PL214862B1

PL214862B1 - Sposób in vitro do okreslania predyspozycji pacjenta ludzkiego z lipoatrofia do reagowania na leczenie bialkiem leptyny, kompozycje farmaceutyczne do zastosowania do leczenia lipoatrofii i kompozycje farmaceutyczne zawierajace bialko leptyny

Info

Publication number: PL214862B1
Application number: PL374301A
Authority: PL
Inventors: Alex M. Depaoli; Elif Arioglu Oral; Simeon I. Taylor; Abhimanyu Garg
Original assignee: Amgen; Univ Texas; Gov Health & Human Serv
Priority date: 2001-10-22
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2013-09-30
Also published as: US20200268853A1; US20070099836A1; US20050020496A1; ES2350924T3; DK2219031T3; PL374301A1; US20190321447A1; EP2219031A1; EP1444516A4; JP2014224142A; US20170095535A1; CA2464277A1; AU2002359288B2; MXPA04003773A; JP2016190872A; CA2464277C; EP2219031B1; WO2003034996B1; EP1444516A2; US20130190225A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro do określania predyspozycji pacjenta ludzkiego z lipoatrofią do reagowania na leczenie białkiem leptyny, kompozycje farmaceutyczne do zastosowania do leczenia lipoatrofii i kompozycje farmaceutyczne zawierające białko leptyny.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny terapeutycznego zastosowania białka leptyny do leczenia lipoatrofii u ludzi.

Stan techniki

Pełny wykaz publikacji literaturowych można znaleźć na końcu szczegółowego opisu.

Objawy lipoatrofii (także znanej jako lipodystrofia) stanowią heterogenną grupę objawów cechującą się małą ilością tkanki tłuszczowej. Z tym stanem mogą także być związane nieprawidłowości metaboliczne. Te nieprawidłowości metaboliczne obejmują hipertriglicerydemię i ciężką oporność na insulinę, której zazwyczaj towarzyszy cukrzyca (Reitmann i in., 2000). Lipoatrofia u ludzi może być dziedziczna lub nabyta. Istnieje więcej niż jedna genetyczna postać lipoatrofii. Wykazano przykładowo, że mutacje genu kodującego laminę A/C (LMNA) są związane z rodzinną częściową lipodystrofią typu Dunnigana (FPLD) (Cao i in., 2000). Osobnicy z FPLD Dunnigana rodzą się z normalnym rozkładem tłuszczu, lecz w okresie dojrzewania, rozwija się u nich postępująca utrata tłuszczu podskórnego na kończynach i tułowiu, z oszczędzeniem tkanki tłuszczowej trzewnej oraz głowy i szyi. Inne położenie chromosomowe (9q34) jest także związane z genem choroby zwanej wrodzoną uogólnioną lipodystrofią (Garg i in., 1999). Wrodzona uogólniona lipodystrofia jest zaburzeniem recesywnym cechującym się prawie całkowitym brakiem tkanki tłuszczowej od urodzenia, opornością na insulinę, hipetriglicerydemią i rogowaceniem ciemnym.

Pewne postacie lipoatrofii u ludzi są nabyte. Przykładowo u wielu pacjentów zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) i leczonych wysoce aktywnymi lekami przeciwretrowirusowymi (HAART) rozwija się częściowa lipodystrofia, cechująca się utratą podskórnej tkanki tłuszczowej twarzy, kończyn i tułowia, przy zwiększeniu tkanki tłuszczowej trzewnej i „karkiem bawolim podobnym do obserwowanego w zespole Cushinga. U tych pacjentów mogą się także rozwijać zaburzenia metaboliczne, takie jak oporność na insulinę i hipertriglicerydemia. Nabyte postacie lipoatrofii mogą także być związane z młodzieńczym zapaleniem skórno-mięśniowym i innymi chorobami autoimmunologicznymi.

Badania na modelach zwierzęcych wykazały, że te nieprawidłowości metaboliczne mogą być związane z utratą tłuszczu (Gavrilova i in., 2000). Jednakże oporność na insulinę i hipertriglicerydemia, które cechują lipoatrofię, są bardzo oporne na leczenie, nawet mimo podjęcia prób różnych podejść (Garg, 2000). Jedno spośród tych podejść obejmuje leczenie tiazolidynodionami, które są agonistami PPARy (receptor gamma aktywowany proliferatorem peroksysomów). Podczas gdy tiazolidynodiony są atrakcyjne, ponieważ wspomagają zarówno różnicowanie adipocytów jak i wrażliwość na insulinę, pacjenci otrzymujący tiazolidynodiony są zazwyczaj prowadzeni metodą leczenia skojarzonego, obejmującego duże dawki insuliny, doustne środki hipoglikemiczne (np. metformina i tiazolidynodiony), i leki obniżające poziom lipidów (np. fibraty i statyny). Pomimo tych terapii, pacjenci z lipoatrofią uogólnioną nadal wykazują poważną hipertriglicerydemię (która powoduje nawracające ataki ostrego zapalenia trzustki), ciężką hiperglikemię (która stwarza ryzyko retinopatii i nefropatii cukrzycowej), i tłuszczowe niealkoholowe zapalenie wątroby (które może prowadzić do marskości) (Arioglu i in., 2000). W istocie jeden lek z grupy tiazolidynodionów, troglitazon, usunięto z rynku St. Zjedn. Ameryki ze względu na jego rzadką lecz ciężką hepatotoksyczność, pozostawiając dostępnymi dwa tiazolidynodiony (rosiglitazon i pioglitazon) (Reitmann, i in.). Tak więc, istnieje potrzeba alternatywnego leczenia lipoatrofii.

