PT1809320E

PT1809320E - Composições contendo lipase, protease e amilase para o tratamento de insuficiência pancreática

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Publication number: PT1809320E
Application number: PT05814918T
Authority: PT
Original assignee: Altus Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2010-10-25
Also published as: HUE031245T2; CN101068565A; EP2198880B1; CY1110838T1; ATE474592T1; SI1809320T1; HK1109068A1; MX2007004534A; KR20070074622A; EP1809320B1; JP2008516965A; ES2614157T3; EP1809320A1; JP4908420B2; BRPI0516515B1; LT2198880T; RU2385736C2; CA2584069C; US7718169B2; AU2005295754A2

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES CONTENDO LIPASE, PROTEASE E AMILASE PARA O TRATAMENTO DE INSUFICIÊNCIA PANCREÁTICA

DOMÍNIO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto composições para o tratamento de estados clínicos, incluindo insuficiência pancreática. As composições da presente invenção compreendem lipase, protease e amilase, numa proporção particular que providencia resultados benéficos em pacientes, tal como os que sofrem de insuficiência pancreática. A presente invenção também tem por objecto processos que utilizam essas composições para o tratamento de insuficiência pancreática.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A digestão consiste no processo fisiológico pelo qual os alimentos ingeridos são transformados em componentes nutrientes que se podem absorver facilmente. No seguimento da ingestão, os alimentos passam através de vários segmentos do tracto gastrointestinal e realiza-se a digestão, principalmente pela acção das enzimas digestivas. Três grupos de enzimas digestivas essenciais para este processo incluem lipases (para a digestão de gorduras), proteases (para a digestão de proteínas) e amilases (para a digestão de hidratos de carbono). A digestão dos alimentos e a absorção dos nutrientes ocorre no intestino delgado. Ai, os alimentos ingeridos são desagregados pelas enzimas digestivas para uma fácil absorção. A maior parte das enzimas digestivas são 1 segregadas pelo pâncreas e chegam ao intestino delgado através do dueto pancreático. 0 pâncreas efectua uma variedade de acções exócrinas e endócrinas necessárias para uma digestão, nutrição e metabolismo adequados. As actividades pancreáticas exócrinas incluem a secreção de proteínas, que funcionam como enzimas, no intestino delgado para catalisar a hidrólise da gordura em glicerol e ácidos gordos, as proteínas em péptidos e aminoácidos e os hidratos de carbono em dextrinas, dissacáridos e monossacáridos, tal como glicose. A insuficiência pancreática exócrina (daqui para a frente "insuficiência pancreática") resulta de uma redução da função pancreática e pode ser causada por um certo número de distúrbios clínicos. Por exemplo, a insuficiência pancreática está associada com fibrose quística, pancreatite crónica, pancreatite aguda, cancro pancreático e síndrome de Shwachmann-Diamond e [E.P. DiMagno et al., em The Pancreas: Biology, Pathobiology and Disease, 2a Ed., V. Liang et al., eds., pp. 665-701 (1993)].

Em pacientes que sofrem de insuficiência pancreática, o pâncreas deixa de produzir e/ou segregar quantidades suficientes de enzimas digestivas para suportar os processos normais da digestão, incluindo a digestão de gorduras, proteínas e hidratos de carbono. Como resultado, esses pacientes sofrem de malabsorção de nutrientes. As manifestações clínicas da insuficiência pancreática incluem cólicas abdominais, barriga inchada, diarreia, diarreia gordurosa, náusea e perda de peso. A insuficiência pancreática está presente em 89 % dos pacientes que sofrem de fibrose quística [D. Borowitz et al., "Use of Fecal Elastase-1 to Identify Misclassification 2

of Functional Pancreatic Status in Patients with Cystic Fibrosis", J. Pediatr., 145, pp. 322-326 (2004)]. A fibrose quística é um distúrbio genético recessivo autossómico que afecta principalmente os sistemas gastrointestinais e respiratório [S.M. Rowe et al., "Mechanisms of Disease: Cystic Fibrosis", N. Engl. J. Med., 352, pp. 1992-2001 (1995)]. As quantidades anormais e a viscosidade do muco produzido em pacientes com fibrose quistica impedem a secreção de quantidades suficientes de enzimas pancreáticas. Um menor volume da secreção pancreática leva à inspissação dentro dos duetos pancreáticos, impedindo o ingresso das enzimas e do bicarbonato no duodeno. Como resultado, os pacientes com fibrose quistica que têm insuficiência pancreática sofrem de uma digestão defeituosa e têm uma malabsorção significativa de gordura e de proteína. Por exemplo, esses pacientes normalmente absorvem menos do que 60 % da gordura da dieta [M.

Kraisinger et al., "Clinicai Pharmacology of Pancreatic

Enzymes in Patients with Cystic Fibrosis and in vitro Performance of Microencapsulated Formultions", J. Clin. Pharmacol., 34, pp. 158-166 (1994)]. Se não for tratada, a maldigestão e a malabsorção de pacientes com fibrose quística levam à desnutrição, incapacidade para ganhar ou manter o peso e a uma diminuição do crescimento, assim como a um agravamento da doença supurativa crónica do pulmão [K. Gaskin et al., "Improved Respiratory Prognosis in CF Patients with Normal Fat Absorption", J. Pediatr., 100, pp. 857-862 (1982); J.M. Littlewood et al., "Control of Malabsorption in Cystic Fibrosis", Paediatr. Drugs, 2, pp. 205-222 (2000)].

Até a esta data, a terapia normalizada para a insuficiência pancreática baseia-se principalmente na administração oral de pancrelipase porcina, contendo uma 3 mistura de lipases, tripsina, quimotripsina, elastase e amilases. Embora os suplementos da enzima pancrelipase porcina contenham quantidades substanciais de amilase, tem sido referenciado que os pacientes com fibrose quistica têm niveis normais de amilase [P.L. Townes et al., "Amylase Polymorphism: Studies of Sera and Duodenal Aspirates in Normal Individuais and in Cystic Fibrosis", Am. J. Hum. Genet., 28, pp. 378-389 (1976)]. De acordo com isto, crê-se que a amilase não desempenha nenhuma função no aumento da digestão dos polissacáridos [E. Lebenthal et al., "Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency: Present Status and Future Needs," Pancreas, 9, pp. 1-12 (1994)]. Os components de lipase, protease e amilase, nos suplementos da enzima pancrelipase porcina, estão normalmente presentes numa relação de 1:3,5:3,5.

Os suplementos de enzima pancreática são normalmente administrados oralmente, em conjunto com as refeições. À medida que estes suplementos passam através do ambiente de baixo pH do estômago, a sua actividade enzimática diminui rapidamente. Como resultado, têm sido necessárias grandes quantidades de concentrado de enzima (algumas vezes da ordem de 15 cápsulas ou comprimidos por refeição) para assegurar a presença de enzima activa suficiente no intestino proximal para mitigar a insuficiência pancreática.

Como a protease e a lipase podem ficar inactivas de forma irreversível, no ambiente ácido do estômago, têm sido aplicadas tecnologias de revestimento entérico aos produtos de pancrelipase, para encapsular as enzimas em micropérolas ou, de alguma forma, tratá-las com um revestimento entérico protector. Embora esses revestimentos entéricos melhorem o perfil do produto, continuam a ser necessárias grandes quantidades de suplementos para se obter o benefício 4 terapêutico. [J.H. Meyer, em Pancreatic Enzymes in Health and Disease, P.G. Lankisch, ed., pp. 71-88 (1991)]. Foi introduzida uma linha de produtos de pancrelipase, muito potente (Ultrase®) , com o objectivo de reduzir as quantidades de comprimidos ou de cápsulas necessárias para tratar a insuficiência pancreática. Contudo, em 1991, na United States Cystic Fibrosis Foundation, em conjunto com a FDA, foram relatados muitos casos de clonopatia fibrosante em crianças com fibrose quística que tomaram esses produtos muito potentes [S.C. Fitzsimmons et al., "High-Dose Pancreatic-Enzyme Supplements and Fibrosing Colonopathy in Children with Cystic Fibrosis", N. Engl. J. Med., 336, pp. 1283-1289 (1997)]. Nestes pacientes, a fibrose colónica causou estenoses que muitas vezes exigiram cirurgia e, nalguns casos, colectomia.

Como um meio para reduzir as doses diárias de enzimas pancreáticas, a FDA retirou do mercado esses produtos muito potentes (definidos como tendo mais do que 2.500 unidades USP por kg de peso do corpo) [D.S. Borowitz et al., "Use of Pancreatic Enzyme Supplements for Patients with Cystic Fibrosis in the Context of Fibrosing Colonopathy", J. Pediatr., 127, pp. 681-684 (1995)]. Além disso, a United States Cystic Fibrosis Foundation, em conjunto com a FDA, recomendaram um exame detalhado da natureza complexa dos extractos da enzima porcina [Id.]. O Painel de Consenso também recomendou a investigação de alternativas de lipases estáveis em meio ácido.

Embora um dado suplemento de enzima pancreática possa ser ou não entericamente revestido, a biodisponibilidade desses suplementos varia muito, devido aos diferenciais na acidificação do intestino entre os 5 pacientes. Como resultado, muitos pacientes tomam fármacos que alteram o pH, tal como bloqueadores do receptor de histamina-2 (¾) e inibidores da bomba de protão (IBP), para melhorar a eficácia clinica dos suplementos de enzima [P.G. Lankish, "Enzyme Treatment of Exocrine Pancreatic Insufficiency in Chronic Pancreatitis' , Digestion, 54 (sup. 2), p. 21-29 (1993); D.Y. Graham, "Pancreatic Enzyme Replacement: the Effect of Antacids or Cimetidine", Dig. Dis. Sei., 27, p. 485-490 (1982); J.H. Saunders et al., "Inhibition of Gastric Secretion in Treatment of Pancreatic Insufficiency", Br. Med. J., 1, p. 418-419 (1977); H.G. Heijerman et al., "Omeprazole Enhances the Efficacy of Pancreatin (Pancrease) in Cystic Fibrosis", Ann. Inter. Med., 114, p. 200-201 (1991); M.J. Bruno et al., "Comparative Effects of Adjuvant Cimetidine and Omprazole during Pancreatic Enzyme Replacement Therapy",

Dig. Dis. Sei ., 39, p. 988- -992 (1994)] • A variabilidade, em termos de potência e de propriedades farmacêuticas e a falta de estabilidade têm também sido identificadas como factores importantes que contribuem para uma fraca resposta de alguns pacientes aos suplementos convencionais de enzimas pancreáticas [C.L. Chase et al., "Enzyme Content and Acid Stability of Enteric-Coated Pancreatic Enzyme Products in vitro", Pancreas, 30, p. 180-183 (2005); D.S. Borowitz et al., J. Pediatr., 127, supra; C.J. Powell et al., "Colonic Toxicity from Pancreatins: a Contemporary Safety Issue", Lancet, 353, p. 911-915 (1999); E. Lebenthal et al., "Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency: Present Status and Future Needs", Pancreas, 9, p. 1-12 (1994); P. Regan et al., "Comparative Effects of Antacids, Cimetidine and Enteric Coating on the Therapeutic Response to Oral Enzymes in Severe Pancreatic Insufficiency", N. Eng. J. Med., 297, 6 ρ. 854-858 (1977)]. Isto inclui a variação da actividade enzimática de lote para lote, a tendência a perder actividade ao longo do tempo por exposição à luz solar, calor ou humidade e um perfil mal definido de reacções adversas [D.S. Borowitz et al., J. Pediatr., 127, supra]. Outros factores que complicam a terapia da insuficiência pancreática incluem a destruição das enzimas de substituição por suco gástrico e/ou proteases intraluminais, esvaziamento gástrico assíncrono do suplemento de enzimas e dos nutrientes alimentares e libertação retardada da enzima a partir das preparações com revestimento entérico [P.G. Lankish, Digestion, 54 supra; P. Regan et al., N. Eng. J. Med., 2 97, supra] .

Devido aos problemas de potência, estabilidade e biodisponibilidade, que caracterizam os suplementos convencionais de enzimas pancreáticas, tem sido proposta a utilização de enzimas derivadas de micróbios, como alternativas às enzimas derivadas de suínos. Por exemplo, a patente norte-americana 6.051.220 descreve composições que compreendem uma ou mais lipases, estáveis em ácidos e uma ou mais amilases, estáveis em ácidos, preferencialmente ambas de origem fúngica. O pedido de patente norte-americana 2004/0057944 descreve composições que contêm lipase de Rhizopus delemar, protease de Aspergillus melleus e amilase de Aspergillus oryzae. O pedido de patente norte-americana 2001/0046493 descreve composições que contêm lipase bacteriana cristalina reticulada, em conjunto com uma protease fúngica ou de planta ou uma amilase bacteriana.

Apesar destes desenvolvimentos, existe ainda a necessidade de optimizar as formulações posológicas para 7 melhorar tanto a eficácia dos suplementos de enzima pancreática como a tolerância do paciente. 0 objectivo de um suplemento de enzima pancreática que exiba a eficácia máxima para a mais baixa dose e caracterizado por um perfil de segurança bem definido, continua a ser de grande importância para todos os pacientes que sofrem de insuficiência pancreática, incluindo na comunidade dos que têm fibrose quística.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto composições e a sua utilização para o tratamento de estados clínicos, incluindo insuficiência pancreática. De acordo com um enquadramento preferido, as composições da presente invenção são caracterizadas por cristais reticulados de lipase microbiana, protease microbiana e amilase microbiana, numa proporção de cerca de 1,0:1,0:0,15 de unidades USP da actividade enzimática. Com vantagem, estas composições são caracterizadas por componentes enzimáticos estáveis, assegurando, por sua vez, uma libertação in vivo da enzima activa, no tracto gastrointestinal e permitindo assim regimes de tratamento com doses eficazes baixas para a insuficiência pancreática.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 ilustra a alteração do coeficiente médio de absorção de gordura ("CAG"), quando comparado com um valor inicial de referência, em pacientes tratados com composições de acordo com a presente invenção, durante um estudo da fase 2. A figura 2 ilustra a alteração do coeficiente médio de absorção de azoto ("CAA"), quando comparado com um valor 8 inicial de referência, em pacientes tratados com várias composições de acordo com a presente invenção, durante um estudo da fase 2 . A figura 3 ilustra a correlação entre o coeficiente de absorção de gordura ("CAG") e o coeficiente de absorção de azoto ("CAA") no início, em pacientes tratados com composições de acordo com a presente invenção durante um estudo da fase 2. A figura 4 ilustra a correlação entre o coeficiente de absorção de gordura ("CAG") e o coeficiente de absorção de azoto ("CAA"), a nível do tratamento, em pacientes tratados com composições de acordo com a presente invenção, durante um estudo da fase 2. A figura 5 ilustra a diferença entre a correlação entre o coeficiente de absorção de gordura ("CAG") e o coeficiente de absorção de azoto ("CAA"), durante o tratamento e o nível inicial, em pacientes tratados com composições de acordo com a presente invenção, durante um estudo da fase 2 . A figura 6 ilustra a alteração do coeficiente médio de absorção de gordura ("CAG"), quando comparado com um valor inicial, em pacientes com fibrose quística tratados com várias doses, de acordo com a presente invenção durante um estudo da fase 1. A figura 7 ilustra a alteração do coeficiente médio de absorção de azoto ("CAA"), quando comparado com um valor inicial, em pacientes tratados com várias doses, de acordo com a presente invenção, durante um estudo da fase 1. 9

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto a descoberta de composições que contêm lipase, protease e amilase, numa proporção de cerca de 1,0:1,0:0,15 unidades USP de actividade enzimática, que são eficazes para o tratamento de estados clínicos, incluindo insuficiência pancreática. A proporção única entre a lipase e a protease e a amilase permite o tratamento destes estados clínicos em regimes terapêuticos com doses baixas que não são possíveis com os suplementos convencionais de enzimas pancreáticas derivadas da enzima porcina. Além disso, esta proporção entre a lipase a protease e a amilase evita uma elevada concentração de protease que se pensa que, em suplementos convencionais de enzima, é responsável por colonopatia fibrosante [D.S. Borowitz et al., J. Pediatr., 127, supra].

