DE19612966B4

DE19612966B4 - MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren

Info

Publication number: DE19612966B4
Application number: DE19612966A
Authority: DE
Inventors: Albrecht Dr. Gröner; Jürgen Dr. Vorlop
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 2009-12-10
Anticipated expiration: 2016-04-02
Also published as: JP2012005502A; DE69740002D1; JP2004331673A; ES2352638T3; US6656720B2; EP0904351A1; EP2275535A1; JP2000507448A; US6455298B1; JP2009034115A; JP2006230415A; DE19612966A1; JP4243349B2; JP2012016358A; DK0904351T3; JP2005211080A; WO1997037000A1; EP0904351B1; US20030073223A1; HK1019233A1

Abstract

MDCK-Zellen, die durch Influenzaviren infizierbar sind und an Wachstum in Suspension in serumfreiem Medium adaptiert sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft MDCK-Zellen, die durch Influenzaviren infizierbar sind und an Wachstum in Suspension in serumfreiem Medium adaptiert sind, sowie Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur unter Verwendung dieser Zellen.
Alle Influenza-Impfstoffe, die seit den 40er Jahren bis heute als zugelassene Impfstoffe zur Behandlung von Mensch und Tier angewandt werden, bestehen aus einem oder mehreren Virusstämmen, die in embryonierten Hühnereiern vermehrt worden waren. Diese Viren werden aus der Allantoisflüssigkeit infizierter Hühnereier isoliert und deren Antigene entweder als intakte Viruspartikel oder als durch Detergentien und/oder Lösungsmittel desintegrierte Viruspartikel sog. Spaltimpfstoff- oder als isolierte, definierte Virusproteine – sog. Subunit-Impfstoff – als Impfstoff angewandt. In allen zugelassenen Impfstoffen sind die Viren durch den Fachmann bekannte Verfahren inaktiviert. Auch die Vermehrung lebend attenuierte Viren, die in Versuchsvaccinen erprobt werden, erfolgt in embryonierten Hühnereiern.
Die Benutzung embryonierter Hühnereier zur Impfstoff-Produktion ist zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Die Eier – aus tierärztlich überwachten, gesunden Hühnerherden – müssen vor der Infektion bebrütet werden, üblicherweise 12 Tage. Vor der Infektion müssen die Eier hinsichtlich lebender Embryonen selektiert werden, da nur diese Eier zur Virusvermehrung geeignet sind. Nach der Infektion werden die Eier erneut bebrütet, üblicherweise 2 bis 3 Tage. Die zu diesem Zeitpunkt noch lebenden Embryonen werden in der Kälte abgetötet und die Allantoisflüssigkeit wird dann durch Absaugen aus den einzelnen Eiern gewonnen. Durch aufwendige Reinigungsverfahren werden Substanzen aus dem Hühnerei, die zu unerwünschten Nebenwirkungen des Impfstoffes führen, von den Viren getrennt, und die Viren konzentriert. Da Eier nicht steril (pathogenfrei) sind, ist es außerdem erforderlich, Pyrogene und alle eventuell vorhandenen Pathogene zu entfernen und/oder zu inaktivieren.
Viren anderer Impfstoffe wie z. B. Tollwutviren, Mumps-, Masern-, Röteln-Viren, Polioviren und FSME-Viren können in Zellkulturen vermehrt werden. Da Zellkulturen, ausgehend von geprüften Zellbänken, pathogenfrei sind und im Gegensatz zu Hühnereiern ein definiertes Virusvermehrungssystem darstellen, das (theoretisch) in beinahe unbegrenzter Menge zur Verfügung steht, ermöglichen sie unter Umständen auch im Fall von Influenzaviren eine wirtschaftliche Virusvermehrung. Eine wirtschaftliche Impfstoffproduktion wird eventuell auch dadurch erreicht, daß die Virus-Isolierung und -Reinigung aus einem definierten, sterilen Zellkulturmedium einfacher erscheint als aus der stark proteinhaltigen Allantoisflüssigkeit.
Die Isolierung und Vermehrung von Influenzaviren in Eiern führt zu einer Selektion bestimmter Phenotypen, von denen sich die Mehrzahl vom klinischen Isolat unterscheidet. Im Gegensatz dazu steht die Isolierung und Vermehrung der Viren in Zellkultur bei der keine passagenabhängige Selektion eintritt (Oxford, J. S. et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185–189; Robertson, J. S. et al., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047–2051). Für einen wirksamen Impfstoff ist deshalb die Virusvermehrung in Zellkultur auch unter diesem Aspekt der in Eiern vorzuziehen.
Es ist bekannt, daß Influenzaviren sich in Zellkulturen vermehren lassen. Neben Hühnerembryozellen und Hamsterzellen (BHK21-F und HKCC) sind MDBK-Zellen, sowie insbesondere MDCK-Zellen als geeignete Zellen zur in vitro-Vermehrung von Influenzaviren beschrieben worden (Kilbourne, E. D., in: Influenza, Seiten 89–110, Plenum Medicak Book Company-New York und London, 1987). Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion ist die Zugabe von Proteasen zum Infektionsmedium, vorzugsweise Trypsin oder ähnliche Serinproteasen, da diese Proteasen extrazellulär das Vorläuferprotein des Hämagglutinin [HA₀] in das aktive Hämagglutinin [HA₁ und HA₂] spalten. Nur gespaltenes Hämagglutinin führt zur Adsorption der Influenzaviren an Zellen mit nachfolgender Virusaufnahme in die Zelle (Tobita, K. et al., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9–14; Lazarowitz, S. G. & Choppin, P. W., Virology, 68 (1975) 440–454; Klenk, H.-D. et al., Virology 68 (1975) 426–439) und somit zu einem weiteren Vermehrungszyklus des Virus in der Zellkultur.
