BR112019012901A2

BR112019012901A2 - Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e uma molécula que se ligue ao cd3 humano e ao cd3 de macaco cinomolgo, composição farmacêutica, e, molécula

Info

Publication number: BR112019012901A2
Application number: BR112019012901-4A
Authority: BR
Inventors: Takahashi Tohru; Yoshimura Chigusa; Kozuma Shiho; Nakamura Kensuke; Suzuki Chikako; Ichikawa Junya
Original assignee: Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2020-01-07
Also published as: TW201829467A; IL267567B1; JPWO2018117237A1; RU2019122411A; US20230287119A1; RU2019122411A3; IL311136A; CO2019007823A2; JP7202185B2; EP3561057A1; JP2023027374A; KR20190121294A; EP3561057A4; WO2018117237A1; CN110431231A; MX2019007347A; SG10201912366YA; PH12019501387A1; CA3048174A1; US11618785B2

Abstract

a presente invenção provê: um novo anticorpo capaz de ligar-se ao cd3 humano; ou uma molécula que é capaz de ligar-se a um antígeno e contém o anticorpo. são providos: um novo anticorpo capaz de ligar-se ao cd3 humano; uma molécula que contém o anticorpo e é capaz de ligar-se a um antígeno; uma composição farmacêutica que contém o anticorpo ou a molécula como um ingrediente ativo e tem uma atividade citotóxica; e outros.

Description

ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO ANTICORPO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO ANTICORPO E UMA MOLÉCULA QUE SE LIGUE AO CD3 HUMANO E AO CD3 DE MACACO CINOMOLGO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MOLÉCULA [Campo Técnico] [001] A presente invenção refere-se a um novo anticorpo que se liga ao CD3 humano e se liga ao CD3 de macaco cinomolgo e às moléculas compreendendo o anticorpo.

[Fundamentos da Técnica] [002] 1) Anticorpos monoclonais anti-CD3, como com qualquer outro anticorpo monoclonal, funciona pelo reconhecimento preciso de suas moléculas alvo. Cada anticorpo anti-CD3 reconhece apenas um epítopo único na molécula de CD3 alvo. Entre os anticorpos monoclonais específicos para um complexo de CD3, OKT3 é o mais amplamente usado e melhor distinguido.

[003] 2) OKT3 é um anticorpo monoclonal humano anti-CD3 derivado de camundongo (Documento Não Patentário 1). Anticorpos monoclonais anti-CD3 foram administrados em um procedimento para prevenir órgãos transplantados de serem rejeitados. Os anticorpos ligam-se aos complexos de TCR nas células T humanas e suprimem a sua ativação e proliferação. Este tratamento foi usado durante um longo tempo de modo a prevenir a rejeição de homoenxerto de um órgão (Documentos Não Patente 2 a 4). OKT3 é o primeiro anticorpo anti-CD3 a ser usado em um tal procedimento. OKT3 tem um efeito imunossupressivo forte, ao passo que o seu uso clínico é dificultado devido às reações adversas severas associadas com a sua imunogenicidade e potencial mitogênico (Documentos Não Patente 5 a 8).

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2/152 [004] 3) OKT3 induz a ativação de célula T e produção de citocina in vitro e libera grandes quantidades de citocinas in vivo resultando na sindrome de citocina (Documento Não Patentário 5). Isto é porque OKT3 é uma molécula IgG bivalente e assim reticula células T e células que expressam receptor de Fcy, consequentemente causando ativação de célula T (Documento Não Patentário 8). Além disso, OKT3 é um anticorpo de camundongo e é, portanto, conhecido causar anticorpos heterofrlicos tais como Anticorpos Humanos Anti-Camundongo (HAMA) até a administração de longa duração (Documento Não Patentário 7). Relatos sobre a aplicação de tratamento com anticorpos anti-CD3 e suas reações adversas estão resumidos abaixo (Documento Patentário 1).

[005] 4) De modo a resolver estes problemas, OKT3 formatado em scFv (Documento Não Patentário 9) e OKT3 humanizado (Documento Não Patentário 10) foram criados. Um anticorpo biespecífico combinando uma cadeia única de OKT3 com uma cadeia única de um anticorpo contra um antígeno alvo expresso na superfície de uma célula cancerosa foi relatada em um outro exemplo de uma aplicação de OKT3 (Documento Patentário 2 e Documento Não Patentário 11).

[006] 5) Anticorpos multiespecíficos compreendendo os anticorpos anti-CD3 descritos na técnica anterior são esperados ter potencial terapêutico significante no tratamento de doenças malignas. Por exemplo, TROP2 é conhecido ser superexpresso em vários tipos de tumores epiteliais (Documentos Não Patente 12 a 16). Um anticorpo biespecífico expresso que geneticamente liga um anticorpo humano específico de TROP2 a um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-CD3 não foi ainda relatado.

[007] 6) OKT3 reage com CD3 de chimpanzé, mas não reage com

CD3 derivado de outros primatas tais como macacos cinomolgos (Documento Não Patentário 17). Igualmente, anticorpo monoclonal anti-CD3 UCHT-1

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3/152 também reage com CD3 derivado de chimpanzé, mas não reage com CD3 derivado de macaco cinomolgo (Documento Não Patentário 18). Por outro lado, alguns anticorpos monoclonais foram verificados que reconhecem antígenos de macaco cinomolgo, mas não reconhecem suas contrapartes humanas. Um exemplo desse grupo é FN-18, que é um anticorpo monoclonal direcionado para CD3 derivado de macaco cinomolgo (Documento Não Patentário 19).

[008] 7) A limitação de OKT3 e as series de anticorpos OKT3 modificados é a sua especificidade para CD3 humano. Esta limitação pode constituir uma barreira considerável para o desenvolvimento de fármacos terapêuticos para tratar doenças humanas. Isto é porque os fármacos candidatos para o desenvolvimento precisam ser submetidos aos testes préclínicos para a obtenção de aprovação para comercialização e é desejável conduzir tais testes pré-clínicos em animais, particularmente primatas superiores tais como macacos cinomolgos. Assim, no caso de fármacos candidatos contendo anticorpos anti-CD3, é muito desejável usar um anticorpo anti-CD3 capaz de se ligar tanto ao CD3 humano quanto ao CD3 de macaco cinomolgo.

[009] 8) O anticorpo de reação cruzada que se liga a ambos de CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo foi relatado nos Documentos Patentários 3 e 4 e Documento Não Patentário 20. Também, um anticorpo biespecífico em que uma cadeia única de um tal anticorpo anti-CD3 é ligada com uma cadeia única de um anticorpo contra um antígeno alvo expresso na superfície da célula cancerosa foi relatado (Documento Patentário 5 e Documento Não Patentário 21). Entretanto, de modo a ser capaz de aplicar anticorpos multiespecíficos ou moléculas multiespecíficas aos alvos cancerosos aplicáveis altamente diversos, existe demanda quanto a um anticorpo anti-CD3 que se liga aos epítopos outros que não aqueles mencionados acima e se liga tanto ao CD3 humano quanto ao de macaco

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4/152 cinomolgo.

[Técnica Anterior] [Documentos Patentários]

[0010] [Documento WO2012/162067	Patentário 1] Publicação Internacional No.
[Documento W02007/108152A1	Patentário 2] Publicação Internacional No.
[Documento	Patentário 3] Publicação de Patente U.S. No.

8236308B2

[Documento W02008/119567Al	Patentário 4] Publicação Internacional No.
[Documento	Patentário 5] Publicação Internacional No.

WO2015/026892Al [Documento Não Patentário] [Documento Não Patentário 1] Salmeron A. et al., J. Immunol.

(1991) 147, 3047-3052

[Documento

Não Patentário 2] Cosmi AB. et al.,

Transplantation (1981) 32, 535-539 [Documento Não Patentário 3] Gilbert EM. et al., Am. J. Med. (1987) 82, 202-206 [Documento Não Patentário 4] Thistlethwaite JR. et al., Transplanation (1987) 43, 176-184 [Documento Não Patentário 5] Abramowicz D. et al.,

Transplanation (1989) 47, 606-608 [Documento Não Patentário 6] Toussaint D. et al., Transplanation (1989) 48, 524-526 [Documento Não Patentário 7] Thistlethwaite, JR. et al., Am.

J. Kidney Dis. (1988) 11, 112-119 [Documento Não Patentário 8] Meuer, SC. et al., Eur. J.

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5/152

Immunol. (1986) 136, 4106-4112 [Documento Não Patentário 9] George AJ. et al., J. Immunol. (1994) 152 (4), 1802-11 [Documento Não Patentário 10] Woodle ES. et al., J Immunol. (1992) 148 (9), 2756-63 [Documento Não Patentário 11] Yankelevich M. et al., Pediatr. Blood Cancer (2012) 59 (7), 1198-1205 [Documento Não Patentário 12] Ohmachi T. et al., Clin. Cancer Res. (2006) 12 (18), 3857-3863 [Documento Não Patentário 13] Muhlmann G., et al., J. Clin. Pathol. (2009) 62 (2), 152-158 [Documento Não Patentário 14] Fong D., et al., Br. J. Cancer (2000) 99 (8), 1290-1295.

[Documento Não Patentário 15] Fong D. et al., Mod. Pathol. (2000) 21 (2) (2000), 186-191 [Documento Não Patentário 16] Ning S., et al., Neurol. Sei. (2013) 34 (10), 1745-1750 [Documento Não Patentário 17] Sandusky et al., J. Med. Primatol. (1986) 15, 441-451 [Documento Não Patentário 18] http://www.nhpreagents.org/NHP/clonelist.aspx?ID=77 [Documento Não Patentário 19] Uda et al., J. Med. Primatol. (2001) 30, 141-147 [Documento Não Patentário 20] Conrad ML. et al., Cytometry A. (2007)71 (11), 925-33 [Documento Não Patentário 21] Lum LG. et al., BioDrugs (2011)25 (6), 365-379.

[Sumário da Invenção] [Problema a ser Resolvido pela Invenção]

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6/152 [0011] Um objetivo da presente invenção é prover um novo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo (daqui em diante, também aludido como um anticorpo, etc.) que se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo, uma molécula compreendendo o anticorpo, etc. e compreendendo ainda 1 ou 2 ou mais anticorpos adicionais ou fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos, a molécula sendo multiespecífica e uma composição farmacêutica tendo atividade citotóxica, etc. que inclua o anticorpo, etc. ou a molécula como um ingrediente ativo.

[Meios para Resolver o Problema] [0012] Os presentes inventores conduziram pesquisa extensiva para alcançar este objetivo e realizaram a presente invenção pelo desenvolvimento de um novo anticorpo anti-CD3 e uma molécula compreendendo este anticorpo.

[0013] Especificamente, a presente invenção abrange os seguintes aspectos:

(1) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, distinguidos em que:

uma sequência de cadeia pesada compreende

CDRH1 compreendendo	a	sequência	de	aminoácido
representada pela SEQ ID NO: 26,
CDRH2 compreendendo	a	sequência	de	aminoácido
representada pela SEQ ID NO: 98, e
CDRH3 compreendendo	a	sequência	de	aminoácido
representada pela SEQ ID NO: 28;
uma sequência de cadeia leve compreende
CDRL1 compreendendo	a	sequência	de	aminoácido

representada pela SEQ ID NO: 29,

CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 99, e

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CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 31; e o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0014] (2) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com (1), em que na CDRH2 o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em A,

E, G, Η, I, L, T, V, R e S, e o segundo Xaa é S, ou o primeiro Xaa é N, e o segundo Xaa é selecionado de um grupo consistindo em E,

R, F, Y, L, V, I, K e T, na CDRL2,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N e

D, e o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0015] (3) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com (1) ou (2), em que na CDRH2, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em R e

S e o segundo Xaa é S, na CDRL2,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N e

[0016] (4) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um

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8/152 anticorpo de acordo com (1), em que a sequência de cadeia pesada compreende uma região variável tendo CDRH1, CDRH2 e CDRH3,

CDRH1 consistindo	em	uma	sequência	de	aminoácido
representada pela SEQ ID NO: 26,
CDRH2 consistindo	em	uma	sequência	de	aminoácido
representada pela SEQ ID NO: 27, e
CDRH3 consistindo	em	uma	sequência	de	aminoácido

representada pela SEQ ID NO: 28;

a sequência de cadeia leve compreende uma região variável tendo CDRL1, CDRL2 e CDRL3,

CDRL1 consistindo	em	uma	sequência	de	aminoácido
representada pela SEQ ID NO: 29,
CDRL2 consistindo	em	uma	sequência	de	aminoácido
representada pela SEQ ID NO: 30, e
CDRL3 consistindo	em	uma	sequência	de	aminoácido

representada pela SEQ ID NO: 31; e o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0017] (5) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que a sequência da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100.

[0018] (6) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com (5), em que na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em A, E, G, Η, I, L, T, V, R e S, e

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9/152 o segundo Xaa é S, ou o primeiro Xaa é N, e o segundo Xaa é selecionado de um grupo consistindo em E, R, F, Y, L, V, I, K e T.

[0019] (7) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com (5), em que na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em R e S e o segundo Xaa é S.

[0020] (8) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102 e 103.

[0021] (9) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com (8), em que na sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102 e 103,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N e D.

[0022] (10) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com (5), em que a sequência da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 16.

[0023] (11) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com (8), em que a sequência da região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 20 e 23.

[0024] (12) Um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de

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10/152 acordo com (1) ou (2), em que o anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102 e 103, em que na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em A, E, G, Η, I, L, T, V, R e S e o segundo Xaa é S, ou o primeiro Xaa é N e o segundo Xaa é selecionado de um grupo consistindo em E, R, F, Y, L, V, I, K e T, e na sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102 e 103,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N e D.

[0025] (13) Um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com (12), em que na SEQ ID NO: 100 o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em R e

S,e o segundo Xaa é S, e na sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102 e 103,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N e D.

[0026] (14) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de

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11/152 aminoácido da SEQ ID NO: 60, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve compreendendo o 135° a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74 e uma região variável de

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12/152 cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84, de acordo com (13).

[0027] (15) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com (1), (4), (5), (8), (10), ou (11), em que o anticorpo ou

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13/152 fragmento de ligação a antígeno compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 16, um ligante e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 20e23.

[0028] (16) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (15), em que uma região variável de cadeia pesada se liga a uma região variável de cadeia leve nesta ordem, ou uma região variável de cadeia leve se liga a uma região variável de cadeia pesada nesta ordem, a partir do terminal amino e opcionalmente: i) tem um ligante entre ambas as regiões variáveis, ii) tem um resíduo de glicina no terminal amino de uma região variável no lado do terminal amino e iii) tem um ligante, marcador FLAG e/ou marcador HIS no terminal carboxila de uma região variável no lado do terminal carboxila.

[0029] (17) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com (16) incluindo uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, uma sequência de aminoácido compreendendo os

2^o

243°

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14/152 resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 75, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.

(18) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com (16) incluindo uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 267° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 267° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72,

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15/152 uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.

[0030] (19) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de nucleotídeo contida em um polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas com um filamento complementar de um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido contida em um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (14) a (18) e se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0031] (20) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido de uma cadeia pesada contida em um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (14) a (18) e uma cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácido de uma cadeia leve contida no anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno

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16/152 do anticorpo de acordo com qualquer um de (14) a (18) e se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0032] (21) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido derivada pela substituição, deleção, ou adição de 1 ou mais aminoácidos de uma sequência de aminoácido contida em uma cadeia pesada contida em um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (14) a (18) e uma cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido derivada pela substituição, deleção, ou adição de 1 ou mais aminoácidos de uma sequência de aminoácido contida em uma cadeia leve contida no anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (14) a (18) e se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0033] (22) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno se ligam ao mesmo sítio no CD3 humano como aquele ligado por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (14) a (18) e se ligam ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0034] (23) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno competem com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (14) a (18) para ligarem-se ao CD3 humano e se ligam ao CD3 de macaco cinomolgo.

[0035] (24) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com (22), em que o sítio no CD3 humano ligado pelo anticorpo é constituído por 7 ou mais aminoácidos selecionados da 55^a serina (Ser), do 56° ácido glutâmico (Glu), da 58^a leucina (Leu), do 59° triptofano (Trp), da 65^a asparagina (Asn), da 66^a isoleucina (Ile), da 77^a serina (Ser), do

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78° ácido aspártico (Asp), da 101^a arginina (Arg), da 101^a glicina (Gly), da 103^a serina (Ser), da 104^a lisina (Lys) e da 105^a prolina (Pro) na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 1.

[0036] (25) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (17) e (19) a (24), em que o anticorpo é IgG.

[0037] (26) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (23), em que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado de um grupo consistindo em Fab, F(ab)’, Fv, scFv e sdAb.

[0038] (27) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (17) e (19) a (25), em que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano incluindo uma região constante da imunoglobulina humana.

[0039] (28) Um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27).

[0040] (29) Um polinucleotídeo de acordo com (27), em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido representada por uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60,

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18/152 uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.

(30) Um vetor compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (28) ou (29).

[0041 ] (31) Uma célula compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (28) ou (29) ou um vetor de acordo com (30), ou produzindo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27).

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19/152 [0042] (32) Um método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liguem ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo, o método compreendendo as etapas de: cultivar uma célula de acordo com (31); e recuperar um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liguem ao CD3 humano a partir das culturas.

[0043] (33) Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liguem ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno sendo obtidos por um método de acordo com (32).

[0044] (34) Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27) e (33) como um ingrediente ativo.

[0045] (35) Uma molécula tendo atividade de ligação a antígeno, compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27) e (33).

[0046] (36) Uma molécula de acordo com (35), em que a molécula é multiespecífica.

[0047] (37) Uma molécula de acordo com (35) ou (36), compreendendo ainda 1 ou 2 ou mais anticorpos adicionais ou fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos além do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27) e (33).

[0048] (38) Uma molécula de acordo com (37), em que o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo adicional é Fab, F(ab)’, Fv, scFv ou sdAb.

[0049] (39) Uma molécula de acordo com (38), em que a molécula compreende Fc.

[0050] (40) Uma molécula de acordo com qualquer um de (37) a (38), em que o anticorpo adicional é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano compreendendo uma região constante da imunoglobulina humana.

[0051] (41) Uma molécula de acordo com qualquer um de (37) a (38),

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20/152 em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno adicionais do anticorpo é ligado com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27) e (33) por meio de um ligante ou sem um ligante.

[0052] (42) Uma molécula de acordo com (41), em que um terminal carboxila da sequência de aminoácido do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno adicionais do anticorpo é ligado com um ligante e um terminal carboxila da sequência de aminoácido do ligante é ligado ainda com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27) e (33).

[0053] (43) Uma molécula de acordo com (42), em que a molécula compreende uma sequência de aminoácido em que um terminal carboxila da sequência de aminoácido do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno adicionais do anticorpo é ligado com um ligante e um terminal carboxila da sequência de aminoácido do ligante é ligado ainda com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22, ou o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo dos 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25. [0054] (44) Uma molécula de acordo com qualquer um de (35) a (42), compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (27) e (33), em que a região variável compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve nesta ordem, ou uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada nesta ordem, a partir do terminal amino e opcionalmente: i) tem um ligante entre ambas as regiões variáveis, ii) tem um resíduo de glicina no terminal amino da região variável no lado do terminal

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21/152 amino e iii) tern um ligante, marcador FLAG e/ou marcador HIS no terminal carboxila de uma região variável no lado do terminal carboxila. As formas aplicáveis incluem moléculas biespecíficas tipo Híbridas e tipo Duais.

[0055] (45) Uma molécula de acordo com (44), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno adicionais do anticorpo são ligados com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80,

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22/152 o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84. As formas aplicáveis incluem moléculas biespecíficas tipo Híbridas e tipo Duais. [0056] (46) Uma molécula de acordo com qualquer um de (36) a (45), em que o anticorpo adicional é anticorpo anticâncer alvo.

[0057] (47) Uma molécula de acordo com qualquer um de (36) a (46), em que a molécula é biespecífica.

[0058] (48) Uma molécula de acordo com qualquer um de (35) a (47), em que a molécula é um polipeptídeo.

[0059] (49) Um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de uma molécula de acordo com (48).

[0060] (50) Um vetor compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (49).

[0061] (51) Uma célula produzindo um polinucleotídeo de acordo com (49) ou um vetor de acordo com (50), ou uma molécula de acordo com (48).

[0062] (52) Um método para produzir uma molécula que se ligue ao

CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo, o método compreendendo as etapas de: cultivar uma célula de acordo com (51); e recuperar uma molécula que se ligue ao CD3 humano a partir das culturas.

[0063] (53) Uma molécula que se ligue ao CD3 humano e CD3 de macaco cinomolgo, a molécula sendo obtida por um método de acordo com (52).

[0064] (54) Uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de acordo com qualquer um de (35) a (48) e (53) como um ingrediente ativo.

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 29/238 / 152 [0065] (55) Uma composição farmacêutica de acordo com (54), em que a composição farmacêutica induz citotoxicidade nas células alvo pelo redirecionamento de células T para as células alvo.

[Efeito da Invenção] [0066] A presente invenção é capaz de obter um novo anticorpo antiCD3 ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se liguem ao CD3 humano e se liguem ao CD3 de macaco cinomolgo e uma nova molécula tendo atividade de ligação a antígeno que inclua o anticorpo, etc. Além disso, uma nova composição farmacêutica é obtida que inclui um tal anticorpo, etc. ou molécula como um ingrediente ativo. O anticorpo, etc. ou molécula têm atividade citotóxica dependente de célula T e é útil como um agente terapêutico ou profilático para várias doenças tais como câncer.

[Breve Descrição dos Desenhos] [0067] [Figura 1] A Figura 1 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de CD3a humano.

[0068] [Figura 2] A Figura 2 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de CD35 humano.

[0069] [Figura 3] A Figura 3 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando antígeno de cadeia única de CD3ay humano.

[0070] [Figura 4] A Figura 4 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de antígeno de cadeia única de CD3ay humano.

[0071] [Figura 5] A Figura 5 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um iniciador de sentido Nhe-poliC-S para a amplificação de gene de cadeia pesada.

[0072] [Figura 6] A Figura 6 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um primeiro iniciador de antis sentido rlgy-ASl para a amplificação de gene de cadeia pesada.

[0073] [Figura 7] A Figura 7 é um diagrama mostrando a sequência de

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24/152 nucleotídeo de um segundo iniciador de antissentido r!gy-AS2 para a amplificação de gene de cadeia pesada.

[0074] [Figura 8] A Figura 8 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um iniciador de sentido Nhe-polyC-S2 para a amplificação de gene de cadeia leve.

[0075] [Figura 9] A Figura 9 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um primeiro iniciador de antissentido rlgL-ASl para a amplificação de gene de cadeia leve.

[0076] [Figura 10] A Figura 10 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um segundo iniciador de antissentido r!gL-AS2 para a amplificação de gene de cadeia leve.

[0077] [Figura 11] A Figura 11 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um iniciador de sentido rlgy-seq para sequenciamento de cadeia pesada.

[0078] [Figura 12] A Figura 12 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um iniciador de antissentido 1 rlgL-seql para sequenciamento de cadeia leve.

[0079] [Figura 13] A Figura 13 é um diagrama mostrando a sequência de nucleotídeo de um iniciador de antissentido 2 r!gL-seq2 para sequenciamento de cadeia leve.

[0080] [Figura 14] A Figura 14 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando a região variável de cadeia pesada de C3-147.

[0081] [Figura 15] A Figura 15 é um diagrama mostrando a sequência de amino da região variável de cadeia pesada de C3-147.

[0082] [Figura 16] A Figura 16 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando a região variável de cadeia leve de C3147.

[0083] [Figura 17] A Figura 17 é um diagrama mostrando a

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 31/238 / 152 sequência de amino da região variável de cadeia leve de C3-147.

[0084] [Figura 18] A Figura 18 é um diagrama mostrando a sequência de oligonucleotídeos de um filamento de sentido do ligante G4S.

[0085] [Figura 19] A Figura 19 é um diagrama mostrando a sequência de oligonucleotídeos de um filamento de antis sentido do ligante G4S.

[0086] [Figura 20] A Figura 20 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7000.

[0087] [Figura 21] A Figura 21 é um diagrama mostrando sequência de aminoácido em C3E-7000.

[0088] [Figura 22] A Figura 22 é um diagrama mostrando sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de C3E-7034.

[0089] [Figura 23] A Figura 23 é um diagrama mostrando sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de C3E-7034.

mostrando [0090] [Figura 24] A Figura 24 é um sequência de aminoácido de CDR-H1 em C3E-7000.

[0091] [Figura 25] A Figura 25 é um sequência de aminoácido de CDR-H2 em C3E-7000.

[0092] [Figura 26] A Figura 26 é um sequência de aminoácido de CDR-H3 em C3E-7000.

[0093] [Figura 27] A Figura 27 é um sequência de aminoácido de CDR-L1 em C3E-7000.

[0094] [Figura 28] A Figura 28 é um sequência de aminoácido de CDR-L2 em C3E-7000.

[0095] [Figura 29] A Figura 29 é um sequência de aminoácido de CDR-L3 em C3E-7000.

[0096] [Figura 30] A Figura 30 é um sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de C3E-7035.

[0097] [Figura 31] A Figura 31 é um diagrama mostrando diagrama diagrama diagrama diagrama diagrama diagrama diagrama mostrando mostrando mostrando mostrando mostrando mostrando

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26/152 sequência de aminoácido de C3E-7035.

[0098] [Figura 32] A Figura 32 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de C3E-7036.

[0099] [Figura 33] A Figura 33 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7036.

[00100] [Figura 34] A Figura 34 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7034.

[00101] [Figura 35] A Figura 35 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7035.

[00102] [Figura 36] A Figura 36 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7036.

[00103] [Figura 37] A Figura 37 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de CD3y humano.

[00104] [Figura 38] A Figura 38 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7034.

[00105] [Figura 39] A Figura 39 é um diagrama mostrando a estrutura complexa de CD3ay e C3E-7034.

[00106] [Figura 40] A Figura 40 é um par de diagramas mostrando a interação entre CD3ay e as cadeias pesada e leve de C3E-7034.

[00107] A Figura 40A é um diagrama relacionado com a região variável de cadeia leve de C3E-7034 e CD3a em que os resíduos de aminoácido de CD3a dentro de uma distância de 4 ângstroms um do outro são indicados pelos galhos espessos no modelo e os outros aminoácidos são indicados pelos galhos finos no modelo.

[00108] A Figura 40B é um diagrama relacionado com a região variável de cadeia pesada de C3E-7034 e CD3a em que os resíduos de aminoácido de CD3a dentro de uma distância de 4 ângstroms um do outro são indicados pelos galhos espessos no modelo e os outros aminoácidos são indicados pelos galhos finos no modelo.

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 33/238 / 152 [00109] [Figura 41] A Figura 41 é um diagrama mostrando os sítios de interação de CD3e humano com as sequências das regiões variáveis de cadeia pesada e leve em C3E-7034.

[00110] [Figura 42] A Figura 42 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada em OKT3.

[00111] [Figura 43] A Figura 43 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada em C3E-3007.

[00112] [Figura 44] A Figura 44 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve em OKT3.

[00113] [Figura 45] A Figura 45 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve em C3E-3007.

[00114] [Figura 46] A Figura 46 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando scFv de C3E-3007.

[00115] [Figura 47] A Figura 47 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de scFv de C3E-3007.

[00116] [Figura 48] A Figura 48 é um diagrama mostrando a atividade de ligação de C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036, que são scFvs anti-CD3 humanizados, ao CD3 humano (PBMC).

[00117] [Figura 49] A Figura 49 é um diagrama mostrando a atividade de ligação de C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036, que são scFvs anti-CD3 humanizados, ao CD3 de macaco cinomolgo (PBMC).

[00118] [Figura 50] A Figura 50A é um diagrama mostrando os efeitos de ativação de C3E-7034 e C3E-3007, que são scFvs anti-CD3 humanizados, sobre as células humanas positivas em CD8 e Figura 50B é um diagrama mostrando os efeitos da ativação de C3E-7034 e C3E-3007, que são os scFvs anti-CD3 humanizados, sobre as células de macaco cinomolgo positivas em CD8.

[00119] [Figura 51] A Figura 51 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de scFv HT1-11.

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28/152 [00120] [Figura 52] A Figura 52 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando scFv HT1-11.

[00121] [Figura 53] A Figura 53 é um par de diagramas mostrando que scFv HT1-11 se liga a uma linhagem de célula humana positiva em TROP2.

[00122] A Figura 53A é um diagrama mostrando que a ligação à linhagem FaDu de célula cancerosa de célula escamosa faríngea.

[00123] A Figura 53B é um diagrama mostrando a ligação à linhagem HPAF-II de célula cancerosa pancreática.

[00124] [Figura 54] A Figura 54 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo de ORF codificando T2C-0001.

[00125] [Figura 55] A Figura 55 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo de ORF codificando T2C-0003.

[00126] [Figura 56] A Figura 56 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo de ORF codificando T2C-0005.

[00127] [Figura 57] A Figura 57 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo de ORF codificando T2C-0006.

[00128] [Figura 58] A Figura 58 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de T2C-0001.

[00129] [Figura 59] A Figura 59 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de T2C-0003.

[00130] [Figura 60] A Figura 60 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de T2C-0005.

[00131] [Figura 61] A Figura 61 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de T2C-0006.

[00132] [Figura 62] A Figura 62 é um par de diagramas mostrando que as moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 T2C-0001, T2C0003, T2C-0005 e T2C-0006 se ligam a uma linhagem de célula positive em TROP2.

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29/152 [00133] A Figura 62A é um diagrama mostrando a ligação à linhagem FaDu de célula cancerosa de célula escamosa faríngea.

[00134] A Figura 62B é um diagrama mostrando a ligação à linhagem HPAF-II de célula cancerosa pancreática.

[00135] [Figura 63] A Figura 63 é um diagrama mostrando a atividade de ligação de moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 e T2C-0006 ao CD3 humano (PBMC).

[00136] [Figura 64] A Figura 64 é um diagrama mostrando a atividade de ligação de moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 e T2C-0006 ao CD3 de macaco cinomolgo (PBMC).

[00137] [Figura 65] [00138] A Figura 65A é um diagrama mostrando TROP2 expresso na linhagem FaDu de célula cancerosa de célula escamosa faríngea.

[00139] A Figura 65B é um diagrama mostrando TROP2 expresso na linhagem HPAF-II de célula cancerosa pancreática.

[00140] A Figura 65 C é um diagrama mostrando que TROP2 não é expresso na linhagem Calu-6 de célula cancerosa pulmonar.

[00141] [Figura 66] [00142] A Figura 66A é um diagrama mostrando que as moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 e T2C-0006 têm atividade citotóxica contra uma linhagem FaDu de célula cancerosa de célula escamosa faríngea na presença de PBMC humana.

