JPH03172183A - 脳因子発現系 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである.細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び/又は破壊は増殖に関連した疾
!!A(腫瘍形成を含む)の基本的原因であると思われ
る.増殖調節因子(刺激剤及び阻害剤)は種々の疾患(
例えば、癌)の診断、予後及び治療に潜在的用途がある
のでそれらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興
味が持たれており、更にまた特に有糸***が癌に影響を
及ぼすかもしれない場合のその有糸***の基本的機構を
理解することにかなりの興味が持たれている。
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである.細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び/又は破壊は増殖に関連した疾
!!A(腫瘍形成を含む)の基本的原因であると思われ
る.増殖調節因子(刺激剤及び阻害剤)は種々の疾患(
例えば、癌)の診断、予後及び治療に潜在的用途がある
のでそれらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興
味が持たれており、更にまた特に有糸***が癌に影響を
及ぼすかもしれない場合のその有糸***の基本的機構を
理解することにかなりの興味が持たれている。
増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はリガンド又はレセブ
ターとして役立つことができる。
って調節され、その場合に蛋白質はリガンド又はレセブ
ターとして役立つことができる。
脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした.不安解消剤、M痩剤、筋弛緩剤及び
鎮静剤として普通に用いられているペンゾジアゼピン(
BZD)は、γ−アミノ##(GABA)で仲介された
抑制性神経伝達の増強作用に基づく薬理学的効果を発揮
すると考えられる, BZDによるGABA一作働性伝
達の調節における第一段階は中枢神経系中の特異的な高
い親和性を有しかつ飽和できる結合部位に対する結合で
あると思われ、この場合にその結合部位は“超分子複合
体”(supermolecular complex
)の成分であると考えられる.この系を理解すること、
及びその系を調節又は制御することができることの必要
性は、天然りガンド及びそれが機能する態様を知ること
に依存している。
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした.不安解消剤、M痩剤、筋弛緩剤及び
鎮静剤として普通に用いられているペンゾジアゼピン(
BZD)は、γ−アミノ##(GABA)で仲介された
抑制性神経伝達の増強作用に基づく薬理学的効果を発揮
すると考えられる, BZDによるGABA一作働性伝
達の調節における第一段階は中枢神経系中の特異的な高
い親和性を有しかつ飽和できる結合部位に対する結合で
あると思われ、この場合にその結合部位は“超分子複合
体”(supermolecular complex
)の成分であると考えられる.この系を理解すること、
及びその系を調節又は制御することができることの必要
性は、天然りガンド及びそれが機能する態様を知ること
に依存している。
これらの因子の検出、単離及び精製は、その混合物の複
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのバイオアフセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生成物の検出及び単離の助けとなって
いる. 〔従来の技術〕 BeaI等、 Cancer Biochem. B
io h s.(1979)3 :93 − 9
6は、増殖及びDNA合威を正常細胞中でよりも形質転
換細胞中で一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在す
ることを報告している。l−1o11ey等、Proc
. Nat1、^cad. Sci. (1980)7
7 : 5989−5992は、上皮細胞成長阻害物質
の精製を記載している。
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのバイオアフセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生成物の検出及び単離の助けとなって
いる. 〔従来の技術〕 BeaI等、 Cancer Biochem. B
io h s.(1979)3 :93 − 9
6は、増殖及びDNA合威を正常細胞中でよりも形質転
換細胞中で一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在す
ることを報告している。l−1o11ey等、Proc
. Nat1、^cad. Sci. (1980)7
7 : 5989−5992は、上皮細胞成長阻害物質
の精製を記載している。
Letansky, Biosci. Re .(19
82) 2 : 39−45は、ウシの胎盤から精製さ
れたべブチドが腫瘍の増殖及びDNA中へのチミジンの
取り込みを正常細胞中でよりも新住物中で一層強く抑制
することを報告している。Chen, Trends
Biochem. Sci.(19B2) 7 :36
4 − 365は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水
流体から単鰭することを報告している, Reddin
g及びSchally ..Proc. Nat1、
Acad. Sci.(1982)79:7014−7
018は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗
一***促進活性を示す精製されたべブチドをブタの視床
下部から単離することを報告している。これらの殆どの
因子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基
本的構造は知られていない. ジアゼパム結合性阻害剤は、Guidotti等、Pr
oc. Nat1、 八cad. Sci,
USA(1983)60 : 383 38
5、Cos ta等、Neuro harmaco1、
(1984)23 : 989−99LFerrer
o等、Neuropharmaco1、 (1984)
23 : 1359 一l362、及びAlha等、S
cience (1985) 229 : 179 −
182によって報告されそして説明されている.〔発明
の概要〕 新規な方法及び組成物が提供され、これらの組威物は、
ゲル浸透力ラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相HPLCで直線グラジェントの酸性(0.1%トリ
フルオロ酢酸)水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の成分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組成物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペブチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする.主題のポリペブチドに特異的に結合
する抗体が提供される.〔具体的な説明〕 天然の生理学的に活性なポリベプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリベプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規な&fl戒物、及び種々
のポリペブチドをコードしている核酸配列が提供される
.そのポリペプチドは脊椎動物、特に呻乳動物の脳細胞
中に天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又
は実質的に相同である(少なくとも60%相当)配列を
もつ.その諸組成物は種々の生理学的活性をもち、そし
て脳細胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範
囲の種々の組織中に一般的に見いだされる.このポリベ
プチドは、ホモジナイズされた脳組織又はその精製され
た画分を用いてクロマトグラフィー力ラムから酸性水性
アセトニトリル溶離剤で溶出することによって単翻可能
であることを特徴とする.一つの因子は逆相Hf’LC
及びゆるやかな直線グラジエントの酸性水性アセトニト
リルを用いてクロマトグラフィーによって実質的に純粋
に単離することができる。その他の成分については所望
の活性は水性酸性n−プロバノールを直線グラジエント
として用いて更に精製することができる.そのクロマト
ダラムは、約0. 1〜0.5ad!/分の流速で合理
的な分離を得るために4時間以上の時間にわたって展開
することができる.逆相HPLCを用いての分離では脳
組織からの部分的に精製されたサンプルをもたらすのが
普通である.部分的な精製は、ゲル浸透クロマトグラフ
ィーを用い溶財剤として酸性水性アセトニトリルを用い
、特に均一に溶出することによって好都合に達成するこ
とができる。好都合には、媒体は0.1%トリフルオロ
酢酸水溶液中の40%アセトニトリルであることができ
る. 二成分は実質的に異なった生理学的活性及び組成をもつ
。内因性ペンゾジアゼビンオイド又はエンドゼピン(E
BZD)と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム(νal
ius+)アゴニストとしてジアゼパムレセブターに結
合する活性を示し、そして細胞質蛋白質であることは明
らかである, EBZDは、低い投与量では、咄乳動物
に興奮及び増強された意識を弓き起こし、一方高い投与
量では、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体につい
ては、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高い
投与量では心臓拍動度数は増大する.それらの化合物は
ジアゼパム結合性阻害剤について公表された(前記のG
uidotti等の文献)配列との幾らかの相同性を示
す. このペブチドは、脳シナブトソームへのペンゾジアゼビ
ンの結合を抑制することにおいて、約1〜10−、普通
には3〜6−のKiをもつことを更に特徴とする(後記
の実験の項を参照のこと).天然のポリペブチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約7 〜15
kDal, 9通には8〜12kDa+,又はSOS−
PAGEで6〜10kDalの範囲の分子量をもつ(後
記の実験の項を参照のこと).このペプチドは親水性で
ある, 1000ユニット/■を越える比活性を得るこ
とができる(後記の実験の項を参照のこと)。
82) 2 : 39−45は、ウシの胎盤から精製さ
れたべブチドが腫瘍の増殖及びDNA中へのチミジンの
取り込みを正常細胞中でよりも新住物中で一層強く抑制
することを報告している。Chen, Trends
Biochem. Sci.(19B2) 7 :36
4 − 365は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水
流体から単鰭することを報告している, Reddin
g及びSchally ..Proc. Nat1、
Acad. Sci.(1982)79:7014−7
018は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗
一***促進活性を示す精製されたべブチドをブタの視床
下部から単離することを報告している。これらの殆どの
因子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基
本的構造は知られていない. ジアゼパム結合性阻害剤は、Guidotti等、Pr
oc. Nat1、 八cad. Sci,
USA(1983)60 : 383 38
5、Cos ta等、Neuro harmaco1、
(1984)23 : 989−99LFerrer
o等、Neuropharmaco1、 (1984)
23 : 1359 一l362、及びAlha等、S
cience (1985) 229 : 179 −
182によって報告されそして説明されている.〔発明
の概要〕 新規な方法及び組成物が提供され、これらの組威物は、
ゲル浸透力ラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相HPLCで直線グラジェントの酸性(0.1%トリ
フルオロ酢酸)水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の成分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組成物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペブチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする.主題のポリペブチドに特異的に結合
する抗体が提供される.〔具体的な説明〕 天然の生理学的に活性なポリベプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリベプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規な&fl戒物、及び種々
のポリペブチドをコードしている核酸配列が提供される
.そのポリペプチドは脊椎動物、特に呻乳動物の脳細胞
中に天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又
は実質的に相同である(少なくとも60%相当)配列を
もつ.その諸組成物は種々の生理学的活性をもち、そし
て脳細胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範
囲の種々の組織中に一般的に見いだされる.このポリベ
プチドは、ホモジナイズされた脳組織又はその精製され
た画分を用いてクロマトグラフィー力ラムから酸性水性
アセトニトリル溶離剤で溶出することによって単翻可能
であることを特徴とする.一つの因子は逆相Hf’LC
及びゆるやかな直線グラジエントの酸性水性アセトニト
リルを用いてクロマトグラフィーによって実質的に純粋
に単離することができる。その他の成分については所望
の活性は水性酸性n−プロバノールを直線グラジエント
として用いて更に精製することができる.そのクロマト
ダラムは、約0. 1〜0.5ad!/分の流速で合理
的な分離を得るために4時間以上の時間にわたって展開
することができる.逆相HPLCを用いての分離では脳
組織からの部分的に精製されたサンプルをもたらすのが
普通である.部分的な精製は、ゲル浸透クロマトグラフ
ィーを用い溶財剤として酸性水性アセトニトリルを用い
、特に均一に溶出することによって好都合に達成するこ
とができる。好都合には、媒体は0.1%トリフルオロ
酢酸水溶液中の40%アセトニトリルであることができ
る. 二成分は実質的に異なった生理学的活性及び組成をもつ
。内因性ペンゾジアゼビンオイド又はエンドゼピン(E
BZD)と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム(νal
ius+)アゴニストとしてジアゼパムレセブターに結
合する活性を示し、そして細胞質蛋白質であることは明
らかである, EBZDは、低い投与量では、咄乳動物
に興奮及び増強された意識を弓き起こし、一方高い投与
量では、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体につい
ては、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高い
投与量では心臓拍動度数は増大する.それらの化合物は
ジアゼパム結合性阻害剤について公表された(前記のG
uidotti等の文献)配列との幾らかの相同性を示
す. このペブチドは、脳シナブトソームへのペンゾジアゼビ
ンの結合を抑制することにおいて、約1〜10−、普通
には3〜6−のKiをもつことを更に特徴とする(後記
の実験の項を参照のこと).天然のポリペブチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約7 〜15
kDal, 9通には8〜12kDa+,又はSOS−
PAGEで6〜10kDalの範囲の分子量をもつ(後
記の実験の項を参照のこと).このペプチドは親水性で
ある, 1000ユニット/■を越える比活性を得るこ
とができる(後記の実験の項を参照のこと)。
EBZロのフラグメントも生物活性である;特に、EB
ZDのアミノ酸33〜52を含むフラグメント(異なっ
た種にわたる共通配列)はジアゼバム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ. 第二の成分は脳因子(BF)と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はEBZDよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてEBZDよりも遅い.その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の戒長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形成
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
ZDのアミノ酸33〜52を含むフラグメント(異なっ
た種にわたる共通配列)はジアゼバム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ. 第二の成分は脳因子(BF)と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はEBZDよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてEBZDよりも遅い.その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の戒長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形成
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
BFは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約5〜20kDa1%普通には約8〜18kDalの
分子量をもつ.この蛋白質は逆相11PLC及び直線グ
ラジエントのO.l%TF^水性n−プロパノールを用
い、約20〜26%n−プロパノールで溶出して精製す
ることができる.その精製された蛋白質は少なくとも約
15 X 10’ユニット/nの比活性をもつことがで
きる(後記の実験の項を参照のこと)。
て約5〜20kDa1%普通には約8〜18kDalの
分子量をもつ.この蛋白質は逆相11PLC及び直線グ
ラジエントのO.l%TF^水性n−プロパノールを用
い、約20〜26%n−プロパノールで溶出して精製す
ることができる.その精製された蛋白質は少なくとも約
15 X 10’ユニット/nの比活性をもつことがで
きる(後記の実験の項を参照のこと)。
第三成分は、アミノ酸配列KWDAWN (hEBZD
のアミノ酸54〜59)をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるプローブを用いて得ることができる。
のアミノ酸54〜59)をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるプローブを用いて得ることができる。
その蛋白質はEBZDよりも実質的に大きく、リーダー
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペブチドの主要部分は細胞の外にある.この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している. これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特に脊椎
動物、一層特定的には補乳動物(ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズξ、霊長類(特にヒト)、等を含む)から得るこ
とができる.それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコシル化を欠
失させ、末端アシル化(特にアセチル化又はホルミル化
)を欠失させ、レセブター(例えば、抗体)への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のべブチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
プテンに共有結合さセ、又は1個以上の、普通には数で
約10%以下の、一層普通には数で約5%以下の、挿入
、欠失、トランジション又はトランスバージョンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペブチドの主要部分は細胞の外にある.この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している. これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特に脊椎
動物、一層特定的には補乳動物(ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズξ、霊長類(特にヒト)、等を含む)から得るこ
とができる.それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコシル化を欠
失させ、末端アシル化(特にアセチル化又はホルミル化
)を欠失させ、レセブター(例えば、抗体)への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のべブチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
プテンに共有結合さセ、又は1個以上の、普通には数で
約10%以下の、一層普通には数で約5%以下の、挿入
、欠失、トランジション又はトランスバージョンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
各々のポリベプチドを更に詳細に考慮する。
EBZDボリペプチド
EBZDボリベブチドは約20キロドルトン(kcal
)未満、普通には約15kDal未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約1 kDal,一層
普通には少なくとも約2kDalである。
)未満、普通には約15kDal未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約1 kDal,一層
普通には少なくとも約2kDalである。
そのポリペブチド組戒物は、逆相HPLCで周囲条件f
でO. 1%水性トリフルオロ酢酸中のO〜60%アセ
トニトリルの直線グラジエントを用いて、28〜50%
アセトニトリル、特に29〜40%アセトニトリル、一
層特定的には約29〜36%アセトニトリル、一層特異
的には30〜34%アセトニトリルの範囲内でμ−ボン
ダパック(Bondapak) Cpsカラムから溶
出することを更に特徴とする。
でO. 1%水性トリフルオロ酢酸中のO〜60%アセ
トニトリルの直線グラジエントを用いて、28〜50%
アセトニトリル、特に29〜40%アセトニトリル、一
層特定的には約29〜36%アセトニトリル、一層特異
的には30〜34%アセトニトリルの範囲内でμ−ボン
ダパック(Bondapak) Cpsカラムから溶
出することを更に特徴とする。
ポリペブチドは少なくとも約15個のアミノ酸、一層普
通には少なくとも約20個のアξノ酸、そして約125
個よりも少ないアミノ酸、普通には約100個よりも少
ないアミノ酸をもつ.天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにPAGE又はゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて約7〜l5kDa +の範囲内の分子量を
もつ。
通には少なくとも約20個のアξノ酸、そして約125
個よりも少ないアミノ酸、普通には約100個よりも少
ないアミノ酸をもつ.天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにPAGE又はゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて約7〜l5kDa +の範囲内の分子量を
もつ。
ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも
1つ、好ましくは下記のアごノ酸配列の少なくとも2つ
、一層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも3つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は3個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
1つ、好ましくは下記のアごノ酸配列の少なくとも2つ
、一層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも3つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は3個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
a. Y aa” aa”^rκQ A T aa’b
. K W D A W c. A M aa’ A ’l (X)X V E
Ed. T K P aa’ aa’ E E M L
F I Y aa●HYKe.QATVGDINTE
RPGMLDf.QATVGDTNTERPGMLDF
TGKg.KGTS) E DA 上記の配列において、 aa”は芳香族アミノ酸、特にフエニルアラニン及びヒ
スチジンであり; aaゝはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約3〜5個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり; aacはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、一層特定
的には約5〜6個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり; aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約3〜4個
の炭素原子をもつものであり;aa’は脂肪族中性ア旦
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約2〜4個の炭素原子をもつもので
あり;aa’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性ア短ノ酸又はそのアミドで
あって且つ4〜5個の炭素原子をもつものであり; A『は芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にYを包含
し; aaqは脂肪族アミノ酸、特に4〜6個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に4〜5個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちN及びQ、好ましくはKであり; Xは1〜3個のアごノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、一層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり;そして XはO又はlである。
. K W D A W c. A M aa’ A ’l (X)X V E
Ed. T K P aa’ aa’ E E M L
F I Y aa●HYKe.QATVGDINTE
RPGMLDf.QATVGDTNTERPGMLDF
TGKg.KGTS) E DA 上記の配列において、 aa”は芳香族アミノ酸、特にフエニルアラニン及びヒ
スチジンであり; aaゝはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約3〜5個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり; aacはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、一層特定
的には約5〜6個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり; aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約3〜4個
の炭素原子をもつものであり;aa’は脂肪族中性ア旦
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約2〜4個の炭素原子をもつもので
あり;aa’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性ア短ノ酸又はそのアミドで
あって且つ4〜5個の炭素原子をもつものであり; A『は芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にYを包含
し; aaqは脂肪族アミノ酸、特に4〜6個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に4〜5個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちN及びQ、好ましくはKであり; Xは1〜3個のアごノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、一層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり;そして XはO又はlである。
主覇の発明の目的のため、種々のアξノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている: 脂肪族 中性 非極性 GAPVLI 極性 STCMNQ 酸性 DE 塩基性 KR 芳香族 FHYW 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも1個を含むポリペブチドは特に興味のあるも
のである; a, TKPaa’ OEEMLFIYaa’ HY
KQATaa’ Gb. K一ロAWaa’ aa
l′ Laa’ aa’ aa’ aa’
κEaa” AMaa’AV (X),lVEE
aa’ KKC. κQATνGDINTERPGML
DFT上記の配列において、 aa’ , aa” I aaQ、及びArは前記で定
義した通りであり; aa’は脂肪族アξノ酸であり、それは特に約4〜6個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、一層特定的には5〜6
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ; aa’は脂肪族中性アもノ酸、特に、約3〜5個の、−
71普通には3〜4個の炭素原子をもち且つ特にヒドロ
キシル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミ
ノ酸であり; aa’−は脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル
置換基及び約3〜5個の炭素原子をもつ中性又は酸性、
特に極性又は酸性アミノ酸であることができ; a1は脂肪族アミノ酸、特に、約2〜6個の炭素原子を
もつ中性又は塩基性アミノ酸、一層特定的には非極性中
性アミノ酸であり; aa’は中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約2〜5個の
、一層普通には2〜4個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり; aa”は脂肪族中性アミノ酸、特に、約3〜5個、一層
普通には4〜5個の炭素原子をもち、カルコゲン(酸素
又は硫黄)官能基、特にヒドロキシル基又はメチルヂオ
基をもつ極性アミノ酸であり;aa’ は脂肪族中性
アミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約3〜4個の炭
素原子をもつ極性アミノ酸であり; aa’″は4〜5個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり; aa″は約3〜6個の炭素原子、特に4〜6個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり; aa’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、3
〜6個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはA
であり; aa’は3〜4個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又
は極性アミノ酸であり、極性である特には、特にヒドロ
キシル基をもち、好ましくはAであり;X′はXと同じ
であり、普通にはl〜3個のアミノ酸であり、それは脂
肪族アミノ酸であり、それは一般的には4〜6個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にN−C方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド
、及び塩基性アミノ酸であり; Xは0又はlであり;そして aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約4〜
6個の、普通には5〜6個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている: 脂肪族 中性 非極性 GAPVLI 極性 STCMNQ 酸性 DE 塩基性 KR 芳香族 FHYW 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも1個を含むポリペブチドは特に興味のあるも
のである; a, TKPaa’ OEEMLFIYaa’ HY
KQATaa’ Gb. K一ロAWaa’ aa
l′ Laa’ aa’ aa’ aa’
κEaa” AMaa’AV (X),lVEE
aa’ KKC. κQATνGDINTERPGML
DFT上記の配列において、 aa’ , aa” I aaQ、及びArは前記で定
義した通りであり; aa’は脂肪族アξノ酸であり、それは特に約4〜6個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、一層特定的には5〜6
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ; aa’は脂肪族中性アもノ酸、特に、約3〜5個の、−
71普通には3〜4個の炭素原子をもち且つ特にヒドロ
キシル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミ
ノ酸であり; aa’−は脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル
置換基及び約3〜5個の炭素原子をもつ中性又は酸性、
特に極性又は酸性アミノ酸であることができ; a1は脂肪族アミノ酸、特に、約2〜6個の炭素原子を
もつ中性又は塩基性アミノ酸、一層特定的には非極性中
性アミノ酸であり; aa’は中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約2〜5個の
、一層普通には2〜4個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり; aa”は脂肪族中性アミノ酸、特に、約3〜5個、一層
普通には4〜5個の炭素原子をもち、カルコゲン(酸素
又は硫黄)官能基、特にヒドロキシル基又はメチルヂオ
基をもつ極性アミノ酸であり;aa’ は脂肪族中性
アミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約3〜4個の炭
素原子をもつ極性アミノ酸であり; aa’″は4〜5個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり; aa″は約3〜6個の炭素原子、特に4〜6個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり; aa’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、3
〜6個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはA
であり; aa’は3〜4個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又
は極性アミノ酸であり、極性である特には、特にヒドロ
キシル基をもち、好ましくはAであり;X′はXと同じ
であり、普通にはl〜3個のアミノ酸であり、それは脂
肪族アミノ酸であり、それは一般的には4〜6個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にN−C方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド
、及び塩基性アミノ酸であり; Xは0又はlであり;そして aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約4〜
6個の、普通には5〜6個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
Xの他に更に、本発明のポリベプチド群の種々のメンバ
ー間に共通構造を維持するために1〜3個、好ましくは
1〜2個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう.又、アミノ酸は天然L−アミノ酸であるが
、ある場合には、D−アξノ酸が使用されてもよい. 特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも10個、普通には少なくとも15
個、好ましくは少なくとも25個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の1つ含むフラ
グメントをもつ:ψ−Z’ −aa’−aa”−aa’
−aa’−aa’−aa’−aa’−aa”κ一aa”
−aa”−aa”−aa”−aa”−P−aa”−aa
”E−aa”−M−L−aa”−aa”−Y−aa!S
−aa”aa”−K−Q−A−T−aa’″−G−aa
”−aa”−aa”aa”−aa”−aa”−P−G−
aa42−aa”−D−aa”aa”−G−aa”−a
a”一κ一W−D−八一W−aa”aa”−L−aa”
−aa”−aa”−aa”一K一E−aa”A−M−a
a”−aa”−Y−(X)x −V−E−Ea a ?
