PT1060241E - Preparação de células para a produção de material biológico. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PREPARAÇÃO DE CÉLULAS PARA A PRODUÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO A presente invenção está relacionada com um método para a preparação de células para utilização na produção de material biológico.

Para a produção de material biológico por exemplo, em linhas celulares, vai ser necessária a preparação de grandes quantidades de células usando um procedimento de aumento de escala em bio-reactores. A patente US No. 5,017,490 descreve um procedimento de aumento de escala que proporciona, em particular, a vantagem de um baixo risco de contaminação por transferência. Contudo, este método não é adequado para células adesivas (por isso não é para células que só crescem se fixadas num substrato) ou células embebidas num substrato (por exemplo, em transportadores porosos). A patente US No. 4,644,912 descreve um método para a preparação de células adesivas para a produção de material biológico (isto é, virus) iniciando com uma célula semente de trabalho, e com passagens subsequentes que resultam no aumento consecutivo de volumes de bio-reactores de 1 litros, 5 litros, 25 litros, 150 litros, e finalmente quer num bio-reactor de 1000 litros ou num bio-reactor complexo de 150 litros. Entre qualquer um destes passos de passagem, as células foram libertadas dos seus transportadores com uma solução diluída de protease. Na passagem final realizou-se a inoculação através do vírus. 1

Assumindo que o tempo médio dos ciclos celulares é de cerca de 20-24 horas, os intervalos de passagem podem ser de cerca de 3-5 em cada dia. Assim, de modo a expandir as células para culturas suficientemente grandes a partir de MWCS1 o procedimento total de aumento de escala pode levar várias semanas, dependendo do volume final do bio-reactor.

Nos métodos acima para a preparação de células, cada lote de produção final tem de ser preparado a partir de MWCS. Para a produção de vastas quantidades de material biológico vai ser necessário utilizar várias linhas de cultura paralelas até recipientes de maiores volumes. Por isso, este procedimento de preparação demora muito tempo e necessita do funcionamento de um número considerável de bio-reactores para a preparação das células bem como para a produção do material biológico. É um objecto da presente invenção proporcionar uma produção muito mais rápida na preparação de células para a produção de material biológico.

Em conformidade, a presente invenção está relacionada com um método para a preparação de células para utilizar na produção de material biológico através da cultura de células, até ao volume de célula desejado, de um lote de pré-produção, no qual após um processo de repetição descontinuo: a) parte das células do lote de pré-produção são usadas para a preparação de pelo menos um lote de produção, e b) a parte restante das células de um lote de pré-produção é usado como uma semente para a preparação de pelo menos um lote de pré-produção subsequente. 2 1 MWCS = banco de células de trabalho do fabricante

Mais em particular, a presente invenção está relacionada com um método para a preparação de células para utilização na produção de material biológico através da cultura de células, até ao volume de célula desejado, de um lote de pré-produção, no qual após um processo de repetição descontinuo: a) parte das células do lote de pré-produção são transferidas para serem usadas como semente para a preparação de pelo menos um lote de pré-produção subsquente, e b) a parte restante das células de um lote de pré-produção é transferida para ser usada como uma semente para a preparação de pelo menos um lote de pré-produção subsequente.

Numa forma de realização da presente invenção o primeiro lote de pré-produção é preparado a partir de um lote semente de trabalho através de pelo menos um passo de passagem.

Numa outra forma de realização preferida da presente invenção, as células que são preparadas são adesivas. No último caso vai ser, em geral, necessário que as células cresçam num substrato. Então, será aconselhável, que durante o processo de repetição cada vez que parte do lote é usado para a preparação de um novo lote, adicionar uma quantidade adicional de substrato. Numa forma de realização preferida, antes de cada adição do substrato, pelo menos parte das células são primeiro libertadas do seu substrato original.

Como aqui utilizado, a expressão "lote de produção" significa uma cultura de células que é usada na produção de material biológico.

Como aqui utilizado, a expressão "lote de pré-produção" significa uma cultura de células que é usada no processo, de 3 acordo com a presente invenção, para a preparação de pelo menos um lote de produção (como definido acima) e um lote de pré-produção subsequente.

