PT1881850E - Compostos peguilados de glp-1 - Google Patents

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PT1881850E PT06759598T PT06759598T PT1881850E PT 1881850 E PT1881850 E PT 1881850E PT 06759598 T PT06759598 T PT 06759598T PT 06759598 T PT06759598 T PT 06759598T PT 1881850 E PT1881850 E PT 1881850E
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Wolfgang Glaesner
Lianshan Zhang
Andrew Mark Vick
John Philip Mayer
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Description

ΡΕ1881859 1 DESCRIÇÃO "COMPOSTOS PEGUILADOS DE GLP-1"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a compostos e composições relacionadas de péptido-1 de tipo glucagon modificados com polietilenoglicol (PEG) que são úteis em condições de tratamento ou distúrbios que beneficiaram de abaixamento da glucose no sangue, diminuição da ingestão de alimentos, diminuição do esvaziamento gástrico ou intestinal, aumento no número de células beta (β) e/ou função e/ou inibição de apoptose de células β, ou diminuição da mobilidade gástrica ou intestinal.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A GLP-1 induz numerosos efeitos biológicos tais como a estimulação da secreção da insulina, inibição da secreção do glucagon, inibindo o esvaziamento gástrico, inibindo a mobilidade gástrica ou a motilidade intestinal, aumentando a utilização da, e induzindo a perda de peso. A GLP-1 pode ainda actuar na prevenção da deterioração de células β pancreáticas que ocorre à medida que diabetes mellitus não dependente da insulina (NIDDM) progride. Uma caracteristica significativa de GLP-1 é a sua capacidade 2 ΡΕ1881859 para estimular a secreção da insulina sem o risco associado de hipoglicemia. A GLP-1 induz a secreção de insulina apenas quando os níveis de glucose são elevados ao contrário de outras terapias que actuam através do aumento da expressão de insulina independentemente de os níveis de glucose serem elevados ou não. A utilidade da terapia que envolve os péptidos GLP-1 tem sido limitada pelo facto de o GLP-1 (1-37) ser fracamente activo, e os dois péptidos truncados que ocorrem naturalmente, GLP-1(7-37)OH e GLP-1(7-36)NH2, são rapidamente eliminados in vivo e possuem semi-vidas in vivo extremamente curtas. É conhecido que a dipeptidil-peptidase IV (DPPIV) produzida endogenamente inactiva os péptidos GLP-1 em circulação através da remoção dos resíduos de histidina e alanina N-terminais e é uma das principais razões para a curta semi-vida in vivo.
Embora várias abordagens tenham resultado em compostos GLP-1 com uma semi-vida mais prolongada ou maior potência do que a do GLP-1 nativo, são necessários compostos adicionais para diminuir ainda mais a eliminação e aumentar a semi-vida, optimizando desse modo a capacidade do GLP-1 para ser útil como um agente terapêutico que pode ser administrado um número mínimo de vezes durante um período de tempo prolongado. Os Pedidos Internacionais Nos. PCT/US2004/006082 e PCT/CTS2000/11814 descrevem a ligação covalente de uma ou mais moléculas de PEG a vários compostos de GLP-1 e exendina. Estes compostos podem ΡΕ1881859 possuir uma semi-vida em excesso de 24 horas permitindo menos administrações do composto GLP-1 PEGuilado mantendo simultaneamente um nivel elevado do composto no sangue durante um período de tempo prolongado.
Investigação adicional elucidou um problema em que a separação de PEG de um composto de GLP-1 PEGuilado ou exendina ocorre durante um período de prateleira prolongado Como resultado, o péptido GLP-1 ou exendina livre aumenta o perfil de exposição à concentração do pico inicial através da janela terapêutica. Isto tem a possibilidade de aumentar os efeitos colaterais de náusea e vómito. A presente invenção procura superar os problemas associados com o armazenamento prolongado em prateleira e o potencial de separação de PEG do composto de GLP-1 PEGuilado ou exendina através da introdução de dois sítios de PEGuilação num composto de GLP-1 ou exendina e depois PEGuilar esses dois sítios de PEGuilação simultaneamente. As vantagens desta abordagem são pelo menos de quatro vezes Primeiro, a PEGuilação dos compostos irá melhorar dramaticamente as semi-vidas in vivo dos compostos. Segundo, a PEGuilação dos compostos irá abrandar a taxa de absorção do composto e desse modo, reduzir o impacto inicial do fármaco que se crê ser responsável pelos efeitos colaterais. Terceiro, podem ser utilizados PEGs lineares directamente para PEGuilação e isso simplificará o processo de síntese. Quarto, a PEGuilação em tandem irá aliviar as questões associadas com armazenamento em prateleira prolongado e o 4 ΡΕ1881859 potencial da separação de PEG de GLP-1 PEGuilado ou composto de exendina através da diminuição da probabilidade de ambos os PEGs serem separados da mesma molécula de péptido de GLP-1 ou exendina.
