inclui-se no âmbito do presente invento. Os inibidores de TNF de 30 kDa, completa e parcialmente desglicosilados, estão abrangidos por este invento.

O inibidor de TNF de 30 kDa, desglicosilado, isolado da urina, é uma proteína com, aproximadamente, 18 kDa.

A sequência de gene identificada, que codifica a proteína de 30 kDa, não contém um codão de terminação, como seria previsto a partir da sequência de aminoácidos da proteína com 18 kDa. Os inventores teorizam, mas não ficarão de nenhum modo limitados por esta teoria, que as proteínas produzidas in vivo, contêm sequências adicionais de aminoácidos. De acordo com essa teoria, a proteína codificada é uma molécula receptora do TNF. A proteína do inibidor, codificada pelo ADNc, possui uma sequência hidrofõbica, que seria compatível com a região abrangida pela membrana celular, e uma porção de ligação ao TNF, que se estenderia para o exterior da célula, a partir da membrana celular. De acordo com esta hipótese, e tal como se descreve no Exemplo 19, expressou-se o ADNc em células t J. Ζ / X

Ref: SYN02/P0RTUGAL

COS o que conduziu a um acréscimo do número de locais de ligação com o TNF, na célula. Os inibidores de TNF do presente invento são, portanto, fragmentos do receptor ou porções da molécula receptora. Esses fragmentos de ligação foram identificados em relação a outras moléculas de ligação/de inibição (por exemplo, o inibidor IL-2), e são referidos por receptores solúveis.

Esta teoria é consistente com a falta de um codão de terminação, na sequência de nucleótidos, que correspondesse ao terminus da proteína, tal como foi previsto a partir da sequência conhecida do factor inibidor de TNF, isolado.

Também é consistente, com o facto de a sequência de nucleõ tidos, para além do local onde deveria ser encontrado o codão de terminação, codificar uma serie de aminoácidos hidrofóbicos.

Portanto, o presente invento abrange, não apenas a porção dos inibidores de TNF, que foi identificada e descrita, mas também, todas as proteínas que contenham alguma porção da sequência de aminoácidos codificada pelas sequências de ADNc aqui identificadas e descritas.

4. Estrutura do inibidor de TNF, de 40 kPa inibidor de TNF de 40 kDa, isolado de um meio condicionado por células U937 humanas e identificado na urina é uma glicoproteína, que contém, pelo menos, uma porção hidrato de carbono. Nu ma das concretizações deste invento, o inibidor natural de TNF de 40 kDa, é desglicosilado. O inibidor desglicosilado de TNF de 40 kDa, que conserva a sua capacidade de se ligar, quer ao TNF alfa, quer ao TNF beta (linfotoxina), estã contido no âmbito deste invento. O inibidor de TNF de 40 kDa, completa e parcialmente desglicosilado , está abrangido por este invento. Os inventores, teorizam que o inibidor de TNF, com 40 kDa, também possa ser um receptor solúvel. A sequência de gene identificada, que codifica a proteína de 40 kDa, não contém um codão de terminação, como seria previsto a partir da sequência de aminoácidos do inibidor desglicosilado de TNF dc 40 kDa. Tal como sc descreve no Exemplo 20, expressou-se o

Ref: SYN02/P0RTUGAL

271

ADNc em células COS, o que conduziu a um acréscimo do número de locais de ligação com o TNF, na célula.

presente invento, abrange o gene que codifica a proteína de 40 kDa, madura, isolada de um meio condicionado por célula U937 humanas e identificada na urina, bem como porções maiores ou menores desse gene, desde que a actividade inibidora sobre o TNF, da proteína codificada, não seja afectada. Tal como se pode ver, na Figura 38, o inibidor maduro de TNF de 40 kDa possui uma área rica em prolina, perto do terminal C previsto, da proteína. Os inibidores de TNF de 4 0 kDa, nos quais a totalidade ou porções da região rica em prolina, não estão incluídos na proteína, são activos como inibidores de TNF e são abrangidos pelo presente invento. Duas dessas proteínas encurtadas, são descritas nos Exemplos 17 e 22, abaixo, e são designadas por inibidor de TNF de 40 kDa,Δ51, e por inibidor de TNF de 40 kDaΔ53. Todas as partes deste pedido que se refiram, genericamente, ao inibidor de TNF de 40 kDa, abrangerão, quer a proteína madura de 40 kDa, isolada de meio condicionado por células U937 humanas, e identificada na urina, quer o inibidor de TNF de 40 kDa,ô51, e o inibidor de TNF, de 40 kDa, Δ53.

Em geral, pensa-se que, pelo menos um, dos receptores do TNF, seja capaz de ligar o TNF alfa e o TNF beta, enquanto alguns receptores de TNF sõ são capazes de ligar o TNF alfa. Isto é consistente com as conclusões do presente invento, segundo as quais se identificaram dois inibidores de TNF, ambos propostos como fragmentos activos de locais receptores de TNF, sendo um activo apenas contra o TNF alfa e sendo o outro activo contra ambos, o TNF alfa e o TNF beta.

5. Inibidor recombinante

a) Generalidades

Será agora descrito um processo de ADN recombinante, para a manufactura de um inibidor de TNF. Numa das concretizações do invento, o local activo funciona de um modo biologicamente equivalente ao do inibidor de TNF, icolado da urina. Pode usar-se uma sequên

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

cia natural ou sintética, de ADN, para dirigir a produção desses inihidores de TNF. Este processo compreende:

a) preparar uma sequência de ADN capaz de obrigar uma célula hospedeira a produzir uma proteína que tenha actividades inibidoras do TNF, ou um seu precursor.

b) cionar a sequência de ADN num vector, capaz de ser transferido para uma célula hospedeira e de nela ser replicado, vector esse que conterá elementos operacionais, necessários para expressar a sequência de ADN, ou um seu precursor;

c) transferir o vector que contém a sequência sintética de ADN e os elementos operacionais, para uma célula hospedeira, capaz de expressar o ADN que codifica o inibidor de TNF ou um seu precursor;

d) cultivar as células hospedeiras, sob condições que permitam a amplificação do vector e a expressão do inibidor ou de um seu precursor;

e) recolher o inibidor ou um seu precursor; e

f) permitir que o inibidor assuma uma estrutura terciária activa, por intermédio da qual possua, ou possa ser transformado numa proteína que possua actividade inibidora de TNF:

Numa concretização do presente invento, o inibidor de TNF é produzido pela célula hospedeira, na forma de uma proteína precursora. Esta proteína precursora, é transformada numa proteína, através de uma ou mais etapas, após o que se permite que se dobre (fold) correctamente, tornando-se um inibidor activo de TNF, usando processos conhecidos dos que possuem um conhecimento médio da arte.

b) Sequências de ADN

As sequências de ADN contempladas para utilização neste método, são parcialmente discutidas nos Exemplos 6, 14A e 17. Está contemplado que essas sequências incluam sequências sintéticas e naturais de ADN e suas combinações. As sequências naturais, incluem

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

ainda, ADNc ou fragmentos de ADN genomico.

Os meios para a criação sintética de sequências de polinucleótidos, que codificam uma proteína idêntica à codificada pelo ADNc ou por sequências polinucleotídicas genómicas, são em geral conhecidas pelos que possuem um conhecimento médio da arte, sobretudo ã luz dos ensinamentos aqui contidos. Como exemplo do estado actual da arte, em relação â síntese de polinucleõtidos, aconselhamos Matteucci, M.D., e Caruthers, M.H., no J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981) e Beaucage S.L., e Caruthers, M.H. no Tetrahedron Lett. 22:1859 (1981), bem como as instruções fornecidas com um sintetizador de oligonucleõtidos ABI, cada uma das quais é aqui especificamente incorporada como referência.

Estas sequências sintéticas podem ser idênticas âs sequências naturais, descritas abaixo com maior detalhe, ou podem conter nucleótidos diferentes. Numa concretização se as sequências sintéticas contêm nucleótidos diferentes dos que são encontrados nas sequências naturais de ADN deste invento, estã contemplado que essas sequências diferentes codificarão ainda um polipéptido, que terá a mesma estrutura primária do que o inibidor de TNF, isolado da urina. Numa concretização alternativa, a sequência sintética, que contém nucleótidos diferentes, codificará um polipéptido, que possui a mesma actividade biológica do que o inibidor de TNF aqui descrito.

Adicionalmente, a sequência de ADN pode ser um fragmento de uma sequência natural, isto é, um fragmento de um polinucleótido que ocorra na natureza e que tenha sido isolado e purificado, pe la primeira vez, pelos presentes inventores. Numa das concretizações, a sequência do ADN é um fragmento de restrição isolado de uma biblioteca de ADNc.

Numa concretização alternativa, a sequência do ADN é isolada de uma biblioteca genómica humana. Um exemplo de tal biblioteca, útil nesta concretização, é descrito por Wyman, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 2880 - 2884.

Numa versão preferida desta concretização, está contempla71 271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

do que a sequência natural de ADN seja obtida através de um método que compreende:

a) Organizar uma biblioteca de ADNc humano, a partir de células, de preferência células U937, capazes de gerarem um inibidor de TNF, num vector e numa célula capaz de amplificar e expressar todo ou parte desse ADNc;

uma

b) Sondar a biblioteca de ADN humano, com pelo menos/sonda capaz de se ligar ao gene do inibidor de TNF ou à sua proteína-produto;

c) Identificar pelo menos um clone que contenha o gene que codifica o inibidor, em virtude da capacidade do clone ligar, pelo menos uma sonda, para o gene ou para a sua proteína-produto;

d) Isolar o gene, ou porção de gene, que codifica o inibidor, a partir do clone ou dos clones escolhidos; e

e) Ligar o gene ou seus fragmentos adequados, a elementos operacionais, necessários para manter e expressar o gene numa célula hospedeira.

As sequências naturais de ADN úteis no processo precedente, também podem ser identificadas e isoladas por intermédio de um método, que compreende:

a) Organizar uma biblioteca genómica humana, propagada de preferência num hospedeiro sbc, recBÇ, preferencialmente o CES 200;

j b) Sondar a biblioteca genómica humana com, pelo menos, uma sonda capaz de ligar um gene do inibidor de TNF ou a sua proteína-produto ;

c) Identificar pelo menos um clone que contenha o gene que codifica o inibidor, através da capacidade do clone ligar, pelo menos, uma sonda para o gene ou sua proteína-produto;

d) Isolar o gene que codifica o inibidor, a partir do clone ou dos clones identificados; e

e) Ligar o gene, ou seus fragmentos adequados, a elementos operacionais para manter e expressar o gene numa célula hospedeira.

As etapas seguintes, incluem-se num terceiro método poten71 271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

ciai para a identificação e o isolamento de sequências naturais de ADN, útil no processo precedente:

a) Preparar ARNm, a partir de células que produzem o inibidor de TNF;

b) Sintetizar ADNc (de cadeia simples ou dupla), a partir desse ARNm;

c) Amplificar as sequências de ADN específicas do inibidor de TNF, presentes nessa mistura de sequências de ADNc, utilizando o processo da reacção em cadeia ccm polimerase (PCR), com iniciadores como os que são apresentados na Tabela 5;

d) Identificar os produtos do PCR que contenham sequências que estejam presentes noutras sondas oligonucleotídicas, apresentadas na Tabela 5, utilizando a análise de manchas de Southern;

e) Subclonar os fragmentos de ADN, assim identificados, em vectores M13, que permitam sequenciação directa das sequências de ADN;

f) Usar essas sequências, para isolar um clone de ADNc a partir de uma biblioteca de ADNc; e

g) Ligar o gene, ou seus fragmentos adequados, a elementos operacionais, necessários para manter e expressar o gene em células hospedeiras.

Ao isolar-se uma sequência de ADN, apropriada para utilização no método acima, prefere-se identificar os dois locais de restrição localizados no interior e na proximidade das porções de extremidade do gene apropriado ou de secções do gene que codifica a proteína nativa ou seus fragmentos. 0 segmento de ADN que contém o gene apropriado ou secções do gene, é, então, removido do material genómico restante, usando endonuleases de restrição apropriadas. Depois da excisão, as extremidades 3' e 5' da sequência do ADN, e quaisquer junções intrão-exão, serão reconstruídas, para se obterem sequências de ADN apropriadas, capazes de codificarem os terminais N e C e o corpo da proteína inibidora de TNF, e capazes de fundirem a sequência do ADN, com os seus elementos operacionais.

ί 1 Ζ /1

Ref: SYN02/P0RTUGAL

Tal como se descreve no Exemplo 17, abaixo, a sequência de ADN, utilizada para a expressão do inibidor de TNF de 40 kDa, pode ser modificada, pela remoção do par de bases 153 ou do par de bases 159, do gene que codifica o inibidor maduro de TNF, de 40 kDa, isolado do meio condicionado por células U937 humanas e identificada na urina. O gene da^53, foi preparado para remover a região prolina do terminal C do gene completo, e o gene da Ú.51, foi preparado para aproximar o terminal C do gene que codifica o inibidor de TNF de 30 kDa.

Depositou-se na American Type Culture Collection, Rockville, M.D., o ns de acesso 40645, uma sequência de ADN, isolada de acordo com estes métodos, a partir de uma biblioteca de ADNc, e que codifica, pelo menos, uma porção de inibidor de TNF de 30 kDa, aqui descrito.

Depositou-se na American Type Culture Collectioi\ Rockville, MD/ o ns de acesso 40620, uma sequência de ADN, isolada de acordo com estes métodos, a partir de uma biblioteca de ADN genómico humano, e que codifica pelo menos uma porção do inibidor de TNF de 30 kDa, aqui descrito.

Depositou-se na American Type Culture Collection, Rockville, MD, o ns de acesso 68204, uma sequência de ADN, isolada de acordo com estes métodos, a partir de uma biblioteca de ADNc, e que codifica pelo menos uma porção do inibidor de TNF de 40 kDa, aqui descrito.

6. Vectores

a) Microrganismos, sobretudo a E. Coli

Os vectores contemplados para utilização no presente invento incluem quaisquer vectores em que possa ser inserida uma sequência de ADN, tal como foi descrita acima, juntamente com quaisquer elementos operacionais, preferidos ou requeridos, vectores esses que possam ser transferidos, subsequentemente, para uma célula hospedeira, e nela possam ser replicados. Os vectores preferidos, são aqueles cujos locais de restrição já foram bem documentados e

271

P) Ref: SYN02/PORTUGAL

que contêm os elementos operacionais preferidos, ou requeridos, para a transcrição da sequência de ADN. No entanto, também estão previstas determinadas concretizações do presente invento, que empregarão vectores ainda não descobertos, que contenham uma, ou mais, das sequências de ADNc aqui descritas. Em particular, prefere-se que todos esses vectores possuam algumas ou todas das características seguintes: (1) possuam um número mínimo de sequências do organismo hospedeiro; (2) sejam mantidos e propagados no organismo hospedeiro, de forma estável; (3) sejam capazes de estar presentes no hospedeiro desejado, can um número elevado de cópias; (4) possuam um promotor regulável posicionado de forma que promova a transcrição do gene de interesse; (5) tenham pelo menos uma sequência de ADN marcadora, que codifique um traço caracteristico seleccionãvel, presente numa porção do plasmideo, separada daquela onde será inserida a sequência de ADN; e (6) tenha uma sequência de ADN capaz de terminar a transcrição.

Em várias concretizações preferidas, esses vectores de cio nação, que contêm, e são capazes de expressar, as sequências de ADN do presente invento, contêm vários elementos operacionais. Do modo como se discutem aqui esses elementos operacionais incluem, pelo menos, um promotor, pelo menos uma sequência de Shine-Dalgarno e um codão iniciador, e, pelo menos, um codão terminador. De preferência, esses elementos operacionais também incluem, pelo menos, um operador, pelo menos uma sequência de comando, para proteínas a ser exportadas do espaço intracelular, pelo menos um gene para uma proteína reguladora, e quaisquer outras sequen cias de ADN, necessárias ou preferidas para a transcrição e para a tradução subsequente, apropriadas, do ADN do vector.

Alguns desses elementos operacionais, podem estar presentes em cada um dos vectores preferidos, do presente invento. Estã contemplado, que quaisquer elementos operacionais adicionais, que possam ser requeridos, possam ser adicionados a esse vector, usando métodos conhecidos dos que têm um conhecimento médio da arte, sobretudo ã luz dos ensinamentos aqui incluídos.

Na prática, é possível construir cada um desses vectores,

271

Ref: SYNO2/PORTUGAL

de um modo que permita que sejam isolados, montados e permutados, com facilidade. Isto facilita a montagem de numerosos genes funcionais, a partir de combinações desses elementos e da região de codificação das sequências de ADN. Para além disso, muitos desses elementos serão aplicáveis em mais do que um hospedeiro. Adicionalmente, estã contemplado que os vectores, em certas concretizações preferidas, contenham sequências de ADN capazes de funcionarem como reguladores (operadores), bem como outras sequências de ADN capazes de codificarem proteínas reguladoras.

(i) Reguladores

Numa concretização estes reguladores servirão para impedir a expressão da sequência de ADN, na presença de certas con dições ambientais e, na presença de outras condições ambientais permitirão a transcrição, e a expressão subsequente, da proteína codificada pela sequência de ADN. Em particular, é preferido que segmentos reguladores sejam inseridos no vector, de modo que essa expressão da sequência de ADN não ocorra ou que ocorra em escala grandemente reduzida na ausência de por exemplo, isopropiltio-beta-D-galactõsido. Nessa situação, os microrganismos transforma dos que contêm a sequência de ADN podem ser cultivados até uma densidade pretendida, antes que se inicie a expressão do inibidor de TNF. Nesta concretização, a expressão da proteína desejada é induzida pela adição de uraa substância, ao meio microbiano, capaz de causar a expressão da sequência de ADN, de pois de ter sido atingida a densidade desejada.

(ii) Promotores

Os vectores de expressão terão que conter promotores que possam ser usados pelo organismo hospedeiro, para expressão das suas próprias proteínas. Se bem que o sistema promotor de lactose seja comummente usado, foram isolados e caracterizados outros promotores microbianos, capacitando, todos os que possuam um conhecimento médio da arte, para a sua utilização, na expressão do inibidor recombinante de TNF.

2 71

Ref: SYN02/PORTUGAL

(iii) Terminador de transcrição

Os terminadores de transcrição, aqui contemplados, servem para estabilizar o vector. Em particular, as sequências descritas por Rosenberg, M. e Court, D., na Ann. Rev. Genet. 13: 319 - 353 (1979) , aqui especificamente incorporadas como referência, são contempladas para uso no presente invento.

(iv) Sequência não traduzida

Faz-se notar que, na concretização preferida, também pode ser desejável reconstruir a extremidade 3' ou 5', da região de codificação, para permitir que as sequências 3’ ou 5’, não traduzi) das, sejam incorporadas no transcrito do gene. Incluídas nessas sequências não traduzidas, estão as que estabilizam o ARNm, tal como foram identificadas por Schmeissner, U., Mckenney, K., Rosenberg,

M e Court, D. na J. Mol. Biol. 176: 39 - 53 (1984), aqui especificamente incorporadas como referência.