De acordo com um enquadramento preferido, as composições da presente invenção contém cristais reticulados de lipase microbiana, uma protease microbiana e amilase microbiana, numa proporção de cerca de 1,0:1:0,15 de unidades USP de actividade enzimática.

Definições

Os termos que se seguem, a menos que seja indicado de outra forma, devem ser entendidos como tendo os significados que se seguem: O termo "amorfo" refere-se a qualquer estado que não seja de cristal, cristalino ou semi-cristalino. A matéria amorfa inclui sólidos e líquidos amorfos. 10 0 termo "cristal" ou "cristalino" refere-se a uma forma de matéria no estado sólido que compreende átomos arranjados num modelo que se repete periodicamente em três dimensões [ver, por exemplo, Barrett, Structure of Methals, 2a ed., (1952)]. 0 cristal ou a forma cristalina de uma enzima é distinta das suas formas amorfa ou semi-cristalina. Os cristais exibem caracteristicas, incluindo uma estrutura em malha, formas caracteristicas e propriedades ópticas, tais como, por exemplo, o indice de refracção. 0 termo "semi-cristalino" refere-se a um estado sólido de uma matéria tanto com regiões cristalinas como amorfas. 0 termo "sujeito", "paciente" ou "indivíduo" refere-se a qualquer mamífero, incluindo qualquer animal classificado como tal, incluindo seres humanos e outros primatas. A expressão "maldigestão" refere-se a uma deagregação defeituosa dos nutrientes (tais como gorduras, proteínas e hidratos de carbono) nos seus constituintes que podem ser absorvidos (mono-, di- ou oligossacáridos, aminoácidos, oligopéptidos, ácidos gordos e monoglicéridos). A maldigestão resulta de várias condições, incluindo insuficiência pancreática. A expressão "malabsorção" refere-se a uma absorção deficiente dos nutrientes digeridos, incluindo vitaminas e elementos em traços, a partir do intestino delgado ou do intestino grosso. A malabsorção pode ser devida a uma absorção defeituosa da mucosa pelo revestimento do intestino ou por anomalias particulares da digestão. A malabsorção intestinal pode ocorrer em relação a 11 muitos nutrientes ou para macronutrientes específicos, nomeadamente gorduras, proteínas ou hidratos de carbono, assim como para micronutrientes, tais como cálcio, magnésio, ferro e vitaminas. A malabsorção resulta de vários estados clinicos, incluindo insuficiência pancreática. A malabsorção de proteínas é referida como "azotorreia". A malabsorção de lípidos refere-se a "diarreia gordurosa". 0 termo "lipase" refere-se a uma enzima que catalisa a hidrólise, (isto é, a separação do grupo hidroxilo e do átomo de hidrogénio dos compostos nos seus fragmentos, por meio da adição de água) de lípidos em glicerol e ácidos gordos simples. Esta reacção enzimática normalmente requer iões de cálcio (Ca2+). As lipases segregadas pelo pâncreas são extremamente importantes para a digestão da gordura (triglicéridos) na ansa superior do intestino delgado. De acordo com um enquadramento preferido, as lipases úteis nas composições e nos processos da presente invenção não são lipases pancreáticas, isto é, não são purificadas no tecido pancreático humano ou de animal. De acordo com um enquadramento mais preferido da presente invenção, as lipases são lipases microbianas. De acordo com um outro enquadramento preferido da presente invenção, a lipase é uma lipase bacteriana. As lipases bacterianas incluem, por exemplo, lipase de Pseudomonas e/ou lipase de

Burkholderia.

As lipases microbianas podem ser isoladas da sua fonte microbiana natural ou podem ser lipases microbianas recombinantes produzidas por via da tecnologia do ADN recombinante, por meio de uma célula hospedeira apropriada, seleccionada a partir de qualquer uma das células hospedeiras de bactérias, leveduras, 12 fungos, plantas, insectos ou mamíferos, em cultura, preferencialmente bactérias. As lipases recombinantes englobam ou são codificadas por ácidos nucleicos a partir de uma sequência de lipase de ocorrência natural. Além disso, as lipases recombinantes incluem uma sequência de aminoácidos que é homóloga ou praticamente idêntica a uma sequência de ocorrência natural, assim como as lipases codificadas por um ácido nucleico que é homólogo ou praticamente idêntico a um ácido nucleico que codifica uma lipase de ocorrência natural. Alternativamente, as lipases úteis nas composições e processos da presente invenção podem ser sintetizadas por técnicas convencionais de síntese de péptidos. 0 termo "protease" refere-se a uma proteinase, enzima proteolítica ou peptidase, que é uma enzima que catalisa o rompimento das ligações interiores do péptido de amida numa proteína. Especificamente, as proteases catalisam a conversão de proteínas nos seus aminoácidos componentes por meio da clivagem da ligação de amida entre o grupo carboxilo de um aminoácido e o grupo amino de outro. As proteases são geralmente identificadas pelo seu grupo catalítico, por exemplo, peptidases de ácido aspártico, peptidades de cisteína (tiol) , metalopeptidases, peptidases de serina, peptidases de treonina, proteases alcalinas ou semi-alcalinas, neutras e peptidases de mecanismo catalítico desconhecido (ver http://merops.sanger.ac.uk) . De acordo com um enquadramento preferido, as proteases úteis nas composições e nos processos da presente invenção não são proteases pancreáticas, isto é, não são purificadas no tecido pancreático humano ou de animal. De acordo com um enquadramento mais preferido da presente invenção, as proteases são proteases microbianas. De acordo com um outro enquadramento preferido da presente invenção, as 13 proteases são proteases fúngicas. De acordo com um outro enquadramento da presente invenção, a protease é uma protease de Aspergillus melleus.

As proteases microbianas podem ser isoladas da sua fonte microbiana natural ou podem ser proteases microbianas recombinantes produzidas por via da tecnologia do ADN recombinante, por meio de uma célula hospedeira apropriada, seleccionada a partir de qualquer uma das células hospedeiras de bactérias, leveduras, fungos, plantas, insectos ou mamíferos, em cultura, preferencialmente de fungos. As proteases recombinantes englobam ou são codificadas por ácidos nucleicos a partir de uma sequência de protease de ocorrência natural. Além disso, as proteases recombinantes incluem uma sequência de aminoácidos que é homóloga ou praticamente idêntica a uma sequência de ocorrência natural, assim como as proteases codificadas por um ácido nucleico que é homólogo ou praticamente idêntico a um ácido nucleico que codifica uma protease de ocorrência natural. Alternativamente, as protease úteis nas composições e processos da presente invenção podem ser sintetizadas por técnicas convencionais de síntese de péptidos. 0 termo "amilase" refere-se a uma enzima que é produzida no pâncreas e também nas glândulas salivares em seres humanos mas não em todos os mamíferos. A amilase da saliva humana é conhecida por ptialina. A amilase é a principal enzima digestiva responsável pela digestão de hidratos de carbono, por exemplo, polissacáridos, por meio da catalisação da conversão de dois componentes de amido (amilose e amilo-pectina) em açúcares simples, no intestino delgado. Mais especificamente, a amilase hidrolisa o amido, glicogénio e dextrina para formar 14 glicose, maltose e as dextrinas do limite. Clinicamente, os níveis de amilase no sangue são muitas vezes elevados em condições de pancreatite aguda e por vezes crónica. A expressão "amilases não pancreáticas" refere-se a amilases que não são purificadas a partir de tecido pancreático de seres humanos ou de animais. De acordo com um enquadramento mais preferido da presente invenção, as amilases são amilases microbianas. De acordo com um outro enquadramento preferido da presente invenção, as amilases são amilases fúngicas. De acordo com um outro enquadramento da presente invenção, a amilase é amilase de Aspergillus e, preferencialmente, é amilase de Aspergillus oryzae.

As amilases microbianas podem ser isoladas da sua fonte microbiana natural ou podem ser amilases microbianas recombinantes produzidas por via da tecnologia do ADN recombinante, por meio de uma célula hospedeira apropriada, seleccionada a partir de qualquer uma das células hospedeiras de bactérias, leveduras, fungos, plantas, insectos ou mamíferos, em cultura, preferencialmente fungos. As amilases recombinantes englobam ou são codificadas por ácidos nucleicos a partir de uma sequência de amilase de ocorrência natural. Além disso, as amilases recombinantes incluem uma sequência de aminoácidos que é homóloga ou praticamente idêntica a uma sequência de ocorrência natural, assim como as amilases codificadas por um ácido nucleico que é homólogo ou praticamente idêntico a um ácido nucleico que codifica uma amilase de ocorrência natural. Alternativamente, as amilases úteis nas composições e processos da presente invenção podem ser sintetizados por técnicas convencionais de síntese de péptidos.

As expressões "dose eficaz sob o ponto de vista 15 terapêutico" ou "quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico" referem-se à quantidade de uma composição que resulta na prevenção, retardamento do inicio dos sintomas ou melhoria dos sintomas do estado clinico a ser tratado. Uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico é aquela que é suficiente para tratar, prevenir, reduzir a severidade, retardar o aparecimento ou reduzir a ocorrência de um ou mais sintomas do estado clinico a ser tratado. Os estados clinicos que podem ser tratados utilizando as composições da presente invenção incluem, por exemplo, insuficiência pancreática, malabsorção e maldigestão. A expressão "unidade de USP" refere-se à unidade de actividade enzimática presente num agente ou numa composição, de acordo com a United States Pharmacopoeia. Uma unidade USP de lipase, protease ou amilase está definida em Pancrelipase, USP, U.S. Pharmacopeia National Formulary, USP 24, pp. 1254-1255 (2000). Os ensaios para a lipase, a protease e a amilase estão descritos nessa referência.

Caracteristicas das composições da presente invenção

Com vantagem, as composições da presente invenção melhoram a absorção de gordura, proteína e amido em pacientes que sofrem de estados clínicos tais como, por exemplo, insuficiência pancreática, o que leva a uma melhoria da nutrição e do crescimento. As composições retêm níveis elevados de actividade específica em ambientes ácidos de pepsina. Esse é o caso porque os seus componentes enzimáticos resistem ao ambiente ácido do tracto gastrointestinal superior, incluindo o pH baixo do estômago e os elevados níveis de protease do tracto gastrointestinal; permitindo que as enzimas sejam 16 libertadas para o intestino numa forma activa. Como resultado, podem ser administradas em quantidades menores por dose e por meio de menos administrações, quando se compara com os suplementos da enzima pancreática porcina. Isto, por sua vez, acomoda uma maior tolerância do paciente.

Além disso, as composições da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo sem necessidade de revestimentos entéricos nem da adição de aqentes supressores de ácidos. Esse é o caso porque os componentes enzimáticos derivados de micróbios utilizados nos vários enquadramentos das composições da presente invenção são mais estáveis face ao ácido do estômaqo do que a enzima pancreática porcina.

Componente de lipase A componente de lipase das composições da presente invenção é preferencialmente uma lipase microbiana. Mais preferencialmente, a lipase é bacteriana, em vez de ter uma origem fúngica ou de uma planta. A lipase é preferencialmente uma que seja estável num ambiente com pH ácido e/ou que seja resistente à degradação proteolítica. A lipase pode também ser utilizada sob uma forma que aumente a sua estabilidade a um pH ácido e/ou a sua resistência à degradação proteolítica. Com essa finalidade, a lipase está preferencialmente sob a forma de cristais reticulados. Qualquer uma das lipases descritas antes pode ser utilizada para formar uma componente de cristal reticulado de lipase das composições da presente invenção. 17

Cristalização da lipase

Os cristais de lipase úteis nas composições da presente invenção podem crescer utilizando processos convencionais, tal como a cristalização em lotes. Ver, por exemplo, a patente norte-americana 6.541.606. Alternativamente, os cristais de lipase podem crescer por precipitação controlada da proteina numa solução aquosa ou numa solução aquosa contendo dissolventes orgânicos. Ver, por exemplo, a patente norte-americana 5.618.710 e o pedido de patente norte-americana 2003/0017144. Como será entendido por um especialista na matéria, as condições a serem controladas durante a cristalização incluem a taxa de evaporação do dissolvente, a presença de co-solutos e tampões apropriados, o pH e a temperatura, por exemplo.

Os cristais de lipase podem ser produzidos por combinação da enzima lipase a ser cristalizada com um dissolvente apropriado ou um dissolvente aquoso contendo agentes de precipitação apropriados, tais como sais ou agentes orgânicos. Combina-se o dissolvente com lipase e, eventualmente, submete-se a agitação a uma temperatura determinada experimentalmente como sendo a apropriada para a indução da cristalização e aceitável para manter a estabilidade e a actividade da proteína. O dissolvente pode eventualmente incluir co-solutos, tais como catiões bivalentes, co-factores ou caotrópicos, assim como espécies de tampões para controlar o pH. A necessidade dos co-solutos e as respectivas concentrações podem ser determinadas experimentalmente para facilitar a cristalização. Para um processo à escala industrial, a precipitação controlada que leva à cristalização pode ser realizada de uma forma melhor por uma 18 co- simples combinação de proteína, precipitante, solutos e, eventualmente, tampões, num processo por lotes. Alternativamente, também se podem utilizar os processos de cristalização em laboratório, tal como diálise ou difusão de vapor. McPherson et al., Methods Enzymol., 114, p. 112-120 (1985) e Gilliland, J. Crystal Growth, 90, p. 51-59 (1988) incluem uma lista compreensiva de condições apropriadas na literatura de cristalização. Ocasionalmente, a incompatibilidade entre o meio de cristalização e o agente de reticulação pode requerer uma alteração do tampão ou do dissolvente, antes da reticulação. A lipase cristaliza sob um certo número de condições, incluindo um intervalo de pH de cerca de 4-9. Para a preparação do componente de lipase, das composições da presente invenção, os agentes de precipitação úteis incluem isopropanol, terc-butanol, 2-metil-2,4-pentandiol (MPD), sulfato de amónio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio e outros i, conhecidos dos especialistas na matéria. Os sais úteis incluem catiões bivalentes ou monovalentes e os seus sais.