Adicionalmente, a introdução de dois sítios de PEGuilação num composto de GLP-1 ou exendina na extremidade C-terminal do composto e depois PEGuilar esses dois sítios de PEGuilação resultou simultaneamente em compostos PEGuilados possuindo maior actividade em relação a esses compostos PEGuilados em que pelo menos um dos sítios de PEGuilação não está na extremidade C-terminal do péptido. Além disso, a ligação de um ligante que compreende dois sítios de PEGuilação na extremidade C-terminal de um composto GLP-1 e depois PEGuilar aqueles dois sítios de PEGuilação resultou simultaneamente em compostos GLP-1 PEGuilados possuindo maior actividade em relação aos compostos PEGuilados em que os sítios de PEGuilação estão ligados à extremidade do C-terminal de um GLP-1 composto sem um ligante.
Esses compostos de GLP-1 PEGuilados podem ser utilizados terapeuticamente para tratar indivíduos com distúrbios incluindo, diabetes, obesidade, anormalidades de mobilidade gástrica e/ou intestinal, deficiência em células beta (B) (e.g. Células β insuficientes ou em não funcionamento), e anormalidades no esvaziamento gástrico e/ou intestinal com uma vantagem particular, sendo esta que os compostos de GLP-1 PEGuilados da invenção requerem menos ΡΕ1881859 doses durante um período de 24 horas, aumentando tanto a conveniência para um indivíduo em necessidade dessa terapia como a probabilidade do cumprimento de um indivíduo com os requisitos de dosagem.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção aqui descrita proporciona compostos de GLP-1 ligados covalentemente a duas moléculas de poli-etilenoglicol (PEG), ou um seu derivado em que cada PEG é ligado a um resíduo de cisteína, resultando em compostos de GLP-1 PEGuilados com uma eliminação da semi-vida de pelo menos uma hora, ou pelo menos 3, 5, 7, 10, 15, 20 horas ou pelo menos 24 horas. Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção possuem um valor de eliminação de 200 mL/h/kg ou inferior, ou 180, 150, 120, 100, 80, 60 mL/h/kg ou inferior, ou inferior a 50, 40 ou 20 mL/h/kg.
Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção compreendem uma sequência de aminoácidos da fórmula:
His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22_Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys45-Xaa46 Fórmula I (SEQ ID NO: 1) em que Xaa8 é: D-Ala, Gly, Vai, Leu, Ile, Ser, ou Thr; Xaa22 é: Gly, Glu, Asp, ou Lys;
Xaa33 é: Vai ou Ile Xaa46 é: Cys ou Cys-NH2 6 ΡΕ1881859 e em que uma molécula de PEG está ligada covalentemen-te a Cys45 e uma molécula de PEG está ligada covalen-temente a Cys46 ou Cys46-NH2.
Preferencialmente, para os compostos de GLP-1 PEGuilados de fórmula I: Xaa8 é Gly ou Vai; Xaa22 é Gly ou Glu; Xaa33 é Vai ou Ile; e Xaa46 é Cys ou Cys-NH2. São também preferíveis os compostos de GLP-1 PEGuilados de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Vai ou Ile; e Xaa46 é Cys ou Cys-NH2. São também preferíveis os compostos de GLP-1 PEGuilados de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Vai; e Xaa46 é Cys. São também preferíveis os compostos de GLP-1 PEGuilados de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Vai; e Xaa46 é Cys-NH2. São também preferidos os compostos de GLP-1 PEGuilados de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys. São também preferidos os compostos de GLP-1 PEGuilados de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys-NH2.
Os polímeros de polietilenoglicol ("PEG") utilizados na invenção possuem pesos moleculares entre 500 e 100 000 daltons, ou entre 5 000 e 40 000 daltons, ou entre 20 000 e 60 000 daltons, ou entre 20 000 e 40 000 daltons, e podem ser moléculas lineares ou ramificadas, e podem ser derivados de polietilenoglicol, como descrito na técnica. A molécula de PEG ligada covalentemente aos compostos OLP-1 na presente invenção não pretende estar limitada a um tipo particular. Preferencialmente, o PEG é um metoxilo de PEG 7 ΡΕ1881859 maleimida de 20 quilodalton linear. Mais preferencialmente, o PEG é:
CH3Õ(CH2CH20MCHí)3MÍC0(afc)2 A presente invenção compreende compostos para estimular o receptor de GLP-1 num indivíduo em necessidade desta estimulação. Os compostos são administrados ao indivíduo numa quantidade eficaz de um composto de GLP-1 PEGui-lado aqui descrito. Indivíduos que necessitam de estimulação do receptor de GLP-1 incluem aqueles com diabetes não dependentes de insulina, hiperglicemia induzida pelo stress, obesidade, distúrbios de mobilidade ou esvaziamento gástrico e/ou intestinal incluindo, por exemplo, síndrome do intestino irritável, deficiência de células beta (B), e dispepsia funcional.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O Péptido 1 de tipo Glucagon (GLP-1) é um péptido de 37 aminoácidos secretado pelas células L do intestino em resposta à ingestão de alimentos. Foram descritos na técnica vários análogos e derivados de GLP-1. A presente invenção descreve modificações a compostos de GLP-1 que resultam no aumento da semi-vida da eliminação e/ou eliminação reduzida. A incorporação de resíduos de cisteína em sítios de aminoácidos particulares do péptido proporciona um grupo tiol ao qual se pode ligar covalentemente um ΡΕ1881859 polietilenoglicol (PEG) ou derivado de PEG resultando num composto de GLP-1 PEGuilado. 