(v) Locais de ligação a ribossomas

A expressão microbiana de proteínas estranhas, requer certos elementos operacionais, que incluem, embora não se lhes fiquem limitados, os locais de ligação a ribossomas. Um local de ligação a ribossomas, ê uma sequência que o ribossoma reconhece e à qual se liga no início da síntese proteica, tal como é apresentado por ) Gold, L., et al, Ann. Rev. Microbio. 35: 557 - 580; ou Marquis, D. Μ., et al, Gene 42: 175 - 183 (1986), ambos aqui especificamente incorporados como referência. Um local de ligação a ribossomas preferido, é o GAGGCGCAAAAA (ATG).

(vi) Sequência de comando e acoplador da tradução

Adicionalmente, prefere-se que o ADN que codifica uma sequência de comando de secreção (sinal) apropriado esteja presente na extremidade 5' da sequência do ADN, tal como é descrito por Watson, Μ. E. na Nucleic Acids Res. 12: 5145 - 5163, aqui especificamente incorporado como referência, se a proteína for para ser excretada do citoplasma. 0 ADN da sequência ds comando, terá que se / 1 2/1 .

Ref: SYN02/PORTUGAL situar numa posição que permita a produção de uma proteína de fusão na qual a sequência de comando estã imediatamente adjacente ao inibidor, e a ele ligada por covalência, isto é, não podem existir sinais de terminação de tradução ou sinais de terminação de transcrição, entre as duas sequências de codificação de ADN. É desejada, a presença da sequência de comando, em parte por uma ou mais das razoes seguintes. Em primeiro lugar, a presença da sequência de comando pode facilitar o processamento do inibidor de TNF, pelo hospedeiro. Em particular, a sequência de comando pode dirigir a clivagem, do produto de tradução inicial, por uma peptidase de comando para se remover a sequência de comando e deixar um polipéptido com a sequência de aminoãcidos que possuía actividade proteica potencial. Em segundo lugar, a presença da sequência de comando, pode faci litar a purificação do inibidor de TNF, ao dirigir a proteína para o exterior do citoplasma celular. Em algumas espécies de microrganismos hospedeiros, a presença de uma sequência de comando apropriada, permitirá o transporte da proteína completa, para o interior do espaço periplãsmico, tal como sucede com algumas E. Coli. No caso de certas E. Coli, Saccharomyces e estirpes de Bacillus e Pseu domonas, a sequência de comando apropriada, permitirá o transporte da proteína para o meio extracelular, através da membrana celular. Nessa situação, a proteína pode ser purificada a partir de proteína extracelular. Em terceiro lugar, no caso de algumas das proteínas preparadas pelo presente invento, a presença da sequência de } comando pode ser necessária, para posicionar a proteína completa num ambiente onde esta se possa dobrar, para assumir a sua estrutura activa, estrutura essa que possui a actividade proteica apropria da.

Numa concretização preferida do presente invento, po siciona-se uma sequência de ADN adicional, imediatamente antes da sequência de ADN que codifica o inibidor de TNF. A sequência de ADN adicional, é capaz de funcionar como acoplador da tradução, isto é, é uma sequência de ADN que codifica um ARN que serve para posicionar os ribossomas, numa posição imediatamente adjacente ao local de ligação a ribossomas do ARN do inibidor, ao qual é contíguo. Numa concretização do presente invento, pode obter-se o acoRef: SYN02/PORTUGAL / ± Ζ / J.

plador da tradução, usando a sequência de ADN TAACGAGGCGCAAAAAATGA AAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG e métodos normalraente conhe eidos dos que têm um conhecimento médio da arte relativa a acopladores da tradução.

(vii) Terminadores da tradução

Os terminadores da tradução, aqui contemplados, servem pa ra parar a tradução do ARNm. Podem ser naturais, tal como é descri· to por Kohli, J., Mol. Gen. Genet. 182: 430 - 439; ou sintetizados tal como é descrito por Pettersson, R. F. Gene 24: 15 - 27 (1983) , sendo ambas as referências aqui especificamente incorporadas como referência.

(viii) Marcador seleccionavel

Adicionalmente, prefere-se que o vector de clonação conte nha um marcador seleccionavel, tal como um marcador de resistência a uma droga ou outro marcador, que cause a expressão de um traço seleccionavel pelo microrganismo hospedeiro. Numa das concretizações do presente invento, introduz-se o gene da resistência ã ampicilina, no vector, enquanto, noutros plasmídeos, se introduzem o gene da resistência à tetraciclina ou o gene da resistência ao cloramfenicol.

Um tal marcador de resistência a droga, ou outro marcador seleccionavel têm em parte, o objectivo de facilitar a selecção de transformantes. Adicionalmente, a presença de um tal marcador seleccionavel, no vector de clonação, pode ser útil, para evitar que microrganismos contaminantes se multipliquem no meio de cultura. Nesta concretização seria obtida uma cultura pura dos microrganismos hospedeiros transformados,atra vés de cultivo dos microrganismos, sob condições que requeressem o fenõtipo induzido, para a sobrevivência.

Os elementos operacionais, tal como foram aqui descritos, são seleccionados por rotina pelos que têm conhecimentos médios da artp, 5 luz de literatura anterior e dos ensinamentos aqui contidos. Em B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983) , são apreIX XIX

Ref: SYN02/PORTUGAL

sentados exemplos gerais desses elementos operacionais, o que fica aqui especificamente incorporado como referência. Podem ser encontrados vários exemplos de elementos operacionais adequados nos vectores discutidos acima, os quais podem ser elucidados através de revisão das publicações que discutem as características básicas dos vectores supramencionados.

Depois da síntese e do isolamento de todas as partes componentes, necessárias e desejadas, do vector discutido acima, cons troi-se o vector, através de métodos em geral conhecidos dos que têm um conhecimento médio da arte. Crê-se que a construção desses vectores, esteja dentro das tarefas e dos objectivos dos que têm um conhecimento médio da arte e, por isso, pode ser efectuado sem experimentação desmesurada. Por exemplo, ligaram-se sequências de ADN semelhantes, a vectores de clonação apropriados, tal como é descrito por Maniatis et al, em Molecular Cloning, Cold Spring Har bor Laboratories (1984), o que é aqui especificamente incorporado como referência.

Na construção dos vectores de clonação do presente invento, deve notar-se, adicionalmente, que podem ser inseridas, em cada vector, cópias múltiplas da sequência de ADN e dos seus elementos operacionais auxiliares. Numa concretização dessas, o organismo hospedeiro produziria maiores quantidades do inibidor de TNF de sejado, por vector. 0 número de cópias múltiplas, da sequência de ADN, que podem ser inseridas no vector, apenas estã limitado pela capacidade de o vector resultante, devido ao seu tamanho ser trans ferido para uma célula hospedeira apropriada, e nela ser replicado e transcrito.

b) Outros microrganismos

Os vectores adequados para utilização em microrganismos, que não a E. Coli, também estão contemplados por este invento. Estes vectores estão descritos na Tabela 1. Adicionalmente, discutem -se abiaxo determinados vectores preferidos.

/1 2/±

Ref: SYN02/P0RTOGAL

271 ) Ref: SYN02/PORTUGAL

1. Backman, K., Ptashne, M. e Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 21, 4174-4178 (1976).

2. de Boer, H.A., Comstock, L.J., e Vasser, M. Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 21-25 (1983).

3. Shimatake, H. e Rosenberg, M. Nature 232, 128-132 (1981).

4. Derom, C., Gheysen, D. e Fiers, W. Gene 12» 45-54 (1982).

5. Hallewell, R.A. e Emtage, S. Gene 1, 27-47 (1980).

6. Brosius, J., Dull, T.J., Sleeter, D.O. e Noller, H.F. J. Mol. Biol. 148 107-127 (1981).

)

7. Normanly, J., Ogden, R.C., Horvath, S.J. e Abelson, J. Nature 121, 213-219 (1986).

8. Belasco, J.G., Nilsson, G., von Gabain, A. e Cohen,

S.N. Cell £fe, 245-251 (1986).

9. Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg M. e Court, D. J. Mol. Biol. 176. 39-53 (1984).

10. Mott, J.E., Galloway, J.L. e Platt, T. EMBO J. 1887-1891 (1985).

11. Koshland, D. e Botstein, D. Cell 23, 749-760, (1980).

12. Mowa, N.R., Kakamura, K. e Inouye, M. J. Mol. Biol. i±l, 317-328 (1980).

. 13. Surin, B.P., Jans, D.A., Fimmel, A.L., Shaw, D.C.,

Cox, G.B. Rosenberg, H. J. Bacteriol. 157. 772-778 (1984).

14. Sutcliffe, J.G. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 25» 37373741 (1978).

15. Peden, K.W.C. Gene 22, 277-280 (1983).

16. Alton, N.K. e Vapnek, D. Nature 232, 864-869 (1979).

17. Yang, M., Galizzi, A., e Henner, D. Nuc. Acids Res. 11(2). 237-248 (1983).

18. Wong, S.-L., Price C.W., Goldfarb, D.S., e Doi,

R.H. Proc. Natl. Acad. Sei. USA H» 1184-1188 (1984).

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

-2919. Wang, P.-Z. e Doi, R.H. J. Biol. Chem. 251. 86198625, (1984).

20. Lin, C.-K., Quinn, L.A., Rodriguez, R.L. J. Cell Biochem. Suppl. (9B). p. 198 (1985).

21. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J., e Filpula, D. J. Bact. 159(31 . 811-819 (1984) .

22. Piava, I., Sarvas, M., Lehtovaara, Ρ., Sibazkov, Μ., e Kaariainen, L. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7£, 55825586 (1982).

23. Wong. S.-L., Pricee, C.W., Goldfarb, D.S., e Doi, R.H. Proc. Natl. Acad. Sei. USA £1, 1184-1188 (1984).

24. Sullivan, M.A., Yasbin, R.E., Young, F.E. Gene 2âr 21-46 (1984).

25. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J., e Filula, D.J. Bact. 159(3). 811-819 (1984).

26. Yansura, D.G. e Henner, D. J. PNAS £1, 439-443 (1984).

27. Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H. e . Heyneker, H.L. Biotechnology, 161-165 (1984).

28. Lory, S., e Tai, P.C. Gene 21, 95-101 (1983).

29. Liu, P.V. J. Infect. Dis. H£ (sup ), 594-599 (1974).

30. Wood, D.G., Hollinger, M.F., e . Tindol, M.B. J. Bact. 145. 1448-1451 (1981).

31. St. John, T.P. e Davis, R.W. J. Mol. Biol. 152. 285-315 (1981).

32. Hopper, J.E., e Rowe, L.B. J. Biol. Chem. 253. 7566-7569 (1978).

33. Denis, C.L., Ferguson, J. e Young, E.T. J. Biol. Chem. 258. 1165-1171 (1983).

34. Lutsdorf, L. e Megnet, R. Archs. Biochem. Biophys. 126. 933-944 (1968).

35. Meyhack, Β., Bajva, Ν., Rudolph, H. e Hinnen, A. EMBO. J. £, 675-680 (1982).

36. Watson, M.E. Nucleic Acid Research 12, 5145-5164 (1984).

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

-3037. Gerband, C. e Guerineau, M. Curr. Genet. 1, 219-228 (1980).

38. Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 25.» 1929-1933 (1978).

39. Jabbar, M.A., Sivasubrananian, N. e Nayak, D.P. Proc. Natl. Acad. Sei. USA £2, 2019-2023 (1985).

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

(i) Vectores para Pseudoroanas

Preferem-se diversos plasmídeos-vectores, que se replicam autonomamente numa larga gama de bactérias Gram-negativas, para utilização como veículos de clonação em hospedeiros do género Pseudomonas. Alguns deles, são descritos por Tait, R. C., Close, T. J., Lundquist, R. C., Hagiya, Μ., Rodriguez, R. L., e Kado, C. I., em Biotechnology, May, 1983, pp. 269-275; Panopoulos, N.J. em Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York,

New York, pp. 163-185 (1981); e Sakagucki, K. em Current Topics in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982), cada um dos quais é aqui especificamente incorporado como referência.

Uma construção particularmente preferida, empregaria o plasmideo RSF1010 e seus derivados, conforme é descrito por Bagdasarian, Μ., Bagdasarian, M.M., Coleman, S., e Timmis, K.N. em Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. e Puhler, A. eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), aqui especificamente incorporados como referência. As vantagens do RSF1010 estão em que é um plasmideo relativamente pequeno, com número de cópias elevado, que se transforma prontamente quer na espécie E. coli, quer na espécie Pseudomonas, mantendo-se estável em ambas. Neste sistema, seria preferida a utilização do sistema de expressão Tac, tal como foi descrito para a Escherichia, uma vez que parece que o promotor trp, da E. coli, é prontamente reconhecido pela ARN polimerase das Pseudomonas, conforme descreve Sakagucki, K. em Current Topics in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982) e Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones A.J.S., Seeburg, P.H., e Heyneker, H.L. em Biotechnology, Feb, 1984, pp. 161-165, as quais são aqui especificamente incorporadas como referência. A actividade transcricional pode ser ainda mais melhorada, requerendo a permuta do promotor com, por exemplo, um promotor trp de E. coli ou de P. aeruginosa. Adicionalmente, o gene lac I da E. coli também seria incluído no plasmideo, para influenciar a regulação.

A tradução pode ser acoplada â iniciação da tradução, em qualquer uma das proteínas das Pseudomonas, bem como a locais de

271 ) Ref: SYN02/P0RTUGAL

iniciação de qualquer das proteinas grandemente expressas, do tipo escolhido, para provocar expressão intracelular do inibidor. Nos casos em que não estejam disponíveis estirpes de restrição menos de uma espécie de pseudomonas hospedeira a eficiência de transformação, com construções plasmídicas isoladas da E. coli, é fraca. Portanto, deseja-se a passagem do vector de clonação das Pseudomonas, através de uma estirpe r-m+ de outra espécie, antes da transformação do hospedeiro desejado, tal como é descrito por Bagdasarian, Μ., et al, Flasmids of Medicai, Environmental and Conunercial Importance, pp.

411-422, Timmis and Puhler eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), aqui especificamente incorporado como referência.

J (ii) Vectores para Bacillus

Para além disso, um sistema de expressão preferido em hospedeiros do género Bacillus, envolve a utilização do plasmideo pUBUO, como veículo de clonação. Tal como em outros sistemas vector-hospedeiro, é possível expressar em Bacillus, o inibidor de TNF, do presente invento, quer como proteína intracelular, quer como proteína segregada. As concretizações presentes, incluem ambos os sistemas. Estão disponíveis vectores de vaivém que se replicam, quer no Bacillus, quer na E. coli, para construir e testar diversos genes, conforme é descrito por Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., e Shivakumar, A.G. em Genetic Engineering, Vol. 2, Setlow ) and Hollander eds., Plenura Press, New York, New York, pp. 115-131 (1980), aqui especificamente incorporados como referência. Para a expressão e secreção do inibidor de TNF a partir do B. subtillis, a sequência de sinal da alfa amilase estã, preferivelmente, acoplada ã região de codificação da proteína. Para a síntese de inibidor intracelular, a sequência de ADN portátil será acoplada, por tradução, ao local de ligação a ribossoma, da sequência de comando da alfa-amilase.

A transcrição de qualquer uma dessas construções, é dirigida, preferivelmente, pelo promotor da alfa-amilase, ou por um seu derivado. Este derivado contém a sequência de reconhecimento da ARN polimerase, do promotor nativo, da alfa-amilase, mas também incor' Ref: SYN02/P0RTUGAL / X Z /i

pora a região do operador lac. Mostrou-se que promotores híbridos semelhantes, construídos a partir do gene promotor da penicilinase e do operador lac, funcionavam em hospedeiros Bacillus, de um modo regulável, tal como é descrito por Yansura, D.G. e Henner em Genetics and Biotechnology of Bacilii, Ganesan, A.T. e Hoch, J.A., eds. Academic Press, pp. 249-263 (1984), aqui especificamente incorporado como referência. 0 gene lac I da E. coli, também seria incluído no plasmideo para efectuar a regulação.

(iii) Vectores para Clostridium

Uma construção preferida, para expressão em Clostridium, estã no plasmideo pJU12, descrito por Squires, C. H. et al, no J. Bacteriol, 159: 465-471 (1984), e aqui especificamente incorporado como referência, transformado no C. perfringens através do método de Heefner, D. L. et al, tal como é descrito no J. Bacteriol. 159: 460-464 (1984), aqui especificamente incorporado como referência. A transcrição, é dirigida pelo promotor do gene de resistência ã tetraciclina. A tradução é acoplada a sequências de Shine-Dalgarno, desse mesmo gene tet^r, de um modo estritamente análogo aos procedimentos esboçados acima, em relação a vectores adequados para utilização noutros hospedeiros.

(iv) Vectores para leveduras

A manutenção de ADN estranho, introduzido em leveduras, po de ser efectuada de modos diversos, tal como é descrito por Bots tein, D. e Davis, R. W., em The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones and Broach, eds., pp. 607-636 (1982), aqui especificamente incorporado como referência. Um sistema de expressão preferido, para utilização com organismos hospedeiros do gênero Saccharomyces, abriga o gene do inibidor de TNF no plasmideo de 2 micron. As vantagens do círculo de 2 micron, incluem um número de cópias relativamente elevado e estabilidade, quando é introduzido em estirpes cir'. Preferivelmente, estes vectores incorporam a origem de replicação e pelo menos um marcador de resistência a antibióticos, do pBR322, para posRef·: SYNO 2/PORTUGAL /1 2/1

sibilitar a replicação e selecção em E. coli. Adicionalmente, é preferível que o plasmídeo tenha a sequência de 2 micron e o gene LEU2 das leveduras, para satisfazer os mesmos desígnios em leveduras mutantes deficientes em LEU2.

Se estiver contemplado que os inibidores recombinantes de TNF sejam, afinal, expressos em leveduras, prefere-se que o vector de clonação seja transferido, primeiro, para Escherichia coli, onde o vector poderá replicar-se e da qual o vector poderá ser obtido e purificado, depois de amplificação. O vector seria, então, transferido para a levedura, para expressão final do inibidor de TNF.

c) Células de mamíferos

ADNc para o inibidor de TNF, servira de gene para a expressão do inibidor em células de mamíferos. Deverá possuir uma sequência que seja eficiente na ligação de ribossomas, tal como a que é descrita por Kozak em Nucleic Acids Research 15: 8125-8132 (1987), aqui especificamente incorporada como referência, e deverá possuir capacidade de codificação, para que uma sequência de comando (ver a secção 3(a)(vi)) dirija a proteína madura para o exterior da célula, numa forma processada. 0 fragmento de restrição do ADN, que contém a sequência de ADNc completa, pode ser inserido num vector de expressão, que tenha um promotor transcricional e um intensificador transcricional, tal como descreve Guarente, L. em Cell 52: 303-305 (1988) e Kadonaga, J. T. et al, em Cell 51: 1079-1090 (1987), ambos aqui especificamente incorporados como referência. O promotor, pode ser regulável, tal como no plasmídeo pMSG (nÇ de catálogo 27450601, da Pharmacia), se a expressão constituitiva do inibidor for prejudicial ao crescimento celular. O vector, deverá ter um sinal de poli-adenilação completo, tal como descreve Ausubel, F. M. et al, em Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987) aqui especificamente incorporado como referência, de modo que o ARNm transcrito desse vector seja processado correctamente. Por fim, o vector terá a origem da replicação e, pelo menos, um marcador de resistência a antibióticos do pBR322, para possibilitar replicação e selecção em E. coli.

