ES2377749T3 - Formulaciones que comprenden nucleótidos antisentidos para conexinas - Google Patents

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Abstract

Una formulación para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante una terapia, cuya formulación comprende: un polinucleótido complementario de una conexina humana; junto con un soporte o un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Description

Formulaciones que comprenden nucle6tidos antisentidos para conexinas Este invento se refiere a las formulaciones para usar en tratamientos terapeuticos y/o cosmeticos, particularmente aquellos en los que una interrupci6n localizada en la comunicaci6n directa celula-celula es deseable. 5 ANTECEDENTES Las uniones intercelulares son estructuras de membrana celular que facilitan la comunicaci6n directa celula-celula. Un canal de uni6n intercelular esta formado por dos hemicanales (conexones), cada uno esta compuesto por seis subunidades de conexinas. Estas conexinas son una familia de proteinas, comunmente denominadas segun sus pesos moleculares o clasificadas segun una base filogenetica, es decir, en una clase α y una clase β. 10 Una capacidad para controlar la expresi6n de las conexinas (y en particular para disminuir sus niveles) proporcionaria por lo tanto una oportunidad para modular la comunicaci6n celula-celula en un paciente, para prop6sitos terapeuticos y/o de remedio. Sin embargo, ya que un numero de proteinas conexinas se expresa ampliamente a traves del cuerpo, no se desea un efecto de disminuci6n general de los niveles para inducir un efecto terapeutico en un sitio especifico. 15 Los oligonucle6tidos antisentidos (ODNs) tienen un potencial considerable como agentes para la manipulaci6n de la expresi6n genica especifica (revisado: Stein y otros, 1992; Wagner 1994). Sin embargo, quedan dificultades que necesitar ser superadas. Estas incluyen la vida media corta de tales ODNs (olig6meros fosfodiester sin modificar tienen tipicamente una vida media intracelular de s6lo 20 minutos debido a la degradaci6n por nucleasas intracelulares (Wagner 1994)) y su liberaci6n de modo consistente y fiable a los tejidos diana.
20 Fue con la intenci6n de superar al menos parcialmente estas dificultades que los solicitantes concibieron el presente invento. RESUMEN DEL INVENTO La invenci6n se define en las reivindicaciones. Consecuentemente, en un primer aspecto, el invento proporciona una
formulaci6n para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante una terapia, cuya formulaci6n 25 comprende: un polinucle6tido complementario de una conexina humana; junto con un soporte o un vehiculo
farmaceuticamente aceptable. En una forma preferida, la formulaci6n contiene polinucle6tidos s6lo para una proteina conexina. Mas preferiblemente, la proteina conexina es conexina 43.
Muchos aspectos del invento se describen con referencia a los oligodesoxinucle6tidos. Sin embargo, se comprende
30 que otros polinucle6tidos adecuados (tales como polinucle6tidos ARN) pueden ser usados en estos aspectos. Alternativamente, la formulaci6n contiene oligodesoxinucle6tidos para mas de una proteina conexina. Preferiblemente, una de las proteinas conexinas a la que se dirigen los oligodesoxinucle6tidos es conexina 43. Otras proteinas conexinas a las que los oligodesoxinucle6tidos estan dirigidos incluyen conexina 26, conexina 31.1 y conexina 32.
35 Convenientemente se selecciona el oligodesoxinucle6tido para conexina 43 de: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC, GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC, y GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT Lo mas convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 43 es:
40 GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC Convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 26 y es: TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA Convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 31.1 es: CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C
45 Convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 32 es:
TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A.
Los polinucle6tidos antisentido se pueden formular para administraci6n parenteral, intramuscular, intracerebral, intravenosa, subcutanea o transdermica. Los polinucle6tidos antisentido se administran preferentemente de forma t6pica (en la parte a ser tratada). Adecuadamente, los polinucle6tidos antisentido se combinan con un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptables para proporcionar una composici6n farmaceutica.
Excipientes o vehiculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera de los comunmente usados para administraci6n t6pica. La formulaci6n t6pica puede estar en forma de crema, unguento, gel, emulsi6n, loci6n o pintura. La formulaci6n del invento se puede presentar tambien en forma de un ap6sito impregnado.
Materiales excipiente adecuados incluyen cualquier excipiente o vehiculo comunmente usado como base para cremas, lociones, geles, emulsiones, lociones o pinturas para la administraci6n t6pica. Los ejemplos incluyen agentes de emulsificaci6n, excipientes inertes que incluyen bases hidrocarbonadas, bases de emulsificaci6n, disolventes no t6xicos o bases hidrosolubles. Ejemplos particularmente adecuados incluyen lanolina, parafina dura, parafina liquida, parafina amarilla blanda o parafina blanca blanda, cera de abeja blanca, cera de abeja amarilla, cetoestearil alcohol, cetilalcohol, dimeticonas, ceras emulsionantes, isopropil miristato, cera microcristalina, alcohol oleilico y alcohol estearilico.
Preferentemente, el excipiente farmaceuticamente aceptable o vehiculo es un gel, un gel copolimero polioxietilenopolioxipropileno no i6nico adecuado, por ejemplo, un gel Plur6nico, preferentemente Plur6nico F-127 (BASF Corp.). Este gel es particularmente preferido, ya que es liquido a baja temperatura pero rapidamente se fija a temperaturas fisiol6gicas, que limitan la liberaci6n del componente ODN al sitio de aplicaci6n o inmediatamente adyacente a ese sitio.
Un agente auxiliar tal como caseina, gelatina, albumina, pegamento, alginato s6dico, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa o polivinil alcohol se pueden incluir tambien en la formulaci6n del invento.
La composici6n farmaceutica se puede formular para proporcionar una liberaci6n sostenida del polinucle6tido antisentido.
Convenientemente, la formulaci6n incluye ademas un tensioactivo para ayudar con la penetraci6n oligodesoxinucleotidica a la celula o la formulaci6n puede contener cualquier agente de carga adecuado. Cualquier tensioactivo no t6xico adecuado puede ser incluido, tal como DMSO. Alternativamente, se puede incluir un agente de penetraci6n transdermica tal como la urea.
En la presente memoria tambien se describe un metodo de reducci6n, de sitio especifico, de los niveles de expresi6n de la proteina conexina con fines terapeuticos y/o cosmeticos, que comprende administrar una formulaci6n como se define anteriormente a un sitio o en un paciente en el se requiere dicha reducci6n.
Todavia en otro aspecto, se describe un metodo para reducir la muerte celular neuronal que de otra manera resultaria de una lesi6n neuronal en un sitio especifico del cerebro, medula espinal o nervio 6ptico de un paciente, que comprende la etapa de administrar una formulaci6n como se define anteriormente a dicho sitio para reducir la expresi6n de proteina(s) conexina(s) en un sitio inmediatamente adyacente a dicho sitio.
Preferiblemente, la formulaci6n se administra para reducir la perdida neuronal debida a trauma fisico del cerebro, medula espinal o nervio 6ptico.
Convenientemente, la formulaci6n se administra en una cantidad suficiente para reducir los niveles de expresi6n de dicha(s) proteina(s) conexina(s) durante al menos 24 horas despues de la administraci6n.
Todavia en otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un medio para estimular la cicatrizaci6n de heridas en un paciente, que comprende la etapa de administrar una formulaci6n como se define anteriormente a dicha herida para reducir el nivel de expresi6n de una(s) proteina(s) conexina(s) en un sitio inmediatamente adyacente a dicha herida.
Generalmente, la herida sera el resultado de un trauma, incluyendo quemaduras. Puede ser, sin embargo, el resultado de una operaci6n.
Tambien se describe un metodo para reducir la inflamaci6n como parte del tratamiento de una herida y/o tejido sometido a trauma fisico que comprende la etapa de administrar una formulaci6n como se define anteriormente o pr6xima a dicha herida o tejido.
Preferentemente, dicha herida es una quemadura.
Alternativamente, dicha herida es el resultado de un trauma fisico en el tejido, incluyendo tejidos neuronales como el cerebro, la medula espinal o el nervio 6ptico.
En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un medio para disminuir la formaci6n de cicatrices en un paciente que ha padecido una herida, que comprende la etapa de administrar una formulaci6n como se define anteriormente a dicha herida para reducir los niveles de expresi6n de una(s) proteina(s) conexina(s) en un sitio inmediatamente adyacente al sitio de dicha herida.
De nuevo, la herida puede ser el resultado de un trauma u operaci6n, aplicandose la formulaci6n en la herida inmediatamente antes de la operaci6n quirurgica y/o cierre de la misma.
En un aspecto adicional mas, se describe un medio para el rejuvenecimiento o engrosamiento de la piel con fines cosmeticos o terapeuticos que comprende la etapa de administrar, una vez o de forma repetida, una formulaci6n como se define anteriormente a la superficie de la piel.
Convenientemente, dicha formulaci6n incluye oligodesoxinucle6tidos dirigidos a la conexina 26 o conexina 43 y es administrada para regular la divisi6n y crecimiento celular basal epitelial.
En otra realizaci6n, dicha formulaci6n incluye oligodesoxinucle6tidos dirigidos a la conexina 31,1 y es administrada para regular la queratinizaci6n de la capa externa.
Preferentemente, la formulaci6n es una crema o gel.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Figuras 1 a 5 muestran secciones de lesiones cerebrales de rata tratadas con gel Plur6nico que contiene oligodesoxinucle6tidos antisentido especifico para la conexina 43, o para lesiones testigo, gel Plur6nico solo. En todos los casos, las lesiones fueron seccionadas seriamente en un plano coronal y las secciones de punto medio usadas para analisis. Cada imagen (excepto la Figura 5) muestra 4 mm por 5,33 mm de tejido. La Figura 5 es aproximadamente de 1,2 mm por 2 mm.
Figura 1: las Figuras 1A y 1C muestran dos lados de una lesi6n testigo 24 horas despues de la lesi6n. La lesi6n ha sido tratada con gel Plur6nico solo. Las secciones han sido tenidas con Nissl (nucleos azules) y el anticuerpo etiquetado con el marcador neuronal N-Neuronal (celulas marrones). Las Figuras 1B y 1D muestran una escala gris de las imagenes 1A y 1C respectivamente con el borde de la lesi6n marcada. N6tese el gran tamano de la lesi6n y la extensi6n irregular de los bordes. La lesi6n se ha extendido hacia abajo en direcci6n al cuerpo calloso (linea discontinua) dentro de las 24 horas despues de la lesi6n.