3−κ〜K−aa”−aa”−aa”−aa”− Z
’上記の配列において、 ψはH原子又はアセチル基であり; zNは結合又は1〜lO個のアξノ酸、好ましくはl〜
9個のアミノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばE−A−^又はII−E−T−R等
もaa’に結合することができ、またこの場合に、2個
のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれか
のアミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同しライン上
のアミノ酸が一緒に採用され;a a 4 r a l
l ’は2〜6個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性
アミノ酸、特にグリシン、アラニン、ブロリン、パリン
、ロイシン及びイソロイシンであり; aa ・+ 1@13+ 79は脂
肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、この場合に特
にaa’・16・25・35・37・7コ・79がいず
れかのものであり、そして残りが好ましくは極性アごノ
酸、特にセリン、スレオニン、システイン、メチオニン
、アスパラギン及びグルタミンであり; a a l + b + ? 1?゜l?+ 3!+
34+ 31S6゜S9+ 64+ ?@は脂肪族中性
アミノ酸(極性及び非極性アミノ酸を包含する)又は脂
肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及びグルタミン
酸であり;特にa a 1?・コz・:l41 59・
78は中性アミノ酸である時に非極性であり、残りは中
性アミノ酸である時に極性であり、そしてまた,,l+
&・7・+7一雫・34・■・56・−4は好ましくは
酸性アξノ酸であり; aa2. +6+ +3−23+ !Sl!1!?14
tr 43+ 45+ 49+ ??は脂肪族中性アミ
ノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフエニルアラニン、ヒス
チジン、チロシン、及びトリブトファンであり、好まし
くは、aa”・IO+!&・2叩・4S・?1は好まし
くは芳香族アミノ酸であり、一方残りのアξノ酸は好ま
しくは脂肪族アミノ酸であり;aa’・9・1z・14
・3b・コ啼・4−・4●・■・h?・7aは脂肪族中
性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニンであ
り、この場合にaa’“SI+ hl+ 16は塩基性
以外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは塩基
性以外の時に好ましくは極性であり、但しaa46は極
性でも非極性でもよく、そしてaaff,l!・14・
:+90・Sl′・67・76 は好ましくは塩基性ア
ミノ酸であり;a a R tは塩基性又は芳香族、特
にフェニルアラニンであり; X及びXは前記で定義した通りであり、そしてがはOi
l , NHz 、又は1〜6個の、普通には1〜4個
のアミノ酸の、特に2〜6個の、普通には4〜6個のア
ミノ酸の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配
列M−P−M−Tの範囲内の配列である。
ー間に共通構造を維持するために1〜3個、好ましくは
1〜2個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう.又、アミノ酸は天然L−アミノ酸であるが
、ある場合には、D−アξノ酸が使用されてもよい. 特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも10個、普通には少なくとも15
個、好ましくは少なくとも25個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の1つ含むフラ
グメントをもつ:ψ−Z’ −aa’−aa”−aa’
−aa’−aa’−aa’−aa’−aa”κ一aa”
−aa”−aa”−aa”−aa”−P−aa”−aa
”E−aa”−M−L−aa”−aa”−Y−aa!S
−aa”aa”−K−Q−A−T−aa’″−G−aa
”−aa”−aa”aa”−aa”−aa”−P−G−
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−aa”−aa”−aa”一K一E−aa”A−M−a
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3−κ〜K−aa”−aa”−aa”−aa”− Z
’上記の配列において、 ψはH原子又はアセチル基であり; zNは結合又は1〜lO個のアξノ酸、好ましくはl〜
9個のアミノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばE−A−^又はII−E−T−R等
もaa’に結合することができ、またこの場合に、2個
のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれか
のアミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同しライン上
のアミノ酸が一緒に採用され;a a 4 r a l
l ’は2〜6個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性
アミノ酸、特にグリシン、アラニン、ブロリン、パリン
、ロイシン及びイソロイシンであり; aa ・+ 1@13+ 79は脂
肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、この場合に特
にaa’・16・25・35・37・7コ・79がいず
れかのものであり、そして残りが好ましくは極性アごノ
酸、特にセリン、スレオニン、システイン、メチオニン
、アスパラギン及びグルタミンであり; a a l + b + ? 1?゜l?+ 3!+
34+ 31S6゜S9+ 64+ ?@は脂肪族中性
アミノ酸(極性及び非極性アミノ酸を包含する)又は脂
肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及びグルタミン
酸であり;特にa a 1?・コz・:l41 59・
78は中性アミノ酸である時に非極性であり、残りは中
性アミノ酸である時に極性であり、そしてまた,,l+
&・7・+7一雫・34・■・56・−4は好ましくは
酸性アξノ酸であり; aa2. +6+ +3−23+ !Sl!1!?14
tr 43+ 45+ 49+ ??は脂肪族中性アミ
ノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフエニルアラニン、ヒス
チジン、チロシン、及びトリブトファンであり、好まし
くは、aa”・IO+!&・2叩・4S・?1は好まし
くは芳香族アミノ酸であり、一方残りのアξノ酸は好ま
しくは脂肪族アミノ酸であり;aa’・9・1z・14
・3b・コ啼・4−・4●・■・h?・7aは脂肪族中
性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニンであ
り、この場合にaa’“SI+ hl+ 16は塩基性
以外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは塩基
性以外の時に好ましくは極性であり、但しaa46は極
性でも非極性でもよく、そしてaaff,l!・14・
:+90・Sl′・67・76 は好ましくは塩基性ア
ミノ酸であり;a a R tは塩基性又は芳香族、特
にフェニルアラニンであり; X及びXは前記で定義した通りであり、そしてがはOi
l , NHz 、又は1〜6個の、普通には1〜4個
のアミノ酸の、特に2〜6個の、普通には4〜6個のア
ミノ酸の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配
列M−P−M−Tの範囲内の配列である。
1個以上の共通アξノ酸を変えることができ(普通には
3個以上の変更を伴わない)、そしてその共通配列での
ア短ノ酸の挿入又は欠失は、Xとして示した以外の3個
まで、好ましくは2個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
3個以上の変更を伴わない)、そしてその共通配列での
ア短ノ酸の挿入又は欠失は、Xとして示した以外の3個
まで、好ましくは2個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くともl5個、好ましくは少なくとも30個のアミノ酸
を配列中にもつ: E R S G V D L LT E 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのア【ノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一賭に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、一層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印(*)は結合(その部位にアミノ酸がないこと)を
意図しており、そして2は0又はlである。その配列は
合計で10個までの、普通には合計で8個までのアξノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはN一末端は
追加の配列ν−11−H−T−R又はそれのいずれかの
部分をもつことができ、モしてC一末端は配列M−P−
M−T又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
くともl5個、好ましくは少なくとも30個のアミノ酸
を配列中にもつ: E R S G V D L LT E 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのア【ノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一賭に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、一層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印(*)は結合(その部位にアミノ酸がないこと)を
意図しており、そして2は0又はlである。その配列は
合計で10個までの、普通には合計で8個までのアξノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはN一末端は
追加の配列ν−11−H−T−R又はそれのいずれかの
部分をもつことができ、モしてC一末端は配列M−P−
M−T又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約l
5個、好ましくは少なくとも約20個、一層好ましくは
少なくとも約30個のア旦ノ酸をもち、下記の配列の1
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも10個、好ましくは少なくとも12
個、そして一層好ましくは少なくとも15個の、星印(
*〉で示したア旦ノ酸を含む(b=ウシ、h=ヒト). *20 V−H−E−T−R−F−E−A−A−V−K−V−1
−Q−S−L−P−K−N−G傘 $ 零
率 本*** 傘D−A−W
−S−S−L−G−D−M−T−K−E−E−A−M−
1−A−Y−V−E−傘傘* E一門−κ−K−1−L−E−T−M−P−M−T(b
EBZD) 傘 傘 K−K−K−Y−G−1 (hEBZD) * 傘 K−K−K−Y−G−1 本発明の特に好ましい組威物については、上記の諸配列
が、約5個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約3個以下
のアミノ酸によってである. EBZD&[l成物は少なくとも約20%の純度、一層
普通には少なくとも約30%の純度、好ましくは少なく
とも約80%の純度、一層好ましくは少なくとも約95
%の純度、望ましくは100%の純度である。
5個、好ましくは少なくとも約20個、一層好ましくは
少なくとも約30個のア旦ノ酸をもち、下記の配列の1
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも10個、好ましくは少なくとも12
個、そして一層好ましくは少なくとも15個の、星印(
*〉で示したア旦ノ酸を含む(b=ウシ、h=ヒト). *20 V−H−E−T−R−F−E−A−A−V−K−V−1
−Q−S−L−P−K−N−G傘 $ 零
率 本*** 傘D−A−W
−S−S−L−G−D−M−T−K−E−E−A−M−
1−A−Y−V−E−傘傘* E一門−κ−K−1−L−E−T−M−P−M−T(b
EBZD) 傘 傘 K−K−K−Y−G−1 (hEBZD) * 傘 K−K−K−Y−G−1 本発明の特に好ましい組威物については、上記の諸配列
が、約5個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約3個以下
のアミノ酸によってである. EBZD&[l成物は少なくとも約20%の純度、一層
普通には少なくとも約30%の純度、好ましくは少なく
とも約80%の純度、一層好ましくは少なくとも約95
%の純度、望ましくは100%の純度である。
それが由来する組織からの戒分を実質的に含まず、由来
組織からの成分が1重量%未満、好ましくは約0. 1
重量%未満、一層好ましくは約0.001重量%未満で
あるEBZD&llI戒物は特に興味がある。本発明の
EBZD&ll底物は、後記の実験の項で記載するアッ
セイ条件下で粗シナブトソープ膜への311−ジアゼバ
ムの結合を40%競争に必要な量によって測定して、少
なくとも15ユニット/■の比活性をもつ.比活性は普
通には少なくとも500ユニット/■、好ましくは少な
くとも約1000ユニット/■であり、モしてl250
ユニット/■以上であってもよい.一般的には、松果体
、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織1g当り少
なくとも約10趨当量あり、そして普通には脈絡叢中の
湿った組織tg当り少なくとも約2On当量ある。前記
したように、本発明の化合物は心臓細胞集合体の収縮に
おいて心臓収縮度数に影響を及ぼすことができ、少ない
投与量では心臓収縮度数を低下させ、この少ない投与量
は一般的には約150,q/一未満である(実験の項を
参照のこと) , EBZDのその他の特徴は、生理学
的活性がEBZDについて立証される種々の試験から明
らかである。
組織からの成分が1重量%未満、好ましくは約0. 1
重量%未満、一層好ましくは約0.001重量%未満で
あるEBZD&llI戒物は特に興味がある。本発明の
EBZD&ll底物は、後記の実験の項で記載するアッ
セイ条件下で粗シナブトソープ膜への311−ジアゼバ
ムの結合を40%競争に必要な量によって測定して、少
なくとも15ユニット/■の比活性をもつ.比活性は普
通には少なくとも500ユニット/■、好ましくは少な
くとも約1000ユニット/■であり、モしてl250
ユニット/■以上であってもよい.一般的には、松果体
、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織1g当り少
なくとも約10趨当量あり、そして普通には脈絡叢中の
湿った組織tg当り少なくとも約2On当量ある。前記
したように、本発明の化合物は心臓細胞集合体の収縮に
おいて心臓収縮度数に影響を及ぼすことができ、少ない
投与量では心臓収縮度数を低下させ、この少ない投与量
は一般的には約150,q/一未満である(実験の項を
参照のこと) , EBZDのその他の特徴は、生理学
的活性がEBZDについて立証される種々の試験から明
らかである。
羅四ヱ
脳因子は少なくとも2kDal,一層普通には少なくと
も5kDa+そして約25kDa +以下、一層普通に
は約22kDal以下であることを特徴とする。脳因子
は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように、
少なくとも約IXIO’,一層普通には少なくとも約5
×103、好ましくは少なくとも約106、好ましくは
少なくとも約1.5X107の比活性をもつ。
も5kDa+そして約25kDa +以下、一層普通に
は約22kDal以下であることを特徴とする。脳因子
は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように、
少なくとも約IXIO’,一層普通には少なくとも約5
×103、好ましくは少なくとも約106、好ましくは
少なくとも約1.5X107の比活性をもつ。
脳因子は普通には少なくとも約10%の純度、一層普通
には少なくとも約50%の純度、好ましくは少なくとも
約80%の純度、一層好ましくは少なくとも約95%の
純度、望ましくは100%の純度である。
には少なくとも約50%の純度、好ましくは少なくとも
約80%の純度、一層好ましくは少なくとも約95%の
純度、望ましくは100%の純度である。
特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの成分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
脳因子の配列は、N一末端近くに又はN一末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む:N−K−E−
L−D−1’−V−Q−K−L−F−V−D−κ−1−
χ−E−Y上記の配列においてXは任意のアミノ酸を示
す。
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む:N−K−E−
L−D−1’−V−Q−K−L−F−V−D−κ−1−
χ−E−Y上記の配列においてXは任意のアミノ酸を示
す。
脳因子はヒトT細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスボリンA又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスボリンA又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。
普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも65%、好ましくは少なくとも約75%相同であ
る(個数での%は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している)。
くとも65%、好ましくは少なくとも約75%相同であ
る(個数での%は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している)。
本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天コロニー形
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビト口及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも■桁の、 好ましくは少なくとも2桁のオーダーで識別することが
できる。
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビト口及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも■桁の、 好ましくは少なくとも2桁のオーダーで識別することが
できる。
欣1u1貢
膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ:
TらC TTA
6AA
しAT L;1”r
1iLiT AA’1
Li’l’l L;iA
ししI
but
Lys Leu Asn 傘
AAA 丁TG AAC TAAAGAAAAT
GACATTTTGTTGAAGAA 1693=L
起(U号辺4し吸:ウシの脳に由来するcDN^クロー
ンのヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列(*
)。アミノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係
で番号づけされている。EBZDと相同な領域は太線に
よって上に線引きされており、そして疎水性及び非荷電
のアミノ酸の延長領域は細線で線引きされている。潜在
的なグリコシル化部位は囲まれている。
GACATTTTGTTGAAGAA 1693=L
起(U号辺4し吸:ウシの脳に由来するcDN^クロー
ンのヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列(*
)。アミノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係
で番号づけされている。EBZDと相同な領域は太線に
よって上に線引きされており、そして疎水性及び非荷電
のアミノ酸の延長領域は細線で線引きされている。潜在
的なグリコシル化部位は囲まれている。
それ故にペプチドは数で上記配列の少なくとも約60%
、一層普通には少なくとも約75%、そして好ましくは
少なくとも約95%をもつ。EBZDとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約10%の純度、好ましくは少なくとも約5
0%の純度、一層好ましくは少なくとも約80%の純度
、そして特に好ましくは少なくとも約95%の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする.その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの成分を含まない
.膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更
に特徴とする. 興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド170の又はヌクレオ
チド270又は273のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む. 本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イディオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る.慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる.本発
明のポリベプチド又はそれのフラグメント、一般的には
少なくとも約15個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる.種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンペット(keyhole Iimpet)ヘモシ
アニン、グロプリン、等を用いることができる.ポリペ
プチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ
ルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息香
酸等を利用することができる。アジュバントとしてはフ
ロインド(Freund)アジュバント、水酸化アルミ
ニウム、等がある。
、一層普通には少なくとも約75%、そして好ましくは
少なくとも約95%をもつ。EBZDとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約10%の純度、好ましくは少なくとも約5
0%の純度、一層好ましくは少なくとも約80%の純度
、そして特に好ましくは少なくとも約95%の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする.その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの成分を含まない
.膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更
に特徴とする. 興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド170の又はヌクレオ
チド270又は273のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む. 本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イディオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る.慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる.本発
明のポリベプチド又はそれのフラグメント、一般的には
少なくとも約15個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる.種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンペット(keyhole Iimpet)ヘモシ
アニン、グロプリン、等を用いることができる.ポリペ
プチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ
ルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息香
酸等を利用することができる。アジュバントとしてはフ
ロインド(Freund)アジュバント、水酸化アルミ
ニウム、等がある。
抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に2
〜4週間の間隔でI回以上の追加免疫注射を行なう。モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その牌臓を単離し、
そのIll!!臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合