0 termo "composto de GLP-1", como aqui utilizado, inclui GLP-1 nativo, [GLP-1(7-37)OH ou GLP-1(7-36)NH2] , análogos de GLP-1, derivados de GLP-1, fragmentos de GLP-1 biologicamente activos, GLP-1 prolongado ou um análogo ou fragmento de um péptido de GLP-1 prolongado, análogos de exendina-4 e derivados de exendina-4. Preferencialmente, um análogo de GLP-1 possui a sequência de aminoácidos de GLP-1(7-37)OH ou um péptido de GLP-1 prolongado, de modo a que 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos diferem do aminoácido na posição correspondente de GLP-1(7-37)OH ou um fragmento de GLP-1 (7-37) OH ou modificado de modo a que 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos diferem do aminoácido na posição correspondente de um péptido de GLP-1 prolongado. O termo "PEGuilado" quando se refere a um composto de GLP-1 da presente invenção refere-se a um composto de GLP-1 que é quimicamente modificada por ligação covalente de duas moléculas de polietilenoglicol ou um seu derivado. Para além disso, pretende-se que o termo "PEG" se refira a polietilenoglicol ou um seu derivado, como são conhecidos na técnica (ver, e.g., Patentes U.S. N°s: 5 445 090; 5 900 461; 5 932 462; 6 436 386; 6 448 369; 6 437 025; 6 448 369; 6 495 659; 6 515 100 e 6 514 491) . preferencialmente, em compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção, PEG (ou um seu derivado) está covalentemente ligado a dois resíduos de cisteína introdu- 9 ΡΕ1881859 zidos no composto de GLP-1. Preferencialmente, os dois resíduos de cisteína introduzidos no composto de GLP-1 estão nas posições 45 e 46. A "actividade insulinotrópica" refere-se à capacidade para estimular a secreção de insulina em resposta aos níveis de glucose elevados, provocando desse modo a incorporação da glucose pelas células e níveis de glucose no plasma diminuídos. A actividade insulinotrópica pode ser avaliada por métodos conhecidos na técnica, incluindo a utilização de experiências in vivo e in vitro que medem a actividade de ligação do receptor de GLP-1 ou activação do receptor, e.g., ensaios que empregam células de ilhéus pancreáticos ou células de insulinoma, como descrito em EP 619 322 de Gelfand, et al., e Patente U.S. N°. 5 120 712, respectivamente. A actividade insulinotrópica é medida de rotina em humanos através da medição dos níveis de insulina ou níveis de péptido C. Para os objectivos da presente invenção é utilizado um ensaio de sinalização do receptor de GLP-1 in vitro para determinar se um composto de GLP-1 PEGuilado da presente invenção irá apresentar actividade insulinotrópica in vivo. A actividade insulinotrópica é uma actividade que pode ser utilizada para demonstrar que o composto de GLP-1 PEGuilado está biologicamente activo. Todos os compostos de GLP-1 PEGuilados exemplificados da invenção possuem actividade insulinotrópica (Ver Exemplo 6) "Potência in vitro" como aqui utilizado, é a medição da capacidade de um péptido para activar o receptor 10 ΡΕ1881859 de GLP-1 num ensaio à base de células. A potência in vitro é expressa como a "EC50" que é a concentração eficaz do composto que resulta em 50% de actividade numa experiência de resposta à dose única. Para estes objectivos da presente invenção, a potência in vitro é determinada utilizando um ensaio de fluorescência que emprega células HEK-293 que expressam estavelmente o receptor de GLP-1 humano. Estas células HEK-293 integraram estavelmente um vector de DNA que possui um elemento de resposta a cAMP (CRE) controlando a expressão do gene da luciferase. A interacção de um composto de GLP-1 ou um composto de GLP-1 PEGuilado com o receptor inicia um sinal que resulta na activação do elemento de resposta a cAMP e subsequente expressão da luciferase. Os valores de EC50 para os compostos de GLP-1 PEGuilados listados no Exemplo 3 foram determinados utilizando o ensaio da luciferase descrito acima. Os valores da potência relativa in vitro podem ser estabelecidos correndo Vals-GLP-l(7-37)OH ou GLP-1 nativo como um controlo e atribuindo ao controlo um valor de referência de 100%. O termo "semi-vida no plasma" refere-se ao tempo no qual metade das moléculas relevantes circulam no plasma antes de serem eliminadas. Um termo utilizado alternativamente é "semi-vida da eliminação". O termo "prolongado" ou "mais longo" utilizado no contexto da semi-vida no plasma ou semi-vida da eliminação indica que existe um aumento estatisticamente significativo na semi-vida de um composto de GLP-1 PEGuilado em relação àquela da molécula de referência (e.g., a forma não-PEGuilada do péptido ou o péptido 11 ΡΕ1881859 nativo), como determinado em condições comparáveis. Preferencialmente, um