La Figura 2: Una lesi6n testigo 24 horas despues de la herida. La figura 2A muestra tinci6n Nissl (nucleos azules) y marcado N-Neuronal de neuronas viables. La Figura 2B es una escala de grises equivalente con el borde de la lesi6n marcado y la parte superior del cuerpo calloso marcado (linea discontinua). La marca de la aguja original es clara pero la muerte neuronal ha tenido lugar mas atras del borde de la lesi6n como se indica mediante el marcado del N-Neuronal. Los bordes de la lesi6n son irregulares y la lesi6n, dentro de las 24 horas, se ha extendido hacia abajo en el cuerpo calloso.
Figura 3: Las Figuras 3A y 3B son imagenes de escalas de color y de grises de una lesi6n tratada con antisentido para conexina 43, 48 horas despues de lesionarse. El perfil de la lesi6n se ha marcado en la Figura 3B para mostrar la extensi6n de la lesi6n y la parte superior del cuerpo calloso se ha marcado (linea discontinua). La Figura 3A se ha tenido con Nissl (nucleos azules) y N-Neuronal (celulas rosadas). N6tese como es de compacta la lesi6n, incluso despues de 48 horas, comparado con las lesiones testigo (Figuras 1 y 2). Mientras que hay una extensi6n hacia el lado derecho, el lado izquierdo de la lesi6n sigue esencialmente la marca de la aguja original con pequenos signos de extensi6n. El lado izquierdo de la lesi6n es bastante recto y no se ha propagado al cuerpo calloso.
Figura 4: Las Figuras 4A y 4B muestran otra lesi6n que ha sido tratada con antisentido para conexina 43, 48 despues de la herida. El marcaje es el mismo que en la Figura 3 con la lesi6n perfilada en la imagen de la escala de grises (Figura 4B). Incluso despues de 48 horas esta lesi6n es extremadamente compacta con pequenas extensiones s6lo hacia la izquierda (lado medio). N6tese como de recto es el lado derecho de la lesi6n con neuronas viables hacia el borde de la marca de la aguja (y verdaderamente sobreviven dentro del area lesionada). La lesi6n esta muy por encima del cuerpo calloso (linea discontinua) indicando que virtualmente no hay ninguna extensi6n hacia abajo.
Figura 5: Un aumento mayor de la vista muestra el borde de una lesi6n tratada con el antisentido de la conexina 43. El borde de la lesi6n se ha marcado mostrando las neuronas viables (marcadas con N-Neuronal) por encima hasta el borde de la marca de la aguja lesionante, incluso 48 horas despues de la lesi6n.
Figura 6: Marcaje inmunohistoquimico de GFAP (rojo) y conexina 43 (verde) de una lesi6n tratada con un antisentido especifico para conexina 43, 24 horas despues de la lesi6n. La imagen esta tomada en el borde lateral de la lesi6n en un punto medio del camino hacia debajo de la profundidad de la lesi6n. Los niveles de astrocitos activados son elevados comparados con los de los testigos (Figura 7) y los niveles de conexina 43, estan notablemente reducidos. El resto de marcaje de conexina esta asociado generalmente con los vasos sanguineos(flechas).
Figura 7: Marcaje inmunohistoquimico de GFAP (rojo) y conexina 43 (verde) de una lesi6n testigo, 24 horas despues de la lesi6n. La imagen esta tomada en el borde medio de la lesi6n y muestra niveles de GFAP ligeramente elevados por encima de c6rtex no lesionado. N6tese el extenso marcaje de la conexina 43, a menudo colocalizada con el marcador de astrocitos GFAP (flechas).
Figura 8 muestra una comparaci6n las areas de la mitad inferior de las secciones transversales de la lesi6n 24 horas (circulos) y 48 horas (rombos) despues de la lesi6n. El analisis se llev6 a cabo en una media secci6n de un corte de la lesi6n seccionada en serie, cortada en el plano coronario. Las lesiones fueron evaluadas usando anticuerpos marcados con N-Neuronal para delinear las neuronas viables. Las lesiones tratadas con DBI (marcadores verdes) han sido tratadas con oligodesoxinucle6tidos antisentido especificos para conexina 43. El grupo de lesi6n tratada s6lo con gel (marcadores rojos) tambien incluye lesiones vacias mientras que el grupo HB3 (marcadores violetas) es tratado con el gel que contiene una secuencia aleatoria de oligodesoxinucle6tidos testigo. N6tese que, mientras las lesiones tratadas con antisentido para conexina 43 pueden ser grandes (presumiblemente en las que el antisentido no ha sido bien liberado), las lesiones mas pequenas son todas tratadas con antisentido para conexina 43. Las lesiones fueron hechas hasta una profundidad de 2 mm y los analisis cubren 1 mm y por debajo, de manera a excluir el borde exterior donde el antisentido no se asent6.
Figura 9: las lesiones en la medula espinal de la rata 24 horas despues del tratamiento con ODNs homosentido y antisentido para conexina 43. Las lesiones homosentido no fueron diferentes de los testigos sin tratar mientras que las lesiones tratadas con antisentido eran mas pequenas y con una inflamaci6n reducida.
Figura 10: lesiones en las patas delanteras de un rat6n neonatal 24 horas despues del tratamiento con ODNs homosentido para conexina 43 (pata izquierda) u ODNs antisentido (pata derecha). N6tese la reducci6n de la inflamaci6n y el aumento en la velocidad de cicatrizaci6n en la pata tratada con antisentido.
Figura 11: secciones a traves del centro de las heridas de 24 horas mostradas en la Figura 10. Las secciones han sido tenidas con azul de toluidina para mostrar los neutr6filos. Hay considerablemente menos neutr6filos en la herida tratada con antisentido que estaba ademas menos inflamada.
Figura 12: pares de lesiones en las patas de ratas cinco dias despues de la lesi6n, que han sido tratadas con ODNs antisentido especificos para conexina 43 u testigo ODNs homosentido. Las lesiones tratadas con antisentido se curan mas rapido y muestran menos signos de formaci6n de cicatrices.
Figura 13: pares de lesiones en las patas de las ratas hechas en el estadio neonato, y observadas aqui 8 dias despues de la lesi6n. Las lesiones fueron tratadas con ODN antisentido especifico de conexina 43 u homosentido testigo. El pelo ha crecido y esta claro que el tratamiento antisentido ha dado como resultado cicatrices mas pequenas y menor perdida de pelo. El sitio de la lesi6n permanece destacado en el testigo tratado con homosentido pero es dificil de detectar en la extremidad tratada con antisentido.
DESCRIPCION DEL INVENTO
Como se ha definido anteriormente de modo amplio, el enfoque del invento es la reducci6n de los niveles de modo especifico de sitio de la expresi6n de la conexina. Esto tendra el efecto de reducir la comunicaci6n directa celulacelula en el sitio en el que la expresi6n de la conexina esta disminuida, lo que genera numerosas aplicaciones terapeuticas/cosmeticas, como se describe a continuaci6n.
La disminuci6n de los niveles de la expresi6n de la conexina esta basada generalmente en la aproximaci6n antisentido usando polinucle6tidos antisentido (tales como polinucle6tidos ADN o ARN), y de modo mas particular en el uso de oligodesoxinucle6tidos (ODN) antisentido. Estos polinucle6tidos (por ejemplo ODN) tienen como objetivo reducir los niveles de las proteinas conexina. Tipicamente los polinucle6tidos son de hebra unica, pero pueden ser de doble hebra.
Los polinucle6tidos antisentido pueden inhibir la transcripci6n y/o la traducci6n de la conexina. Preferiblemente, el polinucle6tido es un inhibidor especifico de la transcripci6n y/o traducci6n a partir del gen de la conexina, y no inhibe la transcripci6n y/o la traducci6n a partir de otros genes. El producto se puede unir al gen o mARN de la conexina bien (i) en 5' de la secuencia codificante, y/o (ii) a la secuencia codificante, y/o (iii) en 3'de la secuencia codificante.
Generalmente, el polinucle6tido antisentido causara la expresi6n de mARN y/o proteina de conexina en una celula que ha de ser reducida.
El polinucle6tido antisentido es generalmente antisentido para el mARN de la conexina. Tal polinucle6tido puede ser capaz de hibridar con el mARN de la conexina y puede asi inhibir la expresi6n de la conexina interfiriendo con uno o mas aspectos del metabolismo del mARN de la conexina incluyendo la transcripci6n, procesamiento del mARN, transporte del mARN desde el nucleo, la traducci6n o la degradaci6n de mARN. El polinucle6tido antisentido hibrida tipicamente con el mARN de la conexina para formar un duplex que puede causar inhibici6n directa de la traducci6n y/o desestabilizaci6n del mARN. Tal duplex puede ser susceptible de degradaci6n por nucleasas.
El polinucle6tido antisentido puede hibridar con todo o parte del mARN de la conexina. Tipicamente, el polinucle6tido antisentido hibrida con la regi6n de uni6n del ribosoma o con la regi6n codificante del mARN de la conexina. El polinucle6tido puede ser complementario a todo o a una regi6n del mARN de la conexina. Por ejemplo, el polinucle6tido puede ser el complemento exacto de todo o de una parte del mARN de la conexina. Sin embargo, no se requiere la complementariedad absoluta y los polinucle6tidos que tienen suficiente complementariedad para formar un duplex, que tienen una temperatura de fusi6n mayor de 20°C, 30°C o 40°C en condiciones fisiol6gicas, son particularmente adecuados para usar en el presente invento.
De este modo el polinucle6tido es tipicamente un hom6logo del mARN. El polinucle6tido puede ser un polinucle6tido que hibrida con el mARN de la conexina en condiciones de media a alta rigurosidad tal como cloruro s6dico 0,03 M y citrato s6dico 0,03 M a partir de alrededor de 50 a alrededor de 60 grados centigrados.
El polinucle6tido sera tipicamente desde 6 a 40 polinucle6tidos de longitud. Preferiblemente sera de 12 a 20 nucle6tidos de longitud. Los polinucle6tidos pueden ser al menos 40, por ejemplo al menos 60 o al menos 80, nucle6tidos de longitud y hasta de 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 o 3000 o mas nucle6tidos de longitud.
La proteina conexina o proteinas diana para el ODN seran dependientes del sitio en el que se ha de efectuar la disminuci6n de los niveles. Esto refleja la estructura no uniforme de las uniones intercelulares en diferentes sitios a traves del cuerpo en terminos de la composici6n de subunidades de conexina. La conexina puede ser cualquier conexina presente de manera natural en un humano o animal. El gen de la conexina (incluyendo la secuencia codificante) tiene generalmente homologia con cualquiera de las conexinas especificas mencionadas aqui, tal como la homologia con la secuencia codificante de la conexina 43 mostrada en la Tabla 1. La conexina es tipicamente una conexina a o �. Preferiblemente, la conexina se expresa en la piel o tejido nervioso (incluyendo las celulas del cerebro).