Λ. I _L

Ref: SYNO2/PORTUGAL

Para se seleccionar uma linha de células estável, que produza o inibidor de TNF, o vector de expressão pode conter o gene de um marcador seleccionãvel, tal como um marcador de resistência a uma droga, ou conter um gene complementar para uma linha de células deficientes, tal como o gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr), para transformar uma linha de células dhfr, tal como descrito por Ausubel et al, acima. Em alternativa, pode co-transformar-se um plasmideo distinto, que contenha o marcador seleccionãvel, em conjunto com o vector de expressão.

7. Células-hospedeiras/Transformação ) 0 vector assim obtido, é transferido para uma célula hospedeira apropriada. Essas células hospedeiras, podem ser microrganismos ou células de mamíferos.

c) Microrganismos

Pensa-se que possa ser escolhido qualquer microrganismo que tenha a capacidade de captar ADN exógeno e de expressar estes genes e elementos operacionais auxiliares. Depois de ter sido escolhido um organismo hospedeiro, transfere-se o vector para o organismo hospedeiro, utilizando métodos do conhecimento geral dos que possuem um conhecimento médio da arte. Em Advanced Bacterial Genetics por R. W. Davis et al, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring ) Harbor, New York, (1980), que é aqui especificamente incorporado como referência, podem encontrar-se exempl©® desses métodos. Numa das concretizações, prefere-se que a transformação ocorra a temperaturas baixas, uma vez que a regulação da temperatura está contemplada, como meio de regular a expressão dos genes pela utilização de elementos operacionais, conforme se descreveu acima. Numa outra concretização, se tiverem sido inseridos reguladores osmolar, no vector, será necessário regular concentração de sais durante a transformação, para assegurar o controlo apropriado dos genes estranhos

Prefere-se que o microrganismo hospedeiro seja um anaeróbio facultativo ou um aerõbio. Hospedeiros específicos, que podem

Ref: SYN02/P0RTUGAL

271

ser preferíveis para utilização neste método, incluem leveduras e bactérias. Leveduras específicas, incluem as do género Saccharomyces e, especialmente, a Saccharomyces cerevisiae. Bactérias específicas, incluem as dos géneros Bacillus, Escherichia e Pseudomonas , sobretudo a Bacillus subtilis e a Escherichia coli. Outras células-hospedeiras estão listadas na Tabela I, supra.

(d) Células de mamíferos vector pode ser introduzido em células de mamífero em cultura, por intermédio de diversas técnicas, tal como coprecipitação, fosfato de cálcio: ADN electroporação ou fusão de protoplasto.

método preferido, é a coprecipitação com fosfato de cãlcio, tal como é descrito por Ausubel et al, acima.

Existem muitos tipos de células estáveis que são transformáveis e que são capazes de transcrever e traduzir a sequência de ADNc, de processar o precursor do inibidor de TNF e de segregar a proteína madura. Contudo, os tipos de células podem variar, em relação à glicosilação das proteínas segregadas e â modificação põs-tradução dos resíduos de aminoácidos, se ocorrer alguma. Portanto, os tipos ideais de células, são aqueles que produzem um inibidor recombinante de TNF, idêntico â molécula natural.

8. Cultura de células construídas por engenharia genética

As células hospedeiras são cultivadas sob condições apropriadas, para expressão do inibidor de TNF. Essas condições são, duma forma geral, específicas para a célula hospedeira e são determinadas com facilidade por quem tenha um conhecimento médio da arte, à luz da literatura publicada sobre as condições de crescimento dessas células e dos ensinamentos aqui contidos. Por exemplo, o Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8.a ed., Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, que é aqui especificamente incorporado como referência, contém informações sobre as condições de cultivo de bactérias. Informações similares, sobre o cultivo de leveduras e de células de mamíferos, podem obter-se em Pollack, R. Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975), aqui es/ J. Z / -L

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 37 pecificamente incorporado como referência.

Quaisquer condições necessárias para a regulação da expressão da sequência de ADN, que dependam de quaisquer elementos operacionais inseridos, ou presentes, no vector, teriam influência sobre as etapas de transformação e de cultura. Numa concretização, cultivaram-se células até uma densidade elevada, na presença de condições reguladoras apropriadas, que inibiam a expressão da sequência da ADN. Quando se estava prestes a atingir a densidade de células óptima, alteraram-se as condições do meio para as condições apropria das para a expressão da sequência de ADN. Assim, está contemplado que a produção do inibidor de TNF possa ocorrer num período subsequente ao crescimento das células hospedeiras até próximo da densidade óptima, e que o inibidor de TNF, resultante, seja recolhido algum tempo depois de terem sido induzidas as condições reguladoras, necessárias para a sua expressão.

· Purificação (a) Inibidor de TNF produzido a partir de microrganismos

Numa das concretizações preferidas do presente invento, o inibidor recombinante de TNF é purificado a seguir à sua colheita e antes de assumir a sua estrutura activa. Prefere-se esta concretij zação porque os inventores pensam que a recuperação de uma quantidade elevada de proteína redobrada, é facilitada se a proteína foi purificada primeiro. Contudo, numa concretização preferida, alternativa, pode permitir-se que o inibidor de TNF se redobre, para assumir a sua estrutura activa, antes da purificação. Numa outra concretização preferida, alternativa, o inibidor de TNF já estã presente na sua forma redobrada, activa, antes de ser recolhido do meio de cultura .

Em determinadas circunstâncias, o inibidor de TNF assumirá a sua estrutura activa peculiar, antes da expressão no microrganismo hospedeiro e do transporte da protéina através da parede ou membrana celulares ou de transporte da proteína para o espaço peλ Ref: SYN02/P0RTUGAL /1 2/1

riplásmico. Em geral, isso ocorrerá se o ADN que codifica uma sequência de comando apropriada, tiver sido ligado ao ADN que codifica a proteína recombinante. Se o inibidor de TNF não assumir a sua estrutura activa peculiar, quaisquer ligações dissulfureto, que se tenham formado, e/ou quaisquer interacções nao-covalentes, que tenham ocorrido, serão quebradas, em primeiro lugar, por agentes desnaturantes ou redutores, por exemplo, cloreto de guanidínio ou beta-mercaptoetanol, antes que o inibidor de TNF assuma a sua estru tura activa, após diluição e oxidação desses agentes, sob condições controladas.

Para purificações anteriores ou posteriores ã redobragem, usam-se, de preferência, algumas das combinações dos passos seguintes: cromatografia de permuta aniõnica (mono Q ou DEAE-Sepharose), cromatografia por filtração em gel (superose), focagem cromatografi ca (chromatofocusing) (Mono P) e cromatografia de interacção hidrofóbica (octil- ou fenil-Sepharose). A cromatografia de afinidade que utiliza TNF tem um interesse especial (descrita no Exemplo 1).

(b) Inibidor de TNF produzido a partir de células de mamíferos

O inibidor de TNF produzido a partir de células de mamíferos, serã purificado a partir de meio condicionado, através de passos que incluirão a cromatografia de permuta iónica e a cromatografia de afinidade que utiliza TNF, tal como se descreve no Exemplo 1 Serã evidente, para os que dominam a arte, que podem ser feitas diversas modificações e alterações aos processos e nos produtos do presente invento. Assim, pretende-se que o presente invento cubra as modificações e as alterações deste invento, desde que estejam abrangidas pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

Tal como se indicou anteriormente, os inibidores de TNF do presente invento, estão contemplados para utilização na forma de agentes terapêuticos, e, por isso, são para ser formulados com supor tes, farmaceuticamente aceitáveis. Numa das concretizações do presente invento, os inibidores de TNF podem ser modificados quimicamente, para melhorar as propriedades farmaco-cinéticas das molécu/ 1 Ζ /1 'j Ref: SYN02/P0RTUGAL

las. Um exemplo, seria a fixação dos inibidores de TNF a um material polimérico de elevada massa molecular, tal como o polietileno-glicol. Além disso, os inibidores da interleucina-1 podem ser administrados em associação com os inibidores de TNF. Esta combinação terapêutica, será particularmente útil no tratamento de doenças inflamatórias e degenerativas.

Os exemplos seguintes, ilustram várias concretizações preferidas actualmente, do invento aqui reivindicado. Todos os artigos e referências, citados nos Exemplos que se seguem, são aqui especificamente incorporados como referência.

EXEMPLO 1 - Preparação das proteínas

A. Materiais gene do TNF alfa (TNFa) foi adquirido à British Biotech nology, Limited, Oxford, England. A resina DEAE-Sepharose CL-6B e as colunas Mono-Q HR5/5 e HR10/10, para FPLC, foram adquiridas à Pharmacia, Inc., Piscataway , New Jersey. A resina Affigel-15 e o conjunto BioRad para teste de proteínas, foram adquiridos à BioRad, Richmond, Califórnia. 0 Tween 20, o bicarbonato de amónio, o fosfato de sódio, o PMSF, o bicarbonato de sódio, o ditiotreitolj violeta de cristal e a actinomicina D, foram adquiridos à Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. A endoproteínase Lis-C, a endoprotei) nase Asp-N e o TRIS, foram adquiridos â Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana. A hexafluoroacetona foi adquirida à ICN Biomedicals, Costa Mesa, Califórnia. O brometo cianogênio, o ácido trifluoroacético e o hidroeloreto de guanidina, foram adquiridos à Pierce Chemicals, Rockford, Illinois. O acetonitrilo e a água para a HPLC foram adquiridos à J. T. Baker Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey. A ureia foi adquirida aos Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland. 0/ H_7-ácido iodoacético foi adquirido à New England Nuclear, Boston, Massachusetts.

-125 / l_/-TNFa foi adquirido a Amersham, Arlington Heights, Illinois. 0 TNFa humano, recombinante, foi adquirido ã Amgen, Thousand Oaks, Califórnia. As colunas C8 de fase inversa (25 cm x 4,6 mm) foram obtidas na Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana. A coluna C8

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

de microporo de fase inversa (7 micron, 22 cm x 2,1 mm) foi obtida na Applied Biosystems, Foster City, Califórnia. As placas Corning de microtitulação, com 96 alvéolos, foram adquiridas à VWR Scientific, Batavia, Illinois. Os meios 5A da McCoys e o soro de bovino fetal, foram adquiridos à Gibco, Grand Island, New York. Os meios RPM-1 1640 e a L-glutamina foram aduiridos à Mediatech, Herndon, Virginia. A tripsina foi adquirida à K. C. Biologicals, St. Lenexa, Kansas. As linhas de células ME180, U937 e L929, foram obtidas da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

B. Testes para o inibidor de TNF

Usaram-se dois tipos de testes para identificar o inibidor de TNF. Um deles é o teste de citotoxicidade; o outro, e um teste de deslocamento em gel.

1. Teste de citotoxicidade

O teste de citotoxicidade, foi executado com células L929 e células ME180, tratadas pela actinomicina D, tal como é descrito porOstrove e Gifford (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 354-358 (1979)) e Aggarwal e Essalu (J. Biol. Chem. 262, 10 000-10 007 (1987)).

Mantiveram-se células L929 (CCLI: American Type Culture Collection) em meio 5A da McCoy, contendo 10% de soro fetal de bovino. Trataram-se brevemente as culturas confluentes, com tripsina a 0,25%, em solução fisiológica que continha EDTA, 5 mM, e foram resuspensas em 4 meio fresco. Depositaram-se cerca de 2 x 10 células tripsinadas, em cada um dos alvéolos das placas (Corning) de 96 alvéolos, e incubaram-se durante 24 horas, a 37°C. A seguir, adicionou-se actinomicina D, até uma concentração final de 0,25 ug/ml. Depois de duas horas adicionaram-se aos alvéolos amostras que continham o TNF e o inibidor de TNF, e prosseguiu-se a incubação, durante a noite, à mesma temperatura. Depois de se fazer uma avaliação ao microscópio, decantou-se o meio e lavaram-se os alvéolos com PBS. A seguir, encheram-se os alvéolos com uma solução de violeta de cristal a 0,1%, formaldeído a 10% e fosfato de potãssio 10 mM, pH 6 durante 5 minutos, lavou-se profundamente com ãgua e secou-se. Extraiu-se o pigmento com citrato de sódio, 0,1 M em etanol a 50%, pH 4,2 DeRef: SYNO2/PORTUGAL / 1 Ζ /X

terminou-se a absorvância do pigmento, a 570 nm, nas células viáveis, utilizando um leitor de lâminas microscópicas Kinetic (Molecular Devices Corp. , CA). Na Figura 1, apresenta-se um exemplo deste teste. O ef eitocitotóxico do TNF reduziu-se na presença do inibidor de TNF.

2. Teste de deslocamento em gel

O teste de deslocamento em gel, envolve a utilização de um sistema electroforético com gel de poliacrilamida nativo. Essa electroforese com gel nativo a 4%, foi conduzida de acordo com Hedrick e Smith (Arch. Biochem. and Biophysics 126, 155-164 (1968)).

Misturou-se o TNF iodado (Amersham) com o inibidor de TNF do Exemplo l.C, depois de cromatografia C8, e incubou-se, durante 30 minutos a 2 horas. Carregou-se a mistura e o TNF iodado no gel nativo a 4%, e executou-se a electroforese. Depois, fixou-se o gel, com ãcido acético a 10%, e lavou-se, após o que se posicionou num filme para auto-radiografia. Tal como se mostra na Figura 2, o complexo de TNF e de inibidor de TNF migra de modo diferente, quando se compara com a migração do próprio TNF. Este teste de deslocamento em gel, foi usado para determinar quais as fracções que continham o inibidor de TNF, nos eluatos da cromatografia em coluna DEAE CL6B.

C. Purificação do inibidor de TNF de 30 kDa

Concentraram-se até 200 ml, 20 litros de urina, de um paciente a quem fora diagnosticada uma disfunção renal, utilizando uma membrana Amicon YM5. A seguir, dializou-se o concentrado, a 4°C, contra Tris-Cl 0,025 M, pH 7,5 e, depois, centrifugou-se, num rotor JA14, a 10 000 rpm, durante 30 minutos. Carregou-se o sobrenadante numa coluna DEAE-Sepharose CL-6B, 40 x 4,5 cm, equilibrada com Tris-Cl 0,0025 M, e pH 7,5, e amplament lavada com tampão de equilíbrio até que a DC^qq do efluente retornasse â linha de base. Conduziu-se a cromatografia usando um gradiente linear de cloreto de sódio 0-0,05 M, em Tris-Cl 0,025 M, pH 7,5 e estabelecendo o controlo através da ^ϋθ280* ^Reco^-^^erain”^{se as} fracções da coluna e testou-se a actividade inibidora de TNF, usando o teste com o gel nativo. O inibidor de TNF eluído, eluiu na forma de um pico bastan7-1 271 ) Ref: SYN02/P0RTUGAL

te estreito, aos 80 mM em NaCl.

A Figura 6A, apresenta o perfil de DC^gg da cromatografia DEAE-Sepharose CL-6B, de 20 litros de urina. A Figura 6B, apresenta a auto-radiografia do teste do gel nativo correspondente, indicando um pico do inibidor de TNF nas fracções 57-63, aproximadamente aos 80 mM em NaCl.

Purificou-se ainda mais o inibidor de TNF, usando uma coluna de afinidade para o TNF. Expressou-se TNF recombinante em BL21/ DE3, com a proteína celular total entre 10% e 20%. Espremeu-se (French-pressing) a pelota de células, sob 20 000 psi (1360,9 atm) e dialisou-se o material solúvel, a 4°C, contra Tris-Cl 0,025 M, pH 8,0. 0 lisado dialisado, foi filtrado (0,2 micron) e depositado sobre uma coluna Mono-Q de FPLC, equilibrada com Tris-Cl 0,025 M, pH e,0. Estabeleceu-se um gradiente linear de NaCl 0 a 0,5 M em Tris-Cl 0,025 M, pH 8,0 e controlou-se através da ^ϋθ280* Recolheram-se fracções de 1 ml e analizou-se a sua pureza, através de SDS-PAGE. A combinação das fracções com TNFa, subsequente, era 90% pura, de acordo com SDS-PAGE, corada segundo Coomassie, e era totalmente activa, de acordo com um teste de proteinas Bradford, que usou lisozima como padrão, e com um bio-teste ΜΕ^θθ, usando o TNFa, da Amgen, como padrão (Bradford, M. Annal. Biochem. 72, 248-254 (1976)).

) Concentrou-se o TNFa, numa Centriprep-10, da Amicon, até cerca de 25· mg/ml, dializou-se, contra NaHCO^, 100 mM, pH 8,5, e acoplou-se, a resina Affigel-15, com 25 mg de TNF/ml de resina. Obteve-se uma eficiência de acoplamento superior a 80%, o que se traduziu numa resina de grande capacidade, que se usou para purificar ainda mais o inibidor de TNF.

Adicionou-se PMSF, com uma concentração final 1-4 mM, à combinação de fracções de DEAE CL-6B, e aplicou-se, numa coluna de afinidade de TNF, 4x1 cm, equilibrada com Tris-Cl 0,025 M, pH 7,5, a um caudal de 0,1 ml/minuto e a 4°C. Lavou-se, então, a coluna, com Tris-Cl 0,025 M, pH 7,5, até que a °θ280 ^e^^-^uen_ te voltasse à linha de base. Subsequentemente, eluiu-se a coluna com

271

') Ref: SYNO 2/PORTUGAL

NaPhos 0,05 pH 2,5, controlando através da ^DO280* ^{A Fi}9^ura 7, apresenta o perfil de ©θ280' ^{da elui}Ç^ao' ^com NaPhos 0,05 M, com pH 2,5, da coluna de afinidade de TNF.

Purificou-se o inibidor de TNF, até à homogeneidade, através de HPLC de fase inversa, numa coluna Syncropak RP-8 (C8). O pico de ^d°280' ^âa coluna de afinidade de TNF foi reunido, foi imediatamente aplicado numa coluna RP-8, equilibrada com TFA 0,1%/ H2O, após o que se impôs um gradiente linear de 1%/minuto, em TFA 0,l%acetonitrilo de 0 a 50%, estabelecendo o controlo por intermédio da DO215 e da ^d°280’ ^Rec°Iberam-se fracçoes e testaram-se quanto à bioactividade, usando células L929 e o teste do gel nativo descrito no Exemplo l.B. Quer um, quer outro dos testes indicaram bioactividade nas fracçoes 28-32, que correspondem a um pico de DO-,., _r e de DO_nori que é eluido aos 18% em acetonitrilo.

'280

215

As Figuras 8A e 8C, apresentam o perfil cromatográfico da reunião de fracçoes da coluna de afinidade de TNF, numa coluna Syncropak RP-8, com a bioactividade correspondente, obtida do teste de citotoxicidade com a L929. A Figura 8B, apresenta uma SDS-PAGE redutora, a 15%, corada com prata, da reunião de fracçoes da RP-8, que indica uma banda única a 30 kDa.

D. Caracterização do componente proteico do inibidor de TNF de 30 kDa J O inibidor de TNF de 30 kDa, é uma glicoproteína, tal como se detectou usando Concanavalina A-Peroxidase, depois de a proteína ter sido, transferida para o filtro de nitrocelulose. Este método, é uma modificação do de Wood e Sarinana (Analytical Biochem.