composto de GLP-1 PEGuilado da presente invenção possui uma semi-vida de eliminação de pelo menos uma hora, mais preferencialmente pelo menos 3, 5, 7, 10, 15, 20 horas e mais preferencialmente pelo menos 24 horas. A semi-vida aqui relatada nos exemplos 4 e 5 são a semi-vida de eliminação; é isso que corresponde à taxa de eliminação linear de log terminal. Os especialistas na técnica entendem que a semi-vida é um parâmetro derivado que altera como uma função de eliminação e volume de distribuição. A eliminação é a medida da capacidade do corpo para eliminar um fármaco. À medida que a eliminação diminui devido, por exemplo, a modificações de um fármaco, seria expectável que a semi-vida aumentasse. Todavia, esta relação reciproca é exacta apenas quando não há alteração no volume de distribuição. Uma relação útil aproximada entre a semi-vida linear log terminal (tij, eliminação (C), e volume de distribuição (V) é fornecida pela equação: t^ ~ 0,693 (V/C). A eliminação não indica quanto fármaco está a ser removido mas, em vez disso, o volume de fluido biológico, tal como sangue ou plasma que teria que ser totalmente liberto do fármaco para justificar a eliminação. A eliminação é expressa como um volume por unidade de tempo. Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção possuem um valor de eliminação de 200 mL/h/kg ou inferior, ou 180, 150, 120, 100, 80, 60 mL/h/kg ou inferior, ou 50, 40 ou 20 mL/h/kg ou inferior (Ver exemplo 4 e 5). 12 ΡΕ1881859
Na presente invenção, é incorporado um aminoácido Cys nas posições 45 e 46 dos compostos GLP-1. A molécula resultante é PEGuilada nos aminoácidos Cys resultando numa molécula modificada que retém a totalidade ou uma porção da actividade biológica enquanto possui uma semi-vida mais prolongada do que a da molécula não modificada ou do que a de uma molécula nativa.
Os compostos GLP-1 para utilização na presente invenção podem ser preparados utilizando métodos convencionais de técnicas de síntese de péptidos em fase solúvel ou fase sólida.
Assim que um composto GLP-1 é preparado e purificado, é PEGuilado por ligação covalente de duas moléculas de PEG ao composto de GLP-1. Foram descritos vários métodos na técnica para conjugar covalentemente PEGs com péptidos (para artigo de revisão ver, Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002). A PEGuilação de péptidos no carboxilo terminal pode ser efectuada via acoplamento enzimático utilizando péptido GLP-1 recombinante como um precursor ou métodos alternativos conhecidos na técnica e descritos. Ver e.g. Patente U.S. 4 343 898 ou International Journal of Peptide & Protein Research.43:127-38, 1994. um método para preparar os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção envolve a utilização de PEG-maleimida para ligar directamente PEG a um grupo tiol do péptido. A introdução de uma funcionalidade tiol pode ser conseguida por adição ou inserção de um resíduo Cys no 13 ΡΕ1881859 ou dentro do péptido nas posições descritas acima. Pode também ser introduzida uma funcionalidade na cadeia lateral do péptido (e.g. acilação do grupo ε-amino da lisina de um ácido contendo um tiol). Um processo de PEGuilação da presente invenção utiliza a adição de Michael para formar um ligante tioéter estável. A reacção é altamente especifica e ocorre em condições suaves na presença de outros grupos funcionais. A PEG maleimida tem sido utilizada como um polímero reactivo para preparar conjugados de PEG-proteína bioactiva, bem definidos. É preferido que o procedimento utilize um excesso molar de um composto GLP-1 contendo tiol em relação a PEG maleimida para conduzir a reacção até ficar completa. As reacções são preferencialmente efectua-das entre pH 4,0 e 9,0 à temperatura ambiente durante 1 a 40 horas. O excesso de péptido contendo tiol não PEGuilado é prontamente separado do produto PEGuilado por métodos de separação convencionais. As condições exemplificativas necessárias para a PEGuilação de compostos GLP-1 são apresentadas no exemplo I e 2. A PEGuilação de cisteína pode ser efectuada utilizando PEG maleimida ou PEG maleimida bifurcada. Um PEG preferido é uma metoxi-PEG maleimida linear de 20 quilodalton.
Nesta forma típica, PEG é um polímero linear com grupos hidroxilo terminais e possui a fórmula HOCH2CH2-(CH2CH20) n-CH2CH2-OH, em que n é desde 8 a cerca de 4000. O hidrogénio terminal pode ser substituído com um grupo protector tal como um grupo alquilo ou arilo. preferencialmente, PEG possui pelo menos um grupo hidroxilo, mais 14 ΡΕ1881859 preferencialmente é um grupo hidroxilo terminal. É este grupo hidroxilo que é preferencialmente activado para reagir com o péptido. Existem muitas formas de PEG úteis para a presente invenção. Existem vários derivados de PEG na técnica e são adequados para utilização na invenção. (Ver, e. g., Patente U.S. N°s: 5 445 090; 5 900 461; 5932 462; 6 436 386; 6 448 369; 6 437 025; 6 448 369; 6 495 659; 6 515 100 e 6 514 491 e Zalipsky, S.
Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995). A molécula de PEG covalentemente ligada a compostos GLP-1 na presente invenção não pretende estar limitada a um tipo particular. O peso molecular de PEG é preferencialmente de 500-100 000 daltons e mais preferencialmente de 20 000-60 000 daltons e ainda mais preferencialmente de 20 000-40 000 daltons. O PEG pode ser linear ou ramificado.
Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção possuem uma actividade biológica in vitro que é pelo menos 0,5% de GLP-1 nativo ou de Val8-GLP-1 (7-37) OH. Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção possuem uma actividade biológica in vitro que é pelo menos 1% da de GLP-1 nativo ou da de Vals-GLP-l(7-37)OH. Preferencialmente, os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção possuem uma actividade biológica in vitro que é pelo menos 3% da do GLP-1 nativo ou da de Vals-GLP-l (7-37)OH. Esta actividade biológica pode ser determinada pelo ensaio de potência in vitro como aqui descrito (exemplo 3) ou por outros ensaios de GLP-1 conhecidos na técnica. Embora alguns compostos de GLP-1 PEGuilados da invenção 15 ΡΕ1881859 possam ter actividade biológica inferior à do GLP-1 nativo ou de Vals-GLP-l(7-37)OH conforme medido num ensaio particular; este decréscimo de actividade é compensado pela semi-vida estendida do composto e/ou menor valor de eliminação . A administração dos compostos de GLP-1 PEGuilados pode ser através de qualquer via conhecida como sendo eficaz pelo médico com experiência regular. Um destes métodos é o parentérico periférico. A administração parentérica é normalmente compreendida na literatura médica como a injecção de uma forma de dosagem no corpo através de uma seringa estéril ou de alguns outros dispositivos mecânicos tais como uma bomba de infusão. As vias parentéricas periféricas podem incluir as vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, e intraperitoneal. Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção podem ser também adaptados a administração pelas vias oral, rectal, nasal, ou respiratória inferior, que são vias não parentéricas. Destas vias não parentéricas, a via respiratória inferior e a via oral são preferidas.
Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma vasta variedade de doenças e condições. Os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção exercem primariamente os seus efeitos actuando num receptor referido como o "receptor de GLP-1." Os indivíduos com doenças e/ou estados que respondem favoravelmente à estimulação do receptor de GLP-1 ou à ΡΕ1881859 administração de compostos de GLP-1 podem ser, deste modo, tratados com os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção. Estes indivíduos são referidos como "em necessidade de tratamento com compostos de GLP-1" ou "em necessidade de estimulação do receptor de GLP-1". Estão incluídos indivíduos com diabetes não dependente de insulina, diabetes dependente de insulina, trombose (ver WO 00/16797), enfarte do miocárdio (ver WO 98/08531), obesidade (ver WO 98/19698), alterações catabólicas após cirurgia (ver Patente U.S. N° 6 006 753), dispepsia funcional e síndrome do intestino irritável (ver WO 99/64060). Estão também incluídos indivíduos que necessitam de tratamento profiláctico com um composto de GLP-1, e.g., indivíduos em risco de desenvolver diabetes não dependente de insulina (ver WO 00/07617). Indivíduos com tolerância diminuída à glucose ou glicemia de jejum, indivíduos cujo peso corporal é cerca de 25% acima do peso corporal normal para a altura e constituição corporal dos indivíduos, indivíduos com uma pancrea-tectomia parcial, indivíduos possuindo um ou mais pais com diabetes não dependente de insulina, indivíduos que tiveram diabetes gestacional e indivíduos que tiveram pancreatite aguda ou crónica estão em risco de desenvolver diabetes não dependente de insulina.
Uma quantidade eficaz dos compostos de GLP-1 PEGuilados aqui descrita é a quantidade que resulta numa terapêutica desejada e/ou efeito profiláctico sem causar efeitos colaterais inaceitáveis quando administrados a um indivíduo em necessidade de estimulação do receptor de GLP- 17 ΡΕ1881859 1. Um "efeito terapêutico desejado" inclui um ou mais dos seguintes: 1) uma melhoria do(s) sintomas(s) associados com a doença ou estado; 2) um atraso no inicio dos sintomas associado com a doença ou estado; 3) longevidade aumentada em comparação com a ausência do tratamento; e 4) maior qualidade de vida em comparação com a ausência do tratamento. Por exemplo, uma "quantidade eficaz" de um composto de GLP-1 PEGuilado para o tratamento de diabetes é a quantidade que deve resultar num maior controlo de concentração de glucose no sangue do que na ausência de tratamento, resultando deste modo num atraso no inicio das complicações da diabetes tal como retinopatia, neuropatia ou doença renal. Uma "quantidade eficaz" de um composto de GLP-1 PEGuilado para a prevenção da diabetes é a quantidade que atrasará, em comparação com a ausência do tratamento, o inicio níveis de glucose no sangue elevados que necessita de tratamento com fármacos anti-hiperglicémicos tais como sulfonilureias, tiazolidinedionas, metformina, insulina e/ou bisguanidinas. Tipicamente, os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção serão administrados de modo que os níveis de plasma estejam no intervalo de cerca de 5 picomoles/litro e cerca de 200 picomoles/litro. Os níveis óptimos no plasma para Vals-GLP- l(7-37)OH foram determinados como estando entre 30 picomoles/litro e cerca de 200 picomoles/litro. A dose de um composto de GLP-1 PEGuilado eficaz para normalizar a glucose no sangue do paciente dependerá de vários factores, entre outros estão incluídos, sem ΡΕ1881859 limitação, o sexo do indivíduo, peso e idade, a gravidade da incapacidade de regular a glucose no sangue, a via de administração e biodisponibilidade, o perfil farmacociné-tico do composto de GLP-lPEGuilado, a potência, e a formulação. Um intervalo de dose típico para os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção estará desde cerca de 0,01 mg por dia a cerca de 1000 mg por dia para um adulto. Preferencialmente, os intervalos de dosagem variam desde cerca de 0,1 mg por dia a cerca de 100 mg por dia, mais preferencialmente de cerca de 1,0 mg/dia a cerca de 10 mg/dia. É preferido que os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção sejam administrados uma vez em cada duas semanas ou uma vez por semana. Dependendo da doença a ser tratada, pode ser necessário administrar os compostos de GLP-1 PEGuilados mais frequentemente tal como duas a três vezes por semana.