Algunas proteinas conexinas son sin embargo mas ubicuas que otras, en terminos de distribuci6n en el tejido. Una de las mas extendidas es la conexina 43. Los ODNs que estan dirigidos hacia la conexina 43 son por lo tanto particularmente adecuados para el uso en el presente invento.
Tambien se contempla que los ODNs que estan dirigidos hacia proteinas de conexina por separado pueden ser usados en combinaci6n (por ejemplo pueden estar dirigidos a 1, 2, 3, 4, o mas conexinas diferentes). Por ejemplo, ODNs dirigidos a la conexina 43, y uno o mas miembros de la familia de la conexina (tal como la conexina 26, 31.1, 32, 36, 40 y 45) se pueden usar en combinaci6n.
Los polinucle6tidos antisentido individuales pueden ser especificos para una conexina particular, o pueden estar dirigidos hacia 1, 2, 3 o mas conexinas diferentes. Los polinucle6tidos especificos estaran dirigidos generalmente a secuencias en el gen o mARN de las conexinas que no estan conservadas entre las conexinas, mientras que los polinucle6tidos no especificos alcanzaran secuencias conservadas.
Los ODNs para usar en el invento seran generalmente olig6meros fosfodiester sin modificar. Variaran en longitud aunque un ODN de 30 mer es particularmente adecuado.
Los polinucle6tidos antisentido pueden ser quimicamente modificados. Esto puede potenciar su resistencia a las nucleasas y puede potenciar su capacidad para entrar en las celulas. Por ejemplo, se pueden usar oligonucle6tidos fosfotioato. Otros desoxinucle6tidos analogos incluyen metilfosfonato, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'fosforamidatos y oligoribo-nucle6tidos fosforotioatos y sus analogos 2'-O-alquil y 2'-O-metilfosfonatos metilribonucle6tido.
Alternativamente se pueden usar oligonucle6tidos de cadenas mixtas (MBOs). Los MBOs contienen segmentos de oligodesoxinucle6tidos fosfotioato y segmentos colocados apropiadamente de oligodesoxi u oligoribonucle6tidos modificados. Los MBOs tienen segmentos de uniones fosforotioato y otros segmentos de otros oligonucle6tidos modificados, tales como metilfosfonato, que es no i6nico, y muy resistente a las nucleasas o 2'-O-alquiloligoribonucle6tidos.
La secuencia exacta del polinucle6tido antisentido usado en el invento dependera de la proteina conexina diana. Para la conexina 43, el solicitante ha encontrado que los ODNs, que tienen las siguientes secuencias son particularmente adecuados:
GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC; GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC; y GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT
Los ODNs dirigidos a otras proteinas conexina pueden ser seleccionados en terminos de su secuencia nucleotidica mediante cualquier aproximaci6n c6moda y convencional. Por ejemplo, se pueden usar los programas informaticos MacVector y OligoTech (de Oligos etc. Eugene, Oreg6n, USA). Por ejemplo, los ODNs para las conexinas 26, 31.1 y 32 tienen las siguientes secuencias:
5'TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (conexina 26)
5'CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C (conexina 31,1)
5'TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A (conexina 32)
Una vez seleccionado, los ODNs pueden ser sintetizados usando un sintetizador de ADN.
Para el uso en el invento, el ODN(s) requiere una liberaci6n especifica de sitio. Tambien requiere la liberaci6n a lo largo de un periodo extenso de tiempo. Mientras que esta claro que el periodo de suministro dependera tanto del sitio en que se inducira la reducci6n de los niveles como del efecto terapeutico que se desea, se requeriran con frecuencia liberaciones continuas de 24 horas o mas.
De acuerdo con el presente invento, esto se logra mediante la inclusi6n del ODN(s) en una formulaci6n junto con un excipiente o vehiculo farmaceuticamente aceptable, particularmente en la forma de una formulaci6n para administraci6n t6pica.
Una vez preparadas, las formulaciones del invento tienen utilidad en cualquier aproximaci6n terapeutica /cosmetica donde se desea una interrupci6n transitoria y especifica de sitio de la comunicaci6n celula-celula. Esto incluye el tratamiento del dano neuronal en el cerebro, la medula espinal o el nervio 6ptico (en el que el dano ha de ser localizado tanto como sea posible), en la promoci6n de la cicatrizaci6n de la herida y en la reducci6n de la formaci6n de cicatriz despues de, por ejemplo, operaciones cosmeticas o quemaduras.
En particular, las formulaciones t6picas tales como cremas pueden ser empleadas para regular la divisi6n de las celulas basales epiteliales y el crecimiento (usando ODNs dirigidos a la conexina 43) y la queratinizaci6n de la capa externa (usando ODNs dirigidos a la conexina 31,1).
Los polinucle6tidos antisentido (incluyendo el ODN) pueden estar presentes en una forma aislada sustancialmente. Se entendera que el producto se puede mezclar con excipientes o diluyentes que no interferiran con el prop6sito del producto que se pretende designar y aun considerarse como sustancialmente aislado. Un producto del invento puede estar tambien en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprendera generalmente el 90%, por ejemplo al menos 95%, 98% 6 99% del polinucle6tido o masa seca de la preparaci6n.
Administraci6n
Los polinucle6tidos antisentido (que incluyen ODNs) del invento (tipicamente en la forma de la formulaci6n tratada aqui) puede ser asi administrada a una persona o a un animal en necesidad del tratamiento, tal como una persona o animal con cualquiera de las enfermedades o estados mencionados aqui. El estado de la persona o animal puede ser asi mejorado. El polinucle6tido y la formulaci6n pueden ser asi usados en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. Se pueden usar en la fabricaci6n de un medicamento para tratar cualquiera de los estados aqui mencionados.
Los polinucle6tidos antisentido pueden ser administrados tipicamente (en el lugar a ser tratado). Preferiblemente, los polinucle6tidos antisentido se combinan con un excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptables para producir una composici6n farmaceutica. Los excipientes y diluyentes adecuados incluyen disoluciones salinas isot6nicas, por ejemplo tamp6n fosfato salino. La composici6n puede ser formulada para administraci6n parenteral, intramuscular, intracerebral, intravenosa, subcutanea o transdermica.
La dosis en la que el polinucle6tido antisentido es administrado al paciente dependera de una variedad de factores tales como la edad, peso y estado general del paciente, la condici6n que esta siendo tratada, y el polinucle6tido antisentido particular que esta siendo administrado. Una dosis adecuada puede sin embargo ser desde 0,1 a 100 mg/kg del peso corporal tal como de 1 a 40 mg/kg del peso corporal.
La ingesta de acidos nucleicos por las celulas de mamiferos es potenciada mediante varias tecnicas de transfecci6n conocidas, por ejemplo aquellas que incluyen el uso de agentes de transfecci6n. La formulaci6n que es administrada puede contener tales agentes. Ejemplo de estos agentes incluye agentes cati6nicos (por ejemplo fosfato calcico y DEAE-dextrano) y lipofectantes (por ejemplo lipofectamT y transfectamT).
Las rutas de administraci6n y dosificaciones descritas anteriormente pretenden ser s6lo una guia, ya que un medico con experiencia sera capaz de determinar facilmente la ruta 6ptima de administraci6n y dosificaci6n para cualquier paciente y condici6n particular.
Hom6logos
La homologia y los hom6logos se tratan aqui (por ejemplo, los polinucle6tidos pueden ser hom6logos de secuencia en el mARN de conexina). Tales polinucle6tidos tienen tipicamente al menos 70% de homologia, preferiblemente al menos 80, 90%, 95%, 97% 6 99% de homologia con la secuencia relevante, por ejemplo a lo largo de una regi6n de al menos 15, 20, 40, 100 nucle6tidos contiguos mas (de la secuencia hom6loga).
La homologia puede ser calculada basandose en cualquier metodo de la tecnica. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede ser usado para calcular la homologia (por ejemplo, usado en sus ajustes por defecto) (Devereux y ofros (1984) Nuc!eic Acids Research 12, p387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden ser usados para calcular la homologia, o alinear las secuencias (tipicamente en sus ajustes por defecto), por ejemplo como se describe en Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S, F y ofros (1990) J Mol Biol 215: 403-10.
El software para realizar los analisis BLAST esta disponible publicamente a traves del Centro Nacional de Informaci6n de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih,gov/)
Este algoritmo implica el primer par de identificaci6n de secuencia de puntuaci6n alta (HSPs) que identifica palabras cortas de longitud W en la secuencia buscada, que bien coincide o satisface algunos umbrales de puntuaci6n T valorados de modo positivo cuando se alinean con una palabra dela misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuaci6n de la palabra vecina (Altschul y ofros, supra). Estas palabras iniciales vecinas actuan como semillas para iniciar busquedas para encontrar HSPs que las contienen. Los fragmentos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que la puntuaci6n de alineaci6n acumulada se pueda aumentar. Las extensiones para los fragmentos de palabras en cada direcci6n se detienen cuando: la puntuaci6n de la alineaci6n acumulada cae por debajo de la cantidad X de su maximo valor conseguido; la puntuaci6n acumulada va a cero o por debajo, debido a la acumulaci6n de uno o mas alineamientos de residuos con puntuaci6n negativa; o cuando se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuaci6n BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Naf!. Acad. Sci, USA 89: 10915-10919) alineamiento (B) de 50, expectaci6n (E) de 10, M=5, N=4, y una comparaci6n de ambas hebras.
El algoritmo BLAST realiza un analisis estadistico de la similitud entre dos secuencias; vease por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Naf!. Acad. Sci, USA 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma (P(N)) mas pequena, que proporciona una indicaci6n de la probabilidad por la cual tendra lugar por casualidad una uni6n entre dos nucle6tidos o secuencias de aminoacidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma mas pequena en comparaci6n con la primera secuencia a la segunda secuencia es menor de alrededor de 1, preferiblemente menor que alrededor de 0,1, mas preferiblemente menor que alrededor de 0,01 y mas preferiblemente menor que alrededor de 0,001.
La secuencia hom6loga difiere tipicamente de la secuencia relevante por al menos (o por no mas de) 2, 5, 10, 15, 20 mas mutaciones (que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones). Estas mutaciones pueden ser medidas a traves de cualquiera de las regiones anteriormente mencionadas en relaci6n a calcular la homologia.