69, 320-322 (1975)), que identificaram glicoproteínas directamente sobre um gel de acrilamida. Executou-se a coloração da glicoproteína pela peroxidase, usando Con A conjugada com peroxidase ou a Con A não conjugada. Quando se usou a Con A não conjugada, incubou-se o filtro de nitrocelulose, durante 1 hora, numa solução que continha Con A (0,5 mg/ml, Miles Laboratory) em tampão fosfato, pH 7,2 (PBS); a seguir, lavou-se 3x5 minutos, em PBS. O filtro lavado, foi incubado em peroxidase ae rábano silvestre (0,1 mg/ml, Sigma

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

Chemical), durante 1 hora. Depois de se lavar 3 x 15 minutos, em PBS, o filtro foi imerso numa solução contendo 3 mg/ml de 4-cloro-1-naftol (Sigma Chemical) e 12,5#l/ml de peróxido de hidrogénio, até desenvolvimento de cor. Observou-se a glicoproteína, com uma coloração púrpura. Fez-se uma fotografia logo que o filtro foi revelado, tal como se mostra na Figura 3.

Levou-se a cabo uma desglicosilação química do inibidor de TNF, pelo método de Edge, Faltynek, Hof, Reichert e Weber (Analytical Biochem. 118, 131-137 (1981)). Arrefeceu-se uma mistura de 0,25 ml de anisolo (Eastman Kodak) e de 0,5 ml de ãcido trifluorometanossulfónico (Eastman Kodak), até 4°C, e, a seguir, dissolveram-se 1-200 ng de inibidor de TNF seco, em 3 /xl dessa mistura. 0 tubo foi salpicado com azoto, e, a seguir, foi incubado, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. A proteína desglicosilada foi analisada sobre SDS-PAGE (Figura 4). A massa molecular do inibidor de TNF, tratado com reagentes químicos, é de cerca de 18 000 dalton. Também se observou uma banda a 14 000, mas isso podia ser um fragmento proteolítico do inibidor de TNF desglicosilado.

Executou-se a desglicosilação enzimática, utilizando N-glicanase, de acordo com as instruções do fabricante (Genzyme Corp.), com excepção de que o inibidor de TNF foi incubado, com N-glicanase, durante 5 a 6 horas, em lugar de o ser durante a noite. Mostrou-se que a massa molecular da forma desglicosilada do inibidor de TNF desnaturado, é de 20 000 dalton, aproximadamente (Figura 5). Quando o inibidor não é desnaturado antes da desglicosilação, a massa molecular da proteína desglicosilada é de 26 000 dalton, aproximadamente .

Ε. O inibidor desglicosilado de TNF de 30 kDa, liga-se ao TNF

Tratou-se inibidor de TNF (30 kDa) marcado radioactivamente, com TFMSA (ácido trifluorometanossulfónico), para se removerem os hidratos de carbono, e separou-se o TFMSA da proteína por HPLC. Mijs turou-se a fracção proteica com TNF em affigel, durante 1 hora, a 4°C, e, removeu-se todo o material não ligado, por centrifugação.

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

Lavou-se profusamente, o TNF - affigel, com NaPO^ 50 mM, pH 2,5. Fez-se a contagem da radioactividade de cada fracção e também se analisou cada uma destas fracçoes através de SDS-PAGE. Mediu-se a ligação não específica do inibidor de TNF, usando affigel - anidroquimotripsina. Os resultados apresentam-se na Tabela 2. Esses resultados, indicam que o inibidor de TNF (30 kDa) desglicosilado, se liga ao TNF.

TABELA 2

Amostra Tipo de _Contagem (CPM)_

Afinidade Corrente de Eluato

Passagem

TNF-INH	nativo	TNF	49401	(55,0%)	40014	(45,0%)
TNF-INH	nativo	Anhy	CT	80000	(98,0%)	1789	( 2,0%)
TNF-INH	tratado can TFMSA	TNF		13369	(73,0%)	4908	(27,0%)
TNF-INH	tratado can TFMSA	Anhy	CT	15682	(94,0%)	926	( 6,0%)

Numa outra experiência, reduziu-se inibidor de TNF (30 kDa), marcado radioactivamente e, a seguir, desglicosilou-se, com N-glicanase. Depois da desglicosilação, incubou-se o material, com gluta) tiona oxidada (GCCG), 13 mM, durante 10 minutos, à temperatura ambiente, e diluiu-se cinco vezes, com Tris 50 mM. A seguir, adicionou-se cisteína, até uma concentração final de 5 mM. Incubou-se o material, a 4°C, durante 16 horas e, depois, misturou-se com TNF-affigel, durante 1 hora, a 4°C. Removeu-se o material não ligado e lavou-se profusamente o gel, com Tris-Cl 50 mM, pH 7,5. Eluiu-se o material ligado, com NaPO^ 50 mM, pH 2,5. Analisou-se a radioactividade de cada fracção e realizou-se uma SDS-PAGE para cada fracção. Tal como se mostra na Tabela 3 e na Figura 18, o inibidor de TNF, desglicosilado e reoxidado, também se liga ao TNF.

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 46 TABELA 3

Amostra 7	Tipo de kf inidade	Contagem (CPM)
Corrente de Passagem	Eluato
TNF-INH Nativo	TNF	18281 (60,0%)	12603 (40,0%)
TNH-INH Nativo
(reduzido/reaxidado)	TNF	28589 (94,0%)	1964 ( 6,0%)
Tratado com TFMSA
(reduzido/reoxidado)	Anhy CT	31371 (98,70)	421 ( 1,3%)
TNF-INH desglicosilado
(reduzido/reoxidado)	TNF	25066 (85,0%)	4305 (15,0%)
TNF-INH desglicosilado
(reduzido/reoxidado)	Anhy CT	29619 (98,4%)	495 ( 1,6%)
EXEMPLO 2 - Determinação da sequência do inibidor de	TNF de 30 kDa

Determinaram-se as sequências N terminais usando sequenciadores de proteínas, modelos 470 e 477, da Applied Biosystems. Antes da determinação das sequências, purificaram-se os péptidos, gerados a partir de um conjunto de enzimas proteolíticos, numa coluna C8 de micro-poro, de HPLC, da Applied Biosystems (22 cm x 2,1 mm).

A. Determinação da sequência do terminal amino

Aplicaram-se directamente, num filtro de polibreno, cerca de 250 pmol de inibidor de TNF, purificado por fase inversa (RP-8), e submeteram-se a uma degradação de Edman automatizada. A informação resultante, acerca da sequência, revelou os primeiros 30 aminoácidos da molécula.

B. Digestão da proteína nativa com endoproteínase Lis-C

Cerca de 250 pmol (5 >ug) de inibidor de TNF, purificado por fase inversa , foram digeridos com 1 /tg de endoproteínase Lis-C. A digestão, que demorou 12 horas, a 25°C, foi conduzida na ι χ Ζ. / X

presença de ureia 1 M, Tween 20 a 0,01% e Na₂HCO3 150 mM, oH 8,0. Antes da purificação dos péptidos, o material digerido foi reduzido, incubando durante 1 hora, depois de se ter adicionado um excesso molar de 50 vezes, de ditiotreitol, ou foi reduzido e alquilado, através de incubação durante mais uma hora, a 37°C, de— 3 -r pois de se adicionar um excesso molar de 2 vezes, de !_ H _/-aciao -iodo-acético, sobre o ditiotreitol. A Figura 9A, apresenta o padrão de HPLC de fase inversa, desta digestão. A Figura 9B, apresenta a configuração da HPLC de fase inversa, desta digestão, seguida de alquilação.

C. Digestão da proteína nativa com endoproteínase Asp-N

Cerca de 250 pmol (5 /ig) do inibidor de TNF, purificado, por fase inversa , foram digeridos com 0,5 - 2,5 /tg de endoproteínase Asp-N. A digestão, que demorou 12-18 horas, a 37°C, foi conduzida na presença de guanidina-HCl 1 M, Tween 20 a 0,01%, e NaPhos 150 mM, pH 8,0. Antes da purificação peptídica , o digerido foi reduzido e alquilado, como no Exemplo 2B. A

Figura 10, apresenta o padrão de HPLC de fase inversa de dois desses digeridos.

D. Redução e carboximetilação da proteína

O inibidor de TNF, purificado por HPLC de fase inversa, foi reduzido e carboximetilado, com j_ H_y-acido iodoacético, conforme descrevem Glazer, et al, em Chemical Modifications of Proteins, pp. 103-104 (1975) , ccm a excepção de que se fizeram dois ciclos de redução suces sivos, seguidos de alquilação. A proteína foi repurifiçada, antes da digestão proteolítica, utilizando HPLC de fase inversa.

E. Digestão da proteina reduzida e carboximetilada com endoproteínase V8

Executou-se uma digestão analítica, dissolvendo 55 pmol (cerca de 1 /tg) de inibidor de TNF, reduzido e carboximetilado, em NaHCO^ 150 mM, pH 8,0, e efectuando a digestão com 0,2 «ug de protease Vtí, durante 18 horas, a 25°C. A HPLC de fase inversa (Fi71 271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

gura 11A) revelou três péptidos sequenciãveis e indicou que podia executar-se uma digestão a uma escala maior. Cerca de 220 praol (4,5 ju.çj) de inibidor de TNF, reduzido e carboximetilado, foram digeridos com 1 /ig de protease V8, durante 5 horas, a 25°C, momento em que se adicionaram mais 0,5 /xg de protease V8 e se prosseguiu a digestão durante mais 16 horas. A Figura 11B, apresenta a HPLC de fase inversa, da digestão com V8 executada numa escala grande.

F. Estrutura primária completa do inibidor de TNF de 30 kDa, baseada nas sequências de péptidos e na sequência do ADNc

Alinharam-se diversos fragmentos peptídicos, de acordo com a sequência de ADNc obtida no Exemplo 4. Isto é apresentado na Figura 19. Os resíduos com os números 14, 42, 43, 44, 96, 97, 105, 107, 108 e 110 até 119, não estão identificados por sequenciação da proteína. A sequência de Gln-Ile-Glu-Asn é, aparentemente, o terminal carboxilo do inibidor de TNF de 30 kDa.

EXEMPLO 3 - O inibidor de TNF de 30 kDa, é produzido por células

U937 estimuladas com PMA e PHA

Cultivou-se a linha de células, de tipo monõcito, U937, a 37oc era meio RPMI, contendo 10% de soro de vitela fetal, até uma densidade celular de 1 x 10^ células/ml. Removeram-se, então, as células, por centrifugação, e ressuspenderam-se, em cinco placas de Petri de lOOcm , diferentes, _a 2 χ 10⁶ células/ml, em meio RPMI sem soro e contendo 10 ng/ml de PMA (12-miristato-13-acetato de forbol) e 5 xxg/ml de PHA-P(fito-hemaglutinina-P). Fez-se a colheita, numa das placas, do meio condicionado, após apenas 10 minutos de incubação, a qual foi utilizada como controlo para o tempo zero.

O meio das placas restantes, foi sendo, sucessivamente, removido, às 24 horas, âs 48 horas, âs 72 horas, e âs 96 horas, após deposição nas placas. Concentrou-se a proteína contida nessas amostras, em cerca de 400 /xl cada uma, através do tratamento Centriprep-10 (da Amicon Corp.). Cada uma das amostras de 400 χχΐ foi, então, misturada com um volume igual de uma preparação de Affigel-15 (Biorad

Ref: SYNO2/PORTUGAL purificado

Corp) , que continha cçrca de 10 mg/ml de TNFa humano recombinante/, que tinha sido preparado no nosso laboratório. Antes de ter sido ligado à resina Affigel-15, esse TNFa mostrara-se bio-activo, através da sua toxicidade para células L929 murinicas.

O meio condicionado, foi incubado em lotes, à temperatura ambiente, com a resina de afinidade de TNFa, durante 2 horas. A fracção não ligada, foi removida depois da centrifugação da resina, e esta lavou-se, subsequentemente, com 1 ml (500 xxl, 2x) de PBS (solução salina tamponada por fosfato), pH 7,5, contendo 0,1% de gelatina. O material ligado foi eluído, com uma solução 25 mM de fosfato de sódio monobãsico, pH 7,5 (400 /xl, 2 x) . Secaram-se /xl de cada uma das fracções não ligadas, lavadas e eluídas, e ressuspenderam-se em 10 /xl de Tris 25 mM, pH 7,5, misturado com 125 /xl (100 pci) de I-TNFa (400 - 800 ci/mmole, da Amersham) e incubando durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Misturaram-se, a seguir, essas misturas, com 5 /xl de sacarose a 40% e 1 ml de azul de bromofenol a 0,1%, e aplicaram-se a um gel nativo de acrilamida, a 4%, tal como se descreve no Exemplo IB. O meio condicionado de todas as amostras, excepto a do controlo para o tempo zero, continha actividade ligante para o TNFa, por este teste, tal como se mostra na Figura 15.

Os 300 /xl remanescentes, de cada amostra ( lâ eluição com pH baixo), foram aplicados numa coluna C8 de HPLC, e foram eluídos com um gradiente linear de acetonitrilo, ao longo de 60 minutos (1% /minuto, caudal de 1 ml/minuto, recolha de fracções de 1 ml). Secou

-se, cada uma das fr.acções e ressuspendeu-se, cada uma delas, em /xl de PBS + gelatina a 0, 1%. Misturaram-se 10 /xl, de cada uma 125 dessas amostras, com I-TNFa, tal como acima, e efectuou-se uma análise em gel nativo de poliacrilamida. Detectaram-se actividades ligantes com o TNFa, nas fracções correspondentes ao acetonitrilo a 33% e a 36%, tal como se apresenta na Figura 16.

EXEMPLO 4 - Análise de ARK mensageiro de células U937, tratadas com PMA/PHA

Cultivaram-se células U937, tal como se descreveu no ExemV.

t X X / X

pio 3, até uma densidade de 1 x 10^ células/ml e, a seguir, ressuspenderam-se em meio isento de soro, numa concentração de 2 χ 10θ células/ml, com ou sem PMA (10 ng/ml) e PHA (5 /xg/ml). Recolheram-se amostras ao fim de 1 hora +/- PMA/PHA, e às 17 horas apenas + PMA/PHA. O ARN completo foi preparado a partir das celúlas, pelo método com tiocianato de guanidínio-fenol-clorofôrmio de Chomczynski e Sacci (Analytical Biochemistry 162: 156 - 159 (1987)). Preparou- se Poli A⁺ ARN, a partir de ARN completo, temperando com oligo dT-celulose (Bethesda Research Labs). Aplicaram-se, então, 8 yig de cada poli A⁺ ARN, a um gel com 1,2% de agarose e 6,6 de formaldeído. O ARN contido no gel foi, então, transferido por blotting para uma membrana de sonda Zeta (Biorad). A membrana fora tratada, tal como se descreve no Exemplo 5, para rastreio de uma biblioteca de ADN genomico humano, com sondas oligonucleotídicas. Adicionaram-se 1 χ 10⁶ cpm/ml de uma sonda marcada de ADN de cadeia simples (polinucleótido-quinase). A sequência dessa sonda é

5’ TTGTGGCACTTGGTACAGCAAAT 3' e corresponde âs bases 410-433 da sequência apresentada na Figura 13. Depois de hibridação, a 65°C, durante a noite, a membrana foi lavada, uma vez, à temperatura ambiente, em 6 x SSC 0,1% SDS e, outra vez, a 65°C, na mesma solução, tendo sido, depois, exposta a ; uma película de raio-X, durante 72 horas. O auto-radiograma gue se apresenta na Figura 17, mostra que o tratamento de células U937, com PMA/PHA, em meio isento de soro, durante 1 hora, estimula claramente a expressão do ARN mensageiro do inibidor de TNFa com 30 kDa, e que, por volta das 17 horas de tratamento, essa mensagem estã virtualmente ausente das células. O tamanho da molécula do ARN mensageiro do inibidor de TNFa de 30 kDa, com base nesta experiência, é de 2,4 quilobares, aproximadamente.

EXEMPLO 5 - Preparação de uma biblioteca de ADN genomico humano para o inibidor de TNF de 30 kDa

Submeteu-se ADN genomico humano a digestão parcial, com Sau3AI, e fez-se uma selecção por tamanhos. Ligou-se ADN, com um tamanho médio de 15 kB, ao local BamHI do bacteriófago lambda Charon 30. (Rimm, D.L., Horness, D., Kucera, J., e Blattner, F.R.

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 51 Gene 12: 301-309 (1980)). Os fagos, foram propagados e amplificados em E. coli CES 200.

A. Sondas

As quatro sondas de hibridação de oligonucleõtidos degeneradas, listadas na Tabela 4, foram sintetizadas num sintetizador de ADN da Applied Biosystems. A mistura de sonda consistia de todas as sequências de ADN possíveis, para a codificação da sequência peptídica dada.

TABELA 4

Designação do péptido	Sequência do péptido	Designação da sonda	Sequência da sonda
LisC 18	KEMGQVE	TNFBP-P20	5'TCNACTCTGNCCCATTCTCTCTT 3’
LisC 11	QGKYIHP	TNFBP-P2’	5'CAAGGGNAAAGTATCACATCC 3’
LisC 11	YNDCPG	TNFBP-P3'	5'TATCAATCGATCTGTCCCNGG 3 '
LisC 11	YIHPQNN	TNFBP-P4	5’TTAGTTTCTGNGGAGTCAGT 3'
		N = G, A, T	ou C.

* — 32 —

Marcaram-se os oligonucleotidos com fgama- P/ATP (Amersham Inc., Arlington Heights, IL) e com T4 polinucleótido- quinase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), até uma actividade específica de 6-9 x 10^ c.p.m./pmol, de acordo com as instruções do fabricante.

B. Metodologia

Aplicaram-se em placa 8,4 x 10 fagos lambda, cue continham ADN genómico humano, e transferiram-se para filtros de nitrocelulose duplos. Estes filtros foram hibridados com 1 pmol/ml da sonda TNFBP-P2¹, durante 16 horas, numa solução que continha 1,0 M

271

Re f: S ΥΝΟΣ/PORTUGAL

de faCl 0,1 M de citrato de sõdio, 2 x solução de Denhardts (Denharct, .T. Biochem. Biophys. Res. Commun, 23: 641-646 (1966)},

0,l^s c SDS, 0,75% de pirofosfato de sõdio e 150 jug/ml d& ARNt de leved; a, a ur: temperatura de 52°C. Esta temperatura é iirfe^-iox, em 2°C. â calculada para o membro mais rico em AT do conjunto ck _>lic -'ectidos. (Suggs. S.V. em Developmental Biology Ucin-g urified Ganes, (Brown, D.D. , e Fox, C.F. eds.) Aca<l«»ic Press,

New York, pp. :3-693 (19SI)). Depois cta hioridação, lavaram-se os filtros, durjnte 45 minutos, â temperatura ambiente, com três soluções distintas de NaCl 1 M, citrato de sõdio 0,1 M e SDS a 0,5% Fez-se uma lavagem rigorosa do membro do conjunto mais rico sn AT, durante oito minutos, à tenperatura Tm (isto é, 2°C acima da temperatura de hibridação). Os filtros foram, então, secos e auto-radiografados, durante 40 beras, a -70°C, com uma película intensificadora.

Detectaram-se onze placas com hibridação positiva, e estas foram isoladas e amplificadas. Testou-se a capacidade desses clones se hibridarem com TNFBP-P20, TNFBP-P3’ e TNFBP-P4, utilizando metodologia semelhante. Um dos clones (TNFBP-8) hibridou-se com todos os quatro oligonucleõtidos. Esse clone, foi purificado e amplificado, em placa. Preparou-se ADN, a partir desse clone, usando Lambda-Sorb (Promega Corporation, Madison, WI) e um método descrito pelo fabricante.

