PT1621212E

PT1621212E - Formulações que contém nucleótidos anti-paralelos em relação a conexinas

Info

Publication number: PT1621212E
Application number: PT05016736T
Authority: PT
Inventors: Becker Dr David; R Green Dr Colin
Original assignee: Coda Therapeutics Inc
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2012-02-20
Also published as: US20070037765A1; EP1146908A1; JP2013135677A; AU2119300A; US20080249041A1; DE60021700D1; CA2361251C; US9193754B2; ES2245638T3; JP2013136594A; DK1621212T3; US7902164B2; DK2314321T3; CA2730386C; US20130079388A1; JP5705890B2; NZ513154A; US20070060538A1; US20070072820A1; US20070078103A1

Description

DESCRIÇÃO

FORMULAÇÕES QUE CONTÉM NUCLEÓTIDOS ΑΝΤΙ-PARALELOS EM

RELAÇÃO A CONEXINAS A presente invenção diz respeito a formulações utilizáveis em tratamentos terapêuticos e/ou cosméticos, em particular aqueles em que se deseja conseguir uma disrupção localizada da comunicação directa entre duas células.

ANTECEDENTES

As junções de hiato são estruturas das membranas celulares que facilitam a comunicação directa entre duas células. Um canal de junções de hiato é constituído por dois hemicanais (conexões) , cada um deles constituído por seis subunidades de conexina. Estas conexinas são uma família de proteínas vulgarmente designadas de acordo com o seu peso molecular ou classificadas numa base filogenética, isto é, numa classe a e numa classe β. A capacidade para regular a expressão de conexinas (e em particular para a sua hiporregulação) iria proporcionar uma oportunidade para modular a comunicação entre duas células num doente para fins terapêuticos e/ou curativos. No entanto, uma vez que há inúmeras proteínas de conexina a serem expressas abundantemente em todo o corpo, a existência de um efeito hiporregulador geral para induzir um efeito terapêutico num local específico é indesejável.

Os oligodesoxinucleótidos (ODN) anti-paralelos possuem um potencial considerável como agentes para a manipulação da expressão de genes específicos (revisão: Stein et al., 1992;

Wagner 1994). No entanto, há ainda dificuldades, que é necessário ultrapassar. Estas incluem o curto semi-período de vida de tais ODN (de uma forma típica, os oligómeros de fosfodiéster não modificados possuem um período de semi-vida intracelular de apenas 20 minutos devido à degradação da nuclease intracelular (Wagner 1994)) e a sua administração, de uma forma consistente e fiável, aos tecidos-alvo.

Foi com o intuito de ultrapassar estas dificuldades, pelo menos parcialmente, que a requerente concebeu a presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção está definida nas reivindicações.

De acordo com isto, num primeiro aspecto, a presente invenção providencia o que está indicado nas reivindicações.

Numa modalidade preferida, a formulação contém polinucleótidos apenas com uma proteína de conexina. Mais preferencialmente, esta proteína de conexina é a conexina 43. Há muitos aspectos da invenção que são descritos tomando como referência os oligodesoxinucleótidos. No entanto, entende-se que, nestes aspectos, também podem ser utilizados outros polinucleótidos adequados (tais como polinucleótidos de ARN).

Alternativamente, a formulação contém oligodesoxinucleótidos com mais do que uma proteína conexina. Preferencialmente, uma das proteínas de conexina a que se dirigem os oligodesoxinucleótidos é a conexina 43. Outras proteínas de conexina às quais se dirigem os 3 oligodesoxinucleótidos incluem conexina 26, conexina 31.1 e conexina 32.

De uma forma adequada, o oligodesaoxinucleótido para a conexina 43 selecciona-se entre GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC, GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC e GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT;

Mais convenientemente, o oligodesoxinucleótido para a conexina 43 é: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC; Convenientemente, o oligodesoxinucleótido para a conexina 26 é: TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA.

Convenientemente, o oligodesoxinucleótido para a conexina 31.1 é: CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C.

Convenientemente, o oligodesoxinucleótido para a conexina 32 é: TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A.

Os polinucleótidos anti-paralelo podem ser formulados para administração parentérica, intramuscular, intracerebral, intravenosa, subcutânea ou transdérmica. De preferência, os polinucleótidos anti-paralelo são administrados por via tópica (no local que se pretende tratar). De um modo adequado, os polinucleótidos anti-paralelos são combinados com um veículo ou um diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico para se obter uma composição farmacêutica.

Como cargas ou veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico inclui qualquer um dos que são vulgarmente utilizados para administração por via tópica. A formulação tópica pode assumir a forma de creme, pomada, gel, emulsão, loção ou tintura. A formulação da presente invenção também pode assumir a forma de um penso impregnado.

Como materiais de veículos adequados entende-se qualquer carga ou veículo vulgarmente utilizado como base para cremes, loções, géis, emulsões, loções ou tinturas para administração por via tópica. Como exemplos referem-se agentes emulsionantes, veículos inertes, incluindo bases hidrocarbonadas, bases emulsionantes, dissolventes não tóxicos ou bases solúveis em água. Como exemplos particularmente adequados refere-se a lanolina, a parafina rígida, a parafina líquida, a parafina amarela mole ou a parafina branca mole, a cera branca de abelhas, a cera amarela de abelhas, o álcool cetostearílico, o álcool cetílico, as dimeticonas, as ceras emulsionantes, o miristato de isopropilo, a cera micro-cristalina, o álcool oleílico e o álcool estearílico.

De preferência, a carga ou o veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico é um gel e de um modo adequado é um gel de copolímero não iónico de polioxietileno-polioxipropileno, por exemplo, um gel Pluronic e, de preferência, o Pluronic F-127 (BASF Corp.). Este gel é particularmente preferido pelo facto de se encontrar no estado líquido a temperaturas baixas, mas conseguir endurecer rapidamente a temperaturas fisiológicos, o que restringe a libertação do componente ODN ao local da aplicação ou a um local imediatamente adjacente.

Também é possível incorporar na formulação da presente invenção um agente auxiliar, tal como caseína, gelatina, albumina, goma, alginato de sódio, carboximetilcelulose, metilcelulose, hidroxietil-celulose ou álcool polivinílico. A composição farmacêutica pode ser formulada de tal modo que proporcione uma libertação controlada do polinucleótido anti-paralelo.

De um modo conveniente, a formulação contém ainda um agente tensioactivo para auxiliar a penetração celular do oligodesoxi-nucleótido ou então a formulação pode conter qualquer agente de carga adequado. É possível adicionar qualquer agente tensioactivo não tóxico adequado, tal como DMSO. Em alternativa, é possível incorporar um agente de penetração transdérmica, tal como a ureia.

Também se descreve aqui um processo de regulação decrescente da expressão da proteína conexina, específico do sítio, para fins terapêuticos e/ou cosméticos, que compreende a administração de uma formulação, tal como definida antes, num local do doente em que é necessária a referida regulação decrescente.

Ainda num outro aspecto, descreve-se um processo para a redução da morte celular neuronal, que noutras circunstâncias resulta de um traumatismo dos neurónios num sítio específico do cérebro, espinal medula ou nervo óptico de um doente, que compreende a etapa de administração de uma formulação, tal como foi definida antes, no referido sítio de regulação decrescente da expressão das proteínas da conexina e na zona imediatamente adjacente ao referido sítio.

De preferência, administra-se a formulação para reduzir a perda de neurónios devida a um trauma físico no cérebro, espinal medula ou nervo óptico.

De uma forma conveniente, a formulação administra-se numa quantidade suficiente para regular de forma decrescente a expressão das referidas proteínas da conexina durante pelo menos 24 horas após a administração.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona meios para promover a cura de feridas num doente, que compreende a etapa de administração de uma formulação, tal como definida antes, à referida ferida, para regular de forma decrescente a expressão da proteína da conexina e os sítios imediatamente adjacentes à referida ferida. a utilização pelo menos de um polinucleótido anti-paralelopara uma proteína de conexina para a preparação de um medicamento para reduzir a morte celular neuronal que de qualquer outro modo ocorreria em resultado de uma lesão neuronal.

Normalmente, a ferida será resultante de um trauma, incluindo queimaduras. No entanto, pode ser provocada por uma cirurgia.

Também se descreve um processo de reduzir a inflamação como parte do tratamento de uma ferida e/ou de tecidos submetidos a traumatismos físicos que compreendem a etapa de administração de uma formulação, tal como definida antes, na referida ferida ou tecido ou próximo deles.

De preferência, a referida ferida é uma queimadura.

Em alternativa, a referida ferida resulta de um trauma físico sobre um tecido, incluindo o tecido neuronal, tal como o cérebro, a medula espinal ou o nervo óptico.

Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona meios para diminuir a formação de escaras num doente que tenha sofrido uma ferida, que compreende a etapa de administração de uma formulação, tal como definida antes, na referida ferida para regular de forma decrescente a expressão das proteínas da conexina e nos sítios imediatamente adjacentes à referida ferida

Novamente, a ferida pode resultar de um trauma ou de uma cirurgia, pretendendo-se que a formulação seja aplicada à ferida imediatamente antes dela ser recuperada por via cirúrgica e/ou antes que se feche.

Ainda num outro aspecto, a invenção proporciona um método para o rejuvenescimento ou o espessamento da pele com um intuito cosmético, que compreende a etapa de administração de uma formulação, conforme definida antes, à superfície da pele, uma vez ou várias vezes repetidas.

De um modo conveniente, a referida formulação contêm oligodesoxinucleótidos dirigidos à conexina 26 ou à conexina 43 e é administrada para regular a divisão e o crescimento das células basais epiteliais.

De acordo com outra variante, a referida formulação contém oligodesoxinucleótidos dirigidos à conexina 31.1 e é administrado para regular a queratinização da camada exterior.

De preferência, a formulação é um creme ou um gel.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As figuras 1 a 5 mostram secções de lesões cerebrais em ratos tratadas com gel Pluronic que continha oligodesoxi-nucleótidos anti-paralelos com a conexina 43 ou então, lesões de contraprova, tratadas apenas com gel Pluronic. Em todos os casos, as lesões foram seccionadas sequencialmente num plano coronal e as secções de ponto intermédio foram utilizadas para análise. Cada imagem (com excepção da figura 5) mostra uma porção de tecido com as dimensões de 4 mm x 5,33 mm. Na figura 5, as dimensões são aproximadamente de 1,2 mm x 2 mm.

Figura 1: as figuras IA a 1C mostram dois lados de uma lesão de contraprova ao fim de 24 horas após o momento da lesão. A lesão foi tratada apenas com gel Pluronic. As secções foram contrastadas com Nissl (núcleos azuis) e marcadas com anticorpos com o marcador neuronal Neuronal-N (células castanhas) . As figuras 1B e 1D mostram imagens em escala de cinzentos das imagens IA e 1C, respectivamente, em que o contorno da lesão foi marcado. Observe-se o grande tamanho da lesão e os rebordos irregulares. A lesão propagou-se em sentido descendente, na direcção do corpo caloso (linha a tracejado) ao fim de 24 horas apenas após o momento de lesão.