Opracowano i badano rozmaite modele dotyczące lipoatrofii z wykorzystaniem zwierząt genetycznie modyfikowanych. Jednakże te modele dostarczają sprzecznych wyników co do wrażliwości tych zwierząt na leczenie leptyną. Przykładowo, w jednym modelu myszy transgenicznej, u której ulega ekspresji skrócona jądrowa wersja SREBP-1c i która naśladuje cechy wrodzonej uogólnionej lipodystrofii wykazując oporność na insulinę i znacznie obniżoną ilość tkanki tłuszczowej, ciągły układowy wlew leptyny przezwyciężył oporność myszy na insulinę (Shimomura i in., 1999). Z drugiej strony, inna mysz transgeniczna, u której ulega ekspresji gen A-ZIP/F-1 i cechująca się brakiem tkanki tłuszczowej, ciężką opornością na insulinę, cukrzycą i znacznie zmniejszonymi poziomami leptyny w osoczu, nie zdołała wytworzyć odpowiedzi na leptynę w podobnych dawkach i z minimalną skutecznością w większych dawkach (Gavrilova i in., 2000). Skuteczność w stosowaniu leptyny zmniejszała się także

PL 214 862 B1 z wiekiem zwierzęcia (Id.). Ponadto, chociaż oporność na insulinę przezwyciężono leptyną u myszy transgenicznych SREBP-1c, nie obserwowano nawrotu lipoatrofii (Shimomura i in.).

Aktualne zastosowanie leptyny w leczeniu ludzi skupia się głównie na zmniejszaniu otyłości i związanej z nią dysfunkcji metabolicznej (Heymsfield i in. 1999). Pacjenci z brakiem leptyny z uwagi na mutacje genu leptyny są chorobliwie otyli od niemowlęctwa i mają pewną liczbę nieprawidłowości hormonalnych obejmujących oporność na insulinę i hipogonadyzm hipogonadotropowy (Montague i in., 1997). Fizjologiczna substytucja rekombinacyjną leptyną przez jeden rok u jednego spośród tych pacjentów spowodowała znaczące zmniejszenie masy ciała i poprawę nieprawidłowości hormonalnych (Farooqi i in., 1999; zgłoszenie PCT nr WO 00/20872). Te poprzednie badania nie były skierowane na zastosowanie leptyny w kontekście lipoatrofii u ludzi.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro do określania predyspozycji pacjenta ludzkiego z lipoatrofią do reagowania na leczenie białkiem leptyny, polegający na tym, że obejmuje etapy w których:

(a) określa się poziom leptyny w próbce surowicy od pacjenta ludzkiego przed wspomnianym leczeniem;

(b) sprawdza się czy poziom leptyny jest niższy niż lub równy 4 ng/ml; i (c) określa się predyspozycję wspomnianego pacjenta ludzkiego do reagowania na terapię zastępczą obejmującą wspomniane leczenie wspomnianym białkiem leptyny.

Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniany pacjent jest mężczyzną a wspomniany poziom leptyny przed leczeniem jest niższy niż lub równy 2 ng/ml.

Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniany pacjent jest kobietą.

Korzystnie sposób ten obejmuje etapy, w których:

(b) sprawdza się czy poziom leptyny (i) u pacjenta płci męskiej jest niższy niż lub równy 2 ng/ml, lub (ii) u pacjentki płci żeńskiej jest niższy niż lub równy 4 ng/ml; i (c) określa się predyspozycję wspomnianego pacjenta do reagowania na terapię zastępczą obejmującą wspomniane leczenie wspomnianym białkiem leptyny.

Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniany poziom leptyny określa się z użyciem testu immunologicznego z przeciwciałem.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna do zastosowania do leczenia lipoatrofii u pacjenta ludzkiego, charakteryzująca się tym, że składa się z inhibitora proteazy i białka leptyny.

Korzystnie w takiej kompozycji według wynalazku wspomniane białko leptyny wybrane jest z grupy składającej się z dojrzałej rekombinowanej ludzkiej metionyloleptyny; sekwencji oznaczonych: NR ID. SEKW. :1 i NR ID. SEKW. :2.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna do zastosowania do leczenia lipoatrofii u pacjenta ludzkiego, charakteryzująca się tym, że składa się z białka leptyny oraz co najmniej jednego związku wybranego z grupy składającej się z tiazolidynodionów, fibratów, statyn i metforminy.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko leptyny do zastosowania do leczenia cukrzycy lub hipertriglicerydemii związanych z lipoatrofią u pacjenta ludzkiego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko leptyny do zastosowania do leczenia lipoatrofiii nabytej u pacjenta ludzkiego.

PL 214 862 B1

Korzystnie w kompozycji według wynalazku do zastosowania do leczenia lipoatrofii nabytej u pacjenta ludzkiego wspomnianym pacjentem ludzkim jest pacjent HIV-dodatni.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku do zastosowania do leczenia lipoatrofii nabytej u pacjenta ludzkiego postać nabyta lipoatrofii jest związana z leczeniem pacjenta HIV-dodatniego wysoce aktywnym leczeniem przeciwretrowirusowym (HAART).

Opisano tu zastosowanie leptyny w leczeniu ludzi z lipoatrofią i związanymi z nią nieprawidłowościami metabolicznymi, oraz dostarczono sposób określania predyspozycji do leczenia leptyną. W jednym wykonaniu, ludzką leptynę stosuje się w hormonalnej terapii zastępczej u pacjentów z lipoatrofią, mających zmniejszone stężenie leptyny w osoczu. Dogodnie stosuje się rekombinowaną ludzką leptynę. Białka leptyny można podawać podskórnie lub układowo lub dowolnymi innymi metodami, w tym metodami stosowanymi w terapii genowej.

Przy ocenie predyspozycji pacjenta z lipoatrofią do leczenia leptyną, można określić stężenie leptyny w osoczu. Pacjentów ze stężeniem leptyny w osoczu poniżej 4 ng/ml, i w szczególności, poniżej 2 ng/ml, a zwłaszcza poniżej 0,5 ng/ml, poddaje się leczeniu leptyną. Zalecane jest także, aby leczenie leptyną było podawane pacjentom ze stężeniem leptyny w osoczu < 4 ng/ml i pacjentom ze stężeniem leptyny w osoczu < 3 ng/ml. Dogodniej leptynę podaje się pacjentom ze stężeniem leptyny w osoczu < 2 ng/ml.