Submeteu-se 1 jug desse ADN a digestão com Sau3AI, e os fragmentos foram sub-clonados no vector M13 de sequenciação, mpl8, digerido com BamHI (Yanish-Perron, C., Vieira, J., e Messing, J. Gene 33: 103-119 (1985)). Os clones do M13 foram, então transferidos para filtros nitrocelulõsicos duplos, e foram hibridados com as sondas oligonucleotídicas da Tabela 4, usando condições jã descritas anteriormente. Os sub-clones positivos, foram purificados, e sequenciados (Sanger, F., e Coulson, A.R.J. Mol. Biol, 94: 441-448 (1975)), usando uma T4ADN-polimerase modificada (Sequenase, US Biochemical Corp., Cleveland,OH), de acordo com a descrição do fabricante, e usando como iniciadores quer as sondas degeneradas usadas para identificar o clone, quer^equência obtida utilizando essas sondas. Entre as sequências obtidas, estão

Ref: SYN02/P0RTUGA1 as dos subclones TNFBP-M13-Sau3A-P2’-2 e TNFBP-M13-Sau3A-P4, e as dos iniciadores P3, P3’, P2’, P2 e P4. A informação relativa a estas sequências apresenta-se na Figura 13. A sequência, contém a codificação de ADN para, pelo menos, 48 aminoácidos, dos péptidos do inibidor de TNF de 30 kDa, diferentes dos gue são especificados pelas sondas e, por isso, confirma-se que o clone ΤΝΓΒΡ8 estabelece codificação para o inibidor do TNF. A sequência também mostra que o gene do inibidor de TNF inclui, pelo menos, um intrão (GTAGGGGCAA

.......CCCCATTCACAG). Por fim, esta sequência mostra que o inibidor de TNF de 30 kDa, é sintetizado na forma de uma proteína precursora, e que é necessária uma clivagem proteolítica, na sequência Arg-Asp, para gerar a proteína madura, activa.

EXEMPLO 6 - Preparação e rastreio de uma biblioteca de ADNc de ARNm obtido de células U937, estimuladas com

PMA/PHA

A experiência desxrita no Exemplo 4, mostra que as células U937, tratadas com PMA/PHA, durante 1 hora, devem conter um conjunto de ARN mensageiros enriquecidos para o inibidor de TNF de 30 kDa. Em conformidade, preparou-se uma biblioteca da ADNc, a partir de poli A ARN obtido de células U937, tratadas com PMA/PHA, tal como se descreveu no Exemplo 4. Obteve-se o ADNc de cadeia dupla, com estremidade romba, a partir de cerca de 5 /ig de poli A*ARN, essencialmente conforme é descrito por Gubler, U. e Hoffman, B.J., (1983 Gene, 25: 263), utilizando reagentes testados lote a lote (Amhersham, Arlington Heights, IL), de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante. Tratou-se cerca de 1 yjg do ADNc de cadeia dupla obtido, com a enzima EcoRI-metilase e acoplaram-se ligantes EcoRI com a sequência: d(pCCGGAATTCCGG) ( New England Biolabs, Beverly, MA), através da T4ADN-ligase, ao que se seguiu digestão com EcoRI endonuclease. Ligou-se, então, esse ADN, a um vector bacteriófago lambda de clonação gtlO (Young, R.A., e Davis, R.

W. (1983) Proc Natl Acad Sei USA, 80: 1194-1198) , que tinha sido digerido com EcoRI, e o produto foi empacotado em partículas infecciosas de bacteriófago lambda, utilizando extractos de empacotamento lambda-ADN (Gigapack II Gold), obtidos de Stratagene (La JoHa,

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 54 CA), de acordo com o seu protocolo. Usou-se, então, esse lambda-lisa o (biblioteca de ADNc), para infectar a estirpe C600 hflA da E. coli, tendo sido demonstrado que a biblioteca continha cerca de 2,5 x 10° membros recombinantes.

Aplicaram-se cerca de 4 x 10^ membros dessa biblioteca na 4 estirpe C600 hflA da E. coli (5 x 10 p.f.u./placa). Colocaram-se doses duplicadas em nitrocelulose, e trataram-se os filtros tal como se descreveu no Exemplo 5, em relação ao rastreio da biblioteca genómica humana. O ADN dos filtros foi, a seguir, hibrida32 do com a mesma sonda, marcada com P, tal como foi descrito no Exemplo 4, com a diferença de que a temperatura de incubação foi de 42°C. Dos 4 x 10^ fagos recombinantes, em placas, hibridaram-se, com esta sonda, 3 placas duplas. Estas, foram, depois, re-isoladas e sondadas, tal como acima, e com uma sonda sintética adicional, com a sequência:

5' CCCCGGGCCTGGACAGTCATTGTA 3’

Esta sonda, corresponde ãs bases 671-694 do clone genõmico humano do inibidor de TNF, apresentado na Figura 13. Ambas as sondas, se hibridaram com todas as três placas identificadas com a primeira.

Depois de purificação das placas, preparou-se ADN, a partir desses três clones, e sub-clonou-se no sítio EcoRI dos vectores M13, MP18 e MP19, conforme se descreveu no Exemplo 5. Cada um desses ADNc consiste de dois fragmentos EcoRI, um com cerca de 800 bp, comum a todos os três clones, e o outro com 1300 bp, 1100 bp ou 1000 bp, dependendo do clone. A origem provável destes três fragmentos EcoRI únicos, em cada clone, é o prolongamento incompleto pela enzima transcriptase inversa, durante a la síntese da cadeia do ADNc. Assim, é provável que esses fragmentos EcoRI representem a extremidade 5' do ARNm do inibidor de TNF, representando, o fragmento com 800 bp, a extremidade 3'. Isto é confirmado pela sequência de ADN obtida para esses fragmentos, conforme se descreve abaixe.

Obteve-se a sequência completa do ADNc com 2100 bp, a partir dos subclones EcoPT do ADNc descrito acima. Usou-se o método de sequênciação didroxi, de terminação de cadeia núcleo-

Ref: SYN02/P0RTPGAL tídica (Sanger, F. e Coulson, A.R. (1975) J. Mol. Biol. 94: 441-448) . Usou-se T7 ADN-polimerase, modificada, Sequenase (U.S. Biochemical, Cleveland, OH) como enzima de prolongamento, tal como é descrito pelo fornecedor. Os iniciadores da sequenciação eram oligonucleõtidos sintéticos, preparados a partir da sequência genómica humana do inibidor de TNF, tal como se mostra na Figura 13, ou sequências obtidas utilizando esses iniciadores. A Figura 20 apresenta a sequência traduzida, derivada de um dos clones de ADNc. Essa sequência, corresponde à que foi obtida através dos dados de sequência proteica, conforme se descreve na Figura 19. Na Figura 21 apresenta-se a sequência completa do ADNc humano do inibidor de TNF de 30 kDa, obtida a partir do clone lambda-gt 10-7ctnfbp.

EXEMPLO 7 - Expressão do ADNc do inibidor de TNF de 30 kDa em Escherichia coli

Preparou-se a porção do gene do ADNc, do inibidor de TNF de 30 kDa, que codifica a actividade ligante do TNFa solúvel, para expressão em E. coli, tal como se descreve abaixo. Devido ao facto de que, â sequência de codificação da proteína, que define a porção terminal C do inibidor de TNF derivado da urina (sequência QIEN, base 771, Figura 20), não se segue um codão de terminação, na sequência do ADNc, adicionou-se um, através de mutagénese dirigida por oligonucleótido, in vitro (Biorad, Richmond, CA). Hibridou-se um clone M13MP19, do fragmento EcoRI, com 1300 bp, do clone lambda-gtl07ctnfbp, com o oligonucleótido sintético:

' CTACCCCAGATTGAGAATTAAGCTTAAGGGCACTGAGGAC 3 ’

Depois da 1â síntese da cadeia e da transfecção um hospedeiro apropriado, identificaram-se os clones mutantes, através de hibridação com o oligonucleótido mutagénico descrito acima. A identidade molecular, dos clones identificados deste modo, foi confirmada através de sequênciação do ADN, conforme jã foi descrito (Exemplo 5). A seguir, removeu-se, da forma Rf, um fragmento com 468bp , definido por Stil ( posição 303) e HindIII, e cue define o terminal C da proteína, na forma de um clone mutagenizado, e inseriu-se num plasmideo de expressão em E. coli, que continha o promotor taci (DeBoer, H.A., et ai,(1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 56 80: 21-25). Esta construção foi executada através da utilização da sequência adaptadora sintética, de cadeia dupla:

5' GATCCGATCTTGGAGGATGATTAAATGGACAGCGTTTGCCCC 3’

GCTAGAACCTCCTACTAATTTACCTGTCGCAAACGGGGGTTC

Este adaptedor acopla traducionalmente o gene do inibidor de TNF (na forma truncada, tal como descrito acima), aos doze primeiros codões do gene 10 do bacteriõfago T7. Na Figura 22 mostra-se a sequência de ADN desta construção, desde o ponto de iniciação da tradução, no gene 10, e até ã sequência do adaptador.

É necessário adicionar um codão metionina (ATG), à sequência do gene do inibidor de TNF, para a expressão em E. coli. Esse plasmídeo, é designado por pTNFiX-1. A massa molecular prevista para esta proteína, é de aproximadamente 17 600 Da, uma massa molecular que estã muito próxima da do inibidor nativo, desglicosilado de TNF (30 kDal

EXEMPLO 8 - Purificação do inibidor activo de TNF, de 30 kDa, a partir da Escherichia coli

Ressuspenderam-se células de 1 litro de cultura de E. coli (pTNFIX-lJMl071on-), cultivadas sob condições induzidas, durante 2 horas, em 10 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 , que continha

EDTA 2mM (tampão TE), e espremeu-se (French pressed ), sob 20 000 psi (1360,9 atm), a 4°C. Centrifugou-se o material, a 20 000 g, durante 10 minutos. Lavou-se uma vez a pelota resultante, com tampão TE. Ressuspendeu-se a pelota lavada, em 2 ml de guanidina-HCl 6 M, e incubou-se, â temperatura ambiente, durante 10 minutos, Depois da incubação, adicionaram-se 80 /xl de DTT 500 mM, e incubou-se a mistura, ã temperatura ambiente, durante mais 30 minutos. Removeu-se o material que se manteve insolúvel depois deste tratamento, centrifugando, a 20 000 g, durante 15 minutos. Adicionaram-se ao sobrenadante, 120 /xl de glutationa oxidada 500 mM, e incubou-se a mistura, ã temperatura ambiente, durante 10 minutos. A seguir, diluiu-se o material em 20 ml de solução Tris base , a 0,6%, e adicionaram-se 220 /xl de cisteína 500 mM. Continuou-se a incubação, durante mais 16 horas, a 4°C. Depois de 16 horas de incubaçao, observou-se uma pequena porção de resíduos insolúveis. O material in

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 57 solúvel, foi removido, através de centrifugação, a 20 000 g, durante 20 minutos. Dialisou-se o sobrenadante resultante, contra Tris-HC1, 50 mM, pH 7,5, durante 16 horas, a 4°C, e, a seguir, centrifugou-se, a 20 000 g, durante 10 minutos. Adicionou-se PMSF, até uma concentração final de 4 mM, a esse sobrenadante, e aplicou-se o material resultante numa coluna de afinidade de TNF (0,7 x 2 cm), com um caudal de 0,1 ml/minuto. Lavou-se abundantemente a coluna, com Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e as proteínas ligadas foram eluídas, com NaPO^-HCl 50 mM, pH 2,5. Carregou-se o eluato, pH 2,5, a uma coluna RP8, que fora equilibrada previamente com TFA 0,1%/H20. Eluiu-se o inibidor de TNF, com um gradiente linear, de TFA 0,1%/acetonitrilo, a 1%/minuto (Figura 25). Analisaram-se as fracçoes por SDS-PAGE (Figura 26) e executaram-se testes de citotoxicidade (Figura 25), para localizar o inibidor de TNF. O inibidor de TNF de 30 kDa produzido em E. coli, migra para cerca de 20 kDa uma vez que não estã glicosilado. As fracçoes número 30 a 35, contêm o inibidor de TNF. A sequência amino terminal, deste material, revela que o inibidor de TNF, produzido em E. coli, possui a sequência seguinte.

Met-Asp-Ser-Val- ()-Pro-Gln-Gli-Lis-Tir-Ile-His-Pro-Gln-Asn-Asn-SerUti lizando este procedimento obtiveram-se cerca de 40 /ig do inibidor de TNF de 30 kDa, a partir de um litro da cultura. O rendi mento foi de 2% a 3%, aproximadamente. O rendimento pode ser aumentado até mais de 50%, purificando o inibidor de TNF antes de este se redobrar.

EXEMPLO 9 - Expressão de genes que codificam o inibidor de

TNF de 30 kDa, em células animais

A expressão do inibidor de TNF, em células animais, requer

as etapas seguintes:
a)	Construção de um vector	de expressão.
b)	Escolha das linhas de células hospedeiras.
c)	Introdução do vector de deiras.	expressão nas células hospe-
d )	Manipulação das rélulas	hospedeiras recombinantes.. pa

aumentar os níveis de expressão de TNFBP.

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 58 1. Os vectores de expressão do inibidor de TNF, concebidos para utilização em células animais, podem ser de diversos tipos incluindo construções de expressão constitutivas, fortes, e construções de gene, indutíveis, bem como os que foram concebidos para expressão em tipos particulares de células. Em todos os casos, posicionam-se promotores, e outras regiões reguladoras de genes, tal como sinais de poliadenilação e intensificadores (indutíveis ou nãc), na localização correcta, relativamente ãs sequências de ADNc, em vectores à base de plasmídeos. Seguem-se dois exemplos de tais construções.

Pode produzir-se uma construção, que use uma região promotora, constitutiva, forte utilizando os sinais de controlo do gene precoce anterior do citomegalovírus (CMV). Este plasmídeo, pode ser construído usando técnicas padrão de biologia molecular (Maniatis, et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), que resultam no plasmideo apresentado na Figura 23 (pCMVXV beta TNFBP paragem A). A origem da replicação, de SV40 é incluída nesse plasmideo para facilitar a sua utilização em células COS, em testes de expressão transiente. Essa construção particular, contém o intensificador e o promotor precoce anterior do CMV, tal como descreve Boshart, et al., (Cell 41: 521-530, 1985), seguidos pelo segundo intrão da B-globina de coelho (ver van Ooyen et al., Science 206: 337-344, 1979), que é flanqueada pelos locais de restrição BamHI e EcoRI. Inclui-se esse intrão, porque se demonstrou que os níveis de expressão eram aumentados quando se incluiam intrões nas regiões transcritas, de alguns vectores de expressão (Buckman e Berg, Mol. Cell. Biol. 8: 4395-4405, 1988). O sinal de poliadenilação é fornecido pelas sequências do vírus de símio 40 (SV40) - coordenadas 2589-2452 do mapa; ver Reddy, et al., Science 200: 494-502, 1978. As sequências do ADNc, do inibidor de TNF de 30 kDa, foram modificadas, tal como se segue: a extensa região localizada 3' em relação ao terminal C do inibidor de TNF purificado, de urina humana, fci deleccionada,e inseriu-se um codão de paragem na posição imediatamente a seguir ã asparagina do terminal C. As sequências não modificadas do ADNc, do j.nibidui de TNF ué 30 kDa, contidas num vector análogo, fera::: inse71 271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 59 ridas em células COS, e mostraram aumentar a actividade de tais células na ligação de TNF.

A segunda construção (ver a Figura 24), (pSVXVTNFBP paragem À) utiliza a região promotora, constitutiva, forte, do gene prematuro do SV40, numa disposição tal como a que se encontra no plasmideo pSV2CAT (Gorman, et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051, 1982). Este plasmideo, deve ser manipulado de modo que se substitua o ADNc do inibidor de TNF, pelas sequências de codificação da cloroamfenicol-acetiltransferase, utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Mais uma vez, modificou-se o ADNc do inibidor de TNF, tal como se descreveu acima em relação à construção do promotor do CMV.

A região do promotor precoce do SV40, inclui sequências desde o local HindIII até ao local BamHI (coordenadas do mapa: 5090-188 ; ver Reddy et al., Science 200: 494-502, 1978), e o sinal de poliadenilação do SV40 é tal como se descreveu acima, para a construção do CMV.

2. Usaram-se duas linhas de células animais para expressar o inibidor de TNF usando os vectores descritos acima para produzir proteína activa. As linhas de células, que foram caracterizadas pela sua capacidade para promoverem a expressão desse genes estranhos, incluem a célula do rim de macaco, a COS-7 e células do ovário de criceto chinês (CHO), deficitárias em di-hidrofolato-redutase (dhrf-) .

3. Para se estabelecer uma linha contínua de células, derivadas de CHO, que segregassem o inibidor de TNF de 30 kDa, para o meio de cultura das células, introduziu-se um plasmideo de expressão do inibidor de TNF, nessas células dhfr-, juntamente com um plasmideo que dirige a síntese da di-hidrofolato-redutase, recorrendo ã técnica de precipitação de ADN com fosfato de cálcio, descrita por Graham e van der Eb (Virology 52:456-467, 1973). As células que captaram o ADN e que expressaram o DHFR, foram seleccionadas, conforme é descrito por Ringold, et al., (J.Mol. Appl. Genet. 1:165-175, 1981)

4. As células que expressam as construções co gene do inõbidor de TNF podem ser manipuladas, para se aumentarem os níveis de produção do inibidor de TNF. As células que contêm vectores de

271

Re f: SYN02/PORTUGAL

- 60 expressão do inibidor de TNF, juntamente com um vector de expressão de dhfr, devem ser submetidas ao protocolo de amplificação de gene descrito por Ringold, et al., (J. Mol. Appl. Genet. 1: 165-175, 1981), utilizando metotrexato, um antagonista competidor do dhfr. A amplificação de gene, conduz a mais cópias dos genes do ini bidor de TNF e de dhfr, presentes nas células, e, concomitantementa, conduz a níveis aumentados do ARNm do inibidor de TNF, o que, por seu turno, conduz a uma maior produção celular da proteína do inibidor de TNF.

EXEMPLO 10 - Isolamento de dois tipos de inibidores de TNF, a partir de meio condicionado de U937 e a existência do segundo inibidor de TNF na urina humana

Cultivaram-se células U937 humanas, até uma densidade de 1 x 10³ células/ml, em balões de 150 cm³, usando meio RPMI1640, que continha 200 unidades por mililitro de penicilina, 200 unidades por mililitro, de estreptomicina, e 10% de soro de vitela fetal. Depois de 3 dias de incubação, a 37°C, recolheram-se as células por centrifugação a 1500 g, durante 7 minutos. Ressuspenderam-se as célu£ las ate uma densidade de 2 x 10 /ml, em meio RPMI1640, sem soro. As células foram cultivadas, na presença de 5 /xg/ml de PHA-P (fito-hemaglutinina) e de 10 ng/ml de PMA (12-miristato-13-acetato-fobol), durante 24 horas.