[00143] A Figura 66B é um diagrama mostrando que as moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 e T2C-0006 têm atividade citotóxica contra linhagem HPAF-II de célula cancerosa pancreática na presença de PBMC humana.

[00144] A Figura 66C é um diagrama mostrando que as moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 e T2C-0006 não exibem nenhuma atividade citotóxica contra a linhagem Calu-6 de célula

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30/152 cancerosa pulmonar humana na presença de PBMC humana.

[00145] [Figura 67] A Figura 67 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7078.

[00146] [Figura 68] A Figura 68 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7078.

[00147] [Figura 69] A Figura 69 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7079.

[00148] [Figura 70] A Figura 70 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7079.

[00149] [Figura 71] A Figura 71 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7085.

[00150] [Figura 72] A Figura 72 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7085.

[00151] [Figura 73] A Figura 73 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7086.

[00152] [Figura 74] A Figura 74 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7086.

[00153] [Figura 75] A Figura 75 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7087.

[00154] [Figura 76] A Figura 76 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7087.

[00155] [Figura 77] A Figura 77 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7088.

[00156] [Figura 78] A Figura 78 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7088.

[00157] [Figura 79] A Figura 79 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7089.

[00158] [Figura 80] A Figura 80 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7089.

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31/152 [00159] [Figura 81] A Figura 81 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7090.

[00160] [Figura 82] A Figura 82 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7090.

[00161] [Figura 83] A Figura 83 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7091.

[00162] [Figura 84] A Figura 84 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7091.

[00163] [Figura 85] A Figura 85 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7092.

[00164] [Figura 86] A Figura 86 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7092.

[00165] [Figura 87] A Figura 87 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7093.

[00166] [Figura 88] A Figura 88 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7093.

[00167] [Figura 89] A Figura 89 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7094.

[00168] [Figura 90] A Figura 90 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7094.

[00169] [Figura 91] A Figura 91 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando C3E-7095.

[00170] [Figura 92] A Figura 92 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de C3E-7095.

[00171] [Figura 93] A Figura 93 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando o iniciador Avançado HN53R.

[00172] [Figura 94] A Figura 94 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando o iniciador Reverso HN53R.

[00173] [Figura 95] A Figura 95 é um diagrama mostrando uma

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32/152 sequência de nucleotídeo codificando o iniciador Avançado HN53S.

[00174] [Figura 96] A Figura 96 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo codificando o iniciador Reverso HN53S.

[00175] [Figura 97] A Figura 97 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo da ORF codificando AXC-0001.

[00176] [Figura 98] A Figura 98 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de AXC-0001.

[00177] [Figura 99] A Figura 99 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo da ORF codificando AXC-0002.

[00178] [Figura 100] A Figura 100 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de AXC-0002.

[00179] [Figura 101] A Figura 101 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo da ORF codificando MGC-0001.

[00180] [Figura 102] A Figura 102 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de MGC-0001.

[00181] [Figura 103] A Figura 103 é um diagrama mostrando uma sequência de nucleotídeo da ORF codificando MGC-0002.

[00182] [Figura 104] A Figura 104 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de MGC-0002.

[00183] [Figura 105] A Figura 105 mostra uma lista de iniciadores usados na preparação de variantes de CDR de anticorpos anti-CD3.

[00184] [Figura 106-1] A Figura 106-1 é um diagrama mostrando a atividade de ligação de variantes de CDR de anticorpos anti-CD3 ao CD3 de ser humano e de macaco cinomolgo (PBMC).

[00185] [Figura 106-2] A Figura 106-2 é um diagrama mostrando a atividade de ligação de variantes de CDR de anticorpos anti-CD3 ao CD3 de ser humano e macaco cinomolgo (PBMC).

[00186] [Figura 107] A Figura 107 é um diagrama mostrando a expressão de Axl na linhagem A549 de célula cancerosa pulmonar humana

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33/152 (A), linhagem PANC-1 de célula cancerosa pancreática humana (B), linhagem MIA PaCa-2 de célula cancerosa pancreática humana (C), linhagem U266B1 de célula de mieloma humana (D) e linhagem Jeko-1 de célula de linfoma da célula do manto (E).

[00187] [Figura 108] Cada uma das Figuras 108A, 108B e 108C é um diagrama mostrando que as moléculas biespecíficas de CD3 anti-Axl AXC-0001 e AXC-0002 têm atividade citotóxica contra as linhagens de célula que expressam Axl na presença de PBMC humana. Cada uma das Figuras 108D e 108E é um diagrama mostrando que as moléculas biespecíficas de CD3 anti-Axl AXC-0001 e AXC-0002 não têm nenhuma atividade citotóxica contra linhagens de célula que não expressam Axl na presença de PBMC humana.

[00188] [Figura 109] A Figura 109 é um diagrama mostrando a atividade de ligação de scFv MAG-032 em células T2 da linhagem de célula de fusão de linfoblasto humana suplementadas com peptídeo MAGECI (A) ou DMSO (B).

[00189] [Figura 110] [00190] A Figura 110A é um diagrama mostrando que as moléculas biespecíficas anti-HLA-A2/MAGECl-CD3 MGC-0001 e MGC-0002 têm atividade citotóxica contra células T2 suplementadas com o peptídeo MAGEC1 na presença de PBMC humana.

[00191] A Figura 110B é um diagrama mostrando que as moléculas biespecífica anti-HLA-A2/MAGECl-CD3 MGC-0001 e MGC-0002 não têm nenhuma atividade citotóxica contra T2 suplementada com DMSO na presença de PBMC humana.

[00192] [Figura 111] A Figura 111 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido de peptídeo MAGEC1.

[00193] [Figura 112] A Figura 112 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido na região CDRH2 de uma variante CDR. O primeiro

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Xaa e o segundo Xaa cada um representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário.

[00194] [Figura 113] A Figura 113 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido na região CDRL2 de uma variante CDR. Xaa representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário.

[00195] [Figura 114] A Figura 114 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada de uma variante de CDR de C3E-7034. O primeiro Xaa e o segundo Xaa cada um representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário.

[00196] [Figura 115] A Figura 115 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido na região variável da cadeia leve de uma variante de CDR de C3E-7034. Xaa representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário.

[00197] [Figura 116] A Figura 116 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido na região variável da cadeia leve de uma variante de CDR de C3E-7035. Xaa representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário.

[00198] [Figura 117] A Figura 117 é um diagrama mostrando a sequência de aminoácido na região variável da cadeia leve de uma variante de CDR de C3E-7036. Xaa representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário.

[Modalidade da Invenção]

1. Definições [00199] Na presente invenção, o termo “gene” significa um nucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo codificando os aminoácidos de uma proteína, ou seu filamento complementar. “Gene” é intencionado incluir, por exemplo, um polinucleotídeo, um oligonucleotídeo, DNA, mRNA, cDNA e cRNA como o nucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo codificando os aminoácidos de uma proteína, ou seu

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35/152 filamento complementar. Um tal gene é um nucleotídeo de filamento único, de filamento duplo, de filamento triplo, ou outro de filamento múltiplo. “Gene” também é intencionado incluir um agregado de filamentos de DNA e RNA, uma mistura de ribonucleotídeos (RNAs) e desoxirribonucleotídeos (DNAs) em um filamento de nucleotídeo e um nucleotídeo de filamento duplo, de filamento triplo ou outro de filamento múltiplo compreendendo um tal filamento de nucleotídeo. Na presente invenção, os termos “sequência de base” e “sequência de nucleotídeo” têm o mesmo significado.

[00200] Na presente invenção, o termo “polinucleotídeo” tem o mesmo significado como “ácido nucléico” e “molécula de ácido nucléico” e também é intencionado incluir, por exemplo, qualquer DNA, RNA, sonda, oligonucleotídeo e iniciador. Um tal polinucleotídeo é um polinucleotídeo de filamento único, de filamento duplo, de filamento triplo ou outro de filamento múltiplo. O “polinucleotídeo” também é intencionado incluir um agregado de filamentos de DNA e RNA, uma mistura de ribonucleotídeos (RNAs) e desoxirribonucleotídeos (DNAs) em um filamento de polinucleotídeo e um agregado de dois filamentos ou três ou mais filamentos compreendendo um tal filamento de polinucleotídeo.

[00201] Na presente invenção, os termos “polipeptideo,” “peptídeo,” e “proteína” têm o mesmo significado.

[00202] Na presente invenção, o termo “antígeno” é algumas vezes usado para significar “imunógeno.” [00203] Na presente invenção, o termo “célula” também inclui, por exemplo, qualquer célula derivada de animais individuais, células subcultivadas, células cultivadas primárias, linhagens de célula, células recombinantes e células microbianas.

[00204] Na presente invenção, o termo “anticorpo” tem o mesmo significado como imunoglobulina. Entretanto, o “anticorpo” usado para o anticorpo anti-CD3 da presente invenção significa uma imunoglobulina tendo

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36/152 regiões constantes e variáveis. O anticorpo não é particularmente limitado e pode ser uma imunoglobulina natural ou pode ser uma imunoglobulina produzida pela síntese parcial ou completa. O anticorpo anti-CD3 da presente invenção é incluído na “molécula” descrita abaixo.

[00205] A estrutura básica de um anticorpo quaternário é constituída por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente. As duas cadeias pesadas são ligadas uma à outra por uma ou mais ligações de dissulfeto dependendo dos isótipos das cadeias pesadas. Cada uma das cadeias leve e pesada tem ligações de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada uma das cadeias pesada e leve contém uma região constante que exibe um grau muito alto de similaridade de sequência de aminoácido e uma região variável que exibe um grau baixo de similaridade de sequência de aminoácido. A cadeia leve tem uma região variável (VL) no terminal amino seguido por uma região constante (CL). A cadeia pesada tem uma região variável (VH) no terminal amino seguido pelas três regiões constantes (CHI, CH2 e CH3). VL e VH são unidos e CL é alinhado com a primeira região constante (CHI) da cadeia pesada. VL e VH são unidos para formar um único sítio de ligação de antígeno.

[00206] As regiões constantes do anticorpo da presente invenção não são particularmente limitadas. Preferivelmente, as regiões constantes derivadas de um anticorpo humano são usadas em um anticorpo da presente invenção para o tratamento ou prevenção de doenças em seres humanos. Os exemplos das regiões constantes de cadeia pesada no anticorpo humano incluem Cyl, Cy2, Cy3, Cy4, Cp, Cô, Cocl, Coc2 e Ca. Os exemplos de regiões constantes de cadeia leve no anticorpo humano incluem Ck e CÀ.

[00207] Eab é composto de CHI de cadeia pesada seguido por VH e CL de cadeia leve seguido por VL. VH e VL cada um contém regiões determinantes de complementaridade (CDRs).

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37/152 [00208] Fc é constituído pelas regiões de terminal carboxila das regiões constantes de cadeia pesada e é um dímero contendo CH2 e CH3. O Fc da presente invenção pode ser Fc tendo uma sequência natural ou pode ser uma forma mutada de Fc contendo uma mutação na sequência natural.

[00209] A região variável é composta de regiões, chamadas de regiões hipervariáveis (HVRs), tendo variabilidade extrema e regiões relativamente invariáveis, chamadas de regiões de arcabouço (FRs), interrompidas pelas regiões hipervariáveis. As regiões variáveis naturais de cadeia pesada e leve cada uma contém quatro FRs conectadas pelas três regiões hipervariáveis. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas em proximidade imediata junto com as regiões hipervariáveis de uma outra cadeia pelas FRs e contribuem para a formação de um sítio de ligação de antígeno no anticorpo.

[00210] As cadeias pesadas e leves de uma molécula de anticorpo são conhecidas cada uma ter três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). As regiões determinantes de complementaridade também são chamadas de domínios hipervariáveis. Estas regiões estão localizadas nas regiões variáveis de cadeias pesada e leve do anticorpo. Estes sítios têm uma estrutura primária em particular altamente variável e são usualmente separados em três posições nas respectivas estruturas primárias de filamentos de polipeptídeo de cadeia pesada e leve. Na presente invenção, as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo são aludidas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3 a partir do terminal amino da sequência de aminoácido de cadeia pesada para as regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e como CDRL1, CDRL2 e CDRL3 a partir do terminal amino da sequência de aminoácido de cadeia leve para as regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve. Estes sítios são próximos um do outro na estrutura tridimensional e determinam a especificidade quanto ao antígeno a ser ligado.

[00211] Na presente invenção, as posições e comprimentos de CDRs

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38/152 foram determinados de acordo com as definições IMGT (Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77).

[00212] As regiões de arcabouço (FRs) são regiões variáveis exceto para Resíduos da CDR. Cada região variável usualmente tem quatro FRs, a saber, FR1, FR2, FR3 e FR4.

[00213] As posições de CDRs e FRs também pode ser determinada de acordo com outras definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, definições IMGT assim como Kabat, Chothia, AbM e definições de contato.

[00214] Na presente invenção, o termo “fragmento de ligação a antígeno do anticorpo” significa um fragmento de anticorpo parcial que tem regiões variáveis de cadeia pesada e leve e tem atividade de ligação a um antígeno. Os exemplos dos “fragmentos de ligação a antígeno no anticorpo” incluem, mas não são limitados a, fragmentos de ligação a antígeno tais como Fab, F(ab’)2, scFv, Fab’, Fv e anticorpo de domínio único (sdAb). Um tal fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser obtido tratando-se uma molécula inteira de uma proteína de anticorpo com uma enzima tal como papaína ou pepsina, ou pode ser uma proteína recombinante produzida em uma célula hospedeira apropriada usando um gene recombinante.

[00215] Na presente invenção, o “sítio” ao qual um anticorpo é ligado, isto é, o “sítio” reconhecido por um anticorpo, significa um peptídeo parcial ou estrutura de primeira ordem parcial em um antígeno que é ligado ou reconhecido pelo anticorpo.

[00216] Na presente invenção, um tal sítio também é aludido como um epítopo ou um sítio de ligação de anticorpo.

[00217] Na presente invenção, o termo “mutante de anticorpo” significa um polipeptideo que tem uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido do anticorpo original pela substituição, deleção, e/ou adição (“adição” inclui inserção) (daqui em diante, coletivamente aludidas como uma “mutação”) de aminoácido(s) e se liga ao CD3 da

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39/152 presente invenção. O número de aminoácidos mutados em um tal mutante de anticorpo é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, ou 50. Um tal mutante de anticorpo pode ser o “anticorpo” da presente invenção.

[00218] Na presente invenção, o termo “mais” em “1 ou mais” referese a um número de 2 a 10.

[00219] No presente relatório descritivo, o termo “molécula” é uma molécula compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo anteriormente mencionados e também inclui moléculas multiespecíficas formadas pelos anticorpos ou uma pluralidade de fragmentos de ligação a antígeno derivada da mesma.

[00220] No presente relatório descritivo, o termo “molécula que é multiespecífica” tem o mesmo significado como uma “molécula multiespecífica.” Uma tal molécula multiespecífica não é particularmente limitada contanto que a molécula seja capaz de ligar-se a uma pluralidade de epítopos diferentes um do outro em uma molécula, e/ou epítopos diferentes um do outro em duas ou mais moléculas. Uma molécula que é multiespecífica também inclui um anticorpo compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e variáveis de cadeia leve (VL). Os exemplos de tais moléculas multiespecíficas incluem, mas não são limitados a, uma molécula inteira de anticorpo tendo dois ou mais tipos de cadeias pesadas e dois ou mais tipos de cadeia leves, isto é, uma molécula multiespecífica tipo IgG e uma molécula consistindo em dois ou mais tipos de fragmentos de ligação a antígeno tendo VLs e VHs, isto é, uma molécula derivada por uma combinação de Fab, Fab’, Fv, scFv, sdAb, etc. (isto é, scFv em tandem, diacorpos, diacorpos de cadeia única e triacorpos). Além disso, uma molécula formada ligando-se genética ou quimicamente uma proteína tendo atividade de ligação a antígeno sem um esqueleto de imunoglobulina, a um fragmento de ligação a antígeno também é incluída na molécula multiespecífica.

[00221] Os exemplos de atividades ou propriedades realizadas por um

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40/152 anticorpo anti-CD3 da presente invenção, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção, ou uma molécula multiespecífica da presente invenção podem incluir atividades biológicas ou propriedades físicoquímicas e podem especificamente incluir várias atividades biológicas, atividade de ligação contra um antígeno ou um epítopo, estabilidade durante a produção ou armazenagem e estabilidade térmica.

[00222] Na presente invenção, a frase “hibridizar sob condições severas” significa hibridização sob condições envolvendo hibridização a 65 °C em uma solução contendo 5 x SSC, seguida por lavagem a 65°C durante 20 minutos em uma solução aquosa contendo 2 x SSC-0,1% de SDS, a 65°C durante 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,5 x SSC-0,1% de SDS e a 65°C durante 20 minutos em uma solução aquosa contendo 0,2 x SSC-0,1% de SDS, ou hibridização sob condições equivalentes. SSC significa uma solução aquosa de NaCl a 150 mM-citrato de sódio a 15 mM e n x SSC significa SSC com n vezes a concentração.

[00223] Na presente invenção, o termo “citotoxicidade” refere-se a alguma mudança patológica promovida nas células e significa não apenas trauma direto, mas qualquer dano estrutural ou funcional às células, incluindo clivagem de DNA, formação de dímeros básicos, rupturas cromossômicas, dano ao aparelho mitótico e reduções nas atividades de várias enzimas.

[00224] Na presente invenção, o termo “atividade citotóxica” significa atividade que causa a citotoxicidade mencionada acima.

[00225] Na presente invenção, o termo “atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)” significa o efeito ou atividade de danificar células alvo tais como células tumorais pelas células NK por intermédio de anticorpos.

[00226] Na presente invenção, o termo “atividade citotóxica pelo redirecionamento de células T” significa que a citotoxicidade é causada por uma molécula multiespecífica compreendendo um anticorpo antigênico

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41/152 antitumoral e um anticorpo anti-CD3. Especificamente, o termo significa que o anticorpo antigênico antitumoral se liga a uma célula de tumor alvo enquanto o anticorpo anti-CD3 se liga a uma célula T de modo que a célula de tumor alvo e a célula T aproximem-se uma da outra para induzir a citotoxicidade mediada pela ativação de célula T A molécula pode estar contida em uma composição farmacêutica.

2. Proteína antigênica CD3 (complexo de CD3) [00227] Na presente invenção, o termo “CD3” tem o mesmo significado como proteína CD3.

[00228] CD3 é expresso, como uma porção de um complexo receptor de célula T multimolecular, nas células T e é um complexo de 5 tipos de cadeias polipeptídicas (γ, δ, ε, ζ e η) (com pesos moleculares de 25000 a 28000, 21000, 20000, 16000 e 22000, respectivamente).

[00229] O CD3 usado na presente invenção pode ser preparado pela purificação ou isolação de tecidos animais (incluindo fluidos corporais), células derivadas de tecidos, ou culturas de células, recombinação de gene, tradução in vitro, síntese química, etc.

[00230] A sequência de nucleotídeo de um cDNA codificando CD3e humano está registrada com GenBank sob Acesso No. NM_000733.3. A sequência de nucleotídeo de um cDNA codificando CD3 de macaco cinomolgo está registrada com o GenBank sob Acesso No. NM_001283615.1. A sequência de aminoácido de CD3e humano está descrita na SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências.

[00231] O cDNA de CD3e pode ser obtido usando, por exemplo, usando o chamado de método de PCR em que uma reação da cadeia da polimerase (daqui em diante, aludido como “PCR”) (Saiki, R.K., et al., Science (1988) 239, 487-489) é realizado usando uma biblioteca de cDNA de órgãos que expressam mRNA de CD3e como um padrão e usando iniciadores capazes de especificamente amplificar o cDNA de CD3e.

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42/152 [00232] Uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína que consiste de uma sequência de aminoácido derivada dos aminoácidos de CD3 pela substituição, deleção, ou adição de 1 ou mais aminoácidos e tem atividades biológicas equivalentes ao CD3 também é incluída na sequência de nucleotídeo do gene CD3. Uma proteína que consiste de uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido de CD3 pela substituição, deleção, ou adição de 1 ou mais aminoácidos e tem atividades biológicas equivalentes ao CD3 também é incluída no CD3.

[00233] Um polinucleotídeo hibridizado sob condições severas a um polinucleotídeo consistindo em uma sequência de nucleotídeo complementar à sequência de nucleotídeo codificando CD3e humano ou de macaco cinomolgo e codificando uma proteína tendo atividades biológicas equivalentes ao CD3a também é incluído no cDNA de CD3a. Além disso, variantes de junção transcritas de locais de gene de CD3e humano ou de macaco cinomolgo, ou polinucleotideos hibridizados a esses sob condições severas e codificando uma proteína tendo atividades biológicas equivalentes ao CD3a também são incluídas no cDNA de CD3a .

3. Anticorpo anti-CD3 (3-1) Classificação de anticorpo [00234] Um anticorpo anti-CD3 da presente invenção e um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo (daqui em diante, também aludido como o anticorpo, etc. da presente invenção) podem ser um anticorpo monoclonal ou um policlonal. Os exemplos de anticorpos monoclonais da presente invenção incluem anticorpos derivados de animal não humano (anticorpos de animal não humano), anticorpos humanos, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados.

[00235] Os exemplos de anticorpos de animal não humano incluem anticorpos derivados de vertebrados tais como mamíferos e pássaros. Os exemplos dos anticorpos derivados de mamífero incluem anticorpos derivados

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 49/238 / 152 de roedor tal como anticorpos de camundongo e anticorpos de rato. Os exemplos de anticorpos derivados de pássaro incluem anticorpos de galinha. Um exemplo de um anticorpo monoclonal de rato anti-CD3 humano é C3-147 [Exemplo l)-7] da presente invenção.

[00236] Os exemplos de anticorpos quiméricos incluem, mas não são limitados a anticorpos compreendendo regiões variáveis derivadas de anticorpo de animal não humano ligados às regiões constantes do anticorpo humano (imunoglobulina humana).

[00237] Os exemplos de anticorpos humanizados podem incluir, mas não são limitados a, anticorpos humanos (regiões variáveis da imunoglobulina humana) enxertados às CDRs nas regiões variáveis de anticorpos de animal não humano, um anticorpo humano enxertado às CDRs assim como às sequências parciais de regiões de arcabouço nos anticorpos de animal não humano e anticorpos tendo aminoácidos do anticorpo humano substituídos no lugar de um ou mais aminoácidos derivados de anticorpo de animal não humano em qualquer um destes anticorpos humanizados. Os exemplos de CDRs nas regiões variáveis de anticorpos de animal não humano incluem CDRH1 a CDRH3 na região variável de cadeia pesada e CDRL1 a CDRL3 na região variável de cadeia leve derivada de anticorpo anti-CD3 de rato C3E7000 da presente invenção e CDRs derivadas da sequência de aminoácidos destas CDRs pela substituição de 1 ou 2 aminoácidos pelos aminoácidos diferentes.

[00238] O anticorpo humano não é particularmente limitado contanto que o anticorpo preferivelmente se ligue ao CD3 humano e mais preferivelmente se ligue ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo. Os exemplos também incluem anticorpos humanos que se ligam ao mesmo sítio como nos anticorpos humanizados da presente invenção. Os exemplos incluem anticorpos humanos que se ligam ao mesmo sítio como C3E-7034.

[00239] Preferivelmente, o anticorpo, etc. da presente invenção se liga

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44/152 ao CD3 humano. Mais preferivelmente, o anticorpo, etc. da presente invenção também tem atividade de ligação ao CD3 de macaco cinomolgo.

[00240] O anticorpo, etc. da presente invenção pode ser compreendido de porções derivadas de uma pluralidade de anticorpos diferentes contanto que o anticorpo se ligue ao CD3 humano e também se ligue ao CD3 de macaco cinomolgo. Os exemplos destes anticorpos incluem anticorpos compreendendo cadeias pesadas e/ou leves trocadas entre uma pluralidade de anticorpos diferentes, anticorpos compreendendo cadeias pesadas e/ou leves inteiras trocadas entre si, anticorpos compreendendo regiões variáveis ou constantes trocadas entre si e anticorpos compreendendo todas ou algumas CDRs trocadas entre si. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo quimérico podem ser derivadas de anticorpos diferentes da presente invenção. CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo humanizado podem ser derivadas de dois ou mais anticorpos diferentes da presente invenção. CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo humano podem ser uma combinação de CDRs carreado por dois ou mais anticorpos diferentes da presente invenção.

[00241] Os exemplos do isótipo do anticorpo monoclonal da presente invenção podem incluir, mas não são particularmente limitados a, IgGs tais como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgM, IgAs tais como IgAl e IgA2, IgD e IgE.

[00242] O isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal podem ser determinados usando, por exemplo, um teste de Ouchterlony, um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), ou um rádio imunoensaio (RIA). Um kit comercialmente disponível para identificação (por exemplo, Kit Elisa de Isotipagem de Imunoglobulina de Rato (BD Pharmingen) pode ser usado. (3-2) Especificidade de ligação de anticorpo anti-CD3 [00243] O anticorpo, etc. da presente invenção reconhecem CD3. Em

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 51/238 / 152 outras palavras, o anticorpo, etc. da presente invenção se ligam ao CD3. O anticorpo, etc. da presente invenção preferivelmente se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco e mais preferivelmente se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[00244] Mais especificamente, o anticorpo da presente invenção e fragmento de ligação a antígeno do mesmo e suas regiões variáveis, se ligam a um domínio tipo Ig presente na região extracelular da cadeia ε (Figura 1, SEQ ID NO: 1) do complexo de CD3 humano. Além disso, estes também se ligam a um domínio tipo Ig presente na região extracelular da cadeia ε do complexo de CD3 de macaco cinomolgo.

[00245] Os epítopos presentes na região extracelular da cadeia ε (Figura 1, SEQ ID NO: 1) do complexo de CD3 humano ligado pelo anticorpo, etc. da presente invenção contêm os seguintes aminoácidos: [00246] Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, ArglOl, Glyl02, Serl03, Lysl04 e Prol05.

[00247] Preferivelmente, o anticorpo, etc. da presente invenção pode manter a ligação ao CD3 humano pela ligação a uma região de epítopo contendo pelo menos 7 aminoácidos selecionados destes 13 aminoácidos.

[00248] Quando um anticorpo é adjacente a estes aminoácidos dentro de uma distância de 4 ângstroms, um tal anticorpo pode ser confirmado ter a mesma especificidade de epítopo como aquela do anticorpo, etc. da presente invenção. Por outro lado, entre os aminoácidos de epítopo ArglOl, Glyl02, Serl03, Lysl04 e Prol05 estão presentes resíduos de epítopo que interagem com anticorpo anti-CD3 OKT3 ou UCHT1 como conhecido na técnica (Lars Kjer-Nielsen et al., PNAS (2004); e Kelly L Arnett et al., PNAS (2004)). Entretanto, OKT3 ou UCHT1 se ligam ao CD3 humano, mas não se ligam ao CD3 de macaco cinomolgo.

[00249] Na presente invenção, “reconhecimento,” isto é, “ligação,” significa ligação que não é adsorção não específica. Os exemplos de critérios

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46/152 para determinar se reconhecimento é alcançado ou não, isto é, a ligação é alcançada ou não, podem incluir uma constante de dissociação (daqui em diante, aludido como “Kd”). Preferivelmente, o anticorpo, etc. da presente invenção tem um valor de K_D de 1 x IO'⁵ M ou mais baixo, 5 x IO'⁶ M ou mais baixo, 2 x IO'⁶ M ou mais baixo, ou 1 x IO'⁶ M ou mais baixo for CD3.

[00250] Na presente invenção, a ligação do anticorpo ao antígeno pode ser ensaiada ou determinada usando um sistema de análise de interação biomolecular (por exemplo, SPR ou BLI), ELISA, ou RIA. A ligação do anticorpo ao antígeno expresso em uma superfície celular pode ser ensaiada pela citometria de fluxo.

[00251] O método de SPR (análise da ressonância plasmônica superficial) é usado como um método analítico para determinar uma constante de dissociação (valor KD), etc. como um índice para a afinidade medindo-se a constante da taxa de associação (valor ka) e a constante da taxa de dissociação (valor kd) pela análise cinética. Os exemplos de equipamento usado na análise SPR incluem BIAcore® (fabricado pela GE Healthcare), ProteOn® (fabricado pela Bio-Rad Laboratories,), SPR-Navi® (fabricado pela BioNavis), Spreeta® (fabricado pela Texas Instruments Inc.), SPRi-Plex II® (fabricado pela Horiba, Ltd.) e Autolab SPR® (fabricado pela Metrohm).

[00252] A BLI (interferometria de biocamada) é um método que envolve medir interaçõe4s biomoleculares usando interferência de biocamada. Os exemplos de equipamento usado na análise de interação BLI incluem o sistema Octet (fabricado pela Pall ForteBio Corp.).

[00253] ELISA é um método que envolve capturar um antígeno ou um anticorpo de interesse contido em uma solução de amostra usando um anticorpo ou antígeno específicos, enquanto detecta e quantifica o antígeno ou anticorpo de interesse através do uso de reação enzimática. Um antígeno ou anticorpo rotulados com enzima é incorporado no sistema de reação e a atividade enzimática é detectada. Para a detecção da atividade enzimática, um

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 53/238 / 152 substrato cujo espectro de absorção é trocado pela reação é usado e o espectro de absorção é digitalizado pela medição de absorbância.

[00254] ELISA celular é um método que envolve capturar um análito na superfície da célula em uma base de célula por célula, enquanto detecta e quantifica o análito através do uso de uma reação enzimática.

[00255] RIA (radio imunoensaio) pode quantificar um anticorpo pela rotulação do anticorpo com um material radioativo e medindo a radioatividade do anticorpo.

[00256] Citometria de fluxo é um método usado para analisar opticamente células individuais pela dispersão de células finas em um fluido e fluindo um fluxo fino do fluido. Um anticorpo rotulado com corante fluorescente se liga à superfície celular de um antígeno através de uma reação de antígeno-anticorpo e o número de células ligadas ao anticorpo é medido usando intensidade de fluorescência que indica a atividade de ligação a antígeno do anticorpo.

[00257] Como mencionado acima, um anticorpo, etc. que se liguem ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo podem ser submetidos aos vários testes de eficácia ou segurança usando primatas, particularmente, macacos cinomolgos, que é essencial para o desenvolvimento não clínico (desenvolvimento pré-clínico) de produtos farmacêuticos e assim preferidos. Também, um anticorpo, etc. que se ligue ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo tem atividade citotóxica e é útil, sozinho ou como uma molécula da presente invenção, no tratamento ou prevenção de doenças tais como cânceres em seres humanos e macacos cinomolgos. As composições farmacêuticas são descritas abaixo.