Krótki opis rysunków

Fig. 1A wskazuje kliniczny przebieg choroby pacjenta NIH-1 przy 4-miesięcznym leczeniu leptyną. Dane z wywiadu przed leczeniem leptyną (rozpoczętym w dniu 0) przedstawiono po to aby wykazać stan zaawansowania wyników badań metabolicznych. Pokazano ważne kamienie milowe leczenia i poprawę parametrów metabolicznych. Fig. 1B przedstawia obrazowanie metodą osiowego rezonansu magnetycznego zależnego od T1 pacjenta NIH-1 na poziomie L4 w warunkach wyjściowych i po 4 miesiącach leczenia leptyną. Należy zauważyć zmniejszenie rozmiaru wątroby i wynikające z tego zmiany pozycji nerek i struktur leżących w linii środkowej ciała.

Fig. 2 wskazuje, że leptyna zmniejsza HbA1c u pacjentów z cukrzycą (n=8). Dane przedstawiono jako średnie zmiany i słupki błędu wskazują 95% przedział ufności. Pokazano także wartość wyjściową i wartość po 4 miesiącach ± SEM (błąd standardowy średniej). *p<0,001.

Fig. 3 wskazuje, że leptyna poprawia krzywą glukozy zarówno w teście tolerancji insuliny, jak i doustnym teście tolerancji glukozy (n=9). Panel A: Glukoza w osoczu w odpowiedzi na 0,2 U/kg insuliny i.v. przed (zamknięte koła i linia ciągła) i 4 miesiące po (otwarte koła i linia punktowa) leczeniu leptyną. Słupki błędu wskazują SEM. *p<0,02. Panel B: Glukoza w osoczu w odpowiedzi na 75 gram glukozy doustnie przed (zamknięte koła i linia ciągła) i 4 miesiące po (otwarte koła i linia punktowa) leczeniu leptyną. Słupki błędu wskazują SEM. *p<0,01.

Fig. 4 wskazuje, że leptyna zmniejsza poziom triglicerydów. Dane przedstawiono jako średnią zmianę wartości wyjściowej i słupki błędu oznaczają 95% przedział ufności. Pokazano także średnią wartość wyjściową i wartość po 4 miesiącach z obserwowanymi przedziałami. Należy zwrócić uwagę, że dane są liniowe i nie stosują się do normalnego rozkładu. *p<0,001.

Szczegółowy opis zalecanych wykonań

Hormon adipocytów - leptyna odgrywa centralną rolę w homeostazie energetycznej. Najpierw stwierdzono ją u otyłych myszy jako brakujący czynnik osoczowy, który po substytucji obniżał przyjmowanie pożywienia i masę ciała (Zhang i in., 1994; Pelleymounter i in., 1995). Ze względu na te początkowe obserwacje dokonywano wielu wcześniejszych prób terapeutycznych z zastosowaniem tego hormonu w leczeniu otyłości. U większości ludzi z otyłością stężenia leptyny w osoczu są wysokie i uważa się, że występuje stan oporności na leptynę (Mantzoros i in., 2000). Jak dotąd wpływ rekombinowanej ludzkiej leptyny jest ograniczony do wywoływania spadku masy ciała u osobników otyłych z wyjątkiem stanu wrodzonego niedoboru leptyny (Heymsfield i in., 1999; Farooqi i in., 1999).

Wynalazek przedstawia możliwość zastosowania leptyny do leczenia lipoatrofii i związanych z nią nieprawidłowości metabolicznych u ludzi, takich jak hiperglikemia, dyslipidemia, hiperlipidemia, hipercholesterolemia, hipertriglicerydemia, miażdżyca naczyń, restenoza naczyń i oporność na insulinę. Wyniki badań u pacjentów z HIV wykazały, że zmniejszenie stężeń osoczowych leptyny jest ściśle związane z początkiem nabytej lipoatrofii. Ponadto, substytucja leptyny u pacjentów z lipoatrofią bardzo wyraźnie poprawia metabolizm glukozy i triglicerydów nawet po wygaszeniu wszystkich innych potencjalnych terapii. We wszystkich tych przypadkach leczenia substytucyjnego leptyną, stężenie wyjściowe leptyny w osoczu wynosiło poniżej 4 ng/ml.

PL 214 862 B1

W jednym ciężkim przypadku nabytej lipoatrofii pacjent (mający stężenie leptyny w osoczu wynoszące <0,5 ng/ml) cierpiał na ciężką hipertriglicerydemię, cukrzycę, bolesne cukrzycowe kępki żółte, i znaczną hepatomegalię. Leczenie leptyną w ciągu czterech miesięcy zdecydowanie poprawiło hipertriglicerydemię i hiperglikemię u pacjenta, co pozwoliło na zaprzestanie plazmaferezy i odstawienie innych leków cukrzycowych. Tej poprawie towarzyszyło także zniknięcie skórnych kępek żółtych, a objętość wątroby pacjenta zmniejszyła się o 40%. Tak więc dane te pokazują, że leczenie substytucyjne leptyną można skutecznie stosować do leczenia nabytej lub wrodzonej lipoatrofii i związanych z nią nieprawidłowości metabolicznych u człowieka.

Ponadto, na bazie tych danych można ekstrapolować, że pacjenci ze stężeniem leptyny w osoczu poniżej 4 ng/ml mogą być dogodną grupą pacjentów do leczenia substytucyjnego leptyną. Poziomy leptyny można zmierzyć stosując płyn ustrojowy, w szczególności krew lub pewną jej część. Tu stosowano osocza pacjentów. Inne płyny ustrojowe, takie jak pełna krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, osocze i prawdopodobnie mocz, także mogą zawierać mierzalne poziomy leptyny. Przedstawione pomiary 4 ng leptyny/ml osocza można odnieść do odpowiednich poziomów w innych płynach ustrojowych. Na przykład, jeśli stosuje się pełną krew, stężenie leptyny zmniejszy się, co wyjaśnia efekt rozcieńczania przy stosowaniu niefrakcjonowanej krwi.