Im Patent US 4 500 513 wurde die Vermehrung von Influenzaviren in Zellkulturen adhärent wachsender Zellen beschrieben. Nach Zellvermehrung wird das Nähr medium entfernt und frisches Nährmedium bei gleichzeitiger oder kurz darauf folgender Infektion der Zellen mit Influenzaviren zu den Zellen gegeben. Eine vorgegebene Zeit nach der Infektion wird Protease (z. B. Trypsin) zugesetzt, um eine optimale Virusvermehrung zu erhalten. Die Viren werden geerntet, gereinigt und zu inaktiviertem oder attenuiertem Impfstoff verarbeitet. Eine wirtschaftliche Influenzavirus-Vermehrung als Voraussetzung für eine Impfstoff-Produktion läßt sich mit der im genannten Patent beschriebenen Methodik jedoch nicht leisten, da der Medienwechsel, die nachfolgende Infektion sowie die später erfolgende Zugabe von Trypsin mehrmaliges Öffnen der einzelnen Zellkulturgefäße erfordert und somit sehr arbeitsintensiv ist. Ferner steigt die Gefahr einer Kontamination der Zellkultur durch unerwünschte Mikroorganismen und Viren mit jeder Manipulation der Kulturgefäße. Eine kostengünstigere Alternative stellt die Zellvermehrung in dem Fachmann bekannten Fermenter-Systemen dar, wobei die Zellen adhärent auf Microcarriern wachsen. Das für das Anwachsen der Zellen auf den Microcarriern erforderliche Serum (üblicherweise fötales Kälberserum) enthält jedoch Trypsin-Inhibitoren, so daß auch bei dieser Produktionsmethode ein Mediumwechsel auf serumfreies Medium notwendig ist, um die Spaltung des Influenzahämaglutinins durch Trypsin und damit eine ausreichend hohe Virusvermehrung zu erzielen. Somit erfordert auch diese Methodik mehrfaches Öffnen der Kulturgefäße und bringt so die erhöhte Gefahr der Kontamination mit sich.
Ein Verfahren zur Vermehrung von MDCK-Zellen in serumfreien Medien wird von Merten et al. (1996), Advances in Experimental Medicine and Biology, Band 397, S. 41–151 beschrieben. Dabei erfolgt das Wachstum der Zellen adhärent auf Microcarriern. Auch US 4,500,513 offenbart ein Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur. Allerdings werden keine Zellen offenbart, die in Suspension wachsen können. Lediglich während der Phase der Infektion liegen die Zellen temporär in Suspension vor.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Zellen und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die eine einfache und wirtschaftliche Influenzavirus-Vermehrung in Zellkultur ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die Erfindung MDCK-Zellen, die durch Influenzaviren infizierbar sind und die an Wachstum in Suspension in serumfreien Medium adaptiert sind. Es wurde gefunden, daß es mit Hilfe derartiger Zellen möglich ist, auf eine einfache und wirtschaftliche Art und Weise Influenzaviren in Zellkultur zu vermehren. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen kann zum einen auf einen Mediumwechsel vor der Infektion zum Entfernen des Serums verzichtet werden und zum anderen kann die Proteasezugabe gleichzeitig mit der Infektion erfolgen. Insgesamt ist somit nur ein einmaliges Öffnen der Kulturgefäße für die Infektion mit Influenzaviren erforderlich, wodurch die Gefahr der Kontamination der Zellkulturen drastisch herabgesetzt wird. Ferner vermindert sich der Arbeitsaufwand, der mit dem Mediumwechsel, der Infektion und der anschließenden Proteasezugabe verbunden wäre. Ein weiterer Vorteil ist, daß der Medienverbrauch deutlich verringert wird.
Bei den erfindungsgemäßen Zellen handelt es sich um MDCK-Zellen.
Vorzugsweise sind es Zellen, die von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)) abgeleitet sind, und besonders bevorzugt Zellen der Zellinie MCDK 33016: Diese Zellinie wurde am 7. Juni 1995 entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2219 hinterlegt. Die Zellinie MDCK 33016 ist abgeleitet aus der Zellinie MCDK durch Passagieren und Selektion hinsichtlich der Fähigkeit, in serumfreien Medium in Suspension zu wachsen und verschiedene Viren zu vermehren, z. B. Orthomyxoviren, Paramyxoviren, Rhabdoviren und Flavoviren. Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sich diese Zellen für eine wirtschaftliche Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur mittels eines einfachen und kostengünstgen Verfahrens.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, bei dem erfindungsgemäße Zellen verwendet werden, insbesondere ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

(i) Vermehrung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen in serumfreiem Medium in Suspension;
(ii) Infektion der Zellen mit Influenzaviren;
(iii) Zugabe von Protease kurz vor, gleichzeitig oder kurz nach der Infektion; und
(iv) weitere Kultivierung der infizierten Zellen und Isolierung der vermehrten Influenzaviren.