[00258] Um anticorpo, etc. da presente invenção que se liga ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo não se liga ao CD3 de camundongo. Portanto, vários ensaios ou testes imunoistoquímicos usando células, tecidos, ou indivíduos de camundongo transfectados com o gene de CD3 humano

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48/152 (incluindo animais transgênicos, animais inativados e animais modificados) e o anticorpo, etc. pode ser realizados sem serem influenciados pelo CD3 dos camundongos hospedeiros. Assim, o anticorpo, etc. são preferidos para o uso em pesquisa e desenvolvimento não clínico nos camundongos de fármacos, fármacos de animal e fármacos de diagnóstico compreendendo o anticorpo, etc.

(3-3) Anticorpo monoclonal [00259] A presente invenção provê anticorpos monoclonais. Estes anticorpos monoclonais incluem, por exemplo, anticorpos monoclonais derivados de animal não humano tais como anticorpos de rato, camundongo, coelho, galinha e peixe, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, mutantes de anticorpo destes anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno e variantes destes anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno.

[00260] Por exemplo, C3-147 obtido pelo método descrito no Exemplo 1 é um anticorpo monoclonal anti-CD3 de rato.

[00261] A sequência de nucleotídeo de um DNA codificando a região variável de cadeia pesada de C3-147 é descrita na SEQ ID NO: 6 (Figura 14) da Listagem de Sequências e a sua sequência de aminoácido é descrito na SEQ ID NO: 7 (Figura 15). A sequência de nucleotídeo de um DNA codificando a região variável de cadeia leve de C3-147 é descrita na SEQ ID NO: 8 (Figura 16) da Listagem de Sequências e a sua sequência de aminoácido é descrita na SEQ ID NO: 9 (Figura 17).

[00262] O mutante de anticorpo da presente invenção preferivelmente pode exibir, por exemplo, sensibilidade reduzida à degradação ou oxidação da proteína, atividades ou funções biológicas melhoradas ou mantidas, redução ou deterioração suprimidas de tais atividades ou funções biológicas, uma capacidade melhorada para se ligarem ao(s) antígeno(s), ou propriedades físico-químicas ou funcionais comunicadas a este(s). E habitualmente

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49/152 conhecido que uma cadeia lateral de um aminoácido específico em uma proteína pode ser alterada, alterando deste modo uma atividade ou função da proteína. Os exemplos de tais alterações incluem a desamidação de uma cadeia lateral de aspartato e isomerização de uma cadeia lateral de aspartato. Mutantes de anticorpo da presente invenção incluem aqueles em que um ou mais aminoácidos são substituídos com outros aminoácidos para prevenir tais alterações.

[00263] Os exemplos destes mutantes de anticorpo da presente invenção incluem anticorpos tendo uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido do anticorpo original pela substituição de aminoácido conservativa. A substituição de aminoácido conservativa é a substituição que ocorre em um grupo de aminoácido relacionado com as cadeias laterais de aminoácido.

[00264] Os grupos de aminoácido preferidos são como segue: um grupo ácido incluindo ácido aspártico e ácido glutâmico; um grupo básico incluindo lisina, arginina e histidina; um grupo não polar incluindo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano; e uma família polar não carregada incluindo glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina. Outros grupos de aminoácido preferidos são como segue: um grupo hidróxi alifático incluindo serina e treonina; um grupo contendo amida incluindo asparagina e glutamina; um grupo alifático incluindo alanina, valina, leucina e isoleucina; e um grupo aromático incluindo fenilalanina, triptofano e tirosina. A substituição de aminoácido em um mutante de anticorpo é preferivelmente realizada sem reduzir a atividade de ligação a antígeno do anticorpo original.

[00265] A presente invenção também abrange um mutante de anticorpo tendo uma sequência de aminoácido, que é derivada da sequência de aminoácido composta de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com (1) mencionado acima, por exemplo, C3-147, em que

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50/152 uma substituição de aminoácido conservativa e/ou alguma outra mutação de aminoácido ocorre (ou é realizado); um anticorpo de camundongo, um anticorpo de rato, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano composto de CDRs tendo uma sequência de aminoácido em que uma mutação de aminoácido conservativa e/ou alguma outra mutação de aminoácido ocorre (ou é realizada) na sequência de aminoácido de qualquer uma de CDRH1 a CDRH3 e CDRL1 a CDRL3 derivadas de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com (1) mencionado acima, por exemplo, C3-147; um fragmento de ligação a antígeno de qualquer um destes mutantes de anticorpo e anticorpos mutados; e uma molécula compreendendo um tal mutante de anticorpo, anticorpos mutados ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

(3-4) Fragmento de ligação a antígeno de anticorpo anti-CD3 [00266] De acordo com um aspecto, a presente invenção provê um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-CD3 da presente invenção. Um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo significa um fragmento que mantém pelo menos atividade de ligação a antígeno entre as funções do anticorpo, ou uma variante do mesmo. Os exemplos de funções do anticorpo geralmente incluem atividade de ligação a antígeno, atividade reguladora da atividade de antígeno, atividade citotóxica celular dependente de anticorpo e atividade citotóxica dependente de complemento. Os exemplos de funções de um anticorpo, etc. da presente invenção e uma molécula multiespecífica compreendendo o anticorpo, etc. da presente invenção incluem a redireção de células T, a ativação de células T e atividade citotóxica contra células cancerosas pela ativação de células T.

[00267] O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo não é particularmente limitado contanto que o fragmento do anticorpo mantenha pelo menos atividade de ligação a antígeno entre as atividades do anticorpo. Os exemplos incluem, mas não são limitados a Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fv de

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51/152 cadeia única (scFv) compreendendo Fvs de cadeia pesada e leve ligados por intermédio de um ligante apropriado e anticorpo de domínio único (sdAb). O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção também é intencionado incluir uma molécula compreendendo o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção assim como outras porções, tais como scFv retendo uma porção de ligante.

[00268] Uma molécula que é derivada de uma proteína de anticorpo pela deleção de 1 ou mais ou mais aminoácidos no seu terminal amino e/ou terminal carboxila e retém pelo menos uma porção das funções do anticorpo também é abrangida no significado do fragmento de ligação a antígeno do anticorpo. Uma tal variante de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo também é abrangida pelo anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou um variante (descrita mais tarde) do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno.

[00269] De acordo com um aspecto, o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção é scFv. O scFv é obtido ligando-se as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo por intermédio de um polipeptídeo ligante (Pluckthun A., The Pharmacology of Monoclonals Antibodies 113, Rosenburg e Moore, ed., Springer Verlag, Nova Iorque, 269315 (1994); e Nature Biotechnology (2005), 23, 1126-1136). Também, scFv em tandem compreendendo dois scFvs ligados por intermédio de um polipeptídeo ligante pode ser usado como uma molécula biespecifica. Altemativamente, triacorpos e tais compreendendo três ou mais scFvs podem ser usados como uma molécula multiespecífica.

[00270] O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo que tenha uma única região variável de cadeia pesada e não tenha nenhuma sequência de cadeia leve. Um tal anticorpo, chamado de um anticorpo de domínio único (sdAb) ou um nanocorpo, foi relatado reter a capacidade para se ligar a um antígeno (Muyldemans S. et al., Protein Eng., (1994), 7 (9),

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1129-35; e Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993), 363 (6428), 446-448). Estes anticorpos também são abrangidos no significado de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a presente invenção.

[00271] A presente invenção também inclui uma imunoglobulina de cadeia única compreendendo sequências de cadeias pesada e leve inteiras do anticorpo ligado por intermédio de um ligante apropriado (Lee, H-S, et al., Molecular Immunology (1999) 36, 61-71; e Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2 (1), 1-4). Uma tal imunoglobulina de cadeia única pode ser dimerizada para reter uma estrutura e atividades similares àquelas do anticorpo, que é originalmente um tetrâmero.

(3-5) Moléculas tendo atividade de ligação a antígeno [00272] A molécula da presente invenção compreende o anticorpo antiCD3 da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00273] A molécula da presente invenção pode compreender ainda, por exemplo, uma sequência de sinal, uma etiqueta para purificação, Gly de terminal amino, uma porção de ligante de fármaco de ADC, um polipeptídeo de ligação a albumina, um polímero tal como PEG, um anticorpo outro que não o anticorpo anti-CD3, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo e uma proteína tendo atividade de ligação a antígeno sem ter um esqueleto de imunoglobulina, que será descrito abaixo.

[00274] A molécula da presente invenção se liga ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[00275] A molécula da presente invenção inclui uma molécula multiespecífica descrita abaixo.

[00276] A molécula da presente invenção pode ser uma forma de ser introduzida dentro de uma célula ou uma forma de ser demonstrada na superfície celular, tal como CAR-T, etc.

(3-6) Moléculas multiespecíficas e moléculas biespecíficas [00277] A molécula multiespecífica da presente invenção é uma

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53/152 molécula tendo dois ou mais sítios de ligação de antígeno. Especificamente, a molécula multiespecífica da presente invenção é uma molécula capaz de ligarse a dois ou mais epítopos diferentes um do outro em uma molécula, ou epítopos diferente um do outro em duas ou mais moléculas e compreende uma pluralidade de fragmentos de ligação a antígeno diferentes um do outro. Os exemplos de moléculas multiespecíficas incluem, mas não são limitados a moléculas multiespecíficas tipo IgG e moléculas multiespecíficas tendo dois ou mais tipos de regiões variáveis, por exemplo, fragmentos de anticorpo tais como scFv em tandem, diacorpos de cadeia única, diacorpos, triacorpos e fragmentos de anticorpo ligados por uma ligação covalente ou uma ligação não covalente. A molécula multiespecífica pode conter Fc.

[00278] Uma molécula multiespecífica da presente invenção compreende um anticorpo anti-CD3 da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo. A molécula multiespecífica da presente invenção compreende um anticorpo, etc. da presente invenção e 1 ou 2 ou mais anticorpos adicionais ou fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos. Os exemplos de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo incluem Fab, F(ab)’, Fv, scFv e sdAb.

[00279] A molécula multiespecífica da presente invenção especificamente se liga ao CD3 ou pode ligar-se ainda a um alvo tal como um receptor de Fc nas células efetoras.

[00280] Os exemplos preferidos de moléculas multiespecíficas da presente invenção incluem moléculas biespecífica. O termo “biespecífico” significa a capacidade de ligação a dois epítopos diferentes um do outro em uma molécula, ou epítopos diferentes um do outro em duas moléculas. Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno tendo tal biespecificidade é abrangido pela presente invenção. Uma molécula biespecífica da presente invenção se liga ao CD3 e se liga a um epítopo que é ausente de CD3, mas presente em um outro antígeno. Mais especificamente, uma tal molécula

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54/152 biespecífica (i) se liga a um epítopo no CD3 (epítopo 1) e (ii) se liga a um epítopo diferente do epítopo 1 no CD3 (epítopos 2), ou se liga a um epítopo em um antígeno outro que não CD3 (epítopo 3).

[00281] Por exemplo, em uma molécula biespecífica tipo scFv em tandem tipificada por BiTE, um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia pesada de um primeiro anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve do primeiro anticorpo são ligados por intermédio de um ligante ou diretamente sem um ligante para formar um primeiro polipeptideo. Também, um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia pesada de um segundo anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve do segundo anticorpo são ligados por intermédio de um ligante ou diretamente sem um ligante para formar um segundo polipeptideo. O primeiro polipeptideo e o segundo polipeptideo são ligados por intermédio de um ligante ou diretamente sem um ligante. Altemativamente, o primeiro polipeptideo e o segundo polipeptideo podem ser ligados por intermédio de uma molécula adicional.

[00282] Em uma molécula biespecífica tipo diacorpo, um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia pesada de um primeiro anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve de um segundo anticorpo são ligados por intermédio de um ligante ou diretamente sem um ligante. Também, um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia leve do primeiro anticorpo e um sítio de ligação de antígeno na região variável de cadeia pesada do segundo anticorpo são ligados por intermédio de um ligante ou diretamente sem um ligante. Também, uma molécula biespecífica pode ser preparada pela dimerização adicional de moléculas biespecíficas tipo diacorpo. Além disso, a molécula biespecífica tipo diacorpo pode ser ligada a uma cadeia única ou ambas as cadeias de Fc por intermédio de um ligante (molécula biespecífica tipo diacorpo-Fc).

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55/152 [00283] Em uma molécula biespecífica tipo scFv dual, dois scFvs a serem ligados aos epítopos diferentes são ligados às duas cadeias de Fc dimérico, por intermédio de ligantes ou diretamente sem ligantes. Altemativamente, dois tipos de scFvs a serem ligados a epítopos diferentes são ligados a CH e CL, respectivamente, por intermédio de ligantes e ligados ainda às duas cadeias de Fc dimérico, respectivamente, por intermédio de ligantes.

[00284] Em uma molécula biespecífica tipo IgG, dois Fabs a serem ligados aos epítopos diferentes são ligados às duas cadeias de Fc dimérico, por intermédio de ligantes ou diretamente sem ligantes.

[00285] Altemativamente, uma molécula biespecífica da presente invenção pode ser um anticorpo biespecífico em que Fab e scFv a serem ligados aos epítopos diferentes são ligados às duas cadeias de Fc dimérico, por intermédio de ligantes ou diretamente sem ligantes. Altemativamente, uma molécula biespecífica da presente invenção pode ser uma molécula biespecífica em que Fab no primeiro anticorpo e scFv no segundo anticorpo são ligados às duas cadeias de Fc dimérico por intermédio de ligantes.

[00286] O scFv e o Fab contidos em uma molécula biespecífica da presente invenção são preferivelmente scFv e Fab de um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano e o Fc é preferivelmente Fc de um anticorpo humano.

[00287] Em uma região variável compreendida em um anticorpo biespecífico da presente invenção, uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve podem ligar-se nesta ordem, ou uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada podem ligar-se nesta ordem, a partir do terminal amino. Um anticorpo biespecífico da presente invenção opcionalmente tem um ligante entre ambas as regiões variáveis e pode (opcionalmente) ter um resíduo de glicina no terminal amino de uma região variável que é colocada no lado do terminal amino. Um

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56/152 anticorpo biespecífico do tipo scFv em tandem da presente invenção opcionalmente tem um ligante, etiqueta FLAG, e/ou etiqueta HIS no terminal carboxila de uma região variável que é colocada no lado do terminal carboxila. Os exemplos preferíveis de anticorpos biespecíficos da presente invenção incluem um anticorpo biespecífico, em que uma região variável de cadeia pesada, um primeiro ligante, uma região variável de cadeia leve, um segundo ligante, uma etiqueta FLAG e etiqueta His ligados nesta ordem a partir do terminal amino.

[00288] O ligante também inclui um polipeptídeo de cadeia única ou um oligopeptídeo de cadeia única, ou produtos sintéticos tais como PEG, nucleotídeos, cadeias de açúcar e compostos. Além disso, qualquer ligante conhecido na técnica pode ser usado sem limitações particulares contanto que o ligante ligue dois polipeptídeos.

[00289] O comprimento do ligante é de 5 a 30 aminoácidos para, por exemplo, um ligante de peptídeo. Quando a molécula biespecífica contém uma pluralidade de ligantes, todos os ligantes de peptídeo usados podem ter o mesmo comprimento ou os ligantes de peptídeo usados podem ter comprimentos diferentes.

[00290] Um exemplo de um ligante de peptídeo é uma unidade de repetição (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser). Um ou mais resíduos de aminoácido outros que não Gly e Ser podem ser adicionados.

(3-7) Anticorpos anti-CD3 humanizados [00291] De acordo com um aspecto, a presente invenção provê um anticorpo humanizado anti-CD3 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[00292] Os exemplos de anticorpos humanizados da presente invenção incluem anticorpos derivados de ser humano contendo apenas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (Nature (1986) 321, 522-525) e anticorpos humanos enxertados com sequências de CDR e a alguns resíduos

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57/152 de aminoácido de regiões de arcabouço pelo enxerto de CDR (Publicação Internacional No. W01990/07861A1).

[00293] Preferivelmente, a região variável de cadeia pesada contida em um anticorpo humanizado anti-CD3 da presente invenção ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo retêm

CDRH1 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 26 (Figura 24) (GVTFNYYG) e CDRH2 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 98 (Figura 112) (IT Xaa Xaa GGRI) (em que o primeiro Xaa e o segundo Xaa cada um representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário. Daqui em diante, o primeiro Xaa também é aludido como Xi e o segundo Xaa também é aludido como X₂.) e

CDRH3 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 28 (Figura 26) (TLDGRDGWVAY).

[00294] Também preferivelmente, a região variável de cadeia leve contida em um anticorpo humanizado anti-CD3 da presente invenção ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo retêm

CDRL1 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 29 (Figura 27) (TGNIGSNY),

CDRL2 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 99 (Figura 113) (R Xaa D) (em que Xaa representa um resíduo de aminoácido natural arbitrário. Daqui em diante, Xaa de CDRL2 também é aludido como X3.), e

CDRL3 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 31 (Figura 29) (QSYSSGFI).

[00295] Na CDRH2 (ITX1X2GGRI) mencionada acima, preferivelmente, Xi é selecionado de um grupo consistindo em A, E, G, Η, I, L, T, V, R e S e X₂ é S; ou Xi é N e X₂ é selecionado de um grupo consistindo em E, R, F, Y, L, V, I, K e T.

[00296] Na CDRL2 (RX3D) mencionada acima, preferivelmente, X3 é

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58/152 selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N e D.

[00297] Na CDRH2 (ITX1X2GGRI) mencionada acima, mais preferivelmente, Xi é selecionado de um grupo consistindo em R e S e X2 é S.

Na CDRL2 (RX3D) mencionada acima, mais preferivelmente, X3 é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N e D.

[00298] Os exemplos preferidos de regiões variáveis de cadeia pesada contidas em tais anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo incluem uma região variável de cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácido representados pela SEQ ID NO: 100 (Figura 114).

[00299] Também, os exemplos preferidos de regiões variáveis de cadeia leve contidas nos anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo incluem [00300] uma região variável de cadeia leve compreendendo os resíduos de aminoácido representados pela SEQ ID NO: 101 (Figura 115), SEQ ID NO: 102 (Figura 116), ou SEQ ID NO: 103 (Figura 117).

[00301] Os exemplos preferidos específicos de regiões variáveis de cadeia pesada contidas nos anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo incluem uma região variável de cadeia pesada que retém

CDRH1 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 26 (Figura 24) (GVTFNYYG),

CDRH2 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 27 (Figura 25) (ITNSGGRI), e

[00302] Os exemplos preferidos específicos de regiões variáveis de cadeia leve contidas nos anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo incluem

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59/152 [00303] uma região variável de cadeia leve que retém

CDRL2 consistindo da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 30 (Figura 28) (RDD), e

[00304] Na presente invenção, as posições e comprimentos de CDRs foram determinados de acordo com as definições IMGT (Desenvolvimental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77).

[00305] Os exemplos específicos de regiões variáveis de cadeia pesada da presente invenção incluem sequência de aminoácidos compreendendo resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 16.

[00306] Os exemplos específicos de regiões variáveis de cadeia leve da presente invenção incluem uma sequência de aminoácido compreendendo resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 17, 20 ou 23.

[00307] Os exemplos preferidos específicos de anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo incluem um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60 e uma região variável de cadeia leve compreendendo o 135° a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64,

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60/152 um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ

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ID NO: 76, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.

[00308] Os exemplos específicos de anticorpos humanizados anti-CD3 ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção incluem um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 16, um Iigante e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 20 e 23.

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62/152 [00309] Nas regiões variáveis compreendidas nos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos da presente invenção, uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve podem ligar-se nesta ordem, ou uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada podem ligar-se nesta ordem, a partir do terminal amino. As regiões variáveis podem compreender um resíduo de glicina nos seus terminais amino. Um ligante, etiqueta FLAG, e/ou etiqueta HIS podem ligar-se na extremidade de terminais carboxila das regiões variáveis.

[00310] Os exemplos preferidos específicos de anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo incluem um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22, e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25.

[00311] Os exemplos mais preferidos específicos de anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo incluem um anticorpo (Clone ID: C3E-7078) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60 (Figura 68), um anticorpo (Clone ID: C3E-7085) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64 (Figura 72), um anticorpo (Clone ID: C3E-7086) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66 (Figura 74),

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63/152 um anticorpo (Clone ID: C3E-7087) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68 (Figura 76), um anticorpo (Clone ID: C3E-7088) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70 (Figura 78), um anticorpo (Clone ID: C3E-7089) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72 (Figura 80), um anticorpo (Clone ID: C3E-7090) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74 (Figura 82), um anticorpo (Clone ID: C3E-7091) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76 (Figura 84), um anticorpo (Clone ID: C3E-7092) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78 (Figura 86), um anticorpo (Clone ID: C3E-7093) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80 (Figura 88), um anticorpo (Clone ID: C3E-7094) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82 (Figura 90), e um anticorpo (Clone ID: C3E-7095) ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os I^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84 (Figura 92).

[00312] Os exemplos preferidos específicos de anticorpos humanizados anti-CD3 da presente invenção ou fragmentos de ligação a

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64/152 antígeno do anticorpo, em que uma região variável de cadeia pesada, um ligante e uma região variável de cadeia leve ligam-se nesta ordem na extremidade de terminal amino e adicionalmente, um segundo ligante, etiqueta FLAG e etiqueta HIS ligam-se na extremidade de terminal carboxila da região variável de cadeia leve, incluem anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo escritos em (16) mencionados acima que compreendem uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 267° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 267° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78,

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 71/238 / 152 uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.

[00313] O anticorpo, etc. da presente invenção podem ser uma molécula incluindo um anticorpo, etc. que compreenda uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada e/ou uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve que sejam 70%, 71%, 72%, 73%, 74%,75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% as mesmas como a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada e/ou a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve contidas no anticorpo anti-CD3 mencionado acima da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e se ligue ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

[00314] O anticorpo etc. da presente invenção pode ser um anticorpo cuja capacidade para ligar-se ao CD3 pode ser otimizada pela introdução de uma mutação ao anticorpo humanizado anti-CD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo anteriormente mencionados. Os exemplos específicos do método para introduzir uma mutação pode incluir mutagênese aleatória usando PCR propensa a erro, mutagênese de aminoácido loco-dirigida usando uma biblioteca NNK, mutagênese loco-dirigida usando informação de estrutura e combinações dos mesmos.

[00315] As atividades ADCC e CDC de um anticorpo, etc. da presente invenção podem ser reduzidas pela substituição de regiões constantes de modo a diminuir atividade efetora do anticorpo.

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66/152 [00316] Para evitar a citotoxicidade nas células normais expressando CD3 humano, é desejável que o anticorpo deva ter atividade efetora baixa. A atividade efetora é conhecida diferir entre subclasses de anticorpo. Por exemplo, IgG4 tem atividade baixa de ADCC e CDC e IgG2 tem atividade de CDC, mas atividade baixa de ADCC. Usando estes traços, um anticorpo com atividade reduzida de ADCC e CDC pode ser preparado substituindo-se as regiões constantes de IgGl com as regiões constantes de IgG2 ou IgG4. Também, um anticorpo IgGl com atividade reduzida de ADCC e CDC pode ser preparado pela substituição de uma porção das regiões constantes de IgGl com referência à IgG2 ou IgG4. Por exemplo, Marjan Hezareh et al., Journal of Virology, 75 (24): 12161-12168 (2001) mostram que a atividade de ADCC e CDC é reduzida substituindo-se os 234° e 235° resíduos de leucina (os números são fundamentados no índice EU de acordo com Kabat et al.) de IgGl com resíduos de alanina.

(3-8) Anticorpos que se ligam ao mesmo sítio e também se ligam ao CD3 de macaco cinomolgo [00317] Um “anticorpo que se liga ao mesmo sítio” como em inclui um anticorpo, etc. da presente invenção e “se liga ao CD3 de macaco cinomolgo” também inclui um anticorpo, etc. da presente invenção. O “anticorpo que se liga ao mesmo sítio” como no caso de um certo anticorpo significa um outro anticorpo que se liga a um sítio em uma molécula de antígeno reconhecida pelo anticorpo. Se um segundo anticorpo se liga a um peptideo parcial ou uma estrutura tridimensional parcial em uma molécula de antígeno ligado por um primeiro anticorpo, o primeiro e segundo anticorpos são determinados como ligando ao mesmo sítio.

[00318] Altemativamente, o primeiro e segundo anticorpos são determinados como ligando ao mesmo sítio pela confirmação de que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo quanto à ligação ao antígeno, isto é, o segundo anticorpo interfere com a ligação do primeiro

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 73/238 / 152 anticorpo ao antígeno, mesmo se a sequência de peptideo ou estrutura tridimensional do sítio de ligação específica não seja determinada.

[00319] Quando o primeiro e segundo anticorpos se ligam ao mesmo sítio e o primeiro anticorpo tem um efeito característico de um aspecto de um anticorpo da presente invenção, tal como atividade citotóxica, o segundo anticorpo também tem uma probabilidade muito alta de ter a mesma atividade.

[00320] Assim, se um segundo anticorpo anti-CD3 se liga a um sítio ligado por um primeiro anticorpo anti-CD3 e o segundo anticorpo anti-CD3 se liga ao CD3 de macaco cinomolgo, o primeiro e segundo anticorpos podem ser determinados como ligando ao mesmo sítio na proteína de CD3. Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que se ligam ao mesmo sítio no CD3 humano como aquele ligado por um anticorpo anti-CD3 da presente invenção ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e se ligam ao CD3 de macaco cinomolgo também são incluídos entre os anticorpos, etc. da presente invenção.

[00321] Altemativamente, o primeiro e segundo anticorpos anti-CD3 podem ser determinados como ligando ao mesmo sítio na proteína de CD3 pela confirmação de que o segundo anticorpo anti-CD3 compete com o primeiro anticorpo anti-CD3 quanto à ligação à proteína de CD3 e o segundo anticorpo anti-CD3 se liga ao CD3 de macaco cinomolgo. Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que competem com o anticorpo anti-CD3 da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo quanto à ligação ao CD3 humano e se ligam ao CD3 de macaco cinomolgo também são incluídos no antígeno, etc. da presente invenção.

[00322] O sítio de ligação de anticorpo pode ser determinado usando qualquer método bem conhecido por aqueles versados na técnica, tal como imunoensaio. Por exemplo, uma série de peptídeos pode ser preparada clivando-se de modo apropriadamente sequencial a sequência de aminoácido

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68/152 do antígeno a partir do seu terminal carboxila ou terminal amino e depois estudando a reatividade do anticorpo para determinar aproximadamente um sítio de reconhecimento. Depois, peptídeos mais curtos são sintetizados e a reatividade do anticorpo a estes peptídeos pode ser estudada para determinar o sítio de ligação. Os peptídeos fragmentos de antígeno podem ser preparados usando uma técnica tal como recombinação de gene ou síntese de peptídeo.

[00323] Um anticorpo, etc. da presente invenção reconhece e se liga a uma região constituindo a estrutura tridimensional de CD3, isto é, um domínio tipo Ig. Um tal sítio de ligação (epítopo) para o anticorpo pode ser determinado pela identificação de resíduos de aminoácido no antígeno adjacentes ao anticorpo usando análise estrutural de raio X.

(3-9) Variantes de anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos [00324] A presente invenção provê uma variante de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. A variante do anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo significa um anticorpo da presente invenção ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo provida com modificação química ou biológica. A variante química inclui, por exemplo, uma forma tendo um esqueleto de aminoácido conjugado com uma porção química e uma forma tendo uma cadeia de carboidrato quimicamente modificada ligada em N ou ligada em O. A variante biológica inclui, por exemplo, uma forma que sofreu modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação ligado em N ou ligado em O, processamento de uma região de terminal amino ou terminal carboxila, desamidação, isomerização de ácido aspártico, ou oxidação de metionina) e uma forma contendo um resíduo de metionina adicionado ao terminal amino pela expressão usando células hospedeiras procarióticas. Uma tal variante também é intencionada incluir uma forma rotulada para permitir a detecção ou isolação do anticorpo ou do antígeno da presente invenção, por exemplo, uma forma rotulada com

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69/152 enzima, uma forma fluorescentemente rotulada, ou uma forma rotulada com afinidade. Uma tal variante do anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é útil para melhorar a estabilidade e retenção no sangue do anticorpo original da presente invenção ou o fragmento de ligação a antígeno original do mesmo, reduzindo a antigenicidade e detectando ou isolando o anticorpo ou o antígeno, etc.

[00325] Os exemplos das porções químicas contidas nas variantes químicas incluem polímeros solúveis em água tais como polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano e álcool polivinílico.

[00326] Os exemplos de variantes biológicas incluem formas modificadas pelo tratamento enzimático ou tratamento celular, formas fundidas com outros peptídeos, tais como uma etiqueta, adicionadas pela recombinação genética e formas preparadas a partir de células hospedeiras expressando uma enzima modificadora de cadeia de açúcar endógena ou exógena.

[00327] Uma tal modificação pode ser feita em uma posição arbitrária ou em uma posição desejada no anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Alternativamente, a mesma ou modificações diferentes podem ser feitas em uma ou duas ou mais posições neles.

[00328] Na presente invenção, uma “variante de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo” também é intencionada incluir um “fragmento de uma variante de um anticorpo.” [00329] Por exemplo, a cadeia pesada de um anticorpo produzida pelas células de mamífero cultivadas é conhecida carecer de um resíduo de lisina no terminal carbóxi (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). Também, a cadeia pesada de um tal anticorpo é conhecida carecer de dois resíduos de aminoácido (glicina e lisina) no terminal carbóxi e ao invés têm um resíduo de prolina amidado no terminal carbóxi (Analytical Biochemistry,

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360: 75-83 (2007)). Além disso, um resíduo de glutamina ou ácido glutâmico de terminal N (amino) na cadeia pesada ou leve de um anticorpo é conhecido ser modificado pela piroglutamilação durante a preparação do anticorpo e o anticorpo da presente invenção pode ter uma tal modificação (Publicação Internacional No. WO2013/147153A1).