Fachowiec w dziedzinie będzie mógł określić skuteczne dawki przez podawanie leptyny, analogu leptyny lub pochodnej leptyny i obserwowanie pożądanego efektu terapeutycznego. Celem leczenia substytucyjnego jest osiągnięcie stężeń bliskich fizjologicznym stężeniom leptyny w osoczu. Szacuje się, że fizjologiczna dawka substytucyjna leptyny wynosi około 0,02 mg na kilogram masy ciała dziennie dla mężczyzn w każdym wieku, około 0,03 mg na kilogram dziennie dla kobiet poniżej 18 lat i około 0,04 mg na kilogram dziennie dla dorosłych kobiet. Próbując osiągnąć prawie fizjologiczne stężenia leptyny, można np. leczyć pacjenta stosując 50 procent oszacowanej dawki substytucyjnej przez pierwszy miesiąc leczenia, 100 procent dawki substytucyjnej przez drugi miesiąc leczenia, 200 procent dawki substytucyjnej przez trzeci miesiąc leczenia, itp. Podczas przebiegu leczenia substytucyjnego leptyną, w celu monitorowania efektu terapeutycznego leczenia leptyną można mierzyć pewne markery biochemiczne. Wśród zalecanych markerów do pomiaru efektu terapeutycznego w celu monitorowania skuteczności leczenia leptyną są poziomy hemoglobiny glikozylowanej (HbA1c) i poziomy triglicerydów (na czczo).

Alternatywnie, poziomy leptyny w osoczu można zmierzyć stosując dostepne w handlu testy immunologiczne, jak następnie ujawniono w przykładach poniżej. Na ogół, test diagnostyczny do pomiaru ilości leptyny we krwi (lub osoczu lub surowicy) można najpierw stosować w celu określenia endogennych poziomów białka. Takie narzędzia diagnostyczne mogą występować w postaci testu z przeciwciałem, takiego jak test typu „antibody sandwich. Ilość endogennej leptyny początkowo ocenia się ilościowo, i określa się wartość wyjściową. Dawki terapeutyczne określa się jako ocenę ilościową endogennego i egzogennego białka leptyny (tj. leptyny, analogu leptyny lub pochodnej leptyny stwierdzanej w organizmie, albo wytwarzanej endogennie albo podawanej). W przebiegu leczenia nadal prowadzi się monitorowanie poziomów leptyny u pacjenta.

Dostarczono tu także kompozycje farmaceutyczne zawierające białko leptyny do zastosowań terapeutycznych. Takie kompozycje farmaceutyczne można stosować do podawania w formie zastrzyku lub doustnie, dopłucnie, donosowo, przezskórnie lub w innej formie podawania. Zalecane metody podawania białek leptyny obejmują metody podskórne, układowe i terapii genowej.

Na ogół, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku obejmują skuteczne ilości białka leptyny razem z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, środkami konserwującymi, solubilizatorami, emulgatorami, środkami wspomagającymi i/lub nośnikami. Takie kompozycje obejmują rozcieńczalniki zawierające różne bufory (np. Tris-HCl, octan, fosforan), o różnym pH i stężeniu jonowym; dodatki takie jak detergenty i środki rozpuszczające (np. Tween 80, Polisorbat 80), przeciwutleniacze (np. kwas askorbinowy, pirosiarczyn sodu), środki konserwujące (np. Thimersol, alkohol benzylowy) i substancje wypełniające (np. laktoza, mannitol); wprowadzenie materiału do preparatów złożonych z cząstek związków polimerycznych takich jak kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy, itp. lub do liposomów. Można także stosować kwas hialuronowy, i to może dawać efekt sprzyjania przedłużonemu utrzymywaniu w krążeniu. Takie kompozycje mogą wpływać na stan fizyczny, trwałość, szybkość uwalniania in vivo, i szybkość klirensu in vivo niniejszych białek i pochodnych. Patrz, np. Remington's Pharmaceutical Sciences wyd. 18-te (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) str. 1435-1712, który załącza się tu na zasadzie odsyłacza. Kompozycje można wytwarzać w postaci ciekłej, lub

PL 214 862 B1 w postaci wysuszonego proszku, takiej jak postać liofilizowana. Rozważa się także preparaty wszczepialne o przedłużonym uwalnianiu, jak preparaty przezskórne.

W celu ułatwienia rozpuszczenia środka terapeutycznego w środowisku wodnym można dodać surfaktant jako środek zwilżający. Surfaktanty mogą obejmować detergenty anionowe takie jak laurylosiarczan sodu, sulfobursztynian dioktylu sodu i sulfonian dioktylu sodu. Można stosować detergenty kationowe i mogą one obejmować chlorek benzalkoniowy lub chlorek benzetoniowy. Jako potencjalne surfaktanty w preparacie można stosować niejonowe detergenty, takie jak lauromakrogol 400, stearynian poloksylu 40, polioksyetylenowany uwodorniany olej rycynowy 10, 50 i 60, monostearynian glicerolu, polisorbat 40, 60, 65 i 80, ester sacharozy i kwasu tłuszczowego, metylocelulozę i karboksymetylocelulozę. Te surfaktanty mogą występować w preparacie białka lub pochodnej albo pojedynczo albo jako mieszanina w różnych stosunkach.

Dodatki, które potencjalnie wzmagają wychwyt białka leptyny stanowią na przykład kwasy tłuszczowe, kwas oleinowy, kwas linolowy i kwas linolenowy.