Die erfindungsgemäßen Zellen können im Rahmen des Verfahrens in verschiedenen dem Fachmann bekannten serumfreien Medien (z. B. Iscove's Medium, UltraCHO-Medium (Fa. BioWhittaker), EX-CELL (Fa. JRH Biosciences)) kultiviert werden. Ansonsten können die Zellen zur Vermehrung auch in den gängigen serumhaltigen Medien (z. B. MEM- oder DMEM-Medium mit 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1,5% bis 5% fötalem Kälberserum) oder proteinfreien Medien (z. B. PFCHO (Fa. JRH Biosciences)) kultiviert werden. Als Kulturgefäße, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können, sind alle dem Fachmann bekannten Gefäße wie z. B. Spinnerflaschen, Rollflaschen oder Fermenter geeignet.
Die Temperatur für die Vermehrung der Zellen vor der Infektion mit Influenzaviren liegt vorzugsweise bei 37°C.
Die Kultivierung zur Vermehrung der Zellen (Schritt (i)) erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens im Perfusionssystem, z. B. in einem Rührkesselfermenter, mit dem Fachmann bekannten Zellrückhaltesystemen, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Spinfilter u. ä.
Die Zellen werden dabei bevorzugt für 2 bis 18 Tage, besonders bevorzugt für 3 bis 11 Tage, vermehrt. Dabei erfolgt ein Austausch des Mediums, zunehmend von 0 auf etwa 1 bis 3 Fermentervolumen pro Tag. Die Zellen werden auf diese Art bis auf sehr hohe Zelldichten vermehrt, vorzugsweise bis zu etwa 2 × 10⁷ Zellen/ml. Die Perfusionsrate kann bei Kultur im Perfusionssystem sowohl über die Zellzahl, den Gehalt an Glucose, Glutamin oder Lactat im Medium, als auch über andere dem Fachmann bekannte Parameter geregelt werden.
Zur Infektion mit Influenzaviren werden ca. 85% bis 99%, vorzugsweise 93 bis 97% des Fermentervolumens mit Zellen in einen weiteren Fermenter überführt. Die im ersten Fermenter verbliebenen Zellen können wiederum mit Medium versetzt und im Perfusionssystem weiter vermehrt werden. Auf diese Weise ist eine dauernde Zellkultur für die Virusvermehrung vorhanden.
Alternativ zum Perfusionssystem können die Zellen in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise auch im Batchverfahren kultiviert werden. Die erfindungsgemäßen Zellen vermehren sich hierbei bei 37°C mit einer Generationszeit von 20 bis 30 h bis zu einer Zelldichte von ca. 8 bis 25 × 10⁵ Zellen/ml.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der pH-Wert des in Schritt (i) verwendeten Kulturmediums während der Kultivie rung geregelt und liegt im Bereich von pH 6,6 bis pH 7,8, vorzugsweise im Bereich von pH 6,8 bis pH 7,3.
Ferner wird in diesem Schritt des Verfahrens vorteilhafterweise der pO₂-Wert geregelt und liegt vorzugsweise zwischen 25% und 95%, insbesondere zwischen 35% und 60% (bezogen auf die Luftsättigung).
Erfindungsgemäß erfolgt die Infektion der in Suspension kultivierten Zellen vorzugsweise wenn die Zellen im Batchverfahren eine Zelldichte von ca. 8 bis 25 × 10⁵ Zellen/ml bzw. ca. 5 bis 20 × 10⁶ Zellen/ml im Perfusionssystem erreicht hat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Infektion der Zellen mit Influenzaviren bei einer m. o. i. (multiplicity of infection) von ca. 0,0001 bis 10, vorzugsweise von 0,002 bis 0,5.
Die Zugabe der Protease, die die Spaltung des Vorläuferproteins des Hämagglutinins [HA₀] und somit die Adsorption der Viren an die Zellen bewirkt, kann erfindungsgemäß kurz vor, gleichzeitig mit oder kurz nach der Infektion der Zellen mit Influenzaviren erfolgen. Erfolgt die Zugabe gleichzeitig mit der Infektion, so kann die Protease entweder direkt zu der zu infizierenden Zellkultur zugegeben werden oder beispielsweise als Konzentrat gemeinsam mit dem Virus-Inokulat. Die Protease ist vorzugsweise eine Serinprotease, und besonders bevorzugt Trypsin.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der zu infizierenden Zellkultur Trypsin bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 200 μg/ml, vorzugsweise 5 bis 50 μg/ml, und besonders bevorzugt 5 bis 30 μg/ml im Kulturmedium zugesetzt. Bei der weiteren Kultivierung der infizierten Zellen gemäß Schritt (iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Trypsinreaktivierung durch erneute Zugabe von Trypsin im Falle des Batchverfahrens bzw. wird im Falle des Perfusionssystems durch kontinuierliche Zugabe einer Trypsin-Lösung oder durch diskontinuierliche Zugabe aufrechterhalten werden. Im letzteren Fall liegt die Trypsinkonzentration vorzugsweise im Bereich von 1 μg/ml bis 80 μg/ml.
Nach der Infektion wird die infizierte Zellkultur zur Vermehrung der Viren weiter kultiviert, insbesondere bis ein maximaler cytophatischer Effekt bzw. eine maximale Virusantigenmenge nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung der Zellen für 2 bis 10 Tage, insbesondere für 3 bis 7 Tage. Die Kultivierung kann wiederum vorzugsweise im Perfusionssystem oder im Batchverfah ren erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen nach der Infektion mit Influenzaviren bei einer Temperatur von 30°C bis 36°C, vorzugsweise von 32°C bis 34°C, kultiviert. Die Kultivierung der infizierten Zellen bei Temperaturen unter 37°C, insbesondere in den oben angegebenen Temperaturbereichen, führt zur Produktion von Influenzaviren, die nach Inaktivierung eine wesentlich höhere Wirksamkeit als Impfstoff aufweisen, im Vergleich zu Influenzaviren, die bei 37°C in Zellkultur vermehrt wurden.
Die Kultivierung der Zellen nach Infektion mit Influenzaviren (Schritt (iv)) erfolgt wiederum vorzugsweise bei geregeltem pH- und pO₂-Wert. Der pH-Wert liegt dabei vorzugsweise im Bereich von 6,6 bis 7,8, besonders bevorzugt von 6,8 bis 7,2, und der pO₂-Wert im Bereich von 25% bis 150%, vorzugsweise von 30% bis 75%, und besonders bevorzugt im Bereich von 35% bis 60% (bezogen auf die Luftsättigung).
Während der Kultivierung der Zellen zur Virusvermehrung gemäß Schritt (iv) des Verfahrens ist auch eine Substitutuion des Zellkulturmediums mit frisch zubereitetem Medium, Mediumkonzentrat oder mit definierten Bestandteilen wie Aminosäuren, Vitaminen, Lipoidfraktionen, Phosphaten usw. zur Optimierung der Antigenausbeute möglich.
Nach Infektion mit Influenzaviren können die Zellen entweder durch weitere Zugabe von Medium oder Mediumkonzentrat über mehrere Tage langsam verdünnt werden oder bei weiterer Perfusion mit abnehmend von etwa 1 bis 3 auf 0 Fermentervolumen/Tag Medium oder Mediumkonzentrat inkubiert werden. Die Perfusionsrate kann dabei wiederum über die Zellzahl, den Gehalt an Glucose, Glutamin, Lactat, Lactatdehydrogenase im Medium oder anderen dem Fachmann bekannte Parameter geregelt werden.