[00330] As deleções nestas sequências de cadeia pesada ou modificações nestas sequências de cadeia pesada ou leve, entretanto, não influenciam em muito a capacidade do anticorpo para ligar-se ao antígeno e suas funções efetoras (ativação de complemento, efeitos citotóxicos dependentes de anticorpo, etc.). Assim, a presente invenção também abrange anticorpos que foram submetidos à deleção ou modificação (daqui em diante aludido como “variantes de deleção”). Os exemplos incluem uma variante de deleção derivada de uma cadeia pesada pela deleção de 1 ou 2 aminoácidos no terminal carboxila, uma forma amidada da variante de deleção (por exemplo, uma cadeia pesada tendo um resíduo de prolina amidado no sítio de terminal carboxila) e um anticorpo tendo um resíduo de terminal amino piroglutamilado na sua cadeia pesada ou leve. Entretanto, uma variante de deleção na cadeia pesada e leve do terminal carboxila do anticorpo de acordo com a presente invenção não é limitada aos tipos descritos acima contanto que a variante de deleção retenha pelo menos alguma capacidade para ligar-se ao antígeno. Duas ou mais cadeias (por exemplo, cadeias pesadas) presentes em um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser cadeias (por exemplo, cadeias pesadas) de qualquer tipo selecionadas de um grupo consistindo em cadeias completas (por exemplo, cadeias pesadas) e as variantes de deleção descritas acima, assim como qualquer combinação de duas ou mais cadeias (por exemplo, cadeias pesadas) de quaisquer dois tipos selecionados destes. A razão quantitativa ou molecular de cada variante de deleção pode ser influenciada pelo tipo de células de mamífero cultivadas produzindo o anticorpo de acordo com a presente invenção e condições de

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71/152 cultura. Os exemplos incluem a deleção feita no resíduo de aminoácido do terminal carboxila de cada uma das duas cadeias pesadas como componentes principais do anticorpo de acordo com a presente invenção. Na presente invenção, uma “variante de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo” também é intencionada incluir um “fragmento de uma variante de um anticorpo.” [00331] A atividade citotóxica celular dependente de anticorpo do anticorpo da presente invenção pode ser realçada regulando-se a modificação (glicosilação, desfucosilação, etc.) da cadeia de açúcar ligada com o anticorpo. Por exemplo, Publicações Internacionais Nos. WO99/54342A1, WOOO/61739A1 e W002/31140A1 tomam conhecida uma técnica para regular a modificação da cadeia de açúcar de um anticorpo, embora esta técnica não seja limitada a isso. Um anticorpo da presente invenção e fragmento de ligação a antígeno do anticorpo também incluem um anticorpo e um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que sofreram modificação da cadeia de açúcar assim regulada.

[00332] Na presente invenção, “deleções” e “modificações” de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e mistura do mesmo caem dentro do escopo do “anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo”. E, “deleções” e “modificações” de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e misturas dos mesmos caem dentro do escopo de “um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo” compreendido em uma molécula que se liga a um antígeno, molécula multiespecífica, molécula biespecífica ou semelhante da presente invenção que é divulgado em (3-5) e (3-6).

4. Produção de anticorpos (4-1) Método usando hibridoma [00333] De acordo com um aspecto da presente invenção, células produzindo anticorpo anti-CD3 são isolados dos baços de animais imunizados

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72/152 com a proteína CD3 de acordo com, por exemplo, o método de Kohler e Milstein (Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonals Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)). As células são fundidas com células de mieloma para estabelecer hibridomas. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de culturas destes hibridomas.

(4-1-1) Preparação de antígeno [00334] O antígeno para a preparação de um anticorpo anti-CD3 pode ser obtido de acordo com, por exemplo, o método para preparar uma proteína de CD3 nativa ou recombinante (antígeno CD3ay humano de cadeia única). Os exemplos de antígenos que podem ser assim preparados incluem a proteína CD3, fragmentos de proteína CD3 e derivados dos mesmos compreendendo ainda uma sequência de aminoácidos arbitrária ou carreador adicionados (daqui em diante, coletivamente aludidos como “CD3”).

[00335] O CD3 nativo pode ser purificado e isolado, por exemplo, de células ou culturas derivadas de tecido humano das células. O antígeno recombinante de CD3ay humano de cadeia única pode ser preparado transfectando-se células hospedeiras com um gene compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido do antígeno de CD3ay humano de cadeia única e recuperar o antígeno das culturas das células. O CD3 obtido pela síntese de proteína livre de célula em um sistema de tradução in vitro de um gene compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido do antígeno de CD3 também é incluído entre “antígenos de CD3” da presente invenção.

(4-1-2) Produção de anticorpos monoclonais anti-CD3 [00336] Um anticorpo monoclonal é tipicamente produzido pelas seguintes etapas:

(a) preparar um antígeno, (b) preparar células que produzem anticorpo,

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73/152 (c) preparar células de mieloma (daqui em diante, aludidas como “mielomas”), (d) fundir as células que produzem anticorpo com os mielomas, (e) triar quanto a um grupo de hibridoma que produz o anticorpo de interesse, e (f) obter clones de célula única (clonagem).

[00337] Este método de produção envolve ainda (g) uma etapa de cultivar os hibridomas, uma etapa de criar animais transplantados com hibridoma, etc. e (h) uma etapa de ensaiar ou determinar a atividade biológica do anticorpo monoclonal, etc., se necessário.

[00338] Este método para preparar anticorpos monoclonais serão agora descritos em detalhes com referência a estas etapas. Entretanto, o método para preparar o anticorpo não é limitado a estas etapas. Por exemplo, as células que produzem anticorpo outras que não as células de baço e mielomas podem ser usadas.

(a) Etapa de preparar antígenos [00339] Uma proteína de CD3 da presente invenção pode ser preparada pela purificação ou isolação de tecidos de animal (incluindo fluidos corporais), células derivadas dos tecidos, ou culturas das células, recombinação genética, síntese de proteína livre de célula, síntese química, etc.

(b) Etapa de preparar células que produzem anticorpo [00340] O antígeno obtido na etapa (a) é misturado com um adjuvante tal como um adjuvante completo ou incompleto de Freund ou alumino sulfato de sódio e animais de laboratório são imunizados com o imunógeno resultante. Qualquer animal de laboratório usado em um método de preparação de hibridoma conhecido na técnica pode ser usado sem limitações. Por exemplo, camundongos, ratos, cabras, ovelha, gado e cavalos podem ser

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74/152 usados. Do ponto de vista de células de mieloma prontamente disponíveis para serem fundidas com células isoladas que produzem anticorpo, etc., os animais a serem imunizados são preferivelmente camundongos ou ratos.

[00341] As cepas de camundongos ou ratos realmente usadas não são particularmente limitadas. No caso de camundongos, por exemplo, A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, ou 129 podem ser usados. No caso de ratos, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, SpragueDawley, ACI, BN, ou Fischer podem ser usados.

[00342] Estes camundongos e ratos são disponíveis de criadores ou distribuidores de animal de laboratório, por exemplo, CLEA Japan, Inc. ou Charles River Laboratories Japan, Inc.

[00343] Destes camundongos e ratos, uma cepa de camundongo BALB/c ou cepas de rato Wistar e Low são particularmente preferidos como animais a serem imunizados em consideração de compatibilidade de fusão com as células de mieloma descritas mais tarde.

[00344] Também, em consideração da homologia entre antígenos humanos e de camundongo, camundongos cujo mecanismo biológico para remover autoanticorpos foi reduzido, isto é, camundongos com doença autoimune, também são preferivelmente usados.

[00345] Neste contexto, estes camundongos ou ratos são preferivelmente de 5 a 12 semanas de idade e mais preferivelmente de 6 a 8 semanas de idade, no momento da imunização.

[00346] Os animais podem ser imunizados com a proteína de CD3 usando, por exemplo, o método de Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), ou Kabat, E. A. e Mayer, Μ. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964).

[00347] Os exemplos de métodos para determinar títulos de anticorpo

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75/152 podem incluir, mas não são limitados a imunoensaios tais como RIA e ELISA.

[00348] As células que produzem anticorpo derivadas de células do baço ou linfócitos separados dos animais imunizados, podem ser preparadas de acordo com um método conhecido na técnica, por exemplo, Kohler et al., Nature (1975) 256, 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, 550; ou Walsh, Nature (1977) 266, 495.

[00349] No caso de células do baço, um método geral pode ser adotado, que envolve picar os baços, filtrar as células em uma malha de aço inoxidável e depois flutuando as células resultantes em um meio essencial mínimo de Eagle (MEM) para separar as células que produzem anticorpo.

(c) Etapa de preparar mielomas [00350] As células de mieloma usadas na fusão de célula não são particularmente limitadas e podem ser selecionadas para o uso a partir de linhagens de célula conhecidas na técnica. Por exemplo, uma linhagem deficiente na hipoxantina-guanina fosforribosil transferase (HGPRT), isto é, X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.Ul (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Agl4 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, ou BU.l derivadas de camundongo, 210.RSY3.Ag.l.2.3 (Y3) derivada de rato, ou U266AR (SKO-007), GM1500-GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), ou 8226AR/NIP4-1 (NP41) derivada de ser humano, cujos procedimentos de triagem já foram estabelecidos, são preferivelmente usadas por conveniência na seleção de hibridomas a partir de células de fusão Estas linhagens deficientes em HGPRT estão disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC).

[00351] Estas linhagens de célula são subcultivadas em um meio apropriado, por exemplo, um meio de 8-azaguanina [meio RPMI-1640 suplementado com glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina e soro bovino fetal (daqui em diante, aludido como “FCS”) e suplementado ainda com 8

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76/152 azaguanina], um meio de Dulbecco modificado de Iscove (daqui em diante, aludido como “IMDM”), ou um meio de Eagle modificado de Dulbecco (daqui em diante, aludido como “DMEM”) e subcultivadas em um meio normal [por exemplo, meio ASF104 (fabricado pela Ajinomoto Co., Inc.) contendo 10% de FCS] durante 3 a 4 dias antes da fusão de célula para garantir que o número de células seja igual a ou maior do que 2 x 10⁷ células no dia da fusão de célula.

(d) Etapa de fundir células que produzem anticorpo com células de mieloma [00352] As células que produzem anticorpo podem ser fundidas com as células de mieloma sob condições que previnem a viabilidade de célula de ser excessivamente reduzida, de acordo com qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, Μ. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964)). Por exemplo, um método químico que envolve misturar células que produzem anticorpo com células de mieloma em uma solução em alta concentração de um polímero tal como polietileno glicol, ou um método físico usando estimulação elétrica pode ser usado.

(e) Etapa de triar quanto ao grupo de hibridoma que produz o anticorpo de interesse [00353] O método usado para selecionar hibridomas obtido pela fusão de célula não é particularmente limitado, mas um método de seleção de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Kohler et al., Nature (1975) 256, 495; Milstein et al., Nature (1977) 266, 550) é tipicamente usado. Este método é eficaz para obter hibridomas usando uma linhagem de célula de mieloma deficiente em HGPRT, que não pode sobreviver na presença de aminopterina. Especificamente, células e hibridomas não fundidos podem ser cultivados em um meio HAT para permitir que hibridomas resistentes à aminopterina vivam e cresçam seletivamente.

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77/152 (f) Etapa de obter clones de célula única (clonagem) [00354] Os hibridomas podem ser clonados usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, uma metil celulose, agarose mole, ou método de diluição limitante (por exemplo, Barbara, B.M. e Stanley, M.S.: Selected Methods in Celular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). O método da diluição limitante é preferido.

(g) Etapa de Cultivar hibridomas e etapa de criar animais transplantados com hibridoma [00355] Os hibridomas selecionados podem ser cultivados para produzir anticorpos monoclonais. Preferivelmente, os hibridomas desejados são clonados e depois submetidos à produção de anticorpo.

[00356] O anticorpo monoclonal produzido por um tal hibridoma pode ser recuperado de culturas do hibridoma. Também, um anticorpo recombinante pode ser recuperado de culturas de células transfectadas com o gene de anticorpo monoclonal. Altemativamente, o hibridoma pode ser injetado intraperitonealmente em camundongos da mesma cepa (por exemplo, BALB/cAnNCrj descritos acima) ou camundongos Nu/Nu e deixado crescer. Depois, os anticorpos monoclonais podem ser recuperados de sua ascite.

(h) Etapa de ensaiar ou determinar a atividade biológica de anticorpos monoclonais [00357] Vários testes biológicos podem ser selecionados e aplicados dependendo do propósito.

(4-2) Método de imunização de célula [00358] As células que expressam CD3 nativo ou células expressando CD3 recombinante ou seu fragmento podem ser usadas como imunógenos para preparar um anticorpo anti-CD3 usando o método do hibridoma descrito acima.

[00359] Os exemplos das células que expressam CD3 nativo incluem células do timo humano e linfócitos T. Estas células que expressam CD3 são

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78/152 usadas em uma quantidade de 1 x IO⁵ a 1 x 10⁹ células, preferivelmente 1 x 10⁶ a 1 x IO⁸ células, mais preferivelmente 0,5 a 2 x 10⁷ células e ainda mais preferivelmente 1 x 10⁷ células, por dose de imunização. O número de células usadas para imunização pode ser mudado dependendo do nível de expressão de CD3. Os imunógenos são geralmente administrados intraperitonealmente mas podem ser administrados por uma via intradérmica. Os hibridomas podem ser preparados pela aplicação do método descrito na seção (4-1-2). (4-3) Método da imunização de DNA [00360] Um anticorpo anti-CD3 da presente invenção também pode ser obtido pelo uso de um método de imunização de DNA. Este método envolve transfectar um animal individual, por exemplo, camundongo ou rato, com um plasmídeo de expressão de antígeno e expressando o antígeno no indivíduo para deste modo induzir imunidade contra o antígeno. Os exemplos do método de transfecção incluem um método de injetar diretamente o plasmídeo no músculo, um método de injetar um reagente de transfecção tal como um lipossoma ou polietilenimina em uma veia, um método usando um vetor viral, um método de injetar partículas de ouro fixadas a plasmídeo usando uma pistola de gene e um método hidrodinâmico de injetar rapidamente uma quantidade grande de solução de plasmídeo em uma veia.

[00361] Um exemplo real de um anticorpo de rato anti-CD3 humano assim obtido é C3-147. A sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de C3-147 é mostrada na SEQ ID NO: 9 da Listagem de Sequências (Figura 17). A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de C3-147 é mostrada na SEQ ID NO: 7 da Listagem de Sequências (Figura 15).

(4-4) Recombinação genética [00362] De modo a preparar um anticorpo da presente invenção, um nucleotídeo (nucleotídeo de cadeia pesada) compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido da sua cadeia pesada e

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79/152 um nucleotídeo (nucleotídeo de cadeia leve) compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido da sua cadeia leve, ou um vetor tendo um inserto do nucleotídeo de cadeia pesada e um vetor tendo um inserto do nucleotídeo de cadeia leve, é introduzido nas células hospedeiras, as células são cultivadas e o anticorpo é recuperado da cultura. O nucleotídeo de cadeia pesada e o nucleotídeo de cadeia leve podem ser inseridos em um vetor.

[00363] As células procarióticas ou eucarióticas podem ser usadas como as células hospedeiras. Quando células hospedeiras eucarióticas são usadas, células animais, células vegetais, ou micróbios eucarióticos podem ser usados.

[00364] Os exemplos das células de animal incluem células derivadas de mamífero, isto é, células HEK293F células renais embrionárias humanas (Subedi GP et al., J Vis Exp. (2015) 106), células COS derivadas de rim de macaco (Gluzman, Y. Cell (1981), 23, 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblasto de camundongo NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), células do ovário do hamster chinês (células CHO, ATCC CCL-61), linhagens deficientes em diidrofoliato redutase das mesmas (CHOdhfr-; Uriaub, G. e Chasin, L.A. PNAS (1980), 77, 4126-4220), células derivadas de pássaros tais como galinhas e células derivadas de insetos.

[00365] Também, células modificadas para realçar as atividades biológicas de anticorpos pela modificação de estruturas de cadeia de açúcar podem ser usadas como os hospedeiros. Por exemplo, células CHO modificadas de modo que a proporção de cadeias de açúcar com fucose não ligadas com N-acetilglicosamina nas suas extremidades redutoras seja de 20% ou mais entre cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo tipo complexo a serem ligadas à região Fc do anticorpo, podem ser usadas para preparar um anticorpo tendo atividade de ADCC realçada ou atividade de CDC (Publicação Internacional No. W002/31140A1).

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80/152 [00366] Os exemplos de micróbios eucarióticos incluem leveduras. Os exemplos das células procarióticas incluem E. coli e Bacillus subtilis.

[00367] Um peptídeo de sinal para a secreção de um anticorpo da presente invenção (anticorpos monoclonais derivados de cada animal, anticorpos de rato, anticorpos de camundongo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, etc.) não é limitado ao sinal secretor de um anticorpo da mesma espécie, do mesmo tipo, ou do mesmo subtipo como o anticorpo da presente invenção ou ao sinal secretor do próprio anticorpo da presente invenção. Qualquer sinal secretor de um anticorpo de um tipo ou subtipo diferentes ou qualquer sinal secretor de uma proteína derivada de uma espécie eucariótica ou espécie procariótica diferentes podem ser selecionados e usados.

[00368] Um anticorpo secretado, etc. contendo o peptídeo de sinal também é abrangido pelo anticorpo, etc. da presente invenção ou pela molécula da presente invenção.

(4-5) Métodos para projetar e preparar anticorpos humanizados [00369] Os exemplos de anticorpos humanizados incluem, mas não são limitados a, anticorpos derivados de ser humano tendo CDRs substituídas com as CDRs de anticorpos de animal não humano (ver Nature (1986), 321, p. 522-525), anticorpos humanos enxertados às sequências de CDR e alguns resíduos de aminoácido de regiões de arcabouço pelo enxerto de CDR (ver W090/07861A1 e US6972323B2) e anticorpos tendo um ou mais aminoácidos de anticorpo humano substituídos por um ou mais aminoácidos derivados de anticorpo de animal não humano em qualquer um destes anticorpos humanizados.

(4-6) Método para preparar anticorpos humanos [00370] Outros exemplos de anticorpos da presente invenção incluem anticorpos humanos. Anticorpo humano anti-CD3 significa um anticorpo antiCD3 consistindo da sequência de aminoácido de um anticorpo derivado de ser

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81/152 humano. Um anticorpo humano anti-CD3 pode ser obtido por um método usando camundongos que produzem anticorpo humano carregando fragmentos de DNA genômico humano compreendendo genes da cadeia pesada e leve de anticorpo humano (ver por exemplo, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e lijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (2000) 97, 722-727).

[00371] Especificamente, animais que produzem anticorpo humano podem ser preparados rompendo-se os locais de gene de cadeia pesada e leve da imunoglobulina endógena de mamíferos não humanos e introduzindo locais de gene da cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana por intermédio de, por exemplo, vetores de cromossoma artificial de levedura (YAC). Altemativamente, as células eucarióticas podem ser transformadas com cDNAs codificando as cadeias pesada e leve, respectivamente, de um tal anticorpo humano, preferivelmente com vetores compreendendo os cDNAs, por uma técnica de recombinação de gene. As células transformadas que produzem um anticorpo humano monoclonal recombinante podem ser cultivadas. Este anticorpo pode ser obtido do sobrenadante de cultura.

[00372] Neste contexto, por exemplo, as células eucarióticas, preferivelmente células de mamífero tais como células HEK293F ou células CHO, podem ser usadas como os hospedeiros.

[00373] Também, um método para obter um anticorpo humano derivado da demonstração em fago selecionado de uma biblioteca de anticorpo humano também é conhecido. Por exemplo, um método de demonstração em fago pode ser usado que envolve deixar que as regiões variáveis de um anticorpo humano sejam expressas como scFv em uma superfície de fago e selecionar o fago que se ligue ao antígeno. Um fago

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82/152 selecionado com base na sua capacidade para ligar-se ao antígeno pode ser submetido à análise de gene para determinar sequências de DNA codificando as regiões variáveis do anticorpo humano que se ligam ao antígeno. Se a sequência de DNA de scFv que se liga ao antígeno é determinada, um vetor de expressão com essa sequência pode ser preparado e introduzido em um hospedeiro adequado para permitir que eles expressem o anticorpo humano (W092/01047A1, WO92/20791 Al, WO93/06213 Al, WO93/11236 Al, WO93/19172 Al, WO95/01438 Al, WO95/15388 Al, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, 433-455).

(4-7) Método para preparar fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos [00374] O método para preparar scFv é bem conhecido na técnica (ver por exemplo, as Patentes US. Nos. 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513 e 5.455.030). Neste scFv, uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve são ligadas por intermédio de um ligante que as impedem de formar um conjugado, preferivelmente um ligante de polipeptídeo (Huston, J.S. et al., PNAS (1988), 85, 5879-5883). A região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve em scFv pode ser derivada do mesmo anticorpo ou pode ser derivada de anticorpos diferentes. [00375] Por exemplo, um peptídeo arbitrário de cadeia única consistindo em 5 a 30 resíduos é usado como o ligante de polipeptídeo que liga estas regiões variáveis.

[00376] De modo a obter DNA codificando scFv das sequências de DNA codificando a cadeia pesada ou região variável de cadeia pesada do anticorpo e DNA codificando a cadeia leve ou região variável de cadeia leve do mesmo, cada porção de DNA codificando as sequências de aminoácido inteiras ou desejadas é usada como um padrão e amplificada pela PCR usando um par de iniciadores flanqueando ambas extremidades do padrão. Subsequentemente, o DNA codificando a porção de ligante de polipeptídeo é amplificado ainda em combinação com um par de iniciadores flanqueando

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83/152 ambas as extremidades do DNA de modo que o fragmento resultante possa ser ligado nas suas extremidades aos DNAs de cadeia pesada e leve. Altemativamente, o DNA codificando a região scFv inteira pode ser obtida pela síntese líquida.

[00377] O DNA codificando scFv pode ser usado para preparar, de acordo com um método de rotina, um vetor de expressão contendo o DNA e células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão. Além disso, as células hospedeiras podem ser cultivadas e o scFv pode ser recuperado a partir das culturas usando um método de rotina.

[00378] Também de modo a obter qualquer outro fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, um gene codificando o fragmento de ligação a antígeno é obtido de acordo com o método descrito acima e introduzido nas células. O fragmento de ligação a antígeno de interesse pode ser recuperado das culturas das células.

[00379] O anticorpo, etc. da presente invenção pode ser multimerizado para realçar a sua afinidade para o antígeno. Neste caso, anticorpos do mesmo tipo podem ser multimerizados, ou uma pluralidade de anticorpos reconhecendo uma pluralidade de epítopos, respectivamente, do mesmo antígeno pode ser multimerizada. Os exemplos de métodos para multimerizar esses anticorpos podem incluir a ligação de dois scFvs a um domínio CH3 de IgG, a ligação destes à estreptavidina e a introdução de um motivo de hélicevolta-hélice.

[00380] O anticorpo, etc. da presente invenção pode ser uma mistura de tipos plurais de anticorpos anti-CD3 diferindo na sequência de aminoácidos, isto é, um anticorpo policlonal. Os exemplos do anticorpo policlonal pode incluir uma mistura de tipos múltiplos de anticorpos com conjuntos de CDR diferindo no todo ou em parte. Um tal anticorpo policlonal pode ser recuperado de culturas de células diferentes cultivadas mistas que produzem anticorpo (W02004/061104A1). Altemativamente, anticorpos

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84/152 separadamente preparados podem ser misturados. Antissoro, que é um aspecto do anticorpo policlonal, pode ser preparado imunizando-se animais com o antígeno desejado e recuperar soro dos animais de acordo com um método padrão.

[00381] Anticorpos conjugados com várias moléculas tais como polietileno glicol (PEG) também podem ser usados como variantes do anticorpo.

[00382] O anticorpo, etc. da presente invenção pode ser qualquer conjugado formado por esses anticorpos com outras moléculas por intermédio de ligantes (imunoconjugados). Um complexo de anticorpo-fármaco em que o anticorpo é conjugado com um material radioativo ou um composto (fármaco) tendo ação farmacológica pode incluir ADC (conjugado anticorpo-fármaco) (Methods Mol Biol. (2013) 1045: 1-27).

[00383] O anticorpo, etc. da presente invenção pode ser ainda qualquer um dos anticorpos conectados a outros polipeptídeos funcionais. Um exemplo de um tal complexo anticorpo-peptídeo é um complexo do anticorpo e um polipeptídeo de ligação a albumina (Protein Eng Des Sei. (2012) (2): 81-8).

[00384] (4-8) Purificação do anticorpo e fragmento de ligação a antígeno do anticorpo [00385] O anticorpo resultante e fragmento de ligação a antígeno do anticorpo podem ser purificados até homogêneos de modo a não conter materiais outros que não o anticorpo, etc. Os métodos comuns de separação e purificação de proteína podem ser usados para a separação e purificação do anticorpo e fragmento de ligação a antígeno do anticorpo.

[00386] O anticorpo pode ser separado e purificado pelos métodos apropriadamente selecionados ou combinados, por exemplo, colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, dessalinização, diálise, eletroforese preparativa em gel de poliacrilamida e focalização isoelétrica, embora o método de separação e purificação não seja limitado.

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85/152 [00387] O método de separação e purificação é preferivelmente realizado, por exemplo, preparando-se um vetor de expressão usando uma sequência de DNA codificando uma etiqueta His ou um marcador FLAG adicionados ao terminal carboxila de uma região variável de anticorpo, transformando células com este vetor, depois cultivando as células para expressar o anticorpo e fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e extraindo o sobrenadante de cultura depois da conclusão da cultura, seguida por purificação usando cromatografia de afinidade com metal (por exemplo, Ni ou Co), colunas de anticorpo antimarcador FLAG, filtração em gel, ou cromatografia de troca iônica.

[00388] O anticorpo expresso e fragmentos de ligação a antígeno do anticorpo contendo uma sequência de aminoácido codificando uma etiqueta tal como uma etiqueta His ou um marcador FLAG também são abrangidos pelo antígeno, etc. da presente invenção ou pela molécula da presente invenção.

(4-9) Moléculas multiespecíficas e moléculas biespecíficas [00389] Os exemplos de métodos para preparar a molécula biespecífica e a molécula multiespecífica da presente invenção incluem um método que envolve introduzir plasmídeos de expressão às células hospedeiras para causar a expressão transitória, um método que envolve introduzir plasmídeos nas células hospedeiras e depois selecionar uma linhagem de célula expressando estavelmente pela seleção com fármaco para causar expressão permanente, um método que envolve a síntese livre de célula e um método que envolve preparar anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno por qualquer um dos métodos descritos acima e depois ligando quimicamente estes anticorpos ou fragmentos usando um ligante de peptídeo sintético.

[00390] Como para a preparação da molécula biespecífica usando regiões variáveis de anticorpo, os exemplos incluem um método que envolve conectar dois anticorpos de cadeia única (scFvs) por intermédio de um ligante

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86/152 de peptideo (scFv em tandem), um método que envolve domínios de emparelhamento cruzado de dois anticorpos diferindo em especificidade e formando um dímero por uma ligação não covalente (diacorpo), um método que envolve domínios de emparelhamento cruzado de dois anticorpos diferindo em especificidade e formando uma cadeia única (diacorpo de cadeia única) e um método que envolve preparar diacorpos de cadeia única e depois formando um dímero por uma ligação não covalente (TandAb, US7129330B2).

[00391] A presente invenção também provê um gene codificando o anticorpo da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, ou uma variante do antígeno, etc., um vetor recombinante tendo um inserto do gene, uma célula transfectada com o gene ou vetor e uma célula produzindo o anticorpo da presente invenção.

5. Composições farmacêuticas [00392] A presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD3 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou a variante do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, e/ou a molécula da presente invenção compreendendo qualquer um deles, por exemplo, a molécula multiespecífica.

[00393] Na presente invenção, o tratamento e/ou prevenção de uma doença inclui, mas não é limitado à prevenção do início da doença, à supressão ou inibição de avanço ou progresso da mesma, o alívio de um ou dois ou mais sintomas exibidos por um indivíduo afetado com a doença, à supressão ou remissão do avanço ou progresso da mesma e o tratamento ou prevenção de uma doença secundária, etc. No caso da molécula, os exemplos de doenças incluem cânceres.

[00394] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo anti-CD3 ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e um

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87/152 diluente, veículo, solubilizador, emulsificador, preservante, e/ou aditivo farmaceuticamente aceitável.

[00395] “Quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz” significa uma quantidade que tenha efeitos terapêuticos ou profiláticos sobre uma doença particular por meio de uma forma de dosagem e via de administração particulares.

[00396] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender materiais para mudar, manter, ou reter o pH, pressão osmótica, viscosidade, transparência, cor, tonicidade, esterilidade, ou a estabilidade, solubilidade, liberação prolongada, absorbabilidade, permeabilidade, forma de dosagem, concentração, propriedades, formato, etc., da composição ou do anticorpo compreendido nela (daqui em diante, aludida como “materiais farmacêuticos”). Os materiais farmacêuticos não são particularmente limitados contanto que os materiais sejam farmacologicamente aceitáveis. Por exemplo, não tóxicos ou de toxicidade baixa é uma propriedade preferivelmente possuída por estes materiais farmacêuticos.

[00397] Os exemplos de materiais farmacêuticos incluem, mas não são limitados aos seguintes: aminoácidos tais como glicina, alanina, glutamina, asparagina, histidina, arginina e lisina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tais como ácido ascórbico, sulfato de sódio e bissulfito de sódio; tampões tais como tampões de fosfato, citrato, ou borato, bicarbonato de sódio e soluções de Tris-HCl; enchedores tais como manitol e glicina; agentes queladores tais como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA); agentes complexantes tais como cafeína, polivinilpirrolidina, β-ciclodextrina e hidroxipropil-βciclodextrina; agentes de volume tais como glicose, manose e dextrina; hidrocarbonetos tais como monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, manose e dextrina; agentes de cor; corretores; diluentes; emulsificantes; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidina; polipeptídeos de peso molecular baixo; contraíons que formam sal; antissépticos tais como cloreto de

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88/152 benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico e peróxido de hidrogênio; solventes tais como glicerina, propileno glicol e polietileno glicol; álcoois de açúcar tais como manitol e sorbitol; agentes de suspensão; tensoativos tais como PEG, éster de sorbitano, polissorbatos tais como polissorbato 20 e polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina e colesterol; realçadores de estabilidade tais como sacarose e sorbitol; realçadores de elasticidade tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, manitol e sorbitol; agentes de transporte; diluentes; excipientes; e aditivos farmacêuticos.

[00398] A quantidade destes materiais farmacêuticos adicionados é de 0,001 a 1000 vezes, preferivelmente de 0,01 a 100 vezes e mais preferivelmente de 0,1 a 10 vezes o peso do anticorpo anti-CD3 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou a variante do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ou uma molécula da presente invenção tal como uma molécula multiespecífica.

[00399] Um imunolipossoma compreendendo um anticorpo anti-CD3 da presente invenção ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou uma variante do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ou uma molécula da presente invenção tal como uma molécula multiespecífica, encapsulada em um lipossoma, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma forma modificada de anticorpo compreendendo o conjugado de anticorpo com um lipossoma (Patente U.S. No. 6214388, etc.) também são incluídos entre as composições farmacêuticas da presente invenção.

[00400] Os excipientes ou carreadores não são particularmente limitados contanto que sejam materiais líquidos ou sólidos habitualmente usados em água, solução salina, fluidos cerebroespinhal artificiais injetáveis e outras preparações para administração oral ou parenteral. Os exemplos de solução salina podem incluir solução salina neutra e solução salina contendo

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89/152 albumina sérica.

[00401] Os exemplos de tampões podem incluir um tampão de Tris ajustado para levar o pH final da composição farmacêutica para 7,0 a 8,5, um tampão de acetato ajustado para levar o pH final para 4,0 a 5,5, um tampão de citrato ajustado para levar o pH final para 5,0 a 8,0 e um tampão de histidina ajustado para levar o pH final para 5,0 a 8,0.