Może być pożądany preparat o kontrolowanym uwalnianiu. Białko leptyny można wprowadzić do obojętnej macierzy, która umożliwia uwalnianie w mechanizmie dyfuzji albo wypłukiwania, jak np. żywice naturalne. Do preparatu można także wprowadzić wolno degenerujące matryce, np. alginiany, polisacharydy. Inną formę kontrolowanego uwalniania tego środka terapeutycznego można uzyskać sposobem opartym na systemie terapeutycznym Oros (Alza Corp.), tj. białko leptyny jest zamknięte w błonie półprzepuszczalnej, która umożliwia wchodzenie wody i wypychanie białka na zewnątrz poprzez pojedynczy mały otwór w wyniku efektów osmotycznych. Pewne powłoczki dojelitowe także dają efekt opóźnionego uwalniania.

Ponadto, w wynalazku brane są pod uwagę ulepszone zestawy do określania predyspozycji pacjenta z lipoatrofią do reagowania na leczenie białkiem leptyny. W jednym aspekcie, ulepszony zestaw mogą zapewnić środki do określania czy poziom leptyny pacjenta przed wymienionym leczeniem leptyną jest niższy lub równy w przybliżeniu 4 ng/ml. W pokrewnym aspekcie, ulepszony zestaw może uwzględniać płeć pacjenta przy określaniu poziomu leptyny u pacjenta przed wymienionym leczeniem leptyną. Następnie, zestaw może zapewniać sposób określania, czy poziom leptyny pacjenta przed wymienionym leczeniem leptyną jest niższy lub równy w przybliżeniu 2 ng/ml jeśli pacjent jest płci męskiej, lub niższy lub równy w przybliżeniu 4 ng/ml jeśli pacjent jest płci żeńskiej. Dogodnie, zestaw zawiera instrukcje stosowania. Zestaw może także obejmować reagenty, probówki, opakowanie i/lub inne składniki reakcji.

Następujące opisy przedstawiono wyłącznie przykładowo i nie należy ich rozumieć jako ograniczenie zakresu zastrzeżeń. Na bazie opisu, fachowiec w dziedzinie może dokonywać modyfikacji i zmian korzystnych rozwiązań, które nie odchodzą od zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d I

Następujący przykład wskazuje, że na rozwój zespołu lipoatrofii związanej z HIV (HIV-LS) może wpłynąć zmniejszony poziom leptyny w osoczu, który przyczynia się do nagromadzenia, utraty lub redystrybucji tłuszczu w organizmie.

Dokładniej, prowadzono badanie w celu określenia czy fenotyp lipoatrofii w HIV-LS jest związany ze zmianami leptyny osoczowej następującymi po zapoczątkowaniu silnie aktywnego leczenia przeciwretrowirusowego (HAART). To badanie obejmowało stu czterdziestu sześciu (146) mężczyzn seropozytywnych pod względem HIV, dla których stężenia leptyny w osoczu porównano przed i po HAART. Metodą badania fizykalnego mężczyzn oceniono i podzielono na dwa główne fenotypy: sama lipoatrofia i lipoatrofia z przyrostem tłuszczu w centralnych partiach ciała („mieszany HIV-LS).

Spośród 146 mężczyzn u czterdziestu dwóch (42/146) mężczyzn stwierdzono umiarkowaną lub ciężką lipoatrofię lub lipohipertrofię w więcej niż jednym regionie ciała po HAART. Dwudziestu siedmiu spośród 146 (27/146) miało samą lipoatrofię i piętnastu (15/146) miało „mieszane zmiany po HAART. Trzydziestu dziewięciu spośród 146 (39/146) nie miało zmian w budowie ciała i ci pacjenci służyli jako pacjenci kontrolni. Na ogół mężczyźni z HIV-LS byli starsi i stosowali inhibitory proteazy przez dłuższy czas. Mieli także niższą wartość wyjściową liczby CD4 i stracili średnio 4 kg masy ciała w stosunku do wartości wyjściowych.

Przed HAART średnia wartość wyjściowa poziomów leptyny zarówno dla grupy z lipoatrofią jak i „mieszanej wynosiła 3,6 ng/ml i średni poziom leptyny dla grupy kontrolnej wynosił 4,1 ng/ml. U tych, u których rozwinęła się sama lipoatrofia po HAART, stężenie leptyny w osoczu znacznie się obniżyło od 3,6 do 2,8 ng/ml (Wilcoxon p = ,006). Z drugiej strony, poziomy leptyny w osoczu pozostawały stałe

PL 214 862 B1 zarówno w grupie „mieszanego HIV-LS (4,0 ng/ml) [p=NS] jak i u 39 seropozytywnych pod względem HIV pacjentów kontrolnych, u których nie rozwinął się HIV-LS (3,7 ng/ml) [p=NS].

Te dane sugerują, że zmniejszony poziom leptyny następujący po silnie aktywnym leczeniu przeciwretrowirusowym u seropozytywnych pod względem HIV pacjentów może przyczyniać się do rozwoju zespołu lipoatrofii.

P r z y k ł a d II

W celu określenia skuteczności stosowania leptyny do leczenia lipoatrofii u ludzi, prowadzono także leczenie substytucyjne leptyną u dziewięciu pacjentów, u których zdiagnozowano różne postacie lipoatrofii. Pacjenci w tym badaniu kierowani byli przez licznych lekarzy w St. Zjedn. Ameryki Płn. i w Europie. Aby mogli być wybrani do badania, pacjenci musieli mieć niskie poziomy (określone jako stężenie leptyny w osoczu równe <3,0 ng/ml u mężczyzn i <4,0 ng/ml u kobiet) w połączeniu z lipodystrofią, i co najmniej jedną spośród następujących nieprawidłowości metabolicznych: (1) występowanie cukrzycy według kryteriów Amerykańskiego Towarzystwa Diabetologicznego (American Diabetes Association) (Patrz Peters i in., 1998); (2) stężenia triglicerydów w osoczu na czczo >200 mg/dl;

i/lub (3) stężenia insuliny w osoczu na czczo >30 μυ/ml. Rozpoznanie lipodystrofii oparto na podstawach klinicznych dobrze znanych fachowcom w dziedzinie.