Um "indivíduo" é um mamífero, preferencialmente um humano, mas pode também ser um animal, e.g., animais de companhia (e.g., cães, gatos, e semelhantes), animais de produção (e.g., vacas, ovelhas, porcos, cavalos, e semelhantes) e animais de laboratório (e.g., ratos, ratinhos, porquinhos-da-índia, e semelhantes).
Os péptidos utilizados para produzir os compostos de GLP-1 PEGuilados da presente invenção podem ser prepara- 19 ΡΕ1881859 dos utilizando métodos convencionais de síntese de péptidos em fase solução ou em fase sólida. A invenção é ilustrada pelos exemplos que se seguem.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - PEGuilação de análogos relacionados com GLP-1:
As reacções de PEGuilação são efectuadas sob condições que permitem a formação de uma ligação tioéster. Especificamente, o pH da solução varia desde cerca de 4 a 9 e as concentrações do péptido contendo tiol variam desde 1 a 10 em excesso molar da concentração de metoxi-PEG2-MAL. As reacções de PEGuilação são normalmente realizadas à temperatura ambiente. O péptido GLP-1 PEGuilado é então isolado utilizando cromatografia de troca iónica em HPLC de fase reversa, ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) Os análogos de GLP-1 PEGuilado são caracterizados utilizando RP-HPLC analítica, HPLC-SEC, SDSPAGE, e/ou Espectro-metria de Massa MALDI.
Os péptidos GLP-1 contendo tiol são feitos reagir com polietilenoglicol-maleimida (PEG-maleimida) para produzir derivados com PEG covalentemente ligado via uma ligação tioéter. Por exemplo, um composto de GLP-1, 46aa de comprimento; 7,5 mg, 1,8 pmol são dissolvidas em 2 mL de 200 mM de tampão fosfato contendo 20 mM de EDTA, pH 7,4. A 20 ΡΕ1881859 solução é então purgada com árgon. A esta solução são adicionados 40 mg de metoxi-PEG-MAL, uma PEG maleimida linear ou bifurcada (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) (0,55:1 mole/mole proporção de PEG para péptido). A reacção é efectuada durante 2 horas. Depois 25 mg do péptido PEGuilado é purificado por RP-HPLC, caracterizado por HPLC de exclusão de tamanho, e testado para actividade in vitro.
Exemplo 2 - Reacção de 2X20kDa-PEG-maleimida com análogos de GLP
Os análogos de GLP-1 são selectivamente PEGui-lados nos resíduos de cisteína introduzidos utilizando 20 kDa mPEG linear activada maleimida (NOF, Inc.). Para a reacção de PEGuilação, o péptido a ser PEGuilado é dissolvido em tampão 100 mM de NH4Ac contendo lOmM de EDTA a pH 6,8 e é adicionado um excesso molar de 1,25 vezes de 20 kDa-mPEG a granel. A reacção é deixada a agitar à temperatura ambiente durante 1-4 horas e a cromatografia de troca catiónica SP-Sepharose é utilizada para separar o composto PEGuilado do PEG livre e do péptido livre. O conjugado é dessalinizado por RP-HPLC e liofilizado.
Exemplo 3 - Ensaio de actividade in vitro
As células HEK-293 que expressam de forma estável o receptor de GLP-1 humano, utilizando um sistema CRE-Luciferase, são semeadas a 30 000 células/poço/80 pL em meio DMEM F12 com pouco soro em placas de 96 poços. No dia 21 ΡΕ1881859 após a sementeira, fracções de 20 pL da proteína de teste dissolvida em 0,5% de BSA são misturadas e incubadas com as células durante 5 horas. Geralmente 10 diluições contendo desde 0,001 nM a 10 nM são preparadas para os compostos de teste GLP-1 e 0,0003 nM e 3 nM são preparados para o padrão Vals-GLP-l(7-37)OH antes da adição às células para produzir um curva de resposta a dose a partir da qual são determinados os valores de EC5o. Após incubação, são adicionados 100 pL de reagente de Luciferase directamente a cada placa e misturados suavemente durante 2 minutos. As placas são colocadas num luminómetro Tri-lux e a produção de luz resultante da expressão da luciferase é calculada. O valor médio de EC5o para o composto de GLP-1 PEGuilado da fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys é de 0,22+0,03 nM. O valor médio de EC5o para o composto de GLP-1 PEGuilado de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é lie; e Xaa46 é Cys-NH2 é de 0,36+0,04 nM.