Figura 2: lesão de contraprova ao fim de 24 horas após o momento do ferimento. A figura 2A mostra a contrastação com Nissl (núcleos azuis) e a marcação com Neuronal-N dos neurónios viáveis. A figura 2B é uma figura equivalente, em escala de cinzentos, com o contorno da lesão demarcado e a parte superior do corpo caloso marcada (linha a tracejado) . 0 tracto original da agulha é bem visível, mas a morte neuronal ocorreu bastante para trás do rebordo da lesão, conforme indicado pela marcação com Neuronal-N. Os rebordos da lesão são irregulares e a lesão, ao fim de 24 horas apenas, tinha-se propagado em sentido descendente na direcção do corpo caloso.

Figura 3: as figuras 3A e 3B são imagens a cores e em escala de cinzentos de uma lesão tratada com compostos anti-paralelos para conexina 43, ao fim de 48 horas após o momento de ferimento. 0 contorno da lesão foi demarcado na figura 3B para mostrar o tamanho da lesão e a parte superior do corpo caloso foi marcada (linha a tracejado). A figura 3A mostra a contrastação com Nissl (núcleos azuis) e Neuronal-N (células cor-de-rosa). Note-se o quão compacta é a lesão, mesmo ao fim de 48 horas, comparativamente com as lesões de contraprova (figuras 1 e 2) . Embora haja uma propagação para o lado da pata direita, o lado esquerdo da lesão segue praticamente o tracto original da agulha, com poucos sinais de propagação. 0 lado esquerdo da lesão é muito linear e não se propagou em sentido descendente na direcção do corpo caloso.

Figura 4: as figuras 4A e 4B mostram outra lesão tratada com compostos anti-paralelos para a conexina 43, ao fim de 48 horas apôs o momento de ferimento. A marcação é idêntica à da figura 3, estando o contorno da lesão demarcado na imagem em escala de cinzentos (figura 4B) . Mesmo ao fim de 48 horas, esta lesão continua extremamente compacta, apenas com uma ligeira propagação para o lado esquerdo (lado médio). Observe-se quão linear é o lado direito da lesão, com neurónios viáveis até ao rebordo do tracto da agulha (e que sobrevivem realmente dentro da área lesionada) . A lesão está bem acima do corpo caloso (linha a tracejado), indicando isso que não houve praticamente nenhuma propagação descendente.

Figura 5: uma vista com uma maior ampliação que mostra o rebordo de uma lesão tratada com compostos anti-paralelos para conexina 43. 0 contorno da lesão foi demarcado, mostrando os neurónios viáveis (marcados com Neuronal-N) mesmo até ao rebordo do tracto da agulha lesionante, mesmo ao fim de 48 horas após o momento de ferimento.

Figura 6: marcação imuno-histoguimica com PAFG (em inglês GFAP) (vermelho) e conexina 43 (verde) de uma lesão tratada com compostos anti-paralelos específicos para a conexina 43, ao fim de 24 horas após o momento de ferimento. A imagem mostra o rebordo lateral da lesão num ponto intermédio da profundidade da lesão. Os níveis de astrócitos activados são elevados em comparação com as contraprovas (figura 7) e os níveis de conexina 43 são reduzidos de uma forma notável. A marcação com conexina restante está geralmente associada aos vasos sanguíneos (setas) .

Figura 7: marcação imano-histoquímica com PAFG (em inglês GFAP) (vermelho) e conexina 43 (verde) de uma lesão de contraprova, ao fim de 24 horas após o momento do ferimento. A imagem mostra o rebordo mediano da lesão e mostra os níveis de PAFG ligeiramente elevados em relação ao córtex não lesionado. Note-se a marcação intensa com conexina 43, frequentemente co-localizada com o marcador astrocítico PAFG (setas). A figura 8 mostra uma comparação entre as semi-áreas inferiores do corte transversal da lesão, ao fim de 24 horas (círculos) e de 48 horas (losangos) após o momento de ferimento. A análise foi efectuada numa secção média da lesão sequencialmente seccionada, cortada ao longo do plano coronal. As lesões foram avaliadas recorrendo à marcação de anticorpos com Neuronal-N para delinear os neurónios viáveis. As lesões tratadas com DB1 (marcadores verdes) foram tratadas com oligodesoxinucleótidos anti-paralelos específicos para a conexina 43. 0 grupo da lesão tratada apenas com gel (marcadores vermelhos) também inclui as lesões vazias, ao passo que o grupo HB3 (marcadores púrpura) compreende os tratados com gel que continha oligodesoxinucleótidos de contraprova de sequência aleatória. Note-se que embora as lesões tratadas com compostos anti-paralelos para a conexina 43 possam ser grandes (presumivelmente nos casos em que o composto anti-paralelo ainda não tenha sido administrado), as lesões mais pequenas são todas tratadas com compostos anti-paralelos da conexina 43. A profundidade das lesões efectuadas era de 2 mm e a análise cobre uma zona de 1 mm e inferior para assim excluir o rebordo exterior no qual o anti-paralelo não se fixou.

Figura 9: lesões da medula espinal de ratos ao fim de 24 horas, após o tratamento com ODS paralelo e anti-paralelo em relação à conexina 43. As lesões concordantes não foram diferentes das lesões de contraprova não tratadas, ao passo que as lesões tratadas com compostos anti-paralelos eram mais pequenas e exibiam uma menor inflamação.

Figura 10: lesões nas patas dianteiras de murganhos neonatais ao fim de 24 horas após o tratamento com ODN de sentido concordante com a conexina 43 (pata esquerda) ou ODN anti-paralela com a conexina 43 (pata direita). Note-se a redução da inflamação e o aumento da taxa de recuperação da pata tratada com os compostos anti-paralelos .

Figura 11: secções por corte através do centro das feridas com 24 horas ilustradas na figura 10. As secções foram coradas com azul-de-toluidina para revelar os neutrófilos. Há um número significativamente menor de neutrófilos na ferida tratada com os compostos anti-paralelos, a qual também estava menos inflamada.

Figura 12: pares de lesões nas patas dos ratos ao fim de cinco dias após o ferimento, as quais foram tratadas com ODN anti-paralelos específicos em relação à conexina 43 ou com ODN de contraprova de sentido concordante. As lesões tratadas com compostos anti-paralelos curam mais rapidamente e mostram menos sinais de cicatrização.

Figura 13: pares de lesões nas patas dos ratos feitas na fase neonatal e aqui ilustradas ao fim de 8 dias após o ferimento. As lesões foram tratadas com ODN anti-paralelo específico em relação à conexina 43 ou com ODN paralelo, de contraprova. 0 pelo cresceu e é evidente que o tratamento anti-paralelo provocou menos cicatrizes e uma menor perda de cabelo. 0 local da lesão permanece proeminente na contraprova tratada com os compostos paralelos, mas é dificilmente detectável no membro tratado com os compostos anti-paralelos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Tal como se descreveu antes, de uma forma genérica, a presente invenção incide sobre a hiporregulação específica do local da expressão de conexina. Isto terá como efeito a redução da comunicação directa célula a célula no local em que a expressão da conexina é hiporregulada, o que proporciona inúmeras aplicações terapêuticas/cosméticas, tal como adiante se descreve.

De um modo geral, a hiporregulação da expressão de conexinas baseia-se na metodologia anti-paralela, utilizando polinucleótidos anti-paralelos (tais como polinucleótidos de ADN ou de ARN) e, mais particularmente, na utilização de oligodesoxinucleótidos (ODN) anti-paralelos. Estes polinucleótidos (por exemplo, ODN) visam as proteínas de conexina que se pretende hiporregular. De uma forma típica, os polinucleótidos são de cadeia simples, mas também podem ser de cadeia dupla. 0 polinucleótido anti-paralelo pode inibir a transcrição e/ou a tradução da conexina. De preferência, o polinucleótido é um inibidor especifico da transcrição e/ou da tradução a partir do gene de conexina e não inibe a transcrição e/ou a tradução a partir de outros genes. 0 produto pode ligar-se ao gene ou ao ARNm de conexina quer (i) em 5' para a sequência codificadora e/ou (ii) para a sequência codificadora e/ou (iii) em 3' para a sequência codificadora.

De um modo geral, o polinucleótido anti-paralelo irá provocar a redução da expressão do ARNm e/ou da proteína de conexina numa célula.

De um modo geral, o polinucleótido anti-paralelo é anti-paralelo para o ARNm da conexina. Um tal polinucleótido pode ser capaz de hibridar com o ARNm de conexina e assim inibir a expressão da conexina por meio da interferência com um ou vários aspectos do metabolismo do ARNm da conexina, incluindo a transcrição, o processamento de ARNm, o transporte de ARNm a partir do núcleo, a tradução ou a degradação de ARNm. De uma forma típica, o polinucleótido anti-paralelo híbrida com o ARNm de conexina para formar uma estrutura dupla que pode provocar a inibição directa da tradução e/ou da destabilização do ARNm. Uma tal estrutura dupla pode ser susceptível à degradação pelas nucleases. 0 polinucleótido anti-paralelo pode hibridar com todo ou parte do ARNm de conexina. De uma forma típica, o polinucleótido anti-paralelo híbrida com a região de ligação ao ribossoma ou com a região codificadora do ARNm da conexina. 0 polinucleótido pode ser complementar para todo o ARNm da conexina ou para uma região deste. Por exemplo, o polinucleótido pode ser o complemento exacto de todo o ARNm da conexina ou de uma parte deste. No entanto, não é necessária uma complementaridade absoluta e os polinucleótidos que possuem uma complementaridade suficiente para formar uma estrutura dupla que possua uma temperatura de fusão superior a 20°C, 30°C ou 40°C, em condições fisiológicas, são particularmente adequados para utilização na presente invenção.

Assim, de uma forma tipica, o polinucleótido é um homólogo do ARNm. 0 polinucleótido pode ser um polinucleótido que híbrida com o ARNm da conexina, em condições de rigor médio a elevado, tais como cloreto de sódio 0,03 M e citrato de sódio 0,03 M, a uma temperatura compreendida entre cerca de 50°C e cerca de 60°C.

De uma forma típica, o polinucleótido irá possuir um comprimento entre 6 e 40 nucleótidos. De preferência, irá possuir um comprimento entre 12 e 2 0 nucleótidos. Os polinucleótidos podem ter pelo menos 40 nucleótidos, por exemplo, pelo menos 60 ou pelo menos 80 nucleótidos de comprimento e até 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000 ou mais nucleótidos de comprimento. A(s) proteína(s) de conexina visada(s) pelo ODN irá(ão) depender do local em que se pretende efectuar a hiporregulação. Isto reflecte o arranjo não uniforme da(s) junção(ões) de hiato em locais diferentes por todo o corpo, em termos de composição de subunidades de conexina. A conexina pode ser qualquer conexina que ocorra naturalmente num ser humano ou animal. De um modo geral, o gene de conexina (incluindo a sequência codificadora) é homólogo de qualquer uma das conexinas específicas aqui mencionadas, tal como a homologia com a sequência codificadora de conexina 43 ilustrada no quadro 1. De uma forma típica, a conexina é uma conexina a ou P. De preferência, a conexina é expressa na pele ou no tecido nervoso (incluindo as células cerebrais).