O meio incubado durante 24 horas (4425 ml), foi recolhido por centrifugação e foi concentrado por um filtro Amicon YM5 até cerca de 100 ml. Fez-se passar o material resultante, através de um gel de afinidade de TNF (0,7 x 2cm) , a um caudal de 0,1 ml/min e lavou-se profusamente o gel, com Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5. Elui ram-se as proteínas ligadas com NaPO^-HCl 50 mM, pH 2,5, e separou-se o inibidor de TNF, de outras proteínas contaminantes, atra vés de HPLC-RPC8. Tal como se mostra na Figura 27, observaram-se dois picos de inibidor de TNF. Uma análise por SDS-PAGE das fracçõe da RPC&, revelou que os pesos moleculares dos dois picos correspondiam, grosseiramente, a proteínas de 30 kDa e de 40 kDa (Figura 28). Submeteu-se a proteína com 30 kDa (TNF-INH]) a análise da sequência do terminal amino, e constatou-se ser a mesma sequência

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 61 que a do inibidor de TNF de 30 kDa, obtida da urina, descrito acima. Contudo, a sequência proteica, da proteína de 40 kDa, revela que não é igual à da proteína de 30 kDa (ver o Exemplo 11). A purificação adicional do segundo pico de inibidor de TNF da urina humana, que se observa ã volta da fracção 35, na Figura 8, revelou que é, também, a proteína de 40 kDa, do inibidor de TNF (Figuras 29 e 30) .

O inibidor de TNF de 40 kDa, é também uma glicoproteína. Este facto foi detectado usando Concanavalina A-peroxidase, depois de a proteína ter sido transferida para um filtro nitrocelulósico, tal como se descreveu no Exemplo ID. Mostrou-se através de SDS-PAGE, que o peso molecular do inibidor de TNF de 40 kDa, tratado com N-glicanase, era, aproximadamente, de 36 kDa. (Ver procedimento descrito no Exemplo l.D).

Seguindo os procedimentos descritos no Exemplo I.E, acima, pode determinar-se que o inibidor de TNF de 40 kDa, desglicosilado, também se liga ao TNF alfa. Além disso, pode mostrar-se que a proteína de 40 kDa, desglicosilada, também se liga ao TNF beta (linfotoxina) .

EXEMPLO 11 - Sequenciação das proteínas do inibidor de TNF de 30

kDa,	derivado	da	U937,	do	inibidor de TNF	de	40 kDa
e do	inibidor	de	TNF de	40	kDa, originário	da	urina

Determinou-se a sequência do terminal amino das proteínas, usando um sequenciador de proteínas da Applied Biosystem, modelo 470. Foram sequenciadas, quer as proteínas nativas, quer as proteínas reduzidas e carboximetiladas. Aplicaram-se cerca de 200 pmol de inibidores de TNF, purificados por fase inversa (RP-8) , a um filtro de polibreno, e submeteram-se a degradação de Edman, automatizada. Na Figura 31, apresenta-se a sequência resultante. Pode ver-se, que a proteína de 30 kDa, derivada das U937, é igual ã que sc· forma e é identificada na urina. A proteína de 40 kDa, do inibidor de TNF, não é igual ã proteína de 30 kDa, do inibidor de TNF. A proteína com 40 kDa, do inibidor de TNF, obtida da urina, não contém dois resíduos do terminal amino; por outro lado, é igual

271

Ref: SYN02/P0RTDGAL

- 62 ã proteína de 49 kDa, derivada das U937.

EXEMPLO 12 - Estrutura primária do inibidor de TNF de 40 kDa

Cerca de 40 ^g, do inibidor de TNF de 40 kDa, reduzido e carboximetilado, foram digeridos com endoprotease V8, tal como foi descrito acima, e os péptidos resultantes foram separados, numa coluna RPC18 (Figura 32). Os péptidos purificados, foram sequenciados, utilizando um sequenciador de proteínas, da Applied Biosystems (modelo 470).

Trataram-se cerca de 90 /ig, do inibidor de TNF, reduzido e carboximetilado, com 5 ,ug de endopeptidase Arg-C, em bicarbonato de amónio 0,2 M, a 37°C. Depois de uma digestão de 24 horas, o material digerido pela Arg-C, foi carregado numa coluna de HPLC-RP8, para separar os péptidos (Figura 33). Os péptidos purificados foram sequenciados como anteriormente. Alguns dos péptidos foram submetidos a nova digestão, com TPCK-tripsina ou quimotripsina. Tra taram-se cerca de 500 pmol do péptido arg-C16, com 3 ug de TPCK-tripsina (Boehringer Mannheim), em bicarbonato de amónio 0,2 M, a 37°C, durante 7 horas, e separaram-se os péptidos usando RP8 (Figura 34). Digeriram-se cerca de 200 pmol do péptido arg-ClO, com 1 ug de quimotripsina (Boehringer Mannheim), a 37°C, durante três horas e meia, e separaram-se os péptidos resultantes, numa coluna

RPC18 (Figura 35).

Determinou-se uma estrutura parcial do inibidor de TNF (40 kDa) alinhando diversos péptidos sobrepostos (Figura 36). Na Figura 38, apresenta-se uma estrutura primária completa do inibidor de TNF de 40 kDa. Os resíduos que não foram identificados através da sequenciação de proteínas, foram deduzidos, a partir de revisão da sequência do clone de ADNc que codifica o inibidor de TNF de 40 kDa, assunto que é discutido no Exemplo 14A e é descrito na Figura 39.

EXEMPLO 13 - Identificação de clones de ADNc para o inibidor de TNF_a de 4 0 kDa

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 63 A informação apresentada no Exemplo 9, revela que as células U937, tratadas com PMA e com PHA, produzem um inibidor do TNFa, com um peso molecular de, aproximadamente, 40 kDa. Essa proteína foi purificada, e a sua sequência de aminoácidos foi substancialmente determinada, tal como se descreveu no Exemplo 12. A Tabela 5, mostra as sequências de diversos pèptidos derivados dessa proteína e fornece as sequências de sondas oligonucleotídicas de sequências mistas, utilizadas para isolar os genes que codificam o inibidor de TNF de 40 kDa, aqui descrito.

As sequências de codificação de gene, que compreendem o inibidor de 4 0 kDa, podem ser isoladas a partir da biblioteca genómica humana descrita no Exemplo 5, ou de uma biblioteca de ADNc, construída a partir de ARNm obtidos a partir de células U937, que tenham sido tratadas com PMA e PHA, durante cerca de 9 horas (Ver Exemplo 14). Cada biblioteca, deverá conter cerca de 1,0 χ 10⁶ recombinantes .

271

Ref: SYN02/P0BTUGAL

- 64 TABELA 5

Sequência

Peptídica

EYYDQTA

AQUAFT

KQEGCR

QMCCSKC

DQTAQMC

PGWYCA

Designação de sonda kD-P2'

KD-P1

KD-PG

KD-P5

KD-P6'

40KDP7

Sequência da sonda

C

5’GAATATTATGATCAAACAGC 3' G C C C G G

T c c c

5'GTAAAACGAACTTGAGC 3’

G G G C G

T T T c

*AAACAAGAAGGATGTCG 3’

G G G G CAC

T

C

5'CATTTAGAACAACACATTTG 3’ C GCTG G C

T

C C

5’GATCAAACAGCACAAATGTG 3' C G G G G

T T c C C c 5’ CCAGGATGGTATTGTGC 3'

G G T T

EXEMPLO 14 - Isolamento de sequências do ADNc do inibidor de

TNF de 40 kDa, a partir de células U937 induzidas por PMA/PHA

Isolou-se ARNm de U937, a partir de células que tinham sido induzidas por PMA/PHA, durante 9 horas. A seguir, foi selecciona do, numa coluna oligo-dT, e o ARNm poliadenilado, assim isolado, foi usado para produzir ADNccd(dsc), usando transcriptase inversa, seguida de E. coli polimerase I/RNase H. Submeteu-se o ADNccd(dsc), a uma reacção em cadeia ccm polimerase usando, como iniciadores, as sondas degeneradas (40 KD-Pl' e 40 KD-P7) apresentadas na Tabela

5. Os produtos de ADN dessa reacção, foram sondados com a sonda 40 EL-P6’, numa mancha Southern (ver Tabela 5), identificando-se uma

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 65 única banda com essa sequência. Isolou-se essa banda num qel de agarose, e clonou-se no ADN do fago M13 (estirpe mpl8). Após transformação, na estirpe JM109 da E. coli, e colocação em meio que continha X-gal e IPTG, identificaram-se placas límpidas, que continham a inserção correcta de ADNc. Na Figura 37, apresenta-se a sequência do ADN desse clone, juntamente com o produto de tradução previsto a partir dessa sequência. Essa sequência de aminoácidos iguala a sequência peptídica apresentada na Figura 36 (resíduos 12-104) e na Figura 38.

EXEMPLO 14A - Isolamento do clone do ADNc do inibidor de TNF de 40 kDa, a partir de células U937 induzidas por PMA/PHA

Isolou-se ARMn(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18,

5294-5299) de células U937 humanas, que tinham sido expostas a PHA e PMA durante 9 horas. Purificou-se ARNm, a partir desse ARN, usandooligo-dT celulose (Aviv, H. e Leder, P. 1972, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 69, 1408-1412). Usaram-se 5 ug, desse ARNm, para sintetizar 3 ug de ADNc de cadeia dupla, com extremidade romba (Gubler, U. e Hoffman, B.J., 1983, Gene 25, 263-269). Depois de se adicionarem ligantês EcoRI, purificou-se o ADNc, numa coluna cromatográfica com fibras de sephacryl S-400 (da Pharmacia) , e precipitou-se com etanol. Ligaram-se 100 ng, desse ADNc, com 1 yug de lambda gt-10 digerido com EcoRI e tratado com fosfatase alcalina, após o que se empacotou in vitro, utilizando gigapack gold (Stratagene). O ADNc empacotado, rendeu 2,5 χ 10⁶ recombinantes, quando foi revestido sobre E. coli C600 hfl. Seleccionaram-se 1,2 χ 10⁶ membros dessa bi32 blioteca, em duplicado, usando a sonda 40 KD-P6+7, marcada com P (5’ GGG CGT ATG TGC TGT CCT CAC AGG 3') tal como foi descrito (Benton, W. D. e Davis, R. W. 1977, Science 196, 180-182). Isolaram-se doze clones de hibridação positivos, e re-seleccionaram-se com as sondas 40 KD-P6' e 40 KD-P7 (ver a Tabela 5, do Exemplo 13). Quatro desses clones hibridaram-se com todas as três sondas. Um desses ele nes, o 040X0*6, foi digerido com EcoRI, e uma inserção de 2,2 kb foi isolada e subclonada com as duas orientações, no vector do bacteriófago M13, mp!9 (Yarrish-Perron, C., et al., 1985, Gene 33, 105

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 66 -119). Determinou-se a sequência de ambas as cadeias, usando o método de terminação da cadeia (Sanger, F. e Coulson, A.R., 1975, J. Mol. Biol. 94, 441-448), com TaqADN polimerase (da U.S. Biochemical). Na Figura 39, apresenta-se essa sequência juntamente com o seu produto de tradução, deduzido. A sequência contém uma única estrutura de leitura aberta, que se estende a partir do tripleto ATG da base 93, bem para além da sequência terminal C da proteína com 40 kDa, no tripleto GAC da base 863.

EXEMPLO 15 - O inibidor de TNF de 40 kDa, inibe tanto o TNF beta como o TNF alfa

Examinaram-se, quer o inibidor de TNF de 30 kDa, quer o inibidor de TNF de 40 kDa, para determinar se também seriam capazes de inibir a actividade do TNF beta (linfotoxina). Incubaram-se várias concentrações de TNF beta (adquirido ã Endogen), com cada um dos inibidores, durante uma hora, à temperatura ambiente. Analisaram-se as misturas resultantes, através do sistema de teste com células L929, tal como se descreveu no Exemplo l.B.l, em relação ao TNF alfa. Essas experiências, revelaram que o inibidor do TNF, de 30 kDa, tem um efeito inibidor pequeno sobre o TNF beta. Contudo, o inibidor de TNF de 40 kDa, revelou um efeito inibidor significativo, sobre o TNF beta. Na Figura 40, podem ver-se os resultados dessas experiências.

EXEMPLO 16 - Preparação de uma biblioteca de ADN genómico humano para o inibidor de 40 kDa

Pode preparar-se uma biblioteca conveniente de ADN genómico humano, para o inibidor de TNF de 40 kDa, do modo descrito no Exemplo 5, para o inibidor de TNF de 30 kDa.

EXEMPLO 17 - Preparação de genes para a expressão do ADNc do inibidor de TNF de 40 kDa, em Escherlchia coli

Prepararam-se porções do gene do ADNc, do inibidor de TNr de 40 kDa, que codifica as actividades ligantes do TNF solúvel (Figura 39) , para expressão em E. coli, tal como se descreve abaixo.

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 67 Por ter sido difícil determinar, de modo definitivo, a sequência do terminal C do inibidor maduro de TNF de 40 kDa, obtido de urina ou de células U937, construímos 3 derivados da sua sequência de codificação do ADNc com base na análise de sequência do clone do ADNc. O primeiro, estende-se à presumível sequência transmembrana, do par de bases 863 desta proteína (Figura 39), e termina com a sequência peptídica ... Gli Ser Tre Gli Asp. Os outros dois, são 51 (Δ 51) e 53 (Ú53) aminoácidos mais curtos do que esse clone e terminam no par de bases 710 ...Ser Pro Tre, e no par de bases 704 ...Ser Tre Ser, respectivamente.

Cada um desses três terminais C, foi criado por mutagénese, in vitro (MutaGene, BioRad, Richmond, CA) de clones em M13 do ADNc do inibidor de TN Et de 40 kDa. Criou-se primeiro o clone mais longo, utilizando os oligonucleótidos sintéticos seguintes:

. 5' CAC TGG CGA CTA AGC TTC GCT CTT C 3’

2. 5' GCG GCG CAC GCC GGA TCC GAT CTT GGA GGA TGA TTA AAT GTT GCC CGC CCA G 3'

O oligonucleótido 1, insere um codão de terminação de tradução, a seguir ao aminoácido 235, Asp, e cria, nesse ponto, um local de reconhecimento da endonuclease de restrição HindIII. O oligo nucleótido 2 adapta a sequência do terminal N, da proteína madura, Leu Pro, Ala... bp 159 (Figura 39), para expressão em E. coli, atra vês de:

1) inserção de um codão ATG, Met, na Dosição aminoácido 1 e 2) inserção de uma sequência acopladora da tradução e de um local de reconhecimento da endonuclease de restrição 5' BamHI. O fragmento mutagenizado, foi removido, por digestão do RfADN, do cio ne M13 mutante, com BamHI/HindIII e foi inserido num plasmideo de expressão em E. coli, tal como se descreveu no Exemplo 7. Os clones que contêm essa construção de gene, são designados oor TNF.40.

Os dois clones encurtados, foram construídos como acima, usando o derivado M13, mutagenizado, do clone co inibidor de TNFa de 40 kDa, isolado acima, e os oligonucleótidos sequintes:

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 68 5' GTCCCCCACCTAAGCTTCGGAGTATGG 3' £51

5' GTCCACGTCCTAAGCTTCCCACCCGGA 3' £53

Estes dois oligonucleótidos, introduzem codões de terminação de tradução, nos bp 710 e 704, respectivamente (Figura 39). Os clones que contêm essas construções de genes, são designados por TNF:40 β51 e TNF:40 Ô53, respectivamente.

EXEMPLO 18 - Expressão de genes que codificam o inibidor de

TNF de 40 kDa, em células animais

Pode executar-se a expressão do clone do inibidor de TNF de 40 kDa, em células animais, tal como se descreveu no Exemolo 9.

A extensa região localizada 3' em relação ao terminal C, do inibidor de TNF de 40 kDa pode ser deleccionada, sendo instalado um codão de paragem, na posição imediatamente a seguir ao ácido asoártico do terminal C.

EXEMPLO 19 - A expressão do ADNc completo, que codifica o inibidor de TNF de 30 kDa, em células de mamíferos, aumenta os locais receptores de TNF

Produziu-se um vector de expressão, que incoruorava a totalidade do ADNc do inibidor de TNF de 30 kDa (2,1 kb), apresentado na Figura 21 e designado por p30KXVA, vector esse que era idêntico, em todos os outros aspectos, ao vector apresentado na Figura 23 (isto é, as sequências do TNF-BP, apresentados nessa figura, foram subs tituídas pelo ADNc com 2,1 kb, usando o local único EcoRI do plasmídeo) . Para uma descrição mais completa do vector de exoressão, veja-se o Exemplo 9. Introduziu-se este plasmídeo, em células COS7, utilizando o procedimento liDofecção, descrito por Feigner et al. , (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 7413 (1987)). As células transfectadas, foram analisadas quanto ã sua capacidade de ligarem o /_

TNFa. A Figura 41, apresenta os resultados do teste de ligação, de células que foram submetidas a transfecção falsificada cu cue foram transfectadas com o vector de expressão p30KXVA. 0 número de locais de ligação, nas células transfectadas pelo plasmídeo, é muitíssimo maior do que esse número nas células de controlo. Na realidade, o clone do ADNc completo (isto é, a estrutura aberta de leitura que

271

Ref: SYN02/PORTUGAL .

- 69 codifica uma proteína muito maior do que o inibidor de 30 kDa obtido da urina) , representa um clone de ADNc de um receptor de TNF.

EXEMPLO 20 - A expressão do ADNc que codifica o inibidor de TNF de 40 kDa, em células de mamíferos, aumenta os locais receptores do TNF

Produziu-se um vector de expressão, usando o fragmento de ADNc, com 2,4 kb, que foi isolado do clone do fago lambda # 6, descrito no Exemplo 14A. Esse plasmideo, é idêntico ao que se descreveu no Exemplo 9 (Figura 23), excepto em que as sequências do ADNc, do inibidor de TNF de 40 kDa, substituíram nesse plasmideo, as sequências do ADNc do inibidor de TNF de 30 kDa. Isolaram-se plasmideos com o fragmento ADNc de EcoRI, com 2,4 kb, em cada uma das orientações, designados por p40KXVA (orientação no mesmo sentido) e p40KXVB (orientação anti-sentido ) . Esses plasmideos, contêm a origem de replicação do SV40, o intensificador e o promotor precoce anterior do citomegálo-vírus, o segundo intrão da B-globina de coelho, o ADNc, do inibidor de TNF com 40 kDa, e o sinal de poliadenilação precoce do SV50, (para urra descrição mais completa deste vector, veja-se o Exemplo 9), num plasmideo baseado no pBR322. Esses plasmideos foram transfectados em células COS7, as quais foram, a seguir, testadas, quanto ã ligação de TNF (ver a Figura 42). As células que tinham sido transfectadas pelo p40KXVA,· exibiram um maior número de locais de ligação do TNF, sobre a superfície da célula, do que as células COS7 isoladamente ou do que as células COS7 transfectadas pelo p40KXVB, o que sugere que este ADNc codifica um receptor do TNF. Podem desenvolver-se outras células de mamíferos, tal como as células CHO, que consigam sobre-produzir este receptor, ou que.segreguem o inibidor de TNF de 40 kDa, para o meio de cultura de tecidos, do modo descrito no Exemplo 9.