Como aqui utilizado, a expressão "produto biológico" significa qualquer substância ou organismo que pode ser produzido a partir de uma cultura de células. Exemplos de "produtos biológicos" são vírus e proteínas tal como as enzimas.

Como aqui utilizado, a expressão "lote semente de trabalho" significa uma quantidade de um certo tipo de células de linhagem definida armazenadas para serem usadas como uma semente a partir da qual todas as culturas do mesmo tipo de células são derivadas.

Como aqui utilizado, a expressão "células adesivas" significa as células que, pelo seu crescimento próprio e/ou propagação, necessitam de ser ligadas a um substrato como aqui definido.

Como aqui utilizado, a expressão "substrato" significa qualquer matéria particulada útil para a ligação das células.

Como aqui utilizado, a expressão "passo de passagem " significa uma sequencia de actividades na propagação e produção de células que compreende pelo menos a transferência de uma quantidade adequada de células e de uma quantidade adequada de meio de cultura para o recipiente de produção, a incubação do recipiente em condições adequadas para o crescimento e propagação das células durante um período de tempo suficiente para o crescimento efectivo das células. Opcionalmente o passo de passagem pode compreender a separação das células do meio de cultura e/ou do substrato 4 após um período de tempo suficiente para o crescimento efectivo das células.

Vai ser claro para o perito que o método, de acordo com a presente invenção, difere essencialmente dos métodos conhecidos nos quais as células são produzidas num processo contínuo em vez do presente processo descontínuo. De acordo com as publicações de patentes EP0417531 e W089/08701 podem ser usados sistemas de cultura contínuos também para a produção de vírus. Em primeiro lugar as células crescem num primeiro bio-reactor, e após uma certa densidade celular ser atingida as células são alimentadas continuamente a partir do primeiro bio-reactor para um segundo bio-reactor. Neste segundo bio-reactor os vírus crescem nas células e subsequentemente estes vírus são retirados continuamente a partir deste segundo bio-reactor. 0 método básico de trabalho de acordo com a presente invenção é a utilização de um bio-reactor mãe a partir do qual os bio-reactor (es) de produção é (são) alimentados com as células. Quando as células são adesivas, após cada passo de passagem as células necessitam, de preferência, de ser separadas dos seus substratos.

Foi desenvolvido, para este propósito, um procedimento de tripsinização em bio-reactores grandes.

As células de produção são definidas até um número de passagem específico e característico denominado ECB2. 0 método descrito permite uma elevada produção uma vez que o aumento de escala via WCS para as células de produção pode ECB = Banco de células aumentado 5 2 ser muito diminuído e são necessários muito menos bio-reactores uma vez que as linhas de produção paralelas não são precisas. São apresentadas na Figura 1 várias formas de realização da presente invenção.

Numa forma de realização preferia as células são expandidas a partir de uma ampola a MWCS até ao nível do primeiro lote de pré-produção através de um ou mais passos de passagem. 0 tamanho do bio-reactor usado para este lote de pré-produção pode variar de um volume e trabalho de vários litros a várias centenas de litros. De seguida, uma parte, por exemplo, 10-20 % das células assim expandidas (por exemplo, passagem X) são usadas para fazer a repopulação de um bio-reactor para a produção de um lote de pré-produção subsequente (sendo o número de passagem X+l), enquanto que as células em massa são transferidas (passagem X ou X+l) para um bio-reactor de tamanho maior de modo a iniciar directamente a produção ou a populá-lo primeiro, e iniciar subsequentemente a produção.

Sabe-se que, nas linhas de produção em série clássicas, o número de duplicação das células derivadas a partir de MWCS no momento da colheita ocorre dentro de certos limites. Um número de geração máximo permitido é determinado para o sistema de produção no local.

No método, de acordo com a presente invenção, o número máximo de passagens de célula pode ser definido por ECB. Por isso, o número de passagem de produção (o número de passagens da célula usadas antes da produção do produto biológico) não é relevante dentro dos limites determinados através de ECB. Como consequência, o número máximo de passagens deve ser 6 cumprido tendo em vista as restrições regulamentares. Como resultado, o lote particular produz material biológico que é o produto final de uma via de aumento de escala directa.