Möglich ist ferner eine Kombination des Perfusionssystems mit einem Feed-Batch-Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt das Ernten und Isolieren der vermehrten Influenzaviren 2 bis 10 Tage, vorzugsweise 3 bis 7 Tage, nach der Infektion. Hierzu werden beispielsweise die Zellen bzw. Zellreste mittels dem Fachmann bekannten Methoden vom Kulturmedium getrennt, beispielsweise durch Separatoren oder Filter. Nachfolgend erfolgt die Konzentrierung der im Kulturmedium vorhandenen Influenzaviren nach dem Fachmann bekannten Methoden, wie z. B. Gradientenzentrifugation, Filtration, Präzipitation u. ä.
Die Erfindung betrifft ferner Influenzaviren, die erhältlich sind durch ein erfindungsgemäßes Verfahren. Diese können nach bekannten Methoden zu einem Impfstoff für die Anwendung am Menschen oder Tier formuliert werden. Die Immunogenität bzw. Effektivität der gewonnenen Influenzaviren als Impfstoff kann nach dem Fachmann bekannten Methoden, z. B. durch den vermittelten Schutz im Belastungsversuch oder als Antikörpertiter neutralisierender Antikörper bestimmt werden. Die erzeugte Virus- bzw. Antigenmenge kann z. B. durch die Bestimmung der Menge an Hämagglutinin nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Es ist beispielsweise bekannt, daß gespaltenes Hämagglutinin an Erythrozyten verschiedener Spezies, z. B. an Hühnererythrozyten, bindet. Dies ermöglicht eine einfache und schnelle Quantifizierung der produzierten Viren bzw. des gebildeten Antigens.
Somit betrifft die Erfindung auch Vakzinen, die die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Influenzaviren enthalten. Derartige Vakzinen können gegebenenfalls die für Impfstoffe üblichen Zusatzstoffe enthalten, insbesondere Stoffe, die die Immunantwort verstärken, d. h. sogenannte Adjuvantien, z. B. Hydroxide verschiedener Metalle, Bestandteile von Bakterienzellwänden, Öle oder Saponine, und darüber hinaus gängige pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe.
Die Viren können in den Vakzinen als intakte Viruspartikel, insbesondere als lebend attenuierte Viren vorliegen. Hierzu werden Viruskonzentrate auf den gewünschten Titer eingestellt und entweder lyophilisiert oder in flüssiger Form stabilisiert.
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Vakzinen desintegrierte, d. h. inaktivierte, oder intakte, jedoch inaktivierte Viren enthalten. Hierzu wird die Infektiosität der Viren mittels chemischer und/oder physika-lischer Methoden (z. B. durch Detergentien oder Formaldehyd) zerstört. Der Impfstoff wird anschließend auf die gewünschte Antigenmenge eingestellt und nach eventueller Zumischung von Adjuvantien oder nach eventueller Impfstoffformulierung, z. B. als Liposome, Microspheres oder ”slow release”-Formulierungen, abgefüllt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann schließlich die erfindungs gemäße Vakzine als Subunit-Impfstoff vorliegen, d. h. sie kann definierte, isolierte Virusbestandteile, vorzugsweise isolierte Proteine des Influenzavirus enthalten. Diese Bestandteile können nach dem Fachmann bekannten Methoden aus den Influenzaviren isoliert werden.
Weiterhin können die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Influenzaviren für diagnostische Zwecke verwendet werden. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch diagnostische Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Influenzaviren oder Bestandteile solcher Viren enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit in diesem Gebiet gängigen Zusatzstoffen und geeigneten Nachweismitteln.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung von Zellinien, die an das Wachstum in Suspension angepaßt und durch Influenzaviren infizierbar sind.
Eine Zellinie, die an das Wachstum in Suspensionskultur angepaßt ist und durch Influenzaviren infizierbar ist wurde ausgehend von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)), die nur wenige Passagen oder über mehrere Monate im Labor vermehrt worden waren, selektioniert. Diese Selektion erfolgte durch Vermehrung der Zellen in Rollerflaschen, die sich mit 16 Upm (anstatt ca. 3 Upm wie für Rollerflaschen mit adhärent wachsenden Zellen üblich) drehten. Nach mehreren Passagen der im Medium suspendiert vorliegenden Zellen wurden in Suspension wachsende Zellstämme gewonnen. Diese Zellstämme wurden mit Influenzaviren infiziert und die Stämme ausgewählt, die die höchste Virusausbeute erbrachten. Eine Erhöhung der Rate an in Suspension wachsenden Zellen während der ersten Passagen bei 16 Upm wird durch die Zugabe von dem Fachmann bekannten Selektionssystemen wie Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder Alanosin und Adenin, einzeln oder in Kombination, über 1 bis 3 Passagen erreicht. Die Selektion von in Suspension wachsenden Zellen ist auch in anderen bewegten, dem Fachmann bekannten, Zellkultursystemen wie Rührflaschen möglich.
Alternativ können vor der Selektion als Suspensionszelle durch Zellclonierung in Mikrotiterplatten hoch virusvermehrende Zellclone etabliert werden. Hierbei werden die adhärent wachsenden Ausgangszellen (nach Trypsinierung) mit serumhaltigem Medium auf eine Konzentration von ca. 25 Zellen/ml verdünnt und je 100 μl dieser Zellsuspension in einen Napf einer Mikrotiterplatte gegeben. Werden zu jedem Napf 100 μl sterilfiltriertes Medium aus einer 2 bis 4 Tage alten (homologen) Zellkultur (”konditioniertes Medium”) zugegeben, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit des Wachstums der in sehr geringer Zelldichte ausgesäten Zellen. Durch lichtmikroskopische Kontrolle werden die Näpfe ausgewählt, in denen nur 1 Zelle enthalten ist; der daraus entstandene Zellrasen wird dann in größere Zellkulturgefäße passagiert. Die Zugabe von Selektionsmedien (z. B. Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder Alanosin und Adenin, einzeln oder in Kombination) nach der 1. Zellpassage über 1 bis 3 Passagen führt zu einer stär keren Unterscheidbarkeit der Zellclone. Die so entstandenen Zellclone wurden hinsichtlich ihrer spezifischen Virusvermehrung ausgewählt und dann als Suspensionszelle selektioniert. Die Selektion von Zellen, die an Wachstum in serumfreien Medium adaptiert sind, kann ebenfalls nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Beispiele für Zellen, die an das Wachstum in serumfreien Medium in Suspension angepaßt sind und durch Influenzaviren infizierbar sind, sind die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) und MDCK 13016, deren Eigenschaften in den folgenden Beispielen beschrieben werden.
Beispiel 2
Vermehrung von Influenzaviren in der Zellinie MDCK 33016
Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219; durch Selektionsdruck aus einer MDCK-Zellkultur erhalten) wurde in Iscove's Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 UpM drehte, bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m. o. i = 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 37°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 3 Tage bestimmt (Tabelle I). Tabelle I Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Rollerflaschen (Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)