No entanto, há algumas proteínas de conexina que são mais ubíquas do que outras em termos de distribuição tecidual. Uma das mais disseminadas é a conexina 43. Sendo assim, os ODN que visam a conexina 43 são particularmente adequados para utilização na presente invenção.

Também se contempla a utilização combinada de ODN que visam proteínas de conexina separadas (por exemplo, podem ser visadas 1, 2, 3, 4 ou mais conexinas diferentes). Por exemplo, é possível utilizar em combinação os ODN que visam a conexina 43 e um ou vários outros membros da família de conexinas (tais como as conexinas 26, 31.1, 32, 36, 40 e 45) .

Os polinucleótidos anti-paralelos individuais podem ser específicos para uma determinada conexina ou então podem visar 1, 2, 3 ou mais conexinas diferentes. De um modo geral, os polinucleótidos específicos irão visar sequências no gene ou ARNm da conexina que não são conservadas entre conexinas, ao passo que os polinucleótidos não específicos irão visar sequências conservadas.

De um modo geral, os ODN utilizáveis na presente invenção irão ser oligómeros de fosfodiéster não modificados. O seu tamanha irá variar em comprimento, mas será particularmente adequado um ODN tricontamérico.

Os polinucleótidos anti-paralelos podem ser modificados por via química. Isto pode reforçar a sua resistência às nucleares e pode acentuar a sua aptidão para entrar nas células. Por exemplo, é possível utilizar oligonucleótidos de fosforotioato. Como exemplos de outros análogos desoxinucleotídicos referem-se metilfosfonatos, fosforo- amidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforoamidatos e fosforotioatos oligorribonucleotídicos e os seus análogos 2'-O-alquílicos e metilfosfonatos 2'-O-metilribonucleotídicos.

Em alternativa, é possível utilizar oligonucleótidos de estrutura mista (OEM, em inglês MBO). Os OEM contêm segmentos de oligodesoxinucleótidos de fosfotioato e segmentos adequadamente localizados de oligodescxinucleótidos ou oligorribonucleótidos modificados. Os OEM possuem segmentos de ligações fosforotioato e outros segmentos de outros oligonucleótidos modificados, tais como metilfosfonato, o qual é não iónico e muito resistente às nucleases ou aos 2'-O-alquiloligorribonucleótidos. A sequência exacta do polinucleótido anti-paralelo utilizado na invenção irá depender da proteína de conexina visada. Para a conexina 43, a requente concluiu que eram particularmente adequados os ODN que possuíam as sequências seguintes: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC; GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC e GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT. É possível seleccionar ODN dirigidos para outras proteínas de conexina em termos da sua sequência nucleotídica, recorrendo para tal a qualquer metodologia conveniente e convencional. Por exemplo, é possível utilizar os programas informáticos MacVector e OligoTech (produzidos por Oligos etc. Eugene, Oregon, E.U.A.). Por exemplo, os ODN para as conexinas 26, 31.1 e 32 possuem as sequências seguintes : 5' TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (conexina 26) 5’ CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C (conexina 31.1) 5’ TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A (conexina 32) .

Uma vez seleccionados, os ODN podem ser sintetizados utilizando um sintetizador de ADN.

Para utilização na invenção, o(s) ODN(s) exigem uma administração especifica do local. Também exigem a administração ao longo de um período prolongado. Embora, como é evidente, o período de administração dependa tanto do local em que se pretende induzir a hiporregulação como do efeito terapêutico desejado, será frequentemente necessária uma administração contínua ao longo de 24 horas ou períodos maiores.

De acordo com a presente invenção, isto consegue-se por meio da inclusão do(s) ODN(s) na formulação em conjunto com uma carga ou um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em particular sob a forma de uma formulação para administração tópica.

Depois de preparadas, as formulações da presente invenção são úteis para qualquer aplicação terapêutica/ cosmética na qual seja desejável uma interrupção transitória e especifica do local na comunicação entre duas células. Tais aplicações compreendem o tratamento de lesões neuronais no cérebro, na medula espinal ou do nervo óptico (em que a lesão deve ser tanto quanto possível localizada), A promoção da recuperação das feridas e a redução da formação de cicatrizes, por exemplo, após cirurgia cosmética ou queimaduras.

Em particular, é possível utilizar as formulações tópicas, tais como os cremes, para regular a divisão e o crescimento das células basais epiteliais (utilizando ODN que visam a conexina 43) e a ceratinização da camada exterior (utilizando ODN que visam a conexina 31.1).

Os polinucleótidos anti-paralelos (incluindo os ODN) podem estar presentes sob uma forma praticamente isolada. Faz-se observar que o produto pode ser misturado com veículos ou diluentes que não interfiram com a finalidade pretendida para o produto e que ainda permitam que se considere como estando praticamente isolado. Um produto da invenção também pode assumir uma forma praticamente purificada, caso este em que irá conter, de um modo geral, 90%, v.g., pelo menos 95%, 98% ou 99%, do polinucleótido ou massa seca da preparação.

Administração

Assim, os polinucleótidos anti-paralelos (incluindo os ODN) da invenção (tipicamente sob a forma da formulação aqui descrita) podem ser administrados a um ser humano ou a um animal que necessite de tratamento, tal como um ser humano ou um animal que padeça de qualquer uma das doenças ou dos estados patológicos aqui mencionados. É assim possível fazer melhorar o estado do ser humano ou do animal. Deste modo, o polinucleótido e a formulação podem ser utilizados para o tratamento terapêutico do corpo de seres humanos ou animais. É possível utilizá-los para a preparação de um medicamento para o tratamento de qualquer um dos estados patológicos aqui referidos.

Os polinucleótidos anti-paralelos podem ser administrados de uma forma típica (no local que se pretende tratar). De preferência, os polinucleótidos anti-paralelos são combinados com um veiculo ou diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico para se obter uma composição farmacêutica: Como veículos e diluentes adequados refere-se os solutos salinos, por exemplo, soluto tamponado com fosfato. A composição pode ser formulada para administração parentérica, intramuscular, intracerebral, intravenosa, subcutânea ou transdérmica. A dose de um polinucleótido anti-paralelo, que é administrada a um doente, irá depender de diversos factores, tais como a idade, a massa corpora e o estado geral de saúde do doente, do estado patológico que se pretende tratar e do polinucleótido anti-paralelo particular administrado. No entanto, uma dose adequada pode estar compreendida entre 0,1 e 100 mg/kg de massa corporal, tal como entre 1 e 40 mg/kg de massa corporal. A absorção de ácidos nucleicos por células de mamíferos é intensificada por meio de diversas técnicas de transfecção conhecidas, por exemplo, as que compreendem a utilização de agentes de transfecção. A formulação administrada pode conter tais agentes. Como exemplos de tais agentes refere-se os agentes catiónicos (por exemplo, fosfato de cálcio e DEAE-dextrano) e lipofectantes (por exemplo, lipofectam™ e transfectam™)

As vias de administração e as dosagens descritas antes são apresentadas apenas a titulo de orientação, uma vez que um especialista na matéria será capaz de determinar facilmente a via de administração e a dosagem óptimas para qualquer doente e estado patológico em questão.

Homólogos A homologia e os homólogos encontram-se aqui descritos (v.g., os polinucleótidos podem ser um homólogo sequencial no ARNm de conexina). De uma forma típica, tais polinucleótidos possuem uma homologia pelo menos de 70 % e, de preferência, uma homologia pelo menos de 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% em relação à sequência relevante, por exemplo, ao longo de uma região pelo menos de 15, 20, 40, 100 ou mais nucleótidos contíguos (da sequência homóloga). A homologia pode ser calculada com base em qualquer método da especialidade. Por exemplo, o conjunto UWGCG' proporciona o programa BESTFIT que pode ser utilizado para calcular a homologia (por exemplo, utilizado com as suas marcações de origem) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, págs. 387-395). É possível utilizar os algoritmos PILEUP' e BLAST para calcular a homologia ou para alinhar sequências (de uma forma típica, nas suas marcações de origem), por exemplo, conforme descrito por Altschul, S.F. (1993) em J. Mol. Evol. 3 6: 2 90-3 0 0 , e por Altschul, S.F. et al. (1990) em J. Mol. Biol. 2 1 5 : 4 03- 1 0 . 0 programa informático para realizar a análise de BLAST é disponibilizado ao público através do Centro Nacional para a Informação Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Este algoritmo implica, em primeiro lugar, a identificação do par de sequências com maior correspondência (PMC, em inglês HSP) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência comparativa que correspondem ou satisfazem algum limiar de soluções de valores positivos T quando ficam alinhadas com uma palavra que possui o mesmo comprimento numa sequência da base de dados. 0 parâmetro T é o limiar de soluções de palavras adjacentes (Altschul et al., supra). Estas coincidências de palavras adjacentes iniciais actuam como inóculos para dar inicio às pesquisas para se descobrir PMC que as contenham. As coincidências de palavras são prolongadas nas duas direcções, ao longo de cada sequência, enquanto for possível aumentar o resultado do alinhamento cumulativo. 0 prolongamento das coincidências de palavras em cada direcção é interrompido quando: o resultado do alinhamento cumulativo desce numa quantidade X desde o seu valor máximo atingido; o resultado cumulativo atinge zero ou um valor inferior devido ã acumulação de um ou vários alinhamentos de resíduos com resultado negativo ou então se atinge o final de qualquer uma das sequências. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. No programa BLAST utiliza-se como valor de origem um comprimento de palavra (W) de 11, os alinhamentos da matriz de resultados BLOSUM62 (veja-se Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 9:1 0915-1 091 9) (B) de 50, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=4 e uma comparação entre as duas hélices. O algoritmo BLAST executa uma análise estatística da semelhança entre duas sequências; veja-se, v.g., Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90:5873-5787. Uma medida da semelhança fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de soma mínima (P (N) ) , a qual proporciona uma indicação da probabilidade de ocorrência eventual de uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos. Por exemplo, considera-se que uma sequência é semelhante a outra sequência no caso de a probabilidade de soma mínima, por comparação da primeira sequência com a segunda sequência, é inferior a cerca de 1, de preferência inferior a cerca de 0,1, mais preferencialmente inferior a cerca de 0,01 e ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 0,001.

De uma forma típica, a sequência homóloga difere da sequência relevante pelo menos (ou no máximo) em 2, 5, 10, 15, 20 ou mais mutações (que podem ser substituições, supressões ou inserções). Estas mutações podem ser medidas através de qualquer uma das regiões supramencionadas relativamente ao cálculo da homologia.