Exemplo 4 - Análise farmacocinética do péptido GLP-1 derivado
Um composto de GLP-1 PEGuilado de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys-NH2 é administrado por vias intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) a uma dose de 0,1 mg/kg a ratos SD machos. Os animais (3 ratos por grupo) são sangrados em vários tempos entre as 0 e 192 horas após a dose. O plasma é recolhido de cada amostra e analisado por radioimunoensaio N-terminal específico. Os parâmetros farmacocinéticos são calculados utilizando métodos não compartimentais (WinNonlin Pro). Por 22 ΡΕ1881859 administração IV, o análogo de GLP-1 PEGuilado possui uma semi-vida de eliminação de aproximadamente 1,2 dias enquanto por administração SC o análogo de GLP-1 PEGuilado possui uma semi-vida de eliminação de aproximadamente 1,1 dias. Não são associadas observações clínicas adversas com a administração IV ou SC de 0,1 mg/kg. A semi-vida de eliminação prolongada, eliminação lenta e biodisponi-bilidade subcutânea (aproximadamente 30%) são observadas para o compostos. Os dados representativos são apresentados a seguir na Tabela 1.
Tabela 1 - Valores médios (± DP) de parâmetros PK para um composto de GLP-1 PEGuilado de fórmula I, em que Xaae é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys-NH2 após administração intravenosa ou subcutânea de 0,1 mg/kg para ratos SD machos.
Via 0ma/ (ng/mL) (h) AUCo-úitimo (ng*h/mL) ti/2d (h) CL/lt (mL/h/kg) Vss/Ff (mL/kg) IV 2020 0,08 52292 25,8 1,9 54 (235) (0,00) (4546) (2,2) (0,2) (2,5) SC 191 24,0 15423 28,3 6,5 268 (SD) (31) (0,0) (2821) (0,8) (1,2) (56)
Concentração máxima observada no plasma. bTempo de concentração máxima observada no plasma. cÁrea sob a curva de concentração no plasma-tempo medida desde o ponto de tempo 0 até ao último. dSemi-vida de eliminação. eEliminação do corpo total como uma função da biodisponibilidade. fVolume de estado estacionário de distribuição como uma função da biodisponibilidade._ 23 ΡΕ1881859
Quando Vals-GLP(7-37)OH é administrado IV de modo semelhante a 344 ratos Fischer a uma dose de 10 pg/kg, são obtidos valores de eliminação profundamente diferentes e de semi-vida de eliminação como listado a seguir.
Eliminação: 1449 ml/h/kg 11/2 (h) : 0,05
Exemplo 5 - Análise Farmacocinética de péptido GLP-1 derivado
Um composto de GLP-1 PEGuilado de fórmula I, em que Xaas é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys-NH2 é administrado por via subcutânea (SC) a uma dose de 0,01 mg/kg a macacos machos cinomolgos. Os animais são sangrados nos vários tempos entre 0 e 168 horas após a dosagem. O soro é recolhido de cada amostra e analisado por radioimunoensaio N-terminal especifico. Os parâmetros far-macocinéticos são calculados utilizando métodos não compartimentais (WinNonlin Pro). Os dados representativos são apresentados a seguir na Tabela 2.
Tabela 2 - valores médios dos parâmetros PK (±DP) para um composto de GLP-1 PEGuilado de fórmula I, em que Xaas é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys-NH2 após administração subcutânea de 0,01 mg/kg a macacos machos cinomolgos. 24 ΡΕ1881859
Animal# Cmx& (ng/mL) O (h) AUCo-úit±mo (ng*h/mL) t1/2d (h) CL/r (iriL/h/kg) Vss/lt (mL/kg) Média 69,49 48 7464,78 75,69 1,06 117,15 DP 17,07 0 1612,03 11,67 0,26 44,89
Abreviaturas: DP = desvio padrão
Concentração máxima observada no plasma. bTempo de concentração máxima observada no plasma. cÁrea sob a curva de concentração no plasma-tempo medida desde o ponto de tempo 0 até ao último. dSemi-vida de eliminação. eEliminação do corpo total como uma função da biodisponibilidade. fVolume de estado estacionário de distribuição como uma função da biodisponibilidade.