Os cristais de lipase úteis nas composições da presente invenção podem ter uma maior dimensão entre cerca de 0,01 ym e cerca de 500 ym, em alternativa, entre cerca de 0,1 ym e cerca de 50 ym ou entre cerca de 0,1 ym e cerca de 10 ym. Podem ser de uma forma seleccionada no grupo que consiste em esferas, agulhas, hastes, placas, tais como hexágonos e quadrados, rombóides, cubos, pirâmides duplas e prismas. 19

Reticulação dos cristais de lipase

Depois de os cristais lipase terem crescido num meio adequado, podem ser reticulados. A reticulação resulta na estabilização da estrutura cristalina através da introdução de ligações covalentes entre as moléculas de proteínas constituintes do cristal. Isto torna possivel a transferência da enzima para um ambiente alternativo que, para uma dada enzima, pode, por outro lado, ser incompatível com a existência da estrutura cristalina ou com a enzima intacta.

Como resultado da reticulação dos cristais de lipase, pode-se alterar a estabilidade enzimática (por exemplo, pH, temperatura, estabilidade mecânica e/ou quimica), o perfil do pH da actividade da lipase, a solubilidade, a uniformidade do tamanho dos cristais ou o seu volume, a taxa de libertação de lipase do cristal e/ou a dimensão dos poros e a forma entre os diferentes moléculas individuais de enzima na estrutura de cristal subj acente.

Vantajosamente, a reticulação realiza-se de tal forma que os cristais reticulados resultantes compreendem uma lipase que apresenta pelo menos cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 % 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,7 % ou 99,9 % ou mais de actividade de lipase quando comparada com uma lipase não modificada. A estabilidade pode ser aumentada em pelo menos cerca de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 % ou mais, quando comparada com a lipase não modificada. A estabilidade pode ser medida em condições de armazenagem, tais como estabilidade do pH, estabilidade da temperatura, estabilidade contra 20 proteases, incluindo proteases gastrointestinais e Pronase™, estabilidade à dissolução ou, por exemplo, como estabilidade biológica in vivo.

Em certos casos, a reticulação dos cristais de lipase atrasa a dissolução da lipase em solução, imobilizando efectivamente as moléculas de enzima em partículas microcristalinas. Após exposição a um estimulo no ambiente circundante dos cristais reticulados de lipase, tais como as condições de utilização em vez das de armazenagem, os cristais de lipase dissolvem-se, libertando polipéptido de lipase e/ou aumentando a actividade da lipase. A taxa de dissolução pode ser controlada por um ou mais dos seguintes factores: o grau de reticulação, a duração do periodo de exposição de cristais de lipase ao agente de reticulação, a taxa de adição do agente de reticulação aos cristais de lipase, a natureza do agente de reticulação, o comprimento da cadeia do agente de reticulação, o pH, a temperatura, a presença de reagentes de sulfidrilo, tais como cisterna ou glutationa, a superfície dos cristais reticulados de lipase, a dimensão dos cristais reticulados de lipase ou a forma dos cristais reticulados de lipase, por exemplo.

Os cristais de lipase podem ser reticulados utilizando um ou uma combinação de agentes de reticulação, incluindo agentes de reticulação multifuncionais, incluindo reagentes bifuncionais, ao mesmo tempo (em paralelo) ou em sequência. Em vários enquadramentos, as reticulações entre os cristais lipase diminuem ou enfraquecem após a exposição a um estímulo do ambiente circundante ou durante um determinado período de tempo, levando assim à dissolução de lipase ou à libertação da actividade. Alternativamente, as reticulações podem 21 quebrar no ponto de ligação, levando à dissolução da proteína ou à libertação da actividade. Ver, por exemplo, as patentes norte-americanas 5.976.529 e 6.140.475. A reticulação pode ser realizada de acordo com qualquer técnica convencional de reticulação. A concentração final de agente de reticulação nos cristais reticulados de lipase deve variar entre cerca de 0,001 mM e cerca de 300 mM, de preferência entre 1,0 mM e cerca de 50 mM, mais preferivelmente entre cerca de 2,0 mM e cerca de 5,0 mM.

De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o agente de reticulação é o bis(sulfo-succinimidil)suberato ("BS3"). Outros agentes de reticulação úteis incluem glutaraldeído, succinaldeído, octano-dialdeído e glioxal. Outros agentes de reticulação multifuncionais incluem halogeno-triazinas, por exemplo, cloreto cianúrico; halogeno-pirimidinas, por exemplo, 2,4,6-tricloro/bromo-pirimidina; anidridos ou halogenetos de ácidos alifáticos ou aromáticos mono- ou di-carboxílicos, por exemplo, anidrido maleico, cloreto de (met)acriloílo, cloreto de cloroacetilo; compostos de N-metilol, por exemplo, N-metilol-cloro-acetamida, di-isocianatos ou di-isotiocianatos, por exemplo, fenileno-1,4-di-isocianato e aziridinas. Outros agentes de reticulação incluem epóxidos, tal como, por exemplo, bi-epóxidos, tri-epóxidos e tetra-epóxidos. Para obter uma lista representativa de outros agentes de reticulação disponíveis, veja, por exemplo, a edição de 2003-2004 do Pierce Chemical Company Catalog. Outros exemplos de agentes de reticulação incluem: 3,3'-ditiobis-propionimidato de dimetilo*HCl (DTBP); ditiobis-(succinimidilpropionato) (DSP) ; bismaleimido-hexano (BMH); 22 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno (DFDNB); suberimidato de dimetilo·2HC1 (DMS); glutarato de disuccinimidilo (DSG), tartarato de disulfo-succinimidilo (sulfo-DST), cloridrato de l-etil-3-[3-dimetilaminoproplil]carbodi-imida (EDC); glicolbis[sulfo-succinimidilsuccinato] de etileno (sulfo-EGS) , éster de N-[γ-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS); N-hidroxisulfo-succinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HSAB); hexanoato de sulfo-succinimidil-6-[a-metil-a-(2-piridilditio)toluamido] (sulfo-LC-SMPT); bi-sulfureto de bis-[β-(4-azido-salicilamido)etilo] (BASED) e NHS-PEG-vinilsulfona (NHS-PEG-VS).

Também se podem utilizar agentes de reticulação reversíveis. Esses agentes de reticulação reversíveis são agentes de reticulação multifuncionais em que se incorpora um agente estimulador como um grupo separado. A funcionalidade reactiva está envolvida na ligação das cadeias laterais reactivas de aminoácidos de uma proteína e o agente estimulador é constituído por uma ligação que pode ser quebrada, alterando uma ou mais das condições no ambiente circundante (por exemplo, pH, presença de agente de redução, da temperatura ou a actividade termodinâmica da água). 0 agente de reticulação pode ser homofuncional ou heterofuncional. A funcionalidade reactiva (ou parte dela) pode ser escolhida, por exemplo, entre um dos seguintes grupos funcionais (em que R, R', R"e R''' podem ser grupos alquilo, arilo ou hidrogénio): I. Dadores reactivos de acilo, como por exemplo: ésteres de carboxilato RCOOR', amidas RCONHR', azidas de acil RCON3, carbodi-imidas R-N=C=N-R', ésteres de N-hidroxi-imida, RCO-O-NR', imidoésteres R-C=NH2+ (OR' ) , 23 anidridos RCO-C-COR', carbonatos RO-CO-O-R7, uretanos RNHCONHR7, halogenetos de ácido RCOHal (em que Hal = halogéneo), hidrazidas de acilo RCONNR"R" e 0-acilisoureias RC0-0-C=NR7(-NR"R"7). II. Grupos carbonilo reactivos, como, por exemplo: aldeídos RCHO e cetonas RCOR7, acetais RC0(H2)R', e cetais RR'C02R'R'' (grupos funcionais reactivos contendo carbonilo conhecidos dos especialistas na matéria da imobilização e reticulação de proteína (Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Company 2003-2004; S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linkingu, (1991). III. Dadores de alquilo ou de arilo, como por exemplo: halogenetos de alquilo ou de arilo R-Hal, azidas R-N3, ésteres de sulfato RSO3R', ésteres de fosfato RP0(0R'3), sais de alquiloxónio RsO+, sulfónio RsS+, ésteres de nitrato RONO2, receptores de Michael RCR7=CR7 7 7 COR", fluoretos de arilo ArF, isonitrilos RN+^c-, halogenoaminas R2N-Hal, alcenos e alcinos. IV. Grupos contendo enxofre, tal como, por exemplo: bisulfuretos RSSR7, sulfidrilos RSH e epóxidos R2COCR7 2· V. Sais, tal como, por exemplo: sais de amónio e alquilo ou de arilo R4N+, carboxilato RC00-, sulfato ROSO3-, fosfato ROPO3 e aminas R3N.

Agentes de reticulação reversíveis, por exemplo, compreendem um agente estimulador. Um agente estimulador inclui um alquilo, um arilo ou outra cadeia com um grupo de activação que pode reagir com a proteína a ser reticulada. Esses grupos reactivos podem ser uma variedade de grupos, tais como aqueles que são sensíveis à deslocação nucleofílica, dos radicais livres ou eletrofílica, incluindo halogenetos, aldeídos, carbonatos, 24 uretanos, xantanos e epóxidos, entre outros. Por exemplo, os grupos reactivos podem ser instáveis aos ácidos, bases, fluoretos, enzimas, redução, oxidação, tióis, metais, fotólise, radical ou calor. 0 cristal reticulado de lipase pode ser fornecido sob a forma de pó, por exemplo, por liofilização ou pulverização anidra. A liofilização ou a secagem por congelação, permite que a água seja separada da composição, produzindo um cristal que pode ser armazenado a uma temperatura que não é a de refrigeração (temperatura ambiente) por longos periodos de tempo e depois é facilmente reconstituído em dissolventes aquosos, orgânicos ou mistos à escolha, sem a formação de suspensões amorfas e com um risco minimo de desnaturação. Carpenter et al., Pharm. Res., 14, p. 969-975 (1997) . A liofilização pode ser realizada conforme descrito na patente norte-americana 5.618.710 ou por qualquer outro método conhecido na técnica. Por exemplo, o cristal reticulado de lipase é primeiro congelado e depois colocado em vácuo forte, onde a água cristalina sublima, deixando para trás um cristal de lipase, contendo apenas as moléculas de água fortemente ligadas.

Caracteristicas dos cristais de lipase reticulados A actividade enzimática dos cristais reticulados de lipase pode ser medida usando qualquer processo convencional. Por exemplo, a actividade da lipase pode ser determinada espectrofotometricamente, conforme descrito no exemplo 6 da patente norte-americana 5.618.710. A actividade da lipase pode ser avaliada através da monitorização da hidrólise do acetato de p-nitrofenilo do substrato. A clivagem do substrato é monitorizada pelo 25 aumento da densidade óptica a 400 nm, com uma concentração inicial do substrato de 0,005 % e uma concentração inicial

_ Q de enzima de 1,5 x 10 M. Adiciona-se a enzima lipase a um volume de mistura reaccional de 5 ml contendo substrato em Tris 0,2 M, a pH 7,0, à temperatura ambiente. A lipase cristalina é removida da mistura reaccional por centrifugação antes de se medir a densidade óptica.

Alternativamente, a actividade da lipase pode ser medida in vitro por hidrólise de azeite, como descrito nos exemplos 2-4 da patente norte-americana 5.614.189. A actividade da lipase também pode ser medida in vivo. Por exemplo, um pequeno volume (cerca de 3 ml) de azeite ou de óleo de milho pode ser marcado com o tiocianato 99Tc- (V) e pode-se marcar a lipase cristalina com HlIn. A gordura marcada é misturada com um alimento animal no qual a lipase cristalina marcada tenha sido aspergida. As imagens cintigráficas do estômago proximal e distai e do intestino delgado são obtidos até haver < 5 % de actividade no estômago. Determina-se então as curvas de esvaziamento para cada um dos isótopos (por exemplo, a percentagem de retenção no estômago ao longo do tempo) e as quantidades de isótopos que entram no intestino delgado proximal, médio e distai das respectivas regiões de interesse.

Preferivelmente, o componente de lipase reticulada das composições da presente invenção tem uma actividade altamente especifica. Uma actividade de lipase altamente especifica é normalmente uma actividade que mostra uma actividade especifica para a trioleina (azeite) maior do que 500, 1.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 ou mais unidades/mg de proteina. 26

Preferivelmente, a componente de lipase reticulada das composições da presente invenção também é estável por um longo periodo de tempo num ambiente hostil encontrado nas regiões gastrointestinais ou seja, regiões gástricas, duodenais e intestinais. Por exemplo, a lipase é estável, de preferência, durante pelo menos uma hora em pH ácido, por exemplo, um ambiente no qual o pH é inferior a 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 ou menos. Tal como se utiliza aqui, "estável" significa que o cristal de lipase é mais activo do que a forma solúvel de lipase para uma determinada condição e tempo. Assim, um cristal de lipase estável mantém uma percentagem maior da sua actividade inicial do que a correspondente forma solúvel de lipase. Nalguns enquadramentos, o cristal lipase retém pelo menos 10 % da sua actividade após exposição a condições de tempo particulares. Noutros enquadramentos, a lipase mantém pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais da sua actividade.

Como alternativa ou para além disso, a componente de cristal reticulado de lipase das composições da presente invenção é resistente ao calor. Por exemplo, em vários enquadramentos, é estável durante pelo menos uma hora, a 30 °C, 37 °C ou 40 °C. A componente de protease A componente de protease das composições da presente invenção é uma protease microbiana. Preferencialmente, a protease é fúngica, em vez de ser de origem bacteriana ou vegetal. Mais preferivelmente, a protease é uma protease de Aspergillus. O mais preferível, é que a protease seja uma protease de Aspergillus melleus. De acordo com um enquadramento preferido, a componente de protease das 27 numa composições da presente invenção está numa forma, cristalizada não reticulada. Os cristais de protease podem ser preparados de acordo com as técnicas de cristalização descritas antes para a lipase, utilizando, por exemplo, etanol como agente de precipitação. Alternativamente, a componente de protease das composições da presente invenção pode estar sob formas não cristalinas, em formas cristalinas reticuladas ou revestidas ou encapsuladas ou de alguma forma formulada de modo que não digira as outras componentes proteicas das composições. A componente de amilase A componente de amilase das composições da presente invenção é preferencialmente uma amilase microbiana. Preferencialmente, a amilase é fúngica, em vez de ser de origem bacteriana ou vegetal. Mais preferencialmente, a amilase é uma amilase de Aspergillus. 0 mais preferível, é que a amilase seja de Aspergillus oryzae. De acordo com um enquadramento preferido, a componente de amilase das composições da presente invenção está numa forma amorfa. Alternativamente, a componente de amilase das composições da presente invenção pode estar sob formas cristalinas, incluindo as formas reticuladas e não cristalinas ou revestidas ou encapsuladas ou formuladas de modo a que mantenha a sua actividade após a administração oral.

Composições compreendendo cristais reticulados de lipase, uma protease e uma amilase

As composições de acordo com a presente invenção incluem as que compreendem cristais reticulados de lipase microbiana, uma protease microbiana e uma amilase microbiana, numa proporção de cerca de 1,0:1,0:0,15 28 unidades USP de actividade enzimática, juntamente com um ou mais excipientes. Preferencialmente, a lipase é uma lipase bacteriana e a protease e a amilase são de origem fúngica. 0 que é mais preferível é que a composição compreenda cristais reticulados de lipase bacteriana com o agente de reticulação BS-3, cristais de protease de Aspergillus melleus e amilase de Aspergillus oryzae solúvel; numa proporção de cerca de 1,0:1,0:0,15 unidades USP de actividade enzimática. A reticulação da componente de lipase das composições da presente invenção proporciona maior estabilidade a pHs extremos e protecção sob proteólise, enquanto as componentes da protease e da amilase mantêm o máximo de solubilidade para a dissolução efectiva. Mais particularmente, a cristalização e a reticulação da componente de lipase ajuda a preparar uma composição com uma actividade enzimática melhorada em doses mais baixas. A forma de cristal da protease também ajuda a proporcionar uma maior estabilidade, pureza e potência da enzima.