De modo a verificar se as especificações das células na etapa de ECB na produção são semelhantes às de MCB3, é necessário realizar validações especificas em relação às caracteristicas de crescimento, livre de adventícios, aos agentes estranhos e endógenos em diferentes etapas, análise de cariologia iso-enzimática e outras. Quando o ECB está totalmente caracterizado pode permitir-se a produção do produto com as células em qualquer número de passagem entre MCB e ECB, uma vez que pode assumir-se que as células não se alteram entre as suas especificações. Como resultado os testes em MWCS podem, assim, estar limitados aos testes de esterilidade. Esta é uma vantage particular do método de acordo com a presente invenção.

Com o número de passagens máximo determinado, podem usar-se células em qualquer etapa intermédia. Por isto e de modo a minimizar mais o tempo necessário para expandir as células a partir de MWCS para o bio-reactor de produção, deve ser vantajoso permitir o início em massa das células. Isto pode ser feito, por example, numa das seguintes maneiras: • As células podem ser estacionadas a um certo número de passagem durante intervalos mais longos à temperatura ambiente (17 - 32 °C) e ser revitalizadas para um crescimento em expansão logarítmica através do aumento da temperatura e da alteração do meio de cultura, ou • As células podem ser congeladas (Temp < -80 °C) em massa e podem ser descongeladas antes da transferência para um MCB = Banco de células principal 7 3 volume pré-determinado do bio-reactor, reduzindo assim a necessidade significativa da via de aumento de escala. 0 método de acordo com a presente invenção pode ser realizado com culturas de células animais e, mais em particular, com células adesivas. Os tipos de células adequadas são, por exemplo, células de hamster (CHO, BHK-1), células de macaco (Vero), células bovinas (MDBK), células caninas (MDCK), células humanas (CaCo, A431) ou células de galinha (CEF).

Como bio-reactor de acordo com a presente invenção pode ser usado uma unidade única a uma pluralidade de unidades de, por exemplo, fermentadores com agitação, fermentadores em camada fixos, fermentadores em camada fluidos, fermentadores de ponte aérea, ou reactores de fibra ocos.

As células acima podem e em alguns casos devem cultivadas quando fixas a um suporte sólido, como os micro- transportadores ou os macro-transportadores em suspensão, por exemplo numa camada fixa, numa camada fluidificada ou em suspensão, ou como as fibras ocas. As células podem, também, estar embebidas num transportador (por exemplo, um transportador poroso).

No decurso do método, de acordo com a presente invenção, em particular quando se utiliza um suporte sólido, as células devem ser libertadas deste suporte sólido. Isto pode ser realizado por qualquer método útil para separar as células de um suporte sólido. De forma vantajosa pode conseguir-se isto pode usar-se uma solução enzimática proteolítica.

Opcionalmente, este passo de libertação enzimática pode ser precedido por um ou mais passos de pré-condicionamento, por exemplo através do tratamento com PBS e/ou EDTA, de modo a 8 aumentar a eficiência proteolitica, e/ou de modo a reduzir a quantidade de enzima proteolitica necessária. EXEMPLO 1

Separação da célula e separação dos transportadores antes da transferência para o bio-reactor seguinte

As células adesivas de uma linha de células MDCK4 foram cultivadas a 37 °C em micro transportadores Cytodex-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) (5 g de transportadores/1) num bio-reactor, com agitação, de 4 litros ("bio-reactor mãe"). 0 meio de crescimento foi EpiSerf (Life Technologies, Paisly, Scotland). 0 crescimento foi continuado até ao máximo de 5xl06 células/ml de cultura.

As células foram separadas dos transportadores através de tripsinização numa solução de Trypsin-EDTA (Life

Technologies, Paisly, Scotland).