[00402] Uma composição farmacêutica da presente invenção é um sólido, um líquido, ou uma suspensão. Um outro exemplo de uma composição farmacêutica da presente invenção é uma preparação seca por congelamento. As preparações secas por congelamento podem ser formadas usando um excipiente tal como sacarose.

[00403] A via de administração para uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser qualquer uma de administração enteral, administração local, ou administração parenteral e é preferivelmente selecionado dependendo da doença alvejada. Os exemplos específicos incluem administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intramuscular, administração intradérmica, administração hipodérmica, administração intraperitoneal, administração transdérmica, administração intraóssea e administração intra-articular.

[00404] A composição da composição farmacêutica pode ser determinada com base no método de administração, a afinidade de ligação do anticorpo para a proteína CD3, etc.

[00405] A dose de um anticorpo anti-CD3 da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou uma variante do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, ou uma molécula da presente invenção tal como uma molécula multiespecífica pode ser determinada com base na espécie do indivíduo, no tipo de doença, sintomas, sexo, idade, condições preexistentes, na afinidade de ligação do anticorpo para a proteína CD3 ou sua atividade biológica e outros fatores. Uma dose de usualmente 0,01 a 1000

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90/152 mg/kg, preferivelmente 0,1 a 100 mg/kg, pode ser administrada uma vez ao dia durante 180 dias ou duas ou três ou mais vezes ao dia.

[00406] Os exemplos de formas para a composição farmacêutica incluem injeções (incluindo preparações secas por congelamento e gotas), supositórios, preparações de absorção transnasal, preparações de absorção transdérmica, formulações sublinguais, cápsulas, tabletes, unguentos, grânulos, aerossóis, pílulas, pós, suspensões, emulsões, gotas oculares e formulações de implante biológico.

[00407] Um anticorpo anti-CD3 da presente invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou uma variante do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, e/ou uma molécula da presente invenção compreendendo qualquer um deles tal como molécula multiespecífica (daqui em diante, aludido como o “anticorpo anti-CD3, etc.”) pode ser usado em combinação com um outro fármaco. O anticorpo anti-CD3, etc. ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD3, etc. como um ingrediente ativo pode ser administrado concorrentemente com ou separadamente do outro fármaco, isto é, uma composição farmacêutica compreendendo um fármaco outro que não o anticorpo anti-CD3, etc. como um ingrediente ativo. Por exemplo, a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo antiCD3, etc. como um ingrediente ativo pode ser administrada depois da administração do outro fármaco, ou o outro fármaco pode ser administrado depois da administração da composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD3, etc. como um ingrediente ativo. Altemativamente, a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD3, etc. como um ingrediente ativo e o outro fármaco pode ser administrado concorrentemente. Na presente invenção, um caso em que o anticorpo antiCD3, etc. e o outro fármaco estão ambos contidos como ingredientes ativos em uma única composição farmacêutica e um caso em que estes ingredientes ativos estão separadamente contidos em uma pluralidade de composições

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91/152 farmacêuticas são ambos incluídos no escopo da “composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD3, etc. e um outro fármaco.” Na presente invenção, a “composição farmacêutica” tem o mesmo significado como uma “composição farmacêutica em que o anticorpo anti-CD3, etc. deva ser administrado em combinação com um outro fármaco.” [00408] Na presente invenção, a frase “administrado em combinação” usado para o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco significa que o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco são introduzidos no corpo de um receptor dentro de um certo período. Uma preparação única contendo o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco pode ser administrada, ou o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco podem ser separadamente formulados e administrados como preparações separadas. No caso de preparações separadas, a cronometragem de administração não é particularmente limitada e as preparações podem ser administradas concorrentemente ou pode ser administrado em tempos diferentes ou em dias diferentes em uma maneira alternada. Em um caso em que o anticorpo antiCD3, etc. e o outro fármaco são separadamente administrados em tempos diferentes ou em dias diferentes, a ordem de administração não é particularmente limitada. Visto que preparações separadas são habitualmente administradas de acordo com os seus respectivos métodos de administração, a frequência de administração pode ser a mesma ou diferente. Além disso, as preparações separadas podem ser administradas pelo mesmo método de administração (via de administração) ou podem ser administradas por métodos de administração (vias de administração) diferentes. Não é necessário que o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco estejam presentes no corpo concorrentemente e é suficiente que o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco sejam introduzidos no corpo durante um certo período de tempo (por exemplo, durante 1 mês, preferivelmente durante 1 semana, mais preferivelmente durante vários dias, ainda mais preferivelmente durante 1

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92/152 dia). Alternativamente, quando um dos ingredientes ativos é administrado, o outro ingrediente ativo pode já ter desaparecido do corpo.

[00409] Os exemplos de formas de dosagem para a “composição farmacêutica em que o anticorpo anti-CD3, etc. deva ser administrado em combinação com o outro fármaco” podem incluir 1) a administração de uma preparação única contendo o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco, 2) a administração concorrente à mesma via de administração de duas preparações obtidas formulando-se separadamente o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco, 3) a administração em uma maneira alternada à mesma via de administração de duas preparações obtidas formulando-se separadamente o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco, 4) a administração concorrente às vias de administração diferentes de duas preparações obtidas formulando-se separadamente o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco e 5) a administração em uma maneira alternada às vias de administração diferentes de duas preparações obtidas formulando-se separadamente o anticorpo antiCD3, etc. e o outro fármaco. A dose, intervalo de dosagem, forma de dosagem, preparação, etc., da “composição farmacêutica em que o anticorpo anti-CD3, etc. deva ser administrado em combinação com o outro fármaco” depende da composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD3, etc., mas não são limitados.

[00410] Uma composição farmacêutica formulada em duas preparações diferentes pode estar na forma de um kit contendo estas preparações.

[00411] Na presente invenção, a “combinação” do anticorpo anti-CD3, etc. e do outro fármaco significa que o anticorpo anti-CD3, etc. e o outro fármaco são “administrados em combinação.” [00412] Um fármaco adicional também pode ser usado na combinação ou na composição farmacêutica da presente invenção.

[00413] A presente invenção provê um método para tratar ou prevenir

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Doenças relacionadas com CD3, o uso do anticorpo da presente invenção para preparar uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção de doenças e uso do anticorpo da presente invenção para tratar ou prevenir as doenças. A presente invenção também abrange um kit para o tratamento ou prevenção compreendendo o anticorpo da presente invenção.

[Exemplos] [00414] A presente invenção será agora descrita em mais detalhes com referência aos exemplos. Entretanto, a presente invenção não é limitada a estes exemplos. Os procedimentos relacionados com a manipulação de gene nos exemplos abaixo foram realizados de acordo com os métodos descritos em “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), ou usando reagentes ou kits comercialmente disponíveis de acordo com os manuais de instrução, a menos que de outro modo especificado.

(Exemplo 1) Preparação de anticorpo de rato anti-CD3 humano

1)-1 Construção de vetor de expressão de CD3eô humano [00415] Um vetor de controle pcDNA3.1-DEST engendrado como um vetor de destinação foi preparado usando o Gateway Vector Conversion System (Thermo Fisher Scientific Inc.). Um cDNA codificando a proteína de CD3e humano (Sequência de Referência no NCBI: NP_000724.1) mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO: 1) foi adquirida da Sino Biological Inc. e clonada no vetor pcDNA3.1-DEST usando a mistura Gateway LR Clonase Enzyme (Thermo Fisher Scientific Inc.) para construir hCD38-pcDNA3.1. Um cDNA codificando a proteína de CD35 humano (NP_000723.1) mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 2) foi amplificada pela PCR usando um cDNA derivado de célula T humana como um padrão de acordo com um método conhecido por aqueles habilitados na técnica e clonados em pcDNA3.1(+) (Thermo Fisher Scientific Inc.) para construir um vetor de expressão hCD3ô-pcDNA3.1. Para a preparação em larga escala de cada vetor de expressão, Endofree Plasmid

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Giga Kit (Qiagen N.V.) foi usado.

1)-2 Immunização [00416] Para imunização, ratos fêmeas WKY/Izm (Japan SLC, Inc.) foram usados. Primeiro, ambas as coxas inferiores de cada rato foram prétratadas com hialuronidase (Sigma-Aldrich Corp.). Depois, os vetores de expressão hCD3a-pcDNA3.1 e hCD3ô-pcDNA3.1 preparados no Exemplo 1)1 foram intramuscularmente injetados nestes sítios. Subsequentemente, a eletroporação in vivo destes sítios foi realizada usando ECM830 (BTX) e um eletrodo de duas agulhas. A mesma eletroporação in vivo como acima foi repetida aproximadamente uma vez a cada duas semanas. Depois, os linfônodos ou os baços foram colhidos dos ratos e usados na preparação de hibridoma.

l)-3 Preparação de hibridoma [00417] As células de linfonodo ou as células do baço foram eletricamente fundidas com células SP2/0-agl4 de mieloma de camundongo (ATCC, No. CRL-1 581) usando a Unidade de Fusão de Célula LF301 (BEX Co., Ltd.). As células fundidas foram diluídas com Meio de Seleção ClonaCell-HY D (StemCell Technologies Inc.) e cultivadas. As colônias de hibridoma foram recuperadas para preparar hibridomas monoclonais. Cada colônia de hibridoma assim recuperada foi cultivada usando Meio de Seleção ClonaCell-HY E (StemCell Technologies Inc.) e o sobrenadante de cultura de hibridoma resultante foi usado para triar quanto a um hibridoma que produz anticorpo anti-CD3 humano.

l)-4 Triagem de anticorpo pelo ELISA de Célula

1)-4-1 Preparação de célula que expressa gene antigênico para ELISA de Célula [00418] As células HEK293oc (expressão estável de linhagem de célula derivada de HEK293 expressando integrina ocv e integrina β3) foram ajustadas para 7,5 x 10⁵ células/mL em um meio DMEM contendo 10% de

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FBS. hCD3e-pcDNA3.1 e hCD35-pcDNA3.1, ou um pcDNA3.1-DEST de controle foi transfectado a isso de acordo com procedimentos de transfecção usando Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.). As células resultantes foram dispensadas em uma quantidade de 100 pL/poço a uma placa de 96 poços (Coming Inc.) e cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2 em um meio DMEM contendo 10% de FBS. As células transfectadas resultantes foram usadas no estado fixo em ELISA de Célula.

1)-4-2 ELISA de Célula [00419] Depois da remoção do sobrenadante de cultura das células HEK293oc transfectadas com vetor de expressão preparadas no Exemplo l)-41, cada sobrenadante de cultura de hibridoma foi adicionado às HEK293oc transfectadas com hCD3e-pcDNA3.1 e hCD3ô-pcDNA3.1, ou pcDNA3.1DEST e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células nos poços foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS. Depois, IgG anti-Rato e Ab Integral ligado a HRP de Cabra (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) diluído 500 vezes com PBS contendo 5% de FBS foram adicionados e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células nos poços foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, uma solução cromogênica de OPD (solução de OPD (dicloridreto de o-fenilenodiamina (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) e H2O2 dissolvido nas concentrações de 0,4 mg/mL e 0,6% (v/v), respectivamente, em citrato de trissódio 0,05 M e hidrogeno fosfato de dissódio dodecahidratado 0,1 M, pH 4,5)) foram adicionados em uma concentração de 100 pL/poço. A reação de cor foi realizada com agitação ocasional e interrompida pela adição de HC1 1 M em uma concentração de 100 pL/poço. Depois, a absorbância foi medida a 490 nm usando uma leitora de placa (ENVISION; Perkin Elmer, Inc.). De modo a selecionar um hibridoma que produz um anticorpo que se ligue ao CD3 humano expresso na superfície da membrana celular, hibridomas que

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96/152 produziram um sobrenadante de cultura exibindo absorbância mais alta para as células HEK293oc transfectadas com vetor de expressão hCD38-pcDNA3.1 e hCD3ô-pcDNA3.1 comparadas com as células HEK293 transfectadas com pcDNA3.1-DEST de controle foram selecionados como hibridomas positivos na produção de anticorpo anti-CD3 humano.

l)-5 Triagem de anticorpo com base na ativação de células T humanas [00420] O anticorpo anti-CD3 obtido de hibridoma foi avaliado quanto à sua ativação de células T com a detecção de um marcador de ativação de CD69 como um índice. As células Jurkat da linhagem de célula T humana (ATCC, No. TIB-152) foram ajustadas a uma concentração de 5 x 10⁶células/mL em um meio de RPMI1640 contendo FBS e adicionados em uma concentração de 100 pL/poço a uma placa de 96 poços. Depois da remoção do sobrenadante pela centrifugação, o sobrenadante de cultura de cada hibridoma positivo na produção de anticorpo anti-CD3 humano selecionado pelo ELISA de célula no Exemplo 1 )-4 ou um anticorpo de controle de isótipo de IgG de rato (R&D Systems, Inc.) foi adicionado em uma concentração final de 5 pg/mL às células Jurkat e a placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos. Depois, o Fragmento Fcy de IgG de Cabra Anti-rato ligante cruzado específico (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) foi adicionado em uma concentração final de 10 pg/poço e as células foram cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2. No dia seguinte, o sobrenadante foi removido e as células nos poços foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS. Depois, anticorpo PE de Camundongo Anti-Ser Humano CD69 (BD Biosciences) foi adicionado em uma concentração de 20 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células nos poços foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (FC500; Beckman Coulter Inc.). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star

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Inc.). A intensidade de fluorescência PE foi plotada em um histograma. Os hibridomas que produziram uma amostra exibindo uma mudança para intensidade de fluorescência mais forte no histograma de intensidade de fluorescência de PE do que no histograma de intensidade de fluorescência do anticorpo de controle de isótipo de IgG de rato foram selecionados como hibridomas produzindo anticorpo anti-CD3 humano positivo quanto à capacidade para ativar células T humanas.

l)-6 Triagem com base na atividade de ligação seletiva ao CD3 humano ou de macaco pela citometria de fluxo

1)-6-1 Preparação de células que expressam gene de antígeno humano [00421] As células Lenti-X293T (Takara Bio Inc., Cat# 632180) foram adicionadas em uma densidade de 5,3 x 10⁴ células/cm² a um frasco de 225 cm² e cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2 em um meio DMEM contendo 10% de FBS. No dia seguinte, hCD3a-pcDNA3.1 e hCD3ô-pcDNA3.1 ou um pcDNA3.1-DEST de controle foram transfectados para as células Lenti-X293T usando Lipofectamina 2000 e as células foram cultivadas ainda durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2. No dia seguinte, as células Lenti-X293T transfectadas com vetor de expressão foram tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Inc.), lavadas com DMEM contendo 10% de FBS e depois ajustadas a uma concentração de 5 x 10⁶ células/mL em PBS contendo 5% de FBS. A suspensão de célula resultante foi usada na análise de citometria de fluxo.

1)-6-2 A análise de citometria de fluxo da atividade de ligação ao CD3 humano [00422] A especificidade de ligação ao CD3 humano do anticorpo produzido por cada hibridoma determinada ser positiva quanto à capacidade para ativar células T humanas no Exemplo l)-5 foi confirmada ainda pela citometria de fluxo. Cada suspensão de célula Lenti-X293T preparada no Exemplo 1)-6-1 foi adicionada em uma concentração de 100 pL/poço a uma

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98/152 microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover o sobrenadante. As células Lenti-X293T transfectadas com hCD38-pcDNA3.1e hCD35-pcDNA3.1 ou as células Lenti-X293T transfectadas com pcDNA3.1-DEST foram colocadas em suspensão pela adição do sobrenadante de cultura de hibridoma e deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS, depois colocadas em suspensão pela adição de conjugado FITC de IgG Anti-Rato (Sigma-Aldrich Corp.) diluído 500 vezes com PBS contendo 5% de FBS e deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS e 2 pg/ml de 7-aminoactinomicina D (Molecular Probes, Inc.), seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo. Os dados foram analisados usando Flowjo. Depois da remoção das células mortas positivas em 7-aminoactinomicina D por bloqueio, a intensidade de fluorescência FITC de células vivas foi plotada em um histograma. Os hibridomas que produziram uma amostra exibindo uma mudança para intensidade de fluorescência mais forte no histograma das células Lenti-X293T transfectadas com hCD38-pcDNA3.1 e hCD3ô-pcDNA3.1 do que no histograma de intensidade de fluorescência das células Lenti-X293T transfectadas de pcDNA3.1-DEST de controle foram selecionados como hibridomas produzindo anticorpos que se liguem ao CD3 humano.

1)-6-3 Construção de vetor de expressão de CD3aô de macaco [00423] Os cDNAs codificando a proteína CD3a de macaco (Sequência de Referência no NCBI: NP_001270544.1) e a proteína de CD35 de macaco (Sequência de Referência no NCBI: NP_001274617.1) foram amplificados pela PCR usando um cDNA derivado de célula T de macaco como um padrão de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica e clonados no pcDNA3.1(+) (Thermo Fisher Scientific Inc.) para construir os vetores de expressão cynoCD38-pcDNA3.1 e cynoCD35-pcDNA3.1.

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1)-6-4 Preparação de células de expressão de gene de antígeno de macaco [00424] As células Lenti-X293T foram inoculadas em uma densidade de 5,3 x 10⁴ células/cm² a um frasco de 225 cm² e cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2 em um meio DMEM contendo 10% de FBS. No dia seguinte, cynoCD3a-pcDNA3.1 e cynoCD35-pcDNA3.1 ou um pcDNA3.1-DEST de controle foi transfectado com as células Lenti-X293T usando Lipofectamina 2000 e as células foram cultivadas ainda durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2. No dia seguinte, as células LentiX293T transfectadas com vetor de expressão foram tratadas com TrypLE Express, lavadas com DMEM contendo 10% de FBS e depois ajustadas a uma concentração de 5 x 10⁶ células/mL em PBS contendo 5% de FBS. A suspensão de célula resultante foi usada na análise de citometria de fluxo.

1)-6-5 Análise de citometria de fluxo da atividade de ligação ao CD3 de macaco [00425] A especificidade de ligação ao CD3 de macaco do anticorpo produzida por cada hibridoma determinado produzir o anticorpo que se liga ao CD3 humano no Exemplo 1)-6-2 foi confirmada ainda pela citometria de fluxo. Cada suspensão de célula Lenti-X293T preparada no Exemplo 1)-6-4 foi adicionada em uma concentração de 100 pL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. As células Lenti-X293T transfectadas com cynoCD3a-pcDNA3.1 e cynoCD3ôpcDNA3.1 ou com o pcDNA3.1-DEST foram colocadas em suspensão pela adição do sobrenadante de cultura de hibridoma e deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS, depois colocadas em suspensão pela adição de conjugado de IgG AntiRato FITC diluído 500 vezes com PBS contendo 5% de FBS e deixado repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS e 2 pg/ml de 7-aminoactinomicina D, seguido pela

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100/152 detecção usando um citômetro de fluxo. Os dados foram analisados usando Flowjo. Depois da remoção das células mortas positivas em 7aminoactinomicina D por bloqueio, a intensidade de fluorescência FITC de células vivas foi plotada para um histograma. Os hibridomas que produziram uma amostra exibindo uma mudança para intensidade de fluorescência mais forte no histograma das células Lenti-X293T transfectadas com cynoCD3apcDNA3.1 e cynoCD3ô-pcDNA3.1 do que no histograma de intensidade de fluorescência das células Lenti-X293T transfectadas com pcDNA3.1-DEST de controle foram selecionados como hibridomas produzindo anticorpos que se ligam ao CD3 de macaco.

1)-6-6 Preparação de células que expressam o gene de CD35 humano [00426] As células Lenti-X293T foram inoculadas em uma densidade de 5,3 x 10⁴ células/cm² a um frasco de 225 cm² e cultivadas durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2 em um meio DMEM contendo 10% de FBS. No dia seguinte, hCD3ô-pcDNA3.1 ou um pcDNA3.1-DEST de controle foram transfectados para as células Lenti-X293T usando Lipofectamina 2000 e as células foram cultivadas ainda durante a noite a 37°C sob condições de 5% de CO2. No dia seguinte, as células Lenti-X293T transfectadas em vetor de expressão foram tratadas com TrypLE Express, lavadas com DMEM contendo 10% de FBS e depois ajustadas a uma concentração de 5 x 10⁶ células/mL em PBS contendo 5% de FBS. A suspensão de célula resultante foi usada na análise de citometria de fluxo.

1)-6-7 Análise de citometria de fluxo da atividade de ligação contra CD35 humano [00427] A especificidade de ligação de CD35 humano do anticorpo produzido por cada hibridoma determinado produzir o anticorpo que se liga ao CD3 de macaco no Exemplo 1)-6-5 foi confirmada ainda pela citometria de fluxo. Cada suspensão de célula Lenti-X293T preparada no Exemplo l)-66 foi adicionada em uma concentração de 100 pL/poço a uma microplaca com

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101/152 fundo em U de 96 poços e centrifugada para remover um sobrenadante. As células Lenti-X293T transfectadas com hCD3ô-pcDNA3.1 ou as células Lenti-X293T transfectadas com pcDNA3.1-DEST foram colocadas em suspensão pela adição do sobrenadante de cultura de hibridoma e deixada repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS, depois colocadas em suspensão pela adição de conjugado de IgG Anti-Rato FITC diluído 500 vezes com PBS contendo 5% de FBS e deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS e 2 pg/ml de 7-aminoactinomicina D, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo. Os dados foram analisados usando Flowjo. Depois da remoção de células mortas positivas em 7-aminoactinomicina D por bloqueio, a intensidade de fluorescência FITC das células vivas foi plotada a um histograma. Hibridomas que produziram uma amostra exibindo uma mudança para intensidade de fluorescência mais forte no histograma das células Lenti-X293T transfectadas com hCD3ô-pcDNA3.1 do que no histograma de intensidade de fluorescência das células LentiX293T de controle transfectadas com pcDNA3.1-DEST foram excluídos como hibridomas produzindo anticorpos que se ligam ao CD35 humano.

1)-6-8 Análise de citometria de fluxo da atividade de ligação às linhagens de célula T de macaco [00428] A especificidade de ligação da linhagem de célula T de macaco do anticorpo produzido por cada hibridoma que produz anticorpo que não foi excluído no Exemplo 1)-6-7 foi confirmada ainda pela citometria de fluxo. Uma linhagem de célula T de macaco cinomolgo HSC-F (JCRB Cell Bank, No. JCRB 1164) foi ajustado a uma concentração de 5 x 10⁶ células/mL em um meio RPMI1640 contendo FBS e adicionada em uma concentração de 100 pL/poço a uma placa de 96 poços. Depois da remoção do sobrenadante pela centrifugação, o sobrenadante de cultura do hibridoma que produz

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102/152 anticorpo que não foi excluído no Exemplo l)-5- 7, ou um anticorpo de controle de isótipo de IgG de rato foram adicionados às células HSC-F e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 1 hora. Depois, o sobrenadante foi removido e as células nos poços foram lavadas uma vez com PBS contendo 5% de FBS, depois colocadas em suspensão pela adição de conjugado de IgG Anti-Rato FITC diluído 500 vezes com PBS contendo 5% de FBS e deixadas repousar a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas três vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS e 2 pg/ml de 7-aminoactinomicina D, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo. Os dados foram analisados usando Flowjo. Depois da remoção das células mortas positivas em 7-aminoactinomicina D por bloqueio, a intensidade de fluorescência FITC de células vivas foi plotada a um histograma. Os hibridomas que produziram uma amostra exibindo uma mudança para intensidade de fluorescência mais forte no histograma de intensidade de fluorescência de FITC do que no histograma de intensidade de fluorescência do anticorpo de controle de isótipo de IgG de rato foram selecionados como hibridomas produzindo anticorpos que também se ligam à linhagem de célula T de macaco.

l)-7 Isotipagem de anticorpos [00429] C3-147 sugestivo de ligar-se ao CD3a humano e de macaco e também que se liga a uma linhagem de célula T de macaco e tendo a alta capacidade para ativar células T humanas foi selecionado dentre os hibridomas produzindo anticorpo anti-CD3 de rato obtidos no Exemplo l)-6 e identificado pela isotipagem de anticorpo. O isótipo foi determinado usando o Kit de ELISA de Isotipagem com Imunoglobulina de Rato (BD Pharmingen). Como um resultado, o isótipo do anticorpo monoclonal anti-CD3 de rato C3147 foi confirmado ser IgG2b e cadeias λ.

(Exemplo 2) Estudo da atividade de ligação de anticorpos monoclonais antiCD3 de rato (C3-147) ao CD3 humano

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2)-1 Preparação de anticorpos monoclonais a partir do sobrenadante de hibridoma

2)-1-1 Cultura de hibridoma que produz C3-147 [00430] O anticorpo monoclonal anti-CD3 de rato foi purificado a partir do sobrenadante de cultura de hibridoma. Primeiro, o hibridoma que produz C3-147 foi deixado crescer até uma quantidade suficiente em Meio de Seleção E ClonaCell-HY (StemCell Technologies Inc.). Depois, o meio foi substituído com um SFM de Hibridoma (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 5 pg/mL de gentamicina (Thermo Fisher Scientific Inc.) suplementado com 20% de Ultra Low IgG FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.), seguido pelo cultivo durante 7 dias. Este sobrenadante cultivado foi recuperado e esterilizado em um filtro de 0,22 pm (Coming Inc.).

2)-1-2 Purificação [00431] O anticorpo foi purificado pela cromatografia de afinidade de proteína G a partir do sobrenadante de cultura de hibridoma preparado no Exemplo 2)-1-1. O anticorpo foi adsorvido em uma coluna de proteína G (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) e a coluna foi lavada com PBS, seguido por elução com uma solução aquosa de glicina/ácido clorídrico 0,1 M (pH 2,7). O eluído foi ajustado entre o pH 7,0 e 7,5 pela adição de Tris-HCl 1 M (pH 9,0). Depois, o tampão foi substituído com PBS usando Dispositivo de Filtração UF Centrífugo VIVASPIN20 (corte de peso molecular: UF30K, Sartorius Japan K.K.) enquanto o anticorpo foi concentrado e ajustado para uma concentração de anticorpo de 2 mg/mL. Finalmente, o concentrado foi filtrado em um filtro Minisart-Plus (Sartorius Japan K.K.) e usado como uma amostra purificada.

2)-2 Ligação de anticorpo anti-CD3 de rato (C3-147) obtido aos antígenos de cadeia única humanos

2)-2-1 Preparação de antígenos de cadeia única de CD3ay humano [00432] Uma sequência de aminoácido codificando CD3a ou CD3y foi

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104/152 obtida a partir da estrutura cristalina (PDBID: 1SY6) de um complexo de OTK3-antígeno de cadeia única de CD3ey humano submetido ao banco de dados de proteína. O mesmo ligante de peptídeo composto de 26 aminoácidos que foi relatado na referência (Kim, K.S. et al., (2000) J. Mol. Biol. 302, 899916) foi usado como um ligante para conectar o terminal carboxila de CD3e ao terminal amino de CD3y. O gene codificando o antígeno de cadeia única de CD3ey humano mostrado na Figura 3 (SEQ ID NO: 4) da Listagem de Sequências foi sintetizado pela adição de sítios de restrição BamHI e HindIII às extremidades 5’ e 3’, respectivamente (GeneArt Gene Synthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.). Um fragmento de aproximadamente 4,8 kb obtido pela digestão de um plasmídeo pQE80L (Qiagen N.V.) com enzimas de restrição BamHI e HindIII foi ligado com um fragmento de aproximadamente 0,6 kb obtido pela digestão do gene de antígeno de cadeia única CD3ey humano com BamHI e HindIII, usando Ligation High (Toyobo Co., Ltd.) para preparar um plasmídeo pQE80L-scCD38y para expressão na E. coli. A sequência de aminoácido do scCDSey resultante está descrita na Figura 4 (SEQ ID NO: 5) da Listagem de Sequências. E. coli BL21 (DE3) para a expressão foi transformada com o plasmídeo pQE80L-scCD38y para expressão e a colônia resultante foi adicionada a 1 L de MagicMedia (Invitrogen Corp.) usando frascos Ultra Yield® (Thomson Instrument Company) e cultivada com agitação a 250 rpm a 30°C durante 21 horas. As células bacterianas assim cultivadas foram recuperadas. As células bacterianas foram rompidas usando um homogeneizador ultrassônico na presença de uma solução de tampão Tris contendo uma solução a 1% de Triton e o ciclo de congelamento-descongelamento foi repetido. Finalmente, os corpos de inclusão foram recuperados pela centrifugação a 15000 rpm a 4°C durante 15 minutos. Os procedimentos de redobra dos corpos de inclusão para purificação foram realizados de acordo com o método da referência (Kjer-Nielsen et al. (2004) PNAS vol. 101, no. 20, 7675-7680) exceto que o

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105 / 152 anticorpo anti-CD3 usado em uma coluna de anticorpo foi um anticorpo monoclonal anti-CD de camundongo OKT3 (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29, Orthoclone, Janssen-Cilag) ao invés de 2C11 usado na literatura.

2)-2-2 Medição SPR da atividade de ligação aos antígenos de cadeia única de CD3ay humano [00433] O anticorpo foi ensaiado quanto à sua ligação ao antígeno usando BIAcore 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) pelo método de captura, que envolve capturar o anticorpo como um ligante em um anticorpo de IgG anti-camundongo imobilizado e ensaiando o antígeno como um análito. O antígeno usado foi o CD3ay humano preparado no Exemplo 2)-2-1. Aproximadamente 11000 RU do anticorpo de IgG anti-camundongo (Kit de Captura de Anticorpo de Camundongo, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) foram covalentemente ligados a um chip sensor CM5 (GE Healthcare BioSciences Corp.) pelo método de encaixe de amina. Similarmente, este anticorpo foi imobilizado em uma célula de referência. O tampão de condução usado foi HBS-EP+ (10 mM de HEPES (pH 7,4), 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA e 0,05% de Tensoativo P20). O anticorpo foi adicionado ao chip imobilizado em anticorpo de IgG anti-camundongo durante aproximadamente 1 minuto e depois capturado como um ligante. Depois, 100 nM do antígeno foram adicionados em uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min durante 120 segundos e a ligação ao antígeno foi monitorada. 10 mM de glicina-HCl (pH 1,7) foram adicionados como uma solução de regeneração em uma taxa de fluxo de 10 μΙ/min durante 3 minutos. Como um resultado, o sinal de ligação de C3-147 depois de 120 segundos foi de 34 RU.

2)-3 Confirmação do sítio de ligação de antígeno no anticorpo anti-CD3 de rato (C3-147) resultante pela SPR [00434] O método para confirmar um sítio de ligação de antígeno foi realizado da mesma maneira como no Exemplo 2)-2-2. Como um resultado, o sinal de ligação obtido para C3-147 foi de 34 RU. Por outro lado, um sítio de

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106/152 ligação de antígeno em SP34 (BD Pharmingen), um anticorpo anti-CD3 conhecido na técnica, foi similarmente confirmado como um exemplo comparativo. O sinal de ligação de 34 RU não foi observado em SP34. Estes resultados indicaram que um sítio de ligação na superfície de CD3ay reconhecido pelo C3-147 é diferente daquele reconhecido pelo SP34.