Em enquadramentos alternativos da presente invenção, a lipase pode estar em qualquer forma estabilizada e uma ou ambas as componentes de protease e de amilase das composições podem estar sob a forma cristalina, amorfa ou semi-cristalina. Alternativamente, uma ou ambas podem estar na forma liofilizada. E, independentemente da sua forma, uma ou ambas podem estar reticuladas.

As composições da presente invenção, vantajosamente, levam a aumentos correlacionados no coeficiente de absorção de gordura e no coeficiente de absorção de azoto em pacientes tratados com elas. Além disso, as composições da presente invenção incluem um nivel de amilase que 29 proporciona uma maior digestão do amido e a absorção de hidratos de carbono nesses pacientes. Em virtude da presente invenção, verificou-se que tal efeito na digestão do amido e na absorção de hidratos de carbono pode ser conseguido usando quantidades muito menores de amilase em relação à lipase e à protease do que as dos suplementos pancreáticos de suinos. Esta verificação é contrária à crença existente na técnica de que a amilase não é necessária para o tratamento da insuficiência pancreática, particularmente em pacientes com fibrose quistica.

Os excipientes úteis nas composições de acordo com a presente invenção actuam como cargas ou uma combinação de cargas, tais como as usadas em composições farmacêuticas. Num enquadramento preferido da presente invenção, o excipiente compreende celulose microcristalina, maltrina, crospovidona, dióxido de silicio coloidal, estearato de magnésio e talco. Um outro grupo preferido de excipientes inclui um ou uma mistura de: sacarose, tre-halose, lactose, sorbitol, lactitol, manitol, inositol, sais de sódio e de potássio, tais como acetato, fosfatos, citratos e borato, glicina, arginina, óxido de polietileno, álcool polivinilico, polietileno-glicol, hexileno-glicol, metoxi-polietileno-glicol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclo-dextrina, polilisina e poliarginina.

Outros excipientes preferidos, podem ser qualquer um ou uma mistura de: 1) aminoácidos, como glicina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, asparagina, glutamina, prolina; 2) hidratos de carbono, por exemplo, monossacáridos como glicose, frutose, galactose, manose, arabinose, xilose, ribose, 3) dissacáridos, tal como lactose, tre-halose, maltose, sacarose, 4) polissacáridos, tal como maltodextrinas, dextranos, amido, glicogénio; 5) 30 alditois, tal como manitol, xilitol, lactitol, sorbitol; 6) ácido glucurónico, ácido galacturónico; 7) ciclodextrinas, tais como ciclodextrina metilica, hidroxipropil^-ciclodextrina e similares; 8) moléculas inorgânicas, tal como cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, fosfatos de sódio e de potássio, ácido bórico, carbonato de amónio e fosfato de amónio; 9) moléculas orgânicas, tais como acetatos, citrato, ascorbato, lactato 10) agentes de emulsão ou de solubilização/estabilização como acácia, dietanolamina, monoestearato de glicerilo, lecitina, monoetanolamina, ácido oleico, álcool de oleilo, poloxâmero, polisorbatos, sulfato de laurilo e sódio, ácido esteárico, monolaurato de sorbitano, monoestearato de sorbitano e outros derivados de sorbitano, derivados de polioxilo, cera, derivados de polioxietileno, derivados de sorbitano; e 11) reagentes que aumentam a viscosidade, como agar, ácido alginico e os seus sais, goma de guar, pectina, álcool polivinilico, óxido de polietileno, celulose e os seus derivados, carbonato de propileno, polietileno-glicol, hexileno-glicol, tiloxapol. Também se podem utilizar sais desses compostos.

Outros exemplos de excipientes estão descritos no Handbook of Pharmaceutical Excipients, publicado conjuntamente pela American Pharmaceutical Association e pela Pharmaceutical Society do Reino Unido. No que respeita às composições, de acordo com a presente invenção, os excipientes são ingredientes inactivos e a lipase, a protease e a amilase são ingredientes activos. A proporção entre ingredientes activos e inactivos, nas composições da presente invenção, numa base de p/p, pode estar entre cerca de 1:9 e cerca de 9:1, de preferência, entre cerca de 1:6 até cerca de 6:1. 31

Num enquadramento alternativo da presente invenção, qualquer uma das componentes de lipase, protease ou amilase pode estar presente na composição em associação com um veiculo polimérico. Isso providencia uma composição de libertação controlada, resistente a ácidos, que permite a libertação da enzima em quantidades eficazes e em doses baixas para o intestino, isto é, o intestino distai, após a ingestão oral.

Os veiculos poliméricos úteis incluem, por exemplo, polímeros utilizados para o encapsulamento de cristais de proteínas para o fornecimento de proteínas, incluindo a libertação biológica controlada. Tais polímeros incluem polímeros biocompativeis e biodegradáveis ou as suas misturas. De preferência, o veiculo polimérico é um polimero biodegradável. A taxa de dissolução e, portanto, a libertação das enzimas será determinado pela técnica de encapsulamento particular, a composição do polimero, a reticulação do polimero, a espessura do polimero, a estabilidade do polimero, a geometria dos cristais da enzima e o grau, se houver, de reticulação da enzima. De acordo com um enquadramento, as composições da presente invenção são encapsuladas numa matriz do veiculo polimérico; proporcionando assim maior protecção, para as componentes de lipase, protease e amilase, em relação ao ambiente hostil do tracto gastrointestinal.

Vias, formas, regimes e processos de tratamento da dose da composição composições tratamento indivíduo,

De acordo com um enquadramento preferido, as da presente invenção são úteis para o da insuficiência pancreática em qualquer incluindo aqueles que sofrem de fibrose 32 quística. De acordo com um enquadramento alternativo, as composições da presente invenção são úteis para o tratamento da malabsorção num indivíduo. Outros enquadramentos da presente invenção incluem o uso das composições da presente invenção para aumentar o coeficiente de absorção de gordura ou para aumentar o coeficiente de absorção de azoto num indivíduo. Outro enquadramento da presente invenção inclui o uso dessas composições para aumentar tanto o coeficiente de absorção de gordura como o coeficiente de absorção de azoto num indivíduo, eventualmente, do mesmo valor. Num enquadramento adicional, as composições da presente invenção são úteis para aumentar a absorção de hidratos de carbono num indivíduo. A utilização das composições, de acordo com a presente invenção, compreende a administração, a um indivíduo, de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico dessa composição. Qualquer uma das composições da presente invenção pode ser usada para tratar qualquer indivíduo que sofra de insuficiência pancreática, incluindo pacientes com fibrose quística. Do mesmo modo, qualquer destas composições pode ser usada para tratar qualquer paciente com fibrose quística. A utilização das composições da presente invenção inclui a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma composição da presente invenção, em que essa quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico aumenta o coeficiente de absorção de gordura nesse indivíduo de um valor entre cerca de 30 % e cerca de 35 % em relação ao valor inicial, quando do coeficiente de absorção de gordura inicial no referido indivíduo é menor ou igual a 40 %. 33

Preferencialmente, o aumento do coeficiente de absorção de gordura nesse indivíduo é cerca de 30 % superior ao valor inicial. Num enquadramento alternativo, a utilização compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de uma composição da presente invenção, em que essa quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, aumenta o coeficiente de absorção de gordura nesse indivíduo de um valor entre cerca de 10 % e cerca de 25 % em relação ao valor inicial, quando o coeficiente inicial de absorção de gordura no referido indivíduo é maior do que 40 % mas inferior a 85 %. Preferencialmente, o aumento do coeficiente de absorção de gordura nesse indivíduo é cerca de 15 % superior ao valor inicial.

Adicionalmente, a utilização das composições, de acordo com a presente invenção, inclui aquela que compreende a administração, a um indivíduo, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de uma composição da presente invenção, em que essa quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico aumenta o coeficiente de absorção de azoto nesse indivíduo de um valor entre cerca de 30 % e cerca de 35 % em relação ao valor inicial, quando do coeficiente inicial de absorção de azoto, no referido indivíduo, é menor ou igual a 40 %. Preferencialmente, o aumento do coeficiente de absorção de azoto nesse indivíduo é cerca de 30 % superior ao valor inicial. Num enquadramento alternativo, a utilização compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma composição da presente invenção, em que essa quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico aumenta o coeficiente de absorção de azoto nesse indivíduo de um valor entre cerca de 10% e cerca de 25% do valor inicial, 34 quando o coeficiente inicial de absorção de azoto no referido indivíduo é maior do que 40 % mas inferior a 85 %. Preferencialmente, o aumento do coeficiente de absorção de azoto nesse indivíduo é cerca de 15% superior ao valor inicial.

Noutro enquadramento, o uso de composições, de acordo com a presente invenção, compreende a administração, a um indivíduo, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de uma composição da presente invenção, em que a quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, aumenta a absorção de hidratos de carbono, nesse indivíduo, num grau maior ou igual a cerca de 10 % em relação ao valor inicial. Noutro enquadramento, tais utilizações incluem aquelas em que a quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de uma composição da presente invenção, é aquela que aumenta a absorção de hidratos de carbono, nesse indivíduo, num grau maior ou igual a cerca de 20 % em relação ao valor inicial. Como se mediu aqui, um aumento de 10 % na absorção de hidratos de carbono constitui um extra de 90 calorias por dia. Após 365 dias, seria absorvido um total de 32.850 calorias adicionais por ano. Porque são precisas aproximadamente 3.500 calorias para ganhar 0,45 kg, haveria um ganho ligeiramente superior a 4,08 quilos por ano, com base num aumento de 10 % na absorção de hidratos de carbono num indivíduo.

As composições, de acordo com a presente invenção, podem ser formuladas por qualquer via convencional de libertação, incluindo a via de administração através do tracto gastrointestinal superior, por exemplo, a boca (por exemplo, em cápsulas, comprimidos, suspensões ou com os alimentos) ou no estômago ou no intestino superior (por 35 exemplo, por tubo ou infusão), via oral. Preferencialmente, as composições são formuladas para fornecimento oral. De acordo com isto, a composição pode estar em qualquer forma farmacêutica, incluindo a de um sólido, liquido, suspensão ou dispersão, tais como, por exemplo, uma cápsula, um comprimido, pílula, saqueta ou drageia. Para bebés e crianças ou qualquer adulto que seja incapaz de tomar comprimidos ou cápsulas, as composições são administradas sob a forma de líquidos, suspensões ou formas em saquetas e podem ser administradas com outros alimentos ou produtos compatíveis.

Num enquadramento da presente invenção, as composições de acordo com a presente invenção são administradas a um indivíduo no momento de uma refeição ou de uma refeição ligeira, numa ou mais cápsulas, suspensões ou saquetas. De preferência, as composições da presente invenção são administradas a um indivíduo em uma a duas cápsulas, suspensões ou saquetas por refeição ou refeição ligeira. As composições podem ser administradas após metade da refeição ou da refeição ligeira ter sido consumida. A quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de uma composição para o tratamento da insuficiência pancreática, de acordo com a presente invenção, compreende lipase, protease e amilase, numa proporção de cerca de 1:1:0,15 unidades USP de actividade da enzima e, por dose, compreende: um nível de lipase activa entre cerca de 5.000 unidades USP e cerca de 100.000 unidades USP, um nível de protease activa entre cerca de 5.000 unidades USP e cerca de 100.000 unidades USP e um nível de amilase activa entre cerca de 750 unidades USP e cerca de 15.000 unidades USP. Mais preferivelmente, tais composições compreendem lipase, protease e amilase numa proporção de cerca de 1:1:0,15 36 unidades USP de actividade da enzima e, por dose, inclui: um nivel de lipase activa entre cerca de 25.000 unidades USP e cerca de 100.000 unidades USP, um nivel de protease activa entre cerca de 25.000 unidades USP e cerca de 100.000 unidades USP e um nivel de amilase activa entre cerca de 3.750 unidades USP e cerca de 15.000 unidades USP. O mais preferível é que tais composições compreendem lipase, protease e amilase numa proporção de cerca de 1:1:0,15 unidades USP de actividade da enzima e, por dose, inclui: um nivel de lipase activa de cerca de 25.000 unidades USP; um nivel de protease activa de cerca de 25.000 unidades USP e um nivel de amilase activa de cerca de 3.750 unidades USP.

Para as crianças, as composições de acordo com a presente invenção compreendem lipase, protease e amilase numa proporção de cerca de 1:1:0,15 unidades USP de actividade da enzima e, por dose, inclui: um nível de lipase activa entre cerca de 12.500 unidades USP e cerca de 25.000 unidades USP, um nível de protease activa entre cerca de 12.500 unidades USP e cerca de 25.000 unidades USP e um nível de amilase activa entre cerca de 1.875 unidades USP e cerca de 3.750 unidades USP. Para as crianças, tais composições compreendem lipase, protease e amilase numa proporção de cerca de 1:1:0,15 unidades USP de actividade da enzima e, por dose, inclui: um nível de lipase activa entre cerca de 500 unidades USP e cerca de 1.000 unidades USP, um nível de protease activa entre cerca de 500 unidades USP e cerca de 1.000 unidades USP e um nível de amilase activa entre cerca de 75 unidades USP e cerca de 150 unidades USP. Para todos os números unitários e os intervalos da actividade da enzima aqui discutidos, uma unidade de lipase, protease ou amilase é definida de acordo com os ensaios antes indicados para a 37 respectiva enzima. As quantidades descritas antes são, respectivamente, também quantidades eficazes sob o ponto de vista terapêutico no tratamento da malabsorção ou da maldigestão em adultos, crianças ou bebés ou para o aumento de qualquer um dos coeficiente de absorção de gordura, coeficiente de absorção de azoto, absorção de hidratos de carbono ou digestão de amido em adultos, crianças ou bebés. 0 modo mais eficaz de administração e de regime de dosagem das composições , de acordo com a presente invenção, vai depender do efeito desejado, do tratamento anterior, se for o caso, do estado de saúde do individuo ou da resposta à terapia e à decisão do médico assistente.

Após a melhoria do estado clinico do individuo, pode-se adoptar um regime de manutenção, se necessário. Posteriormente, a dose ou a frequência de administração ou ambas podem ser reduzidas, em função dos sintomas, para um nivel em que o estado clinico melhorado se mantém. Os indivíduos podem, no entanto, necessitar de um tratamento intermitente numa base de longo prazo face a qualquer recorrência dos estados clinicos ou dos sintomas.