1 dpi 2 dpi 3 dpi

Versuch 1 1:64 1:512 1:1024

Versuch 2 1:4 1:128 1:1024

Versuch 3 1:8 1:32 1:512
Die angegebenen Verhältnisse bedeuten, daß eine 1:X-Verdünnung der Virusernte noch hämagglutinierende Eigenschaften besitzt. Die hämmagglutinierenden Eigenschaften können bespielsweise bestimmt werden wie in Mayer et al., Viro logische Arbeitsmethoden, Band I (1974), Seite 260 bis 261 oder in Grist, Diagnostic Methods in Clinical Virology, Seite 72 bis 75 beschrieben durchgeführt werden.
Beispiel 3
Vermehrung von Influenzaviren in der Zellinie MDCK 13016 in Spinnerflaschen
Die Zellinie MDCK 13016 wurde in Iscove's Medium mit einer Splittingrate von 1:6 bis 1:10 zwei mal wöchentlich in einer Spinnerflasche (50 Upm) bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von 8,0 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m. o. i = 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 6 Tage bestimmt (Tabelle II). Tabelle II Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Spinnerflaschen (Zellinie MDCK 13016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)

1 dpi 3 dpi 4 dpi 5 dpi 6 dpi

Versuch 1 1:2 1:128 1:1024 1:102 1:2048

Versuch 2 1:4 1:512 1:2048 1:204 1:1024
Beispiel 4
Vermehrung verschiedener Influenzastämme in der Zellinie MDCK 33016 in Rollerflaschen

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove's Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 UpM drehte, bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit verschiedenen Influenzavirusstämmen (m. o. i ≈ 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung am 5. Tage nach der Infektion bestimmt (Tabelle III). Tabelle III Vermehrung von Influenzastämmen in Rollerflaschen (Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

	HA-Gehalt 5 Tage nach Infektion
Influenzastamm	HA-Gehalt
A/Singapore/6/86	1:1024
A/Sichuan/2/87	1:256
A/Shanghai/11/87	1:256
A/Guizhou/54/89	1:128
A/Beijing/353/89	1:512