パートナーと融合させる。
〜4週間の間隔でI回以上の追加免疫注射を行なう。モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その牌臓を単離し、
そのIll!!臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合
パートナーと融合させる。
例えば、Galfer等、Nature(1977)
266:550;KenneLL等、 Current
To ics in Microbiolo
and Im++*u−既旦u(1987)
81 : 77 ;米国特許第4,381,292号及
び第4.363,799号を参照のこと.しかしながら
、特定の目的に対しては、その他の咄乳動物、例えば霊
長M(例えばヒト)を、ヒトFc鎖をもつ抗体の生産の
ために、用いることができる.EBZDポリペプチド及
びEBZDポリペブチドに特異的に結合する抗体は、個
々に又は一緒にして、インビボ及びインビトロの両方に
用途がある。主題の化合物はジアゼバムレセプターへの
結合のためのアゴニストとして用いることができる.本
発明の化合物は、ジアゼパムレセプターの数及び分布を
求めるのに用いることができる.加えて、本発明の化合
物は噛乳動物宿主の心臓拍動を調節するのに、噛乳動物
宿主を鎮静させるのに、又は噛乳動物宿主に興奮を引き
起させるのに用いられる.脳因子ポリペプチド及び脳因
子ポリペブチドに特異的に結合する抗体は、個々に又は
一緒になって、インビボ及びインビトロの両方で用途が
ある.このポリベプチドは腫瘍抑制特性をもっているの
で、このポリペプチドは、腫瘍細胞の過度の増殖を抑制
するために、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細
胞混合物と共に用いることができる。
266:550;KenneLL等、 Current
To ics in Microbiolo
and Im++*u−既旦u(1987)
81 : 77 ;米国特許第4,381,292号及
び第4.363,799号を参照のこと.しかしながら
、特定の目的に対しては、その他の咄乳動物、例えば霊
長M(例えばヒト)を、ヒトFc鎖をもつ抗体の生産の
ために、用いることができる.EBZDポリペプチド及
びEBZDポリペブチドに特異的に結合する抗体は、個
々に又は一緒にして、インビボ及びインビトロの両方に
用途がある。主題の化合物はジアゼバムレセプターへの
結合のためのアゴニストとして用いることができる.本
発明の化合物は、ジアゼパムレセプターの数及び分布を
求めるのに用いることができる.加えて、本発明の化合
物は噛乳動物宿主の心臓拍動を調節するのに、噛乳動物
宿主を鎮静させるのに、又は噛乳動物宿主に興奮を引き
起させるのに用いられる.脳因子ポリペプチド及び脳因
子ポリペブチドに特異的に結合する抗体は、個々に又は
一緒になって、インビボ及びインビトロの両方で用途が
ある.このポリベプチドは腫瘍抑制特性をもっているの
で、このポリペプチドは、腫瘍細胞の過度の増殖を抑制
するために、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細
胞混合物と共に用いることができる。
それ故に本発明の化合物は下記の場合のような状態で用
いることができる:正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる:骨
髄が噛乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合;細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはT細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる.脳因子ポリペプチド
は、腫瘍中に注入するか、リポソーム中に封入する(こ
の場合にリポソームはIUI,細胞に対する特異的な又
は優先的な抗体に結合していてもよい)か、等によって
、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体内で用いること
ができる。他の方法としては、本発明のポリペブチドは
免疫調節剤として用いることができる.このポリペブチ
ドは、ポリペプチドについての診断において、それ自体
で又は抗体との組み合せで用いることができる.診断ア
ッセイでの使用のためにそのいずれか又は両方がラベル
され又はラベルされないであろう.多数の診断アッセイ
が文献に記載されており、該ポリペプチド、又は抗体へ
の種々のラベル、例えば酵素、放射性核種、フルオレッ
サー、基質、補酵素、粒子(例えば磁性粒子)等の直接
又は間接のいずれかでの結合を含む.これらのアッセイ
の例示としては、例えば米国特許第3.817,837
号、第3,850.752号、第4,174,384号
、第4.277,437号及び第4 , 374 .
925号を参照のこと。
いることができる:正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる:骨
髄が噛乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合;細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはT細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる.脳因子ポリペプチド
は、腫瘍中に注入するか、リポソーム中に封入する(こ
の場合にリポソームはIUI,細胞に対する特異的な又
は優先的な抗体に結合していてもよい)か、等によって
、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体内で用いること
ができる。他の方法としては、本発明のポリペブチドは
免疫調節剤として用いることができる.このポリペブチ
ドは、ポリペプチドについての診断において、それ自体
で又は抗体との組み合せで用いることができる.診断ア
ッセイでの使用のためにそのいずれか又は両方がラベル
され又はラベルされないであろう.多数の診断アッセイ
が文献に記載されており、該ポリペプチド、又は抗体へ
の種々のラベル、例えば酵素、放射性核種、フルオレッ
サー、基質、補酵素、粒子(例えば磁性粒子)等の直接
又は間接のいずれかでの結合を含む.これらのアッセイ
の例示としては、例えば米国特許第3.817,837
号、第3,850.752号、第4,174,384号
、第4.277,437号及び第4 , 374 .
925号を参照のこと。
種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリベプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
El^、ELISA ,RrA 、ホモゲニアスEIA
, ドットープロット、ウエスターンズ(West
erns)等と称される。
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリベプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
El^、ELISA ,RrA 、ホモゲニアスEIA
, ドットープロット、ウエスターンズ(West
erns)等と称される。
本発明のポリペプチドに対する抗体は抗イディオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イディオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエビトープ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ。
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イディオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエビトープ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ。
それ故に、これらの抗イディオタイプはジアゼパムアゴ
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
上記のポリベプチドは、天然源に由来する天然ポリベプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然&[1戒物は多数の種々の組織、例え
ば牌臓及び精巣中に見いだすことができる. 本発明の化合物を単離するために、脳Mi織から血餅を
排除し、ホモジナイズし、酸性(pH< 4 )条件下
で有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約4kD
al未満である低分子量物質を除去する。
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然&[1戒物は多数の種々の組織、例え
ば牌臓及び精巣中に見いだすことができる. 本発明の化合物を単離するために、脳Mi織から血餅を
排除し、ホモジナイズし、酸性(pH< 4 )条件下
で有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約4kD
al未満である低分子量物質を除去する。
その生威物を次いでゲル浸透カラム及び約35〜45%
アセトニトリルを含有する0. 1%トリフルオロ酢酸
水溶液熔離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑
制剤として作用するらしい化合物を排除する。その諸両
分をパイオアッセイによって観察する。その生成したE
BZD画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム
、例えば、μ−ボンダバッターC.カラムを用い、水性
0.1%トリフルオロ酢酸中の約0〜60%アセトニト
リルの線状グラジエントを用い、そして長いカラム及び
遅い溶出速度、例えば4時間以上、好ましくは5時間以
上を用いて更に精製した.本発明のEBZD化合物は約
30〜50%アクリロニトリル、一層特定的には30〜
40%アクリロニトリルの百分中に見いだされる.BP
化合物含有画分を、逆相HPLCを用い、0. 1%水
性アセトニトリルの直線グラジエントを用い、32〜3
6%アセトニトリルで溶離し、このプロセスを1回以上
繰り返して、更に精製する.このII1された両分を次
いで、逆相1{PLCを用い、0. 1%水性n−プロ
パノールの直線グラジエントを用い、約22〜24%n
−プロパノールで溶離し、このプロセスを1回以上繰り
返して、更に精製する.他の方法として、本発明のポリ
ペプチドは、特にポリベプチドが30個未満のアミノ酸
、一層特定的には25個未満のアミノ酸の場合に、公知
の技術に従って合成することができる.例えば、Bar
any及びMerrifield, Sofid−Ph
ase Pe tide S nthesis,“↑h
e Peptides, Analysis Syn
thesis Biology ,Special
Methods in Peptide Synth
esis. Part A+Vo1、 2+ Gro
ss及びMerenhoferW、Acaden+ic
Press(米国) 1980、1〜284頁を参照
のこと。
アセトニトリルを含有する0. 1%トリフルオロ酢酸
水溶液熔離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑
制剤として作用するらしい化合物を排除する。その諸両
分をパイオアッセイによって観察する。その生成したE
BZD画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム
、例えば、μ−ボンダバッターC.カラムを用い、水性
0.1%トリフルオロ酢酸中の約0〜60%アセトニト
リルの線状グラジエントを用い、そして長いカラム及び
遅い溶出速度、例えば4時間以上、好ましくは5時間以
上を用いて更に精製した.本発明のEBZD化合物は約
30〜50%アクリロニトリル、一層特定的には30〜
40%アクリロニトリルの百分中に見いだされる.BP
化合物含有画分を、逆相HPLCを用い、0. 1%水
性アセトニトリルの直線グラジエントを用い、32〜3
6%アセトニトリルで溶離し、このプロセスを1回以上
繰り返して、更に精製する.このII1された両分を次
いで、逆相1{PLCを用い、0. 1%水性n−プロ
パノールの直線グラジエントを用い、約22〜24%n
−プロパノールで溶離し、このプロセスを1回以上繰り
返して、更に精製する.他の方法として、本発明のポリ
ペプチドは、特にポリベプチドが30個未満のアミノ酸
、一層特定的には25個未満のアミノ酸の場合に、公知
の技術に従って合成することができる.例えば、Bar
any及びMerrifield, Sofid−Ph
ase Pe tide S nthesis,“↑h
e Peptides, Analysis Syn
thesis Biology ,Special
Methods in Peptide Synth
esis. Part A+Vo1、 2+ Gro
ss及びMerenhoferW、Acaden+ic
Press(米国) 1980、1〜284頁を参照
のこと。
比較的大きなポリペプチド、特に約20個以上のアミノ
酸をもつもの、一層特定的には約30個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチトをコードする配列
を得るためにハイブリッドDNA技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペブチ
ドの発現に用いることができる。ポリベプチドをコード
するためにゲノムDNA, cDNA,合成DNA又は
それらの組み合せを用いることができ、いずれかのイン
トロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライ
シング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決され
る。ほとんどの場合において、オープンリーディングフ
レームが用いられ(イントロンなし)、この場合にその
リーディングフレームをコードする配列は発現宿主中で
機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される. 特に興味のあるcDNAとしてはEBZDについて得ら
れるcDNAがある.このcDNAは開始のメチオニン
から約120bpまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ(A)+テールを含む約225bpを含む。
酸をもつもの、一層特定的には約30個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチトをコードする配列
を得るためにハイブリッドDNA技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペブチ
ドの発現に用いることができる。ポリベプチドをコード
するためにゲノムDNA, cDNA,合成DNA又は
それらの組み合せを用いることができ、いずれかのイン
トロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライ
シング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決され
る。ほとんどの場合において、オープンリーディングフ
レームが用いられ(イントロンなし)、この場合にその
リーディングフレームをコードする配列は発現宿主中で
機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される. 特に興味のあるcDNAとしてはEBZDについて得ら
れるcDNAがある.このcDNAは開始のメチオニン
から約120bpまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ(A)+テールを含む約225bpを含む。
下記はヒト及びウシcDNA配列を示している.5’
−GAGCACCGGTGGAGAGGCCTAAGG
TTGCGCTTNael 1 G G G 11ind [1 ↓ C一 −C−−−− 一〇 −−−−−−GA 87 TTTGGCTGCCA−GCCATTCATTTCA
CCTAAACTGATTTA 434−−一一一↑
一A−TGT−−−−−GTG−−−AT−−−−−−
−−−−GACATAACTAGCTAAGCCAGA
AGCTCAAGACAGCCCAGGATA 5
11TGACTAACAGATTAGGAGCTGAA
ACGGTTACTAATCCTTGCTGAGTAA
TTTTTATCAGTAGATGAATTAAAAG
TATCTT 590TGTTACTTT/ACT
TCG/AT<poly A)−3’ 607上
記はウシとヒトのヌクレオチド及びEBZDの推定され
たアミノ酸配列を比較して示している。ヒトの配列にお
いて異る残部はウシの配列の上及び下に示されており、
それは3つのオーバラップするcDN^クローンから求
められた.ヌクレオチド残部はウシのクローンの複合配
列に関して番号付けされており、アミノM残基は開始の
メチオニンに関して番号付けされている.ウシの配列の
リーディングフレームは星印(*)に挟まれている。3
つの別個のクローンのポリ(A)十付加部位における差
異は逆スラッシュによって示されている。
−GAGCACCGGTGGAGAGGCCTAAGG
TTGCGCTTNael 1 G G G 11ind [1 ↓ C一 −C−−−− 一〇 −−−−−−GA 87 TTTGGCTGCCA−GCCATTCATTTCA
CCTAAACTGATTTA 434−−一一一↑
一A−TGT−−−−−GTG−−−AT−−−−−−
−−−−GACATAACTAGCTAAGCCAGA
AGCTCAAGACAGCCCAGGATA 5
11TGACTAACAGATTAGGAGCTGAA
ACGGTTACTAATCCTTGCTGAGTAA
TTTTTATCAGTAGATGAATTAAAAG
TATCTT 590TGTTACTTT/ACT
TCG/AT<poly A)−3’ 607上
記はウシとヒトのヌクレオチド及びEBZDの推定され
たアミノ酸配列を比較して示している。ヒトの配列にお
いて異る残部はウシの配列の上及び下に示されており、
それは3つのオーバラップするcDN^クローンから求
められた.ヌクレオチド残部はウシのクローンの複合配
列に関して番号付けされており、アミノM残基は開始の
メチオニンに関して番号付けされている.ウシの配列の
リーディングフレームは星印(*)に挟まれている。3
つの別個のクローンのポリ(A)十付加部位における差
異は逆スラッシュによって示されている。
ウシのcDNAプローブを調製するのに用いられたNa
e I及び旧ndl[Iの制限部位が示されている.実
験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくとも
約45個の塩基(15個以上のコドン)をもつフラグメ
ントが、本発明のポリベプチドの発現に用いることがで
きる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダプ
ター等を用いることによって、その配列を天然配列から
変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野生
型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作ること
ができる。従って、天然ポリベプチド、及び相応の生理
学的特性を有するがしかし1個以上のアミノ酸の異なっ
ているポリペブチドの両方を作ることができる。
e I及び旧ndl[Iの制限部位が示されている.実
験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくとも
約45個の塩基(15個以上のコドン)をもつフラグメ
ントが、本発明のポリベプチドの発現に用いることがで
きる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダプ
ター等を用いることによって、その配列を天然配列から
変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野生
型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作ること
ができる。従って、天然ポリベプチド、及び相応の生理
学的特性を有するがしかし1個以上のアミノ酸の異なっ
ているポリペブチドの両方を作ることができる。
使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる.発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
滑末端または付着端を有していることができる.発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
従って、適当な宿主における発現のために、発現ヘクタ
ー内に対象の配列を導入することができる。
ー内に対象の配列を導入することができる。
宿主は、原核生物または真核生物、すなわち、細菌、藻
類、菌類、例えば、酵母、噛乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていようが、本発明のポリペブチドの
コード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの
場合、以下のように特徴付けられる。常にというわけで
はないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または
多数のコピー数のエピソーム要素を提供する、野生型複
製系以外の複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコ
ード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必
要ないであろう。コード配列は、5′末端および3′末
端において、しばしば野生型の制′4’lj H域以外
の、転写および翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナ
ルのそれぞれによって挟まれている.従って、プロモー
ター領域は5′末端において用いられ、キャップ配列、
制御された発現のためのオペレーター、およびエンハン
サー配列等を含み、構成的発現のためにプロモーター制
御を含んでいないことができる。3′末端においては、
ターミネーター、終止コドン、および最適にはポリアデ
ニル化配列等が存在する.転写および翻訳制御配列およ
びコード配列の発現造成物は、しばしば、ベクターが導
入されている形質転換された宿主に関する選択および発
現ベクターを保有する細胞に対する競争的好都合の提供
の双方を可能にする1種もしくはそれ以上のマーカーに
連結される。マーカーは、栄養要求宿主に対する原栄養
性の付与による補完、殺生物剤(biocide)耐性
、例えば、種々の抗生物質および重金属等に対する耐性
、および免疫等含んでいることができる。種々の配列は
、宿主中で機能的であるように選択される。
類、菌類、例えば、酵母、噛乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていようが、本発明のポリペブチドの
コード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの
場合、以下のように特徴付けられる。常にというわけで
はないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または
多数のコピー数のエピソーム要素を提供する、野生型複
製系以外の複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコ
ード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必
要ないであろう。コード配列は、5′末端および3′末
端において、しばしば野生型の制′4’lj H域以外
の、転写および翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナ
ルのそれぞれによって挟まれている.従って、プロモー
ター領域は5′末端において用いられ、キャップ配列、
制御された発現のためのオペレーター、およびエンハン
サー配列等を含み、構成的発現のためにプロモーター制
御を含んでいないことができる。3′末端においては、
ターミネーター、終止コドン、および最適にはポリアデ
ニル化配列等が存在する.転写および翻訳制御配列およ
びコード配列の発現造成物は、しばしば、ベクターが導
入されている形質転換された宿主に関する選択および発
現ベクターを保有する細胞に対する競争的好都合の提供
の双方を可能にする1種もしくはそれ以上のマーカーに
連結される。マーカーは、栄養要求宿主に対する原栄養
性の付与による補完、殺生物剤(biocide)耐性
、例えば、種々の抗生物質および重金属等に対する耐性
、および免疫等含んでいることができる。種々の配列は
、宿主中で機能的であるように選択される。
多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリン力一が、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
ポリリン力一が、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
従って、コード配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
ある場合には、コード配列を5′−コード配列に連結し
て、融合生戒物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この5′一配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる:米国特許第4,411,994号、EPA88.