De uma forma típica, a sequência homóloga híbrida selectivamente com a sequência original a um nível significativamente superior ao nível de referência natural. De uma forma típica, a hibridação selectiva é efectuada em condições de rigor entre médias e elevadas (por exemplo, utilizando cloreto de sódio 0,03 M e citrato de sódio 0,03 M, a uma temperatura compreendida entre cerca de 50°C e cerca de 60°C). No entanto, tal hibridação pode ser efectuada em quaisquer condições adequadas conhecidas na especialidade (veja-se Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Por exemplo, no caso de ser necessário um rigor elevado, as condições adequadas compreendem a utilização de SSC 0,2x a 60 °C. No caso de ser necessário um baixo rigor, então as condições adequadas compreendem a utilização de SSC 2x a 60 °C.

Seguidamente descrever-se-ão diversos aspectos da invenção, tomando como referência a secção experimental subsequente, a qual será considerada como possuindo um intuito meramente ilustrativo e não limitativo do âmbito da invenção.

PARTE EXPERIMENTAL EXPERIÊNCIA 1

MATERIAIS E MÉTODOS

Aplicação anti-paralela

Utilizou-se gel Pluronic F-127 a 30 % (BASF Corp) em soluto salino tamponado com fosfato (água de qualidade molecular) para se administrar, ao embrião de pinto em desenvolvimento (Simons, et al., 1992) ODS anti-paralelo específicos de conexina (conexina 43) não modificados.

Mantiveram-se os embriões de pintos a incubar a 38 °C e tratou-se de acordo com as fases de Hamilton e Hamburger. Fez-se uma abertura nos ovos e abriram-se as membranas vitelina e amniótica sobre a área que se pretende tratar, utilizando para tal uns fórcipes finos. Após a aplicação anti-paralelo, os orifícios nos ovos foram fechados com fita-cola e os ovos recolocados na incubadora durante 48 horas, período este ao fim do qual se efectuou a análise da maior parte das experiências, com a excepção da análise do tempo decorrido para a "desfuncionalização" e a recuperação de conexina al. O gel Pluronic é líquido a temperaturas baixas da ordem de 0°C a 4°C, mas endurece quando se deixa cair sobre o embrião a uma temperatura fisiológica, não saindo do lugar pelo menos durante 12 horas. O gel tem a vantagem suplementar de ser um agente tensioactivo suave e admite-se que utilizado por si só ou em combinação do DMSO acelera notavelmente a penetração de ODN nas células (Wagner, 1994). A adição de um identificador de CITF (em inglês FITO) para o ODN D31, visualizada por microscopia de varrimento com laser confocal, demonstrou a penetração intracelular das sondas. As sequências de oligodesoxinucleótidos utilizadas estão indicadas no quadro 1.

Quadro 1: efeito sobre o desenvolvimento de membros da aplicação de ODN entre as fases 8 e 14 do desenvolvimento de embriões de pintos

Oligodesoxinucleótidos anti-paralelo para a conexina 43

DB1 GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC

CG1 GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT

Oligodesoxinucleótidos de contraprova

DB1 (paralelo) GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT

TAC

DB1 (pinto) GTA GTT ACG ACA GGA GGA ATT GTT CTC GTC

CV3 (aleatório) TCG AAC TGT CAA GAC TGC TAT GGC GAT

CAT

Apenas gel.

Todos os ODN foram aplicados numa concentração final entre 0,5 mM e 1,0 mM, após a análise dependente da dose durante experiências preliminares com um intervalo de concentrações entre 0,05 mM e 50 mM. Os efeitos gerais de toxicidade apenas foram evidentes para concentrações de ODN superiores a 10 mM. As misturas de gel de ODN foram preparadas a partir de soluções de reserva concentradas, guardadas a -80°C.

Sequências anti—paralelas A DB1 é uma sequência anti-paralela de murganho complementar das bases 1094 a 1123 de um gene de conexina al. Tem quatro incompatibilidades com a sequência de conexina al de pinto. A CG1 é complementar das bases 720 a 749 de conexina al de pinto. A eficácia desta sonda foi melhorada por adição ao gel de 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) . O DMSO não teve qualquer efeito suplementar sobre os resultados obtidos com os ODN anti-paralelo ou as contraprovas.

Sequências de controlo A DB1 (pinto) é o equivalente de conexina al de pinto das bases 954 a 983 de conexina al de pinto compatíveis com D31. No entanto, a análise indica uma elevada probabilidade de formação de estruturas helicoidais estaminais (G = -7.0 kcal/mol, Tm da espira = 92) e homodimerização (Tm =1,5) e por tal motivo actua como uma sequência de contraprova. Foi já descrito que alguns oligonucleótidos de sentido concordante podem formar tripletos de ADN estáveis (Neckers et al., 1993) que inibem a transcrição. No entanto, isto não foi evidente com a DB1 (sentido concordante) . Também se utilizou uma sequência de contraprova aleatória sem nenhuma estrutura secundária estável (G = 1,4 kcal/mol) e com homodimerização instável, designada por CV3. Uma contraprova suplementar em que se aplicou uma mistura com concentrações iguais de DB1 e DB1 (sentido concordante) proporcionou os níveis de referência de defeitos.

Monitorização da desfuncionalização de proteinas A localização imuno-histoquímica da proteína de junção de hiato de conexina al em interfaces entre duas células proporciona uma medição directa do efeito anti-paralelo. Foram utilizadas sondas anti-péptidos de anticorpos específicos para a conexina al para contrastar a totalidade dos embriões e depois analisou-se a distribuição da conexina por microscopia por varrimento com laser confocal, de acordo com procedimentos convencionais (Green et ai., 1995). A marcação de contraprova para outras duas conexinas expressas em embriões de pinto em desenvolvimento (conexinas bl e b2) foi efectuada de um modo idêntico, utilizando também anticorpos específicos para as sequências (Becker et al., 1995).

RESULTADOS

Redução da expressão de conexina al

Utilizando o gel Pluronic F-127 para administrar ODN anti-paraleloespecíficos de conexina al ao embrião de pinto em desenvolvimento, é possível interferir na expressão de proteínas em momentos seleccionados e isto permite que o tratamento anti-paralelo seja encaminhado para regiões específicas de um embrião de pinto. Colocou-se uma gotícula de gel, que continha o produto anti-paralelo numa concentração relativamente baixa, exactamente sobre embriões individuais. 0 gel endureceu e permaneceu no mesmo local pelo menos durante 12 horas e deste modo conseguiu-se manter nessa região uma dose baixa controlada de produto anti-paralelo. As aplicações anti-paralelas foram encaminhadas e cronometradas para bloquear a formação de junções antes dos períodos de expressão elevada no membro, no tubo neural e na face. Estes momentos são seleccionados por forma a optimizar os efeitos do produto anti-paralelo por redução da expressão da nova proteína, em vez de ficar dependente do ritmo de transformação da proteína que já se encontra nas membranas das células do tecido visado. Tanto os ODN DB1 como CG1 reduziram a expressão de uma proteína de conexina al ao fim de duas horas no tubo neural e no membro, de uma forma drástica ao fim de 4 a 8 horas e em alguns tecidos persistia ainda ao fim de 18 a 24 horas e 48 horas (dados não apresentados). Não foi observável nenhuma hiporregulação da proteína de conexina ai em qualquer uma das contraprovas utilizada. De igual modo, dois outros membros da família de conexinas expressos no embrião de pinto, a conexina b 1 e a conexina b2, não foram afectados pelo ODN anti-paralelo específico para a conexina al.

Foram efectuadas diversas contraprovas em paralelo de todas as experiências. Estas compreendiam: DB1 de sentido concordante, combinação de DEI anti-paralelo e DB1 de sentido concordante, DB1 de pinto (que forma estruturas helicoidais estaminais consigo), CV3 aleatória de ODN, gel Pluronic por si só, gel Pluronic com DMSO e STP por si só. Nenhuma das contraprovas teve um efeito observável sobre a expressão da proteína de conexina al. EXPERIENCIA 2

INTRODUÇÃO

Os astrócitos constituem o tipo de célula mais abundante no cérebro dos mamíferos. Estão extensivamente acoplados uns aos outros e aos neurónios através de junções de hiato constituídas predominantemente por conexina 43 (Giaume e McCarthy (1996) ) . Após uma isquémia induzida ou uma lesão cerebral física, estes canais permanecem abertos e propaga-se uma onda de depressão (que tem início com o aumento do potássio intersticial e dos sinais de glutamato e apoptóticos) (Cotrina e t a 1 . , (1998); Lin e t a 1 (1998) ) . Ocorre a propagação lenta de ondas de níveis elevados de cálcio citossólico e moléculas de segundos mensageiros, tais como 1P3, através dos canais de junções de hiato até aos neurónios para além do núcleo da região danificada, daí resultando uma lesão disseminada no período de 24 a 48 horas após a agressão. Deste modo, as células adjacentes não danificadas são destruídas (Lin et al., 1998), o chamado efeito colateral.

Nesta experiência investiga-se a aptidão das formulações da invenção para evitar este efeito colateral.

MATERIAIS

Prepararam-se os oligodesoxinucleótidos com as sequências seguintes: GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (conexina 43) TTG TGA TTT ATT TAG TTC GTC TGA TTT C (contraprova aleatória)

MÉTODOS

Oligodesoxinucleótidos (ODN)

Os ODN não modificados foram administrados em gel Pluronic F-127 (BASF) em soluto salino tamponado com fosfato (STP) . O gel Pluronic é líquido a valores baixos de temperatura (0°C-4°C) e endurece a valores fisiológicos de temperatura, sendo também um agente tensioactivo suave. Normalmente, os ODN não modificados possuem um período de semi-vida aproximadamente de 20 minutos em células (Wagner, 1994), mas o método de incorporação com gel 'Pluronic' proporciona uma fonte contínua de difusão, actuando o gel como um- reservatório (Becker et al . , (1999)). Os ODN específicos para a conexina 43, ou ODN aleatórios de contraprova com uma constituição de bases idêntica, foram aplicados numa concentração final de 2 mM. As experiências de contraprova com gel por si só também foram efectuadas. Os ODN eram tricontaméricos e foram analisados para se demonstrar que não deveria ocorrer nenhuma formação de hélices fechadas ou homodimerização.

Lesão

Provocaram-se lesões cerebrais em ratos (machos) da estirpe Wistar com uma massa entre 250 g e 300 g. Anestesiou-se os animais com halotano a l%-2% em oxigénio e imobilizou-se a sua cabeça com um grampo esteriotáxico. Rapou-se a região em torno do local da lesão foi rapada, rasgou-se a pele sobre o crânio num plano sagital utilizando um escalpelo e puxou-se para trás para que ficassem visíveis as placas cranianas. Fez-se um orifício com um diâmetro de 0,5 mm através da placa craniana a uma distância de 3 mm para a direita da bregma, utilizando um dispositivo de incisão Arlec e fez-se uma lesão no córtex cerebral utilizando uma agulha de seringa, 19G de calibre ΛΜ, ligada a uma plataforma micrométrica. A plataforma permitiu uma regulação direccional precisa e uma profundidade de penetração exacta de 2 mm, o que manteve a lesão dentro do córtex e bem acima do corpo caloso.