(Exemplo 3) Sequenciamento de CDNAs codificando regiões variáveis em anticorpos de rato anti-CD3 (C3-147) [00435] Os cDNAs codificando as regiões variáveis do anticorpo antiCD3 de rato (C3-147) foram sequenciados pelo seguinte método.

3)-l Síntese de cDNA [00436] Os lisados de célula (50 rnM de Tris-HCl (pH 7,5), 250 rnM de LiCl, 5 mM de EDTA (pH 8), 0,5% de dodecil sulfato de lítio (LiDS) e 2,5 rnM de ditiotreitol (DTT)) do hibridoma que produz anticorpo anti-CD3 de rato (C3-147) foram misturados com grânulos magnéticos ligados a oligo dT25 do Kit Dynabeads mRNA DIRECT (Thermo Fisher Scientific Inc.) de modo que o mRNA fosse ligado aos grânulos magnéticos. Em seguida, os grânulos magnéticos foram lavados uma vez cada com solução de lavagem de mRNA A (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M de LiCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de LiDS e 0,1% de Triton X-100) e uma solução para a síntese de cDNA (50 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM de KC1, 3 mM de MgCl₂, 5 mM de DTT, 0,5 mM de dNTP, 0,2% de Triton X-100 e 1,2 unidades de inibidor de RNase (Thermo Fisher Scientific Inc.). Depois, um cDNA foi sintetizado usando uma solução para a síntese de cDNA suplementada com 12 unidades de Transcriptase Reversa SuperScript III (Thermo Fisher Scientific Inc.). Subsequentemente, o cDNA foi lavado com uma solução de reação de cauda 3’ (50 mM de fosfato de potássio, 4 mM de MgCl₂, 0,5 mM de dGTP, 0,2% de Triton X-100 e 1,2 unidade de inibidor de RNase), seguida pela reação de cauda 3’ com uma solução de reação suplementada com 48 unidades de Terminal Transferase, recombinante (Roche Applied Science).

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3)-2 Amplificação e sequenciamento de fragmentos de gene da região variável de cadeia pesada e leve da imunoglobulina de rato [00437] Os grânulos magnéticos foram lavados com uma solução de TE (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA e 0,1% de Triton X-100). Depois, os genes da cadeia pesada e leve de imunoglobulina de rato foram amplificados pela 5’-RACE PCR. Especificamente, os grânulos magnéticos foram transferidos para uma solução de reação de PCR (0,2 μΜ de iniciadores, 0,2 mM de dNTP e 0,25 unidades de PrimeSTAR HS DNA Polimerase (Takara Bio Inc.)) e submetidos a 35 ciclos de reação cada envolvendo 94°C durante 30 segundos e 68°C durante 90 segundos. Os conjuntos de iniciador usados são descritos abaixo.

[00438] Conjunto de iniciadores de PCR para a amplificação de gene de cadeia pesada

Iniciador de sentido Nhe-poliC-S

5’GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’; Figura 5 (SEQ ID NO: 50)

Primeiro iniciador de antissentido rlgy-ASl ’-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3 ’; Figura (SEQ ID NO: 51)

Segundo iniciador de antissentido r!gy-AS2 ’-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3 ’; Figura (SEQ ID NO: 52)

Conjunto de iniciadores de PCR para a amplificação de gene de cadeia leve

Iniciador de sentido Nhe-poliC-S2

5’GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’; Figura 8 (SEQ ID NO: 53)

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Primeiro iniciador de antissentido rlgL-ASl

5’-TTCCACATCACTCGGGTAGAAATCAG-3’; Figura 9 (SEQ ID NO: 54)

Segundo iniciador de antissentido r!gy-AS2 ’ -TAAC ACC AGGGTAGA AATCTGTC ACC AT-3 ’; Figura (SEQ ID NO: 55) [00439] A análise de sequência foi realizada na sequência de nucleotídeos dos fragmentos amplificados pela reação de PCR. Os iniciadores usados são descritos abaixo.

[00440] Iniciador de sentido rlgy-seq para sequenciamento de cadeia pesada

5’-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3’; Figura 11 (SEQ ID NO: 56)

Iniciador de antissentido rlgL-seql para sequenciamento de cadeia leve

5’-TCCCTGGAGCTCCTCAGT-3’; Figura 12 (SEQ ID NO:

57)

Iniciador de antissentido r!gL-seq2 para sequenciamento de cadeia leve

5’-GCCTTGTCAGTCTTGAGC-3’; Figura 13 (SEQ ID NO:

58) [00441] A análise de sequência foi realizada usando um analisador de sequência de gene (“Analisador de DNA ABI PRISM 3700; Applied Biosystems, Inc.” ou “Analisador 3730x1 Applied Biosystems; Applied Biosystems, Inc.”). O Dye Terminator Cicle Sequencing System com AmpliTaq DNA polimerase (Life Technologies Corp.) e GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.) foram usados na reação de sequenciamento.

[00442] A sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada de C3-147 determinada pela análise de sequência é descrita na Figura

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109/152 (SEQ ID NO: 6) e a sua sequência de aminoácidos é descrita na Figura 15 (SEQ ID NO: 7). A sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve C3-147 está descrita na Figura 16 (SEQ ID NO: 8) e a sua sequência de aminoácidos está descrita na Figura 17 (SEQ ID NO: 9).

(Exemplo 4) Preparação de scFv anti-CD3 de rato (C3E-7000) e a sua forma humanizada (C3E-7034)

4)-l Preparação de scFv de anticorpo anti-CD3 de rato (C3-147)

4)-1-1 Construção de vetor de expressão scFv de anticorpo CD3 de rato (pC3E-7000) [00443] Um oligonucleotídeo de filamento de sentido (Figura 18 (SEQ ID NO: 10)) de um fragmento de DNA tendo sequências adicionais de 15 bases a montante e a jusante de uma sequência de DNA codificando um ligante a ser inserido entre a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) de C3-147 e um filamento oligonucleotídeo de antissentido do mesmo (Figura 19 (SEQ ID NO: 11)) foram sintetizados (Sigma-Aldrich Corp., Custom Oligo Synthesis Service) e ajustados a 100 pmol/pL. Depois, 20 μΕ de cada um destes oligonucleotídeos foram misturados e deixados repousar a 96°C durante 10 minutos, a 70°C durante 2 minutos, a 60°C durante 2 minutos, a 40°C durante 2 minutos e a 30°C durante 2 minutos para recozimento para preparar um fragmento de DNA do ligante a ser inserido entre VH e VL. Em seguida, um fragmento de DNA amplificado pela PCR para adicionar uma sequência de sinal da cadeia pesada de IgG humana, o fragmento de DNA (mostrado na Figura 14 (SEQ ID NO: 6)) de VH do anticorpo anti-CD3 de rato C3-147 amplificado pela PCR, o fragmento de DNA do ligante a ser inserido entre VH e VL e um fragmento de DNA amplificado pela PCR em que uma sequência de DNA codificando uma etiqueta FLAG-His foram adicionados a uma região contendo a sequência de DNA VL de C3-147 (mostrada na Figura 16 (SEQ ID NO: 8)) tal que a etiqueta FLAG-His estivesse localizada no terminal carboxila, foram

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110/152 ligados com uma cadeia principal de vetor derivada de um vetor de expressão pcDNA-3.3TOPO para células animais (Thermo Fisher Scientific Inc.) usando o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar um vetor de expressão de scFv pC3E-7000 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 20 (SEQ ID NO: 14) na ORF.

4)-1-2 Expressão e purificação de scFv anti-CD3 de rato (C3E-7000) [00444] Células Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual. O vetor de expressão scFv foi transfectado para as células Expi293F na fase de crescimento logarítmico. O scFv foi transitoriamente expresso, filtrado e depois usado na purificação. A purificação foi realizada em duas etapas envolvendo a cromatografia de afinidade Ni usando His Trap Excel (GE Healthcare BioSciences Corp.) e filtração em gel usando Superdex 200 increase (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Um pico correspondendo ao peso molecular do monômero de scFv foi recuperado e usado como uma amostra de proteína purificada. Para a purificação, o sistema de cromatografia AKTA foi usado e todas as etapas foram realizadas a 4°C. HBSor (25 mM de histidina/5% de sorbitol, pH 5,0) foi usado como um tampão para a proteína purificada. A amostra de proteína purificada foi aplicada ao SEC para análise para determinar a sua pureza e concentração. Depois, a amostra foi usada em vários ensaios. A sequência de aminoácido em C3E-7000 é descrita na Figura 21 (SEQ ID NO: 15).

4)-2 Humanização de scFv anti-CD3 de rato (C3E-7000)

4)-2-1 Projeto de humanização de anticorpo anti-CD3 [00445] A modelagem molecular das regiões variáveis do anticorpo de rato foi realizada de acordo com um método conhecido na técnica como modelagem de homologia (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) usando um programa de análise tridimensional de estrutura de proteína comercialmente disponível Discovery Studio 3.5 (Dassault Systems S.A.).

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111/152 [00446] A humanização foi realizada por um método geralmente conhecido como enxerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 1002910033 (1989)). Um anticorpo aceitador foi selecionado de sequências de consenso do subgrupo humano especificado por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) ou as sequências da linha germinativa com base na identidade de aminoácido dentro das regiões de arcabouço, as contagens prognosticadas da imunogenicidade esperada ou propriedades físicas, etc. Também, retro mutação foi selecionada com referência aos critérios, etc., provida por Queen et al. (PNAS (1989) 86, 10029-10033) através do uso do modelo de estrutura tridimensional construído pelos métodos descritos acima.

4)-2-2 Projeto de sequência de aminoácidos humanizada C3E-7000 [00447] Com base no método descrito no Exemplo 4)-2-1, a sequência de aminoácido de C3E-7034 servindo como uma forma humanizada de C3E7000 foi projetada com as sequências de consenso do subgrupo humano γ3 e λ6 como aceitadores. A sequência de aminoácido de C3E-7034VH projetada a partir da sequência de amino de C3-147VH mostrada na Figura 15 (SEQ ID NO: 7) pela substituição de arginina na posição de aminoácido 16 com glicina, alanina na posição de aminoácido 17 com serina, lisina na posição de aminoácido 19 com arginina, valina na posição de aminoácido 23 com alanina, valina na posição de aminoácidos 24 com alanina, serina na posição de aminoácido 88 com alanina e treonina na posição de aminoácido 93 com valina é descrita na Figura 22 (SEQ ID NO: 16).

[00448] A sequência de aminoácido de C3E-7034VL projetada a partir da sequência de amino de C3-147VL mostrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 9) pela substituição de glutamina na posição de aminoácido 1 com asparagina, valina na posição de aminoácido 3 com metionina, asparagina na posição de aminoácido 8 com histidina, treonina na posição de aminoácido 12 com ácido

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112/152 glutâmico, asparagina na posição de aminoácido 13 com serina, leucina na posição de aminoácido 14 com prolina, treonina na posição de aminoácido 16 com lisina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 19 com treonina, leucina na posição de aminoácidos 20 com isoleucina, arginina na posição de aminoácido 43 com serina, leucina na posição de aminoácido 75 com serina, asparagina na posição de aminoácido 79 com serina, valina na posição de aminoácido 81 com leucina e glutamina na posição de aminoácido 82 com lisina é descrita na Figura 23 (SEQ ID NO: 17).

[00449] As sequências de CDR de C3E-7000 e C3E-7034 com base na definição de CDR de IMGT são descritas na Figura 24 (SEQ ID NO: 26) para a CDR-H1, Figura 25 (SEQ ID NO: 27) para a CDR-H2, Figura 26 (SEQ ID NO: 28) para a CDR-H3, Figura 27 (SEQ ID NO: 29) para a CDR-L1, Figura 28 (SEQ ID NO: 30) para a CDR-L2 e Figura 29 (SEQ ID NO: 31) para a CDR-L3.

4)-2-3 Modificação de scFv anti-CD3 humanizado C3E-7034 [00450] De modo a preparar variantes tendo atividade de ligação e atividade citotóxica distintivas enquanto mantém a reatividade cruzada com CD3e de macaco, variantes foram projetadas, do mesmo modo como no método descrito no Exemplo 4)-2-1, pela substituição de aminoácidos nas regiões de arcabouço de VL de C3E-7034 com aqueles correspondentes na VL de scFv (sequência contendo as quatro mutações A2S, S8P, V13A e F80L em IGLVl-40*01).

4)-2-3-1 Projeto de sequência de aminoácidos de C3E-7035 [00451] A sequência de aminoácido de C3E-7035 servindo como uma variante de C3E-7034 foi projetada. A sequência de aminoácido da cadeia leve de C3E-7035 projetada a partir da região variável de cadeia leve de C3E7034 mostrada na Figura 23 (SEQ ID NO: 17) pela substituição de asparagina na posição de aminoácido 1 com glutamina, a substituição de fenilalanina na posição de aminoácido 2 com alanina, a substituição de metionina na posição

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113/152 de aminoácido 3 com valina, a substituição de histidina na posição de aminoácido 8 com serina, a substituição de ácido glutâmico na posição de aminoácido 12 com glicina, a substituição de serina na posição de aminoácido 13 com valina, a substituição de lisina na posição de aminoácido 16 com glutamina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 17 com arginina, a substituição de histidina na posição de aminoácido 40 com leucina, a substituição de ácido glutâmico na posição de aminoácido 41 com prolina, a substituição de serina na posição de aminoácido 43 com treonina, a substituição de serina na posição de aminoácido 44 com alanina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 46 com lisina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 47 com leucina, a substituição de isoleucina na posição de aminoácido 48 com leucina, a substituição de ácido aspártico na posição de aminoácido 57 com serina, a substituição de serina na posição de aminoácido 60 com prolina, a substituição de isoleucina na posição de aminoácido 67 com lisina, a deleção de ácido aspártico na posição de aminoácido 68, a deleção de arginina na posição de aminoácido 69, a substituição de serina na posição de aminoácido 71 com glicina, a substituição de lisina na posição de aminoácido 72 com treonina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 77 com alanina, a substituição de serina na posição de aminoácido 79 com treonina, a substituição de asparagina na posição de aminoácido 80 com glicina, a substituição de leucina na posição de aminoácido 81 com fenilalanina, a substituição de lisina na posição de aminoácido 82 com glutamina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 83 com alanina e a substituição de fenilalanina na posição de aminoácido 90 com tirosina é descrita na Figura 30 (SEQ ID NO: 20). A sequência completa de C3E-7035 contendo metionina e alanina inseridas imediatamente antes da região variável de cadeia leve está descrita na Figura 31 (SEQ ID NO: 22) da Listagem de Sequências.

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4)-2-3-2 Projeto de sequência de aminoácidos de C3E-7036 [00452] A sequência de aminoácido de C3E-7036 servindo como uma variante de C3E-7034 foi projetada. A sequência de aminoácido da cadeia leve de C3E-7036 projetada a partir da região variável de cadeia leve de C3E7034 mostrada na Figura 23 (SEQ ID NO: 17) pela substituição de histidina na posição de aminoácido 8 com serina, a substituição de ácido glutâmico na posição de aminoácido 12 com glicina, a substituição de serina na posição de aminoácido 13 com valina, a substituição de lisina na posição de aminoácido 16 com glutamina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 17 com arginina, a substituição de lisina na posição de aminoácido 23 com treonina, a substituição de arginina na posição de aminoácido 24 com glicina, a substituição de histidina na posição de aminoácido 40 com leucina, a substituição de ácido glutâmico na posição de aminoácido 41 com prolina, a substituição de serina na posição de aminoácido 43 com treonina, a substituição de serina na posição de aminoácido 44 com alanina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 46 com lisina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 47 com leucina, a substituição de isoleucina na posição de aminoácido 48 com leucina, a substituição de ácido aspártico na posição de aminoácido 57 com serina, a substituição de serina na posição de aminoácido 60 com prolina, a substituição de isoleucina na posição de aminoácido 67 com lisina, a deleção de ácido aspártico na posição de aminoácido 68, a deleção de arginina na posição de aminoácido 69, a substituição de serina na posição de aminoácido 71 com glicina, a substituição de lisina na posição de aminoácido 72 com treonina, a substituição de treonina na posição de aminoácido 77 com alanina, a substituição de serina na posição de aminoácido 79 com treonina, a substituição de asparagina na posição de aminoácido 80 com glicina, a substituição de leucina na posição de aminoácido 81 com fenilalanina, a substituição de lisina na posição de aminoácido 82 com glutamina, a

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115/152 substituição de treonina na posição de aminoácido 83 com alanina e a substituição de fenilalanina na posição de aminoácido 90 com tirosina está descrita na Figura 32 (SEQ ID NO: 23). A sequência de aminoácidos completa de C3E-7036 está descrita na Figura 33 (SEQ ID NO: 25).

4)-2-3-3 Projeto de aminoácido nas variantes de CDR [00453] Para o propósito de remover um sítio de desaminação presente em C3E-7034 CDRH2 (Figura 25, SEQ ID NO: 27), C3E-7078 tendo arginina substituída no lugar de asparagina na posição de aminoácido 53 na região variável de cadeia pesada C3E-7034 mostrada na Figura 22 (SEQ ID NO: 16) e C3E-7079 tendo serina substituída consequentemente foram projetadas. Também, C3E-7085 tendo arginina substituída no lugar de asparagina na posição de aminoácido 53 na região variável de cadeia pesada C3E-7036 foi projetada. A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7078 está listada na Figura 68 (SEQ ID NO: 60). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7079 está listada na Figura 70 (SEQ ID NO: 62). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7085 está listada na Figura 72 (SEQ ID NO: 64).

[00454] Para o propósito de reduzir a afinidade de C3E-7078 para CD3 humano, C3E-7086 tendo glicina substituída no lugar de ácido aspártico na posição de aminoácido 52 na região variável de cadeia leve de C3E-7078, C3E-7087 tendo glutamina substituída consequentemente, C3E-7088 tendo asparagina substituída consequentemente, C3E-7089 tendo serina substituída consequentemente e C3E-7090 tendo alanina substituída consequentemente foram projetadas. Igualmente, com o propósito de reduzir a afinidade de C3E7079 para CD3 humano, C3E-7091 tendo glicina substituída no lugar de ácido aspártico na posição de aminoácido 52 na região variável de cadeia leve C3E7079, C3E-7092 tendo glutamina substituída consequentemente, C3E-7093 tendo asparagina substituída consequentemente, C3E-7094 tendo serina substituída consequentemente e C3E-7095 tendo alanina substituída

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116/152 consequentemente foram projetadas. A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7086 está listada na Figura 74 (SEQ ID NO: 66). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7087 está listada na Figura 76 (SEQ ID NO: 68). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7088 está listada na Figura 78 (SEQ ID NO: 70). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7089 está listada na Figura 80 (SEQ ID NO: 72). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7090 está listada na Figura 82 (SEQ ID NO: 74). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7091 está listada na Figura 84 (SEQ ID NO: 76). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7092 está listada na Figura 86 (SEQ ID NO: 78). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7093 está listada na Figura 88 (SEQ ID NO: 80). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7094 está listada na Figura 90 (SEQ ID NO: 82). A sequência de aminoácidos inteira de C3E-7095 está listada na Figura 92 (SEQ ID NO: 84). 4)-3 Preparação de scFv anti-CD3 humanizado (C3E-7034, C3E-7035 e C3E7036)

4)-3-1 Construção do vetor de expressão pC3E-7034 de scFv anti-CD3 humanizado (C3E-7034) [00455] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA de scFv contendo uma cadeia leve de C3E-7034 (mostrada na Figura 23 (SEQ ID NO: 17)) conectada ao terminal carboxila da cadeia pesada de C3E7034 (mostrada na Figura 22 (SEQ ID NO: 16)) por intermédio de um ligante flexível de 15 aminoácidos foi sintetizado com sequências adicionais de 15 bases fixadas a montante e a jusante (GeneArt Gene Synthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.). Uma região contendo o DNA de C3E7034 e sequências adicionais a montante e a jusante foi amplificada pela PCR usando este fragmento de DNA como um padrão para se obter um fragmento de DNA de inserto. Uma região de vetor exceto para a região scFv foi amplificada pela PCR usando o vetor de expressão pC3E-7000 preparado no Exemplo 4)-1-1 como um padrão para se obter um fragmento de vetor. Estes

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117/152 fragmentos de DNA foram recozidos usando o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar um vetor de expressão de scFv anti-CD3 humanizado pC3E-7034 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 34 (SEQ ID NO: 18) na ORF.

4)-3-2 Construção de vetor de expressão de scFv anti-CD3 humanizado (C3E-

7035) pC3E-7035 [00456] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA de scFv contendo a cadeia leve de C3E-7035 (mostrada na Figura 30 (SEQ ID NO: 20)) conectada ao terminal carboxila da cadeia pesada de C3E7034 (mostrada na Figura 22 (SEQ ID NO: 16)) por intermédio de um ligante flexível de 17 aminoácidos foi sintetizado com as sequências adicionais de 15 bases fixadas a montante e a jusante (GeneArt Gene Synthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.). Um vetor de expressão de C3E-7035 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 35 (SEQ ID NO: 21) na ORF foi construído do mesmo modo como no Exemplo 4)-3-1. O vetor de expressão resultante foi designado como “pC3E-7035.”

4)-3-3 Construção de vetor de expressão de scFv anti-CD3 humanizado (C3E-

7036) pC3E-7036 [00457] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA de scFv contendo a cadeia leve de C3E-7036 (mostrada na Figura 32 (SEQ ID NO: 23)) conectada ao terminal carboxila da cadeia pesada de C3E7034 (mostrada na Figura 22 (SEQ ID NO: 16)) por intermédio de um ligante flexível de 15 aminoácidos foi sintetizado com sequências adicionais de 15 bases fixadas à sua a montante e a jusante (GeneArt Gene Synthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.). Um vetor de expressão C3E-7036 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 36 (SEQ ID NO: 24) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 4)-3-1. O vetor de expressão resultante foi designado como “pC3E-7036.”

4)-3-4 Construção de vetores de expressão de scFv de anticorpo CD3

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118/152 humanizado modificado na CDR [00458] A mutagênese loco-dirigida com base na PCR foi realizada usando pC3E-7034 contendo a sequência de nucleotídeo de C3E-7034 mostrada na Figura 34 (SEQ ID NO: 18) na ORF como um padrão e usando iniciadores tendo a sequência de nucleotideos mostrada nas Figuras 93 e 94 (SEQ ID NOs: 85 e 86) para preparar um vetor de expressão C3E-7078 contendo a sequência de nucleotídeo de C3E-7078 tendo arginina substituída no lugar de asparagina na posição de aminoácido 53 na região variável de cadeia pesada de C3E-7034, na ORF. O vetor de expressão resultante foi designado como “pC3E-7078.” Igualmente, a mutagênese loco-dirigida com base na PCR foi realizada usando pC3E-7034 como um padrão e usando os iniciadores das Figuras 95 e 96 (SEQ ID NOs: 87 e 88) para preparar um vetor de expressão C3E-7079 contendo a sequência de nucleotídeo de C3E7079 tendo serina substituída no lugar de asparagina na posição de aminoácido 53 na região variável de cadeia pesada de C3E-7034. O vetor de expressão resultante foi designado como “pC3E-7079.” Igualmente, a mutagênese loco-dirigida com base na PCR foi realizada usando pC3E-7036 como um padrão e usando iniciadores das Figuras 93 e 94 (SEQ ID NOs: 85 e 86) para preparar um vetor de expressão de C3E-7085 contendo a sequência de nucleotídeo de C3E-7085 tendo arginina substituída no lugar de asparagina na posição de aminoácido 53 na região variável de cadeia pesada C3E-7036. O vetor de expressão resultante foi designado como “pC3E-7085.” [00459] Vetores de expressão contendo a sequência de nucleotídeo de C3E-7086 tendo glicina substituída no lugar de ácido aspártico na posição de aminoácido 52 na região variável de cadeia leve de C3E-7078, C3E-7087 tendo glutamina substituída consequentemente, C3E-7088 tendo asparagina substituída consequentemente, C3E-7089 tendo serina substituída consequentemente, ou C3E-7090 tendo alanina substituída consequentemente na ORF e vetores de expressão contendo a sequência de nucleotídeo de C3E

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119/152

7091 tendo glicina substituída no lugar de ácido aspártico na posição de aminoácido 52 na região variável de cadeia leve de C3E-7079, C3E-7092 tendo glutamina substituída consequentemente, C3E-7093 tendo asparagina substituída consequentemente, C3E-7094 tendo serina substituída consequentemente, ou C3E-7095 tendo alanina substituída consequentemente na ORF também foram preparados pelo mesmo método como acima. Uma lista dos nomes dos vetores preparados, padrões e iniciadores está resumida na Tabela 1 e uma lista de iniciadores está resumido na Figura 105.

[Tabela 1]

ID do Clone	Padrão	Iniciador avançado	Iniciador reverso
C3E-7086	C3E-7078	LD52G Fw	LD52G Rv
C3E-7087	C3E-7078	LD52Q Fw	LD52Q Rv
C3E-7088	C3E-7078	LD52N Fw	LD52N Rv
C3E-7089	C3E-7078	LD52S Fw	LD52S Rv
C3E-7090	C3E-7078	LD52A Fw	LD52A Rv
C3E-7091	C3E-7079	LD52G Fw	LD52G Rv
C3E-7092	C3E-7079	LD52Q Fw	LD52Q Rv
C3E-7093	C3E-7079	LD52N Fw	LD52N Rv
C3E-7094	C3E-7079	LD52S Fw	LD52S Rv
C3E-7095	C3E-7079	LD52A Fw	LD52A Rv

4)-3-5 Expressão e purificação de scFv anti-CD3 humanizado [00460] C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036 foram expressos e purificados da mesma maneira como no Exemplo 4)-1-2.

4)-3-6 Expressão e purificação de scFv anti-CD3 humanizado modificado na CDR [00461] As variantes de CDR C3E-7078, C3E-7079, C3E-7085, C3E7086, C3E-7087, C3E-7088, C3E-7089, C3E-7090, C3E-7091, C3E-7092, C3E-7093, C3E-7094 e C3E-7095 foram expressas e purificadas da mesma maneira como no Exemplo 4)-1-2.

[00462] (Exemplo 5) Análise de estrutura cristalina de scFv anti-CD3

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120/152 humanizado (C3E-7034)

5)-1 Preparação de um complexo de scFv anti-CD3 humanizado (C3E-7034)antígeno de cadeia única humano CD3ay [00463] CD3ay preparado no Exemplo 2)-2-1 e C3E-7034 preparado no Exemplo 4)-3-1 foram misturados em uma razão molar de 1:2. A solução tampão foi substituída com 10 mM de Tris HC1 (pH 7,5) e 50 mM de NaCl usando Amicon Ultra 15 MWCO 10K (Merck Millipore) e a solução resultante foi concentrada para 3,5 mg/mL. Este concentrado foi purificado pela cromatografia de filtração em gel usando Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Uma fração do complexo foi concentrada em aproximadamente 4,0 mg/mL usando Amicon Ultra 15 MWCO 10K (Millipore).

5)-2 Cristalização [00464] O complexo resultante de CD3ay e C3E-7034 foi cristalizado pelo método da difusão de vapor. A 0,5 pL da solução de proteína, uma quantidade igual de uma solução precipitante (0,1 M de MES monohidratado (pH 6,5), 1,6 M de sulfato de amônio e 10% v/v de 1,4-dioxano) foi adicionada e a solução resultante foi colocada em um recipiente selado contendo 0,05 mL de uma solução precipitante de modo que as soluções não tivessem nenhum contato entre si. O recipiente foi deixado repousar a 25°C. Um mês mais tarde, cristais tipo bastão de 0,1 mm x 0,05 mm x 0,05 mm foram obtidos.

5)-3 Análise de estrutura cristalina de raio X e identificação de epítopo [00465] O cristal resultante foi imerso em Perfluoropoliéter PFOX175/08 (Hampton Research Corp.) e subsequentemente congelado em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raio X foram coletados usando linha de luz BL41XU (SPring-8, Hyogo, Japão). A intensidade de difração foi digitalizada a partir da imagem de difração resultante usando software imosflm (CCP4: Collaborative Computational Project No. 4) para determinar

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121/152 fatores de estrutura cristalina. Os cristais foram em um sistema hexagonal com um grupo espacial de P62 e células unitárias de a = 193,54 ângstroms, b = 193,54 ângstroms e c = 43,88 ângstroms.

[00466] O método da substituição molecular foi realizado usando os fatores estruturais resultantes e as coordenadas estruturais tridimensionais dos modelos de homologia para determinar fases. Um software phaser (CCP4: Collaborative Computational Project No. 4) foi usado no cálculo. Os cristais contiveram um complexo em uma unidade assimétrica.

[00467] O refinamento estrutural foi realizado usando o software Refmac5 (CCP4: Collaborative Computational Project No. 4) e a correção de modelo foi realizada usando o software Coot. Esta operação foi realizada repetidamente para se obter um fator R final de 22,1 % e um fator R livre de 27,0% com uma resolução de 3,3 ângstroms. O modelo final conteve resíduos de aminoácido 1 a 108 da região de cadeia leve C3E-7034 (Figura 23, SEQ ID NO: 17), resíduos de aminoácido 1 a 118 da região de cadeia pesada C3E7034 (Figura 22, SEQ ID NO: 16), resíduos de aminoácido 33 a 67 e 71 a 118 da região CD3a (Figura 1, SEQ ID NO: 1) e resíduos de aminoácidos 23 a 103 da região CD3y (Figura 37, SEQ ID NO: 3). Os resíduos de aminoácido 68 a 70 da região CD3a (Figura 1, SEQ ID NO: 1) e a região de terminal amino (resíduo de aminoácido 1), a porção de ligante (resíduos de aminoácido 120 a 134) e a região de terminal carboxila (resíduos de aminoácidos 243 a 269) de C3E-7034 (Figura 38, SEQ ID NO: 19) não foram incluídos no modelo por causa da sua densidade elétrica obscura. A Figura 39 mostra o modelo de fita do complexo inteiro e a superfície.