La secuencia hom6loga tipicamente hibrida de modo selectivo con la secuencia original a un nivel significativamente por encima del fondo. La hibridaci6n selectiva se logra tipicamente usando condiciones de media a alta rigurosidad (por ejemplo cloruro s6dico 0,03 M y citrato s6dico 0,03 M desde alrededor de 50°C a alrededor de 60°C). Sin embargo, tal hibridaci6n puede ser llevada a cabo bajo cualquier condici6n adecuada conocida en la tecnica (vease Sambrook y ofros (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Por ejemplo, si se requiere una alta rigurosidad, las condiciones adecuadas incluyen SSC 0,2x a 60°C.
Diversos aspectos del invento seran ahora descritos con referencia a la secci6n experimental siguiente que se comprendera que se proporciona a medio de ilustraci6n y no para constituir una limitaci6n en el alcance del invento.
EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1
MATERIALES Y METODOS
Aplicaci6n antisentido
Se us6 gel F-127 Plur6nico al 30% (BASF Corp) en tamp6n fosfato salino (agua de pureza molecular) para liberar ODNs antisentido especificos para conexina a1 sin modificar (conexina 43) al embri6n de pollo en desarrollo (Simons, y otros, 1992). Los embriones de pollo fueron incubados a 38°C y los estadios determinados segun los estadios de Hamilton y Hamburger. A los huevos se les hicieron ventanas y las membranas vitelina y amni6tica sobre el area a ser tratada fueron abiertas usando finos forceps. Despues de la aplicaci6n del antisentido, los huevos fueron sellados con cinta y recolocados en el incubador durante 48 horas, tiempo al cual la mayoria de los experimentos fueron analizados, siendo la excepci6n el analisis a distintos tiempos de la "eliminaci6n de la expresi6n" de la conexina y su recuperaci6n.
El gel Plur6nico es liquido a bajas temperaturas, 0-4°C, pero se asienta cuando se anade por goteo sobre el embri6n a temperatura fisiol6gica, permaneciendo en el sitio durante al menos 12 horas. El gel tiene la ventaja adicional de ser un tensioactivo suave y este, usado bien solo o junto con DMSO, parece acelerar notablemente la penetraci6n de ODN en las celulas (Wagner, 1994). La adici6n de una etiqueta FITC al ODN DB1, vista usando microscopia confocal de escaneado con laser , demostr6 la penetraci6n intracelular de las sondas. Las secuencias de desoxioligonucle6tidos usados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1:El efecto sobre el desarrollo de extremidades de la aplicaci6n de ODN entre los estadios 8 y 14 del desarrollo del embri6n de pollo.
Oligodesoxinucle6tidos antisentido para la conexina 43
DB1 GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC
CG1 GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT
Oligodesoxinucle6tidos testigo
DB1 (homosentido) GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC
DB1 (pollo) GTA GTT ACG ACA GGA GGA ATT GTT CTC GTC
CV3 (al azar) TCG AAC TGT CAA GAC TGC TAT GGC GAT CAT
S6lo el gel
Todos los ODNs fueron aplicados a una concentraci6n final de 0,5-1,0 mM seguido de un analisis dependiente de dosis durante experimentos preliminares que cubrian un intervalo de concentraciones desde 0,05 mM a 50 mM. Los efectos de toxicidad general s6lo fueron evidentes con concentraciones de ODN superiores a 10 mM. Las mezclas de gel ODN fueron preparadas a partir de disoluciones patr6n concentradas almacenadas a -80°C.
Secuencias antisentido
DB1 es una secuencia de rat6n antisentido, complementaria a las bases 1094-1123 del gen de la conexina a1. Tiene cuatro errores de apareamiento con la secuencia de pollo de la conexina a1. CG es complementaria a las bases 720-749 de la conexina a1 de pollo. La eficacia de esta sonda fue mejorada con Dimetilsulf6xido (DMSO) al 1% anadido al gel. El DMSO no tuvo ningun efecto anadido sobre ningun otro resultado con ODN antisentido o testigo.
Secuencias testigo
DB1 (pollo) es el equivalente de la conexina a1 de pollo del DB1 que empareja con las bases 954-983 de la conexina a1 de pollo. El analisis indica, sin embargo, una alta probabilidad de formar estructuras de bucle de tallo (G= -7.0 kcal/mol, Tm del bucle= 92°) y homodimerizaci6n (Tm = 1,5°) y por lo tanto actua como una secuencia testigo. Se ha demostrado que algunos oligonucle6tidos homosentido pueden formar tripletes de ADN estables (Neckers y otros, 1993) que inhiben la transcripci6n. Sin embargo, esto no fue evidente con el DB1 (homosentido). Una secuencia testigo al azar sin estructura secundaria estable (G= 1,4 kcal/mol) y homodimerizaci6n inestable fue tambien usada, llamada CV3. Un testigo adicional aplicando una mezcla de DB1 y DB1 (homosentido) de igual concentraci6n dio niveles de fondo de los defectos.
Monitorizando la eliminaci6n de los niveles de proteina.
La localizaci6n inmunohistoquimica de una proteina de uni6n intercelular conexina 1 en el punto de contacto celulacelula proporciona una medida directa del efecto antisentido. Se usaron sondas de anticuerpos especificos anti peptido de la conexina 1 para tenir embriones totales y se analiz6 la distribuci6n de la conexina usando microscopia de barrido con laser confocal segun los procedimientos establecidos (Green y otros, 1995). El marcaje de los testigos para otras dos conexinas expresadas en el embri6n de pollo en desarrollo (conexinas b1 y b2) fue llevada a cabo de igual modo, usando tambien anticuerpos especificos de secuencia (Becker y otros., 1995).
RESULTADOS
Reducci6n de la expresi6n de conexina a1
Usando gel F-127 Plur6nico para liberar ODNs antisentido especificos para conexina a1 no modificados al embri6n de pollo en desarrollo, la expresi6n de la proteina puede ser interferida a puntos de tiempos elegidos y permitir que el tratamiento antisentido sea dirigido a regiones especificas de un embri6n de pollo. Una gota de gel que contiene el antisentido a una concentraci6n relativamente baja fue colocada de forma precisa en embriones individuales. El gel se asienta y permanece en su sitio durante al menos 12 horas y asi se mantiene una dosis baja sostenida de antisentido en esta regi6n. Las aplicaciones antisentido fueron dirigidas y puestas a un tiempo para bloquear la formaci6n de la uni6n previamente a los periodos de expresi6n elevada en las extremidades, el tubo neural y la cara. Estos tiempos fueron elegidos para optimizar los efectos del antisentido reduciendo la expresi6n de nuevas proteinas mas que dependiendo de la renovaci6n de la proteina ya en las membranas de las celulas del tejido diana. Ambos ODNs de DB1 y CG1 redujeron la expresi6n de la proteina conexina a1 dentro de dos horas en el tubo neural y la protuberancia de la extremidad, dramaticamente dentro de 4-8 horas y persisti6 a 18-24 horas y 48 horas en algunos tejidos (datos no mostrados). No fue evidente la disminuci6n de los niveles de la proteina conexina a1 en ninguno de los testigos usados. Igualmente, dos otros miembros de la familia de conexina expresada en el embri6n de pollo, conexina b1 y conexina b2, no fueron afectados por el ODN antisentido especifico de la conexina a1.
Se corrieron varios testigos paralelos con todos los de los experimentos. Estos incluian; DB1 homosentido, DB1 antisentido y DB1 homosentido combinados, DB1 de pollo (que forma estructuras de bucle en tallo consigo mismo), ODNs al azar CV3, gel Plur6nico solo, gel Plur6nico con DMSO y PBS solo). Ninguno de los testigos tuvo un efecto notable sobre la expresi6n de proteina de conexina a1.
EXPERIMENTO 2
INTRODUCCION
Los astrocitos constituyen el tipo celular mas abundante en el cerebro de mamifero. Estan ampliamente acoplados entre si y a las neuronas a traves de uniones intercelulares compuestas predominantemente de conexina 43 (Giaume y McCarthy (1996)). Tras la isquemia inducida o dano cerebral fisico estos canales permanecen abiertos y una onda expansiva de depresi6n (iniciada por potasio intersticial y senales de glutamato y apopt6ticas aumentadas) es propagada (Cotrina y otros, (1998); Lin y otros (1998). Ondas de aumento de calcio citos6lico y moleculas segundos mensajeros tales como IP3 se extienden lentamente via los canales de uni6n intercelular a las neuronas mas alla del nucleo de la regi6n danada, dando como resultado una extensi6n de la lesi6n en las 24-48 horas siguientes al dano. De esta manera, las celulas vecinas no danadas son destruidas (Lin y otros, 1998), el asi llamado efecto colateral.
Este experimento investiga la capacidad de las formulaciones del invento para impedir los efectos colaterales.
MATERIALES
Los oligodesoxinucle6tidos fueron preparados con las siguientes secuencias:
GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (conexina 43)
TTG TGA TTT ATT TAG TTC GTC TGA TTT C (testigo al azar)
METODOS
Oligodesoxinucle6tidos (ODNs)
Los ODNs no modificados fueron liberados en gel F-127 Plur6nico (BASF) en tamp6n fosfato salino (PBS). El gel Plur6nico es liquido a bajas temperaturas (0-4°C) y se asienta a temperaturas fisiol6gicas, y tambien es un tensioactivo suave. Los ODNs tienen normalmente una vida media de aproximadamente 20 min en las celulas (Wagner, 1994) pero el metodo de carga del gel Plur6nico proporciona un fuente de difusi6n continua, actuando el gel como un reservorio Becker y otros, (1999)). Se aplicaron los ODNs especificos para la conexina 43, o los ODNs testigo al azar de composici6n de bases similar, a una concentraci6n final de 2 mM. Se llevaron a cabo tambien testigos de s6lo gel. Los ODNs fueron de 30 mer analizados para mostrar que no tuvieran lugar bucles en horquilla u homodimerizaci6n.
Formaci6n de la lesi6n
Las lesiones cerebrales fueron llevadas a cabo en ratas Wistar macho de 250-300 g. Los animales fueron anestesiados con halotano 1-2% en oxigeno y la cabeza mantenida en una pinza estereotaxica. La regi6n alrededor del sitio de la lesi6n fue afeitada y la piel sobre el craneo cortada en un plano sagital con un escalpelo y tirada hacia
atras para dejar las placas del craneo limpias. Un agujero de diametro 0,5 mm fue perforado a traves de la placa del craneo 3 mm hacia la derecha del bregma usando un grabador Arlet y se hizo una lesi6n en el c6rtex del cerebro usando una aguja de jeringa de calibre 19G 1 � unida a la plataforma micrometrica. La plataforma permiti6 un control direccional preciso y una penetraci6n de 2 mm de profundidad precisa que mantuvo la lesi6n dentro del c6rtex y muy por encima del cuerpo calloso.