632および116,201 .コード配列は正しい
リーディングフレームで分泌リーダーおよびプロセッシ
ングシグナルに連結されることによって、その融合コー
ド配列を発現ベクター中に挿入して発現造底物を提供す
ることができる. ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペブチドを単
離することができる.ポリペブチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペブチドを単離す
ることができる.ポリペブチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンテイー
クロマトグラ7イー、}IPLc、電気泳動、グラジエ
ント遠心分離および溶剤抽出等がある. 用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる.生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。
て、融合生戒物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この5′一配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる:米国特許第4,411,994号、EPA88.
632および116,201 .コード配列は正しい
リーディングフレームで分泌リーダーおよびプロセッシ
ングシグナルに連結されることによって、その融合コー
ド配列を発現ベクター中に挿入して発現造底物を提供す
ることができる. ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペブチドを単
離することができる.ポリペブチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペブチドを単離す
ることができる.ポリペブチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンテイー
クロマトグラ7イー、}IPLc、電気泳動、グラジエ
ント遠心分離および溶剤抽出等がある. 用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる.生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。
天然に存在するEBZDの濃度は一般に5〜500汀/
dである.投与方法に応じて、用量は約0. 5〜50
0IIg/kgまで、より通常には約5 〜50g/k
gまで変化することができ、用量が25g/kgを越え
る場合には精神安定作用が生ずる.特定の用量は、所望
の反応、投与方法および用量の反復性等によって変化す
る. 以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
dである.投与方法に応じて、用量は約0. 5〜50
0IIg/kgまで、より通常には約5 〜50g/k
gまで変化することができ、用量が25g/kgを越え
る場合には精神安定作用が生ずる.特定の用量は、所望
の反応、投与方法および用量の反復性等によって変化す
る. 以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
Bio−Sil TSK−250ゲルロ過HPLC力ラ
ムを、パイオーランドラボラトリーズ(リッチモンド、
カルフォルニア)より購入した, B −Bondap
ak−C..カラムをウォーターズアソシエート(5ル
フォールド、マサチューセジツ)より入手した.トリプ
シン(TPCκ処理)、−キモトリプシンおよびスタフ
ィ口コッカル・アウレウス(Sta h Iococo
l aureus)v8ブロテアーゼは、ワーリントン
(Worthington)から得る。エンドブロティ
ナーゼLys − Cをベーリンガーマンハイムから得
た。3H−ラベル化ジアゼバム、RO15−1788、
フルニトラゼパムおよびβカルボリンをNIJ ,ボス
トン、マサチューセッンから得た。キャリャフリー12
51−ヨウ素はアマーシャム(アーリントンハイト、イ
リノイ)製のものであった。
ムを、パイオーランドラボラトリーズ(リッチモンド、
カルフォルニア)より購入した, B −Bondap
ak−C..カラムをウォーターズアソシエート(5ル
フォールド、マサチューセジツ)より入手した.トリプ
シン(TPCκ処理)、−キモトリプシンおよびスタフ
ィ口コッカル・アウレウス(Sta h Iococo
l aureus)v8ブロテアーゼは、ワーリントン
(Worthington)から得る。エンドブロティ
ナーゼLys − Cをベーリンガーマンハイムから得
た。3H−ラベル化ジアゼバム、RO15−1788、
フルニトラゼパムおよびβカルボリンをNIJ ,ボス
トン、マサチューセッンから得た。キャリャフリー12
51−ヨウ素はアマーシャム(アーリントンハイト、イ
リノイ)製のものであった。
新鮮な又は凍結したウシの脳(480 g湿重量)を融
解し次いで細断した.細断した組織を、2379dのエ
タノール(9B%) 、H?.5−の濃HCi!、およ
び2. 5 dのアブ口ティニン〔ウシの肺源の23
TIU/d(シグマケミカル社)〕から成る2400d
の抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコマ
ーシャル混合機中でホモジナイズした.ホモジネートを
4゜Cで一夜で撹拌し、ベックマン型l9ローター中8
000rpm+で30分間遠心分離し、次いで上澄みを
注意深く除去した.最終量は約2070dであった。ク
ロロホルム(2070II1)および207ldの酸性
の水(203dの水と4dの濃HCj!)を上澄みに添
加し、混合物を約1時間激しく撹拌し、次いで室温に放
置し二相に分離した。水性の上相を注意深く除去し次い
でスベクトラポール透析膜チューブ(3,500MWカ
ットオフ、アメリカンサイエンティフィックプロダクト
)中、4 ”CでO. l M酢酸2Ofを2回取り換
えて透析した。透析した上澄みを凍結乾燥した.凍結乾
燥材料(785■)を粗分画と称した. ゲル′ クロマトグーフィー Bio−Sjl TSX−250カラム(60X 2.
I Cll)を高速液体クロマトグラフィ−(IIP
LC)システム(ウォーターズアソシエーツ)に取付け
た.粗分画を0.1%三フッ化酢酸を用い40%アセト
ニトリル水溶液中に8 mg / Ml1の濃度で熔解
した.カラムを0. 1%三フッ化酢酸(TP^)と共
に40%アセトニトリルを用いて平衡化した.2Idの
アリコート(16■のタンパク質)を注入し次いで0.
1%濃度のTFAを有する40%アセトニトリル水溶
液を移動相として均一に溶出を行った。流速を2−/分
に設定しそしてチャートスピードを0.25CI/分に
設定した.クロマトグラフィー処理を室温で行った,5
1dの分画を採取した。各分百のアリコートを凍結乾燥
し次いでペンゾジアゼピン(BZD)結合競合活性(B
ZD−BCA)および成長押制活性について3回分析し
た. BZD.−BC八の位置を知った後(分画24)、先に
述べた如く、49回のクロマトグラフィー操作を行った
.全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した.約
65■の活性な乾燥粉末を得た.これをTSκ〜250
分画と称した.この分画は約936ユニットのBZD−
BCA活性を含有していた.TSK−250 の
クロマトグーフィ−TSK−250分画を0
. 1%TPAに溶解し(2■/一)、更にμ−Bon
dapak − C , aカラム(78mm (内径
)×30cm)を用い室温で逆相HPLCにより分別し
た.試料を均一に適用し、カラムを洗浄し次いで0.
1%TFAで平衡化した。流速を2II1/分に設定し
、そしてチャート速度を0.25c■/分に設定した.
第一の溶剤0. 1%TF^と第二の溶剤0. 1%T
PA中のアセトニトリルと間での線状グラジエント法を
用いた.グラジエントの条件は20分内で0〜28%、
次いで140分内で28〜42%、lO分内で42〜5
2%更に6分内で52〜100%であった.全ての溶剤
は、HPLC等級のものであった.4M1の分画を採取
した。
解し次いで細断した.細断した組織を、2379dのエ
タノール(9B%) 、H?.5−の濃HCi!、およ
び2. 5 dのアブ口ティニン〔ウシの肺源の23
TIU/d(シグマケミカル社)〕から成る2400d
の抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコマ
ーシャル混合機中でホモジナイズした.ホモジネートを
4゜Cで一夜で撹拌し、ベックマン型l9ローター中8
000rpm+で30分間遠心分離し、次いで上澄みを
注意深く除去した.最終量は約2070dであった。ク
ロロホルム(2070II1)および207ldの酸性
の水(203dの水と4dの濃HCj!)を上澄みに添
加し、混合物を約1時間激しく撹拌し、次いで室温に放
置し二相に分離した。水性の上相を注意深く除去し次い
でスベクトラポール透析膜チューブ(3,500MWカ
ットオフ、アメリカンサイエンティフィックプロダクト
)中、4 ”CでO. l M酢酸2Ofを2回取り換
えて透析した。透析した上澄みを凍結乾燥した.凍結乾
燥材料(785■)を粗分画と称した. ゲル′ クロマトグーフィー Bio−Sjl TSX−250カラム(60X 2.
I Cll)を高速液体クロマトグラフィ−(IIP
LC)システム(ウォーターズアソシエーツ)に取付け
た.粗分画を0.1%三フッ化酢酸を用い40%アセト
ニトリル水溶液中に8 mg / Ml1の濃度で熔解
した.カラムを0. 1%三フッ化酢酸(TP^)と共
に40%アセトニトリルを用いて平衡化した.2Idの
アリコート(16■のタンパク質)を注入し次いで0.
1%濃度のTFAを有する40%アセトニトリル水溶
液を移動相として均一に溶出を行った。流速を2−/分
に設定しそしてチャートスピードを0.25CI/分に
設定した.クロマトグラフィー処理を室温で行った,5
1dの分画を採取した。各分百のアリコートを凍結乾燥
し次いでペンゾジアゼピン(BZD)結合競合活性(B
ZD−BCA)および成長押制活性について3回分析し
た. BZD.−BC八の位置を知った後(分画24)、先に
述べた如く、49回のクロマトグラフィー操作を行った
.全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した.約
65■の活性な乾燥粉末を得た.これをTSκ〜250
分画と称した.この分画は約936ユニットのBZD−
BCA活性を含有していた.TSK−250 の
クロマトグーフィ−TSK−250分画を0
. 1%TPAに溶解し(2■/一)、更にμ−Bon
dapak − C , aカラム(78mm (内径
)×30cm)を用い室温で逆相HPLCにより分別し
た.試料を均一に適用し、カラムを洗浄し次いで0.
1%TFAで平衡化した。流速を2II1/分に設定し
、そしてチャート速度を0.25c■/分に設定した.
第一の溶剤0. 1%TF^と第二の溶剤0. 1%T
PA中のアセトニトリルと間での線状グラジエント法を
用いた.グラジエントの条件は20分内で0〜28%、
次いで140分内で28〜42%、lO分内で42〜5
2%更に6分内で52〜100%であった.全ての溶剤
は、HPLC等級のものであった.4M1の分画を採取
した。
各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでBZD−BC
Aに対し3回分析した。大部分の活性部分が、31〜3
2%アセトニトリル濃度間で溶出した.分画36と分画
37をプールし、次いで12mの0.1%TPAで希釈
した.混合物を、p − Bondapak − C
+ eカラム〔3.9■(内径)X30cm)に均一に
適用した.流速は14/分であり、チャート速度は0.
25cm/分であった.第一の溶剤0.1%TFAと第
二の溶剤0.1%TFAを有するアセトニトリルとの間
で直線グラジエント法を用いた。グラジェント条件は次
の通りであった。lO分内で0〜30%、次いで60分
内で30〜40%であった。分画を採取した.殆ど全て
の活性(約850ユニット)部分は31%までのアセト
ニトリル濃度で分画6内に溶離した。この分画をHPL
C Cam分画と称し、これは約68onのタンパク
を有していた. また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒトEBZDを精製した. 〜シナプトソームの! 1 粗シナブス膜分画を、体重200gまでのスブラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからZuckin等(Proc. Nai1、 Ac
ad.匙豆υ5A(1974)71 : 4802−4
806)の記載の如く調製した.シナフ゜ス膜を、50
mMのトリスー11(J (pH7.4)で3回洗浄し
、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離により
ペレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を50aM
}リスーuci. (pH7.4)に懸濁させ次いで
−20℃で保存した。
Aに対し3回分析した。大部分の活性部分が、31〜3
2%アセトニトリル濃度間で溶出した.分画36と分画
37をプールし、次いで12mの0.1%TPAで希釈
した.混合物を、p − Bondapak − C
+ eカラム〔3.9■(内径)X30cm)に均一に
適用した.流速は14/分であり、チャート速度は0.
25cm/分であった.第一の溶剤0.1%TFAと第
二の溶剤0.1%TFAを有するアセトニトリルとの間
で直線グラジエント法を用いた。グラジェント条件は次
の通りであった。lO分内で0〜30%、次いで60分
内で30〜40%であった。分画を採取した.殆ど全て
の活性(約850ユニット)部分は31%までのアセト
ニトリル濃度で分画6内に溶離した。この分画をHPL
C Cam分画と称し、これは約68onのタンパク
を有していた. また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒトEBZDを精製した. 〜シナプトソームの! 1 粗シナブス膜分画を、体重200gまでのスブラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからZuckin等(Proc. Nai1、 Ac
ad.匙豆υ5A(1974)71 : 4802−4
806)の記載の如く調製した.シナフ゜ス膜を、50
mMのトリスー11(J (pH7.4)で3回洗浄し
、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離により
ペレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を50aM
}リスーuci. (pH7.4)に懸濁させ次いで
−20℃で保存した。
EBZD−辷八 についてのア セイ種々の両分
又は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナブト
ソームへの3}1−BZロの結合の阻害を、結合競争活
性の指標として使用した。シナブトソーム膜への311
−BZ[+の結合を、25−のβ−カルボリンの不在下
又は存在下のいずれかで使い捨ての12 X 75mの
ボリブロビレン管中において2通り実施した.その結合
混合物は、所望の種々の濃度の試験化合物、20++M
のTris−HCI (pH=7. 4 ) 、シナブ
スM!!!濁液(70 − 100Ilgのクンバク質
) 、1〜5mM(7)3H−BZD及び合計体積0.
1 af中0.5%の最終濃度のジメチルスルホキシ
ドを含んだ.4℃で30分間のインキュベーションの後
、0. 1 MのTris−l1cj! (pH= 7
. 4 )中10%の冷ポリエチレングリコール(PE
06000) 0. 7−を各々の管に添加した.その
懸濁液をすぐ4゜CでGF/Bフィルターにより真空濾
過した.そのフィルターを、IIIIg/IIiのBS
Aを含む50−Mの冷Tris−11CI (pH一7
. 4 ) 10dにより洗浄した。そのフィルターを
、計数バイアルに移し、そしてアクアシン(Aquas
−sine)(NEN)10Idを、各バイアルに添加
し、そしてBeckmanβ一カウンターを用いて放射
能を測定した。25−のβ一カルボリンの存在において
結合した放射能(合計結合の2〜8%)は、非特異的で
あると思われ、そしてデーターはそれに応じて修正され
た。タンパク質濃度を、標準としてBS^を用いて、L
O@TV+など,,J. Bio1、 Chest.(
1951)ユ超:265〜275の方法によって測定し
た.ポリアクリルアミドゲル ゛ PAGE)0.
1 Mのリン酸ナトリウム(pH=7. 2 ) 、
0. 1%のSOS及び6Mの尿素を含む15.6%の
ポリアクリルアミドビスーアクリルアミド(30:0.
8)の15cmの分離ゲル(0. 75mの厚さ)を使
用した.そのゲルは、ゲル20d当りTt!MED(B
ioRad) 10Il1を含み、そして、20%の過
硫酸アンモニウムの1. 0 m/Iliのゲルを用い
ることによって重合されたものである.分離ゲルの条件
と同一の緩衝液条件を用いる3.5%のアクリルアミド
溶液の上層ゲルを、下層ゲルの上に注いだ.上層ゲルの
約3閣を残して、コム(Comb)を、その上のゲル中
に挿入した.0.01Mのリン酸ナトリウム(pH=7
. 2 ) 、7 Mの尿素、1%のSOS及び1%の
2−メルカプトエタノール中サンプル40IJ1を、2
分間煮沸し、そしてすぐに適用した.そのランニング緩
衝液は、0. 1%のSOSを含む0. 1 Mのリン
酸ナトリウム(pl1=7.2)であった.トラッキン
グ染料がゲルの底に達するまで、そのゲルを、室温で5
V/CIで泳動させた。そのゲルを、50%メタノール
及び9%酢酸中に固定し、固定溶液中において0. 1
%クーマシープルー(Coosasie blue)に
より染色し、そして50%メタノール及び9%酢酸によ
り脱染色した.脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた.
15%の分離ゲル及び5%のスクッキングゲルを使用す
る、Laemsli,Nature(1970) 22
7 : 680 〜685のPAGE法もまた、使用さ
れた.ゲル上のタンパク質を、Merr i 1 +
など,, Science(1981) 211 :
1437〜l439の銀染色法又はクーマシーブルー染
色法のいずれかによって検出した. ンパク のヨウソ Barridge, Methods Enz mo1
、(1978)50 : 54〜65によって記載され
ているクロラミンーT法を用いて125Iにより、又は
Biochem.J. (1973)ユ33 : 52
9〜539に記載されている”J−Balton及び}
lunter試薬を用いて、タンパク質をラベルした。
又は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナブト
ソームへの3}1−BZロの結合の阻害を、結合競争活
性の指標として使用した。シナブトソーム膜への311
−BZ[+の結合を、25−のβ−カルボリンの不在下
又は存在下のいずれかで使い捨ての12 X 75mの
ボリブロビレン管中において2通り実施した.その結合
混合物は、所望の種々の濃度の試験化合物、20++M
のTris−HCI (pH=7. 4 ) 、シナブ
スM!!!濁液(70 − 100Ilgのクンバク質
) 、1〜5mM(7)3H−BZD及び合計体積0.
1 af中0.5%の最終濃度のジメチルスルホキシ
ドを含んだ.4℃で30分間のインキュベーションの後
、0. 1 MのTris−l1cj! (pH= 7
. 4 )中10%の冷ポリエチレングリコール(PE
06000) 0. 7−を各々の管に添加した.その
懸濁液をすぐ4゜CでGF/Bフィルターにより真空濾
過した.そのフィルターを、IIIIg/IIiのBS
Aを含む50−Mの冷Tris−11CI (pH一7
. 4 ) 10dにより洗浄した。そのフィルターを
、計数バイアルに移し、そしてアクアシン(Aquas
−sine)(NEN)10Idを、各バイアルに添加
し、そしてBeckmanβ一カウンターを用いて放射
能を測定した。25−のβ一カルボリンの存在において
結合した放射能(合計結合の2〜8%)は、非特異的で
あると思われ、そしてデーターはそれに応じて修正され
た。タンパク質濃度を、標準としてBS^を用いて、L
O@TV+など,,J. Bio1、 Chest.(
1951)ユ超:265〜275の方法によって測定し
た.ポリアクリルアミドゲル ゛ PAGE)0.
1 Mのリン酸ナトリウム(pH=7. 2 ) 、
0. 1%のSOS及び6Mの尿素を含む15.6%の
ポリアクリルアミドビスーアクリルアミド(30:0.