Para que a presente invenção possa ser melhor entendida, estabeleceram-se os exemplos que se seguem. Estes exemplos têm apenas fins ilustrativos e não foram construídos como limitando, de qualquer maneira, o âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem referem-se a composições de acordo com a presente invenção, bem como estudos 38 clínicos avaliando a sua segurança e eficácia para o tratamento da insuficiência pancreática. Estes estudos incluíram ensaios clínicos da fase 1 e a fase 2 em pacientes com fibrose quística que sofrem de insuficiência pancreática. 0 estudo da fase 2 avaliou a eficácia das composições, de acordo com a presente invenção, medindo as mudanças no coeficiente de absorção de gordura ("CAG"), no coeficiente de absorção de azoto (CAA), na absorção oral de hidratos de carbono, no peso das fezes por dia, no número de fezes por dia e na qualidade de vida, em termos de sintomas gastrointestinais, conforme medido pelo questionário da fibrose quística ("QFQ"). 0 estudo também avaliou a dosagem de tais composições que providenciam o mais alto grau do coeficiente clinicamente significativo de melhoria da absorção de gordura em relação ao valor inicial (sem enzima) nos indivíduos tratados.

Como foi demonstrado, no estudo da fase 2, as composições de acordo com a presente invenção providenciam um aumento estatisticamente significativo no CAG médio e no CNA desde o início até o período de tratamento em pacientes com fibrose quística com insuficiência pancreática. Verificou-se que as composições, de acordo com a presente invenção, eram eficazes numa dose mínima de 25.000 unidades USP de lipase, 25.000 unidades USP de protease e 3.750 unidades de USP de amilase por cápsula ("a dose média" ou "unidade 2" do estudo); levando a um aumento significativo 10 %) tanto no CAG como CNA na maioria dos indivíduos. O CAG e o CNA também aumentaram quando a dose de tratamento continha lipase, protease e amilase numa proporção de 100.000:100.000:15.000 unidades USP de actividade enzimática por cápsula ("a dose mais 39 elevada" da "unidade 3" do estudo) . No entanto, não houve diferença estatística entre os regimes de dose média e dose mais alta no que respeita quer ao CAG ou ao CNA. As composições, de acordo com a presente invenção e usadas na fase 2 do estudo também incluem as administradas numa dose de 5.000 unidades USP de lipase, 5.000 unidades USP de protease e 750 unidades USP de amilase por cápsula ("dose baixa" ou "unidade 1" do estudo).

Vantajosamente, mesmo após o controle para valores iniciais de CAG e de CNA e o género dos indivíduos tratados, este efeito das composições, de acordo com a presente invenção, no CAG e no CNA manteve-se estatisticamente significativo (p = 0,0003 e < 0,0001, respectivamente, para os grupos de tratamento com as doses médias e mais elevadas). Quando se examinou tanto o CAG como o CAA, como quartis separados (figuras 1 e 2) as maiores mudanças foram observadas em indivíduos com valores de referência < 40 % e, proporcionalmente, mudanças menores em indivíduos com valores iniciais de CAG e CAA > 4 0 %. No que respeita ao CAG, o aumento médio no grupo de tratamento com uma dose média, dos oito indivíduos com CAG ^ 40 % do valor inicial, foi de 35,3 %. O aumento médio no grupo de 12 indivíduos de dose maior,

com um valor inicial de CAG ^ 40 %, foi de 30,4 %. O aumento global no CAG em 2 0 indivíduos com um valor base de CAG < 4 0 %, tanto para os grupos de dose média como de dose mais elevada, foi de 32,3 %.

As composições, de acordo com a presente invenção, também produziram um efeito significativo do tratamento, medida em termos de mudança no número e peso das fezes por dia, nos indivíduos tratados. Os indivíduos que receberam a dose mais elevada apresentaram uma diminuição 40 significativa no número de fezes em relação ao valor inicial até ao periodo de tratamento, enquanto a diminuição do peso das fezes foi estatisticamente significativa para ambos os grupos de tratamento com uma dose média e com uma dose mais elevada. De facto, houve uma correlação inversa altamente significativa (R -0,7283, p < 0,0001) entre a alteração na absorção de gordura e a alteração no peso das fezes. A este respeito, portanto, a dose mais elevada (unidade 3) do estudo não diferiu significativamente da dose média (unidade 2).

Em todos os indivíduos do estudo, embora não tenha havido mudanças globais estatisticamente significativas, notou-se no ensaio de estimulação do amido, com e sem enzimas, o efeito observado nos indivíduos que receberam uma dose mais elevada tanto na alteração máxima da glicose como na área sob a curva (AUC) que tenderam (p <0,057) para uma direcção que sugeriu a actividade da amilase. Além disso, uma análise ad-hoc por meio do ensaio exacto de Fischer mostrou que mais indivíduos no grupo de dose média e no grupo de dose maior tiveram um aumento ^ 10 % na alteração máxima da glicose no seguimento do ensaio de estimulação do amido, do que o grupo de tratamento com dose mais baixa, com base na comparação dos períodos de tratamento com e sem enzimas (p = 0,0138). Esses resultados demonstram que as funções da amilase, como um componente importante das composições da presente invenção, levam a uma melhor digestão do amido e a uma melhor absorção dos hidratos de carbono.

Nenhum evento adverso sério foi relatado nos indivíduos tratados com as composições de acordo com a presente invenção, que foi bem tolerada para todas as doses na fase 2 do estudo. Nenhum indivíduo morreu no 41 decorrer deste estudo.

Exemplo 1 - Preparação das composições do estudo

As composições utilizadas nos estudos da fase 1 e da fase 2, aqui discutidos, compreendem lipase, protease e amilase, cada uma das quais foi fabricada separadamente, em condições controladas, a partir de diferentes tipos de estirpes microbianas antes do isolamento, purificação e secagem. 0 fabrico foi realizada de modo a fornecer composições que sejam estáveis e mantenham uma potente actividade enzimática dentro do intestino delgado.

Lipase: Os processos de produção e purificação da lipase bactérias são bem conhecidos dos especialistas na matéria. Por exemplo, a componente de lipase das composições foi produzido através da fermentação da bactéria Burkholderia cepacia (anteriormente conhecida como Pseudomonas cepacia). A fermentação ocorreu num fermentador de 25 mil litros. A estirpe foi retirada de um banco de células congeladas e liofilizadas, cresceu num plano inclinado, colocado em oito litros de cultura de sementes, depois foi fermentada nnum fermentador de sementes de 2.500 litros e, finalmente, foi produzida num fermentador de 25.000 litros. Após a fermentação, os organismos viáveis foram mortos por tratamento térmico e removidos por centrifugação. Concentrou-se a proteína por evaporação, seguida por precipitação em etanol e lavou-se com etanol num cesto de centrifugação. A lipase mais purificada foi gerada por precipitação em sulfato de amónio, adsorção e eluição com celulose de DEAE e em seguida foi refinada, concentrada e dessalinizada por ultra-filtração. O material resultante 42 foi posteriormente purificado por tratamento com acetona e CM-celulose e em seguida adicionou-se glicina como agente de estabilização. Filtrou-se o material resultante por meio de uma membrana de filtração e em seguida liofilizou-se. 0 material foi então peneirado e analisado guanto à actividade especifica, pureza e ausência de agentes patogénicos. A lipase purificada foi ainda tratada por diafiltração para remover o estabilizador de glicina. Depois precipitou e cristalizou em t-butanol a 25 %, seguido de reticulação com BS3 dentro dos intervalos de concentração descritos supra, de preferência de modo a gue a concentração final de agente de reticulação nos cristais reticulados de lipase esteja dentro do intervalo entre cerca de 2,0 mM e cerca de 5,0 mM. Os cristais reticulados de lipase foram lavados com cinco volumes de tampão de etanol a 15 %, seguido de uma lavagem adicional com cinco volumes de tampão de etanol a 15 % (com acetato de cálcio 1,5 mM, a pH 5,0), a fim de reduzir tanto o agente de reticulação residual como o t-butanol. O material resultante foi liofilizado e embalado para expedição em frascos de HDPE com fecho de fita, embalados num saco de PE com um exssicante de gel de silica. Cada lote foi especificamente analisado quanto à contaminação micro-biológica com Burkholderia cepacia, além de outros micróbios e tinha de ser negativo para Burkholderia cepacia e agentes patogénicos antes de ser libertado para uso clinico.

Protease: Os processos de produção e purificação de proteases são conhecidos dos especialistas na matéria. Por exemplo, a protease foi produzida por fermentação sólida de Aspergillus melleus. A cultura das sementes foi posta 43 em solução e depois transferida para farelo de trigo. Uma vez que a semente tenha revestido o farelo esterilizado, carregaram-se os sólidos em bandejas para a fermentação em salas de fermentação. Quando a fermentação estava completa, extraiu-se a enzima a partir da biomassa sólida por perfusão de água através de grandes tanques de extracção.

Fez-se então passar o extracto contendo protease através de leitos de carvão e filtrou-se para remover as partículas em suspensão. A solução foi então concentrada e tratada, uma segunda vez, com carvão. A protease precipitou em etanol e, em seguida, secou-se em vácuo para a purificação final. A protease foi dissolvida e, em seguida, passou através de uma resina de permuta iónica. 0 material foi então filtrado antes de ser transferido para os tanques de cristalização, onde cristalizou com várias adições de etanol. Depois de a cristalização estar concluída, os cristais foram recuperados num cesto de centrifugação e lavou-se com mais etanol. Os cristais foram recuperados do cesto de centrifugação e secaram-se com ar forçado, seguido de secagem em vácuo. Depois de o pó estar seco foi transferido para recipientes a granel para uma peneiração final e embalagem.

Amilase: Os processos de produção e purificação de amilase são conhecidos dos especialistas na matéria. Por exemplo, a amilase foi produzida por fermentação sólida de Aspergillus oryzae. A cultura das sementes foi posta em solução e depois foi transferida para farelo de trigo. Logo que a semente revestiu o farelo esterilizado, carregaram-se os sólidos em bandejas para a fermentação. 44

Após a fermentação estar completa, a enzima foi extraida a partir da biomassa sólida por perfusão de água através de tanques de extracção. 0 extracto filtrado foi então concentrada e diafiltrado. Este diafiltração foi seguida de tratamento térmico e ajuste do pH, seguida de outra diafiltração e concentração. Adicionou-se então gelatina de peixe ao material como um estabilizador antes da secagem por pulverização e representa até 30 % do peso total do produto. Uma vez seco, o material foi peneirado, misturado com dextrina e embalado. A dextrina foi utilizada como um estabilizador para uma armazenagem a longo prazo e pode representar até 30 % do peso total do produto final. A proteína nos ingredientes farmacêuticos activos resultantes tinha uma pureza superior a 90 % avaliada por SEC CLAR com detecção a 280 nm. Esses 90 % não têm em conta a presença de gelatina ou dextrina como excipientes; nem o excipiente teve uma densidade óptica significativa a 280 nm. Após terem sido purificadas e tratadas, a lipase, a protease e a amilase foram formuladas em conjunto, sob a forma de cápsulas. Mais particularmente, as enzimas secas misturaram-se em meio anidro (com os excipientes) e encheram-se com elas cápsulas de gelatina. As composições foram designadas por TheraCLEC™.

Exemplo 2 - Estudo da fase 2

Doses de tratamento

As composições utilizadas no estudo da fase 2, continham ingredientes activos de cristais reticulados de lipase de Burkholderia cepacia, cristais de protease de Aspergillus melleus e amilase solúvel de Aspergillus oryzae; e os seguintes ingredientes inactivos: celulose 45 microcristalina, maltrina, silício coloidal, estearato de magnésio e talco, lipase, protease e amilase numa proporção de unidades USP de actividade enzimática. crospovidona, dióxido de Continham 1:1:0,15

As composições foram entregues sob a forma de cápsulas com duas potências diferentes. A formulação mais potente, denominada "TCT20", foi cheia em cápsulas do tamanho 2, brancas opacas, cápsulas de gelatina dura com uma potência de 20.000 unidades USP de lipase, 20.000 unidades USP de protease e 3.000 unidades USP de amilase. A formulação menos potente, denominada por "TCT5", foi cheia em cápsulas do tamanho 5, brancas opacas, cápsulas de gelatina dura com uma potência de 5.000 unidades USP de lipase, 5.000 unidades USP de protease e 750 unidades USP de amilase. A proporção entre ingredientes activos e inactivos, numa base p/p foi de 3:4 para TCT20 e de 2:5 para TCT5.

Utilizaram-se cápsulas de placebo do tamanho 2 e do tamanho 5 no estudo da fase 2 para tornar cega a dose de TheraCLEC. As cápsulas de placebo continham os mesmos ingredientes inactivos que as cápsulas de TheraCLEC e tinham a mesma aparência que as cápsulas de TheraCLEC, de modo que a identidade da cápsula (activa versus placebo) era desconhecida. Deu-se o número apropriado e o tipo de cápsulas de TheraCLEC e cápsulas de placebo para alcançar o nível de dose cega para a qual o indivíduo foi tornado aleatório.

Durante o estudo da fase 2, aproximadamente a meio de cada refeição ou refeição ligeira, durante o período de tratamento de 28 dias, os indivíduos tomaram um total de seis cápsulas, que foram uma combinação de cápsulas 46

TheraCLEC e de placebo, uma era uma cápsula do tamanho 5 e cinco foram cápsulas do tamanho 2, como se descreve a seguir:

Quadro 1. Distribuição do tratamento em estudo versus placebo por unidade de tratamento Número de cápsulas por refeição/refeição ligeira Unidade de Estudo Cápsulas de tamanho 5 Cápsulas de tamanho 2 Unidade 1 1 TCT 5 5 Placebo Unidade 2 1 TCT 5 1 TCT 20 4 Placebo Unidade 3 1 Placebo 5 TCT 20

Selecção e escalonamento das doses A dose mais alta do estudo da fase 2, fixada em 100.000 unidades USP de lipase/refeição foi equivalente a 1.250 unidades USP de lipase por kg para um individuo de 80 kg e 2.500 unidades USP de lipase por kg, para um individuo de 40 kg.

Quadro 2. Dose do fármaco do estudo TheraCLEC™

Unidades USP/refeição ou referição ligeira TheraCLEC" Componente activo Unidade 1 Unidade 2 Unidade 3 Lipase 5.000 25.000 100.000 Protease 5.000 25.000 100.000 Amilase 750 3.750 15.000

Outros parâmetros do estudo da fase 2 47 0 estudo da fase 2 foi um estudo clínico aleatório, duplamente cego e com um intervalo de dose paralelo. 0 estudo envolveu um total de 129 indivíduos do género masculino e feminino, de aproximadamente 26 locais dos EUA e com três níveis de doses de TheraCLEC™ (cerca de 42 indivíduos por unidade). 0 estudo foi dividido em quatro períodos distintos de observação e de avaliação: triagem, valores de base, tratamento e seguimento.

População do estudo da fase 2

As composições preparadas tal como descrito antes foram ensaiadas em três populações de indivíduos. A população que pretende ser tratada, modificada ("PSTm") incluiu todos os indivíduos elegíveis que foram submetidos às medições do período inicial (sem enzima), receberam pelo menos uma dose aleatória, tiveram avaliações do período de tratamento em matéria de segurança e tiveram uma recolha de fezes de marcador para marcador. Fez-se ensaios noutras populações de indivíduos e os resultados foram consistentes com os da população PSTm.

Período de triagem (dia SI valor base)

No primeiro dia da visita de triagem (dia Sl), os indivíduos foram entrevistados para determinar a sua elegibilidade para a inclusão no estudo. Os indivíduos também foram submetidos a um exame físico completo.