Con el animal preparado, se aspiraron 10 ml de gel F-127 Plur6nico (BASF) enfriado en hielo que contenia ODN especifico para conexina 43 (o un ODN testigo) en una aguja de jeringa de calibre 19G 1 � preenfriada recortada a modo que tuviera una punta plana. La aguja de la jeringa fue unida a una pipeta volumetrica via una punta de pipeta amarilla cortada en la parte inferior. El gel se asent6 entonces en la aguja segun se calent6 a temperatura ambiente. La aguja con el tap6n de gel en su punta fue transferida a una jeringa de 1 ml que contenia PBS y se coloc6 una funda sobre el eje de la aguja de modo que la punta de la aguja pudiera bajar a la lesi6n con la funda (subiendo contra el craneo) impidiendo la sobrepenetraci6n. Una presi6n suave sobre el embolo "hizo saltar" el tap6n de gel fuera de la aguja dentro de la lesi6n. La herida fue despues tratada con per6xido de hidr6geno para parar el sangrado y la piel fue suturada de vuelta en su sitio. Los animales fueron cuidadosamente monitorizados y dejados hasta que estuvieron listos para el sacrificio 24 horas, 48 horas 6 12 dias mas tarde.
Corte de secciones congelados
Los animales fueron sacrificados usando Nembutal (pentobarbitona s6dica, Virbac) y decapitados. Los cerebros fueron retirados intactos y congelados inmediatamente en hielo seco y almacenados a -80°C hasta que estuvieron listos para hacer los cortes de secciones. Las criosecciones seriadas (secciones de 30 mm) fueron tomadas desde la frente a la parte posterior (plano coronario), las secciones secas montadas sobre placas tratadas con cromo y aluminio, y almacenadas para histoquimica o inmunohistoquimica a -80°C. La primera y la ultima secci6n de cada lesi6n fueron grabadas a modo que las secciones del punto medio de la lesi6n estuvieran claramente identificadas.
Histoquimica
Para las tinciones con hematoxilina y eoxina las secciones fueron hidratadas a traves de series decrecientes de alcoholes (absoluto, 2 x 95%, 1 x 70% y agua) y tenidas en hematoxilina de Gill durante 4 minutos. Las secciones fueron despues lavadas en agua, sumergidas en agua de Scott y vueltas a lavar en agua. Fueron despues tenidas durante 30 segundos en eoxina en tamp6n de Moore. Las secciones fueron lavadas una vez mas en agua antes de la deshidrataci6n a traves de una serie de alcoholes (2 x 95%, 1 x absoluto), 50:50 alcohol: xilol y sumergidas en xileno. Las secciones fueron despues montadas usando medio de montaje Histomount�.
Para la tinci6n Nissl, las secciones fueron deshidratadas en una serie gradual creciente de alcoholes (75%, 95%, 3 x 100%), cinco minutos en cada, y las grasas eliminadas en xileno durante cinco minutos. Las secciones fueron despues rehidratadas disminuyendo a traves de la misma serie de alcoholes y lavadas en agua. Las secciones fueron despues colocadas en un disoluci6n de tinci6n Nissl (5 ml de una disoluci6n patr6n acuosa de violeta de Cresilo al 2%, 90 ml de acido acetico glacial en una disoluci6n acuosa, 10 ml de una disoluci6n de acetato s6dico 1,35%) durante 10 minutos. Las secciones fueron despues deshidratadas rapidamente en una serie de alcoholes creciente durante 5 minutos a 75%, despues 2 minutos cada una a 95% y 3 x 100%, tres cambios de xileno durante 10 minutos cada uno. Fueron despues cubiertas con medio de montaje Histomount�.
Inmunohistoquimica
Se dej6 que las secciones congeladas volvieran primero a temperataura ambiente en PBS. Despues fueron permeabilizadas en metanol durante dos minutos, lavadas en PBS y transferidas a una disoluci6n de lisina 0,1 M y Trit6n-X 100 al 0,1% en PBS para bloquear durante 30 min. Le siguieron dos lavados en PBS, de dos minutos cada uno. Se elimin6 el PBS y se aplicaron 50 ml por secci6n de anticuerpo primario.
La inmunohistoquimica fue llevada a cabo con anticuerpos primarios contra conexina 43, nucleos neuronales (proteina nuclear NeuN especifica de vertebrados) y GFAP (proteina acidica fibrilar glial). Los siguientes anticuerpos fueron usados:
Anticuerpo de conejo anti-Cx 43 (Gourdie y otros, (1991)) a una concentraci6n de 1:300.
Anticuerpo de rat6n anti-Cx 43 (Chemicon Internacional, Inc.) a una concentraci6n de 1:100.
Anticuerpo de conejo anti-rata GFAP (DAKO, �0334), a una concentraci6n de 1:1000.
Anticuerpo de rat6n anti-nucleos neuronales (Chemicon Internacional, Inc.) a una concentraci6n de 1:1000.
Para el marcaje de conexina y GFAP las secciones fueron incubadas durante toda la noche a 4°C. Fueron despues lavadas tres veces durante 15 minutos en PBS en un agitador orbital. A continuaci6n, el exceso de PBS fue eliminado y se aplicaron 50 ml por secci6n de Alexa� 488 anti-conejo IgG (Molecular Probes, Oreg6n, USA) a una concentraci6n de 1:200. Para monoclonales y dobles marcajes, se us6 un anticuerpo CY3 anti-rat6n (Chemicon,
132C). Las secciones fueron incubadas en la oscuridad durante dos horas a temperatura ambiente seguida por tres lavados de 15 minutos en PBS. Para el montaje el exceso de PBS fue eliminado de las placas portaobjetos y una o dos gotas de medio antidecoloraci6n Citifluor (disoluci6n de glicerol/PBS) fueron aplicadas. Un cubreobjetos fue colocado sobre las secciones y sellado con esmalte de unas. Para el marcaje de N-Neuronales el anticuerpo secundario fue un anticuerpo de cabra anti-rat6n biotinilado seguido por una HRP unida a avidina y una reacci6n DAB (Kit Sigma ExtrAvidin o DAKO �uickstain).
Captura de imagenes y Analisis
El marcaje inmunofluorescente fue llevado a cabo usando un microscopio de barrido confocal laser Leica TCS 4D. Las imagenes doblemente marcadas fueron combinadas subsiguientemente usando la funci6n Leica combinada o en Adobe Photoshop. Las muestras tenidas con hematoxilina y eoxina, y Nissl fueron capturadas usando una camara digital 3008 Kontron Progress (�eis) y las areas lesionadas analizadas usando MetaMorph (Universal Imaging Corp). Las areas lesionadas fueron analizadas por la secci6n media de cada lesi6n.
RESULTADOS
La bien documentada extensi6n de las lesiones cerebrales en las primeras 24-48 horas despues del trauma tuvo lugar en los experimentos testigos con gel y en todas las lesiones, tratadas por los autores con testigos y con antisentido, y tendieron a extenderse hace el extremo exterior donde el gel es menos probable que se asiente tras la carga. Sin embargo, las lesiones testigo se extendieron hacia abajo en el cuerpo callosos y hacia los lados a partir de los extremos desiguales, en extensi6n (Figuras 1 y 2). El examen de los tejidos marcados con anticuerpo anti N-Neuronal revel6 muerte neuronal que tuvo lugar desde muy atras desde el extremo de la lesi6n, con areas de tinci6n de Nissl y que no quedaron neuronas viables. Esta extensi6n tuvo lugar predominantemente dentro de 24 horas (Figuras 1 y 2), continuando hasta 48 horas despues de la lesi6n. Esto es especialmente evidente en la Figura 2 en la que la muerte neuronal es evidente dentro de 24 horas desde muy atras desde el extremo de la lesi6n hasta tejidos que de otro modo parecen normales, y la lesi6n se ha extendido hasta abajo en el cuerpo calloso. Por el contrario, las lesiones mejor tratadas con antisentido para conexina 43 permanecen confinadas hacia el sitio original de la lesi6n y tienen niveles basales claramente definidos (Figuras 3 y 4). El marcaje de N-Neuronal colocaliza con tejidos tenidos con Nissl y ninguna de las lesiones tratadas con antisentido de conexina 43 se extendi6 hasta el cuerpo calloso. El marcaje N-Neuronal muestra una supervivencia neuronal hasta arriba del extremo de la lesi6n del tracto de la aguja original. Las neuronas supervivientes alrededor de estas lesiones definen frecuentemente limites agudos marcando el extremo del tracto de la aguja (Figuras 3 y 5). Mas tejidos permanecen viables dentro de la misma lesi6n despues del tratamiento antisentido; en lesiones testigo, la muerte celular lleva a una perdida de tejidos dentro del area lesionada (comparese la lesi6n testigo en la Figura 2 a 24 horas con las lesiones tratadas con antisentido en las Figuras 3 y 4 a 48 horas).
Mientras que el marcaje de anticuerpo de la proteina acidica fibrilar glial (GFAP) muestra alguna activaci6n aumentada de astrocitos en los extremos de las lesiones, los niveles de proteina conexina 43 estan claramente reducidos en muchos sitios a lo largo del extremo de las lesiones tratadas con antisentido, particularmente los extremos basales y medios (Figura 6) comparado con testigos (Figura 7). En algunas areas el unico marcaje de conexina 43 que permanece 24 horas despues del tratamiento con antisentido especifico de conexina 43 es en las paredes de los vasos sanguineos pese a los niveles aumentados de GFAP (Figura 6). En general, el marcaje de conexina 43 alrededor de la lesi6n tratada con antisentido colocaliza en mucha menor medida con el marcaje de GFAP que en los testigos en los que mas de la mitad del marcaje de conexina 43 esta relacionada con los astrocitos. Los niveles de otras conexinas (conexinas 26 y 32) no parecen estar alterados por los tratamientos especificos de conexina 43.
36 animales fueron lesionados. El area transversal (corte central del volumen de la lesi6n en un plano coronario) fue analizada para 21 animales. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
�reas transversales de lesiones tratadas con oligodesoxinucle6tidos testigo y con oligonucle6tidos especificos para conexina 43, dejadas vacias, o tratadas s6lo con gel. Las medidas son para animales medidos despues de 24 horas, 48 horas y 12 dias. Dos grupos de figuras estan incluidos-medidas de la lesi6n entera, y medidas desde 1 mm por debajo de la superficie. En base al analisis del segundo grupo la lesi6n tratada DB1 mas grande (parentesis) esta excluida ya que cae fuera de las desviaciones estandar 3 a partir de la media para este grupo. N6tese que el cerebro de rata se cura (a diferencia de otras especies) y medidas de 12 dias de lesi6n no representan la extensi6n original de la extensi6n de la lesi6n.