Estando o animal preparado, aspirou-se 10 mL de gel Pluronic F-127 (BASF) arrefecido com gelo, que continha ODN específico para a conexina 43 (ou um ODN de contraprova) , para dentro de uma agulha de seringa 19G de calibre 14, previamente arrefecida, aplicada de tal forma que ficasse com uma ponta plana. A agulha da seringa foi ligada a uma pipeta volumétrica através de uma ponta de pipeta amarela alterada. Depois o gel endureceu na agulha, à medida que aquecia até à temperatura ambiente. Transferiu-se a agulha com a camada de gel na sua ponta para uma seringa com a capacidade de 1 mL que continha STP e fez-se deslizar uma manga sobre o veio da agulha para que a ponta da agulha pudesse ser introduzida na lesão, actuando a manga (ao ser empurrada contra o crânio) no sentido de evitar uma penetração excessiva. Por pressão ligeira sobre o êmbolo da seringa a camada de gel foi "empurrada" para fora da agulha e para dentro da lesão. Depois tratou-se a ferida com peróxido de hidrogénio para interromper a hemorragia e suturou-se a pele para voltar ao normal. Monitorizou-se os animais cuidadosamente e deixou-se em repouso até estarem prontos para serem sacrificados ao fim de 24 horas, 48 horas ou 12 dias.

Seccionamento sob congelação

Os animais foram sacrificados utilizando Nembutal (pentobarbitona sódica, Virbac) e depois foram decapitados. Removeu-se os seus cérebros intactos, congelou-se imediatamente em neve carbónica e guardou-se a -80°C até estarem prontos para seccionamento. Foram retiradas criossecções sequenciais (secções com 30 mm) desde a parte frontal até à parte traseira (plano coronal), montou-se as secções a seco sobre lamelas tratadas com alúmen de crómio e guardou-se para análise histoquimica ou imuno-histoquimica a -80°C. Registou-se a primeira e a última secção de cada lesão para que as secções intermédias da lesão fossem claramente identificadas.

Histoquimica

Para a contrastação com hemotoxilina e eosina, hidratou-se as secções através de uma série descendente de álcoois (absoluto, 2 x 95%, 1 x 70% e água) e corou-se com hemotoxilina de Gill durante 4 minutos. Depois lavou-se as secções com água, mergulhou-se em água de Scott e lavou-se novamente com água. Depois corou-se durante 30 segundos em eosina tamponada de Moore. Lavou-se as secções mais uma vez com água antes da desidratação através de uma série de álcoois (2 x 95%, 1 x absoluto), álcool:xilol a 50:50 e mergulhou-se em xileno. Depois montou-se as secções utilizando o meio de montagem Histomountá.

Para a contrastação com Nissl, desidratou-se as secções com uma série de grau ascendente de álcoois (75%, 95%, 3 x 100%), durante cinco minutos em cada um, e desengordurou-se em xileno durante cinco minutos. Depois hidratou-se novamente as secções por passagem pela mesma série de álcoois em sentido descendente e lavou-se com água. Depois colocaram-se as secções numa solução de contrastação de Nissl (5 mL de uma solução de reserva de violeta-de-cresilo a 2 %, 90 mL de uma solução de ácido acético a 6 % em água, 10 mL de uma solução de acetato de sódio a 1,35 %) durante 10 minutos. Depois desidratou-se rapidamente as secções numa série ascendente de álcoois durante 5 minutos a 75 %, depois 2 minutos a 95 % e a 3 x 100 % e três cargas de xileno, cada uma delas durante 10 minutos. Depois recobriu-se com meio de montagem de Histomountá.

Imuno-histoquímica

Em primeiro lugar, deixou-se as secções congeladas regressarem à temperatura ambiente em STP. Depois efectuou-se a permeabilização em metanol durante dois minutos, enxaguou-se com STP e transferiu-s para uma solução de lisina 0,1 M e 0,1% de Triton-X 100' em STP para bloqueio durante 30 minutos. Seguiram-se duas lavagens com STP, cada uma delas durante dois minutos. Removeu-se o STP e aplicou-se 50 mL de anticorpo primário por secção.

Efectuou-se a imuno-histoquímica com anticorpos primários contra a conexina 4 3, Neuronal-Nuclei (proteína nuclear NeuN específica de vertebrados) e PAFG (em inglês GFAP) (proteína acídica fibrilar glial). Foram utilizados os anticorpos a seguir indicados:

Anticorpo de coelho anti-Cx 43 (Gourdie et ai., (1991)) numa concentração de 1:300.

Anticorpo de murganho anti-Cx 43 (Chemicon International, Inc.) numa concentração de 1:100.

Anticorpo de coelho anti-PAFG de rato (DAKO, Z 0 33 4) , numa concentração de 1:1000.

Anticorpo de murganho anti-Neuronal Nuclei (Chemicon International, Inc.) numa concentração de 1:1000.

Para a marcação com conexina e PAFG, manteve-se as secções a incubar de um dia para o outro a 4°C. Depois lavou-se três vezes com STP, durante 15 minutos, numa agitadora orbital. A seguir removeu-se o STP em excesso e aplicou-se 50 mL de Alexaá 488 anti-IgG de coelho (Molecular Probes, Oregon, E.U.A.) por secção, numa concentração de 1:200. Para a marcação monoclonal e a dupla, utilizou-se um anticorpo secundário anti-murganho CY3 (Chemicon, 132C) . Manteve-se as secções a incubar na ausência de luz durante duas horas, à temperatura ambiente, seguindo-se três lavagens de 15 minutos em STP. Para a montagem, removeu-se o STP em excesso das lamelas e aplicou-se uma ou duas gotas de meio anti-desvanecimento Citifluor (solução de glicerol/STP). Colocou-se uma lâmina de cobertura sobre as secções e selou-se com um verniz para as unhas. Para a marcação com Neuronal-N, o anticorpo secundário era um anticorpo biotinilado de cabra anti-murganho, seguindo-se uma reacção com PAR (em inglês HRP) ligada a avidina e DAR (estojo ExtrAvidin da Sigma ou estojo Quickstain da DAKO).

Obtenção de imagens e análise

Efectuou-se a marcação imunofluorescente utilizando um microscópio de varrimento a laser confocal Leica TCS 4D. Subsequentemente combinou-se as imagens duplamente marcadas utilizando a função Leica Combine' ou o programa informático Adobe Photoshop. Obteve-se imagens das amostras coradas com hemotoxilina e eosina e com Nissl ou das secções marcadas com Neuronal-N, utilizando para tal uma câmara digital Kontron (Zeiss) Progress 3008, e depois analisou-se as áreas lesionadas utilizando um dispositivo MetaMorph (Universal Imaging Corp). As áreas lesionadas foram analisadas para a secção intermédia de cada lesão.

RESULTADOS A bem documentada disseminação das lesões cerebrais nas primeiras 24 a 48 horas após o trauma ocorreu nas nossas experiências de contraprova com gel e todas as lesões, as de contraprova e as tratadas com compostos anti-paralelo, tiveram tendência para se disseminar próximo do rebordo exterior, onde a probabilidade de o gel se fixar é menor após a sua introdução. No entanto, as lesões de contraprova disseminaram-se em sentido descendente na direcção do corpo caloso e lateralmente para formar rebordos desiguais e esfarrapados (figuras 1 e 2). O exame dos tecidos marcados com anticorpo de Neuronal-N' revela que a morte neuronal ocorre bem para trás do rebordo da lesão, havendo áreas coradas com Nissl nas quais não existem nenhuns neurónios viáveis. Esta propagação ocorre predominantemente nas 24 horas imediatamente subsequentes (figuras 1 e 2), continuando até terem decorrido 48 horas após o momento da lesão. Isto é particularmente evidente na figura 2, em que a morte neuronal é evidente ao fim de 24 horas bem para trás do rebordo da lesão, em tecido que de qualquer outra forma pareceria normal, e em que a lesão se propagou em sentido descendente na direcção do corpo caloso. Pelo contrário, as lesões que foram melhor tratadas com compostos anti-paralelos em relação à conexina 43 permanecem confinadas ao local original de lesão e possuem níveis de base bastante bem definidos (figuras 3 e 4) . A marcação com Neuronal-N fica co-localizada com o tecido contrastado com Nissl e nenhuma das lesões tratada com compostos anti-paralelos para a conexina 43 se propagou através do corpo caloso. A marcação com Neuronal-N mostra a sobrevivência neuronal até ao rebordo da lesão original do tracto da agulha. Os neurónios sobreviventes em torno destas lesões definem frequentemente fronteiras acutilantes, demarcando o rebordo do tracto da agulha (figuras 3 e 5) . Há mais tecido que permanece viável dentro da própria lesão após o tratamento anti-paralelo; nas lesões de contraprova, a morte celular leva à perda de tecido dentro da área da lesão (compare-se a lesão de contraprova da figura 2 ao fim de 24 horas com as lesões tratadas com compostos anti-paralelo das figuras 3 e 4 ao fim de 48 horas).

Embora a marcação com anticorpos da proteína acídica fibrilar glial (PAFG) mostre algum aumento da activação de astrócitos nos rebordos das lesões, os níveis de proteína de conexina 43 são evidentemente reduzidos em muitos locais, ao longo do rebordo das lesões tratadas com compostos anti-paralelos, em particular os rebordos basal e mediano (figura 6), comparativamente com as contraprovas (figura 7). Em algumas áreas, a única marcação de conexina 43 que ainda permanece, ao fim de 24 horas após o tratamento anti-paralelo específico para conexina 43, é a das paredes dos vasos sanguíneos, apesar do aumento dos níveis de PAFG (figura 6) . De um modo geral, a marcação de conexina 43 em torno de lesões tratadas com compostos anti-paralelo está co-localizada com a marcação de PAFG numa extensão muito menor do que nas contraprovas, nas quais mais de metade da marcação de conexina 43 está relacionada com os astrócitos. Houve níveis de outras conexinas (conexinas 26 e 32) que aparentemente não foram alterados pelos tratamentos anti-paraleloespecíficos para a conexina 43.

Foram lesionados 36 animais. Analisou-se a área de corte transversal (fatia central do volume da lesão num plano coronal) em 21 animais. Os resultados estão indicados no quadro 2 .