EXEMPLO 21 - Inibidor isolado a partir de monócitos humanos

Prepararam-se monócitos humanos, a partir õe 55C ml de sangue, conforme descreve (Hannum, C.H. et al., Nature 343, 336-340, 1990) Fez-se uma sementeira de monócitos frescos (2 χ 10⁷ células)

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 70 em 500 ml de meio RPMI1640, isento de soro, e trataram-se com 10 ng/ ml, de PMA, e com 5 ug/ml, de PHA-P, durante 24, 48 e 72 horas, a 37oc. Depois da incubação, os meios foram colhidos, por centrifugação e concentrados até 50 ml. As amostras dos meios concentrados,foram aplicadas, uma de cada vez, numa coluna de afinidade de TNF {2 ml de volume de leito) e foram eluídas com ácido, tal como no Exemplo 1. O material eluido foi, depois, ainda mais purificado, usando uma coluna de HPLC RPC-8 sob as mesmas condições do Exemolo 1, e cada fracção foi tratada pelo teste de citotoxicidade em relação ãs L929. A Figura 43 mostra os dois picos de actividade inibidora do TNF. Esses dois picos, correspondem aos inibidores de TNF de 30 kDa e de 4 0 kDa, que também se detectaram no meio de cultura de células U937, que fora tratado com PMA e PHA, e que se identificaram na urina .

EXEMPLO 22 - Expressão e purificação de formas encurtadas do inibidor de TNF de 40 kDa (8 51 e Δ53) , a partir de E. coli

Ressuspenderam-se, 2 porções de 300 ml de células de cultu ras de E. coli (inibidor de TNF de 40 kDa, ó 51, e inibidor de TNF de 40 kDa,β 53) feitas crescer,separadamente,sob condições induzidas, durante 2 horas, em 10 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 que continha EDTA 2 mM (tampão TE) , apôs o que foram espremidas (French pressed ), sob 20 000 g, durante 10 minutos. Lavaram-se as pelotas resultantes, uma só vez, com tampão TE. As pelotas lavadas foram ressuspensas em 2 ml de guanidina-HCl, 6 M/Tris-HCl 100 mM, pH 8,5/PMSF 4 mM, e foi incubada, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Depois da incubação, adicionou-se DTT 500 mM, até uma concentração final de 4 mM, e incubou-se a mistura, ã temperatura ambiente, durante mais 1 hora. 0 material insolúvel foi removido, por centrifugação a 20 000 g, durante 15 minutos. Adicionou-se glutationa oxidada 500 mM, ao sobrenadante, até uma concentração final de 20 mM, e incubou-se a mistura ã temperatura ambiente, durante 10 minutos. A seguir, diluiu-se este material, em 20 ml de solução base de Tris a 0,6%, contendo 5 mM de cisteina. Adicionou-se PMSF até uma concentração final de 2 mM. Depois dc incubado, durante 16 horas, a

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 71 4°C, este material foi dializado contra 300 volumes de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 durante 3 horas, a 4ec, a seguir, centrifugou-se a

000 g, durante 15 minutos. 0 sobrenadante, foi aplicado numa coluna de afinidade de TNF (0,7 x 2 cm, 13 mg de rhTNF/ml de affigel-10), com um caudal de 0,09 ml/minuto. Lavou-se profusamente a coluna, com Tris-HCl 50 mM, com pH 7,5. Eluiram-se as proteínas ligadas com NaH2PO^-HCl 50 mM, com pH 2,5. Os eluatos ácidos foram aplicados numa coluna de RP8 (2 x 200 mm Spelco), e eluiram-se os inibidores de TNF, com um gradiente linear de acetonitrilo, em TFA 0,1%, e com um caudal de 1 ml por gradiente por minuto (Figuras 44A e 45A). Examinaram-se as fracções, através do teste de citotoxicidade em L929, para localizar os inibidores de TNF. 0 pico mais importante de cada perfil de fase RP8, contém-a actividade inibidora de TNF (Figuras 44B e 45 B). Os inibidores de TNF produzidos por E. coli (inibidor de TNF de 4 0 kDa, 2153, e inibidor de TNF de 40 kDa, Δ51), migram para os locais esperados numa SDS-PAGE (Figuras 44B e 45B). A sequência do terminal amino desses materiais, revela que os inibidores de TNF, produzidos por E. coli, possuem a sequência seguinte:

Met-Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Fen-Tre-Pro-Tir-Ala-Pro-Glu .

Usando este procedimento, obtiveram-se cerca de 150 pg de cada um dos inibidores de TNF de 40 kDa (ô 51 e Δ53) , a partir de 30 ml da cultura. O rendimento foi de alguns por cento podendo, no entanto, ser aumentado, para mais de 30%, através de optimização de cada etapa desta purificação.

Ambos os inibidores de TNF de 40 kDa (oô51 e o Ú53), inibem, não apenas o TNF-alfa, mas também o TNF-beta.

EXEMPLO 23 - Expressão e purificação do inibidor de TNF de 40 kDa, de comprimento total

Purificou-se um inibidor activo de TNF de 40 kDa, a partir de uma estirpe de E. coli que continha plasmídeos que possuíam um gene para o inibidor maduro dc TNF de 40 kDa, de comprimento total (tal como no Exemplo 12). Para isolar o inibidor activo, usou-se o mesmo método já usado no Exemplo 22. Esse inibidor activo inibe, quer o TNF-alfa quer o TNF-beta, e a sequência do terminal amino é igual

271

Ref: SYN02/PORTUGAL

- 72 ã que se apresenta no Exemplo 22.

EXEMPLO 24 - Composição de aminoácidos do inibidor de TNF de 40 kDa

Analisou-se inibidor maduro de TNF de 40 kDa, uroduzido por U937, quanto ã composição total em amioãcidos, através do sistema PTC de análise de aminoácidos. Na Tabela 6, apresentam-se os dados reais e previstos relativos à composição do inibidor maduro de TNF de 40 kDa, de comprimento total, tal como é apresentado na ^igura 38.

EXEMPLO 25 - Produção de inibidores de TNF modificados quimicamente

Com o objectivo de se aumentar a semi-vida dos inibidores de TNF no plasma, podem Droduzir-se inibidores de TNF modificados quimicamente pelo polietileno-glicol (PEG). A modificação, pode fazer-se através de reticulação do PEG com um resíduo cisteína das moléculas do inibidor de TNF. Uma vez que todos os resíduos cisteína, dos inibidores de TNF formam ligações dissulfureto, podem construir-se inibidores de TNF, mutantes, que contenham um resíduo cisteína extra, no terminal amino, nos locais de glicosilação, e nos terminais carboxilo de cada inibidor. A mutagénese pode ser executada por PCR, usando oligonucleótidos que contenham a mutação desejada. Tal como para o inibidor de TNF de 30 kDa, adicionou-se um resíduo cisteína extra no residuo de número 1, 14 ou 105. Estas proteínas mutantes foram expressas em E. coli, usando o mesmo sistema já descrito nos Exemplos 7, 22 e 23, e foram redobrados, para a forma activa do inibidor de TNF. As proteínas mutantes são tão activas como as proteínas não mutadas. Será efectuada a polietilenoglicolação dessas proteínas e será avaliada a sua actividade. Os mutantes de 40 kDa, serão construídos tal como acima e será efectuada a Dolietilenoglicolação, para se obterem Droteínas activas, tendo aumentado a estabilidade do inibidor de TNF.

271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 73 TABELA 6 $ Calculado, por sequência de ADN experimental

Asx	14	13,0
Glx	23	22,6
Ser	25	23,2
Gli	14	17,8
His	4	4,5
Tre	26	23,9
Ala	17	17
Arg	14	15,1
Pro	26	22,3
Vai	13	8,7
Ile	4	3,4
Leu	10	8,6
Fen	5	4,6
Lis	6	5,4
Tir	5	5,0
Trp	3	ND
Met	3	ND
Cis	22	ND

ND: nao determinado

Deve ser entendido que a aplicação dos ensinamentos do presente invento a um sistema de expressão específico se situará dentro das capacidades dos que possuam um conhecimento ordinário da arte, ã luz dos ensinamentos aqui contidos. Deste modo, será evidente, aos que possuem um conhecimento ordinário da arte,que se podem íazer diversas modificações e alterações, aos processos e nos produtos do presente invento. Pretende-se que o presente invento cubra essas modi71 271

Ref: SYN02/P0RTUGAL

- 74 ficações e variações desde que se situem no âmbito das reivindica ções anexas ou de seus equivalentes.

271

Ref: -SYNO 2/PORTUGAL

-75·

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de ADN recombinante para a produção de um inibidor de factor de necrose tumoral (TNF), caracterizado por compreender:

   (a) cultivar em condições adequadas para a expressão do referido inibidor de TNF, uma célula hospedeira, que não é uma célula humana capaz de glicosilação, contendo um ácido nucleico seleccionado de entre o grupo consistindo:

   (i) na sequência de ADN seguinte, ou uma sua porção de codificação:

   CATGCCTGCA GGTCGACTCT AGAGGATCTG GGGCCTACTA GúiTTGAGTl GAGGGAACAA AAAÍGAACAC 80 90 100 TO 13 130 U0

   AQGGACÀAC TAGAGAACAA TTAAGCATCA GATTGTAIGC CCCUCTGTC TALCTiTCAi GGuACALCTC

   150 Έ0 170 180 190 200 710

   TAiiCn-Gl GAGTGGCGTG GCCTGCGCGG AATGTTICAC TG-GGAAGGA CTTGAGCCAG GGAAGTTTTiL

   220 230 2L0 250 260 270 280

   GATCTGCTAC CCCTAAGCTT CCCATCCCTC CCTCTCTTGA TGGTGTCTCC TCTATCTGAT TCTTCCCC1G

   289 298 307 315 325 33L

   GKT CTl CTr CSC ΠΤΓ TTC CTIT Θ5 STÃ 1SC KC 'í- CGu GTT ÃTT GGA CTG GTC

   Vai Leu Leu Glu Leu Leu Vai Gly He Tyr Pro Ser Gly Vai He Gly Leu Vai __30__352 __361__37C__ 373 __388

   GCT CAC ΠΔ GGG GAC AGG GAG AAG AGA GAT ΔΟΤ GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT

   Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Vai Cys Pro Gin Gly Lys Tyr __ 397 __L06 L15 _ LiL _ L33 UL

   ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG ÃTT TÕC TÕT ACC AAG TGC CAC AAA G GTAGGGCAA He His Pra Gin Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys uys His Lys Ala

   L5L L6L L7L L8L L9L 50L 511

   GTGGAAACGG TGAATGCCCT CAGGTCTGGG GTGCTGCTTC TTTCTCTGCT TCTTCCAGH GTTCTTCCCT

   52L 53L 5U 55L 56L 57L 58L

   AACTTTGCTG TCTC1CCTGG GCTGGGATTT TCTCCCTCCC TCCTCTCCTA GAGACTTCAG GDAATCGGCC

   59L SOL 61L 57L 63L 6U 65L

   CTGGCTGDG TCCCTAGCAT GGGGCTCCTT CCTTGTGTTC 1CACCGGCAG CCTAACTCTG CGGCCCGAn

   66L 673 682 591 700

   CA CÃ ÕÃ ACC TÃG TTG TAC AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ÃCG GAC

   Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pra Gly Pro Gly Gin Aso Thr Asp

   709 __718__ 727 __36__7L5 75L

   TGC AGG GAG TGT GAG AGC KC TCC TTC ACC GCT TCÃ GAA ÃAC CAC CTC AGA CÃC Cys Aro Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Aro His 763 772 781 7Ç7 B07 8Π

   TKTTCJCCTECTKÍÍATCCCEBaS GGTGAGTGTG CACAGGGAGG AGAGTCAGGC Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Ara Lys

   827 837 8Í7 857 867 877 887

   GGDTCTTGAG TGGTGTGTGG GTGCCTGTCT ATGTGCAGGC TGGTGGGTGT GGDCAGGAAG GTGTGTGTTT

   897 907 917 927 937 9L7 957

   TGGTGGGACA CTGCATGGAT GTGAGTGTGl ATTACAGAGA CACACACTTA GGGGTATGTC AGGAAGGGGA

   967 977 987 997 1007 1016

   KCAGGGACA GGAGGATGCA GGACTCATAC CCCATCTTCI CCCCTCACCÀ GÃÃ S(G S5T EÃG Glu MET Gly Gin «5

   GTG GE ER Vai Glu Ile

   71 271

   Ref: SYNO2/PORTUGAL

   -76(ii) na sequência de ADN seguinte, ou uma sua porção de codificação:

   297 306 GAT AGT GTG TGT CCC CAA Asp Ssr Vai Cys Pro Gin

   GGA Gly AAA Lys 315 TAT Tyr 369 ATC Ile 324 333 342 351 360 AAA Lys 4 14 _ CAA Gin AAT Asn AAT Asn 3Θ7 TCG Ser ATT lie TGC Cys 396 - —- CAC His CCT Pro 37Θ TGT Cys ACC Thr AAG Lys 405 TGC Cys CAC His GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg 423 432 4-41 450 459 468 GAG TGT GAG AGC GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu 477 486 495 504 513 522 AGC TGC TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu MET Gly Gin Vai Glu Ile Ser Ser Cys Thr

   531 540 549 558 567 576 GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG Vai Asp Arg Asp Thr Vai Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp 585 594 603 612 621 630 — .— - - - - - ____ - - _ A.GT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC ctc AAT GGG ACC gtg Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Vai 639 64Θ 657 675 684 - - - —.— - — _ _ CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC TGC CAT GCA GGT TTC His Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin Asn Thr Vai Cys Thr Cys His A3 a Gly Phe 693 702 711 720 729 738 - _____ _____ - — — — - -- — ___ TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC TGT AAG AAA AGC CTG GAG Phe Leu Arg Glu Asn Glu cys Vai Ser Cys Ser Asn Cys Ly» Lys Ser Leu Glu 747 756 765 — — - - - - — ____ TGC ACG AAG TTG TGC CTA CCC CAG ATT GAG AAT Cys Thr Cys Leu Cys Leu Pro Gin Ile Glu Asn

   71 271

   Re f: SYNO 2/PORTUGAL

   -77(iii) na sequência de ADN seguinte, ou uma sua porção de codificação:

   iQ 20 30 50 50 60 70 '

   84T CflCTCGG AÍXACGCCCT «atctctaTG OX.6AGTctc AACCíLTCaac ^GGCAcTTtfG

   SO 90 100 110 120 130 140

   GACSTCCTGG ACAGACCGAG TCCCGGGAAG CCCCAGCACT GCCGCTGCCA CACTGCCCTG AGCCCAAATQ

   150 160 171 1B0 lB9 190 >_ _ ______ _ _

   GGGGAGTGAG AGGCCATAGC T6TCTGGC ATG GGC CTC TCC ACC GTG CCT GAC CTG CTG

   MET Gly Leu Ser Thr Vai Pro Asp Leu Leu

   207 216 22 S CTG CCG CTG GTG CTC CTG GAG CTG TTG Leu Pro Leu Vel Lau Leu Glu Leu Leu 261 270 279 GGA CTG GTC CCT CÃC CTÃ GGG GAC ÃGG Gly LSu Vai Pro HÃS Leu Gly Asp Arq 315 324 333 GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT Gly Ly» Tyr 1 le Mi* Pro Gin Asn Asn

   234 243 252 GTG GGA ATA TAC ccc TCA GGG GTT ATT Vel Gly lie Tyr Pro Ser Gly vel Ile 208 297 306 GÃG ÃÃG AGA GAT ÃGT GTG TGT CCC CAA Glu Ly» Arq Asp Ser Vel Cys Pro Gin 342 351 360 TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC CÃC AAA Ser Ile Cys Cys Tnr Lys Cys His Lys

   369 378 307 396 405 414 GGA ACC TÃC TTG TAC AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG Gly Tnr Tyr Llu Tyr Asn Aep Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arq 423 432 441 430 459 460 GÃG TGT GÃG ÃGC GGC TCC TTC ACC GCT TCÃ GÃÃ AAC CÃC CTC AGA CÃC TGC CTC Glu Cys Glu Ser Gly 5ar Phe Thr Ale Ser Glu Asn His Leu Arg Hi· Cys L0u 477 486 495 504 513 522 AGC TGC TCC AAA TGC cgã AAG GAA ATG GCT CÃG GTG GAG ÃTC TCT TCT TGC ACA Ser Cys Ser Lyfc Cys Arq Lys Glu ηετ Gly Gin vel Glu 1 le Ser Ser Cys Thr 531 340 549 55Θ 567 576 GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TÃC CGG CAT TAT TGG Và 1 ASp Arq Asp Tnr vel Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg Hi· Tyr Trp 303 594 603 612 621 630 AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT GGG ACC GTG Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Lau Cys Leu Asn Gly Thr Vel 639 640 637 666 675 684 CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC TGC CAT GCA GGT TTC His L0u Ser Cy« G 1 n Glu Lys Gin Asn Thr Vel Cys Thr Cys His Aie Gly Phé

   71 271

   Ref: SYNO2/PORTUGAL

   693 702 711 720 729 ?3β ___ - - . TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC TGT AAG AAA AGC CTG GÃG pns Leu Arq Glu Asn Glu Cys Vai Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu 747 75o 765 774 7B3 792 TGC ACG AAG TTG TGC CTA CCC CAG ATT GAG AAT GTT ÃÃG GGC ACT GAG* GÃc TCA Cys Tnr Lys Leu Cys Leu Pro Gin 1 le G lu Asn Va 1 Lys Gly Thr Glu Asp Ser BOI 810 Bl9 626 637 646 GGC ACC ACA GTG CTG TTG CCC CTG GTC ATT ttc TTT GGT CTT TGC CTT TTÃ TCC Gly T nr Trif Vai Leu Leu Pro Leu Vai Ile Phe Phe G 1 y Leu Cys Leu Leu Ser 653 864 B73 662 691 900 CTC CTC TTC ATT GGT TTA ATG TAT CGC TÃC CAA CGG TGG AAG TCC AAG CTC TAC Leu Lsu Phe 1 1· Gly Leu n£T Tyr Arg Tyr Gin Arg Trp Lys Ser Lys Leu Tyr 909 916 927 93b 943 934 TCG ATT GTT TGT GGG AAA TCG ACA CCT GAA AAA GAG GGG GÃG CTT GAA GGA ACT Ser I 1» Vil Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu Gly Glu Leu Glu Gly Tnr 9ô3 972 961 990 999 1006 ACT ACT AAG CCC CTG GCC CCA AAC CCA AGC TTC AGT CCC ACT CCA GGC TTC ACC Thr Thr Ly* Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser Phe Ser Pro Thr Pro Gly Prt· Thr

   1017 1026 1033 1044 1053 1062 CCC ACC CTG GGC TTC AGT CCC GTG CCC AGT TCC ACC TTC ÃCC TCC AGC TCC ACC Pro Th#* Lau Gly Phe Ser Pro Vai pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr 1071 íoao 1069 1096 1107 1116 TAT ACC CCC GGT GAC TGT CCC AAC TTT GCG GCT CCC CGC AGA GAG GTG GCA CCA Tyr Thr Pro Gly Asp Cys Pro Aan Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Vai Ala Pro 1123 1134 1143 1132 1161 1170 CCC TAT cãg 6GG GCT GAC CCC ÃTC CTT GCG ÃCÃ GCC CTC GCC TCC GÃC CCC ÃTC Pro Tyr Gin Gly Ala Asp Pro lie Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro lie 1179 1186 1197 1206 1213 1224 CCC AAC CCC CTT CAG AAG TGG GAQ GAC AGC GCC CAC AAG CCA CAG ÃGC CTA GAC Pro Aen Pro Leu Gin Lys Trp Glu Asp 5er Ali His Lys Pro Gin Ser Leu Aep 1233 1242 1231 1260 1269 1276 ACT GAT GAC CCC GCG ACG CTG TAC GCC GTG GTG GAG AAC GTG CCC CCG TTG CGC Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Vai V* 1 Glu Asn Vai Pro Pro Leu Arg 1267 1296 1305 1314 1323 1332 TGG AAG GAA TTC GTG CGG CGC CTA GGG CTG ÃGC GAC CÃC GÃG ÃTC GÃT CGG CTG Trp Ly % Glu Phe Vai Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu lie Asp Arg Leu