DB1 esta tratada con anti conexina 43
HB3 esta con oligos al azar y parecen ser t6xicos
Lesi6n entera: (medidas en mm cuadrados)
24 horas
48 horas 12 dias
DB1
2,42; 3,16; 3,78; 5,57 3,7; 6,05; 2,91; 3,41; 4,53 2,79; 2,86
HB3
7,14 13,19
Gel/vacio
5,04; 4,48 3,96; 3,41; 3,56; 5,91 2,58; 3,3
Lesiones desde 1 mm hacia abajo: (esta es considerada una medida mas precisa ya que todas las lesiones tienden a extenderse hacia el borde externo indicando que el gel de tratamiento se ha asentado en el fondo de la lesi6n y/o el c6rtex externo ha sido danado cuando se ha perforado el craneo o al insertar la aguja de carga del gel).
24 horas
48 horas 12 dias
DB1
0,91; 1,13; 2,12; 2,41 (3,38); 0,99; 1,54; 1,44; 1,08 0,47; 1,2
HB3
5,9 5,6
Gel/vacio
3,2; 2,19 1,86; 1,5; 1,68; 2,17 1,07; 1,43
En el analisis final el area de la lesi6n desde una linea de 1 mm por debajo del extremo del c6rtex externo fue medida a modo de excluir la extensi6n de la lesi6n en el extremo exterior en el que los tratamientos antisentido tienen poco o ningun efecto (debido a que el gel se inyecta en y se asienta en el fondo de las lesiones). Un animal 5 tratado con con antisentido cae mas de tres desviaciones estandar fuera de la media para este grupo y ha sido excluido. El tamano de la lesi6n media para lesiones tratadas con antisentido a 24 y 48 horas fue de 1,45 mm2 (+/-0,55), para testigos 2,1 mm2 (+/-0,6). Las cuatro mas pequenas (de 8 lesiones tratadas con antisentido y 8 lesiones testigo a 24 y 48 horas) fueron todas tratadas con antisentido para conexinas, siendo la lesi6n testigo mas pequena 50% mas grande que estas cuatro. Estos datos se muestran tambien en forma grafica en la Figura 8. A 12 dias tiene
10 lugar la regeneraci6n en la rata (pero no en tejido cerebral humano) y los limites de la extensi6n de la lesi6n no estan claramente definidos.
DISCUSION
El metodo del tap6n de gel Plur6nico-ODN antisentido ha sido usado para estudiar el efecto de la eliminaci6n de la expresi6n de conexina 43 durante la astrocitosis que tiene lugar tras la lesi6n del c6rtex cerebral del cerebro de 15 mamiferos. En el cerebro, la liberaci6n de toxinas a partir de neuronas muriendo causa lo que se conoce por efecto colateral, con las toxinas extendiendose a celulas vecinas a traves de canales de uniones intercelulares (Lin y otros, (1998)). En condiciones neurodegenerativas, la lenta liberaci6n de toxinas aparentemente lleva a un aumento de los niveles de canales de conexina 43 en astrocitos para permitir el transporte y la eliminaci6n de las toxinas a la corriente sanguinea. Sin embargo, en casos de trauma grave, este aumento de los niveles ayuda a la extensi6n de
20 elevados niveles de toxina a neuronas vecinas, matandolas. El bloqueo del aumento de los niveles de conexina 43 y la eliminaci6n de la expresi6n de los canales de conexina 43 impide esta extensi6n que lleva a lesiones hasta un 50% mas pequenas en areas transversales. Esto tiene implicaciones significativas en el manejo de fallos isquemicos, tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, y modulaci6n de efectos secundarios a partir de intervenci6n quirurgica.
25 EXPERIMENTO 3
INTRODUCCION
El efecto colateral en tejidos neurales mediante el cual las neuronas danadas liberan toxinas que se extienden y matan celulas vecinas esta bien documentado. El experimento 2 muestra que este efecto puede ser reducido en el cerebro usando una aproximaci6n de liberaci6n sostenida de oligodesoxinucle6tidos antisentido para eliminar los
30 niveles de la proteina de uniones intercelulares conexina 43.
Otro tejido de composici6n similar al cerebro es la medula espinal en la que la poblaci6n neuronal esta apoyada por poblaciones de celulas gliales, incluyendo astrocitos que son responsables para el efecto neuroprotector eliminando el glutamato y el exceso de calcio a partir del entorno neural. Este experimento investiga la capacidad de las formulaciones del invento para reducir la extensi6n de las lesiones de medula espinal.
MATERIALES
Los oligodesoxinucle6tidos fueron preparados con las siguientes secuencias:
GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (conexina 43)
GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (testigo homosentido)
METODOS
Las ratas Wistar fueron anestesiadas y su medula espinal expuesta. Una lesi6n de una hemisecci6n estandar fue despues hecha en la medula y 5 ml de gel Plur6nico frio, que contenia bien ODNs antisentido o bien homosentido para la conexina 43 (5 mM) fueron colocados en la lesi6n. Las aplicaciones fueron hechas en ciego. La medula expuesta fue despues recuperada y la rata devuelta a su jaula. Algunos animales fueron sacrificados a 24 horas mientras que otros fueron mantenidos durante 12 dias y dos meses para determinar la extensi6n de la regeneraci6n neuronal y el tamano final de la lesi6n. Para estudios de regeneraci6n axonal las ratas fueron anestesiadas y sus axones cortados previamente a sus sitios de entrada en la medula espinal. Un precipitado de peroxidasa de rabano (HRP) fue colocada en el corte para marcar de modo retr6grado los axones a lo largo del periodo de 24 horas. Al dia siguiente las ratas fueron sacrificadas y sus medulas espinales retiradas y fijadas en paraformaldehido 2%. Las medulas fueron despues procesadas para cortes transversales y las secciones de series longitudinales de 8 mm fueron tomadas a traves de las medulas. Las secciones fueron despues inmunotenidas tanto para las conexinas como para el GFAP solo con yoduro de propidio como marcador nuclear, o procesadas para revelar el HRP.
RESULTADOS
A 24 horas posterior a la lesi6n hubo una notable diferencia entre las lesiones de medulas espinales tratadas con conexina 43 homosentido y ODNs antisentido. Las lesiones homosentido no parecieron diferentes de los testigos sin tratar mientras que las lesiones tratadas con antisentido parecieron mas pequenas y menos inflamadas (Figura 9).
A dia 12 los axones marcados con HRP podian ser visto tanto en las medulas tratadas con homosentido como en las tratadas con antisentido pero en ningun caso atraves6 la lesi6n ningun numero significativo de axones regenerantes. Sin embargo, hubo una notable diferencia en el tamano de la lesi6n pareciendo la lesi6n antisentido significativamente mas pequena que las lesiones homosentido o sin tratar.
Dos meses tras la lesi6n de las medulas espinales el marcaje con HRP de axones en regeneraci6n revel6 que no consiguieron atravesar el sitio de la lesi6n en los tratamientos tanto homosentido como antisentido. El tamano de la lesi6n fue significativamente mas pequeno en las medulas tratadas con antisentido indicando una reducci6n significativa en muerte celular neuronal secundaria.
DISCUSION
Usando las formulaciones del invento, la eliminaci6n de los niveles de conexina 43 por los oligodesoxinucle6tidos antisentido redujo significativa-mente le extensi6n de la lesi6n que tiene lugar en las primeras 24-48 horas tras el dano de la medula espinal. La eliminaci6n de los niveles de conexina 43 tambien reduce la inflamaci6n, ayudando ademas en el efecto neuroprotector, pero no hubo cambio en la capacidad para las neuronas de crecer de nuevo a traves del sitio de la lesi6n. Asi, el tratamiento antisentido con oligodesoxinucle6tidos especificos para conexina 43 no puede ayudar al crecimiento de neuronas danadas, pero tiene un efecto nueuroprotector significativo reduciendo la extensi6n del insulto.
EXPERIMENTO 4
INTRODUCCION
Para reparar heridas cutaneas se activan un numero de tipos celulares, tales como fibroblastos, celulas endoteliales y queratinocitos, para proliferar, migrar y colocar matriz extracelular para rellenar la herida.
La comunicaci6n y la senalizaci6n intercelular es una caracteristica clave del proceso de cicatrizaci6n de heridas. Los mecanismos de senalizaci6n extracelular se cree que son las piezas clave aunque es tambien probable que la senalizaci6n intercelular a traves de las redes extensivas de los canales de uniones intercelulares en las capas dermicas pueda tener tambien un papel. Las ondas de calcio que se propagan desde las celulas heridas a traves de la epidermis pueden senalizar su dano. En una cicatrizaci6n de heridas normal los niveles de conexinas comienzan a caer dentro de 6 horas y les lleva 6 dias para recuperarse. Los papeles que estos cambios juegan no se
comprenden pero una teoria es que las celulas se liberan de sus vecinas para dividirse rapidamente, y despues las uniones reforman la migraci6n coordinada en y sobre el sitio de la herida.
Este experimento investiga la capacidad de las formulaciones del invento para afectar la cicatrizaci6n de heridas.
MATERIALES
Los oligodesoxinucle6tidos fueron preparados con las siguientes secuencias:
GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (conexina 43)
GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (testigo homosentido)
METODOS
Los ratones neonatales, de la cepa CD1, fueron anestesiados con un anestesico local mediante pulverizaci6n. Una herida con una incisi6n limpia, de 2 mm de largo, fue luego hecha a lo largo de la longitud de ambas patas delanteras con un cuchillo de iridectomia. Haciendo las heridas bajo un microscopio de disecci6n se pueden hacer muy reproducibles en tamano. Estas cicatrizan generalmente en 3-6 dias. El polvo de carb6n fue rociado en las heridas para marcarlas para una identificaci6n subsiguiente del sitio de la herida a tiempo mas tardios-esto no afecta la cicatrizaci6n de ninguna manera. 5 ml de gel Plur6nico enfriado, que contenia ODNs bien homosentido o bien antisentido fueron despues aplicados a las heridas. El gel Plur6nico es liquido entre 0-4 °C pero se asienta a temperaturas mas altas. Una vez que se aplica a las heridas el gel se asienta en su sitio y actua como un reservorio de liberaci6n lenta para los ODNs asi como un tensioactivo suave, ayudando a la penetraci6n de los ODNs en el tejido. La aplicaci6n de los ODNs homosentido fue hecha sobre una pata y el antisentido en la otra, alternando izquierda y derecha entre las distintas camadas. Los ratones neonatales fueron calentados bajo una lampara y despues devueltos a sus madres. Las heridas fueron examinadas a diario y registradas en lo que respecta a la calidad de la cicatrizaci6n. Los ratones representativos fueron seleccionados a dia 1, dia 5 dia 8 posterior a la operaci6n y sus patas delanteras fotografiadas antes de que los ratones fueran anestesiados y perfundidos con paraformaldehido 2%. Las patas delanteras fueron retiradas y sumergidas-fijadas en paraformaldehido 2% durante toda la noche y despues procesadas para histiologia de resina (1 dia) o cera (2 dias en adelante).