8)の15cmの分離ゲル(0. 75mの厚さ)を使
用した.そのゲルは、ゲル20d当りTt!MED(B
ioRad) 10Il1を含み、そして、20%の過
硫酸アンモニウムの1. 0 m/Iliのゲルを用い
ることによって重合されたものである.分離ゲルの条件
と同一の緩衝液条件を用いる3.5%のアクリルアミド
溶液の上層ゲルを、下層ゲルの上に注いだ.上層ゲルの
約3閣を残して、コム(Comb)を、その上のゲル中
に挿入した.0.01Mのリン酸ナトリウム(pH=7
. 2 ) 、7 Mの尿素、1%のSOS及び1%の
2−メルカプトエタノール中サンプル40IJ1を、2
分間煮沸し、そしてすぐに適用した.そのランニング緩
衝液は、0. 1%のSOSを含む0. 1 Mのリン
酸ナトリウム(pl1=7.2)であった.トラッキン
グ染料がゲルの底に達するまで、そのゲルを、室温で5
V/CIで泳動させた。そのゲルを、50%メタノール
及び9%酢酸中に固定し、固定溶液中において0. 1
%クーマシープルー(Coosasie blue)に
より染色し、そして50%メタノール及び9%酢酸によ
り脱染色した.脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた.
15%の分離ゲル及び5%のスクッキングゲルを使用す
る、Laemsli,Nature(1970) 22
7 : 680 〜685のPAGE法もまた、使用さ
れた.ゲル上のタンパク質を、Merr i 1 +
など,, Science(1981) 211 :
1437〜l439の銀染色法又はクーマシーブルー染
色法のいずれかによって検出した. ンパク のヨウソ Barridge, Methods Enz mo1
、(1978)50 : 54〜65によって記載され
ているクロラミンーT法を用いて125Iにより、又は
Biochem.J. (1973)ユ33 : 52
9〜539に記載されている”J−Balton及び}
lunter試薬を用いて、タンパク質をラベルした。
EBZDに欠する
ウシの脳からの精製されたEBZDに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した。生後6週間のSprague−
Dawleyラットを、完全フロイントアジュバント
中に乳化された、合計201!gの精製タンパク質によ
り感作した。続く追加免疫接種を、不完全フロイントア
ジュバント中タンパク質10,wを用いて2週間隔で与
えた。各接種の後1週間で試験採血を行い、そして下記
に概説されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体
についてスクリーンした.そのアッセイのために適切な
抗血清は、一般的に、2〜3回のみの追加免疫接種の後
、得られた.ウサギ(およそ3kgの重さのニュージー
ランドホワイトウサギ)における精製されたウシの脳の
EBZDに対する抗血清をまた、ラットのために記載さ
れた同じ方法によって調製した.但し、40iIg及び
20l!gのタンパク質を、それぞれ、1次接種及び追
加免疫注射のために使用した。
ットにおいて調製した。生後6週間のSprague−
Dawleyラットを、完全フロイントアジュバント
中に乳化された、合計201!gの精製タンパク質によ
り感作した。続く追加免疫接種を、不完全フロイントア
ジュバント中タンパク質10,wを用いて2週間隔で与
えた。各接種の後1週間で試験採血を行い、そして下記
に概説されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体
についてスクリーンした.そのアッセイのために適切な
抗血清は、一般的に、2〜3回のみの追加免疫接種の後
、得られた.ウサギ(およそ3kgの重さのニュージー
ランドホワイトウサギ)における精製されたウシの脳の
EBZDに対する抗血清をまた、ラットのために記載さ
れた同じ方法によって調製した.但し、40iIg及び
20l!gのタンパク質を、それぞれ、1次接種及び追
加免疫注射のために使用した。
ラジオイムノアッセイ
精製されたウシの脳因子を、およそ3×10locpI
I/nの比活性にクロラミンTにより放射性ヨウ化し、
そして4゜CでTNEN緩衝液(20sMのTris−
HCl,pH= 7.4 ; 5mMのEDTA
; 150mMの NaCl ;0.05%の
NP−40 ; 0.1%のBSA)中に保存した。
I/nの比活性にクロラミンTにより放射性ヨウ化し、
そして4゜CでTNEN緩衝液(20sMのTris−
HCl,pH= 7.4 ; 5mMのEDTA
; 150mMの NaCl ;0.05%の
NP−40 ; 0.1%のBSA)中に保存した。
ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とポ
リプロピレン管C3dの容量)に添加された:精製され
た脳因子の標準又はサンプルlOpl、ラット抗血清(
TNEN緩衝液中において1:30に希釈された)10
d及びI!Slによりラベルされたウシの脳因子(〜5
X lo’cps) 30m。室温で45分間のイン
キュベーションの後、熱失活されホルマリンにより固定
されたS.アウレアス(S.aureus)の10%!
Q濁液50dを添加し、そしてその混合物をさらに30
分間放置した.次に、免疫吸着剤をn−ブチルフタレー
ト油のクッションを通して遠心分離し(15,000x
g , 1分)、そしてS.アウレアスペレット中
の放射能活性の量を、r一分光測定によって測定した。
リプロピレン管C3dの容量)に添加された:精製され
た脳因子の標準又はサンプルlOpl、ラット抗血清(
TNEN緩衝液中において1:30に希釈された)10
d及びI!Slによりラベルされたウシの脳因子(〜5
X lo’cps) 30m。室温で45分間のイン
キュベーションの後、熱失活されホルマリンにより固定
されたS.アウレアス(S.aureus)の10%!
Q濁液50dを添加し、そしてその混合物をさらに30
分間放置した.次に、免疫吸着剤をn−ブチルフタレー
ト油のクッションを通して遠心分離し(15,000x
g , 1分)、そしてS.アウレアスペレット中
の放射能活性の量を、r一分光測定によって測定した。
抗血清の不在において結合した放射能は非特異的である
と思われ、そしてデーターはそれに応じて修正された. RIA反応性物質についての検定されるべき組織は次の
ようにして加工された.新鮮な又は冷凍された組織(お
よそIgの正味重量)を、1(ldの冷ホモジナイゼー
ション緩衝液(20mHのTris−MCI,pH =
1− 4 ; 5 mMのEDTA ; 150s+M
のNaCf ; 0. 2%のNP40 ; 0.2
ggMのフェニルメチルスルホニルフルオリド;一当り
100カリクレイン阻害剤ユニットのTrasylol
)に添加し、そしてPolytron組織ホモジナイザ
ーにより3回、■5秒間の破壊により均質化した.その
抽出物を取り出し、そしてtoo,ooo×gで30分
間の遠心分離により残骸を除去した.次に、この上清液
を、5分間95゜Cへ加熱し、そして低速度で遠心分離
し、沈殿した蛋白質を除去した。一連のl:3の希釈の
抽出物を、TNEN緩衝液により調製し、そしてラジオ
イムノアッセイに使用した.標準曲線は各セットのアッ
セイを含み、そして免疫反応性物質の量を、直接的な比
較により算定した。
と思われ、そしてデーターはそれに応じて修正された. RIA反応性物質についての検定されるべき組織は次の
ようにして加工された.新鮮な又は冷凍された組織(お
よそIgの正味重量)を、1(ldの冷ホモジナイゼー
ション緩衝液(20mHのTris−MCI,pH =
1− 4 ; 5 mMのEDTA ; 150s+M
のNaCf ; 0. 2%のNP40 ; 0.2
ggMのフェニルメチルスルホニルフルオリド;一当り
100カリクレイン阻害剤ユニットのTrasylol
)に添加し、そしてPolytron組織ホモジナイザ
ーにより3回、■5秒間の破壊により均質化した.その
抽出物を取り出し、そしてtoo,ooo×gで30分
間の遠心分離により残骸を除去した.次に、この上清液
を、5分間95゜Cへ加熱し、そして低速度で遠心分離
し、沈殿した蛋白質を除去した。一連のl:3の希釈の
抽出物を、TNEN緩衝液により調製し、そしてラジオ
イムノアッセイに使用した.標準曲線は各セットのアッ
セイを含み、そして免疫反応性物質の量を、直接的な比
較により算定した。
ウシ及びヒトのEBZDを、エンドプロティナーゼLy
s−Cを含む0.1MのTris−アセテート(pH=
8. 0 ) 40xrにおいて24゜Cで16時間消
化した。EBZD :酵素の比は、重量基準で10:1
であった.ペブチドフラグメントを、水中0.05%T
FAから0.045%TFAを含む60%アセトニトリ
ルまでの直線2時間グラジエントを用いてμ−Bond
apak − C + sカラム(Waters)での
rpHPLCによって分離した。ベプチドをモニターし
、モして214nMでのそれらの吸収によって同定し、
集め、凍結乾燥し、そしてアッセイのために使用した. Bio−Sil TSK−250のカラムからウシの脳
のEBZDの溶出プロフィールを決定した, BZD結
合の競争活性は、リボヌクレアーゼ(肝〜11 , 5
00)よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一の
ピークとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムT
SK−250からの活性フラクション24のクロマトグ
ラフィーの結果、その活性は31〜32%のアセトニト
リルの間で溶出した.分析用逆相カラムに基づく、プー
ルされたフラクション36及び37の再クロマトグラフ
ィーは、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもた
らした。その精製は第1表に要約される. 第1表:ウシの脳のEBZDの精製 粗原料 7851 1.010’ 1.29
100 a:上記のアンセイ条件下で粗シナブトソーム膜への3
11−ジアゼパムの結合に対する40%競争のために必
要とする材料. bニプールされた材料の直接計量による。
s−Cを含む0.1MのTris−アセテート(pH=
8. 0 ) 40xrにおいて24゜Cで16時間消
化した。EBZD :酵素の比は、重量基準で10:1
であった.ペブチドフラグメントを、水中0.05%T
FAから0.045%TFAを含む60%アセトニトリ
ルまでの直線2時間グラジエントを用いてμ−Bond
apak − C + sカラム(Waters)での
rpHPLCによって分離した。ベプチドをモニターし
、モして214nMでのそれらの吸収によって同定し、
集め、凍結乾燥し、そしてアッセイのために使用した. Bio−Sil TSK−250のカラムからウシの脳
のEBZDの溶出プロフィールを決定した, BZD結
合の競争活性は、リボヌクレアーゼ(肝〜11 , 5
00)よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一の
ピークとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムT
SK−250からの活性フラクション24のクロマトグ
ラフィーの結果、その活性は31〜32%のアセトニト
リルの間で溶出した.分析用逆相カラムに基づく、プー
ルされたフラクション36及び37の再クロマトグラフ
ィーは、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもた
らした。その精製は第1表に要約される. 第1表:ウシの脳のEBZDの精製 粗原料 7851 1.010’ 1.29
100 a:上記のアンセイ条件下で粗シナブトソーム膜への3
11−ジアゼパムの結合に対する40%競争のために必
要とする材料. bニプールされた材料の直接計量による。
C:280mμでの吸光度から計算された。
d:低い比活性のため、この段階で直接的にアンセイす
ることは不可能であった.この数は、フラクション24
及び25中のTSK−250クロマトグラフィー処理の
後に回収された合計ユニットを示す, 84.2%の収率を伴う969倍の精製を、3段階方法
で達威した.阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した.しかしながら、最大の阻害度は、8−の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに52%に過ぎないこ
とが見出された.Ki値は、3■ジアゼバム又は”H
− RO15−1788のいずれがリガンドとして使用
されても、約5−であることが見出された。
ることは不可能であった.この数は、フラクション24
及び25中のTSK−250クロマトグラフィー処理の
後に回収された合計ユニットを示す, 84.2%の収率を伴う969倍の精製を、3段階方法
で達威した.阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した.しかしながら、最大の阻害度は、8−の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに52%に過ぎないこ
とが見出された.Ki値は、3■ジアゼバム又は”H
− RO15−1788のいずれがリガンドとして使用
されても、約5−であることが見出された。
猜製された蛋白質の均質性は、6Mの尿素の存在におい
てPAGEによって示された。ペプチドの分子量は、1
0.5Kドルトンであると算定された.Laes+s+
liのSDS−PAGE法による精製された蛋白質(ウ
シ又はヒト)の分析もまた、見掛のMr〜7Kドルトン
を有する単一のバンドを与えた.精製されたタンパク質
は、溶離用溶媒として0.1%のTFA と共に、水中
40%アセトニトリルを用いるBjo−Sil TSK
−250カラム(60aa X 7. 5 mの内部直
径)から単一の対称ピークとして出現した.その見掛分
子量は、このゲル浸透クロマトグラフィー法によって約
11.5Kドルトンであることが計算された.この精製
されたヒトの脳のεBZDは、類似する物理化学的特性
及び生物学的特性を示した.シナブトソーム膜への 1
!51−ラベルされた(クロラミン−T法又はBo l
ton及びlfun ter法のいずれかによる)精
製タンパク質の特異的結合は観察されなかった. 旦迎坐仕奄 RIA系を展開して組織抽出物、体液および組織培養細
胞中のEBZDを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シEBZロに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
の115■−ラベル化EBZDの除去を測定した。ウシ
およびヒトのBBZDは、ウシEBZD蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合するIIJ−ラベル化ウ
シEBZDとの競争において同様な能力を示した。この
ことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基が存
在していることを示している.エンドプロティナーゼL
ys−C消化によって得られモして逆相HPLCによっ
て精製されたウシBBZDのペプチドフラグメントはい
ずれもなんらの免疫反応性も示さなかった.従って、f
!BZDの免疫原決定基はエンドブロティナーゼLys
−Cによって生じた単一ペプチドフラグメントのいずれ
にも保有されていない.ラビットの種々の組織中のEB
ZDの分布を下記第2表に示す. 第2表:種々のラ 組織 脳 腎臓 唾液腺 肝臓 胃 結腸 肺臓 肺 心臓 胸腺 膵臓 大腿筋 甲状Jli(Thyroid) ビット組織中のEBZDの分布 K当量/m織1g(湿重) 3.80 3.42 1.76 1.52 1.27 1.05 0.97 0.84 0.73 0.67 0.50 0.37 0.06 N.D. =検出できず. RlA法の詳細は前述してある. 血清または血漿以外の試験組織はすべて、Rl^によっ
て検出されるlliBZDを含有していた.ウシの脳、
牌臓および胸腺は組織1g(湿重)当り約11.5 ,
7. 6および6.8R当量を含有していたが、ヒト
の脳は組織1g(湿重)当り15.7ag当量を含有し
ていることが見い出された.ラビット脳中のEBZDの
濃度は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはる
かに低いものであることが見い出された. E8ZDは
モンキーの脳中にも見い出された。
てPAGEによって示された。ペプチドの分子量は、1
0.5Kドルトンであると算定された.Laes+s+
liのSDS−PAGE法による精製された蛋白質(ウ
シ又はヒト)の分析もまた、見掛のMr〜7Kドルトン
を有する単一のバンドを与えた.精製されたタンパク質
は、溶離用溶媒として0.1%のTFA と共に、水中
40%アセトニトリルを用いるBjo−Sil TSK
−250カラム(60aa X 7. 5 mの内部直
径)から単一の対称ピークとして出現した.その見掛分
子量は、このゲル浸透クロマトグラフィー法によって約
11.5Kドルトンであることが計算された.この精製
されたヒトの脳のεBZDは、類似する物理化学的特性
及び生物学的特性を示した.シナブトソーム膜への 1
!51−ラベルされた(クロラミン−T法又はBo l
ton及びlfun ter法のいずれかによる)精
製タンパク質の特異的結合は観察されなかった. 旦迎坐仕奄 RIA系を展開して組織抽出物、体液および組織培養細
胞中のEBZDを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シEBZロに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
の115■−ラベル化EBZDの除去を測定した。ウシ
およびヒトのBBZDは、ウシEBZD蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合するIIJ−ラベル化ウ
シEBZDとの競争において同様な能力を示した。この
ことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基が存
在していることを示している.エンドプロティナーゼL
ys−C消化によって得られモして逆相HPLCによっ
て精製されたウシBBZDのペプチドフラグメントはい
ずれもなんらの免疫反応性も示さなかった.従って、f
!BZDの免疫原決定基はエンドブロティナーゼLys
−Cによって生じた単一ペプチドフラグメントのいずれ
にも保有されていない.ラビットの種々の組織中のEB
ZDの分布を下記第2表に示す. 第2表:種々のラ 組織 脳 腎臓 唾液腺 肝臓 胃 結腸 肺臓 肺 心臓 胸腺 膵臓 大腿筋 甲状Jli(Thyroid) ビット組織中のEBZDの分布 K当量/m織1g(湿重) 3.80 3.42 1.76 1.52 1.27 1.05 0.97 0.84 0.73 0.67 0.50 0.37 0.06 N.D. =検出できず. RlA法の詳細は前述してある. 血清または血漿以外の試験組織はすべて、Rl^によっ
て検出されるlliBZDを含有していた.ウシの脳、
牌臓および胸腺は組織1g(湿重)当り約11.5 ,
7. 6および6.8R当量を含有していたが、ヒト
の脳は組織1g(湿重)当り15.7ag当量を含有し
ていることが見い出された.ラビット脳中のEBZDの
濃度は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはる
かに低いものであることが見い出された. E8ZDは
モンキーの脳中にも見い出された。
ウシのタンパク質に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。EBZDがヒトの脳脊髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された.ヒト乳癌細胞(MCF 7
)肝癌細胞(HEP 2) 、神経芽腫細胞(MTB
14)、神経膠神経芽腫細胞(CCL 127)および
膠芽腫細胞(H↑810)について計算したところ、そ
れぞれ濃縮細胞(〜10’細胞)lII1当り9.1、
8.9 , 8.6 ,0.32および0.26#1r
当量のEBZDを含有していた。EBZD 1 nは約
6X10”分子を含んでいる.従って、MCP 7.
HEP 2およびHTB 14細胞は細胞1個当り〜5
X10’分子のE!BZDを含有している.従って、E
BZDは補乳動物の組織中に広く分布しており、モして
081 とは異り脳に特有のべブチドではない.広い組
織分布は、EBZDの機能が組織に特異的なものという
よりむしろ一般的なものであろうということを示唆して
いる. 大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ(Vega)神経 視神経 3.4 7.5 5.3 1.3 2.6 l7.4 26.7 l4.3 1.7 16.2 EBZD濃度は前述の如くにRIA によって測定した. 第3表は、RIAによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるEB−ZDの分布を要約している.脳の
領域はすべてEBZD様物質を保有しているが、BBZ
D濃度の実質的な局所的変化があることが示された.試
験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡叢に
おいて見い出され、そして最低濃度は下垂体において見
い出された。
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。EBZDがヒトの脳脊髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された.ヒト乳癌細胞(MCF 7
)肝癌細胞(HEP 2) 、神経芽腫細胞(MTB
14)、神経膠神経芽腫細胞(CCL 127)および
膠芽腫細胞(H↑810)について計算したところ、そ
れぞれ濃縮細胞(〜10’細胞)lII1当り9.1、
8.9 , 8.6 ,0.32および0.26#1r
当量のEBZDを含有していた。EBZD 1 nは約
6X10”分子を含んでいる.従って、MCP 7.