B/Beijing/1/87	1:256
B/Yamagata/16/88	1:512

A/PR/8/34	1:1024

A/Equi 1/Prag	1:512
A/Equi 2/Miami	1:256
A/Equi 2 Fontembleau	1:128
A/Swine/Gent	1:512
A/Swine/Iowa	1:1024
A/Swine/Arnsberg	1:512

Beispiel 5
Vermehrung verschiedener Influenzastämme in MDCK 33016-Zellen im Fermenter

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove's Medium mit einer Zelleinsaat von 1 × 10⁵ Zellen/ml in einen Rührkesselfermenter (Arbeitsvolumen 8 l) eingesät. Bei einer Inkubationstemperatur von 37°C, einem pO₂-Wert von 50 ± 10% (geregelt) und einem pH-Wert von 7,1 ± 0,2 (geregelt) vermehrten sich die Zellen innerhalb von 4 Tagen auf eine Zelldichte von 7 × 10⁵ Zellen/ml. Zu diesen Zellen wurden 8 ml Virus-Stocklösung (entweder A/PR/8/34 oder A/Singapore/6/86 oder A/Shanghai/11/87 oder A/Beijing/1/87 oder B/Massachusetts/71 oder B/Yamagata/16/88 bzw. B/Panama/45/90) und gleichzeitig 16 ml einer 1,25%igen Trypsinlösung zugegeben und die inokulierte Zellkultur bei 33°C weiter inkubiert. Die Virusvermehrung wurde über 6 Tage bestimmt (Tabelle IV). Tabelle IV Vermehrung von Influenzavirus-Stämmen im Fermenter (Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

	HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)
	1 dpi	3 dpi	4 dpi	5 dpi	6 dpi
A/PR/8/34	1:64	1:512	1:1024	1:2048	1:2048
A/Singapore	1:32	1:512	1:2048	1:2048	1:1024
A/Shanghai	1:8	1:128	1:256	1:256	1:512
A/Beijing	1:16	1:256	1:1024	1:1024	n. d.
B/Yamagata	1:8	1:128	1:512	1:512	n. d.
B/Massachusetts	1:4	1:128	1:256	1:512	n. d.
B/Panama	n. d.	1:128	1:256	n. d.	1:1024

Beispiel 6
Einfluß der Infektionsdosis (m. o. i.) auf die Virusvermehrung

Die Zellinie MDCK 13016 (durch Selektionsdruck aus einer MDCK-Zellkultur erhalten) wurde in UltraCHO-Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 Upm drehte, bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Es wurde der Einfluß der Infektionsdosis (m. o. i.) auf die Ausbeute an Antigen und Infektiosität untersucht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m. o. i = 0,5 und m. o. i. = 0,005) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 37°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 3 Tage bestimmt (Tabelle V). Tabelle V Vermehrung von Influenzavirusstamm PR/8/34 in der Zellinie MDCK 13016 in Rollerflaschen nach Infektion mit einer m. o. i. von 0,5 bzw. 0,005. Die Auswertung der Virusvermehrung erfolgte durch Antigennachweis (HA) und Infektionsitätstiter (CCID₅₀-Cell culture infective dose 50% in log₁₀)

Tage nach Infektion	2		3		4		5
	HA	CCID₅₀	HA	CCID₅₀	HA	CCID₅₀	HA	CCID₅₀
PR/8/34
m. o. i. = 0,5	128	5,1	256	5,7	512	5,3	1024	5,4
m. o. i. = 0,005	64	4,9	512	8,0	512	8,3	1024	8,3

Die Bestimmung des CCID₅₀-Wertes kann dabei z. B. nach der Methode erfolgen, die in Paul, Zell- und Gewebekultur (1980), S. 395 beschrieben ist.
Beispiel 7
Einfluß der Medien-Substitution auf die Virusvermehrung

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove's Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 UpM drehte, bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Es wurde der Einfluß einer Medien-Substitution auf die Ausbeute an Antigen und Infektiosität untersucht. Die nun 4 Tage alte Zellkultur wurde mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m. o. i. = 0,05) infiziert, wobei die Trypsinzugabe (20 μg/ml Endkonzentration in der Rollflasche) durch Mischen des Virusinokulums mit der Trypsinstammlösung erfolgte. Die Zellkultur wurde mit Medienzusätzen versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 5 Tage bestimmt (Tabelle VI). Tabelle VI Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Rollflaschen (Zellinie MDCK 33016); Zugabe von 5% (Endkonzentration) eines 3fach konzentrierten Iscove's Mediums, von Glucose (Endkonzentration 3%) bzw. Glucose und Caseinhydrolysat (Endkonzentration 3% bzw. 0,1%) gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

	HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)
Zugabe	1 dpi	3 dpi	4 dpi	5 dpi
-	1:16	1:256	1:1024	1:1024
(Kontrolle)
3 × Iscove's	1:8	1:128	1:1024	1:2048
Glucose	1:32	1:512	1:2048	1:2048
Glucose/Caseinhydrolysat	1:8	1:128	1:512	1:1024