La inflamaci6n de la herida fue evaluada 24 horas tras la herida. Las secciones de resina a traves de la herida estan tenidas con azul de Toluidina para revelar celulas positivas para nissl, neutr6filos que son las primeras celulas en responder al dano. Estos pueden tambien ser revelados usando marcadores especificos de neutr6filos.
La muerte celular y la eliminaci6n es evaluada mediante marcaje tunel para determinar la velocidad de eliminaci6n de celulas apopt6ticas. La tinci6n de macr6fagos fue usada para mostrar el periodo de limpieza tras la muerte celular. Estas son llevadas a cabo 3-5 dias posteriores a la herida.
Angiogenesis
La granulaci6n es una caracteristica del tejido conectivo cicatrizante y es causada por la invasi6n de numerosos capilares. Se conoce que los macr6fagos expresan potentes factores angiogenicos tales como VEGF. El grado de vascularizaci6n esta monitorizado con anticuerpos para los receptores VEGF, anti-PCAM y anti-FLT-1 que son ambos buenos marcadores de vasos sanguineos. La contracci6n de este tejido es provocada por la diferenciaci6n de los fibroblastos de la herida en un miofibroblasto contractil. Despues de que han cicatrizado la herida mueren apopt6ticamente y son eliminados por los macr6fagos. Estas celulas pueden ser reveladas mediante anticuerpos especificos anti actina de musculo liso y su formaci6n y eliminaci6n puede ser seguida.
Hiperenervaci6n
Los nervios sensoriales son muy sensibles a las senales liberadas sobre la herida y muestran liberaci6n de senales transitorias en los sitios de las heridas en adultos. Sin embargo, en heridas neonatales esta liberaci6n de senales es mas abundante y da como resultado una hiperenervaci6n permanente. Mientras que no esta claro lo que son estas senales es probable que se liberen a partir de macr6fagos inflamatorios. La hiperenervaci6n es maxima a 7 d posteriores a la herida y la distribuci6n nerviosa puede revelarse usando anticuerpos PGP 9,5 contra neurofilamentos.
La formaci6n de la cicatriz es evaluada normalmente semanas o meses despues del cierre de la herida. Sin embargo, una evaluaci6n razonable puede ser hecha 12 dias despues de la herida. Las secciones a traves de las heridas son tenidas con la tinci6n de colageno Rojo de Picrosirus y examinadas por un microscopio de confocal para determinar la densidad del colageno y la orientaci6n en el sitio de la herida.
RESULTADOS
Dia 1 24 horas despues de la herida notables diferencias fueron evidentes entre las extremidades tratadas con el homosentido y el antisentido. Las heridas tratadas con el homosentido no parecieron diferentes de las heridas sin tratar con un espectro normal de grados y velocidades de cicatrizaci6n (Figura 10). Las extremidades tratadas con antisentido fueron notablemente diferentes de los testigos, pareciendo estar menos inflamadas y la velocidad de cicatrizaci6n fue generalmente mas rapida.
Las secciones de resina de las extremidades representativas tenidas con una tinci6n de nissl revelaron significativamente menos celulas neutr6filas indicando un tejido menos inflamado (Figura 11).
Dia 5
Tras estos dias se habian comenzado a caer las costras de las heridas. En esta etapa la mayoria de las heridas tratadas con los antisentido parecieron ser mas pequenas que las tratadas con homosentido con costras mas pequenas o cicatrizaci6n menos prominente (Figura 12).
Dia 8
8 dias despues de la herida, en las extremidades habia crecido pelo. Las heridas tratadas con homosentido fueron aun visibles siendo demarcadas por una falta de pelo alrededor del sitio de la herida. Las heridas tratadas con los antisentidos fueron la mayoria invisibles, estando recubiertas por crecimiento de pelo normal. Esta diferencia en el crecimiento del pelo indica que una cicatrizaci6n reducida habia tenido lugar en las heridas tratadas con los antisentido (Figura 13).
CONCLUSIONES
La aplicaci6n de los ODNs antisentido de la conexina 43 a una herida tiene un notable efecto sobre el proceso de cicatrizaci6n. El primer efecto notable es una reducci6n en la inflamaci6n de las heridas que es notable en secciones que muestran un respuesta inflamatoria mucho menor en terminos de niveles de neutr6filos. Segun progresa la cicatrizaci6n, las heridas tratadas con antisentido cicatrizan mucho mas rapido y con menos formaci6n de costra que las lesiones testigo.
Esta reducci6n en la respuesta inflamatoria y la subsiguiente cicatrizaci6n mejorada es posible debido a la reducida comunicaci6n con los neutr6filos y a una aceleraci6n de los procesos de cicatrizaci6n natural. Los ODNs antisentido pueden reducir la expresi6n de conexina en 4-8 horas de modo que no tendran un efecto sobre la senalizaci6n inicial de la herida pero jugaran un papel en los eventos de senalizaci6n secundarios. Es interesante observar que los neutr6filos que invaden en respuesta a la herida expresan normalmente una gran cantidad de conexina 43. Es tambien posible que formen uniones intercelulares con otras celulas en la herida y que comuniquen con ellas. La reducci6n en esta forma de comunicaci6n puede dar como resultado una reducci6n de los factores secretados a partir de neutr6filos y puede reducir la muerte celular en la herida asi como la granulaci6n e hiperenervaci6n. Tambien se conoce que en condiciones normales los niveles de proteina conexina (conexinas 26, 31.1 y 43) estan reducidos tanto en las capas epiteliales como en las subdermicas de las heridas empezando en 6 horas, y permaneciendo disminuidas durante hasta 6 dias. La aproximaci6n antisentido puede acelerar esta reducci6n proteica inicial bloqueando los procesos traduccionales como ocurre con la eliminaci6n proteica de la membrana. Ciertamente, los efectos de la eliminaci6n de los niveles de conexina 43 inmediatamente tras la herida tiene un notable efecto en reducir los niveles inflamatorios y aumentar la velocidad de cicatrizaci6n.
EXPERIMENTO 5
INTRODUCCION
La inflamaci6n y muerte celular secundaria que sigue a una quemadura es una preocupaci6n principal. Las victimas de quemaduras graves por encima de un alto porcentaje de su cuerpo por lo general mueren uno o dos dias despues del trauma. Este experimento investiga la capacidad de las formulaciones del invento para afectar beneficiosamente el proceso de recuperaci6n de la quemadura.
MATERIALES
Los oligodesoxinucle6tidos fueron preparados con las siguientes secuencias:
GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (conexina 43)
GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (testigo homosentido)
METODOS Las quemaduras reproducibles son liberadas a la piel humedecida, y el gel Plur6nico que contiene ODNs antisentido inyectados subdermicamente a la quemadura. Una serie de quemaduras fueron hechas usando hierro de soldar hacia los lados izquierdo y derecho del craneo de seis ratones neonatos. Las quemaduras sobre un lado de la cabeza fueron tratadas con ODN especifico de conexina 43 en gel Plur6nico y aquellas en el otro lado con ODN
5 testigo homosentido en gel Plur6nico.
RESULTADOS
Tras 24 horas, las seis quemaduras tratadas con ODN de conexina 43 mostraron niveles mas bajos de inflamaci6n comparados con las quemaduras testigo. Estas diferencias fueron notables (datos no mostrados).
UTILIDAD
10 Asi, de acuerdo con el invento, hay formulaciones proporcionadas mediante las cuales la comunicaci6n celula-celula puede ser disminuida en una manera transitoria y especifica de sitio. Las formulaciones tienen por lo tanto, aplicaci6n en metodos de terapia y en tratamientos cosmeticos.
La liberaci6n del componente ODN de la formulaci6n durante un periodo extendido (24 horas o mas) es una ventaja particular a la hora de tratar dano neuronal. Esto es debido, en la mayoria de los casos de dano neuronal fisico
15 directo, a que la perdida de celulas neuronales se extiende mas alla del sitio de la lesi6n concreta a las celulas circundantes. Esta perdida de celulas neuronales secundaria tiene lugar durante 24 horas de la lesi6n original y esta mediada por la comunicaci6n de uniones intercelulares celula-celula. La disminuci6n de la expresi6n de proteina conexina bloquea por lo tanto o al menos disminuye los niveles de comunicaci6n entre las celulas y minimiza el dano de celulas neuronales secundario.
20 Igualmente, en ejemplos de otros danos en tejidos (particularmente heridas) las formulaciones del invento se ha encontrado que son eficaces tanto en promover el proceso de cicatrizaci6n de heridas, reduciendo la inflamaci6n y minimizando la formaci6n de costra. Las formulaciones tienen por lo tanto un claro beneficio en el tratamiento de las heridas, sea el resultado de un trauma externo (incluyendo quemaduras) o de intervenci6n quirurgica.
Se apreciara ademas que la descripci6n anterior se proporciona s6lo como un ejemplo y que se pueden hacer
25 modificaciones, tanto en terminos de los ODNs especificos y los excipientes o vehiculos farmaceuticamnte aceptables empleados sin salirse del alcance del presente invento.