Os indivíduos foram convidados a comer uma dieta rica em gordura durante todo o período do estudo. Os indivíduos foram autorizados a tomar os medicamentos necessários para o tratamento e gestão das suas fibroses quísticas subjacentes e doenças relacionadas. Os 48 indivíduos não receberam os produtos suplementares enzimáticos nem auxiliares dietéticos que podem ter sido interpretados como suplementação enzimática durante os períodos de estudo da fase inicial (dias B1-B3) e do tratamento (dias T1-T28).

Os indivíduos foram submetidos aleatoriamente a uma das três doses cegas de TheraCLEC™.

Período de referência (Dias B1-B3)

No período de 10-14 dias após a visita de triagem, os pacientes, de forma aleatória, foram convidados a entrar numa instalação de internamento, em jejum e antes da primeira refeição do dia (pequeno almoço). O período de referência começou com a primeira refeição do dia (pequeno almoço) no dia Bl. Antes do pequeno almoço, registou-se o peso corporal. O indivíduo começou então um período de dieta controlada de 72 horas, sem suplementos de enzimas pancreáticas. Tomou um marcador de fezes (500 mg de corante azul FD & C # 2) no início da primeira refeição no dia Bl. Registou-se a gordura e a proteína ingeridas com base no consumo real. A recolha de fezes para as avaliações da gordura fecal e do azoto começou após o primeiro marcador ter passado (as fezes contendo o primeiro marcador foram descartadas) e terminou quando o segundo marcador foi observado nas fezes (as fezes contendo o segundo marcador foram recolhidas).

Em cada dia do período de referência, os indivíduos foram avaliados quanto a eventos adversos e medicações concomitantes, registaram-se os sinais vitais e realizou-se um exame físico simplificado. 49

Período de tratamento (dias T1-T28) A primeira dose do fármaco do estudo foi dada a cada indivíduo no primeiro dia do período de tratamento (Tl) aproximadamente a meio da primeira refeição após a realização dos procedimentos de pré-dose e do ensaio de indução do amido no dia Tl (almoço) . Os indivíduos foram então observados durante pelo menos 30 minutos após a administração da primeira dose. Se o fármaco for bem tolerado, os indivíduos, em seguida, tomam a mesma dose do fármaco do estudo, aproximadamente a meio de cada uma das 3 refeições e 2 refeições ligeiras desde o dia Tl até ao dia 28 do período de tratamento. Neste estudo, o meio de uma refeição foi definido como o momento em que os indivíduos consumiram aproximadamente metade da refeição ou da refeição ligeira.

No dia T2 9, os indivíduos abandonaram o fármaco do estudo. Durante a visita ao consultório no dia T29/ET, realizou-se um exame físico completo. Os indivíduos também foram avaliados quanto a eventos adversos.

Período de seguimento (Dia F7 ±2)

Durante o período de seguimento, os indivíduos foram mantidos numa dieta rica em gordura e as enzimas dos cuidados usuais como prescrito pelo seu médico. 0 fim da visita ao escritório no período de seguimento (dia F7 ± 2) foi agendado para ocorrer de 7 ± 2 dias após o término da visita do período de tratamento (dia T29). Nesta visita, os indivíduos foram submetidos a um exame físico abreviado e foram avaliados para eventos adversos e concomitantes medicações. 50

Análise de gordura e azoto nas fezes

Recolheram-se fezes para um teste de mancha da elastase fecal durante a visita de triagem para avaliar a elegibilidade para o estudo. Cada indivíduo teve o exame de fezes em vários momentos durante o estudo para avaliar a presença de sangue oculto e de glóbulos brancos.

Durante o período de referência de internamento e no período de tratamento em internamento deu-se um marcador indicador (500 mg de Azul FD & C # 2) no início da primeira refeição da dieta controlada (pequeno almoço), que consiste em aproximadamente 100 gramas de gordura e um mínimo de aproximadamente 2 gramas de proteína por quilo de peso corporal, por dia. A ingestão real de gordura e de proteína foi registada com base na quantidade de alimentos consumidos.

Após 72 horas de dieta controlada, um segundo marcador indicador azul foi dado a indivíduos em jejum com a refeição de ensaio para o ensaio inicial de estimulação. A recolha de fezes para as avaliações da gordura e do azoto fecal começou após o primeiro marcador azul ter passado e foi concluída quando o segundo marcador azul tinha passado. As fezes recolhidas foram medidas quanto ao peso das fezes e à análise do teor de gordura e de azoto. Seligson, D (ed), Standard Methods of Clinicai Chemistry, Volume II, Fatty Acids in Stool, 1985, Academic Press, pp 34-39; Veldee MS, Nutritional Assessment, Therapy, and Monitoring in Burtis CA, Ashwood ER (eds). Tietz Textbook of Clinicai Chemistry, 3a Ed., 1999, W.B. Sanders Co, pp 1385-86. O coeficiente de absorção de gordura (% CAG) foi calculado manualmente para cada sítio usando dados 51 recolhidos em dois momentos: (1) o consumo de gordura, em g/24 horas, conforme previsto pela nutricionista da pesquisa central e (2) a excreção de gordura, em g/24 horas, tal como previsto pelos Mayo Clinicai Laboratory Services. 0 CAG foi calculado manualmente, como se segue: (Média de gramas de gordura consumida/24 horas - média de gramas de gordura excretada/24 horas)x!00 Média de gramas de gordura consumida/24 horas 0 coeficiente de absorção de azoto (% CAA) foi calculado manualmente usando dados recolhidos em dois momentos: (1) o consumo de azoto em g/24 horas, conforme previsto pela nutricionista da pesquisa central e (2) a excreção de azoto, em g/24 horas, tal como previsto pelos Mayo Clinicai Laboratory Services. 0 CAA foi calculado manualmente, como se segue: (Média de gramas de azoto consumida/24 horas - média de gramas de azoto excretada/24 horas) x 100 Média de gramas de azoto consumido/24 horas

Avaliação da eficácia - coeficiente de absorção de gordura O coeficiente de absorção de gordura no período de referência, no tratamento e a alteração desde o período de referência até ao tratamento foi resumido pelo grupo de tratamento. O coeficiente de absorção de gordura relatada foi a média de dois cálculos independentes do CAG utilizando dois resultados de gordura fecal de uma recolha de fezes. Analisou-se a diferença entre os três grupos de tratamento, em coeficiente médio de absorção de gordura durante o período de tratamento, por meio de uma análise 52 unidireccional da variância. A fim de avaliar as três possiveis comparações, feitas duas a duas, enquanto se controlava a taxa global de erro do tipo I, de 5 %, utilizou-se o teste de intervalo de expansão de Tukey. A variável dependente incluiu as medições durante o tratamento.

Realizou-se uma análise de regressão linear, examinando os efeitos simultâneos do grupo de tratamento e o CAG médio do período de referência. A variável dependente incluiu novamente as medições do período de tratamento. Factores adicionais que foram analisados no modelo incluíram as medições a seguir ao período de referência que se seguem: idade, género, raça e IMC. Para estes factores adicionais utilizou-se um processo de regressão para eliminar os factores não significativos (p > 0,10) do modelo. As comparações, feitas aos pares, foram realizadas utilizando o teste do intervalo de expansão de Tukey nesta análise de regressão linear. O coeficiente de absorção de gordura (CAG) no período de referência, no tratamento e a alteração desde o período de referência até ao tratamento, para a população PSTm estão resumidos no quadro 3, por grupo de tratamento. Nas três populações de tratamento, houve um aumento significativo do CAG médio desde o período de referência até ao período de tratamento. Durante o tratamento, o CAG foi significativamente maior em ambas as unidades de tratamento 2 (a dose média) e unidade de tratamento 3 (a dose mais elevada) do que na unidade do tratamento 1 (a dose baixa) . Além disso, as unidades de tratamento 2 e 3 apresentaram o maior aumento médio no CAG sem enzima para com enzima do que a unidade de tratamento 1. Embora a unidade de tratamento 3 mostrasse uma vantagem numérica 53 consistente em relação à unidade de tratamento 2, esta diferença não foi estatisticamente significativa.

Quadro 3: Coeficiente médio de absorção de gordura -

Análise de variância

Periodo de referência

N Média (DP)

Tratamento**

N Média (DP)

Mudança do periodo de referência para o tratamento

N Média (DP)

Percentagem (%) de variação do periodo de referência para o tratamento

N Média (DP)

Unidade 1 (N = 39)

Unidade 2 (N = 41)

Unidade 3 (N = 37)

Total (N = 117)

Valor de p* 39 41 36 116 55,0 (17,54) 55, 6 (20,29) 52,2 (19,14) 54,4 (18,94) 39 41 37 117 5 6,2 (18,16) 67,0 (18,08) 69, 7 (17,86) 64,3 (18,81) 0,0032 39 41 36 116 1,2 (14,77) 11,4 (19,10) 17,3 (18,37) 9,8 (18,59) 0,0005 39 41 36 116 5, 6 (32,15) 42, 7 (95,46) 45, 9 (53,51) 31,2 (68,69) 0,0153 * Valor de p geral da análise de variância ** Resultado do tratamento (por meio do teste de comparações múltiplas de Tukey para comparações feitas aos pares): Unidade de tratamento 1 vs unidade de tratamento 2, PSTm valor de p = 0,0229, Unidade de tratamento 2 vs unidade de tratamento 3, PSTm valor de p = 0,7874, Unidade de tratamento 1 vs unidade de tratamento 3, PSTm valor de p = 0,0041,

Se o CAG do período de referência for repartido em quintilhos de 0-100 %, é claro que todas as unidades de tratamento têm um aumento mais profundo em relação ao período de referência de 0-40 % do CAG do que o CAG do período de referência fosse superior a 40 % (ver figura 1) . Além disso, quanto mais baixo for o CAG de referência, melhor é a resposta ao tratamento. 54

Avaliação da eficácia - coeficiente de absorção de azoto 0 coeficiente de absorção de azoto (CAA) no período de referência (Bl a B3) e durante o tratamento para a população PSTm estão resumidos a seguir no quadro 4, por grupo de tratamento. 0 coeficiente de absorção de azoto relatado foi a média de dois cálculos independentes do CAG utilizando dois resultados do azoto fecal de uma recolha de fezes. A diferença entre os três grupos de tratamento, no CAA médio, foi analisada da mesma maneira como CAG médio.

Da mesma maneira que as medições do CAG, nas três populações de tratamento, houve um aumento significativo no CAG médio desde o período de referência até ao período de tratamento. Nas três populações de tratamento, o CAA durante o tratamento foi significativamente maior tanto na unidade de tratamento 2 como na unidade de tratamento 3, do que na unidade de tratamento 1. Além disso, as unidades de tratamento 2 e 3 apresentaram o maior aumento médio do CAA sem enzima e com enzima em relação à unidade de tratamento 1. Enquanto a unidade de tratamento 3 mostrou uma vantagem numérica consistente sobre a unidade de tratamento 2, esta diferença não foi estatisticamente significativa.

Quadro 4: Coeficiente médio de absorção de azoto - análise de variância

Unidade 1 Unidade 2 Unidade 3 Total Valor de p* (N = 39) (N = 41) (N = 37) (N = 117) Valor de referência 55 Ν 39 41 36 116 Média (DP)

Tratamento**

N Média (DP)

Alteração do valor de referência até ao tratamento

N Média (DP)

Variação percentual da linha de base até ao tratamento

N Média (DP) 60,6 (16,38) 58, 8 (17,88) 56,8 (16,36) 58,8 (16,84) 39 41 37 117 61,6 (15,46) 71,3 (16,38) 74, 6 (13,51) 69, 1 (16,05) 0,0009 39 41 36 116 1, 1 (14,89) 12,5 (18,37) 17,5 (18,00) 10,2 (18,33) 0,0002 39 41 36 116 9, 0 (48, 83) 37, 6 (96,72) 4 0,6 (45, 04) 29,0 (69,74) 0,0883 * Valor global de p da análise de variância ** Em resultado do tratamento (por meio do teste de Tukey para comparações múltiplas num intervalo alargado, feito aos pares): Unidade de tratamento 1 vs unidade de tratamento 2, PSTm p = 0,0145. Unidade tratamento 2 vs unidade de tratamento 3, PSTm p = 0,6130. Unidade de tratamento 1 vs unidade de tratamento 3, PSTm p = 0,0009.

Se o CAA de referência for repartido em quintilos de 0-100%, é evidente, na figura 2, que todos os grupos de tratamento tiveram um maior aumento em relação ao valor de referência, se o CAA de referência foi de 40 % ou menos do que se o CAA de referência for superior a 40 %. As unidades de tratamento 2 e 3 ainda parecem mais eficazes do que a unidade de tratamento 1. Além disso, quanto menor for o CAA de referência, maior será a resposta ao tratamento.

Aumentos do CAG e do CAA e a correlação entre eles 0 estudo reflectiu um aumento significativo no CAG médio e no CAA desde o período de referência até ao período de tratamento nos grupos de tratamento com doses 56 médias e mais elevadas entre as três populações de tratamento. Além disso, a unidade de tratamento 3 (o grupo de tratamento com a dose mais elevada) apresentou os maiores aumentos médios no CAG e no CAA durante este periodo de tempo, embora a diferença entre a dose média e a alta não fosse estatisticamente significativa. Mesmo após o controlo dos valores de referência do CAG e do CAA e do género, este efeito do tratamento no CAG e no CAA manteve-se estatisticamente significativo (p = 0,0003 e p <0,0001, respectivamente)· A correlação entre os aumentos do CAG e do CAG também foi estatisticamente significativa. As figuras 3 e 4 ilustram a correlação entre o CAG e o CAA nos pacientes da PSTm tratados com todas as doses das composições de acordo com a presente invenção, a nível do período de referência e ao nível do tratamento, respectivamente. A figura 5 ilustra a diferença entre a correlação entre o CAG e o CAA ao nível do tratamento e dos valores de referência nesses pacientes.

Avaliação da eficácia - análise da alteração em relação aos valores de referência - amostragem das fezes

As alterações médias no número de fezes e no peso das fezes desde os valores de referência até aos períodos de tratamento, em função do valor final relevante do período de tratamento são apresentados separadamente para cada grupo de tratamento do estudo no quadro 5 e no quadro 6, respectivamente.

Nas três unidades de tratamento, houve uma diminuição no número de fezes desde o início até o período de tratamento (p = 0,0968, = 0,0975 e p = 0,1807, 57 3 em respectivamente). A unidade de tratamento particular, apresentou a maior redução da média (-2,6 na PSTm) no número de fezes desde o inicio até ao tratamento (p = 0,0003). No entanto, a comparação entre grupos na mudança do número de fezes não revelou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de tratamento.

Houve também uma significativa diminuição no peso das fezes desde o periodo de referência até ao tratamento nos grupos de tratamento de doses médias e mais altas das três populações de tratamento (p = 0,0001). Enquanto a unidade do tratamento 3 das três populações apresentou o maior decréscimo médio de peso de fezes desde o periodo de referência até ao tratamento (p < 0,0001), as comparações, aos pares, utilizando o teste de Tukey de comparações múltiplas não revelou diferenças estatistica-mente significativas entre as unidades de tratamento com doses médias e mais elevadas.