T a b e l a 1 reasumuje wyjściowe cechy kliniczne pacjentów leczonych w badaniu.

T a b e l a 1: Cechy pacjentów

Pacjent	Wiek/Płeć/Typ	Leczenie obniżające poziom lipidów	Insulina na czczo¹ ^U/ml)	Leptyna² (ng/ml)	RMR³ (kcal/dzień)	Tłuszcz całkowity⁴ (%)
NIH-1	17/F Nabyty Uogólniony	Fenofibrat Atorwastatyna Orlistat, Plazmafereza raz w tygodniu	31,2	<0,5	2010	7
NIH-2	17/F Wrodzony Uogólniony	Brak	334	1,0	2030	17
NIH-3	27/F Nabyty Uogólniony	Brak	19	0,7	1570	18
NIH-4	17/F Wrodzony Uogólniony	Brak	211	1,1	2480	17
NIH-5	15/F Wrodzony Uogólniony	Brak	115	0,8	2670	15
NIH-6	37/F Wrodzony Uogólniony	Brak	25	0,6	1370	15
NIH-7	42/F Rodzinny Częściowy	Gemfibrozyl	40,3	3,6	1980	26
UTSW-1	31/F Wrodzony Uogólniony	Fenofibrat	61,5	0,7	1702	8
UTSW-2⁵	33/F Nabyty Uogólniony	Gemfibrozyl	12,3	2,4	1497	14

¹ Insulina na czczo, współczynnik konwersji do pmol/l: 7,15X (należy zwrócić uwagę, że pewni pacjenci są leczeni insuliną egzogenną) ² Współczynnik konwersji do nmol/ml: 0/08X ³ Spoczynkowa przemiana materii ⁴ Otrzymany z pomiarów z zastosowaniem metody absorpcjometrii podwójnej energii promieniowania rentgenowskiego, gdzie pomiary są 7-8% wyższe niż w technice ważenia pod wodą ⁵ Pacjent bez cukrzycy

PL 214 862 B1

Każdy spośród dziewięciu pacjentów zrekrutowanych do badania był płci żeńskiej. Chociaż badanie było otwarte dla obu płci, istnieje tendencja do rozpoznawania kobiet wcześniej i częściej. Pięć z dziewięciu pacjentów miało wrodzoną uogólnioną lipodystrofię lub zespół Seip-Beradinelli. To rozpoznanie postawiono na podstawie uogólnionej utraty tłuszczu od urodzenia, w połączeniu z innymi kryteriami klinicznymi (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM #269700; Garg i in., 1992). Jak się okazało trzech pacjentów miało (na podstawie wywiadu) nabytą uogólnioną lipodystrofię z dostrzegalną utratą tłuszczu w dzieciństwie. U jednego spośród tych pacjentów (UTSW-2) rozwinęła się uogólniona lipodystrofia z młodzieńczym zapaleniem skórno-mięśniowym. Inny pacjent (NIH-7) miał rodzinną częściową lipodystrofię Dunnigana (OMIM # 151660; Garg, 1999; i Cao i in., 2000).

Projekt badania

Badanie zaprojektowano jako prospektywne badanie otwarte przy Dziale Cukrzycy Narodowego Instytutu Cukrzycy, Chorób Układu Pokarmowego i Nerek (Diabetes Branch of National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases, NIDDK), i przy Centrum Medycznym Uniwersytetu Texas Southwestern (UT Southwestern) w Dallas. Rekombinowaną metionylowaną ludzką leptynę (leptyna rekombinowana) do badania zapewniła firma Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA). Odpowiedź każdego pacjenta porównano z jego stanem wyjściowym. Ze względu na rzadkość zespołów lipoatrofii i zmienność cech klinicznych, nie było wykonalne włączenie do badania randomizowanej, leczonej placebo grupy kontrolnej. Komisje etyczne NIDDK i Centrum Medycznego Uniwersytetu Texas Southwestern zatwierdziły badanie. Od pacjentów lub ich prawnego przedstawiciela otrzymano pisemną świadomą zgodę.

Pacjentów badano jako pacjentów szpitalnych w Centrum Klinicznym Narodowych Instytutów Zdrowia (Clinical Center of the National Institutes of Health) i w Ogólnym Centrum Badań Klinicznych Centrum Medycznego (General Clinical Center) Uniwersytetu Texas Southwestern przed leczeniem i ponownie po 1, 2 i 4 miesiącach leczenia leptyną. Wszyscy pacjenci przyjmowali stałe dawki towarzyszących leków przez co najmniej 6 tygodni przed rozpoczęciem leczenia leptyną. Podczas badania, stopniowo zmniejszano dawki leków hipoglikemicznych lub przerywano ich podawanie, zgodnie z potrzebą.

Celem tego badania było osiągnięcie prawie fizjologicznych stężeń leptyny w osoczu. Fizjologiczną dawkę substytucyjną oszacowano na 0,02 mg/kg/dzień dla mężczyzn w każdym wieku, 0,03 mg/kg/dzień dla kobiet poniżej 18 lat i 0,04 mg/kg/dzień dla dorosłych kobiet. Rekombinacyjną leptynę podawano podskórnie co 12 godzin. Istotne jest, aby zwrócić uwagę, że dawka substytucyjna wynosi w przybliżeniu jedną dziesiątą dawki najpowszechniej stosowanej w badaniach otyłości. Pacjentów leczono 50% dawki substytucyjnej przez pierwszy miesiąc, 100% dawki substytucyjnej w następnym miesiącu i 200% dawki substytucyjnej przez następujące dwa miesiące. Pierwotne punkty końcowe w celu określenia skuteczności rekombinacyjnej leptyny określono jako poziomy hemoglobiny A1c i triglicerydów w osoczu na czczo.