Quadro 2 Áreas em corte transversal de lesões tratadas com contraprova e com oligodesoxinucleótidos específicos para conexina 43, deixadas vaias ou tratadas apenas com gel. As medições foram realizadas para animais monitorizados ao fim de 24 horas, 48 horas e 12 dias. Estão incluídos dois conjuntos de números - medições da lesão total e medições 1 mm abaixo da superfície. Na análise do segundo grupo, exclui-se a maior lesão tratada com DB1 (parêntesis), visto que não satisfaz 3 desvios padrão da média para este grupo. Faz-se observar que o cérebro do rato não se cura (ao contrário de outras espécies) e as medições da lesão ao fim de 12 d ias não representam a extensão original de propagação da lesão. DB1 é tratado com anti-conexina 43 HB3 é oligo aleatório e aparentemente é tóxico

Lesão total: (medidas em mm quadrados) 24 horas 48 horas 12 dias DB1 2,42; 3,16; 3,78; 3,7; 6,05; 2,91; 2,79; 2,86

Lesões 1 mm abaixo: (considera-se que esta é uma medição mais exacta, uma vez que todas as lesões tendem a propagar-se no rebordo exterior, indicando que o gel de tratamento de depositou no fundo da lesão e/ou que o córtex exterior foi lesionado quando se perfurou o crânio ou quando se inseriu a agulha com o gel ). 24 horas 48 horas 12 dias DB1 0,91/ 1,13; 2,12; 2,41 (3,38) ; 0,99; 1,54; 1,44; 1,08 0,47; 1,2 HB 3 5, 9 5, 6 Gel/vazio 3,2/2,19 1,86; 1,5; 2,17 1,07; 1,43

Na análise final mediu-se a área da lesão a partir de uma linha 1 mm abaixo do rebordo do córtex exterior para desta forma excluir a lesão propagada no rebordo exterior, onde os tratamentos anti-paralelos têm um efeito fraco ou nulo (devido ao facto de o gel ser injectado e se depositar no fundo das lesões) . Houve um dos animais tratados com compostos anti -paralelos que não falha a média para este grupo em mais de três desvios padrão, tendo por isso sido excluído. 0 tamanho médio das lesões para lesões tratadas com compostos anti-paralelos, ao fim de 24 e 48 horas, era de 1,45 mm2 (± 0,55) e para as contraprovas era de 2,1 mm2 (± 0, 6) . As quatro lesões mais pequenas (entre 8 lesões tratadas com compostos anti-paralelos e 8 lesões de contraprova, às 24 e 48 horas) tinham sido todas tratadas com para conexina 43 anti-paralela, em que a lesão de contraprova mais pequena tinha um tamanho 50 % superior ao destas quatro. Estes dados também estão apresentados graficamente na figura 8. Ao fim de 12 dias, a regeneração ocorre no rato (mas não no tecido cerebral humano) e os limites da lesão propagada não estão definidos de uma forma evidente.

DISCUSSÃO 0 método com camada de gel Pluronic - ODN anti-paralelo foi utilizado para estudar o efeito da desfuncionalização de conexina 43 durante a astrocitose que ocorre após a lesão do córtex cerebral do cérebro de mamíferos. No cérebro, a libertação de toxinas a partir dos neurónios moribundos provoca aquilo que se chama o efeito colateral, com as toxinas a disseminarem-se pelas células adjacentes através dos canais de junções de hiato (Lin et al, (1998)). Em condições neurodegenerativas, a libertação lenta de toxinas dá aparentemente origem a uma hiperregulação dos canais de conexina 43 em astrócitos para permitir o transporte e a remoção das toxinas para a corrente sanguínea. No entanto, nos casos de trauma grave, esta hiperregulação ajuda a disseminar os níveis elevados de toxinas pelos neurónios adjacentes, aniquilando-os. 0 bloqueio da hiperregulação de conexina 43 e a desfuncionalização dos canais de conexina 43 evita esta disseminação, dando origem a lesões com um tamanho até 50% inferior em termos de área em corte transversal. Isto tem implicações significativas na forma como nos debruçamos sobre as apoplexias isquémicas, no tratamento de doenças neurodegenerativas e na modulação dos efeitos secundários decorrentes de intervenções cirúrgicas. EXPERIÊNCIA 3

INTRODUÇÃO O efeito colateral em tecidos neurais, segundo o qual os neurónios lesionados libertam toxinas que se disseminam e aniquilam as células adjacentes, está bem documentado. A experiência 2 mostra que este efeito pode ser reduzido no cérebro utilizando uma metodologia de libertação controlada de oligodesoxinucleótidos anti-paralelos para desfuncionalizar a conexina 43 proteica das junções de hiato. A medula espinal é um outro tecido com uma constituição semelhante à do cérebro e na qual a população neural é suportada por populações de células gliais, incluindo os astrócitos, que são responsáveis pelo efeito neuroprotector através da remoção do glutamato e do cálcio em excesso do ambiente neural. Esta experiência pesquisa a aptidão das formulações da invenção para reduzir a propagação das lesões da medula espinal.

MATERIAIS

Foram preparados oligodesoxinucleótidos com as sequências seguintes: GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (conexina 43) GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (controlo paralelo)

MÉTODOS

Anestesiaram-se ratos Wistar e expôs-se a sua espinal medula. Fez-se então uma lesão numa semi-secção na medula e colocou- se na medula 5 ml de gel Pluronic arrefecidol, contendo ODN que paralelo quer anti-paralelo em relação à conexina 43 (5mM). As aplicações foram cegas. Recuperou-se então a medula exposta e o rato voltou à sua gaiola. Alguns animais foram sacrificados às 24 horas enquanto os outros se mantiveram durante 12 dias e dois meses para determinar a extensão da regeneração dos neurónios e a dimensão final da lesão. Para os estudos da regeneração axonal anestesiaram-se os ratos e os seus axões dividiram-se antes de entrarem no sitio da espinal medula. Colocou-se um pelete de peroxidase de rábano silvestre (PRS) no corte de forma a marcar de forma retrógrada os axões ao longo de um período de 24 horas. No dia seguinte, sacrificaram-se os ratos e retiraram-se as respectivas espinas medulas e fixaram-se em paraformaldeído a 2 %. Trataram-se então as medulas por criogenia das secções e fez-se uma série de secções longitudinais de 8 mm ao longo das medulas. As secções foram então imuno-coradas quer para as conexinas quer para GFAP em conjunto com iodeto de propídio como um marcador nuclear ou trataram-se para revelar a PRS.

RESULTADOS Às 24 horas após a lesão, houve uma diferença marcada entre as lesões da espinal medula tratadas com conexina 43 paralela e ODN anti-paralelos. Aparentemente, as lesões tratadas com os ODS de sentido concordante não eram diferentes das lesões de contraprova, ao passo que as lesões tratadas com ODN anti-paralelos eram aparentemente mais pequenas e estavam menos inflamadas (figura 9).

Ao fim de 12 dias, era possível observar os axónios marcados com PRS tanto nas medulas tratadas com ODN de sentido concordante como anti-paralelo, mas em nenhum dos casos houve números significativos de axónios em regeneração através da lesão. No entanto, houve uma diferença notável no tamanho da lesão, em que a lesão anti-paralela parecia significativamente mais pequena do que as lesões tratadas com ODN de sentido concordante ou então não tratadas.

Ao fim de dois meses após a lesão das medulas espinais, a marcação com PAR dos axónios em regeneração revelou que não tinham conseguido atravessar o local da lesão, tanto no tratamento de sentido concordante como no anti-paralelo. 0 tamanho da lesão era significativamente menor nas medulas tratadas com compostos anti-paralelos, indicando isso uma redução significativa da morte secundária de células neuronais.

DISCUSSÃO

Utilizando as formulações da invenção, a des-funcionalização da conexina 43 com oligodesoxinucleótidos anti-paralelos reduz significativamente a propagação da lesão que ocorre nas primeiras 24 a 48 horas após a lesão da medula espinal. A desfuncionalização da conexina 43 também reduz a inflamação, contribuindo ainda mais para o efeito neuroprotector, mas não há nenhuma alteração na aptidão dos neurónios para crescerem novamente através do local da lesão. Assim, o tratamento anti-paralelo com oligodesoxinucleótidos específicos para a conexina 43 não pode ajudar os neurónios danificados a crescer novamente, mas tem um efeito neuroprotector significativo ao reduzir a propagação da lesão. EXPERIENCIA 4

INTRODUÇÃO

Para se reparar feridas da pele são activados inúmeros tipos de células, tais como fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos, para fins de proliferação, migração e deposição de matriz extracelular para preencher a ferida. A comunicação e a sinalização intercelular são caracteristicas fundamentais do processo de recuperação de feridas. Admite-se que os mecanismos de sinalização extracelular são o factor fundamental, embora também seja provável que a sinalização intercelular através de redes extensas de canais de junções de hiato nas camadas de pele também aqui desempenhe uma função. As ondas de cálcio que se propagam a partir das células lesionadas, através da epiderme , podem assinalar os seus danos. Na reparação de feridas normais, os níveis de conexina começam a baixar ao fim de 6 horas e são necessários até 6 dias para recuperarem. As funções que estas alterações desempenham não são ainda bem compreendidas, mas há uma teoria que diz que as células são libertadas a partir das suas adjacentes para se dividirem rapidamente e depois as junções formam-se novamente para coordenar a migração para dentro do local da ferida e para o cobrir.

Nesta experiência pesquisa-se a aptidão das formulações da invenção para curar feridas.

MATERIAIS

MÉTODOS

Anestesiaram-se murganhos neonatais, da estirpe CDI, com anestésico local por pulverização. Depois fez-se uma ferida 35 limpa por incisão, com um comprimento de 2 mm, ao longo do comprimento de ambas as patas com uma faca de iridectomia. Fazendo as feridas num microscópio de dissecção é possível reproduzi-las na sua dimensão. De um modo geral, estão curadas ao fim de 3 a 6 dias. Pulverizou-se carvão em pó sobre as feridas para as marcar e assim ser possível identificar subsequentemente o local da ferida em momentos posteriores - isto não afecta de modo algum a recuperação. Depois aplicou-se às feridas 5 mL de gel Pluronic gelado que continha os ODN de sentido concordante e anti-paralelo. 0 gel Pluronic é líquido para valores de temperatura entre 0°C e 4°C, mas endurece a valores superiores de temperatura. Depois de ser aplicado ã ferida, o gel endurece no local e actua como um reservatório de libertação lenta para os ODN e também como um agente tensioactivo suave que vai auxiliar na penetração dos ODN no tecido. A aplicação dos ODN de sentido concordante foi efectuada numa das patas e a dos ODN anti-paralelona outra, alternando a esquerda e a direita entre ninhadas. As crias foram aquecidas sob uma lâmpada e depois colocadas novamente junto das suas mães. As feridas foram examinadas diariamente e classificadas quanto à qualidade da reparação. Fez-se a selecção de crias representativas ao fim de 1 dia, 5 dias e 8 dias após a operação e fotografou-se os seus membros dianteiros antes de se anestesiar as crias e de se efectuar a perfusão com 2 % de paraformaldeido. Removeu-se os membros dianteiros e fixou-se por imersão em 2 % de paraformaldeido de um dia para o outro e depois processou-se para histologia com resina (1 dia) ou cera (a partir do 2o dia) .