HEP 2およびHTB 14細胞は細胞1個当り〜5
X10’分子のE!BZDを含有している.従って、E
BZDは補乳動物の組織中に広く分布しており、モして
081 とは異り脳に特有のべブチドではない.広い組
織分布は、EBZDの機能が組織に特異的なものという
よりむしろ一般的なものであろうということを示唆して
いる. 大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ(Vega)神経 視神経 3.4 7.5 5.3 1.3 2.6 l7.4 26.7 l4.3 1.7 16.2 EBZD濃度は前述の如くにRIA によって測定した. 第3表は、RIAによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるEB−ZDの分布を要約している.脳の
領域はすべてEBZD様物質を保有しているが、BBZ
D濃度の実質的な局所的変化があることが示された.試
験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡叢に
おいて見い出され、そして最低濃度は下垂体において見
い出された。
EBZDの 命(anale fic) ’r体重2.
3〜2.6kgの雄性ニュージーランドラビットをこの
実験の全体を通じて用いた。ヤコブ(Jacob)等、
ニューロファーマコル.(■肛炒har−maco1、
) (1972年)11:1−16頁に記載されたの
直接穿刺法に若干の変更を施すことによってicν注射
を行なった.動物は、頭蓋に小さな穴(直径0.8閣)
を開ける(ベントバルビタール麻酔下)ことによって実
験の2日前に準備した.この穴は正中線に対して1.
0鴎側方およびプレグマに対して1. 0鵬口吻側に位
置している.実験の日、注射の直前に、皮膚の傷上に局
所麻酔薬を噴霧する。
3〜2.6kgの雄性ニュージーランドラビットをこの
実験の全体を通じて用いた。ヤコブ(Jacob)等、
ニューロファーマコル.(■肛炒har−maco1、
) (1972年)11:1−16頁に記載されたの
直接穿刺法に若干の変更を施すことによってicν注射
を行なった.動物は、頭蓋に小さな穴(直径0.8閣)
を開ける(ベントバルビタール麻酔下)ことによって実
験の2日前に準備した.この穴は正中線に対して1.
0鴎側方およびプレグマに対して1. 0鵬口吻側に位
置している.実験の日、注射の直前に、皮膚の傷上に局
所麻酔薬を噴霧する。
#26の針を頭蓋の表面から12一の深さまで鉛直に挿
入する.正確な位置決めは大脳脊髄液の出現によって指
示される.針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、こ
の針を同じ深さまで再度挿入する.注射は、常に、注射
器微量ビュレットを用いてlO〆の容量で30〜60秒
間にわたって実施する.対照の動物には同容量の滅菌食
塩水を与える.薬剤はすべて滅菌した等張の食塩水中に
溶解し、そしてその遊離塩基として表現される. 動物は一般に実験の2〜3時間前一対の縦仕切り棒(S
tanchion)内に位置させる.結腸温度は、リー
ズーノースランプ・スピードマックス・レコーダー(L
eeds−Northrup Speedosax r
ecorder)上に記録されるように特別に電線が引
かれているYSIスキャンニング・テレサーモメーター
(YSIScanning Telethera+om
eter)に接続されている直腸サーミスタブローブに
よって測定される.実験は22.0±1. 0 ’Cの
常温室内で実施する.興奮活性は立直り反射の回復時間
の短縮によって示される.25■/kgのベントバルビ
タールを静脈内に投与されたラビットは麻酔にかかり、
その麻酔時間の間は自らを正常な直立位置まで動いて戻
すことなく仰向けになっていることができる.ラビット
が仰向けの姿勢をこれ以上続けていることができなくな
った時を立直り反射の回復時間と考えた. 瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した.さらに、ある種の常同的(stereotypi
c)応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した.b EBZD 到星 注射のlO分後、動物は連続的な咀哨反応を開始する.
呼吸は90分から204分まで増加した.運動活性の増
大。機能冗進(hyperreactivity)なし
.痛覚脱失なし. 則虹屋 注射のIO分後、呼吸は98分から65分まで減少.強
迫的咀哨および軽度の興奮.興奮は短時間続いた.a能
冗進なし.痛覚脱失なし.200n 注射の4分後、動物は目を閉じる.呼吸減少(l08分
から50分まで〉.注射のIO分後、立直り反射欠如.
動物は深い麻酔状態にはなかった.bEBZD投与の2
8分後、立直り反射は回復した.痛覚欠如なし。
入する.正確な位置決めは大脳脊髄液の出現によって指
示される.針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、こ
の針を同じ深さまで再度挿入する.注射は、常に、注射
器微量ビュレットを用いてlO〆の容量で30〜60秒
間にわたって実施する.対照の動物には同容量の滅菌食
塩水を与える.薬剤はすべて滅菌した等張の食塩水中に
溶解し、そしてその遊離塩基として表現される. 動物は一般に実験の2〜3時間前一対の縦仕切り棒(S
tanchion)内に位置させる.結腸温度は、リー
ズーノースランプ・スピードマックス・レコーダー(L
eeds−Northrup Speedosax r
ecorder)上に記録されるように特別に電線が引
かれているYSIスキャンニング・テレサーモメーター
(YSIScanning Telethera+om
eter)に接続されている直腸サーミスタブローブに
よって測定される.実験は22.0±1. 0 ’Cの
常温室内で実施する.興奮活性は立直り反射の回復時間
の短縮によって示される.25■/kgのベントバルビ
タールを静脈内に投与されたラビットは麻酔にかかり、
その麻酔時間の間は自らを正常な直立位置まで動いて戻
すことなく仰向けになっていることができる.ラビット
が仰向けの姿勢をこれ以上続けていることができなくな
った時を立直り反射の回復時間と考えた. 瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した.さらに、ある種の常同的(stereotypi
c)応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した.b EBZD 到星 注射のlO分後、動物は連続的な咀哨反応を開始する.
呼吸は90分から204分まで増加した.運動活性の増
大。機能冗進(hyperreactivity)なし
.痛覚脱失なし. 則虹屋 注射のIO分後、呼吸は98分から65分まで減少.強
迫的咀哨および軽度の興奮.興奮は短時間続いた.a能
冗進なし.痛覚脱失なし.200n 注射の4分後、動物は目を閉じる.呼吸減少(l08分
から50分まで〉.注射のIO分後、立直り反射欠如.
動物は深い麻酔状態にはなかった.bEBZD投与の2
8分後、立直り反射は回復した.痛覚欠如なし。
8日齢のヒナA (ch icken)の胚から心室を
単個細胞に分離し3日間回転培養に付した。この方法に
より、直径約150ミクロンの小さな規則的球形の細胞
が生ずる.集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合して
おり、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダ
ル(Myrdal)およびデハーン(DeHaan)、
ジエイ.セル.フィズ. (J.Ce旦迂社h)(19
83年)旦互319〜325頁〕。電気生理学的特性を
基準にすれば、この調製物は威体の噛乳動物のブルキン
エ線維、主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダルおよ
びデハーン、ディ・イニシエイション・オヴ・ザ・ハー
トビート(The Initiationof the
Heartbeat)デニス・ノーブル(Dents
Noble)編、1975年、オツクスフォート・ユ
ニバーシティ・プレス社(Oxford Univer
sity Press) 、ロンドン、p. 7 )
.これらの集塊は24℃で平衡化しbEBZDを用いて
24時間処理した.2つの個別の実験において、100
x/dの量で処理した集塊の収縮速度は対照と有意に相
違した.これを以下に示す.実験1: (測定された収縮速度(秒)/5回の収縮間間隔)N
平 均 標準偏差 SE MEAN未処理 14
11.48 1,44 0.38処
理 14 7,94 2.04 0.55実験2
: N 平 均 標準偏差 SR Ml!AN未処理
13 24.59 3.18 0.
88処理 12 19.33 2.37 0.6
8各実験において、スチューデントTテストによれば、
処理された母集団は有意に未処理の母集団と異なってい
る.これら2つの母集団が同じものであるという確率は
0.0001より小さい(p = 0.0000).起
iJl定 ウシおよびヒトのEBZDのアミノ酸配列を、(a)エ
ンドプロティナーゼリシンC、(b)キモトリブシン、
(C)スタフィロコッカル・アウレウス(Sta h
Iococcal aureus) VBおよび(d)
臭化シアンを用いたbEBZDおよびht!BZDの消
化により得られたペプチドのマイクロシークエンス分析
によって決定した.ペプチドフラグメントは揮発性溶剤
を用いてrpHPLCによって精製した.アミノ末端を
ブロックしたべブチドを12N HCj!中で周囲温度
において16時間インキユベーションした.次いで、試
料を凍結乾燥によって乾燥させた.ベプチドを、470
A型気相プロテインシークエンサー(ProteinS
equencer) (アブライド・バイオシステムズ
社(App目ed 8josystess,Inc.)
)による自動反復エドマン分解に付した, rpFIP
Lcによってフェニルチオヒダントインアミノ酸を分析
した. これとは別に、蛋白質(ウシおよびヒトEBZD )ま
たはベブチドを、6NHCffiを用いて105“Cで
16〜20時間減圧において加水分解した.得られたア
ミノ酸をフエニルチオカルバモイル誘導体に転化しビコ
(Pico)TAG システム〔ウォーターズ・アソシ
エーツ(WaLers Associates) )に
よって分析した。フエニルチオカルバモイルアミノ酸を
254nMの吸光度によって検出した。
単個細胞に分離し3日間回転培養に付した。この方法に
より、直径約150ミクロンの小さな規則的球形の細胞
が生ずる.集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合して
おり、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダ
ル(Myrdal)およびデハーン(DeHaan)、
ジエイ.セル.フィズ. (J.Ce旦迂社h)(19
83年)旦互319〜325頁〕。電気生理学的特性を
基準にすれば、この調製物は威体の噛乳動物のブルキン
エ線維、主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダルおよ
びデハーン、ディ・イニシエイション・オヴ・ザ・ハー
トビート(The Initiationof the
Heartbeat)デニス・ノーブル(Dents
Noble)編、1975年、オツクスフォート・ユ
ニバーシティ・プレス社(Oxford Univer
sity Press) 、ロンドン、p. 7 )
.これらの集塊は24℃で平衡化しbEBZDを用いて
24時間処理した.2つの個別の実験において、100
x/dの量で処理した集塊の収縮速度は対照と有意に相
違した.これを以下に示す.実験1: (測定された収縮速度(秒)/5回の収縮間間隔)N
平 均 標準偏差 SE MEAN未処理 14
11.48 1,44 0.38処
理 14 7,94 2.04 0.55実験2
: N 平 均 標準偏差 SR Ml!AN未処理
13 24.59 3.18 0.
88処理 12 19.33 2.37 0.6
8各実験において、スチューデントTテストによれば、
処理された母集団は有意に未処理の母集団と異なってい
る.これら2つの母集団が同じものであるという確率は
0.0001より小さい(p = 0.0000).起
iJl定 ウシおよびヒトのEBZDのアミノ酸配列を、(a)エ
ンドプロティナーゼリシンC、(b)キモトリブシン、
(C)スタフィロコッカル・アウレウス(Sta h
Iococcal aureus) VBおよび(d)
臭化シアンを用いたbEBZDおよびht!BZDの消
化により得られたペプチドのマイクロシークエンス分析
によって決定した.ペプチドフラグメントは揮発性溶剤
を用いてrpHPLCによって精製した.アミノ末端を
ブロックしたべブチドを12N HCj!中で周囲温度
において16時間インキユベーションした.次いで、試
料を凍結乾燥によって乾燥させた.ベプチドを、470
A型気相プロテインシークエンサー(ProteinS
equencer) (アブライド・バイオシステムズ
社(App目ed 8josystess,Inc.)
)による自動反復エドマン分解に付した, rpFIP
Lcによってフェニルチオヒダントインアミノ酸を分析
した. これとは別に、蛋白質(ウシおよびヒトEBZD )ま
たはベブチドを、6NHCffiを用いて105“Cで
16〜20時間減圧において加水分解した.得られたア
ミノ酸をフエニルチオカルバモイル誘導体に転化しビコ
(Pico)TAG システム〔ウォーターズ・アソシ
エーツ(WaLers Associates) )に
よって分析した。フエニルチオカルバモイルアミノ酸を
254nMの吸光度によって検出した。
硅p坐牝ヱ量遣一
bEBZDおよびhEBZDのアミノ酸配置を、68l
lCfで加水分解した後、アミノ酸自動分析装置を用い
て決定した。これらの蛋白質には、システインを除くす
べての共通のアミノ酸が存在していた。これらのデータ
から計算された最小分子量は約9,900であり、SO
S−r’AGHによってra認された値と一致する。
lCfで加水分解した後、アミノ酸自動分析装置を用い
て決定した。これらの蛋白質には、システインを除くす
べての共通のアミノ酸が存在していた。これらのデータ
から計算された最小分子量は約9,900であり、SO
S−r’AGHによってra認された値と一致する。
N一末端アミノ酸は、敗サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、bEB
ZDおよびhEBZDの末端アξノ基がブロックされて
いることを示唆している.配列は実験の部に記載のよう
に決定した, bEBZDおよびhEBZDの配列を
、公表されているDBIの配列と比較しながら以下に示
す. r−DBr KKKY. .bEBZロ
配列と異なるhEBZDアミノ酸配列中の残基には下線
を引いた. hEBZDのアミノ酸配列とbEBZロのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのEBZDが数個の保存的
置m基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している.6個のアミノ酸置換基の
中の5個がDNAレベルにおけるたった1個の塩基変化
と一致する.これらの結果は、ヒトおよびウシのEBZ
I)が異なる種の間で構造的に高度に保存されているこ
とを立証している。
した場合でさえ検出されなかった。このことは、bEB
ZDおよびhEBZDの末端アξノ基がブロックされて
いることを示唆している.配列は実験の部に記載のよう
に決定した, bEBZDおよびhEBZDの配列を
、公表されているDBIの配列と比較しながら以下に示
す. r−DBr KKKY. .bEBZロ
配列と異なるhEBZDアミノ酸配列中の残基には下線
を引いた. hEBZDのアミノ酸配列とbEBZロのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのEBZDが数個の保存的
置m基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している.6個のアミノ酸置換基の
中の5個がDNAレベルにおけるたった1個の塩基変化
と一致する.これらの結果は、ヒトおよびウシのEBZ
I)が異なる種の間で構造的に高度に保存されているこ
とを立証している。
ウシの&Il織から単離したポリ (A” )RNAを
cDNA合戒用の鋳型として使用した。第1 11のc
DNA合威はオリゴ(dT)とトリ骨髄芽球症ウィルス
(AMν)逆転写酵素とを使用して実施した.第2鎖は
大腸菌RNase H , DNAポリメラーゼ■お
よびDNAリガーゼ(NAD’ )を使用して合威した
a Slヌクレアーゼ消化および続いて大腸菌DNAポ
リメラーゼIの大断片によるフィルイン反応によって2
本鎖cDNAを平滑末端化した。ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼを使用して、デオキシ
グアニン残基約15個をcDNAの3′末端に酵素的に
加えた.次に、このGの尾部をもつcDN^をA−50
カラム上でサイズ分別して、500塩基対未満のcDN
Aと導入されなかったデオキシグアニン残基とを除去し
た.次に、プールしたcDN八の濃縮を、EcoRIで
消化したλgt.10 0NAの存在下におけるエタ
ノール沈殿によって実施した。
cDNA合戒用の鋳型として使用した。第1 11のc
DNA合威はオリゴ(dT)とトリ骨髄芽球症ウィルス
(AMν)逆転写酵素とを使用して実施した.第2鎖は
大腸菌RNase H , DNAポリメラーゼ■お
よびDNAリガーゼ(NAD’ )を使用して合威した
a Slヌクレアーゼ消化および続いて大腸菌DNAポ
リメラーゼIの大断片によるフィルイン反応によって2
本鎖cDNAを平滑末端化した。ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼを使用して、デオキシ
グアニン残基約15個をcDNAの3′末端に酵素的に
加えた.次に、このGの尾部をもつcDN^をA−50
カラム上でサイズ分別して、500塩基対未満のcDN
Aと導入されなかったデオキシグアニン残基とを除去し
た.次に、プールしたcDN八の濃縮を、EcoRIで
消化したλgt.10 0NAの存在下におけるエタ
ノール沈殿によって実施した。
影遼RIで切断したλgt.IOに対するGの尾部をも
つcDNAの連結反応は、3′末端にデオキシシトシン
12個を含みそして5′末端にEcoRI開裂DNAの
1本鎖突出部に相補的な配列(AATT)を含む1本鎖
オリゴヌクレオチドリン力一を使用して新規の方法によ
って実施した.連結したDNAのin vitroパ
ッケージングの後で、組換えファージを大腸菌株C60
0 rk− tak” Iff l中へ導入した.これ
は、組換え(野生型でない)フエージに感染すると細胞
溶菌される。その方法により、放射性ja識合戒オリゴ
ヌクレオチド〔17ヌクレオチド長:その配列はウシH
BZD中に見出される6個の連続するアミノ酸(KWD
AWN)によって推定した〕を使用し、プラークからの
DNAを二重にスクリーニングした。コドンが不明なの
で、オリゴヌクレオチドの32種の縮重プールとしてM
SIを合成した。MS1によるスクリーニングにより陽
性のブラークを得これをブラーク精製し、そして1.8
kbの挿入部を含有することが示された。この挿入部を
プラスミドpEMBL中にサブクローン化した.これを
pMP1と称する.挿入部を制限地図化した後、続いて
適当な数片をM13株中に更にサブクローン化し、そし
てSanger−Coulserのジデオキシ法によっ
て配列を決めた.pMPI中に含まれるcDNAは、M
SIの種とほとんど同し挿入部の5′末端から約300
塩基対のDNA配列を含んでいた.更に、pMP1のヌ
クレオチド配列により、配列が決定されているウシEB
ZDに関して決定したアミノ酸配列と類似の(但し、同
一ではない)アミノ酸配列が予想された。これらの2種
の蛋白質が密接に関連していることはアミノ酸配列の頴
著な保存性によって示唆されている。配列が決まってい
るEBZDからアミノ酸3個を除去することにより、残
りのアミノ酸をpMPJの配列と関連させることができ
、この結果アミノ酸43%が保存される。更に、多数の
変化が保存的置換を含んでいる(前記の記載を参照され
たい)。
つcDNAの連結反応は、3′末端にデオキシシトシン
12個を含みそして5′末端にEcoRI開裂DNAの
1本鎖突出部に相補的な配列(AATT)を含む1本鎖
オリゴヌクレオチドリン力一を使用して新規の方法によ
って実施した.連結したDNAのin vitroパ
ッケージングの後で、組換えファージを大腸菌株C60
0 rk− tak” Iff l中へ導入した.これ
は、組換え(野生型でない)フエージに感染すると細胞
溶菌される。その方法により、放射性ja識合戒オリゴ
ヌクレオチド〔17ヌクレオチド長:その配列はウシH
BZD中に見出される6個の連続するアミノ酸(KWD
AWN)によって推定した〕を使用し、プラークからの
DNAを二重にスクリーニングした。コドンが不明なの
で、オリゴヌクレオチドの32種の縮重プールとしてM
SIを合成した。MS1によるスクリーニングにより陽
性のブラークを得これをブラーク精製し、そして1.8
kbの挿入部を含有することが示された。この挿入部を
プラスミドpEMBL中にサブクローン化した.これを
pMP1と称する.挿入部を制限地図化した後、続いて
適当な数片をM13株中に更にサブクローン化し、そし
てSanger−Coulserのジデオキシ法によっ
て配列を決めた.pMPI中に含まれるcDNAは、M
SIの種とほとんど同し挿入部の5′末端から約300
塩基対のDNA配列を含んでいた.更に、pMP1のヌ
クレオチド配列により、配列が決定されているウシEB
ZDに関して決定したアミノ酸配列と類似の(但し、同
一ではない)アミノ酸配列が予想された。これらの2種
の蛋白質が密接に関連していることはアミノ酸配列の頴
著な保存性によって示唆されている。配列が決まってい
るEBZDからアミノ酸3個を除去することにより、残
りのアミノ酸をpMPJの配列と関連させることができ
、この結果アミノ酸43%が保存される。更に、多数の
変化が保存的置換を含んでいる(前記の記載を参照され
たい)。
pMP1の発見は、ウシEBZDが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している.最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をp
MP1がコードしている点である。