Analizy biochemiczne

Osoczowe poziomy glukozy i triglicerydów określono standardowymi metodami stosując zautomatyzowane urządzenie Hitachi (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i stosując przyrząd Beckmana (Beckman, CA). Hemoglobinę A1c określono metodą jonowymiennej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA). Poziomy wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) w osoczu określono stosując zestaw handlowy (Wako, Richmond, VA). Poziomy insuliny w osoczu określono metodą testów immunologicznych z zastosowaniem reagentów dostarczonych przez Abbott Imx Instrument (Abbott Park, IL) i zestaw handlowy (Linco Research, Inc., St. Charles, MO). Poziomy leptyny w osoczu określono metodą testów immunologicznych z zastosowaniem zestawu handlowego (Linco Research, Inc. St. Charles, MO).

Metody

Spoczynkowe zużycie energii zmierzono stosując urządzenie Deltatrac (Sensormedics, Yorba Linda, CA). Test przeprowadzono po poszczeniu przez noc przez ponad 8 godzin u pacjentów w spoczynku po przebudzeniu pomiędzy 6 a 8 rano. Doustny test tolerancji glukozy przeprowadzono po poszczeniu przez noc stosując 75 gramów dekstrozy. Poziom glukozy w osoczu zmierzono w -10, 0, 30, 60, 90, 120 i 180 minut od obciążenia glukozą.

Wysokodawkowy test tolerancji insuliny przeprowadzono stosując 0,2 IU/kg normalnej insuliny aby ocenić wrażliwość na insulinę. Insulinę podawano dożylnie po poszczeniu przez noc. Próbki na glukozę zebrano w -10, 0, 5, 10, 15, 20 i 30 minut od podania insuliny. Stałą K (szybkość zniknięcia glukozy jako odbicie ogólnej wrażliwości organizmu na insulinę) obliczono jako stałą szybkości dla

PL 214 862 B1 spadku glukozy we krwi po dożylnym podaniu insuliny stosując kinetykę pierwszego rzędu (Harrision i in., 1976).

Tłuszcz w organizmie określono stosując absorpcjometr podwójnej energii promieniowania rentgenowskiego (DEXA, Hologic QDR 4500) (Hologic, Inc., Bedford, MA) (Lambrinoudaki i in., 1998). Zależne od T1 osiowe skany MR wątroby otrzymano na skanerze 1,5 tesli (General Electric Medical Systems, Milwaukee) (Abate i in., 1994). Objętości wątroby obliczono stosując pakiet oprogramowania do analizy obrazu MEDx (Sensor Systems, Inc., Sterling, VA), na stacji roboczej Sun. Przez umieszczenie punktu zaczepu dla algorytmu śledzącego brzeg, na poszczególnych sąsiednich przekrojach wykonano ślady zewnętrznych brzegów wątroby. Następnie obliczono objętości wątroby na podstawie powierzchni w pikselach i grubości plastra. Pacjentki uczestniczące w badaniu w placówce NIH poproszono o relację na temat przyjmowania przez nie pożywienia w ciągu ostatnich 3 dni w momencie wyjściowym i po 4 miesiącach aby obliczyć szacowane dzienne przyjmowanie pożywienia (Feskanich i in., 1993).

Analizy statystyczne

Pomiary przedstawia się jako średnią ± SEM. Aby porównać zmienne badania podczas różnych okresów badania, zastosowano analizę wariancji wielokrotnych pomiarów. Dane liniowe takie jak stężenia triglicerydów i obliczone stałe K przekształcono logarytmicznie. Tam gdzie to było odpowiednie stosowano symetryczny test-t Studenta do porównania danych wyjściowych w różnych punktach czasowych. Stężenie glukozy w osoczu podczas doustnego testu tolerancji glukozy porównano stosując 2-czynnikową analizę wariancji, przy czym okres badania i czas podczas testu modelowano jako czynniki powtarzalne. Dziewięćdziesięcio-pięcio procentowe przedziały ufności dla różnic pomiędzy średnimi wyprowadzono z analizy wariancji i dla różnic pomiędzy średnimi (Hanh i in., 1991). Zmiany uważano za statystycznie istotne dla p<0,05. W celu wykonania analizy statystycznej specyficznych hipotez a priori, nie dokonywano żadnych dostosowań dla jednoczesnych porównań.

Wyniki

Wyjściowe cechy pacjentek

Ośmiu z dziewięciu pacjentów w badaniu miało cukrzycę i u wszystkich występowała hiperlipemia (Tabela 1). Wszyscy pacjenci z cukrzycą otrzymali farmakoterapię przed badaniem (Tabela 1 i 2) i 4 pacjenci otrzymali farmakoterapię kontrolującą poziom lipidów (Tabela 1). Średnia HbA1c u pacjentów z cukrzycą wynosiła 9,1±0,5% (norma: <5,6%). Średnie poziomy triglicerydów były podwyższone do 1405 mg/dl (zakres: 322-7420 mg/dl; zakres normy: 35-155 mg/dl) [16 mmol/l, zakres: 3,6-8,7 mmol/l]. Poziomy wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) zwiększyły się około 3-krotnie od górnej granicy normy (1540±407 μmol/l; norma: 350-550 μmol/l). Sześć z siedmiu pacjentów NIH miało stłuszczenie wątroby w badaniu ultradźwiękowym i powiększoną wątrobę w badaniu fizykalnym. Trzech pacjentów poddano biopsji wątroby i u dwóch z tych trzech zdiagnozowano niealkoholowe tłuszczowe zapalenie wątroby na podstawie kryteriów histopatologicznych (Manton i in., 2000; Berasain i in., 2000; Luyckx, i in., 2000).