Tabla 1
REFERENCES
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5
�220� �223� Descripci6n de la Secuencia Artificial: Oligonucle6tido
�400� 5 cgtccgagcc cagaaagatg aggtc
25
10
�210� 6 �211� 25 �212� DNA �213� Secuencia Artificial
15
�220� �223� Descripci6n de la Secuencia Artificial: Oligonucle6tido
20 25
�400� 6 tttcttttct atgtgctgtt ggtga �210� 7 �211� 30 �212� DNA �213� Secuencia Artificial �220� �223� Descripci6n de la Secuencia Artificial: Oligonucle6tido 25
30 35
�400� 7 gacagaaaca attcctcctg ccgcaattac �210� 8 �211� 30 �212� DNA �213� Secuencia Artificial �220� 30
�223� Descripci6n de la Secuencia Artificial: Oligonucle6tido
5 10
�400� 8 gtagttacga caggaggaat tgttctcgtc �210� 9 �211� 30 �212� DNA �213� Secuencia Artificial �220� �223� Descripci6n de la Secuencia Artificial: Oligonucle6tido 30
15
�400� 9 tcgaactgtc aagactgcta tggcgatcat 30
20
�210� 10 �211� 28 �212� DNA �213� Secuencia Artificial
�220� �223� Descripci6n de la Secuencia Artificial: Oligonucle6tido
25
�400� 10 ttgtgattta tttagttcgt ctgatttc 28
30
�210� 11 �211� 30 �212� DNA �213� Secuencia Artificial
35
�220� �223� Descripci6n de la Secuencia Artificial: Oligonucle6tido �400� 11
gacagaaaca attcctcctg ccgcaattac 30
�210� 12 �211� 1149 �212� DNA �213� Homo sapiens
�400� 12

Claims (51)

  1. REIVINDICACIONES
    1.Una formulaci6n para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante una terapia, cuya formulaci6n
    comprende: un polinucle6tido complementario de una conexina humana; junto con un soporte o un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
  2. 2.Una formulaci6n para uso en el tratamiento de una lesi6n tisular, cuya formulaci6n comprende:
    un polinucle6tido complementario de una conexina; junto con un soporte o un vehiculo farmaceuticamente aceptable. 3.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o 2, que se formula para administraci6n t6pica. 4.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 3, que esta en forma de una crema, una pomada, un
    gel, una emulsi6n, una loci6n o una pintura. 5.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 4, que esta en forma de un gel. 6.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 5, que esta en forma de un gel de copolimero no i6nico
    polioxietileno-polioxipropileno. 7.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 5, que esta en forma de un gel de Pluronic. 8.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 7, que comprende Pluronic F-127. 9.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 8, que comprende 30% de Pluronic F-127. 10.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o 2, en donde el polinucle6tido se formula para la
    administraci6n por via parenteral, intramuscular, intracerebral, subcutanea o transdermica.
  3. 11.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una formulaci6n de liberaci6n retardada. 12.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
    adicionalmente un agente auxiliar seleccionado entre caseina, gelatina, albumina, pegamento, alginato s6dico,
    carboximetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa o alcohol polivinilico. 13.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente uno o varios entre un agente tensioactivo, un emulsionante, un agente de carga, un vehiculo inerte y un agente de penetraci6n transdermica.
  4. 14.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que esta en forma de
    vendaje impregnado por lo menos con un polinucle6tido complementario de una conexina. 15.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucle6tido es ADN.
  5. 16.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el
    polinucle6tido es ARN. 17.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el polinucle6tido es un oligodesoxinucle6tido.
  6. 18.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 17, en donde el oligodesoxinucle6tido es un
    oligonucle6tido de fosfodiester no modificado. 19.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el polinucle6tido es un oligonucle6tido modificado quimicamente seleccionado entre fosforotioatos, metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos, fosforotioatos de oligorribonucle6tido y sus analogos 2'-Oalquilicos, metilfosfonatos de 2'-O-metilribonucle6tido y oligonucle6tidos con la cadena principal hibrida.
  7. 20.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el
    polinucle6tido tiene una longitud comprendida entre 6 y 40 nucle6tidos. 21.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucle6tido tiene una longitud comprendida entre 12 y 20 nucle6tidos.
  8. 22.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el polinucle6tido tiene una longitud de al menos 40 nucle6tidos.
  9. 23.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene polinucle6tidos complementarios de una conexina a.
  10. 24.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que contiene polinucle6tidos complementarios de una conexina .
  11. 25.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la conexina es conexina 26, conexina 31.1, conexina 32, conexina 36 o conexina 43.
  12. 26.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y 25, en donde la conexina es conexina 43.
  13. 27.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, 24 y 25, en donde la conexina es conexina 31.1.
  14. 28.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, 24 y 25, en donde la conexina es conexina 26.
  15. 29.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene polinucle6tidos complementarios de mas de una conexina.
  16. 30.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 29, que incluye polinucle6tidos complementarios de conexina 26, conexina 31.1, conexina 32, conexina 36, conexina 40, conexina 43 y/o conexina 45.
  17. 31.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, que contiene polinucle6tidos complementarios de una sola conexina.
  18. 32.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, en la que el polinucle6tido complementario de la conexina 43 se selecciona entre:
    el polinucle6tido complementario de la conexina 26 es:
    el polinucle6tido complementario de la conexina 31.1 es:
    o el polinucle6tido complementario de la conexina 32 es:
  19. 33.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 32, en donde el polinucle6tido complementario de la conexina 43 es GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC.
  20. 34.Una formulaci6n para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25, 26 y 29 a 31, en la que el polinucle6tido complementario presenta una homologia de al menos 70% con un polinucle6tido que tiene la siguiente secuencia:
  21. 35.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 34, en la que el polinucle6tido complementario tiene una homologia de al menos 90% con un polinucle6tido que tiene la siguiente secuencia:
  22. 36.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 35, en donde el polinucle6tido complementario tiene una homologia de al menos 95% con la siguiente secuencia:
  23. 37.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en donde el polinucle6tido complementario es bicatenario.
  24. 38.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en donde el polinucle6tido complementario es monocatenario.
  25. 39.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucle6tido complementario es capaz de unirse a un ARNm de conexina.
  26. 40.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 39, en donde el polinucle6tido complementario es capaz de unirse a un ARNm de la conexina 43.
  27. 41.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 39 o 40, en donde el polinucle6tido complementario tiene una complementariedad absoluta con el ARNm.
  28. 42.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 39 o 40, en donde el polinucle6tido complementario no tiene una complementariedad absoluta con el ARNm.
  29. 43.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, en donde el polinucle6tido complementario se puede unir a un ARNm de conexina (i) en 5' de la secuencia codificante, y/o (ii) en la secuencia codificante y/o (iii) en 3' de la secuencia codificante.
  30. 44.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, en donde el ARN comprende la SE� ID NO: 12.
  31. 45.Una formulaci6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se formula en una cantidad suficiente para disminuir la muerte celular en una herida en un tejido de mamifero, o inmediatamente adyacente a la misma.
  32. 46.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 45, en donde el tejido de mamifero se selecciona entre la piel, el tejido neural, el cerebro, la medula espinal, el tejido conjuntivo y los vasos sanguineos.
  33. 47.Una formulaci6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en un metodo para favorecer la cicatrizaci6n de heridas.
  34. 48.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 47, en donde la conexina es conexina 43, conexina
  35. 31.1 o conexina 26.
  36. 49.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 47 o 48, en donde la formulaci6n es una formulaci6n de liberaci6n retardada.
  37. 50.Una formulaci6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en el tratamiento de una herida, en donde la formulaci6n se aplica antes de restanar o cerrar una herida.
  38. 51.Una formulaci6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo de tratamiento de una herida producida por cirugia.
  39. 52.Una formulaci6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 51, en donde la formulaci6n se aplica antes de cerrar una herida quirurgica.
  40. 53.Una formulaci6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para favorecer el rejuvenecimiento o el engrosamiento de la piel con un fin terapeutico mediante la regulaci6n de la divisi6n y del crecimiento de las celulas basales epiteliales, en donde la conexina es la conexina 26 o la conexina 43.
  41. 54.Una formulaci6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para favorecer el rejuvenecimiento o el engrosamiento de la piel con un fin terapeutico mediante la regulaci6n de la queratinizaci6n de la capa externa, en donde la formulaci6n contiene un polinucle6tido complementario de la conexina 31.1.
  42. 55.Una formulaci6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para:
    (a)
    reducir la muerte de celulas neuronales que de otro modo seria el resultado de una lesi6n neuronal;
    (b)
    tratar un dano neuronal en el cerebro, la medula espinal o el nervio 6ptico, o lesiones cerebrales;
    (c)
    tratar lesiones de la medula espinal o un traumatismo de la medula espinal;
    (d)
    tratar trastornos neurodegenerativos;
    (e)
    favorecer la cicatrizaci6n de una herida que se ha originado por traumatismo, quemaduras o cirugia;
    (f)
    reducir la inflamaci6n;
    (g)
    tratar una apoplejia isquemica;
    (h)
    disminuir la formaci6n de cicatrices; o
    (i)
    rejuvenecer la piel con un fin terapeutico.
  43. 56.Una formulaci6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para el tratamiento de una apoplejia isquemica, en donde la formulaci6n comprende un polinucle6tido complementario de una proteina conexina 43.
  44. 57.Un producto para almacenar o suministrar una formulaci6n, que comprende un polinucle6tido complementario de una proteina conexina, comprendiendo dicho producto una jeringa y una aguja, en donde el producto contiene un polinucle6tido complementario de una proteina conexina y un gel de Pluronic F-127.
  45. 58.Un producto de acuerdo con la reivindicaci6n 57, en donde la proteina conexina es conexina 43.
  46. 59.El uso de una formulaci6n tal y como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, en la fabricaci6n de un medicamento para:
    (a)
    favorecer la cicatrizaci6n de una herida;
    (b)
    reducir la muerte de celulas neuronales que de otro modo seria el resultado de una lesi6n neuronal;
    (c)
    tratar un dano neuronal en el cerebro, la medula espinal o el nervio 6ptico, o lesiones cerebrales;
    (d)
    tratar lesiones de la medula espinal o un traumatismo de la medula espinal;
    (e)
    tratar trastornos neurodegenerativos;
    (f)
    reducir la inflamaci6n;
    (g)
    tratar una apoplejia isquemica;
    (h)
    disminuir la formaci6n de cicatrices; o
    (i)
    rejuvenecer la piel con un fin terapeutico.
  47. 60.Un uso de acuerdo con la reivindicaci6n 59, en donde la herida es el resultado de un traumatismo, quemaduras o cirugia. 61.Un polinucle6tido complementario de una conexina, en donde:
    (a)
    la conexina es la conexina 43 y el polinucle6tido se selecciona entre:
    (b)
    la conexina es la conexina 26 y el polinucle6tido es
    (c)
    la conexina es la conexina 31.1 y el polinucle6tido es
    (d)
    la conexina es la conexina 32 y el polinucle6tido es
  48. 62.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con la reivindicaci6n 61, que es ADN. 63.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con la reivindicaci6n 61, que es ARN.
  49. 64.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 63, que es un oligodesoxinucle6tido.
  50. 65.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 64, que es bicatenario.
    5 66.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 64, que es monocatenario.
  51. 67.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 66, que es un oligonucle6tido modificado quimicamente, seleccionado entre fosforotioatos, metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos, fosforotioatos de oligorribonucle6tido y sus analogos 2'-O-alquilicos,
    10 metilfosfonatos de 2'-O-metilribonucle6tido y oligonucle6tidos con la cadena principal hibrida.
    FIGURA�AA
    FIGURA�A�
    FIGURA�AC
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