Exemplo 6 - Análise Farmacodinâmica do péptido GULP-1 derivado
Um composto de GLP-1 PEGuilado de fórmula I, em que Xaas é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys-NH2 é administrado por via subcutânea (SC) a uma dose de 0,01 mg/kg a macacos machos cinomolgos. Uma faseada infusão intravenosa de glucose é imediatamente aplicada após administração SC do controlo do veículo (tampão fosfatado salino) e 1, 5, e 7 dias após administração SC de 0,01 mg/kg de análogo de GLP-1 PEGuilado. Os procedimentos de infusão intravenosa de glucose faseada são realizados em macacos sedados após um jejum de 16 horas. As amostras de sangue são retiradas 10 minutos antes do inicio da infusão de glucose e imediatamente antes do inicio da infusão de glucose para definir a linha de base. Uma infusão faseada de glucose (20% de dextrose) é então iniciada a uma taxa de 10 mg/kg/min durante 20 minutos seguido por uma infusão de 25 ΡΕ1881859 25 mg/kg/min durante mais 20 minutos. As amostras de sangue são retiradas em intervalos de 10-minutos durante o período de infusão. Os níveis de insulina são determinados por imunoensaio. A actividade insulinotrópica é demonstrada durante pelo menos 7 dias (relativamente a placebo; p<0,0001) após uma única injecção SC de 0,01 mg/kg do análogo de GLP-1 PEGuilado. Os dados representativos são apresentados a seguir na Tabela 3.
Valores médios dos parâmetros PD (+SD) para um composto de GLP-1 PEGuilado de fórmula I, em que Xaa8 é Vai; Xaa22 é Glu; Xaa33 é Ile; e Xaa46 é Cys-NEt após administração subcutânea de 0,01 mg/kg a macacos machos cinomolgos.
Tabela 3
Insulina AUC Grupo Veículo Média SD SE Dia 1 Média SD SE Dia 5 Média SD SE Dia 7 Média SD SE AUCúltimo (pM*min) 14983 5789 2363 30862 10770 4397 27203 6507 2657 28542 7685 3137 ΡΕ1881859 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Eli Lilly e Company <120> Compostos Peguilados GLP-1 <130> X-17063 <160> 1 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> construção sintética <220> <221> MIST-CARACTERÍSTICA <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Ala, Gly, Vai, Leu, Ile, Ser, ou Thr <220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA <222> (2)..(2) <223> Ala é D-isómero <220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA <222> (16)..(16) <223> Xaa na posição 16 é Gly, Glu, Asp, ou Lys <220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA <222> (27)..(27) <223> Xaa na posição 27 é vai ou Ile <220> <221> MISC_CARACTERÍSTICA <222> (40)..(40) <223> Xaa na posição 40 é Cys ou Cys-NH2 27 ΡΕ1881859 <400> 1
His Xaa Glu Gly Thr phe Thr ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 1 S 10 15
Gin Ala Ala tys Glu Phe lie Ala Trp teu xaá tys Gly Gly prp ser 20 25 50
Ser Gly Ala pro pro pro Cys xaa 35 40
Lisboa, 18 de Novembro de 2010

Claims (13)

  1. ι ΡΕ1881859 REIVINDICAÇÕES 1. Composto GLP-1 di-PEGuilado compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula: Âla^Âit»%s-Glú*Phe*IÍ«-Âl^^4^-Xs%i4íp-Gly-0íy-Pit)'SeT*Sèr*Gly-Ak-Pro-Prc-Pro-Cpi^ Xa&*s EíhmuI* I (SEQ IO NO; 1} em que Xaas é: D-Ala, Gly, Vai, Leu, Ile, Ser, ou Thr; Xaa22 é: Gly, Glu, Asp, ou Lys; Xaa33 é: Vai ou Ile; Xaa46 é: Cys ou Cys-NH2; e em que uma molécula de PEG é covalentemente ligada a Cys45 e uma molécula de PEG é covalentemente ligada a Cys46 ou Cys46-NH2.
  2. 2. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com a reivindicação 1, em que Xaas é Gly, ou Vai, e Xaa22 é Gly ou Glu.
  3. 3. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que Xaas é Vai e Xaa22 é Glu.
  4. 4. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que Xaas é Vai, Xaa22 é Glu, Xaa33 é Ile, e Xaa46 é Cys-NH2.
  5. 5. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com 2 ΡΕ1881859 qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que as moléculas de PEG possuem pesos moleculares entre 5 000 e 40 000 daltons.
  6. 6. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que as moléculas de PEG possuem pesos moleculares entre 20 000 e 60 000 daltons.
  7. 7. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que as moléculas de PEG possuem pesos moleculares entre 20 000 e 40 000 daltons.
  8. 8. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que cada uma das moléculas de PEG utilizada numa reacção de PEGuilaçâo é uma metoxi-PEG-maleimida linear de 20 000 dalton.
  9. 9. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que as moléculas de PEG são ligadas simultaneamente.
  10. 10. Composto GLP-1 di-PEGuilado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que um ligante compreendendo os sítios de PEGuilaçâo Cys45 e Cys46 ou Cys46-NH2 é ligado ao C-terminal do composto de GLP-1.
  11. 11. Composto GLP-1 di-PEGuilado de qualquer uma 3 ΡΕ1881859 das reivindicações 1 a 10 para utilização como um medicamento .
  12. 12. Composto GLP-1 di-PEGuilado de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização no tratamento de diabetes não dependente de insulina ou obesidade.
  13. 13. Utilização de um composto GLP-1 di-PEGuilado de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 na preparação de um medicamento para o tratamento de diabetes não dependente de insulina ou obesidade. Lisboa, 18 de Novembro de 2010
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