Verificou-se a inflamação da ferida ao fim de 24 horas após o ferimento. Contrastou-se as secções de resina ao longo da ferida com azul-de-toluidina para revelar as células positivas a nissl, os neutrófilos, que são as primeiras células a responder a uma lesão. Estes também podem ser revelados utilizando marcadores específicos para neutrófilos.

Avalia-se a morte celular e a depuração por marcação com Tunel para assim se determinar a taxa de depuração de células apoptóticas. Recorreu-se à contrastação de macrófagos para se observar o período de depuração apôs a morte celular. Estas operações têm lugar ao fim de 3 a 5 dias após o ferimento.

Angiogénese A granulação é uma característica da reparação do tecido conjuntivo e é provocada pela invasão de inúmeros capilares. Sabe-se que os macrófagos expressam factores angiogénicos poderosos, tais como o FCEV (em inglês VEGF). 0 grau de vascularização é monitorizado com anticorpos para os receptores de FCEV, anti-MACP (em inglês anti-PCAM) e anti-flt-1, que são bons marcadores de vasos sanguíneos. A contracção deste tecido é provocada pela diferenciação de fibroblastos da ferida num miofibroblasto contráctil. Depois de unirem a ferida, morrem apoptoticamente e são removidos pelos macrófagos. Estas células podem ser reveladas por anticorpos específicos para a actina do músculo liso, sendo possível monitorizar a sua formação e a sua remoção. Hiperenervação

Os nervos sensoriais são muito sensíveis aos sinais libertados no momento do ferimento e mostram um crescimento transitório nos locais das feridas em adultos. No entanto, em feridas neonatais, este crescimento é mais profuso e resulta numa hiperenervação permanente. Embora não se saiba bem o que são estes sinais, é provável que sejam libertados pelos macrófagos inflamatórios. A hiperenervação é máxima ao 7o dia após o ferimento e a distribuição nervosa pode ser revelada utilizando o anticorpo PGP 9.5 contra neurofilamentos.

Normalmente, a cicatrização é verificada ao fim de semanas ou meses apôs o fecho da ferida. No entanto, é possível efectuar uma avaliação razoável ao fim de 12 dias após o ferimento. Faz-se a contrastação de secções ao longo da ferida com o corante colagénico vermelho-de-Picrosirus e examina-se num microscópio confocal para se determinar a densidade e a orientação do colagénio no local da ferida.

RESULTADOS

Io dia

Ao fim de 24 horas após o ferimento, eram evidentes diferenças notáveis entre os membros tratados com ODN de sentido concordante e os compostos anti-paralelos. As feridas tratadas com ODN de sentido concordante não pareciam ser diferentes das feridas não tratadas, com um espectro normal de graus e taxas de cura (figura 10) . Os membros tratados com ODN anti-paralelo eram notavelmente diferentes das contraprovas, parecendo menos inflamados e com uma taxa de cura geralmente mais rápida.

As secções de resina dos membros representativos marcadas com um corante de nissl revelaram um número significativamente menor de neutrófilos, indicando isso um tecido menos inflamado (figura 11). 5 o dia

Ao fim de 5 dias após o ferimento, as crostas tinham começado a cair. Nesta fase, a maior parte das feridas tratadas com ODN anti-paralelo pareciam ser mais pequenas do que as tratadas com ODN de sentido concordante, exibindo crostas mais pequenas ou uma cicatrização menos proeminente (figura 12). 8 o dia

Ao fim de 8 dias após o ferimento, tinha já crescido pelo nas feridas. As feridas tratadas com ODN de sentido concordante ainda eram visíveis, estando demarcadas por uma falta de pelo em torno do local da ferida. A maior parte das feridas tratadas com ODN anti-paralelo eram invisíveis, tendo sido cobertas por um crescimento normal de pêlo. Esta diferença no crescimento de pelo indica que as feridas tratadas com ODN anti-paralelo tiveram uma cicatrização reduzida (figura 13).

CONCLUSÕES A aplicação de ODN anti-paralelo em relação à conexina 43 a uma ferida tem um efeito notável sobre o processo de cura. 0 primeiro efeito visível é uma redução da inflamação das feridas, a qual é evidente nas secções que exibem uma resposta inflamatória muito menor em termos de níveis de neutrófilos. À medida que a reparação continua, as feridas tratadas com ODN anti-paralelo curam mais depressa e com menos cicatrização do que as lesões de contraprova.

Esta redução da resposta inflamatória e a melhor reparação subsequente ficam a dever-se, possivelmente, a uma comunicação reduzida de neutrófilos e a uma aceleração dos processos naturais de cura. Os ODN anti-paralelos podem reduzir a expressão de conexina em 4 a 8 horas, por forma que esta não tenha um efeito sobre a sinalização inicial do ferimento, mas desempenhe uma função nos fenómenos de sinalização secundária. É interessante verificar que os neutrófilos que surgem em resposta ao ferimento normalmente expressam grandes quantidades de conexina 43. Também é possível que formem junções de hiato com outras células na ferida e comunicam com elas. A redução desta forma de comunicação pode resultar numa redução dos factores segregados a partir dos neutrófilos e numa redução da morte celular na ferida, bem como da granulação e da hiperenervação. Também se sabe que, em condições normais, os níveis de proteínas conexinas (conexinas 26, 31.1 e 43) são reduzidos, tanto na camada epitelial como subdérmica das feridas, com início ao fim de 6 horas e permanecendo reduzidos durante um período até 6 dias. A metodologia anti-paralela pode acelerar esta redução inicial de proteínas por meio do bloqueio dos processos de tradução, enquanto ocorre a remoção das proteínas a partir da membrana. Na verdade, os efeitos da desfuncionalização da conexina 43 imediatamente após o ferimento possui efeitos notáveis sobre a redução dos níveis inflamatórios e o aumento das taxas de cura. EXPERIENCIA 5

INTRODUÇÃO A inflamação e a morte celular secundária que ocorre a seguir a uma queimadura é um assunto preocupante. As vítimas de queimaduras graves numa grande percentagem do seu corpo muitas vezes morrem ao fim de um ou dois dias após o trauma. Nesta experiência pesquisa-se a aptidão das formulações da invenção para afectarem de uma forma benéfica o processo de recuperação de queimaduras.

MATERIAIS

Foram preparados oligodesoxinucleótidos com as sequências seguintes: GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (conexina 43) GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (contraprova de sentido concordante)

MÉTODOS

Provocam-se queimaduras reproduzíveis em pele humedecida e injecta-se gel Pluronic, que continha ODN anti-paralelo, por via subdérmica na queimadura. Infligiu-se um conjunto de queimaduras, utilizando um ferro de soldar, nos lados esquerdo e direito do crânio de seis murganhos recém-nascidos. As queimaduras num dos lados da cabeça foram tratadas com ODN específico para a conexina 43 em gel Pluronic e as do outro lado foram tratada com ODN de contraprova de sentido concordante em gel Pluronic.

RESULTADOS

Ao fim de 24 horas, a totalidade das seis queimaduras tratadas com ODN para a conexina 43 exibiram níveis inferiores de inflamação, comparativamente com as queimaduras de contraprova. Estas diferenças foram bem evidentes (dados não representados).

UTILIDADE

Assim, proporciona entre duas transitória formulações tratamentos de acordo com a presente invenção, esta formulações através das quais a comunicação células pode ser hiporregulada de uma forma e dependente do local. Sendo assim, as são aplicáveis em métodos para terapia e cosméticos. A administração do componente ODN da formulação durante um período prolongado (24 horas ou superior) constitui uma vantagem particular para o tratamento de lesões neuronais. Na maior parte dos casos de lesão neuronal física directa, isto fica a dever-se ao facto de a perda de células neuronais se prolongar bem além do local da lesão, até às células adjacentes. Esta perda secundária de células neuronais ocorre nas 24 horas subsequentes à lesão original e é mediada pela comunicação entre células pelas junções de hiato. Assim sendo, a hiporregulação da expressão de proteínas conexinas bloqueia ou pelo menos hiporregula a comunicação entre as células e minimiza a lesão secundária das células neuronais.

De igual modo, em casos de lesão de outros tecidos (em particular, feridas), concluiu-se que as formulações da invenção são eficazes para favorecer o processo de cura da ferida, para reduzir a inflamação e para minimizar a formação de cicatrizes. Sendo assim, as formulações são claramente benéficas para o tratamento de feridas, quer resultantes de traumas externos (incluindo as queimaduras) quer de intervenção cirúrgica.

Faz-se ainda observar que a descrição anterior é meramente exemplificativa e que é possível efectuar modificações, tanto em termos de ODN específicos como de cargas ou veículos farmaceuticamente aceitáveis utilizados, sem que haja afastamento do âmbito da presente invenção.

Quadro 1 1 atgggtgact ggagcgcctt aggcaaactc cttgacaagg ttcaagccta ctcaactgct 61 ggagggaagg tgtggctgtc agtacttttc attttccgaa tcctgctgct ggggacagcg 121 gttgagtcag cctggggaga tgagcagtct gcctttcgtt gtaaaactca gcaacctggt 181 tgtgaaaatg tctgctatga caagtctttc ccaatctctc atgtgcgctt ctgggtcctg 241 cagatcatat ttgtgtctgt acccacactc ttgtacctgg ctcatgtgtt ctatgtgatg 301 cgaaaggaag agaaactgaa caagaaagag gaagaactca aggttgccca aactgatggt 361 gtcaatgtgg acatgcactt gaagcagatt gagataaaga agttcaagta cggtattgaa 421 gagcatggta aggtgaaaat gcgagggggg ttgctgcgaa cctacatcat cagtatcctc 481 ttcaagtcta tctttgaggt ggccttcttg ctgatccagt ggtacatcta tggattcagc 541 ttgagtgctg tttacacttg caaaagagat ccctgcccac atcaggtgga ctgtttcctc 601 tctcgcccca eggagaaaac catcttcatc atcttcatgc tggtggtgtc cttggtgtcc 661 ctggccttga atatcattga actcttctat gttttcttca agggcgttaa ggatcgggtt 721 aagggaaaga gcgaccctta ccatgcgacc agtggtgcgc tgagccctgc caaagactgt 781 gggtctcaaa aatatgctta tttcaatggc tgctcctcac caaccgctcc cctctcgcct 841 atgtctcctc ctgggtacaa gctggttact ggcgacagaa acaattcttc ttgccgcaat 901 tacaacaagc aagcaagtga gcaaaactgg gctaattaca gtgcagaaca aaatcgaatg 961 gggcaggcgg gaagcactct ctctaactcc catgcacagc cttttgattt ccccgatgat 1021 aaccagaatt ctaaaaaact agctgctgga catgaattac agccactagc cattgtggac 1081 cagcgacctt caagcagagc cagcagtcgt gccageagca gacctcggcc tgatgacctg

1141 gagatctag REFERÊNCIAS

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<211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial <400> 1 gtaattgcgg caagaagaat tgtttctgtc 30

<210> 2 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 2 gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc 30

<210> 3 <211> 30 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 3 ggcaagagac accaaagaca ctaccagcat 30 <210> 4