Após a sedimentação dos transportadores 80% das células separadas foram transferidas para 3 outros bio-reactores de tamanho semelhante. Os últimos bio-reactores de "produção" possuem, todos, transportadores (célula substrato) adicionados pela parte da frente. Permitiu-se que as células fizessem a repopulação os transportadores e que são usados, subsequentemente, para a produção nestes bio-reactores de produção. MDCK = Madin Darby Canine Kidney (linha de células) 9 4

Permitiu-se que as restantes células no "bio-reactor mãe" fizessem a repopulação dos restantes transportadores Cytodex-3 e foram cultivadas até à densidade de célula desejada. EXEMPLO 2

Separação da célula sem separação dos transportadores antes da transferência para o bio-reactor seguinte A cultura das células foi realizada como descrito no Exemplo 1, contudo, após a tripsinização, 80% das células separadas incluindo os transportadores são transferidos para os 3 bio-reactores de produção. Adicionalmente, adicionam-se transportadores adequados a todos os bio-reactores. EXEMPLO 3

Separação da célula sem separação dos transportadores após a transferência para o bio-reactor seguinte A cultura das células foi realizada como descrito no Exemplo 1, contudo, 80 % das células ainda aderidas foram transferidas para um bio-reactor de tamanho semelhante o qual foi usado, de seguida, directamente para a formação de produto.

As restantes células nos micro transportadores no fermentador mãe foram, de seguida, separadas através de tripsinização, após serem adicionados os novos transportadores e se deixar as células repopular os substratos. 10 EXEMPLO 4

Início a partir de células em massa congeladas

Nesta experiência parte da cultura foi usada para fazer um novo lote no fermentador mãe e em alguns fermentadores filhos e parte da cultura foi usada para congelar células em massa.

As células congeladas em massa (total 14,4X108 células) foram inoculadas numa cultura de partida num fermentador mãe de 3 litros que contém 5 g de Cytodex por litro e meio EpiSerf, e depois disso foram incubadas a 37 °C. Os crio-conservantes residuais foram removidos através da alteração do meio no dia 1.

No dia 2 realizou-se a tripsinização, 50% das células em massa congeladas e as restantes células foram inoculadas para micro-transportadores num fermentador subsequente. A partir da Tabela 1 pode deduzir-se que as células continuam a crescer a uma taxa normal entre o dia 2 e 3. No dia 4 o conteúdo do fermentador mãe era de tripsina separada e fez-se um novo lote num novo micro-transportador (10 g/1) e em dois outros fermentadores seguintes ao fermentador mãe.

No dia 5 a eficiência da preparação de culturas em placas foi de cerca de 85%. 11

Tabela 1

Fermentador mãe Fermentador Fermentador mãe Dia de 3 litros mãe de 3 litros de 3 litros Células x Células x Células x 100.000/ml 100.000/ml 100.000/ml 0 NOD 1 6,6 2 14 3 15,5 4 30 5 5,5 10 10 Eficiência 85% 85% 85% da preparação de culturas em placas EXEMPLO 5

Transferência a partir de um fermentador mãe de pequena escala para um fermentador de produção em larga escala

As células sofreram um aumento de escala para uma larga escala em fermentadores de 65 litros e de 550 litros (volume de trabalho de 50 litros e 250 litros, respectivamente) usando uma densidade de micro-transportador de 5 g de Cytodex por litro.

Como pode ser visto a partir da Tabela 2, 90% do total das células foi transferido para um fermentador de larga escala a partir de um fermentador de 50 litros de cultura com 800000 células/ml das quais se provou que 69% eram viáveis.

Verificou-se o mesmo no fermentador mãe de 50 litros; cerca de 69% das células de repropagação revelaram-se ser viáveis. O procedimento foi o seguinte: 12

No dia 0, permitiu-se que os transportadores sedimentassem em 50 litros de cultura, onde após o sobrenadante ser removido (meio de cultura) e substituído por pbs. O conteúdo do fermentador foi agitado durante 5-15 minutos. O sobrenadante foi removido após re-sedimentação dos transportadores. Este passo pode ser repetido se necessário.

Depois este passo foi repetido com PBS/EDTA (0,4 gramas de EDTA/litro de PBS). Agitou-se, de novo, a cultura durante 5-15 minutos, deixou-se os transportadores sedimentarem, removeu-se o sobrenadante, e repetiu-se o passo com o PBS/EDTA até as células se tornarem redondas e prontas para serem separadas por tripsina.