[00468] A Figura 40 mostra a interação entre CD3e e as cadeias leve e pesada de C3E-7034. O painel A é um diagrama em que os aminoácidos de CD3e tendo uma distância dentro de 4 ângstroms da região variável de cadeia leve de C3E-7034 são indicados pelas barras espessas no modelo e os outros aminoácidos são indicados pelas barras finas no modelo. No diagrama, Ser55,

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Glu56, ArglOl, Glyl02, SerlO3, Lysl04 e Prol05 indicados pelo nome de resíduo e no. de resíduo dentro de caixas são resíduos de aminoácido de CD3a tendo uma distância dentro de 4 ângstroms da região variável de cadeia leve de C3E-7034 e cada posição de aminoácido corresponde a uma posição na SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências. O Painel B é um diagrama em que os resíduos de aminoácido de CD3e tendo uma distância dentro de 4 ângstroms da região variável de cadeia pesada de C3E-7034 são indicados pelas barras espessas no modelo e os outros aminoácidos são indicados pelas barras finas no modelo. No diagrama, Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78 e ArglOl indicados pelo nome de resíduo e no. de resíduo dentro de caixas são aminoácidos de CD3a e cada posição de aminoácido corresponde à posição na SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências. Os seguintes resíduos de aminoácido têm uma distância dentro de 4 ângstroms de C3E-7034 e foram interpretados como sendo epítopos no CD3a para C3E-7034: Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, ArglOl, Glyl02, Serl03, Lysl04 e Prol05.

[00469] Entre estes epítopos no CD3a para C3E-7034, ArglOl, Glyl02, Serl03, Lysl04 e Prol05 são resíduos de epítopo comuns no CD3a para OKT3 e UCHT1 (Kjer-Nielsen et al., PNAS 101 (2004), p. 7675-80; e Arnett et al., PNAS 101 (2004), p. 16268-73). Também foi revelado que C3E7034 não interage com as posições de aminoácido de 22 a 48 na SEQ ID NO: 1, que corresponde aos epítopos para os anticorpos anti-CD3 tais como I2C e H2C como descritos na WO2008/119565A2. A Figura 41 mostra resíduos interagentes com a sequência de CD3a. A sequência de sinal de CD3a é indicada pelas letras em itálico e os aminoácidos tendo uma distância dentro de 4 ângstroms de C3E-7034 são sublinhados.

(Exemplo 6) Preparação de OKT3 scFv humanizado

6)-l Construção do vetor de expressão de ScFv de OKT3 pC3E-3OOO [00470] scFv de um anticorpo monoclonal anti-CD3 de camundongo

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0KT3 (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29, Orthoclone, Janssen-Cilag) foi preparado pelo mesmo método como no Exemplo 4)-1-1 e inserido em um vetor de expressão derivado de pcDNA3.3 para células animais. O vetor de expressão resultante foi designado como “pC3E-3OOO.”

6)-2 Projeto de sequência de aminoácidos de ScFv de OKT3 humanizada (C3E-3OOO) [00471] Com base no método descrito no Exemplo 4)-2-1, a sequência de aminoácido de C3E-3007 servindo como uma forma humanizada de OKT3 foi projetada com as sequências de consenso do subgrupo humano gama 1 e capa 4 como aceitadores. Os aminoácidos capa 1 foram introduzidos em alguns sítios em consideração da influência sobre as contagens de imunogenicidade e sobre as propriedades físicas. A sequência de aminoácido da cadeia leve de C3E-3007 projetada a partir da região variável de cadeia pesada de OKT3 mostrada na Figura 42 (SEQ ID NO: 36) pela substituição de glutamina na posição de aminoácido 5 com valina, leucina na posição de aminoácido 11 com serina, alanina na posição de aminoácido 12 com lisina, arginina na posição de aminoácido 13 com lisina, metionina na posição de aminoácido 20 com valina, lisina na posição de aminoácido 38 com arginina, arginina na posição de aminoácido 40 com alanina, isoleucina na posição de aminoácido 48 com metionina, lisina na posição de aminoácido 67 com arginina, alanina na posição de aminoácido 68 com valina, leucina na posição de aminoácido 70 com isoleucina, treonina na posição de aminoácido 72 com alanina, serina na posição de aminoácido 76 com treonina, glutamina na posição de aminoácido 82 com ácido glutâmico, treonina na posição de aminoácido 87 com arginina, serina na posição de aminoácido 91 com treonina, treonina na posição de aminoácido 114 com leucina e leucina na posição de aminoácido 115 com valina está descrita na Figura 43 (SEQ ID NO: 38).

[00472] A sequência de aminoácido da cadeia leve de C3E-3007

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124/152 projetada a partir da região variável de cadeia leve de 0KT3 mostrada na Figura 44 (SEQ ID NO: 37) pela substituição de valina na posição de aminoácido 3 com glutamina, leucina na posição de aminoácido 4 com metionina, alanina na posição de aminoácido 9 com serina, isoleucina na posição de aminoácido 10 com serina, metionina na posição de aminoácido 11 com leucina, serina na posição de aminoácido 12 com alanina, alanina na posição de aminoácido 13 com valina, prolina na posição de aminoácido 15 com leucina, lisina na posição de aminoácido 18 com arginina, valina na posição de aminoácido 19 com alanina, metionina na posição de aminoácido 21 com isoleucina, serina na posição de aminoácido 39 com prolina, treonina na posição de aminoácido 41 com lisina, serina na posição de aminoácido 42 com alanina, alanina na posição de aminoácido 59 com ácido aspártico, histidina na posição de aminoácido 60 com arginina, arginina na posição de aminoácido 62 com serina, serina na posição de aminoácido 69 com ácido aspártico, tirosina na posição de aminoácido 70 com fenilalanina, serina na posição de aminoácido 71 com treonina, glicina na posição de aminoácido 76 com serina, metionina na posição de aminoácido 77 com leucina, ácido glutâmico na posição de aminoácido 78 com glutamina, alanina na posição de aminoácido 82 com valina, serina na posição de aminoácido 99 com glutamina e leucina na posição de aminoácido 103 com valina está descrita na Figura 45 (SEQ ID NO: 39).

6)-3 Construção de vetor de expressão de ScFv de OKT3 humanizado (C3E3007) pC3E-3007 [00473] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência da região de DNA de scFv contendo a cadeia leve de C3E-3007 (mostrada na Figura 45 (SEQ ID NO: 39)) conectada ao terminal carboxila da cadeia pesada de C3E-3007 (mostrada na Figura 43 (SEQ ID NO: 38)) por intermédio de um ligante flexível de 15 aminoácidos e sequências adicionais de 15 bases a montante e a jusante do mesmo foi sintetizado (GeneArt Gene

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Synthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.). Um vetor de expressão C3E-3007 contendo a sequência de nucleotideo da Figura 46 (SEQ ID NO: 34) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 4)-3-1. Ο vetor de expressão resultante foi designado como “pC3E-3007.”

6) -4 Expressão e purificação de ScFv de 0KT3 humanizado (C3E-3007) [00474] C3E-3007 foi expresso e purificado da mesma maneira como

Exemplo 4)-1-2. A sequência de aminoácido de C3E-3007 está descrita na Figura 47 (SEQ ID NO: 35).

[00475] (Exemplo 7) A atividade in vitro de scFv anti-CD3 humanizado

7) -l Estudo da atividade de ligação de scFv anti-CD3 humanizado (C3E3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036) contra CD3 humano

7)-1-1 Estudo da atividade de ligação de scFv anti-CD3 humanizado (C3E3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036) ao CD3 humano pela citometria de fluxo [00476] PBMC humana comercialmente disponível (Cellular Technology Ltd. (CTL)) foi ajustada a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próxima ao IR Fixável VIVA/MORTA (Thermo Fisher Scientific Inc.) e um anticorpo anti-CD19 (Beckman Coulter Inc.) foram adicionados às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL com PBS contendo 5% de FBS, adicionados em uma concentração de 100 pL/poço a uma microplaca de fundo em U de 96 poços e centrifugadas para remover um sobrenadante. Cada scFv anti-CD3 humanizado (C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036) diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado em uma concentração de 100 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 60 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois,

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Penta-His Alexa Fluor 488 (Qiagen N.V.) diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado em uma concentração de 30 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star Inc.). A intensidade de fluorescência média (MFI) de Alexa Fluor 488 em uma fração livre de células mortas e as células positivas em CD 19 foram calculadas. O valor MFI da amostra não suplementada com scFv foi subtraída do valor de MFI da amostra suplementada com scFv para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). Como mostrado na Figura 48, os scFvs anti-CD3 humanizados foram verificados ligarem-se ao CD3 humano.

7)-1-2 Estudo de atividade de ligação de scFvs anti-CD3 humanizados (C3E3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036) ao CD3 humano por SPR [00477] A afinidade de cada scFv anti-CD3 humanizado (C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036) para CD3 foi determinada pelo método da ressonância plasmônica superficial usando BIAcore T-200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Cinco concentrações diferentes do scFv foram injetadas dentro do CD3 imobilizado sobre um chip sensor. Rmax foi estimado a partir da resposta resultante e a concentração de anticorpo que atingiu 1/2 do mesmo foi definido como a constante de dissociação do scFv para CD3. Como um resultado, as constantes de dissociação destes scFvs para CD3 foram 400, 4,5, 22 e 25 nM, respectivamente.

7)-2 Um estudo da atividade de ligação de anticorpo humanizado CD3 scFv (C3E-3007, C3E-7034 e C3E-7036) com CD3 de macaco cinomolgo 7)-2-1 Preparação de PBMC de Macaco Cinomolgo [00478] As PBMC foram coletadas do sangue de um macaco cinomolgo de acordo com o método padrão usando SepMate (StemCell

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Technologies Inc.) e Solução de Separação de Linfócito (Nacalai Tesque Inc.).

7)-2-2 Estudo de atividade de ligação de scFvs anti-CD3 humanizados (C3E3007, C3E-7034, C3E-7035 e C3E-7036) ao CD3 de macaco cinomolgo pela citometria de fluxo [00479] As PBMC de macaco cinomolgo obtidas no Exemplo 7)-2-1 foram ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS e tingidas e analisadas da mesma maneira como Exemplo 7)-1-1. Como mostrado na Figura 49, os scFvs anti-CD3 humanizados (C3E-7034, C3E7035 e C3E-7036) foram verificados ligar-se ao CD3 de macaco cinomolgo.

7)-3 Ativação de célula T de scFvs anti-CD3 humanizados (C3E-3007 e, C3E-7034) [00480] As células mononucleares de sangue periférico humanas (PBMC) foram isoladas da camada de célula branca fresca de doadores aleatórios pelo método da centrifugação de gradiente de densidade usando Lympholyte-H (Cedarlane). Cada scFv anti-CD3 humanizado (C3E-3007 e C3E-7034) diluído para 100 nM com LR10 (RPMI1640 contendo 10% de IgG FBS ultrabaixo (Thermo Fisher Scientific Inc.)) e a mesma concentração de anticorpo Anti-His (Qiagen N.V.) foram misturados nas mesmas quantidades. As PBMC de ser humano ou macaco foram ajustadas para 2 x 10⁵ células com LR10 e misturadas com a mistura do scFv anti-CD3 humanizado e anticorpo Anti-His, na mesma quantidades em uma microplaca de fundo em U de 96 poços e cultivadas a 37°C durante 24 horas sob condições de 5% de CO2. Depois da conclusão da reação, a solução de reação foi centrifugada e um tampão classificador (HBSS(-) (Thermo Fisher Scientific Inc.), 0,1% de BSA (Sigma-Aldrich Corp.) e 0,1% de azida de sódio (Sigma-Aldrich Corp.)) foram adicionados. Depois da centrifugação, o Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo ao Infravermelho Fixável VIVA/MORTA (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionado às células, que

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128/152 foram depois deixadas repousar a 4°C durante 20 minutos. As células foram lavadas com um tampão classificador. Depois, um anticorpo anti-CD69 rotulado com PE (Becton, Dickinson e Company) e um anticorpo anti-CD8 rotulado com FITC (Becton, Dickinson e Company) diluído com um tampão classificador foram adicionados às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 20 minutos. As células foram lavadas com um tampão classificador e depois recolocadas em suspensão em PBS (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) contendo 1% de paraformaldeído, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto II; Becton, Dickinson and Company). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star Inc.). A razão de uma fração altamente expressando CD8 e altamente expressando PE para uma fração livre de células mortas foi calculada como a porcentagem com respeito à população (% de parentes). Como mostrado na Figura 50, os scFvs anti-CD3 humanizados foram verificados ativar células que altamente expressam CD8 de ser humano e macaco.

7) -4 Comparação da atividade de ligação de scFv anti-CD3 humanizado modificado na CDR com CD3 de ser humano e macaco cinomolgo pela citometria de fluxo [00481] As PBMC humanas obtidas no Exemplo 7)-1-1 e as PBMC de macaco cinomolgo obtidas no Exemplo 7)-2-1 foram cada uma ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS e tingidas e analisadas da mesma maneira como no Exemplo 7)-1-1. Como mostrado na Figura 106, os scFvs anti-CD3 humanizados modificados na CDR foram confirmados ter atividade de ligação com CD3 tanto de ser humano quanto de macaco.

(Exemplo 8) Preparação de scFv anti-TROP2 humanizado

8) -l Construção de vetor de expressão de scFv HT1-11 pHTl-1 IscFv [00482] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA codificando os aminoácidos de scFv HT1-11 mostrada na Figura 51

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129/152 (SEQ ID NO: 41) foi sintetizado (GeneArt Gene Synthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.). O fragmento de DNA sintetizado foi inserido dentro de um vetor derivado de pcDNA-3.3TOPO (Thermo Fisher Scientific Inc.) usando o kit de clonagem pela PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de scFv anti-TROP2 humanizado pHTl-llscFv contendo a sequência de nucleotídeo mostrada na Figura 52 (SEQ ID NO: 40) na ORF.

8)-2 Expressão e purificação de scFv HT1-11 (HT1-11 scFv) [00483] scFv HT1-11 foi expresso e purificado da mesma maneira como no Exemplo 4)-1-2.

(Exemplo 9) Avaliação da atividade de ligação de scFv anti-TROP2 humanizado (HT1-11 scFv) contra TROP2 humano pela citometria de fluxo [00484] Uma linhagem FaDu de célula cancerosa de célula escamosa faríngea (ATCC) ou uma linhagem HPAF-II de célula cancerosa pancreática (ATCC) foram ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo ao Infravermelho Fixável VIVA/MORTA foi adicionado às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 1 x 10⁶células/mL com PBS contendo 5% de FBS, adicionados em uma concentração de 100 pL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugadas para remover um sobrenadante. O scFv anti-TROP2 humanizado (scFv HT1-11) diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado em uma concentração de 100 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 60 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, Penta-His Alexa Fluor 488 diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado em uma concentração de 30 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois

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130/152 recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (FACSCanto® II). Os dados foram analisados usando Flowjo. A intensidade de fluorescência média (MFI) de Alexa Fluor 488 em uma fração livre de células mortas foi calculada. O valor de MFI da amostra não suplementada com anticorpo foi subtraída do valor MFI da amostra suplementada com scFv para calcular um valor relativo de MFI (rMFI). Como mostrado na Figura 53, o scFv anti-TROP2 humanizado foi verificado ligar-se ao TROP2 humano.

(Exemplo 10) Preparação de moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3

10)-1 Construção de um vetor de expressão de molécula biespecífica antiTROP2-CD3

10)-1-1 Construção do vetor de expressão de molécula biespecífica scFv HT1-11/C3E-7034 (T2C-0001) [00485] Um fragmento de DNA de inserto foi obtido pela PCR usando o pscFv HT1-11 preparado no Exemplo 8)-l como um padrão e usando iniciadores projetados para adicionar as sequências de nucleotídeos de scFv HT1-11 e uma porção de uma sequência de sinal da cadeia pesada de anticorpo humano ao lado 5’ e adicionar a sequência de nucleotídeo de um ligante para conectar scFvs ao lado 3’. Também, um fragmento de DNA vetorial contendo a região inteira de vetor incluindo o DNA de scFv anti-CD3 foi obtido pela PCR usando o vetor de expressão pC3E-7034 preparado no Exemplo 4)-3-1 como um padrão e usando iniciadores codificando uma sequência de sinal e a sequência de terminal amino do scFv anti-CD3. Estes fragmentos de DNA foram ligados usando o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar um vetor de expressão de molécula biespecífica anti-TROP2-anti-CD3 pT2C-0001 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 54 (SEQ ID NO: 42) na ORF.

10)-1-2 Construção de um vetor de expressão de molécula biespecífica scFv HT1-11/C3E-3007 (T2C-0003)

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131/152 [00486] Um vetor de expressão de molécula biespecífica anti-TROP2CD3 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 55 (SEQ ID NO: 44) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 10)-1-1 exceto que pC3E-3007 foi usado como um padrão para preparar o fragmento de vetor. O vetor de expressão resultante foi designado como “pT2C-0003.”

10)-1-3 Construção de um vetor de expressão de molécula biespecífica scFv HT1-11/C3E-7035 (T2C-0005) [00487] Um vetor de expressão de molécula biespecífica anti-TROP2CD3 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 56 (SEQ ID NO: 46) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 10)-1-1 exceto que pC3E-7035 foi usado como um padrão para preparar o fragmento de vetor. O vetor de expressão resultante foi designado como “pT2C-0005.”

10)-1-4 Construção de um vetor de expressão de molécula biespecífica scFv HT1-11/C3E-7036 (T2C-0006) [00488] Um vetor de expressão de molécula biespecífica anti-TROP2CD3 contendo a sequência de nucleotídeo da Figura 57 (SEQ ID NO: 48) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 10)-1-1 exceto que pC3E-7036 foi usado como um padrão para preparar o fragmento de vetor. O vetor de expressão resultante foi designado como “pT2C-0006.”

10)-2 Expressão e purificação de moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 [00489] T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 e T2C-0006 foram expressas e purificadas da mesma maneira como no Exemplo 4)-1-2. A sequência de aminoácido de T2C-0001 está descrita na Figura 58 (SEQ ID NO: 43). A sequência de aminoácido de T2C-0003 está descrita na Figura 59 (SEQ ID NO: 45). A sequência de aminoácido de T2C-0005 está descrita na Figura 60 (SEQ ID NO: 47). A sequência de aminoácido de T2C-0006 está descrita na Figura 61 (SEQ ID NO: 49).

(Exemplo 11) Avaliação da atividade in vitro de moléculas biespecíficas antiTROP2-CD3

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11)-1 Avaliação da atividade de ligação por SPR

11)-1-1 Atividade de ligação de uma molécula biespecífica anti-TROP2-CD3 ao TROP2 [00490] A molécula biespecífica foi ensaiada quanto à sua ligação a TROP2 usando BIAcore 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) pelo método de captura, que envolve capturar o antígeno por um anticorpo de IgG anti-ser humano e ensaiar a molécula biespecífica como um análito. O antígeno usado foi a forma fundida TROP-2 recombinante humano/Fc de IgG humana (R&D Systems, Inc.). Aproximadamente 2000 RU do anticorpo IgG(Fc) anti-ser humano (Kit de Captura de Anticorpo Humano, GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) foram covalentemente ligadas a um chip sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) método de encaixe de amina. Similarmente, este anticorpo foi imobilizado sobre uma célula de referência. O tampão de condução usado foi HBS-P (10 mM de HEPES (pH 7,4), 0,15 M de NaCl e 0,005% de Tensoativo P20). A molécula biespecífica foi preparada em uma razão de diluição de 2 vezes de 200 nM a 1 nM. Uma solução a 1 pg/ml do antígeno foi adicionada sobre o chip imobilizado no anticorpo IgG(Fc) anti-ser humano durante aproximadamente 30 segundos. Depois, cada concentração da molécula biespecífica foi adicionada em uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min durante 300 segundos. Subsequentemente, a fase de dissociação foi monitorada durante 600 segundos. Uma solução 3 M de cloreto de magnésio foi adicionada como uma solução de regeneração durante 30 segundos. Os dados foram analisados usando o modelo da ligação 1:1 do software analítico (software BIAavaliation, versão 4.1.1) para calcular uma constante da taxa de associação (ka), uma constante da taxa de dissociação (kd) e uma constante de dissociação (KD; KD = kd/ka).

11)-1-2 Atividade de ligação de uma molécula biespecífica anti-TROP2-CD3 a um antígeno de cadeia única CD3ay humano [00491] A molécula biespecífica foi ensaiada quanto à sua ligação ao

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133/152 antígeno CD3ay usando BIAcore 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) por um método que envolve imobilizar o antígeno e ensaiar o anticorpo como um análito. O antígeno usado foi o antígeno de cadeia única de CD3ay humano preparado no Exemplo 2)-2-1. Aproximadamente 100 RU do antígeno foram covalentemente ligados a um chip sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) pelo método de encaixe de amina. O tratamento de imobilização foi realizado sem a adição de uma proteína antigênica como uma célula de referência. O tampão de condução usado foi HBS-P (10 mM de HEPES (pH 7,4), 0,15 M de NaCI e 0,005% de Tensoativo P20). A molécula biespecífica foi preparada em uma razão de diluição de 2 vezes de 1 μΜ (concentração mais alta) a 4 nM ou em uma razão de diluição de 2 vezes de 200 nM a 1 nM. Cada concentração da molécula biespecífica foi adicionada ao chip imobilizado em antígeno em uma taxa de fluxo de 10 μΐ/min durante 25 minutos e a quantidade da molécula biespecífica ligada a ele foi monitorada. Uma solução a 10 mM de glicina-ácido clorídrico (pH 1,5) foi adicionada como uma solução de regeneração durante 30 segundos. Os dados foram analisados usando software analítico (Software BIAavaliation, versão 4.1.1) para calcular uma constante de dissociação KD da quantidade da molécula biespecífica ligada em cada concentração. Os resultados são mostrados nas Tabelas 2 e 3.

[Tabela 2]_____________________________________________________________

	Nome	CD3ey KD (nM)
1	T2C-0001	13,9
2	T2C-0003	171
3	T2C-0005	126
4	T2C-0006	171

[Tabela 3]

	Nome	TROP2 KD (nM)
1	T2C-0001	12,8
2	T2C-0003	6,7

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3	T2C-0005	11,9
4	T2C-0006	9,3

11)-2 Avaliação da atividade de ligação pela citometria de fluxo

11)-2-1 Atividade de ligação de uma molécula biespecífica anti-TROP2-CD3 para TROP2 [00492] As mesmas linhagens de célula cancerosa como aquelas no Exemplo 9 foram usadas e tingidas e analisadas da mesma maneira como no Exemplo 9. Como mostrado na Figura 62, as moléculas biespecíficas antiTROP2-CD3 foram verificadas ligar-se a TROP2.

11)-2-2 Atividade de ligação de uma molécula biespecífica anti-TROP2-CD3 a um antígeno de cadeia única de CD3ey humano [00493] As células foram tingidas e analisadas da mesma maneira como no Exemplo 7)-1-1. Como mostrado na Figura 63, as moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 foram verificadas ligar-se ao antígeno de cadeia única de CD3ey humano.

11)-2-3 Atividade de ligação de uma molécula biespecífica anti-TROP2-CD3 a um antígeno de CD3 de macaco cinomolgo [00494] As PBMC de macaco cinomolgo obtidas no Exemplo 7)-2-1 foram ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS e tingidas e analisadas da mesma maneira como no Exemplo 7)-1-1. Como mostrado na Figura 64, as moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 (T2C-0001, T2C-0005 e T2C-0006) foram verificadas para ligar-se ao antígeno de CD3 de macaco cinomolgo.

11)-3 Avaliação da atividade citotóxica de moléculas biespecíficas antiTROP2-CD3

11)-3-1 Análise de expressão de TROP2 nas células alvo [00495] A linhagem de célula cancerosa de célula escamosa faríngea FaDu (ATCC), linhagem HPAF-II de célula cancerosa pancreática (ATCC), ou a linhagem de células Calu-6 de célula cancerosa pulmonar humana foram ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O

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Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo ao Infravermelho Fixável VIVA/MORTA (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionado às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma concentração de 100 pL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugadas para remover um sobrenadante. Anticorpo anti-TROP2 Alexa Fluor 488 (Affymetrix eBioscience) e Anticorpo de Controle de Isótipo (Affymetrix eBioscience) diluídos com PBS contendo 5% de FBS foram adicionados em uma concentração de 25 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Cytomics FC500, Beckman Coulter Inc.). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star Inc.). A intensidade de fluorescência média geométrica (MFI geométrica) de Alexa Fluor 488 em uma fração livre de células mortas foi calculada. Como mostrado nas Figuras 65A, 65B e 65C, a expressão de TROP2 foi observada nas células FaDu e HPAF-II, mas não foram observadas nas células Calu-6.

11)-3-2 Preparação de células alvo [00496] As células FaDu, HPAF-II, ou Calu-6 foram ajustadas a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL com um meio RPMI1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 10% de FBS. A cada linhagem de célula, 100 μΕ de Radionuclideo Cromo-51 (Perkin Elmer, Inc.) foram adicionados por mL da suspensão de célula e as células foram cultivadas a 37°C durante 2 horas sob condições de 5% de CO2. As células foram lavadas duas vezes com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS, depois recolocadas em suspensão a 2 x 10⁵células/mL em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células alvo.

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11)-3-3 Preparação de células efetoras [00497] PBMC congeladas comercialmente disponíveis (Cellular Technology Limited) foram descongeladas a 37°C, transferidas para uma solução de um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS suplementado com reagente Anti-agregado Wash (Cellular Technology Limited), lavadas duas vezes, depois ajustadas a 1 x 10⁶ células/mL com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células efetoras.

11)-3-4 Ensaio de citotoxicidade [00498] As células FaDu, as células HPAF-II, ou as células Calu-6 obtidas no Exemplo 11)-3-2 foram adicionadas em uma concentração de 50 pL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada molécula biespecífica anti-TROP2-CD3 ajustada em concentrações variáveis foi adicionada em uma concentração de 50 pL/poço. As células efetoras preparadas no Exemplo 11)-3-1-3 foram adicionadas em uma concentração de 100 pL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1000 rpm durante 1 minuto, as células foram cultivadas a 37°C durante 20 a 24 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota de 50 pL do sobrenadante foi recuperada em LumaPlate (Perkin Elmer, Inc.) e secada a 50°C durante aproximadamente 2 horas, seguido pela medição usando uma leitora de placa (TopCount; PerkinElmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas foi calculada de acordo com a seguinte expressão:

Porcentagem de Células Lisadas (%) = (A - B) / (C - B) x 100 A: Contagem do poço de amostra

B: Contagem de fundo média (poços não suplementados com anticorpo) (n = 3). 50 pL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. Os outros procedimentos foram os mesmos como no caso do poço de amostra.

[00499] C: Média da contagem de liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas em um tensoativo) (n = 3). 50 pL de um meio para ensaio

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137/152 foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. 100 pL do tensoativo foram adicionados e a alíquota de 50 pL foi transferida para LumaPlate, como com o poço de amostra e ensaiada.

[00500] Como mostrado nas Figuras 66A, 66B e 66C, estas moléculas biespecíficas anti-TROP2-CD3 exibiram atividade citotóxica contra as células FaDu e as células HPAF-II). Por outro lado, estas moléculas biespecíficas não exibiram nenhuma atividade citotóxica nas células Calu-6.

(Exemplo 12) Preparação de moléculas biespecíficas anti-Axl-CD3

12)-1 Construção de vetor de expressão de molécula biespecífica anti-AxlCD3

12)-1-1 Construção de vetor de expressão de molécula biespecífica scFv 11D5-T3/C3E-7034 (AXC-0001) [00501] A sequência de aminoácido de um anticorpo scFv 11D5-T3 de cadeia única anti-Axl foi projetada conectando-se a sequência com glicina adicionada no terminal N de h#HD5-T3H (descrita na Figura 12 no relatório descritivo de Publicação do Pedido de Patente Europeu No. 2270053) e h#HD5-T3L (descrita na Figura 6 no relatório descritivo da Publicação do Pedido de Patente Europeu No. 2270053) por intermédio de um ligante de polipeptídeo consistindo em uma sequência tendo 3 repetições de (GGGGS). Uma sequência de nucleotídeo codificando estas sequências de aminoácido foi sintetizada (GENEART, Thermo Fisher Scientific). Um fragmento de DNA de inserto foi obtido pela PCR usando esta sequência de nucleotídeo como um padrão e usando iniciadores projetadas para adicionar a sequência de nucleotídeo de uma porção de uma sequência de sinal da cadeia pesada de anticorpo humano à extremidade 5 ’ e adicionar a sequência de nucleotídeo de um ligante para conectar scFvs à extremidade 3’. Também, um fragmento de DNA vetorial foi obtido pela amplificação na PCR da região de vetor inteira incluindo DNA de scFv de CD3 usando o vetor de expressão pC3E-7034 preparado no Exemplo 4)-3-1 como um padrão e usando iniciadores

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138/152 consistindo em uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de sinal da cadeia pesada de anticorpo humano e o scFv de CD3. Os fragmentos de DNA ligados usando o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) resultou no vetor de expressão de molécula biespecífica anti-AXL-anti-CD3 pAXC-0001 contendo a sequência de nucleotídeo mostrada na Figura 97 (SEQ ID NO: 89) na ORF.

12)-1-2 Construção de vetor de expressão de molécula biespecífica scFv 11D5-T3/C3E-7036 (AXC-0002) [00502] Um vetor de expressão de molécula biespecífica anti-Axl-CD3 contendo a sequência de nucleotídeo mostrada na Figura 99 (SEQ ID NO: 91) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 10)-1-1 exceto que pC3E-7036 foi usado como um padrão para preparar o fragmento de vetor. O vetor de expressão resultante foi designado como “pAXC-0002.”

12) -2 Expressão e purificação de moléculas biespecíficas anti-AxL-CD3 [00503] AXC-0001 e AXC-0002 foram expressas e purificadas da mesma maneira como no Exemplo 4)-1-2. A sequência de aminoácido de AXC-0001 está descrita na Figura 98 (SEQ ID NO: 90). A sequência de aminoácido de AXC-0002 está descrita na Figura 100 (SEQ ID NO: 92).

(Exemplo 13) Avaliação de atividade in vitro de moléculas biespecíficas antiAxl-CD3

13) -1 Análise de expressão de Axl nas células alvo [00504] A linhagem de célula cancerosa pulmonar humana A549 (ATCC), linhagem de célula cancerosa pancreática humana PANC-1 (ATCC) ou MIA PaCa-2 (ATCC), linhagem célula de mieloma humana U266B1 (ATCC), ou linhagem de célula de linfoma da célula do manto Jeko-1 (ATCC) foi ajustado a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo ao Infravermelho Fixável VIVA/MORTA (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionado às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As

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139/152 células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma concentração de 100 pL/poço em uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugadas para remover o sobrenadante. O anticorpo anti-Axl (RD Systems, Inc.) e anticorpo de Controle de Isótipo (RD Systems, Inc.) diluídos com PBS contendo 5% de FBS foram adicionados em uma concentração de 25 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, anticorpo de IgG anticamundongo Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific Inc.) diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado em uma concentração de 25 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Cytomics FC500, Beckman Coulter Inc.). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star Inc.). A intensidade de fluorescência média geométrica (MFI geométrica) de Alexa Fluor 488 em uma fração livre de células mortas foi calculada. Como mostrado nas Figuras 107A, 107B, 107C, 107D e 107E, a expressão de Axl foi observada em A549, PANC-1 e MIA PaCa-2, mas não foi observada em U266B1 e Jeko-1.