Quadro 5: Variação do número de fezes desde o periodo de referência até ao tratamento

Grupo 1 (N=39) Grupo 2 (N=41) Grupo 3 (N=37) Total (N=l17) Valor de p* Valor de referência N 39 41 37 117 Média 7,7 8,2 8,8 8,3 (DP) (3,04) (3,49) (4,56) (3,73) Tratamento 58 N 39 41 37 117 Média (DP) 6, 9 (3,06) 7,4 (4,37) 6,2 (3,01) 6, 9 (3,56) Variação do valor de referência para o tratamento 0,0968 N 39 41 37 117 Média (DP) -0,8 (3,39) -0, 9 (4,52) -2, 6 (4,04) -1,4 (4,07) Teste t** aos pares 0,1393 0,2211 0,0003 0,0003 * Valor global de p da análise de v ** Teste t aos pares Nota: Alteração dos resultados em r comparações múltiplas num intervalo Unidade de tratamento 1 vs unidade Unidade tratamento 2 vs unidade de Unidade de tratamento 1 vs unidade ariância slação à rç alargado, ie tratamer tratamento ie tratamer íferência feito aos ito 2, PSTr 3, PSTm vr ito 3, PSTr por meio c pares): t valores c ilores de p t valores c o teste de Tukey para e p = 0,5502. = 0,4842. e p = 0,2040.

Quadro 6: Variação do peso das fezes (gramas) desde o periodo de referência até ao tratamento

Unidade 1 (N = 39) Unidade 2 (N = 41) Unidade 3 (N = 37) Total (N = 117) Valor de p * Periodo de referência N 38 41 36 115 Média (DP) 1234,0 (529,46) 1251,8 (474,14) 1396,8 (613, 79) 1291,3 (539, 16) Tratamento N 38 41 37 116 Média (DP) 1174,1 (565,34) 937,3 (539, 91) 869,2 (448,92) 993,2 (533, 10) Mudança desde o periodo de referência até após o tratamento 0,0001 N 38 41 36 115 Média (DP) -59, 9 (399,46) -314,5 (455, 89) -514,2 (428,37) -292,9 (463,44) Teste t aos pares** 0,3612 <0,0001 <0,0001 <0,0001 * valor global de p da análise de variância. ** Teste t aos pares. Nota: Alteração a partir dos resultados de referência (pelo teste de Tukey para comparações múltiplas): Unidade de tratamento 1 vs unidade de tratamento 2, PSTm, valor de -p = 0,8842. Unidade de tratamento 2 vs unidade de tratamento 3, PSTm, valor de p = 0,2415. Unidade de tratamento 1 vs unidade de tratamento 3, PSTm, valor de p = 0,1971. 59

Avaliação da eficácia - digestão de amido e absorção de hidratos de carbono, medidas pela resposta da glicose no sangue

No teste de estimulação do amido, os indivíduos que permaneceram em jejum durante a noite, durante pelo menos 8 horas, ingeriram uma refeição de ensaio normalizada que inclui 100 gramas de pão de farinha branca (50 g de hidratos de carbono) durante o periodo de referência de internamento e no periodo de tratamento hospitalar. Os indivíduos foram descansar durante 30 minutos antes do ensaio de estimulação inicial e a actividade teve de ser limitada durante a avaliação. Mediram-se os niveis de gi icose no sangue com um glicosimetro (Accucheck, Bayer). A medida foi feita imediatamente antes da refeição de teste. Administrou-se TheraCLEC aproximadamente a meio da refeição com pão. Fez-se uma série de medidas com o glicosimetro durante um periodo de 4 horas. Os valores calculados incluem a alteração máxima da glicose desde o jejum até à mudança máxima de glicose com e sem enzima (T17 - Tl). Os indivíduos com diabetes mellitus não realizaram o ensaio de estimulação do amido se o valor medido da glicose em jejum foi inferior a 75 mg/dL. A resposta da glicose no sangue foi medida pelas variáveis que se seguem na população PSTm:

Alteração da glicose desde o momento 0: A alteração da glicose em cada um dos momentos desde o tempo 0. Resposta máxima da glicose: Valor máximo da glicose após o momento 0.

Alteração máxima na resposta da glicose: Definida como a resposta máxima, deduzido o valor de glicose no 60 momento 0.

Hora do pico da resposta da glicose (Tmax) : Definida como as horas desde o momento 0 até à variação máxima da glicose.

Apresentam-se as estatisticas descritivas para cada uma destas variáveis, por grupo de tratamento, para os seguintes: 1. Sem TheraCLEC™ 2. Com TheraCLEC™ 3. Com TheraCLEC™ menos sem TheraCLEC™ mu _ ΦΜ

4. Relação (R) entre: com TheraCLEC e sem TheraCLEC

Estas estatisticas descritivas são apresentadas tanto para todos os indivíduos como apenas para os indivíduos sem diabetes. Um indivíduo foi considerado como tendo diabetes relacionada com a fibrose quística se tinha ou uma histórica clínica conhecida de diabetes, fazendo uso de insulina ou de medicação oral relacionada com diabetes ou se tinha uma valor medido de glicose, em jejum, ^ 126 mg/dL ou uma glicose pós-prandial ^ 200 mg/dL.

No quadro 7, os 25 pacientes com fibrose quística relacionada com diabetes mellitus foram retirados da análise para reduzir a variabilidade tanto da glicose elevada do período de referência, como a diminuição da glicose após o "ensaio de estimulação do amido" como resultado das injecções de insulina da manhã. TCT5 parece ter um número de indivíduos significativamente menor (p = 61 0,0053) com o aumentos na glicose máxima, com ou sem enzima, > 10 mg/dL do que TCT25. Além disso, os resultados do quadro 7 sugerem que o intervalo médio da amilase na unidade de tratamento 2 é tão eficaz quanto a dose mais elevada na unidade de tratamento 3.

Quadro 7: Ensaio de estimulação do amido em pacientes não diabéticos com fibrose quística - olhando para a alteração máxima de glicose no tratamento com e sem enzima Máximo de glicose Δ com e sem enzima Unidade de tratamento 1; TCT5 (Jnidade de tratamento 2: TCT25 Unidade de tratamento 3: TCT100 <10 mg/dl 21 14 15 > 10 mg/dl 4 16 11 > 20 mg/dl 3 8 8 * Exacto de Fisher (geral): p = 0,0138 TCT5 vs TCT25, p = 0,0053 TCT5 vs TCT100, p = 0,0644 TCT25 vs TCT100, p = 0,4357

Em geral, este estudo demonstrou que os indivíduos tratados com composições de acordo com a presente invenção atingiram uma maior digestão e absorção de hidratos de carbono, medidas pela resposta da glicose no sangue, com os indivíduos no grupo de tratamento com a dose mais elevada que exige menos tempo para fazê-lo.

Exemplo 3 - Estudo da fase 1

Antes do estudo da fase 2, as composições de acordo com a presente invenção também foram avaliadas quanto à sua segurança e eficácia preliminar num ensaio da fase 1 em pacientes com fibrose quística sofrendo de insuficiência pancreática.

Realizou-se um estudo de variação da dose, com um marcador aberto, para determinar a segurança aguda, 62 tolerabilidade e actividade clínica da TheraCLEC em 23 pacientes com fibrose quística que sofrem de insuficiência pancreática. Os indivíduos tomaram quer 100, 500, 1.000, 2.500 quer 5.000 unidades de lipase/ kg/refeição de TCT durante três dias. Monitorizaram-se os parâmetros clínicos e laboratoriais de segurança e os eventos adversos. Não houve eventos adversos graves ou mortes no estudo da fase 1. A maioria dos eventos adversos foram ligeiros, embora as queixas gastrointestinais fossem comuns. O TheraCLEC™ aumentou o coeficiente de absorção de gordura e o coeficiente de absorção de azoto em todos os grupos, excepto naqueles que receberam 100 unidades de lipase/kg/refeição. Para todos os indivíduos com outros níveis de dosagem, o aumento médio de CAG = 20,6 ± 23,5, o aumento médio de CAA = 19,7 + 12,2 % e o peso médio das fezes diminuiu = 425 ± 422 gramas. O TheraCLEC™ foi bem tolerado neste estudo de exposição de curta duração, em doses até 5.000 unidades de lipase/kg/refeição. Dados preliminares de eficácia demonstraram um efeito benéfico na absorção de gordura e de azoto. Vantajosamente, estes efeitos foram observados com uma dose de 500 unidades de lipase/kg/refeição e não pareceu haver nenhuma necessidade de aumentar a dose para além desse nível para alcançar esses resultados. Estes dados suportaram um ensaio aleatório mais alargado da fase 2 . 1. Concepção do estudo da fase 1

Realizou-se um estudo em vários centros, com doses variadas com um marcador aberto, tendo como objectivo principal determinar a segurança e a tolerabilidade agudas 63 de cinco níveis de doses de TheraCLEC™, em indivíduos com insuficiência pancreática, com fibrose quística. Os objectivos secundários consistiram em avaliar o efeito do TheraCLEC™ na absorção oral de gordura e de azoto, sintomas gastrointestinais e o número e o peso das fezes. 0 TheraCLEC™ tinha fixado proporções de lipase, amilase e protease. Os grupos de dosagem basearam-se na dose de lipase por kg de refeição, conforme se mostra no quadro 8.

Quadro 8: Grupos de dosagem

Componente activo Unidades USP/kg/referição Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Lipase 500 1.000 2.500 5.000 100 Protease 500 1.000 2.500 5.000 100 Amilase 75 150 375 750 15

Dadas como cápsulas com as enzimas que se seguem, em proporções fixas: 20.000 unidades USP de lipase + 20.000 unidades USP de protease + 3.000 unidades USP de amilase por cápsula).

Os indivíduos com fibrose quística seguidos em um dos onze centros acreditados pela Fundação CF foram recrutados para este estudo. Todos os indivíduos assinaram um termo de consentimento aprovado pelo Comité de Revisão Institucional local e, no caso de pacientes pediátricos, também foi dado um parecer favorável. Os indivíduos incluídos tinham á 13 e ^ 45 anos de idade, tinham um diagnóstico de fibrose quística com base em critérios-padrão [B.J. Rosenstein et al., "The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement", J. Pediatr., 132, pp. 589-595 (1998)], tinham insuficiência pancreática com base na elastase fecal < 100 mg/g, medida na triagem em ambulatório utilizando o ensaio de ELISA monoclonal de 64

ScheBo (BioTech EUA) e tinham um coeficiente de absorção de gordura < 80 % medido na triagem hospitalar, tinham um volume expiratório forçado em um segundo (VEFi ) ú 30 % do previsto, tinham um indice de massa corporal > o 10° percentil e estavam clinicamente estáveis, sem evidência de infecção respiratória aguda do tracto superior ou inferior. Excluiram-se os indivíduos que estavam grávidas ou amamentando, tinham um episódio de síndrome de obstrução intestinal distai necessitando de intervenção na sala de emergência ou no hospital nos últimos seis meses, estavam a tomar medicações que alteram o pH gástrico (por exemplo, antagonistas do receptor de histamina-2, inibidores da bomba de protões ou antiácidos) na semana anterior e eram incapazes de parar com essas medicações durante o estudo, tinham uma história de colonopatia fibrosante, aspergilose broncopulmonar alérgica ou doença hepática definida pelos seguintes critérios: alanina-aminotransferase (AST), aspartato-aminotransferase (ALT) ou fosfatase alcalina no dobro do normal; história de sangramento de varizes; evidências de cirrose ou doença hepática significativa na biópsia hepática, transplante de fígado; o indivíduo tinha tomado ácido ursodesoxicólico no ano anterior. Os indivíduos incapazes de interromper a alimentação entérica por tubo durante os períodos de internamento do protocolo do estudo, pessoas com hipersensibilidade conhecida a aditivos alimentares ou aqueles que tinham participado em outro estudo qualquer de investigação de fármacos, produtos biológicos ou dispositivos não aprovados, no mês anterior, também foram excluídos.

Se os indivíduos preencherem os critérios na visita de triagem inicial, são admitidos num centro de investigação clínica. A terapia de enzimas prescrita ao 65 indivíduo foi descontinuada, normalmente dá-se oralmente um marcador de corante indicador (FD & C Azul # 2 500 mg) e colocou-se o indivíduo numa dieta especial composta por 100 gramas de gordura e um mínimo de 2 gramas de proteína por kg de peso corporal por dia, divididos por três refeições e duas refeições ligeiras. A ingestão real de gordura e de proteína foi registada com base na quantidade de alimentos consumidos. Após 72 horas de dieta especial, a dieta foi interrompida e deu-se um segundo um marcador indicador. Os pacientes reiniciaram a sua terapia enzimática normal nesse momento. A recolha de fezes para avaliar a gordura e o azoto nas fezes começou após se observar as primeiras fezes em que se viu o marcador azul e foi concluída quando o segundo marcador passou, com essas fezes incluídas na recolha. Calculou-se o CAG e, se era < 80 %, o indivíduo foi elegível para a fase de tratamento do estudo.

Os indivíduos foram novamente internados num centro de investigação clínica e descontinuou-se o suplemento de enzimas pancreáticas de rotina. Forneceu-se o marcador de corante e a dieta especial e os indivíduos tomaram a medicação do estudo, com cada uma das três refeições e as duas refeições ligeiras nas 72 horas seguintes, com doses por grupo como descrito anteriormente. Os indivíduos foram instruídos para tomar a medicação do estudo antes de cada refeição. Após 72 horas de dieta especial, a dieta foi interrompida e deu-se um segundo um marcador indicador. Os pacientes reiniciaram sua terapia enzimática normal nesse momento. O procedimento de recolha de fezes foi o mesmo que foi descrito antes. Um telefonema de acompanhamento foi feito no prazo de três dias depois da alta do centro de investigação clínica e ocorreu uma visita de acompanhamento, três a sete dias após a alta. 66 A monitorização de segurança incluiu a incidência de eventos adversos, como determinado pelo questionário aberto final aos indivíduos do estudo em regime ambulatório e de internamento e durante o telefonema programado, a frequência dos ensaios de laboratório anormais, incluindo hematológicos, da quimica do soro de rotina e perfis de coagulação, análise de urina, excreção urinária de ácido úrico e hematina das fezes e o ensaio das células brancas do sangue. Também se monitorizou a frequência dos sintomas gastrointestinais, conforme medido por um questionário de fibrose quistica (QFQ) modificado, especifico do tracto GI [A. Quittner et al., "CFQ Cystic Fibrosis Questionnaire, a Health Related Quality of Life Measure", versão inglesa 1.0. (2000)]. O Therapeutics Development Network Data Safety and Monitoring Board (DSMB) da Fundação CF providenciou supervisão a este ensaio. O DSMB monitorizou os dados de segurança dos grupos que utilizaram doses crescentes durante todo o ensaio e foi necessária a avaliação formal de segurança antes de os indivíduos poderem estar incluídos nos grupos de 5.000 unidades de lipase/kg/refeição, uma vez que esta dose excede as actuais recomendações de dosagem. O DSMB também foi encarregue de interromper o ensaio a qualquer momento por preocupações de segurança em relação aos indivíduos. 2. Composição da fase 1

/ Ί TM

Os tres componentes enzrmaticos do TheraCLEC , lipase, protease e amilase, foram fabricados de forma independente. A lipase derivou da fermentação da bactéria Burkholderia cepacia (anteriormente conhecida como 67 P seudomonas cepacia) e foi então tratada para formar cristais de lipase que foram posteriormente reticulados, criando uma forma estável de enzima em ácido e proteases, sem revestimento entérico (referida como TheraCLEC™-lipase). Cada lote foi especificamente posto em cultura para a contaminação microbiológica com Burkholderia cepacia e deve ser negativo para Burkholderia cepacia para a libertação do lote para uso clinico. A componente de protease derivou de Aspergillus melleus; a componente de amilase derivou da fermentação de Aspergillus oryzae. Da mesma forma, estes produtos foram submetidos a várias etapas de purificação e depois foram cultivados para os fungos e as leveduras totais.