<211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 4 tcctgagcaa tacctaacga acaaata 27

<210> 5 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 5 cgtccgagcc cagaaagatg aggtc 25

<210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 6 tttcttttct atgtgctgtt ggtga 25 <210> 7

<211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 7 gacagaaaca attcctcctg ccgcaattac 30

<210> 8 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 8 gtagttacga caggaggaat tgttctcgtc 30

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 9 tcgaactgtc aagactgcta tggcgatcat 30 <210> 10

<211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <4 0 0> 10 ttgtgattta tttagttcgt ctgatttc 28

<210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <4 0 0> 11 gacagaaaca attcctcctg ccgcaattac 30 <210> 12 <211> 1149

<212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 12

Lisboa, 13 de Fevereiro de 2012.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Formulação para se utilizar no tratamento do corpo de um ser humano ou de um animal, por terapia, caracterizada pelo facto compreender: um polinucleótido anti-parelo em relação a uma conexina humana; em conjunto com um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
2. Formulação para se utilizar no tratamento de tecido danificado, caracterizada pelo facto compreender: um polinucleótido anti-parelo em relação a uma conexina humana; em conjunto com um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
3. Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de a formulação se destinar a administração tópica.
4. Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo facto de estar sob a forma de um creme, uma pomada, um gel, uma emulsão, uma loção ou uma tinta.
5. Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo facto de estar sob a forma de um gel.
6. Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de estar sob a forma de um gel de um copolimero não iónico de polioxiteileno - polioxipropileno.
7 . Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de estar sob a forma de gel de Pluronic.
8. Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de compreender Pluronic F-127.
9. Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo facto de compeender Pluronic F-127 a 30 %.
10. Formulação para se utilizar de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o polinucleótido ser formulado para administração parentérica, intramuscular, intracerebral, subcutânea ou transdérmica.
11. Formulação para se utilizar de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de ser uma formulação de libertação sustentada.
12. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de compreender ainda um agente auxiliar seleccionado entre caseína, gelatina, albumina, cola, alginato de sódio, carboximetilcelulose, metilcelulose, hidroxietil-celulose ou álcool de polivinilo.
13. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de compreender ainda um ou mais de tensioactivos, agentes de emulsão, agentes de carga, veículos inertes e agentes de penetração transdérmica.
14. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de estar sob a forma de um revestimento impregnado com pelo menos um polinucleótidos anti-paralelo em relação à conexina.
15. Formulação, para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de o polinucleótido ser ADN.
16. Formulação, para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo facto de o polinucleótido ser ARN.
17. Formulação, para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo facto de o polinucleótido ser um oligodesoxinucleótido.
18. Formulação, para ser utilizada de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo facto de o oligodesoxinucleótido ser um oligonucleótido de fosfodiéster não modificado.
19. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo facto de o polinucleótido ser um oligonucleótido quimicamente modificado seleccionado entre fosforotioatos, fosfonatos de metilo, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos, fosforotioatos de oligoribonucleótidos e os seus análogos de 2'-O-alquilo, metilfosfonatos de 2'-O-metilribonucleótidos e oligonucleótidos de estrutura mista.
20. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de o polinucleótido ter entre 6 e 40 nucleótidos de comprimento.
21. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de o polinucleótidos ter entre 12 e 20 nucleótidos de comprimento.
22. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo facto de o polinucleótido ter pelo menos 40 nucleótidos de comprimento.
23. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo facto de conter polinucleótidos anti-paralelos em relação à conexina.
24. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo facto de conter polinucleótidos anti-paralelos em relação à conexina β.
25. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de a conexina ser conexina 26, conexina 31.1, conexina 32, conexina 36 ou conexina 43.
26. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 23 e 25, caracterizada pelo facto de a conexina ser conexina 43.
27. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22, 24 e 25, caracterizada pelo facto de a conexina ser conexina 31.1.
28. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22, 24 e 25, pelo facto de a conexina ser conexina 26.
29. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de conter polinucleótidos anti-paralelos em relação a mais do que uma das conexinas.
30. Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo facto de incluir polinucleótidos anti-paralelos dirigidos a conexina 26, conexina 31.1, conexina 32, conexina 36, conexina 40, conexina 43 e/ou conexina 45.
31. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das revindicações 1 a 28, caracterizada pelo facto de conter polinucleótidos anti-paralelos em relação apenas a uma conexina.
32. Formulação, para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 25 a 31 caracterizada pelo facto de o polinucleótico, anti-paralelo em relação à conexina 43 ser seleccionado entre: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC; GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC; e GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT; o polinucleótico, anti-paralelo em relação à conexina 26 ser: TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA; o polinucleótico anti-paralelo em relação à conexina 31.1 ser: CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C; ou o polinucleótico anti-paralelo em relação à conexina 32 ser: TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A.
33. Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti-paralelo em relação à conexina 43 ser GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC.
34. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 25, 26 e 29 a 31, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti-paralelo ter pelo menos 70 % de homologia com um polinucleótido com a sequência que se segue: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC.
35.Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti-paralelo ter pelo menos 90 α Ό de homologia com um polinucleótido com a sequência que se segue: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC
36.Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo facto de 0 polinucleótico anti-paralelo ter pelo menos 95 g. Ό de homologia com um polinucleótido com a sequência que se segue: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC.
37. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo facto de o polinucleótidos anti-paralelo ter hélice dupla.
38. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 36, caracterizada pelo facto de o polinucleótido anti-paralelo ter hélice simples.
39. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti-paralelo ser capaz de se ligar a um ARNm de uma conexina.
40. Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti- paralelo ser capaz de se ligar a um ARNm da conexina 43.
41 . Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti-paralelo ter uma complementaridade absoluta com o ARNm.
42. Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti-paralelo não ter uma complementaridade absoluta com o ARNm.
43. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 39 a 42, caracterizada pelo facto de o polinucleótico anti-paralelo poder ligar-se a um ARNm de conexina quer (i) 5' à sequência de codificação e/ou (ii) à sequência de codificação e/ou (iii) 3' à sequência de codificação.
44. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações 39 a 42, caracterizada pelo facto de o ARN compreender a SEQ ID NO: 12.
45. Formulação para ser utilizada de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de ser formulada numa quantidade suficiente para diminuir a morte de células num tecido de mamífero ou num tecido imediatamente adjacente a uma ferida.
46. Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo facto de o tecido de mamífero ser selecionado entre pele, tecido neutro, cérebro, espinal medula, tecido conjuntivo e vasos sanguíneos.
47. Formulação, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de se utilizar num processo de promoção de cura de feridas.
48. Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo facto de a conexina ser conexina 43, conexina 31.1 ou conexina 26.
49. Formulação para ser utilizada de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizada pelo facto de a formulação ser uma formulação de libertação sustentada.
50. Formulação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo facto de se utilizar para o tratamento de uma ferida em que se aplica a formulação antes da cura ou de a ferida estar fechada.
51. Formulação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo facto de se utilizar num processo de tratamento de uma ferida resultante de uma cirurgia.
52. Formulação, para ser utilizada de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo facto de a formulação ser aplicada antes do fecho de uma ferida cirúrgica.
53. Formulação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo facto de se utilizar num processo de promoção do rejuvenescimento da pele ou de um espessamento para um fim terapêutico por meio da regulação da divisão e crescimento de células da base epiletial, em que a conexina é conexina 26 ou conexina 43.
54. Formulação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo facto de se utilizar num processo de promoção do rejuvenescimento da pele ou de um espessamento para um fim terapêutico por meio da regulação da queratinização da camada externa, em que a formulação contém um polinucleótido anti-paralelo contra a conexina 31.1.
55. Formulação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo facto de se utilizar num processo de: (a) redução da morte de células neuronais que, por sua vez, resultaram de um traumatismo dos neurónios; (b) tratamento de neurónios danificados no cérebro, espinhal medula ou nervo óptico ou lesões no cérebro; (c) tratamento de lesões da espinhal medula ou de traumatismos da espinhal medula; (d) tratamento de distúrbios neurodegenerativos; (e) promoção da cura de feridas que sejam o resultado de traumatismos, queimaduras ou cirurgia; (f) redução da inflamação, (g) tratamento de acidente vascular isquémico; (h) diminuição da formação de escaras; ou (i) rejuvenescimento da pele para um fim terapêutico.
56. Formulação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo facto de se utilizar num processo de tratamento de acidente vascular isquémico, em que a formulação compreende um polinucleótido anti-paralelo em relação à proteína conexina 43.
57. Produto para a armazenagem ou a distribuição de uma formulação caracterizado pelo facto de compreender um polinucleótido anti-paralelo em relação à proteína conexina, em que o referido produto compreende uma seringa e uma agulha, em que o produto contém um polinucleótido anti-paralelo em relação à proteína conexina e um gel de Pluronic F-127.
58. Produto, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo facto de a proteína conexina ser conexina 43.
59. Utilização de uma formulação, tal como definida em uma qualquer das reivindicações até à 46, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento para: (a) promoção da cura de feridas; (b) redução da morte de células neuronais que, por sua vez, resultaram de um traumatismo dos neurónios; (c) tratamento de neurónios danificados no cérebro, espinhal medula ou nervo óptico ou lesões no cérebro; (d) tratamento de lesões da espinhal medula ou de traumatismos da espinhal medula; (e) tratamento de distúrbios neurodegenerativos; (f) redução da inflamação, (g) tratamento de acidente vascular isquémico; (h) diminuição da formação de escaras; ou (i) rejuvenescimento da pele para um fim terapêutico.
60. Utilização, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo facto de a ferida ser o resultado de traumatismo, queimaduras ou cirurgia.
61. Polinucleótido anti-paralelo em relação à conexina, caracterizado pelo facto de: (a) a conexina ser conexina 43 e o polinucleótido seleccionar-se entre: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC; GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC; e GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT; (b) a conexina ser conexina 26 e o polinucleótido ser TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA; (c) a conexina ser conexina 31.1 e o polinucleótido ser CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C; ou (d) a conexina ser conexina 32 e o polinucleótido ser TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A.
62. Polinucleótido anti-paralelo, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo facto de ser ADN.
63. Polinucleótido anti-paralelo, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo facto de ser ARN.
64. Polinucleótido anti-paralelo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 61 a 63, caracterizado pelo facto de ser um oligodesoxinucleótido.
65. Polinucleótido anti-paralelo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 61 a 64, caracterizado pelo facto de ser de hélice dupla.
66. Polinucleótido anti-paralelo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 61 a 64, caracterizado pelo facto de ser de hélice simples.
67. Polinucleótido anti-paralelo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 61 a 66, caracterizado pelo facto de ser um oligonucleótido quimicamente modificado seleccionado entre fosforotioatos, fosfonatos de metilo, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos, fosforotioatos de oligoribonucleótidos e os seus análogos de 2'-O-alquilo, metilfosfonatos de 2'-0-metil-ribonucleótido e oligonucleótidos de estrutura mista. Lisboa, 13 de Fevereiro de 2012.