13)-2 Preparação de células alvo [00505] A549, PANC-1, MIA PaCa-2, U266B1 e Jeko-1 foram cada uma ajustada a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL com um meio RPMI1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 10% de FBS. A cada linhagem de célula, 100 pL de Radionuclideo Cromo-51 (Perkin Elmer, Inc.) foram adicionados por mL da suspensão de célula e as células foram cultivadas a 37°C durante 2 horas sob condições de 5% de CO2. As células foram lavadas duas vezes com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS,

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140/152 depois recolocadas em suspensão a 2 x 10⁵ células/mL em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células alvo.

13)-3 Preparação de células efetoras [00506] PBMC congeladas comercialmente disponíveis (Cellular Technology Limited) foram descongeladas a 37°C, transferidas para uma solução de um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS suplementado com reagente Anti-agregado Wash (Cellular Technology Limited), lavadas duas vezes, depois ajustadas a 1 x 10⁶ células/mL com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células efetoras.

13)-4 Ensaio de citotoxicidade [00507] As células A549, PANC-1, MIA PaCa-2, U266B1, ou Jeko-1 obtidas no Exemplo 13)-2 foram adicionadas em uma concentração de 50 pL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada molécula biespecífica anti-Axl CD3 ajustada em concentrações variáveis foi adicionada em uma concentração de 50 pL/poço. As células efetoras preparadas no Exemplo 13)-3 foram adicionadas em uma concentração de 100 pL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1000 rpm durante 1 minuto, as células foram cultivadas a 37°C durante 20 a 24 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota de 50 pL do sobrenadante foi transferida para uma LumaPlate (Perkin Elmer, Inc.) e secada a 50°C durante aproximadamente 2 horas, seguido pela medição usando uma leitora de placa (TopCount; Perkin Elmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas foi calculada de acordo com a seguinte equação:

Porcentagem de células lisadas (%) = (A - B) / (C - B) x 100

A: Contagem do poço de amostra

B: Contagem Média do Fundo (poços não suplementados com anticorpo) (n = 3). 50 pL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. Os outros procedimentos foram os mesmos como no caso do poço de amostra.

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141/152 [00508] C: Média da contagem de liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas em um tensoativo) (n = 3). 50 pL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. 100 pL do tensoativo foram adicionados e a alíquota de 50 pL foi transferida para LumaPlate, como com o poço de amostra e ensaiada.

[00509] Como mostrado nas Figuras 108A, 108B, 108C, 108D e 108E, estas moléculas biespecíficas anti-Axl CD3 exibiram atividade citotóxica contra A549, PANC-1 e MIA PaCa-2. Entretanto, estas moléculas biespecíficas não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra U266B1 ou Jeko-1.

(Exemplo 14) Preparação de vetor de expressão de molécula biespecífica antiHLA-A2/MAGEC1-CD3

14)-1 Construção de vetor de expressão de molécula biespecífica anti-HLAA2/MAGEC1-CD3

14)-1-1 Construção de vetor de expressão de molécula biespecífica MAG-032 scFv/C3E-7034 (MGC-0001) [00510] scFv MAG-032 que especificamente se liga a HLAA2/MAGEC1 foi obtido de uma biblioteca de fago de anticorpo humano. Um fragmento de DNA de inserto contendo uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de scFv MAG-032 foi obtido pela PCR usando a sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de scFv MAG-032 como um padrão e usando iniciadores projetados para adicionar uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de sinal da cadeia pesada de anticorpo humano à extremidade 5 ’ e adicionar uma sequência de nucleotídeo codificando um ligante para conectar scFvs e uma porção de C3E-7034 à extremidade 3’. Também, um fragmento de DNA vetorial foi obtido pela amplificação em PCR da região de vetor inteira incluindo DNA de scFv anti-CD3 usando o vetor de expressão pC3E7034 preparado no Exemplo 4)-3-1 como um padrão e usando iniciadores

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142/152 consistindo em uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de sinal da cadeia pesada de anticorpo humano e a sequência de terminal amino do scFv anti-CD3. Estes fragmentos de DNA foram ligados usando um kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar um vetor de expressão de molécula biespecífica anti-HLA-A2/MAGECl-anti-CD3 pMGC-0001 contendo a sequência de nucleotídeo mostrada na Figura 101 (SEQ ID NO: 93) na ORF.

14)-1-2 Construção de vetor de expressão de molécula biespecífica scFv MAG-032 /C3E-7036 (MGC-0002) [00511] Um vetor de expressão de molécula biespecífica anti-HLAA2/MAGEC1-CD3 contendo a sequência de nucleotídeo mostrada na Figura 103 (SEQ ID NO: 95) na ORF foi construído da mesma maneira como no Exemplo 14)-1-1 exceto que pC3E-7036 foi usado como um padrão para preparar o fragmento de vetor. O vetor de expressão resultante foi designado como “pMGC-0002.”

14) -2 Expressão e purificação de moléculas biespecíficas anti-HLAA2/MAGEC1-CD3 [00512] MGC-0001 e MGC-0002 foram expressos e purificados da mesma maneira como no Exemplo 4)-1-2. A sequência de aminoácido de MGC-0001 está listada na Figura 102 (SEQ ID NO: 94). A sequência de aminoácido de MGC-0002 está listada na Figura 104 (SEQ ID NO: 96).

(Exemplo 15) Avaliação de atividade in vitro de moléculas biespecíficas antiHLA-A2/MAGEC1-CD3

15) -1 Análise de expressão de HLA-A2/MAGEC1 nas células alvo [00513] As células da linhagem de célula de fusão de linfoblasto humano T2 (ATCC) foram ajustadas a uma concentração apropriada com um meio AIM-V (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 20% de FBS. O peptídeo MAGEC1 da Figura 106 (SEQ ID NO: 97) (Sigma Genosys) ou DMSO foram adicionados às células, que foram depois incubadas a 37°C

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143/152 durante 4 horas. As células foram lavadas duas vezes com um meio AIM-V contendo 20% de FBS e depois ajustadas a uma concentração apropriada com PBS contendo 5% de FBS. O Kit de Tingimento de Célula Morta Próximo ao Infravermelho Fixável VIVA/MORTA (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada às células, que foram depois deixadas repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois ajustadas a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL com PBS contendo 5% de FBS, inoculadas em uma concentração de 100 pL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços e centrifugadas para remover um sobrenadante. O anticorpo anti-HLA-A2/MAGECl (MAG032 scFv) diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado em uma concentração de 25 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS. Depois, Penta-His Alexa Fluor 488 (Qiagen N.V.) diluído com PBS contendo 5% de FBS foi adicionado em uma concentração de 25 pL/poço e a placa foi deixada repousar a 4°C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% de FBS e depois recolocadas em suspensão em PBS contendo 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Cytomics FC500, Beckman Coulter Inc.). Os dados foram analisados usando Flowjo (Tree Star Inc.). A intensidade de fluorescência média geométrica (MFI geométrica) de Alexa Fluor 488 em uma fração livre de células mortas foi calculada. Como mostrado nas Figuras 109A e 109B, a expressão de HLA-A2/MAGEC1 foi observada nas células T2 suplementadas com o peptideo MAGEC1, mas não foi observada nas células T2 suplementadas com DMSO.

15)-2 Preparação de células alvo [00514] As células T2 foram ajustadas a uma concentração apropriada com um meio AIM-V (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 20% de FBS. Peptideo MAGECI ou DMSO foram adicionados às células, que foram

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144/152 depois incubadas a 37°C durante 4 horas. As células foram ajustadas a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL com um meio RPMI1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo 10% de FBS. A esta linhagem de célula, 100 pL de Radionuclideo Cromo-51 (Perkin Elmer, Inc.) foram adicionados por mL da suspensão de célula e as células foram cultivadas a 37°C durante 2 horas sob condições de 5% de CO2. As células foram lavadas duas vezes com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS, depois recolocadas em suspensão a 2 x 10⁵células/mL em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células alvo.

15)-3 Preparação de células efetoras [00515] PBMC congeladas comercialmente disponíveis (Cellular Technology Limited) foram descongeladas a 37°C, transferidas para uma solução de um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS suplementado com reagente Anti-agregado Wash (Cellular Technology Limited), lavadas duas vezes, depois ajustadas a 1 x 10⁶ células/mL com um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS e usadas como células efetoras.

15)-4 Ensaio de citotoxicidade [00516] As células T2 obtidas no Exemplo 15)-2 foram adicionadas em uma concentração de 50 pL/poço a uma microplaca com fundo em U de 96 poços. Cada molécula biespecífica anti-HLA-A2/MAGECl-CD3 ajustada em concentrações variáveis foi adicionada em uma concentração de 50 pL/poço. As células efetoras preparadas no Exemplo 15)-3 foram adicionadas em uma concentração de 100 pL/poço. Depois da centrifugação na temperatura ambiente a 1000 rpm durante 1 minuto, as células foram cultivadas a 37°C durante 20 a 24 horas sob condições de 5% de CO2. Uma alíquota de 50 pL do sobrenadante foi recuperada em uma LumaPlate (Perkin Elmer, Inc.) e secada a 50°C durante aproximadamente 2 horas, seguido pela medição usando uma leitora de placa (TopCount; Perkin Elmer, Inc.). A porcentagem de células lisadas foi calculada de acordo com a seguinte equação:

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Porcentagem de Células Lisadas (%) = (A - B) / (C - B) x 100 A: Contagem de poço de amostra

B: Contagem média de fundo (poços não suplementados com anticorpo) (n = 3). 50 pL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. Os outros procedimentos foram os mesmos como no caso do poço de amostra.

[00517] C: Média da contagem de liberação máxima (poços contendo células alvo lisadas em um tensoativo) (n = 3). 50 pL de um meio para ensaio foram adicionados ao invés de adicionar o anticorpo. 100 pL do tensoativo foram adicionados e a alíquota de 50 pL foi transferida para LumaPlate, como com o poço de amostra e ensaiada.

[00518] Como mostrado nas Figuras 110A e 110B, estas moléculas biespecíficas anti-HLA-A2/MAGECl-CD3 exibiram atividade citotóxica contra as células T2 suplementadas com o peptídeo MAGEC1. Por outro lado, estas moléculas biespecíficas não exibiram nenhuma atividade citotóxica nas células T2 suplementadas com DMSO.

[Aplicabilidade Industrial] [00519] O anticorpo humanizado anti-CD3 da presente invenção se liga ao CD3 humano e também se liga ao CD3 de macaco cinomolgo. Portanto, o anticorpo humanizado anti-CD3 da presente invenção pode ser usado vantajosamente em testes não clínicos para o desenvolvimento de fármacos.

[Texto Livre da Listagem de Sequências]

SEQ ID NO: 1: Sequência de aminoácidos de CD3a humano SEQ ID NO: 2: Sequência de aminoácidos de CD35 humano SEQ ID NO: 3: Sequência de aminoácidos de CD3y humano SEQ ID NO: 4: Sequência de nucleotídeo codificando antígeno de cadeia única de CD3ay humano

SEQ ID NO: 5: Sequência de aminoácidos de antígeno His

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146/152 scCD3

SEQ ID NO: 6: Sequência de nucleotideo codificando a região variável de cadeia pesada de C3-147

SEQ ID NO: 7: (C3-147_VH AA): Sequência de amino da região variável de cadeia pesada de C3-147

SEQ ID NO: 8: (C3-147_VL DNA): Sequência de nucleotideo codificando a região variável de cadeia leve de C3-147

SEQ ID NO: 9: (C3-147_VL AA): Sequência de amino da região variável de cadeia leve de C3-147

SEQ ID NO: 10: (Ligante G4S de sentido):

SEQ ID NO: 11: (Ligante G4S de antissentido):

SEQ ID NO: 12: (C3E-7000_VH AA): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada em C3E-7000

SEQ ID NO: 13: (C3E-7000_VL AA): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve em C3E-7000

SEQ ID NO: 14: (C3E-7000 ORF): Sequência de nucleotideo codificando C3E-7000

SEQ ID NO: 15: (C3E-7000 AA): Sequência de aminoácidos de C3E-7000

SEQ ID NO: 16: (C3E-7034_VH AA): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C3E-7034

SEQ ID NO: 17: Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E-7034

SEQ ID NO: 18: (C3E-7034 ORF): Sequência de nucleotideo codificando C3E-7034

SEQ ID NO: 19: (C3E_7034 AA): Sequência de aminoácidos de C3E-7034

SEQ ID NO: 20: (C3E-7035_VL AA): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E-7035

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147 / 152

SEQ ID NO: 21: (C3E-7035 ORF): Sequência de nucleotídeo codificando C3E-7035

SEQ ID NO: 22: (C3E_7035 AA): Sequência de aminoácidos de C3E-7035

SEQ ID NO: 23: (C3E-7036_VL_AA): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E-7036

SEQ ID NO: 24: (C3E-7036 ORF): Sequência de nucleotídeo codificando C3E-7036

SEQ ID NO: 25: (C3E_7036 AA): Sequência de aminoácidos de C3E-7036

SEQ ID NO: 26: (7000_CDR-Hl): Sequência de aminoácidos de CDR-H1 em série C3E-7000

SEQ ID NO: 27: (7000_CDR-H2): Sequência de aminoácidos de CDR-H2 em série C3E-7000

SEQ ID NO: 28: (7000_CDR-H3): Sequência de aminoácidos de CDR-H3 em série C3E-7000

SEQ ID NO: 29: (7000_CDR-Ll): Sequência de aminoácidos de CDR-L1 em série C3E-7000

SEQ ID NO: 30: (7000_CDR-L2): Sequência de aminoácidos de CDR-L2 em série C3E-7000

SEQ ID NO: 31: (7000_CDR-L3): Sequência de aminoácidos de CDR-L3 em série C3E-7000

SEQ ID NO: 32: (C3E-3OOO ORF): Sequência de nucleotídeo codificando ScFv de OKT3

SEQ ID NO: 33: (C3E-3OOO AA): Sequência de aminoácidos de ScFv de OKT3

SEQ ID NO: 34: (C3E-3007 ORF): Sequência de nucleotídeo codificando scFv de C3E-3007

SEQ ID NO: 35: (C3E-3007 AA): Sequência de aminoácidos

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 154/238

148/152 de scFv de C3E-3007

SEQ ID NO: 36: (C3E-3OOO_VH AA): Sequênciade aminoácidos da região variável de cadeia pesada de OKT3

SEQ ID NO: 37: (C3E-3OOO_VL AA): Sequênciade aminoácidos da região variável de cadeia leve de OKT3

SEQ ID NO: 38: (C3E-3007_VH AA): Sequênciade aminoácidos da região variável de cadeia pesada de C3E-3007

SEQ ID NO: 39: (C3E-3007_VL AA): Sequênciade aminoácidos da região variável de cadeia leve de C3E-3007

SEQ ID NO: 40: (HT1-11 ORF): Sequência de nucleotídeo codificando scFv HT1-11

SEQ ID NO: 41: (HT1-11 AA): Sequência de aminoácidos de scFvHTl-11

SEQ ID NO: 42: (T2C-0001 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando T2C-0001

SEQ ID NO: 43: (T2C-0001 AA): Sequência de aminoácidos de T2C-0001

SEQ ID NO: 44: (T2C-0003 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando T2C-0003

SEQ ID NO: 45: (T2C-0003 AA): Sequência de aminoácidos de T2C-0003

SEQ ID NO: 46: (T2C-0005 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando T2C-0005

SEQ ID NO: 47: (T2C-0005 AA): Sequência de aminoácidos de T2C-0005

SEQ ID NO: 48: (T2C-0006 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando T2C-0006

SEQ ID NO: 49: (T2C-0006 AA): Sequência de aminoácidos de T2C-0006

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 155/238

149/152

SEQ ID NO: 50: Sequência de aminoácidos de um iniciador de sentido para a amplificação de gene de cadeia pesada

SEQ ID NO: 51: Sequência de nucleotídeo de uma primeira rodada de iniciador de antissentido para a amplificação de gene de cadeia pesada

SEQ ID NO: 52: Sequência de nucleotídeo de segunda rodada de iniciador de antissentido para a amplificação de gene de cadeia pesada

SEQ ID NO: 53: Sequência de nucleotídeo de um iniciador de sentido para a amplificação de gene de cadeia leve

SEQ ID NO: 54: Sequência de nucleotídeo de uma primeira rodada de iniciador de antissentido para a amplificação de gene de cadeia leve

SEQ ID NO: 55: Sequência de nucleotídeo de uma segunda rodada de iniciador de antissentido para a amplificação de gene de cadeia leve

SEQ ID NO: 56: Sequência de nucleotídeo de um iniciador de sentido para sequenciamento de cadeia pesada

SEQ ID NO: 57: Sequência de nucleotídeo de iniciador de antissentido 1 para sequenciamento de cadeia leve

SEQ ID NO: 58: Sequência de nucleotídeo de iniciador de antissentido 2 para sequenciamento de cadeia leve

SEQ ID NO: 59: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7078

SEQ ID NO: 60: Sequência de aminoácidos de C3E-7078

SEQ ID NO: 61: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7079

SEQ ID NO: 62: Sequência de aminoácidos de C3E-7079

SEQ ID NO: 63: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7085

SEQ ID NO: 64: Sequência de aminoácidos de C3E-7085

SEQ ID NO: 65: Sequência de nucleotídeo da ORF

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 156/238

150/152 codificando C3E-7086

SEQ ID NO: 66: Sequência de aminoácidos de C3E-7086

SEQ ID NO: 67: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7087

SEQ ID NO: 68: Sequência de aminoácidos de C3E-7087

SEQ ID NO: 69: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7088

SEQ ID NO: 70: Sequência de aminoácidos de C3E-7088

SEQ ID NO: 71: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7089

SEQ ID NO: 72: Sequência de aminoácidos de C3E-7089

SEQ ID NO: 73: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7090

SEQ ID NO: 74: Sequência de aminoácidos de C3E-7090

SEQ ID NO: 75: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7091

SEQ ID NO: 76: Sequência de aminoácidos de C3E-7091

SEQ ID NO: 77: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7092

SEQ ID NO: 78: Sequência de aminoácidos de C3E-7092

SEQ ID NO: 79: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7093

SEQ ID NO: 80: Sequência de aminoácidos de C3E-7093

SEQ ID NO: 81: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7094

SEQ ID NO: 82: Sequência de aminoácidos de C3E-7094

SEQ ID NO: 83: Sequência de nucleotídeo da ORF codificando C3E-7095

SEQ ID NO: 84: Sequência de aminoácidos de C3E-7095

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 157/238

151/152

SEQ ID NO: 85: Sequência de nucleotídeo de um iniciador de sentido para C3E-7078

SEQ ID NO: 86: Sequência de nucleotídeo de um iniciador de antissentido para C3E-7078

SEQ ID NO: 87: Sequência de nucleotídeo de um iniciador de sentido para C3E-7079

SEQ ID NO: 88: Sequência de nucleotídeo de um iniciador de antissentido para C3E-7079

SEQ ID NO: 89: (AXC-0001 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando AXC-0001

SEQ ID NO: 90: (AXC-0001 AA): Sequência de aminoácidos de AXC-0001

SEQ ID NO: 91: (AXC-0002 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando AXC-0002

SEQ ID NO: 92: (AXC-0002 AA): Sequência de aminoácidos de AXC-0002

SEQ ID NO: 93: (MGC-0001 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando MGC-0001

SEQ ID NO: 94: (MGC-0001 AA): Sequência de aminoácidos de MGC-0001

SEQ ID NO: 95: (MGC-0002 ORF): Sequência de nucleotídeo da ORF codificando MGC-0002

SEQ ID NO: 96: (MGC-0002 AA): Sequência de aminoácidos de MGC-0002

SEQ ID NO: 97: (peptídeo MAGECI): Sequência de aminoácidos de peptídeo MAGECI

SEQ ID NO: 98: (CDRH2 de variantes): Sequência de aminoácidos de CDRH2 de uma variante de CDR

SEQ ID NO: 99: (CDRL2 de variantes): Sequência de

Petição 870190071525, de 26/07/2019, pág. 158/238

152/152 aminoácidos de CDRL2 de uma variante de CDR

SEQ ID NO: 100: (VH de variantes de C3E-7034): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada da variante de CDR de C3E-7034

SEQ ID NO: 101: (VL de variantes de C3E-7034): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve da variante de CDR de C3E-

7034

SEQ ID NO: 102: (VL de variantes de C3E-7035): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve da variante de CDR de C3E-

7035

SEQ ID NO: 103: (VL de variantes de C3E-7036): Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve da variante de CDR de C3E-

7036

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizados pelo fato de que:

uma sequência de cadeia pesada compreende

CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 26, CDRH2 compreendendo representada pela SEQ ID NO: 98, e a sequência de aminoácido CDRH3 compreendendo a sequência representada pela SEQ ID NO: 28; uma sequência de cadeia leve compreende de aminoácido CDRL1 compreendendo representada pela SEQ ID NO: 29, a sequência de aminoácido CDRL2 compreendendo representada pela SEQ ID NO: 99, e a sequência de aminoácido CDRL3 compreendendo representada pela SEQ ID NO: 31; e a sequência de aminoácido

o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que na CDRH2 o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em

A, E, G, Η, I, L, T, V, R, e S, e o segundo Xaa é S, ou o primeiro Xaa é N, e o segundo Xaa é selecionado de um grupo consistindo em

E, R, F, Y, L, V, I, K, e T, na CDRL2,

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 7/25

2/19

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S,

N, e D, e o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizados pelo fato de que na CDRH2, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em R e S, e o segundo Xaa é S, na CDRL2,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S,

N, e D, e o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que a sequência de cadeia pesada compreende uma região variável tendo CDRH1, CDRH2, e CDRH3, a CDRH1 consistindo representada pela SEQ ID NO: 26, a CDRH2 consistindo representada pela SEQ ID NO: 27, e a CDRH3 consistindo representada pela SEQ ID NO: 28;

a sequência de cadeia 1 tendo CDRL1, CDRL2, e CDRL3, em uma sequência de ammoacido em uma sequência de aminoácido em uma sequência de aminoácido compreende uma região variável a CDRL1 consistindo em uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 29,

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 8/25

3/19 a CDRL2 consistindo em uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 30, e a CDRL3 consistindo em uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 31; e o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligam-se ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizados pelo fato de que a sequência de região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 5, caracterizados pelo fato de que na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em A, E, G, Η, I, L, T, V, R, e S, e o segundo Xaa é S, ou o primeiro Xaa é N, e o segundo Xaa é selecionado de um grupo consistindo em E, R, F, Y, L, V, I, K, e T.
7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 5, caracterizados pelo fato de que na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em R e S, e o segundo Xaa é S.
8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizados pelo

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 9/25

4/19 fato de que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102, e 103.
9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 8, caracterizados pelo fato de que na sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102, e 103,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N,eD.
10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 5, caracterizados pelo fato de que a sequência de região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 16.
11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizados pelo fato de que a sequência de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 20, e 23.
12. Anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102, e 103, em que na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 100, o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em A, E, G, Η, I, L, T, V, R, e S, e o segundo Xaa é S, ou

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 10/25

5/19 o primeiro Xaa é N, e o segundo Xaa é selecionado de um grupo consistindo em E, R, F, Y, L, V, I, K, e T, e na sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102, e 103,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N,eD.
13. Anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizados pelo fato de que na SEQ ID NO: 100 o primeiro Xaa é selecionado de um grupo consistindo em R e S, e o segundo Xaa é S, e na sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 101, 102, e 103,

Xaa é selecionado de um grupo consistindo em Q, A, G, S, N,eD.
14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, caracterizados pelo fato de que compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66 e

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 11/25

6/19 uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 12/25

7/19 compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo os 2^o a 119° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84 e uma região variável de cadeia leve compreendendo os 135° a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84, de acordo com a reivindicação 13.
15. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5, 8, 10 ou 11, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 16, um ligante, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 20, e 23.
16. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15,

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 13/25

8/19 caracterizados pelo fato de que uma região variável de cadeia pesada ligase a uma região variável de cadeia leve nesta ordem, ou uma região variável de cadeia leve liga-se a uma região variável de cadeia pesada nesta ordem, a partir do terminal amino, e opcionalmente: i) tem um ligante entre ambas as regiões variáveis, ii) tem um resíduo de glicina no terminal amino de uma região variável no lado do terminal amino, e iii) tem um ligante, marcador FLAG e/ou marcador HIS no terminal carboxila de uma região variável no lado do terminal carboxila.
17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizados pelo fato de que incluem uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 75, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80,

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 14/25

9/19 uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.
18. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizados pelo fato de que incluem uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22, uma sequência de aminoácido compreendendo o 2o até 267o resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60, uma sequência de aminoácido compreendendo o 2o até 267o resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76,

Petição 870190071531, de 26/07/2019, pág. 15/25

10/19 uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou uma sequência de aminoácido compreendendo os 2^o a 269° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.
19. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendem uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de nucleotídeo contida em um polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas com um filamento complementar de um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, e ligam-se ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.
20. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno compreendem uma cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido de uma cadeia pesada contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, e uma cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácido de uma cadeia leve contida no anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, e ligamse ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.

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21. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno compreendem uma cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido derivada pela substituição, deleção, ou adição de 1 ou mais aminoácidos de uma sequência de aminoácido contida em uma cadeia pesada contida em um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, e uma cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido derivada pela substituição, deleção, ou adição de 1 ou mais aminoácidos de uma sequência de aminoácido contida em uma cadeia leve contida no anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, e ligam-se ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo.
22. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno ligam-se ao mesmo sítio no CD3 humano como aquele ligado por um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, e ligamse ao CD3 de macaco cinomolgo.
23. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno competem com um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18 para ligarem-se ao CD3 humano, e ligam-se ao CD3 de macaco cinomolgo.
24. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 22, caracterizados pelo fato de que o sítio no CD3 humano ligado pelo anticorpo é constituído por 7 ou mais aminoácidos selecionados dentre o 55° serina (Ser), o 56° ácido

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12/19 glutâmico (Glu), o 58° leucina (Leu), o 59° triptofano (Trp), o 65° asparagina (Asn), o 66° isoleucina (Ile), o 77° serina (Ser), o 78° ácido aspártico, o 101° arginina (Arg), o 101° glicina (Gly), o 103° serina (Ser), o 104° lisina (Lys), e o 105° prolina (Pro) na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 1.
25. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, 19 a 24, caracterizados pelo fato de que o anticorpo é IgG.
26. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizados pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado de um grupo consistindo em Fab, F(ab)’, Fv, scFv, e sdAb.
27. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, 19a 25, caracterizados pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano incluindo uma região constante da imunoglobulina humana.
28. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
29. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido representada por uma sequência de aminoácido consistindo nos 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácido consistindo nos 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22,

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13/19 uma sequência de aminoácido consistindo no 2o até 241o resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25, uma sequência de aminoácido consistindo nos 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60, uma sequência de aminoácido consistindo no 2o até 241o resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, consistindo nos

2^o

243° uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, consistindo nos

2^o

243° ou uma sequência de aminoácido resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84.

consistindo nos

2^o

243°
30. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 28 ou 29.

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31. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 28 ou 29 ou um vetor como definido na reivindicação 30, ou produz um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
32. Método para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que ligam-se ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar uma célula como definida na reivindicação 31; e recuperar um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo que ligam-se ao CD3 humano a partir das culturas.
33. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, caracterizados pelo fato de que se ligam ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno sendo obtidos por um método como definido na reivindicação 32.
34. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33 como um ingrediente ativo.
35. Molécula que tem atividade de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33.
36. Molécula de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a molécula é multiespecífica.
37. Molécula de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente 1 ou 2 ou mais anticorpos adicionais ou fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos além do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como

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15/19 definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33.
38. Molécula de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo adicional é Fab, F(ab)’, Fv, scFv, ou sdAb.
39. Molécula de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende Fc.
40. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizada pelo fato de que o anticorpo adicional é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano compreendendo uma região constante da imunoglobulina humana.
41. Molécula de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo adicionais são ligados com o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33 por meio de um ligante ou sem um ligante.
42. Molécula de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que um terminal carboxila da sequência de aminoácido do anticorpo ou do fragmento de ligação a antígeno do anticorpo adicionais é ligado com um ligante, e um terminal carboxila da sequência de aminoácido do ligante é ligado adicionalmente com o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33.
43. Molécula de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a molécula compreende uma sequência de aminoácido em que um terminal carboxila da sequência de aminoácido do anticorpo adicional ou do fragmento de ligação a antígeno do anticorpo é ligado com um ligante, e um terminal carboxila da sequência de aminoácido do ligante é ligado adicionalmente com

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16/19 o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo consistindo nos 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo consistindo nos 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 22, ou o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo consistindo nos 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO:

25.
44. Molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 35 ou 42, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 33, em que uma região variável de cadeia pesada liga-se a uma região variável de cadeia leve nesta ordem, ou uma região variável de cadeia leve liga-se a uma região variável de cadeia pesada nesta ordem, a partir do terminal amino, e opcionalmente: i) tem um ligante entre ambas as regiões variáveis, ii) tem um resíduo de glicina no terminal amino de uma região variável no lado do terminal amino, e iii) tem um ligante, marcador FLAG e/ou marcador HIS no terminal carboxila de uma região variável no lado do terminal carboxila.
45. Molécula de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo adicionais são ligados com o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 19, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo o 2o até 241o resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 25, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 60,

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17/19 o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 241° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 64, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 66, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 68, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 70, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 72, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 74, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 76, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 78, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 80, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 82, ou o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo compreendendo os 2^o a 243° resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 84 por meio de um ligante ou sem um ligante.
46. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 45, caracterizada pelo fato de que o anticorpo adicional é anticorpo-alvo anticâncer.
47. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 46, caracterizada pelo fato de que a molécula é

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18/19 biespecífica.
48. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 47, caracterizada pelo fato de que a molécula é um polipeptídeo.
49. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de uma molécula como definida na reivindicação 48.
50. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 49.
51. Célula, caracterizada pelo fato de que produz um polinucleotídeo como definido na reivindicação 49 ou um vetor como definido na reivindicação 50, ou uma molécula como definida na reivindicação 48.
52. Método para produzir uma molécula que se ligue ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar uma célula como definida na reivindicação 51; e recuperar uma molécula que se ligue ao CD3 humano a partir das culturas.
53. Molécula que se liga ao CD3 humano e ao CD3 de macaco cinomolgo, a molécula caracterizada pelo fato de ser obtida por um método como definido na reivindicação 52.
54. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 48 ou 53 como um ingrediente ativo.
55. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica induz citotoxicidade nas células-alvo pelo redirecionamento das células T para as células-alvo.
56. Uso de uma molécula como definida em qualquer uma

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19/19 das reivindicações 35 a 48 ou 53, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para induzir citotoxicidade nas células-alvo pelo redirecionamento das células T para as células-alvo.