As três componentes da enzima compreendendo TheraCLEC™ foram formuladas como uma cápsula contendo o pó. Os estudos pré-clinicos de eficácia demonstraram que a lipase e a protease foram eficazes em doses de > 500 unidade de lipase/kg/refeição e ú 1.000 unidades de protease/kg/refeição, num modelo de cão, de insuficiência pancreática. A análise in vitro da amilase derivada de Aspergillus, em TheraCLEC™, foi realizada usando tanto a metodologia da USP como a de FCC (Food Chemical Codex) (que é equivalente à metodologia USP utilizada para o ensaio dos fármacos). A amilase fúngica tem um perfil de pH diferente do da amilase derivada de suinos. A amilase fúngica é vinte vezes mais activa, a pH 4,8, do que a amilase suína. Assim, escolheu-se uma dose de amilase vinte vezes menor do que seria encontrado em relação à lipase, numa cápsula padrão de pancrelipase, para a

TheraCLEC™. 3. Análise de dados do estudo da fase 1 68 0 coeficiente de absorção de gordura foi calculado da seguinte forma: (gramas de gordura consumida-gramas de gordura excretada x 100 gramas de gordura consumida A mesma equação, utilizando o número de gramas de azoto, foi utilizada para calcular o coeficiente de absorção de azoto (CAA).

Os requerentes planearam resumir as caracteristicas demográficas e de prognóstico, incluindo idade, género, raça, genótipo, função pulmonar e elastase fecal em manchas por meio dos grupos de dosagem e no global. A dimensão da amostra, para o estudo da fase 1, foi estimada em 20 indivíduos, quatro indivíduos por cada grupo de dosagem. 0 estudo não foi desenhado para os testes estatísticos formais. Os requerentes planearam agrupar eventos adversos usando um sistema de classificação padrão. A frequência de valores laboratoriais anormais foi organizada em forma de tabela durante o período de estudo, para cada momento de análise e para cada grupo de dose. 4. Resultados do estudo da fase 1

Vinte e três indivíduos (14 H) foram envolvidos em 11 centros de fibrose quística. A idade média dos participantes foi de 23,5 ± 7,8 (DP) (intervalo = 15,2-44,5 anos) (quadro 9). Registou-se mais um indivíduo nos grupos 1, 3 e 5 como resultado de vários centros de recrutamento simultâneo de indivíduos.

Quadro 9. Estudos Demográficos 69 Número de Pacientes Idade (n = 23) Planeado 20 Parâmetro Anos Arrolados 23 Média 23,5 Descontinuados do estudo dos fármacos 0 Desvio padrão 7,8 Max-Min 15,2-44,5 anos Raça (n = 23) Género (n = 23) Parâmetro N (%) Parâmetro N (%) Caucasiano 22 (95, 7%) Masculino 14 (61 %) Negro 0 (0,0 %) Feminino 9 (39 %) Asiático 0 (0,0 %) Hispânico 0 (0,0 %) Outras 1 (4,3 %) 5. Segurança 0 TheraCLEC™ foi bem tolerado em todas as doses. Não há eventos adversos graves ou mortes documentados e não houve retiradas de pacientes durante o estudo. Durante o periodo de pré-tratamento sem terapia enzimática, o sistema do corpo mais afectado foi o gastrointestinal, com 14 indivíduos a relatar um total de 23 eventos adversos pré-tratamento. Os eventos adversos gastrointestinais mais comuns pré-tratamento foram desconforto abdominal (4 indivíduos que relataram 5 eventos), dor na zona abdominal superior (4 indivíduos que relataram 4 eventos) e flatulência (4 indivíduos que relataram 4 eventos). 0 segundo sistema do corpo mais vulgarmente afectado foi o sistema respiratório, com 5 indivíduos a relatarem 8 eventos adversos pré-tratamento. 0 evento respiratório adverso mais comum, pré-tratamento, foi a tosse (4 indivíduos que relataram 4 eventos).

Os eventos adversos emergentes do tratamento, começando após 2 dias, ocorreram em 18 (78,3 %) dos 23 indivíduos. Não foram encontradas diferenças estatística- 70 mente significativas entre os grupos na incidência de eventos adversos emergentes do tratamento (p = 0,6196). Houve 11 (47,8 %) indivíduos com eventos adversos relacionados (definidos como eventos classificados pelo investigador como possivelmente ou provavelmente relacionados com a medicação do estudo).

Seis indivíduos experimentaram aumentos da alanina-aminotransferase (ALT) e/ou aspartato-aminotransferase (AST) durante o estudo. Quatro indivíduos tinham níveis elevados de enzima quando iniciaram o tratamento com o fármaco do estudo. Um indivíduo (grupo 1) tinha um nível de ALT elevado no final da visita do estudo e um indivíduo (grupo 5) teve AST elevada na avaliação de acompanhamento na visita de seguimento. 6. Eficácia

Conforme resumido na quadro 10 e nas figuras 6 e 7, os dados preliminares da actividade clínica nos grupos 1-4 demonstraram que o tratamento com TheraCLEC™ aumentou o CAG e o CAA, quando comparado com o período sem qualquer suplemento de enzimas pancreáticas. Para todos os indivíduos, nos grupos 1-4, o aumento médio do CAG foi de 20,6 ± 23,5% e o CAA média aumentou 19,7 ± 12,2 %. O peso das fezes também diminuiu após o tratamento com TheraCLEC™ para estes grupos, com uma diminuição média de 425 ± 422 gramas. 0 CAG e o CAA aumentaram minimamente ao longo dos períodos sem enzimas com o menor nível de dose de TheraCLEC™ (grupo 5: 100 unidades USP de lipase/kg/ refeição, 100 unidades USP de protease/kg/refeição e 15 unidades USP de amilase/kg/refeição).

Quadro 10: Actividade clinica de TheraCLEC™: alterações 71 desde o período de triagem até ao período de tratamento

Mudança em relação à referência Grupo 1 (N = 5) Grupo 2 (N = 4) Grupo 3 (N = 5) Grupo 4 (N = 4) Grupo 5 (N = 5) Total (N = 23) CAG1 Média 122,7% 17,7% 18, 9% 17,2% 1,2% 15,4% (DP) (19,4) (25,9) (11,9) (42,3) (20,3) (23,8) CAA2 Média 20,3% 14,4% 15, 8% 20, 6% 0,1% 14,0% (DP) (14,2) (18,0) (5,7) (16,5) (4,1) (13,7) Média do número de fezes -1,2 -0, 8 -2,6 -2,8 0,2 -1,4 (DP) (1,5) (1,7) (1,7) (2,6) (3,3) (2,4) (DP) Peso médio das fezes (g) -311,4 -308,8 -613,2 -836,0 -116,8 -425,5 (DP) (371,7) (367,5) (423,3) (284,7) (373,2) (422,2) DP = desvio padrão 1 Coeficiente de absorção de gordura = 100 * (número de gramas de gordura consumida - o número de gramas de gordura obtida)/(número de gramas de gordura consumida). 2 Coeficiente de absorção de azoto - 100 * (número de gramas de azoto consumido - número de gramas de azoto obtido)/(número de gramas de azoto consumido).

Resultados do estudo da fase 1 0 TheraCLEC™ parece ser seguro e bem tolerado neste estudo de exposição de três dias. Não houve relação com a dose nos eventos adversos emergentes do tratamento. As queixas gastrointestinais foram frequentes durante este estudo, se os indivíduos estavam em tratamento usual, sem enzimas ou com TheraCLEC™, embora tenham ocorrido com a menor frequência durante o periodo em ambulatório quando os indivíduos estavam com o tratamento habitual. Durante as fases de internamento do estudo, os participantes foram questionados sobre as queixas no tracto GI, numa base regular e o estudo não foi cego, criando assim distorções. 72

Os aumentos das enzimas hepáticas e a presença tanto da hematina como de células brancas do sangue nas fezes deixaram de ser comuns quando os indivíduos estavam com TheraCLEC ™ ao contrário do que quando estavam sem enzimas nos cuidados habituais.

Houve uma melhoria da absorção de gordura e de azoto com TheraCLEC™ comparado com o valor de referência, demonstrando a eficácia das componentes de lipase e protease em TheraCLEC™. Não pareceu haver uma curva de resposta à dose para doses acima de 500 unidades de lipase/kg/refeição. Embora tenha havido uma tendência para um menor peso fecal, com o aumento das doses, o intervalo foi grande. Os valores para o CAG neste estudo parecem ser menores do que os publicados na literatura. As explicações possíveis incluem distorções de selecção, dieta, recolhas completas e calendário das enzimas.

Todos os participantes neste estudo tinham insuficiência pancreática grave, conforme determinado pela triagem da elastase fecal e corroborado pelo CAG sem enzimas. Outros estudos incluíram pacientes com insuficiência pancreática, o que vai alterar o CAG médio mais elevado [R.C. Stern et al., "A Comparison of the Efficacy and Tolerance of Pancrelipase and Placebo in the Treatment of Steatorrhea in Cystic Fibrosis Patients with Clinicai Exocrine Pancreatic Insufficiency", Am J. Gasteroenterol., p 1932-1938 (2000); M.P Francisco et al., "Ranitidine and Omeprazole as Adjuvant Therapy to Pancrealipase to Improve Fat Absorption in Patients with Cystic Fibrosis", J. Pediatr. Gastrenterol. Nutr., 35, pp. 79-83 (2002) ] .

Neste estudo, os participantes ingeriram pelo menos 73 100 gramas de gordura por dia. O CAG relatado na literatura, que foi determinado com base na dieta de rotina do paciente, provavelmente foi baseado numa menor ingestão de gordura, já que muitos pacientes em ambulatório tomaram menos de 100 gramas de gordura por dia [P. Durie et al., "Uses and Abuses of Enzyme Therapy in Cystic Fibrosis", J. Royal Soc. Med., 91, supl. 34, pp. 2-3 (1998); D. A. Kawchak et al., "Longitudinal, Prospective

Analysis of Dietary Intake in Children with Cystic Fibrosis", J. Pediatr., 129, pp. 119-129 (1996)]. Uma menor carga de gordura pode ser mais facilmente manipulada pela lipase lingual, residual, compensatória em pacientes com fibrose quística [B. Fredrikzon et al., "Lingual Lipase: an Important Lipase in the Digestion of Dietary Lipids in Cystic Fibrosis?", Pediatr. Res., 14, p. 1387-1390 (1980)].

Utilizou-se um corante alimentar azul para marcar a recolha das fezes. Curiosamente, os enfermeiros do centro de pesquisa clinica relataram que os marcadores de vermelho carmim ou de carvão vegetal podem ser difíceis de identificar nas fezes. O FD & C Azul # 2, na dose de 500 mg, por via oral, é facilmente visível quando passa nas fezes e demarca claramente o início e o final da recolha de fezes. Uma recolha de fezes reduzida vai resultar em menos gordura na recolha total de fezes, levando a um CAG falsamente elevado. Estudos anteriores podem ter tido CAGs falsamente mais elevados por causa da dificuldade em identificar o início e o fim da recolha. Dado que a recolha de fezes é repulsiva, existe uma tendência humana para acabar com a recolha tão rápido quanto possível.

Lisboa, 18 de Outubro de 2010. 74

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição caracterizada pelo facto de compreender lipase, protease e amilase, numa proporção entre lipase protease amilase, na referida composição, de cerca de 1:1:0,15 unidades USP.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a lipase estar sob a forma de cristais reticulados de lipase.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de os cristais de lipase serem reticulados com um reticulador multifuncional.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de o agente de reticulação multifuncional ser suberato de bis(sulfo-succinimidilo).
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a protease estar sob a forma de cristais de protease.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a amilase estar sob a forma de amilase amorfa.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a lipase ser uma lipase microbiana, a protease ser uma protease microbiana e a amilase ser uma amilase microbiana. 1
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de a lipase microbiana ser uma lipase bacteriana. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a lipase bacteriana ser uma lipase de Pseudomonas. 10 . Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a lipase bacteriana ser lipase de Burkholderia. 11. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de a protease microbiana ser uma protease : fúngica. 12 . Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo facto de a protease fúngica ser uma protease de Aspergillus. 13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de a protease de Aspergillus ser uma protease de Aspergillus melleus. 14 . Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de a amilase microbiana ser uma amilase fúngica • 15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de a amilase fúngica ser uma amilase de Aspergillus. 2
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo facto de a amilase de Aspergillus ser uma amilase de Aspergillus oryzae.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de a lipase ser seleccionada no grupo que consiste em cristais reticulados de lipase de Pseudomonas e cristais reticulados de lipase de Burkholderia, em que os referidos cristais estão reticuladas com suberato de bis (sulfo-succinimidilo).
18. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de a lipase estar sob a forma de cristais reticulados de lipase, seleccionados no grupo que consiste em cristais reticulados de lipase de Pseudomonas e cristais reticulados de lipase de Burkholderia, a protease está sob a forma de cristais de protease de Aspergillus melleus e a amilase estar sob a forma de amilase amorfa de Aspergillus oryzae.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de compreender ainda um excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a composição estar sob uma forma de dosagem oral seleccionada no grupo que consiste em comprimidos, cápsulas, pastas fluidas, saquetas, suspensões e drageias.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se utilizar no tratamento de malabsorção num mamifero. 3 22 . de acordo com a Composição, caracterizada pelo facto de de insuficiência pancreática reivindicação 1, se utilizar no tratamento num mamífero.
23. Composição para ser utilizada de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo facto de aumentar o coeficiente de absorção de gordura e o coeficiente de absorção de azoto num mamífero.
24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo facto de o coeficiente de absorção de gordura e o coeficiente de absorção de azoto estarem aumentados, do mesmo valor, no referido mamífero.
25. Composição para ser utilizada de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo facto de aumentar a absorção de hidratos de carbono num mamífero. CM Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 21, 22, 23 e 25 , caracterizada pelo facto de o mamífero sofrer de fibrose quística. 27 . Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 21, 22, 23 e 25 , caracterizada pelo facto de providenciar cerca de 25.000 unidades USP de lipase, cerca de 25.000 unidades USP de protease e cerca de 3750 unidades USP de amilase. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 21, 22, 23 e 25, caracterizada pelo facto de providenciar cerca de 100.000 unidades USP de lipase, cerca de 100.000 unidades USP de protease e cerca de 15.000 unidades USP de amilase. 4
29. Composição, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo facto de se destinar a ser administrada ao referido mamífero com cada refeição ou refeição ligeira.
30. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 21, 22, 23, 25 e 26, caracterizada pelo facto de providenciar ao referido mamífero cerca de 25.000 a 100.000 unidades USP de lipase, cerca de 25.000 a 100.000 unidades USP de protease e cerca de 3.740 a 15.000 unidades USP de amilase. Lisboa, 18 de Outubro de 2010. 5