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している.最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をp
MP1がコードしている点である。
なぜなら、リーディングフレームが、その蛋白質の公知
の末端アミノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである. 聾覗遣仁王■又』− ウシの牌臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたcDN^は0.6kbpの挿入部であり、これをp
EMBL中にクローン化してpEBZI)を得た.配列
決定を行なったところ、pMP1と相同のコード配列が
得られた。ウシのエンドゼビン(bEBZD)をコード
するDNA断片を、』劇1消化およびNae I消化を
組合せることにより、cDNAプラスミド(EBZD)
から切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精製
し、発現ベクター(pSM 1 . 2)中にStu
1部位に挿入した,psM1.2発現ベクターの形或は
、pBR322の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺
伝子(Bolivar等、Gene(1977) 2
: 95) 、pTR213のIacプロモーターおよ
びリポソーマル結合部位(Roberts等、l’ro
c. Nat1、 Acad. Sci. LISA(
1979)76: 160−IG4 )をpt,c3
ooのi −Z融合遺伝子(GuarcnLc等、Ce
ll(1980)20: 543 553 )にスプ
ライシングすることによって行なった。得られたプラス
ミドはクローニング部位例えばStu 1部位に揮人さ
れた外来遺伝子を融合蛋白質として発現することができ
る。この構造において、EBZDに関する全コード配列
は、cro蛋白質の最初の2個のアミノ酸をコードする
ON八に位相を合わせて融合された。ブラスミドpsB
108は挿入部を正しい配向で含んでおり、プラスミド
psB103は挿入部を誤った配向で含んでおり、そし
てプラスミドpsB125は神入部を含んでいない。各
種のプラスミドを含む大腸菌HBIOI クローンを対
数期まで増殖させ、そして振とうしなから37゜Cで2
時間、最終濃度l1までIPTGを加えることによって
誘導した。この細胞を遠心によって収集し、リゾチーム
洗浄剤処理によって溶菌した。基本的に、溶菌物は上清
(細胞質ゾル)とペレット(細胞質内封人体)とに分け
て、免疫化学的技術によって分析することができる。
の末端アミノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである. 聾覗遣仁王■又』− ウシの牌臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたcDN^は0.6kbpの挿入部であり、これをp
EMBL中にクローン化してpEBZI)を得た.配列
決定を行なったところ、pMP1と相同のコード配列が
得られた。ウシのエンドゼビン(bEBZD)をコード
するDNA断片を、』劇1消化およびNae I消化を
組合せることにより、cDNAプラスミド(EBZD)
から切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精製
し、発現ベクター(pSM 1 . 2)中にStu
1部位に挿入した,psM1.2発現ベクターの形或は
、pBR322の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺
伝子(Bolivar等、Gene(1977) 2
: 95) 、pTR213のIacプロモーターおよ
びリポソーマル結合部位(Roberts等、l’ro
c. Nat1、 Acad. Sci. LISA(
1979)76: 160−IG4 )をpt,c3
ooのi −Z融合遺伝子(GuarcnLc等、Ce
ll(1980)20: 543 553 )にスプ
ライシングすることによって行なった。得られたプラス
ミドはクローニング部位例えばStu 1部位に揮人さ
れた外来遺伝子を融合蛋白質として発現することができ
る。この構造において、EBZDに関する全コード配列
は、cro蛋白質の最初の2個のアミノ酸をコードする
ON八に位相を合わせて融合された。ブラスミドpsB
108は挿入部を正しい配向で含んでおり、プラスミド
psB103は挿入部を誤った配向で含んでおり、そし
てプラスミドpsB125は神入部を含んでいない。各
種のプラスミドを含む大腸菌HBIOI クローンを対
数期まで増殖させ、そして振とうしなから37゜Cで2
時間、最終濃度l1までIPTGを加えることによって
誘導した。この細胞を遠心によって収集し、リゾチーム
洗浄剤処理によって溶菌した。基本的に、溶菌物は上清
(細胞質ゾル)とペレット(細胞質内封人体)とに分け
て、免疫化学的技術によって分析することができる。
発現したEBZD融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつEBZD発現ベ
クター(p58101111)を含む大腸菌クローンだ
けが高いレベルのEBZDポリペプチドを産生ずる。大
部分のcro−EBZDは上清分画(細胞質ゾル)中に
見出された。ペレット分画(細胞質封入体)中には、検
出可能な量だけが見出された。一方、psnl03また
はpsB125クローンのいずれの溶菌物においてもc
ro−EBZDは検出されなかった。IPTGによる誘
導後に、細胞培養物11当り0. 5 tpgのcro
εBZDが産生されたものと推定される。
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつEBZD発現ベ
クター(p58101111)を含む大腸菌クローンだ
けが高いレベルのEBZDポリペプチドを産生ずる。大
部分のcro−EBZDは上清分画(細胞質ゾル)中に
見出された。ペレット分画(細胞質封入体)中には、検
出可能な量だけが見出された。一方、psnl03また
はpsB125クローンのいずれの溶菌物においてもc
ro−EBZDは検出されなかった。IPTGによる誘
導後に、細胞培養物11当り0. 5 tpgのcro
εBZDが産生されたものと推定される。
[1io−Sil TSκ−250分取用カラム(60
X 2. 1 c+++)を高圧液体クロマトグラフィ
−([’LC)システム(Waters Associ
ates)に取付けた。トリフルオロ酢酸(TF八)0
.1%を含む水中の40%アセトニトリル中に粗製分画
を8■/ rnlの濃度で熔解した。カラムを0. I
%TPAを含む40%アセトニトリルで平衡化した。ア
リコート2−(タンパク質16■)を注入し、最終濃度
0. 1%のTFAを含む水中の40%アセトニトリル
移動相によって均一に展開を実施した。RFの位置(分
画23)が分かった後で、前記の操作を二〜三百回行な
った。分画を監視する方法は後述する細胞増殖調節アッ
セイであった。前記の漫透クロマトグラフィーから脳因
子(Gl^)の見掛けの分子量を計算したところ、約1
8kDa lであった。
X 2. 1 c+++)を高圧液体クロマトグラフィ
−([’LC)システム(Waters Associ
ates)に取付けた。トリフルオロ酢酸(TF八)0
.1%を含む水中の40%アセトニトリル中に粗製分画
を8■/ rnlの濃度で熔解した。カラムを0. I
%TPAを含む40%アセトニトリルで平衡化した。ア
リコート2−(タンパク質16■)を注入し、最終濃度
0. 1%のTFAを含む水中の40%アセトニトリル
移動相によって均一に展開を実施した。RFの位置(分
画23)が分かった後で、前記の操作を二〜三百回行な
った。分画を監視する方法は後述する細胞増殖調節アッ
セイであった。前記の漫透クロマトグラフィーから脳因
子(Gl^)の見掛けの分子量を計算したところ、約1
8kDa lであった。
TSK−250 の゛ 1 クロマトグラフィ
−15試行からのTSK−250画分23をプールした
(容量75d)。プールされた材料を水中0. 1%T
FAにより2倍に希釈した。この混合物を、水中0.1
%TF八によりあらかじめ平衡化されたμ−ボンダパッ
クーC.カラA(78nun内径X 300mm)に室
温にて均一に注入した。一次溶剤0. 1%TFAと二
次溶剤0. 1%TF八を{’Bうアセトニトリルとの
間で直線グラジエントを用いた。グラジエント条件は2
0分間にO〜28%、 140分間に28〜42%、1
0分間に42〜52%、そして次に6分間に52〜10
0%であった.すべての溶剤はHPLCグレードであっ
た。4−の画分を集めた。各画分のアリコートを50n
のBSA と共に乾燥し、モしてGl^についてアッセ
イした。
−15試行からのTSK−250画分23をプールした
(容量75d)。プールされた材料を水中0. 1%T
FAにより2倍に希釈した。この混合物を、水中0.1
%TF八によりあらかじめ平衡化されたμ−ボンダパッ
クーC.カラA(78nun内径X 300mm)に室
温にて均一に注入した。一次溶剤0. 1%TFAと二
次溶剤0. 1%TF八を{’Bうアセトニトリルとの
間で直線グラジエントを用いた。グラジエント条件は2
0分間にO〜28%、 140分間に28〜42%、1
0分間に42〜52%、そして次に6分間に52〜10
0%であった.すべての溶剤はHPLCグレードであっ
た。4−の画分を集めた。各画分のアリコートを50n
のBSA と共に乾燥し、モしてGl^についてアッセ
イした。
CIAの2個のピークを貯蔵した。第1の活性(α)は
32〜33.5%の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方第2のピーク(β)は34.5〜36%の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
桔製は次のようにして行った。
32〜33.5%の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方第2のピーク(β)は34.5〜36%の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
桔製は次のようにして行った。
IO試行からの活性画分30及び3lをプールし、そし
て0.1%TFAにより2倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμ−ボンダパックカラム(78 X 300腑
)に均一に適用し、モしてカラムを0. 1%TFAで
洗浄しそして平衡化した。流速は1d/分であり、そし
てチャートスピードはQ.lc+s/分であった。やは
り、第l溶剤0. 1%TFAと第2溶剤0. 1%↑
F^の濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジ
エントを用いた。グラジエント条件は、40分間に0〜
30%、240分間に30〜38%、そして20分間に
38〜100%であった.最初の12画分は6一であり
、そして次に4一画分を集めた。アリコートをCIAに
ついてアッセイした。活性は32〜33.5%の間のア
セトニトリル濃度において?容出した。
て0.1%TFAにより2倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμ−ボンダパックカラム(78 X 300腑
)に均一に適用し、モしてカラムを0. 1%TFAで
洗浄しそして平衡化した。流速は1d/分であり、そし
てチャートスピードはQ.lc+s/分であった。やは
り、第l溶剤0. 1%TFAと第2溶剤0. 1%↑
F^の濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジ
エントを用いた。グラジエント条件は、40分間に0〜
30%、240分間に30〜38%、そして20分間に
38〜100%であった.最初の12画分は6一であり
、そして次に4一画分を集めた。アリコートをCIAに
ついてアッセイした。活性は32〜33.5%の間のア
セトニトリル濃度において?容出した。
両分30〜32をプールした。12dの0.1%TFA
をプールされた両分に加えた。混合物(24dを、0.
1%TFAで平衡化された分析用μ−ボンダバックC
.カラム( 3. 9 x 300an)上に均一に適
用した.,流速及びチャートスピードはそれぞれ0.
4 111f/分及び0.1cm/分であった。やはり
、第1溶剤0. l%TFAと第2溶剤0. 1%TF
^の濃度を有するアセトニトリルの間で直線グラジエン
トを用いた。
をプールされた両分に加えた。混合物(24dを、0.
1%TFAで平衡化された分析用μ−ボンダバックC
.カラム( 3. 9 x 300an)上に均一に適
用した.,流速及びチャートスピードはそれぞれ0.
4 111f/分及び0.1cm/分であった。やはり
、第1溶剤0. l%TFAと第2溶剤0. 1%TF
^の濃度を有するアセトニトリルの間で直線グラジエン
トを用いた。
グラジエント条件は、25分間に0〜30%、200分
間に30〜38%、そして25分間に38〜100%で
あった。2−の画分を集めた。画分のアリコートをGT
Aについてアッセイした。活性は分析用C.カラムから
、約34%のアセトニトリル濃度において溶出した。
間に30〜38%、そして25分間に38〜100%で
あった。2−の画分を集めた。画分のアリコートをGT
Aについてアッセイした。活性は分析用C.カラムから
、約34%のアセトニトリル濃度において溶出した。
画分29−31をプールし、そして0. 1%TPAで
2倍に希釈し、モしてμ−ボンダバックC.カラム(3
.9X 300mm)に適用した。第1溶剤0. l%
TFAと第2溶剤0. 1%TPAの濃度を有するn−
プロバノールとの間の直線グラジエントを用いた。グラ
ジエント条件は、40分間に0〜18%、225分間に
18〜27%、そして20分間に27〜35%であった
。流速は0.4−/分であり、そしてチャートスピード
は0.1cm/分に設定された。両分を集め、そしてア
リコートをGl^についてアッセイした。活性は約23
%のn−プロパノール濃度において溶出した.両分28
及び29をプールし、そしてO.l%TPAにより5倍
希釈し、そしてO. l%TFAの濃度を有するn−プ
ロバノールを第2?fI剤として用いてμ−ボンダバッ
クC.カラム(319X 300+nm)上で再クロマ
トグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジエン
ト条件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初の8
個の両分は6II1であり、そして1. 6 dの両分
を集めた。各両分のアリコートをCIAについてアッセ
イした。ほとんどの活性が両分15〜l7に現われた。
2倍に希釈し、モしてμ−ボンダバックC.カラム(3
.9X 300mm)に適用した。第1溶剤0. l%
TFAと第2溶剤0. 1%TPAの濃度を有するn−
プロバノールとの間の直線グラジエントを用いた。グラ
ジエント条件は、40分間に0〜18%、225分間に
18〜27%、そして20分間に27〜35%であった
。流速は0.4−/分であり、そしてチャートスピード
は0.1cm/分に設定された。両分を集め、そしてア
リコートをGl^についてアッセイした。活性は約23
%のn−プロパノール濃度において溶出した.両分28
及び29をプールし、そしてO.l%TPAにより5倍
希釈し、そしてO. l%TFAの濃度を有するn−プ
ロバノールを第2?fI剤として用いてμ−ボンダバッ
クC.カラム(319X 300+nm)上で再クロマ
トグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジエン
ト条件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初の8
個の両分は6II1であり、そして1. 6 dの両分
を集めた。各両分のアリコートをCIAについてアッセ
イした。ほとんどの活性が両分15〜l7に現われた。
画分15〜17は約15Jlgの蛋白質及び約230X
10″ユニットのCIAを含有していた。
10″ユニットのCIAを含有していた。
この画分をtlPLc CB’画分とした。最終精製
画分は、CCL64を拭験細胞として用いた蛋白質n当
り15.33 X to3ユニソトの比活性を有してい
た。
画分は、CCL64を拭験細胞として用いた蛋白質n当
り15.33 X to3ユニソトの比活性を有してい
た。
次の第4表は結果を要約する.
第4表 ウシ脳因子の精製
粗製物
TSK−250
+11”I,C−C18’ 0.015630
3,680
1,551
2. 760
230
0.421
4.38
15.333.00
100
181
14.8
(傘) CCL64細胞のDNAへの1251−デオキ
シウリジンの取り込みを50%阻害するために必要な材
料アッセイはNunc96ウエルプレート(Kas+s
Lrupvcj90, DK−COOO+ Rosk
ilde ,デンマーク)中で行った。ヒト肺癌細胞(
A549)又はミンクの肺細胞(CCL64)を試験細
胞として使用した.10%ウシ胎児血清(FCS)及び
ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)(0.57
■/Idずつ)及びグルタミンを伴うドルベコ改変イー
グル培地(DMEM) 50 Il1中3.5×103
細胞を、端のウエル以外のすべてのウェルに導入した。
シウリジンの取り込みを50%阻害するために必要な材
料アッセイはNunc96ウエルプレート(Kas+s
Lrupvcj90, DK−COOO+ Rosk
ilde ,デンマーク)中で行った。ヒト肺癌細胞(
A549)又はミンクの肺細胞(CCL64)を試験細
胞として使用した.10%ウシ胎児血清(FCS)及び
ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)(0.57
■/Idずつ)及びグルタミンを伴うドルベコ改変イー
グル培地(DMEM) 50 Il1中3.5×103
細胞を、端のウエル以外のすべてのウェルに導入した。
端のウエルには50mのPBSを導入し、そしてプレー
トを37゜Cにてインキユベートした。
トを37゜Cにてインキユベートした。
試験サンプルを、10%FCS , P/S及びグルタ
ミンを含むDMEM中に懸濁して3連試験を行った.4
日後、50mの試験サンプルを各試験ウエルに加え、他
方対照ウエルには50ttlの培地のみを加えた。プレ
ートを37゜Cにて3日間インキユベートした。4日目
に、isl−ヨード−2′−デオキシウリジンの溶液(
(4Ci/■−0. 5mCi /xtl (0. I
Jアイソトープ/ ml、10%FCS SP/S,
グルタミンを含有するDMEM中)100μlを各ウエ
ルに加え、モしてフ゜レートを37゜Cにてインキユヘ
ートした。5日目に、培地をウエルから吸引し、200
I1!のPBSで1回洗浄した。次に、200 Il
lのメタノールを各ウエルに加え、プレートをlO分間
インキユベートし、そしてメタノールを吸引により除去
した.水酸化ナトリウム(200pI, IM)を各
ウエルに加え、プレートを30分間37’Cにてインキ
ユベートし、そして次に水酸化ナトリウムをタイターテ
ック(Titertec)プラグ(フロー・ラブス)に
より取り出した.プラグを12 X 75011のプラ
スチックチューブに移し、そして放射能を定量測定する
ためにT一カウンターで計数した。
ミンを含むDMEM中に懸濁して3連試験を行った.4
日後、50mの試験サンプルを各試験ウエルに加え、他
方対照ウエルには50ttlの培地のみを加えた。プレ
ートを37゜Cにて3日間インキユベートした。4日目
に、isl−ヨード−2′−デオキシウリジンの溶液(
(4Ci/■−0. 5mCi /xtl (0. I
Jアイソトープ/ ml、10%FCS SP/S,
グルタミンを含有するDMEM中)100μlを各ウエ
ルに加え、モしてフ゜レートを37゜Cにてインキユヘ
ートした。5日目に、培地をウエルから吸引し、200
I1!のPBSで1回洗浄した。次に、200 Il
lのメタノールを各ウエルに加え、プレートをlO分間
インキユベートし、そしてメタノールを吸引により除去
した.水酸化ナトリウム(200pI, IM)を各
ウエルに加え、プレートを30分間37’Cにてインキ
ユベートし、そして次に水酸化ナトリウムをタイターテ
ック(Titertec)プラグ(フロー・ラブス)に
より取り出した.プラグを12 X 75011のプラ
スチックチューブに移し、そして放射能を定量測定する
ためにT一カウンターで計数した。
ソフトアガー・コロニー アッセイ
10%ウシ血清を含有するDMEM中0.5%寒天(ア
ガーノーブル;ディフコラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン)の2.0一の基層を60nmのコスター組織
培養皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混合物、1. O
xlO’ A549^g3 (ソフトアガー増殖クロ
ーン3)細胞及び2連の種々の濃度の試験されるべきサ
ンプルを含有する0.3%寒天を加えた。
ガーノーブル;ディフコラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン)の2.0一の基層を60nmのコスター組織
培養皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混合物、1. O
xlO’ A549^g3 (ソフトアガー増殖クロ
ーン3)細胞及び2連の種々の濃度の試験されるべきサ
ンプルを含有する0.3%寒天を加えた。
プレートを空気中5%CO.の加湿雰囲気中で37゜C
にてインキユベートし、そして7日後に適切な補充物を
含有する0.3%寒天2. 0 dの添加により再供給
した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして
低倍率の無作為の視野5個当り6細胞より多いコロニー
の数を7日及び14日後に計数した。
にてインキユベートし、そして7日後に適切な補充物を
含有する0.3%寒天2. 0 dの添加により再供給
した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして
低倍率の無作為の視野5個当り6細胞より多いコロニー
の数を7日及び14日後に計数した。
コロニーノ 率アッセイ
このアッセイは6ウエルーファルコンプレート( 9.