Beispiel 8
Vermehrung von Influenzaviren in MDCK 33016-Zellen im Fermenter und Gewinnung der Viren
Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove's Medium mit einer Zelleinsaat von 0,5 × 10⁵ Zellen/ml in einen Rührkesselfermenter (Arbeitsvolumen 10 l) eingesät. Bei einer Inkubationstemperatur von 37°C, einem pO₂-Wert von 55 ± 10% (geregelt) und einem pH-Wert von 7,1 ± 0,2 (geregelt) vermehrten sich die Zellen innerhalb von 4 Tagen auf eine Zelldichte von 7 × 10⁵ Zellen/ml. Zu diesen Zellen wurden 0,1 ml Virus-Stocklösung (A/Singapore/6/86; m. o. i. ca. 0,0015) und gleichzeitig 16 ml einer 1,25%igen Trypsinlösung zugegeben und die inokulierte Zellkultur bei 33°C weiter inkubiert. Die Virusvermehrung wurde nach 5 Tagen bestimmt und das Virus geerntet. Zellen und Zellreste wurden durch Tangentialflußfiltration entfernt (Sartocon Mini-Microsart Modul mit 0,45 μm Porengröße; Durchführung der Filtration entsprechend den Angaben des Herstellers), wobei kein Verlust an Antigen (gemessen als HA) im Filtrat nachweisbar war. Das Virusmaterial wurde durch erneute Tangentialflußfiltration (Sartocon Mini – Ultrasart Modul mit 100000 NMGT (nominelle Molekularge wichts-Trenngrenze); Durchführung der Filtration entsprechend den Angaben des Herstellers) von 9,5 l auf 600 ml ankonzentriert. Die Antigenmenge im Konzentrat betrug 5120 HA-Einheiten (Ausgang 256 HA-Einheiten; Konzentrierungsfaktor 20), während die Infektiosität im Konzentrat 9,2log₁₀ CCID₅₀ betrug (Ausgang 8,9log₁₀ CCID₅₀; Konzentrierungsfaktor 16); der Verlust an Antigen und Infektiosität betrug weniger als 1%, gemessen im Filtrat nach der 100000 NMGT-Filtration.
Beispiel 9
Vermehrung der Influenzaviren in MDCK 33016-Zellen im Perfusionsfermenter

1,6 × 10⁸ Zellen der Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurden in das Reaktorgefäß des Biostat MD (Fa. Braun Biotech Int., Melsungen, Deutschland) mit einem Nutzvolumen von 2000 ml in UltraCHO-Medium suspendiert (0,8 × 10⁵ Zellen/ml) und im Perfusionsbetrieb mit steigender Durchflußrate bei 37°C vermehrt (Sauerstoffeintrag durch Schlauchbegasung (Sauerstoffregelung 40 ± 10% pO₂); pH-Regelung pH-Wert ≤ 7,2; Zellrückhaltung durch Spinnfilter > 95%). Die Lebendzellzahl nahm innerhalb von 11 Tagen um das 200fache auf 175 × 10⁵ Zellen/ml zu (Tabelle VIIIa). 1990 ml dieser Zellkultur wurden in einen 2. Perfusionsfermenter (Arbeitsvolumen 5 l) überführt, während die restlichen Zellen mit Medium wieder auf 2000 ml aufgefüllt wurden und die Zellvermehrung im Perfusionsbetrieb erneut erfolgte. Im 2. Perfusionsfermenter (Virusinfektion) wurden die Zellen mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m. o. i. = 0,01) unter gleichzeitiger Zugabe von Trypsin (10 μg/ml Endkonzentration) infiziert und 1 h inkubiert. Anschließend wurde der Fermenter im Perfusionsbetrieb weiter inkubiert (Regelung von pO₂:40 ± 10% und pH: ≤ 7,2). Am ersten Tag nach der Infektion erfolgte die Inkubation bei 37°C, die Virusernte im perfundierten Zellkulturüberstand wurde verworfen. Ab dem 2. Tag nach der Infektion erfolgte die Virusvermehrung bei 33°C und die Perfusionsrate von 2 Fermentervolumen/Tag wurde innerhalb von 7 Tagen auf 0 reduziert. Das für die Virusvermehrung erforderliche Trypsin lag in einer Konzentration von 10 μg/ml im UltraCHO-Medium vor, das für die Perfusion benutzt wurde. Die Virusernte (= perfundierter Zellkulturüberstand) wurde bei 4°C gesammelt und die Virusvermehrung über 7 Tage als Antigenmenge bestimmt (Tabelle VIIIb). Tabelle VIIIa Vermehrung von MDCK 33016-Zellen im Perfusionsfermenter

Tag	Lebendzellzahl [× 10/ml]	Gesamtzellahl [× 10/ml]	Perfusion [l/Tag]
0	0,6	0,6	0
3	8,0	8,3	0
4	14,6	17,5	1,1
5	33,3	34,7	1,1
6	49,8	53,6	2,1
7	84,5	85,6	3,9
8	82,6	84,9	4,0
9	100,8	104,8	4,1
10	148,5	151,0	4,0
11	175,8	179,6	3,9

Tabelle VIIIb Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 im Perfusionsfermenter (Zellinie MDCK 33016), gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten) im kumulierten perfundierten Zellkulturüberstand

Tag nach Infektion	HA-Gehalt in Virusernte	Medium-Zugabe (Perfusion)	Gesamtmenge Virusernte
1	< 4	4 l	0 l
2	8	4 l	4 l
3	64	3 l	7 l
4	256	2 l	9 l
5	2048	2 l	11 l
6	4096	1 l	12 l
7	4096	0 l	12 l