Adicionou-se, então, a tripsina (concentração final de 0,025%) ao PBS/EDTA e incubou-se durante 5-15 minutos. De seguida, nem a célula que contém o sobrenadante (após sedimentação dos transportadores agora "nus") foi transferida (como no exemplo 9) nem a mistura de células mais transportadores foi transferida (total de 80 % da mistura total).

Após a transferência das células para o fermentador de 550 litros, permitiu-se que as restantes células (por isso 10% das células viáveis) fizessem a repopulação dos transportadores ainda presentes no fermentador após se voltar a encher o fermentador de 50 L com o meio de cultura. Provou-se que cerca de 70% das células são viáveis. 13

Tabela 2

Dia 50 litros de cultura 250 litros de cultura Células x 100.000/ml Células x 100.000/ml 0 8 (400 x 108 total de células 1,1 (275 x 108 total de células 1 O co 2 2,9 3 3,4 4 8,9 5 18 EXEMPLO 6

Análogo ao Exemplo 5, contudo, 80% da cultura do transportador- células de ligação foi transferida a partir do bio-reactor mãe para o bio-reactor de produção. Iniciou-se a produção após a adição de virus. 20% as células e dos transportadores que permaneceram no bio-reactor mãe foram tripsinizados e separados e após a adição de novo substrato no bio-reactor mãe, permitiu-se que fizessem a repopulação no bio-reactor mãe enquanto a produção se realiza no bio-reactor de produção fisicamente separado. EXEMPLO 7

Cultura em larga escala iniciada a partir de células em massa congeladas.

As células em massa congeladas foram descongeladas e inoculadas num fermentador de 10 litros (volume de trabalho) (densidade de transportador Cytodex de 5 g/1; meio de cultura EpiSerf) a uma densidade de inoculação de lxlO6 células/ml. Após a ligação, o meio de cultura foi substituído de modo a remover os crio-protectores residuais. 14

Após o dia 1 a quantidade de células viáveis ligadas aos transportadores era de 0,45xl06 células/ml que a partir dai começaram a crescer. A uma densidade de 2,8xl06 células/ml as células foram separadas a partir dos seus transportadores através de tripsinização e transferiu-se 80 % para um fermentador com um volume de trabalho de 50 litros (transportadores 5 g/1).

Como se pode deduzir a partir da Tabela 3, no dia 1 a quantidade de células viáveis após a congelação de células em massa foi de cerca de 45 %.

Da quantidade total das células transferidas, a viabilidade após a separação da tripsina era de 71,4%.

Tabela 3

Dia Densidade de células (xl06/l) em: Fermentador de 10 litros Fermentador de 50 litros 0 1,0 Vé 0, 45 34 1,3 5 2, 6 6 2,8 (400 x 108 total de células 6 0,6 (400 x 108 total de células 0,28 (140 x 108 total) 7 0,4 (200 x 108 total) 13-04-2007 15

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a preparação de células para utilizar na produção de material biológico através da cultura de células, até ao volume de célula desejado, de um lote de pré-produção, no qual após um processo de repetição descontinuo: a) parte das células do lote de pré-produção são usadas para a preparação de pelo menos um lote de produção, e b) a parte restante das células de um lote de pré-produção é usado como uma semente para a preparação de pelo menos um lote de pré-produção subsequente.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual no processo de repetição descontinuo: a) parte das células do lote de pré-produção são transferidas para serem usadas como semente para a preparação de pelo menos um lote de pré-produção subsequente, e b) a parte restante das células de um lote de pré-produção é transferida para ser usada como uma semente para a preparação de pelo menos um lote de pré-produção subsequente.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo primeiro lote de pré-produção ser preparado a partir de um lote de trabalho semente através de pelo menos um passo de passagem.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1-3, caracterizado pelas células serem células adesivas que para o seu crescimento e/ou para a sua propagação necessitam de estar ligadas a um substrato. 1
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas células serem células adesivas que para o seu crescimento e/ou para a sua propagação necessitam de estar ligadas a um substrato, as células crescem no referido substrato, e ou antes de cada passo de transferência são libertadas do referido substrato.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1-5, caracterizado pelo material biológico de interesse ser um virus. 13-04-2007 2