6 crAの面積/ウエル)中で行った。A549細
胞(200)を各ウエル中、10%FCS , P/S
及びグルタミンを含むl allのDMEM中にプレー
トした。プレートした直後に、1. 0 tttlの培
地中種々の濃度の試験材料を2連で加えた。対照ウエル
には試験材料をなんら含まない1. 0 dの培地のみ
を加えた。プレート空気中5%CO2の加湿雰聞気中3
7゜Cにて10日間インキユベートし、50%メタノー
ル中0.2%メチレンプル−1.0−を各ウエルに添加
し、そして20分間放置し、染料を除去し、そして各ウ
エルを0.1dの水で2回洗浄し、そして空気乾燥した
。
6 crAの面積/ウエル)中で行った。A549細
胞(200)を各ウエル中、10%FCS , P/S
及びグルタミンを含むl allのDMEM中にプレー
トした。プレートした直後に、1. 0 tttlの培
地中種々の濃度の試験材料を2連で加えた。対照ウエル
には試験材料をなんら含まない1. 0 dの培地のみ
を加えた。プレート空気中5%CO2の加湿雰聞気中3
7゜Cにて10日間インキユベートし、50%メタノー
ル中0.2%メチレンプル−1.0−を各ウエルに添加
し、そして20分間放置し、染料を除去し、そして各ウ
エルを0.1dの水で2回洗浄し、そして空気乾燥した
。
コロニーのサイズ及び数を定量測定した。
生理ヱ迫且責
DNA合成の50%阻害が、それぞれ98n/d、21
tri/yd及び95ng/ayj!の粗画分、TSκ
−250画分及び最終純蛋白質において観察された。従
って、A549ヒト肺癌細胞における50%DNA合成
阻害が純蛋白質の約9nM濃度において見られた。
tri/yd及び95ng/ayj!の粗画分、TSκ
−250画分及び最終純蛋白質において観察された。従
って、A549ヒト肺癌細胞における50%DNA合成
阻害が純蛋白質の約9nM濃度において見られた。
bBFはまた、寒天(Ag)上でのヒト肺癌細胞八54
9の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコ
ロニー形成の50%減少が約16ng/tailのbB
Fにおいて見られた。A549細胞のコロニー形成率は
この蛋白質により顕著に阻害された。13ng/it(
1.24nM)の蛋白質濃度において、コロニー形成率
は対照のそれに比べて50%に過ぎなかった。約80n
B/rnflのbBFの在在下では八549細胞のコロ
ニは見られなかった。
9の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコ
ロニー形成の50%減少が約16ng/tailのbB
Fにおいて見られた。A549細胞のコロニー形成率は
この蛋白質により顕著に阻害された。13ng/it(
1.24nM)の蛋白質濃度において、コロニー形成率
は対照のそれに比べて50%に過ぎなかった。約80n
B/rnflのbBFの在在下では八549細胞のコロ
ニは見られなかった。
八549細胞を種々の濃度のbBFの存在下又は非在在
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、bBFは量依在的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、DNAへの125I−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、bBFは量依在的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、DNAへの125I−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。
bBFはA549細胞、ヒト黒色腫細胞(A375 A
g)及びヒト乳癌細胞(MCF− 7 )の種々のクロ
ーンの増殖を阻害した。ヒト***線維芽細胞(Wl−2
6)の増殖がbBFにより刺激された。脳因子はまた、
ネズミ線維芽細胞セルライン3T3−^31に対して増
殖刺激的である。
g)及びヒト乳癌細胞(MCF− 7 )の種々のクロ
ーンの増殖を阻害した。ヒト***線維芽細胞(Wl−2
6)の増殖がbBFにより刺激された。脳因子はまた、
ネズミ線維芽細胞セルライン3T3−^31に対して増
殖刺激的である。
ヒトT一細胞機能(Zarlin5等、Transpl
antation(1976)21 : 46B−4
76 )に対する脳因子の効果を研究するために、同種
異系的(allogeneically)に誘導された
増殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定
するためのミクロ法を用いた。
antation(1976)21 : 46B−4
76 )に対する脳因子の効果を研究するために、同種
異系的(allogeneically)に誘導された
増殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定
するためのミクロ法を用いた。
末梢血リンパ球(PBL)を正常個体のヘバリン処理血
液から、フィコールーハイバク遠心により単離した。次
にPBLをリン酸緩衝化塩溶液(PBS)で3回洗浄し
、そして10%の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清(HS)が補充されたR PMI 1640の培
地(ギブコ、グランドアイル、NY)中にl×10’P
BL/dの濃度で恕濁した。次に、0,ltdのこれら
のPBL (応答細胞(responding cel
l)と称する〕を96−ウエルプレートの2連の丸底ウ
エルのそれぞれに加え、そして次に0.05dの培地の
み又は2XIO’個のX一線照射された(2500Ra
d)同種異系細胞〔゜゛刺激細胞”(stia+ula
ting cell)と称する〕を含有する0.05−
の培地、及び0.05yilの培地のみ又は種々の濃度
の脳因子(0.9〜75ユニット扇因子/ウエルをもた
らず)を含有する培地を加えた。細胞を5%C(hイン
キュベーター中で37゜Cにてインキユベートし、そし
て2日目及び5日目に0.05zffiの培地を各ウエ
ルから取り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有
する培地0.05++fを添加した。
液から、フィコールーハイバク遠心により単離した。次
にPBLをリン酸緩衝化塩溶液(PBS)で3回洗浄し
、そして10%の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清(HS)が補充されたR PMI 1640の培
地(ギブコ、グランドアイル、NY)中にl×10’P
BL/dの濃度で恕濁した。次に、0,ltdのこれら
のPBL (応答細胞(responding cel
l)と称する〕を96−ウエルプレートの2連の丸底ウ
エルのそれぞれに加え、そして次に0.05dの培地の
み又は2XIO’個のX一線照射された(2500Ra
d)同種異系細胞〔゜゛刺激細胞”(stia+ula
ting cell)と称する〕を含有する0.05−
の培地、及び0.05yilの培地のみ又は種々の濃度
の脳因子(0.9〜75ユニット扇因子/ウエルをもた
らず)を含有する培地を加えた。細胞を5%C(hイン
キュベーター中で37゜Cにてインキユベートし、そし
て2日目及び5日目に0.05zffiの培地を各ウエ
ルから取り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有
する培地0.05++fを添加した。
増殖応答を決定するため、6日目に各群からウエルの内
容物をプールし、そして0. 1−を96−ウエルプレ
ートの4連のウエルのそれぞれに加え、次に0.025
dの容量中1μCiの’+1−チミジン(3HTdR
,ニューイングランドニュークレア、ボストン、MA)
を加えた。6時間後、ウエルの内容物を多ウエル収得器
を用いて゛ガラスフィルターストリンプ上に収得し、こ
れらのストリップをシンチレーション液体を含有するバ
イアルに移し、そして’H − TdR取り込みをβ一
カウンター中での計数により決定した. 細胞変14:Tリンパ球(CTL)の生成に対する効果
を決定するため、6日目にウエノレからフ゜−ノレされ
た残りのリンパ球を96−ウエルプレートの3連のLR
底ウエルに加え(0.15d/ウェル)、そして0.1
5mF!の4倍逐次希釈物も3連のウェルのそれぞれに
加えた。SIC,ラヘル化標的細胞(target c
ell)を調製するため、同種異系刺激細胞の提供者か
ら生したリンポプラストイドセルライン(LCL)細胞
1.5XlO’を500μCi”Cr(NazCrOn
, ニューイングランドニュークレア、ボストン、MA
)により37゜Cにて1時間ラベルし、次に標的細胞を
15%熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含有する培
地で3回洗浄し、そしてこの培地に6XlO’細胞/
tnlで再p4した。次に、0.051dの標的細胞を
、エフエクター細胞を収容する各ウエルに、及び培地の
み〔自然(spontaneous) ”Cr放出を決
定するため〕又は洗剤のみ(51(,放出を決定するた
め)を収容するウエルに加え、そしてプレートを37℃
にて6時間インキユベートした。次に、上清の一定のア
リコートを各ウエルから取り出し、モしてγカウンター
中で計数するためにチューブに移した。特異的SIC,
放出%を次のようにして決定した。
容物をプールし、そして0. 1−を96−ウエルプレ
ートの4連のウエルのそれぞれに加え、次に0.025
dの容量中1μCiの’+1−チミジン(3HTdR
,ニューイングランドニュークレア、ボストン、MA)
を加えた。6時間後、ウエルの内容物を多ウエル収得器
を用いて゛ガラスフィルターストリンプ上に収得し、こ
れらのストリップをシンチレーション液体を含有するバ
イアルに移し、そして’H − TdR取り込みをβ一
カウンター中での計数により決定した. 細胞変14:Tリンパ球(CTL)の生成に対する効果
を決定するため、6日目にウエノレからフ゜−ノレされ
た残りのリンパ球を96−ウエルプレートの3連のLR
底ウエルに加え(0.15d/ウェル)、そして0.1
5mF!の4倍逐次希釈物も3連のウェルのそれぞれに
加えた。SIC,ラヘル化標的細胞(target c
ell)を調製するため、同種異系刺激細胞の提供者か
ら生したリンポプラストイドセルライン(LCL)細胞
1.5XlO’を500μCi”Cr(NazCrOn
, ニューイングランドニュークレア、ボストン、MA
)により37゜Cにて1時間ラベルし、次に標的細胞を
15%熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含有する培
地で3回洗浄し、そしてこの培地に6XlO’細胞/
tnlで再p4した。次に、0.051dの標的細胞を
、エフエクター細胞を収容する各ウエルに、及び培地の
み〔自然(spontaneous) ”Cr放出を決
定するため〕又は洗剤のみ(51(,放出を決定するた
め)を収容するウエルに加え、そしてプレートを37℃
にて6時間インキユベートした。次に、上清の一定のア
リコートを各ウエルから取り出し、モしてγカウンター
中で計数するためにチューブに移した。特異的SIC,
放出%を次のようにして決定した。
次の第5表が結果を示す。
第5表、ヒトT−リンパ球のアロ抗原
誘4増殖応答に対する脳因子の効果
207
103.690
?0, 140
64,507
78.287
87.095
99 552
末梢血リンパ球(PBL)は正常個体■のヘパリン処理
血液から得られ、そして個体CからのX一線照射された
(2500Rad)同種異系PBL (Cx)により刺
激され、そして6目後、3]1−チミジン(’H Td
R)の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
血液から得られ、そして個体CからのX一線照射された
(2500Rad)同種異系PBL (Cx)により刺
激され、そして6目後、3]1−チミジン(’H Td
R)の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
CPM−カウント/分。
脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のP
BLOT一細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性T−リンパ球
の生威に対して観察された。
BLOT一細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性T−リンパ球
の生威に対して観察された。
同し量の5IC,放出を生じさせる未処理のエフエクタ
ー細胞の数として、75ユニットの脳因子と共にインキ
ユベートされた約16倍多くのエフエクター細胞が42
%の5ICr放出を生じさせるために必要である。
ー細胞の数として、75ユニットの脳因子と共にインキ
ユベートされた約16倍多くのエフエクター細胞が42
%の5ICr放出を生じさせるために必要である。
上記の結果から、この発明の化合物はインビト口及びイ
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血消、血漿、尿、又は脳脊髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、&IN織中の細胞によって形威され
るポリベプチトの量の決定のため、診断的に使用するこ
とができる。さらに、この発明の化合物はポリペプチド
のりセプターの決定のために使用することができる。さ
らに、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存
在下で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤
として、又はジアゼパムリセプターもしくはGABA一
作働性リセプターと関連する生理学的機能を調節するた
めに使用することができる。従って、脳組織由来の脳因
子化合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等の
ために、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉種、又は
癌における正常細胞と腫瘍細胞との混合物からRtU細
胞を除去するために他の添加物と組合わせて使用するこ
とができる。脳因子化合物はまた、T一細胞の増殖のj
PJ f!ffのためにも使用することができる。EB
ZD化合物はEBZロリセブターの活性を調節するため
にも使用することができる。
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血消、血漿、尿、又は脳脊髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、&IN織中の細胞によって形威され
るポリベプチトの量の決定のため、診断的に使用するこ
とができる。さらに、この発明の化合物はポリペプチド
のりセプターの決定のために使用することができる。さ
らに、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存
在下で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤
として、又はジアゼパムリセプターもしくはGABA一
作働性リセプターと関連する生理学的機能を調節するた
めに使用することができる。従って、脳組織由来の脳因
子化合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等の
ために、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉種、又は
癌における正常細胞と腫瘍細胞との混合物からRtU細
胞を除去するために他の添加物と組合わせて使用するこ
とができる。脳因子化合物はまた、T一細胞の増殖のj
PJ f!ffのためにも使用することができる。EB
ZD化合物はEBZロリセブターの活性を調節するため
にも使用することができる。
前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例によ
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である。
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、活性ポリペプチド成分を含有し該活性ポリペプチド
成分に関して実質的に均一なポリペプチド組成物であっ
て、該ポリペプチドは、水性0.1Mトリフルオロ酢酸
−n−プロパノールでの20%〜26%n−プロパノー
ル画分で溶出すること、約8〜18kDalであること
、腫瘍細胞又はT細胞の成長を抑制すること、及び哺乳
動物の脳中に見いだされる、ことを特徴とする、上記の
ポリペプチド組成物又はその生理学的に活性なフラグメ
ント、をコードしており、そして適切な方向で、少なく
とも1つの、野生型プロモーター以外のプロモーター、
野生型ターミネーター以外のターミネーター、又は野生
型複製系以外の複製系に結合されているDNA配列を含
むDNA表現構造体。 2、該複製系、プロモーター及びターミネーターが原核
生物宿主中で官能性である、請求の範囲第1項記載のD
NA発現造成物。
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US06/694,712 US4714683A (en) | 1985-01-25 | 1985-01-25 | Polypeptide tumor inhibitors and antibodies thereto |
US766864 | 1985-08-15 | ||
US06/766,864 US4806492A (en) | 1985-01-25 | 1985-08-15 | Polypeptide tumor inhibitors and antibodies thereto |
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JP2269729A Pending JPH03164183A (ja) | 1985-01-25 | 1990-10-09 | 脳由来の膜蛋白質発現系 |
JP2269723A Pending JPH03155787A (ja) | 1985-01-25 | 1990-10-09 | Ebzd蛋白質発現系 |
JP2269728A Pending JPH03178999A (ja) | 1985-01-25 | 1990-10-09 | 脳由来の膜蛋白質に対する抗体 |
JP2269724A Pending JPH03169896A (ja) | 1985-01-25 | 1990-10-09 | 脳因子 |
JP2269722A Pending JPH03169892A (ja) | 1985-01-25 | 1990-10-09 | Ebzd蛋白質に対する抗体 |
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JP2269723A Pending JPH03155787A (ja) | 1985-01-25 | 1990-10-09 | Ebzd蛋白質発現系 |
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JP (9) | JPH064672B2 (ja) |
AU (1) | AU589598B2 (ja) |
ES (2) | ES8705897A1 (ja) |
MX (1) | MX163576B (ja) |
PT (1) | PT81916B (ja) |
WO (2) | WO1993013089A1 (ja) |
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JP2690956B2 (ja) * | 1987-08-22 | 1997-12-17 | 三井東圧化学株式会社 | 生体由来のタンパク質 |
DE68926448T2 (de) * | 1988-10-14 | 1996-12-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Bildsensor und verfahren zu dessen herstellung |
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US5758132A (en) * | 1995-03-29 | 1998-05-26 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson | Clock control system and method using circuitry operating at lower clock frequency for selecting and synchronizing the switching of higher frequency clock signals |
JP2003527831A (ja) * | 1999-10-05 | 2003-09-24 | キュラジェン コーポレイション | エンドゼピン様ポリペプチドおよびエンドゼピン様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド |
WO2006005590A1 (en) * | 2004-07-12 | 2006-01-19 | Geneprot Inc. | Polypeptide for the treatment of neurological disorders |
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US3622577A (en) * | 1968-11-08 | 1971-11-23 | Du Pont | Trimerization of organic isocyanates |
US3686225A (en) * | 1969-04-01 | 1972-08-22 | Du Pont | Complexes of polyether compounds and ionic compounds |
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US3839557A (en) * | 1972-01-24 | 1974-10-01 | Lilly Co Eli | Antibiotics monensin and a204 for improving ruminant feed efficiency |
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US4024158A (en) * | 1975-09-19 | 1977-05-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Aroylcrownethers |
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SU726096A1 (ru) * | 1977-07-07 | 1980-04-05 | Институт химии Уральского научного центра АН СССР | Амиды дибензо-18-краун-6, как промежуточные продукты дл синтеза их комплексов с сол ми металлов |
SU732270A1 (ru) * | 1977-07-07 | 1980-05-05 | Институт химии Уральского научного центра АН СССР | Комплексные соединени дибензо-18- краун-6 с сол ми металлов как катализаторы реакции переэтерификации и поликонденсации в синтезе полиэтилентерефталата |
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IT1134503B (it) * | 1980-11-28 | 1986-08-13 | Proter Spa | Composti della diclorodietilaminofenilalanina ad azione antitumorale |
SU981318A1 (ru) * | 1981-07-31 | 1982-12-15 | Предприятие П/Я А-1997 | Способ получени производных 2,5,8,15,18,21-гексаоксатрицикло/20,4,0,09,14/ гексакозана |
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