Beispiel 10
Herstellung eines experimentellen Influenza-Impfstoffes
Aus Infuenzavirus A/PR/8/34 aus Beispiel 2 – A/PR/8 bei 37°C vermehrt – (Versuch 2; Vaccine A) und Beispiel 4 – A/PR/8 bei 33°C vermehrt – (Vaccine B) wurde ein experimenteller Impfstoff hergestellt. Die Influenzaviren im Zellkulturmedium wurden von Zellen und Zellbruchstücken durch niedertourige Zentrifugation (2000 g, 20 min, 4°C) getrennt und durch eine Saccharosegradientenzentrifugation (10 bis 50% (Gew./Gew.) linearer Saccharosegradient, 30000 g, 2 h, 4°C) gereinigt. Die Influenzavirus-haltige Bande wurde gewonnen, mit PBS pH 7,2 1:10 verdünnt, bei 20000 Upm sedimentiert und das Pellet in PBS aufgenommen (Volumen 50% des ursprünglichen Zellkulturmediums). Die Influenzaviren wurden mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer 35%igen Formaldehydlösung im Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C unter Rühren).
Je 10 NMRI-Mäuse, 18 bis 20 g schwer, wurden mit je 0,3 ml dieser inaktivierten Versuchsimpfstoffe am Tag 0 und Tag 28 durch subcutane Injektion geimpft. 2 und 4 Wochen nach der Impfung sowie 1 und 2 Wochen nach der Revaccination wurde den Tieren Blut zur Bestimmung des Titers neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8/34 entnommen. Zur Bestimmung der Schutzrate wurden die Mäuse 2 Wochen nach Revaccination (6 Wochen nach Versuchsbeginn) durch intranasale Applikation von 1000 LD₅₀ (Letale Dosis 50%) belastet. Die Ergebnisse des Versuches sind in Tabelle IX zusammengefaßt. Tabelle IX Wirksamkeit von Versuchsvaccinen: für Vaccine A wurde das Influenzavirus A/PR/8/34 bei 37°C und für Vaccine B bei 33°C vermehrt. Untersucht wurden die Titer neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8 sowie die Schutzrate nach Belastung der Mäuse

Titer neutralisierender Antikörper/ml* Schutzrate Anzahl lebend/gesamt

2 w pvacc 4 w pvacc 1 w prevacc 2 w prevacc

Vaccine A < 28 56 676 1620 1/10

Vaccine B 112 1549 44670 112200 9/10

* Wochen nach Vaccination (w pvacc) bzw. Wochen nach Revaccination (w prevacc)

Die Versuche belegen, daß Influenzaviren, die bei 37°C in Zellkultur mit hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus nur geringe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und kaum Schutz vermittelten, während Influenzaviren, die bei 33°C in Zellkultur mit ebenfalls hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus sehr hohe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und zu sehr gutem Schutz führten.

Claims

MDCK-Zellen, die durch Influenzaviren infizierbar sind und an Wachstum in Suspension in serumfreiem Medium adaptiert sind.
Zellen nach Anspruch 1, wobei es sich um Zellen der Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) handelt.
Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß (i) Zellen nach einem der Ansprüche 1–2 in serumfreiem Medium in Suspension vermehrt werden; (ii) die Zellen mit Influenzaviren infiziert werden; (iii) kurz vor der Infektion, gleichzeitig mit der Infektion oder kurz nach der Infektion der Zellsuspension eine Protease zur Spaltung des Vorläuferproteins des Hämagglutinins [HA0] zugesetzt wird; und (iv) nach einer weiteren Kultivierungsphase, die in den Zellen vermehrten Influenzaviren isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kultur der Zellen im Perfusionssystem erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kultur der Zellen im Batch-Verfahren erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei der pH-Wert des Kulturmediums im Schritt (i) im Bereich von 6,6 bis 7,8 liegt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der pH-Wert des Kulturmediums im Bereich von 6,8 bis 7,3 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Infektion mit Influenzaviren erfolgt, wenn die Zellkultur eine Zelldichte von ca. 8 bis 25 × 10⁵ Zellen/ml (Batchverfahren) bzw. von ca. 5 bis 20 × 10⁶ Zellen/ml (Perfusionsverfahren) erreicht hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Infektion der Zellen mit Influenzaviren bei einer m. o. i. (infektiöse Einheiten pro Zelle; ”multiplicity of infection”) von ca. 0,001 bis 10 erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Infektion bei einer m. o. i. von ca. 0,002 bis 0,5 erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei die Protease eine Serinprotease ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Serinprotease Trypsin ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei Trypsin bis zu einer Endkonzentration im Kulturmedium von 1 bis 200 μg/ml zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Endkonzentration von Trypsin im Kulturmedium im Bereich von 5 bis 50 μg/ml liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 14, wobei die infizierten Zellen 2 bis 10 Tage kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die infizierten Zellen 3 bis 7 Tage kultiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16, wobei die infizierten Zellen bei 30°C bis 36°C kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die infizierten Zellen bei 32°C bis 34°C kultiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 18, wobei das Ernten und Isolieren der vermehrten Viren 2 bis 10 Tage nach der Infektion erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Ernten und Isolieren der Viren 3 bis 7 Tage nach der Infektion erfolgt.
Verfahren zu Herstellung eines Impfstoffs, dadurch gekennzeichnet, daß (i) Influenzaviren in Zellkultur nach einem der Ansprüche 3–20 vermehrt und isoliert werden; (ii) die Influenzaviren aus Schritt (i) zu einem Impfstoff formuliert werden.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (ii) die Influenzaviren als intakte Viruspartikel zu einem Impfstoff formuliert werden.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den intakten Viruspartikeln um lebend attenuierte Viren handelt.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (ii) isolierte Virusbestandteile der Influenzaviren zu einem Impfstoff formuliert werden.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den isolierten Virusbestandteilen um isolierte Influenzavirus-Proteine handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff Adjuvantien enthält.