   71 271

   Ref: SYNO2/PORTUGAL

   1341 1330 1339 1368 1377 13B6 GAG CTG CAS AAC GGG CGC TGC CTG CGC GAG GCG CÃÃ TAC AGC ATG CTC GCG ÃCC Glu Leu Gin Aan Gly Arg Cys Leu Arg Glu Al* Gin Tyr Ser Γ1ΕΤ uew Al* Thr 1395 1404 1413 1422 1431 1440 TGG AGG CGG CGC ÃCG CCG CGG CGC GAG GCC ACG CTG GÃG CTG CTG GGÃ CGC GTG Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Al* Tnr Leu Glu Leu Leu Gly Arg V*l 1449 143S 1467 1476 1483 1494 CTC CGC GAC ATG GAC CTG CTG GGC TGC CTS GAG GAC ATC GÃG GÃG GCG CTT TGC Lsu Arg Asp ηετ Asp L»u Lsu Gly Cys Leu Glu Asp 11. Glu Glu Al* Lsu Cys 1303 1312 1321 1330 1346 1336 6GC Gly CCC GCC Pre Al. GCC Al* CTC CCG Leu Pro CCC Pro GCG CCC Al* Pro AGT Ser CTT CTC Lsu Lsu AGA Arg _> TGA GGCTGCGCCC CTGCGGGCAG 1366 1376 1386 1396 1606 1616 1626

   CTCTAAGGAC C6TCCTGCGA GATC6CCTTC CAACCCCACT TTTTTCTGGA AAGGaGGGGT CCTGCAGGGG

   1^36 1646- 1636 1666 1676 1686 1696

   CAAGCAGGAG CTAGCAGCCG CCTACTTGGT GCTAACCCCT CGATGTACAT AGCTTTTCTC AGCTGCCTGC

   1706 1716 1726 1736 1746 1736 1766 GCGCCGCCGA CAGTCAGCGC TGTGCGCGCG GAGAGAGGTG CGCCGTGGGC TCAAGAGCCT GAGT6GSTGG 1776 1786 1796 1806 1816 1826 1836 TTTGCGAGGA TGAGGGACSC TATGCCTCAT GCCCGTTTTG GGTGTCCTCA CCAGCAAGGC TGCTCGGGGG 1846 1856 1866 10>6 1886 1896 1906 CCCCTGGTTC GTCCCTGAGC CTTTTTCACA GTGCATAAGC AGTTTTTTTT GTTTTTGTTT TGTTTTGTTT 1916 1926 1936 1946 1936 1966 1976 TGTTTTTAAA TCAATCATGT TACACTAATA GAAACTTGGC ACTCCTGTCC CCTCTGCCTG GACAAGCACA 1986 1996 2006 2016 2026 2036 2046 TAGCAAGCTG AACTGTCCTA AGGCAGGGGC GAGCACGGAA CAATGGGGCC TTCAGCTGGA GCTGTGGACT 2036 2066 2076 2086 TTTGTACATA CACTAAAATT CTGAAGTTAA AGCTCAAAAA AA

   71 271

   Ref: SYNO2/PORTUGAL (iv) na sequência de ADN seguinte, ou uma sua porção de codificação:

   236 CCG Pro 243 200 209 218 227 GAG CCC Glu Pro 254 TGC TGC _ - . ACA Thr 263 TGC Cys 317 TGC Cys TCG Ser CGG CTC AGA GAA Glu CAT His __ - GAC Asp GTC val GGG Gly AGC Ser AGC Ser AAG Lys TAC Tyr 281 GCA Ala 335 TAT Tyr AAA Lys ArgLeu 272 Arg CAA Gin ___ GCT Ala CCG Pro GGC Gly 326 CAG Gin 290 ACA Thr CAG Gin 299 ATG MET Cy. Cys 308 TTC TGT ACC AAG ACC TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACA TAC Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr 344 333 362 371 380 389 ACC CAG CTC TGG AAC TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC Thr Gin Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser 39Θ 407 416 425 434 443 - _L - ___ - - — ·_ — — TCT GAC CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CSC ATC TGC ACC Ser Asp Gin val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Asn Arg Ile Cys Thr 452 461 470 — - - _ _ TGC AGG CCC GSC TGG TAC TGC Cys Arg Pro Gly Trp Tyr cys 1

   (v) na sequência de ADN seguinte, ou uma sua porção de codificação:

   10 20 30 40 50 60 70

   GAATTCGGCG CAGCSGAGCC TGGAGAGAAG GCGCTGG8CT GCGAGGGCGC GAGGGCGCGA 6GGCAGGGGG eo 90 ιοί no íi» >_______;_ _ J___

   CAACCGGACC CCGCCCGCAC CC ATG GC9 CCC GTC GCC GTC TGG.GCC GCG CTG GCC

   MET Ala Pro Vai Ala Vai Trp Ala Ala Leu Ala

   12Θ GTC Val GGA Gly 137 TGG Trp 146 GCT Ala GCG Ala 153 TTG Leu 164 173 TTT Phe CTG Leu GAG CTC GCG Ala CAC His GCC Ala CCC Pro GCC Ala CAG Gin GTG GCA Blu Leu Val Ala 182 191 200 209 21B 227 ACA CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC ACA TGC CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cy» Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Aap 236 245 254 263 272 291 CAG ACA GCT CAG ATO TGC TGC AGC AAG TGC TC3 CCG GGC CAA CÃT GCÃ AAA GTC Oln Thr Ala Gin MET Cy» Cy» Ser Ly» Cy» Ser Pro Gly Gin His Ata Ly» Val 290 299 308 317 326 333 TTC TGT ACC AAG ACC TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GÃG GÃC AGC ACA TAC Phe Cy» Thr Ly» Thr Ser Asp Thr Val Cy» Asp Ser Cy» Glu Aap Ser Thr Tyr

   71 271

   Ref: SYNO 2/PORTUGAL

   ΖΛΑ 333 362 371 380 389 ACC CAG CTC TGG AAC TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC Thr Gin Leu Trp A*n Trp Vai Pro Glu Cy» Leu S*c Cys Gly S«r Arg Cy» S»r 398 407 416 423 434 443 TCT GAC CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CSG GAA CAG AAC CGC ATC TGC ACC Ser A»P Gin Vai Glu Thr Gin Ala Cy» Thr Arg Glu Gin Asn Arg 11« Cy» Thr *32 461 470 479 488 497 TSC AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC CGG CTG TGC Cy» Arg Pro Gly Trp Tyr Cy» Ala Leu S«r Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys 306 313 324 333 342 331 GCG CCS CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC AGA CCA GGA ACT GAA Ala Pro Leu Arg Ly» Cy» Arg Pro Gly Ph· Gly Vai Ala Arg Pro Gly Thr Glu 360 369 37S 387 396 603 ACA TCA GAC STG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCS GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT Thr Ser A»p Vai Vai Cy» Lys Pro Cy» Ala Pro Gly Thr Ph· S.r Asn Thr Thr

   614 623 632 641 630 639 TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC CAQ ATC TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT Ser S«r Thr A»p 11· Cys Arg Pro Hi» Gin 11· Cy» A«n Vai Vai Ala I 1· Pro 668 677 686 693 704 713 __ __ -- —-_— - -- GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA GTC TGC ACG TCC AC3 TCC CCC ACC CGG AGT ATG Gly Aen Ala Ser Arg Aap Ala Vai Cy» Thr S«r Thr Ser Pro Thr Arg S*r πετ 722 731 740 749 230 767 GCC CCA GGG GCA GTA CAC TTA CCC CAG CCA GTG TCC ACA CGA TCC CAA CAC ACG Ala Pro Gly Ala Vai Hl» Leu Pro Gin Pro Vai S«r Thr Arg Ser Gin Hi» Thr 776 7Θ3 794 003 812 021 CAG CCA ACT CCA GAA CCC AGC ACT GCT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG Gin Pro Thr Pro Glu Pro S«r Thr Ala Pro S*r Thr S«r Phe Leu Leu Pro ηετ 830 Θ39 848 Θ37 866 Θ73 GGC CCC AGC CCC CCA GCT GAA GGG AGC act GGC GAC TTC GCT ctt CCA GTT GGA Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly S»r Thr Gly A»o Ph· Ala Leu Pro Vai Gly

   71 271

   Réf: SYNO2/PORTUGAL

   084 093 902 911 920 929 CTG ATT GTG OGT GTG ACA GCC TTG GGT CTA CTA ATA ATA GGA GTG GTG AAC TGT Leu Ile Vai Gly Vai Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile Gly Vai Vai Asn Cy» 930 947 936 963 974 903 GTC ATC ATG ACC CAG GTG AAA AAG AAG CCC TTG TGC CTG CAG AGA GAA GCC AAG Vai 11· ηετ Thr Gin Vai Lys Lys Ly» Pro Leu Cy» Leu Gin Arg Glu Ala Ly» 992 1OO1 1O1O 1019 1020 1037 GTG CCT CAC TTG CCT GCC GAT AAG GCC CGG GGT ACA CAG GGC CCC GAG CAG CAG Vai Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin 1046 1033 1064 1073 1002 1091 CAC CTG CTG ATC ACA GCG CCG AGC TCC AGC AGC AGC TCC CTG GAG AGC TCG GCC Hia Leu Leu I le Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala 1100 1109 1118 1127 1136 1145 AGT GCG TTG GAC AGA AGG GCG CCC ACT CGG AAC CAG CCA CAG GCA CCA GGC GTG Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly Vai 1154 1163 1172 1101 1190 1199 GAG GCC AGT GGG GCC GGG GAG GCC CGG GCC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser

   1217 1226 1233 1244 1233

   GGT Gly GGC Gly CAT Hi» 1271 GGG Gly ACC Thr CAG Gin 12Θ0 6TC Vai AAT Asn GTC Vai 1289 ACC Thr TGC Cy» ATC Ile 1298 GTG Vai AAC GTC Asn Vai 1307 TGT Cy» AGC Ser TCT GAC CAC AGC TCA CAG TGC TCC TCC CAA GCC AGC TCC ACA ATG GGA GAC Ser Asp Hi» Ser Ser Gin Cy» Ser Ser Gin Ala Ser Ser Thr MET Gly Asp 1323 1334 1343 1332 1361 GAT TCC AGC CCC TCG GAG TCC CCG AAG GAC GAG CAG GTC CCC TTC TCC AAG Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Ly» A»p Glu Gin Vai Pro Phe Ser Ly» 1379 138Θ 1397 1406 1413 - - - - — — GAA TGT GCC TTT CGG TCA CAG CTG GAG ACG CCA 6AG ACC CTG CTG GGG AGC Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser 1433 1442 1431 1460 1469 GAA GAG ΑΑβ CCC CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GCT GGG ATG AAG CCC AGT Glu G 1 u Ly» Pro Leu Pro Leu Gly Vai Pro Asp Ala Gly MET Ly» Pro Ser

   71 271

   Réf: SYN02/PORTUGAL

   1479 1498 1499 1909 1919 1929 1939 _>

   TAA CCAGGCCS6T GTGGGCTQTO TCQTAGCCAA 6GTGGGCT6A 9CCCTGGCAG GATGACCCTG

   1949 1999 1969 1978 1989 1998 1609 CGAAGGGGCC CT96TCCTTC CAGGCCCCCA CCACTA6GAC TCTGAGGCTC YTTCTGGGCC AAGTTCCTCT 1619 1629 1639 1649 1698 1669 1679 AGTGCCCTCC ACAGCCQCA6 CCTCCCTCTO ACCTGCAGGC GGCAGCGGGT tgtggaaagc 1688 1699 1708 1719 1728 1738 1748 CTCTGCTGCC ATSGTGTGTC CCTCTCGGAA GGCTGGCTGG GCATGGACGT TCGGGGCATQ CT66GGCAAG 1799 1768 1778 1799 1799 1808 1918 TCCCTGACTC TCTGTGACCT GCCCCGCCCA GCTGCACCTG CCAGCCTGGC TTCTGGAGCC CTTGGGTTTT 1929 1938 1948 1899 1969 1878 1988 TTGTTTGTTT GTTTGTTTGT TTGTTTGTTT CTCCCCCTGG GCTCTGCCCC AGCTCTGGCT TCCAGAAAAC 1999 1908 1918 1929 1938 1949 1998 CCCAGCATCC TTTTCTGCAG AGGGGCTTTC TGGAGAGGAG GGATGCTGCC TGAGTCACCC ATGAAGACAG

   1968 1979 1988 1998 2008 2018 2029 GACAGTGCTT CA6CCTGAG6 CTGAGACTSC GGGATGGTCC TGGGGCTCTG tgcagggagg AGGTGGCAGC 2038 2048 2098 2069 2078 2086 2099 CCTGTAGGGA ACGGGGTCCT TCAAGTTAGC TCAGGAGGCT TGGAAAGCAT CACCTCAGGC CAGGTGCAGT 2108 2118 2129 2138 2148 2198 2168 CCCTCACGCC TATGATCCCA GCACTTTGGG AGGCTGAGGC GGGTGGATCA CCTGAGGTTA GGAGTTCGAG 2178 2198 2198 2209 2218 2229 2238 ACCAGCCTGG CCAACATGOT AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAGAAA TTAQCCGGGC STGGTGGCGG 2249 2298 2268 2278 2298 2299 2308 gcacctatag TCCCAGCTAC TCAGAAGCCT gaggctggga AATCGTTTGA ACCCGGGAAG CGGAGGTTGC 2318 2329 2338 2348 2398 2368 2379 AGGGAGCCGA SATCACGCCA CTGCACTCCA GCCTGGGCGA CAGAGCGAGA 8TCTGTCTCA AAAGAAAAAA

   2399

   AAAAAAAACC GAATTC

   71 231

   Ref: SYNO2/PORTUGAL

   -84sequência que é degenerada nas regiões de suas porções, de (i), (ii), (iii), (iv), e (v);

   (vi) numa codificação, ou (iv) (vii) (v) , numa sequência que hibridiza para ou (vi); e (ii), (iii), (viii) numa sequência que é complementar a (i) , (ii) , (iii), (iv), (ν), (vi), ou (vii);

   (b) cultivar o referido inibidor.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda, antes do passo (a), os passos de:

   I) preparar um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico possuindo uma sequência seleccionada de entre o grupo consistindo numa das sequências (i), (ii), (iii), (iv), (ν), (vi), OU (vii);

   II) clonar a sequência de ADN para um vector capaz de ser transferido para, e replicado numa célula completa, contendo esse vector elementos operacionais necessários para expressar a sequência de ADN; e

   III) transferir o vector contendo a sequência de ADN sintético e elementos operacionais para um hospedeiro capaz de expressar o ADN que codifica o inibidor de TNF;
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda o passo de, (c) permitir que o inibidor assuma uma estrutura de actividade terciária por meio da qual possuí actividade inibidora de TNF.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido inibidor de TNF ser não glicosilado e possuir um peso molecular de cerca de 18kDa.

   71 271

   Ref: SYNO2/PORTUGAL

   -855 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido inibidor de TNF possuir a seguinte sequência de aminoácidos:

   Asp Ser Vai Cys Pro Gin Gly Lys Tyr Ile His Pro Gin Asn Asn Ser Ile Cys Cys 20 Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr 40 Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys 60 Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Vai Glu Ile Ser Ser Cys Thr Vai 80 Asp Arg Asp Thr Vai Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn 100 Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Vai His Leu Ser cys Gin 120 Glu Lys Cln Asn Thr Vai cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys 140 Vai Scr Cys Scr Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gin Ile 160 Glu Asn
5. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido inibidor de TNF possuir a seguinte sequência de aminoácidos : Lau ^pro Al* Gin Vai Ala Ph· Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Sar

   Thr cya Arg Lau Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys Cys

   Sar Lys Cys Sar Pro Gly Gin His Ala Lys Vai Phe Cys Thr Lys Thr

   Sar Asp Thr Vai Cys Asp Sar Cya Glu Asp Sar Thr Tyr Thr Gin Lau

   Trp Asn Trp Vai Pro Glu Cys Lau Sar Cya Gly Sar Arg Cys Sar Sar

   Asp Gin Vai Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Cln Asn Arg Ile Cys

   Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Lau Sar Lys Gin Glu Gly Cys

   Arg Lau cys Ala Pro Lau Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Vai Ala

   Arg Pro Gly Thr Glu Thr Sar Aap Vai Vai cys Lys Pro cys Ala Pro

   Gly Thr Pha sâr Asn Thr Thr Sar Sar Thr Asp Ile Cys Arg Pro His

   Cln.Ile Cys Asn Vai Vai Ala Ile Pro Gly Asn Ala Sar Arg Asp Ala

   vai Cya Thr Sar Thr Sar Pro Thr Arg Sar Mat Ala Pro Cly Ala Vai His Lau Pro Gin Pro Vai Sar Thr Arg Sar Cln His Thr Cln Pro Thr Pro Clu Pro Sar Thr Ala Pro Sar Thr Sar Pha Lau Lau Pro Mat Cly

   Pro Sar Pro Pro Ala Glu Gly Sar Thr Gly Asp

   -8671 271

   Réf: SYNΟ2/PORTUGAL como mostrada pelos resíduos 1 a 235 (inibidor de 40kDa), ou pelos resíduos 1 a 182 (inibidor de 40kDa, 53), ou pelos resíduos 1 a 184 (inibidor de 40kDa, 51).
6. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido inibidor de TNF não ser glicosilado ou ser produzido num hospedeiro que não é uma célula humana capaz de glicosilação.
7. 8 - Processo de acordo com as reivindicações 5 ou 6, para a produção de um inibidor de TNF possuindo um resíduo cisteína de ocorrência não natural, caracterizado por a referida cisteína de ocorrência não natural se encontrar no terminal C, no terminal N ou num local de glicosilação do
8. 9 - Processo de acordo com por o referido inibidor de TNF aminoácidos referido inibidor.

   a reivindicação 8, caracterizado possuir a seguinte sequência de

   Asp Ser Vai Cys Pro Gin Gly tys Tyr Lys Cys Ilis Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Arg Asp Thr Vai Cys Gly Cys Arg Lys Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Lys Gin Asn Thr Vai Cys Thr Cys His Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu

   Asn

   Ile His Pro Gin Asn Asn Ser Ile Cys Cys 20 Thr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr 40 Asp Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys 60 Leu Gly Gin Vai Glu Ile Ser Ser Cys Thr Vai - 80 Asp Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn 100 Leu Leu Asn Gly Thr Vai His Leu Ser Cys Gin 120 Glu Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys 140 Vai Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gin Ile 160 Glu

   e por a referida cisteína de ocorrência não natural se encontrar no resíduo número 14, 105 ou 111.

   71 271

   Ref: SYNO 2/PORTUGAL

   -8710 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido inibidor de TNF ser ligado a um material polimérico de elevado peso molecular.
9. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido material polimérico de elevado peso molecular ser polietilenoglicol.
10. 12 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por compreender o inibidor de TNF de acordo com a reivindicação 11 num transportador farmaceuticamente aceitável.