Średnie stężenie leptyny w osoczu wynosiło 1,3±0,3 ng/ml w warunkach wyjściowych (Tabela 1), i zwiększało się w miarę leczenia do 2,3±0,5 ng/ml pod koniec pierwszego miesiąca, 5,5±1,2 ng/ml pod koniec drugiego miesiąca i 11,1±2,5 ng/ml pod koniec czwartego miesiąca. Tak więc, podawanie rekombinowanej leptyny w dawkach stosowanych w tym badaniu dawało w wyniku w przybliżeniu normalne poziomy leptyny w osoczu u tych pacjentek.

Wpływ leptyny na pierwszego pacjenta: studium przypadku (Fig. 1)

Pierwszy pacjent leczony w badaniu (NIH-1) jest najciężej dotknięty chorobą i przebieg jego leczenia jest pouczający jeśli chodzi o przedstawienie niezwykle silnego wpływu substytucji leptyny w tej populacji nawet po wygaszeniu wszystkich innych potencjalnych terapii. Ten pacjent urodził się zdrowy, lecz wystąpiła u niego utrata tłuszczu w wieku pomiędzy 10 a 12 lat. Rozwinęła się u niego ciężka hipertriglicerydemia w wieku 13 lat i cukrzyca w wieku 14 lat. Pojawił się w Centrum Klinicznym NIH w wieku 15 lat z potwierdzonymi poziomami triglicerydów >10000 mg/dl (>113 nmol/l) i cukrzycą z HbA1c równą 9,5%. Miał bolesne cukrzycowe kępki żółte rozsiane na ciele i intensywną hepatomegalię sięgającą wchodu miednicy. Dodano leczenie plazmaferezą raz w tygodniu i Orlistat aby zmniejszyć nadmiar triglicerydów we krwi (Fig. 1A) (Bolan i in.). Inne godne uwagi cechy kliniczne obejmowały żarłoczny apetyt (opisywał przyjmowanie nadmiaru pożywienia w ilości 3200 kcal/dzień) i znacznie podwyższoną spoczynkową przemianę materii na poziomie 2010 kcal/dzień, 180% przewidywanej. W ciągu czteromiesięcznego okresu, rekombinowana leptyna spowodowała wyraźną postępującą poprawę hipertriglicerydemi i hiperglikemii, co pozwoliło na zaprzestanie plazmaferezy i odstawienie

PL 214 862 B1 leków przeciwcukrzycowych (Fig. 1A). Poprawie parametrów metabolicznych towarzyszyło zniknięcie skórnych kępek żółtych. Ponadto, objętość wątroby tego pacjenta zmniejszyła się o 40% (od 4213 ml w warunkach wyjściowych do 2644 ml po 4 miesiącach, wskazane na Fig. 1B).

Leptyna poprawiła kontrolę metaboliczną u wszystkich pacjentów z cukrzycą i z lipoatrofią

Przed rozpoczęciem leczenia leptyną, ośmiu pacjentów z cukrzycą i z lipoatrofią wykazywało słabą kontrolę metaboliczną. Po czterech miesiącach leczenia substytucyjnego leptyną, HbA1c obniżyła się o średnio 1,9 punkta procentowego (95% Cl, 1,1 do 2,7%, p=0,0012) (Fig. 2). Indywidualne odpowiedzi pacjentów pokazano w Tabeli 3. Godne uwagi jest to, że kontrola glikemii poprawiła się pomimo ograniczenia lub przerwania wyjściowego leczenia przeciwcukrzycowego (Tabela 2).

T a b e l a 2: Zmiany leczenia hipoglikemicznego podczas badania

Pacjent	Leczenie hipoglikemiczne w czasie okresu wyjściowego	Leczenie hipoglikemiczne po 4 miesiącach leczenia
NIH-1	Metformina (500 mg bid) Akarboza (50 mg tid)	Brak
NIH-2	Insulina (800 U/dzień)	Brak
NIH-3	Insulina (40 U/dzień) Metformina (500 mg tid)	Brak
NIH-4	Insulina (1200 U/dzień)	Brak
NIH-5	Insulina (3000 U/dzień)	Brak
NIH-6	Metformina (500 mg tid)	Brak
NIH-7	Insulina (200 U/dzień) Proglitazon (45 mg qd)	Insulina (60 U/dzień)
UTSW-1	Insulina (700 U/dzień)	Insulina (300 U/dzień)
UTSW-2 Pacjent bez cukrzycy	Brak	Brak

Zaobserwowano znaczącą poprawę poziomów glukozy w osoczu podczas testu tolerancji insuliny pod koniec 4 miesięcy w porównaniu z wartością wyjściową (Fig. 3A). Wartość K (szybkość zniknięcia glukozy) wzrastała od 0,0071±0,0012 do 0,0169±0,0039 wskazując poprawę wrażliwości całego organizmu na insulinę (p=0,035). Ponadto, doustny test tolerancji glukozy także uległ znacznej poprawie w porównaniu z wartością wyjściową (Fig. 3B).

Pod koniec czteromiesięcznego leczenia rekombinacyjnego leptyną poziomy triglicerydów na czczo spadły o 60% (Cl, 43 do 77%, p<0.001, Fig. 4). Podczas tego samego okresu, poziom wolnych kwasów tłuszczowych na czczo spadł od 1540±407 μmol/l do 790±164 μmol/l (p=0,045). Indywidualne odpowiedzi pokazano w Tabeli 3.

T a b e l a 3: Parametry metaboliczne pacjentów podczas różnych etapów leczenia

Pacjent	HbA1c (%)	Triglicerydy¹ (mg/dl)	Wolne kwasy tłuszczowe²(pmol/l)
Miesiąc³	0	1	2	4	0	1	2	4	0	1	2	4
NIH-1	8,6	7,6	7,4	7,0	7420	6440	1632	1214	3977	3517	2216	1701
NIH-2⁴	9,8	8,3	7,4	10,0	633	523	471	405	2922	1452	1372	1244
NIH-3	9,3	7,8	8,4	7,9	450	579	233	281	919	368	451	454
NIH-4	7,6	6,7	6,1	5,0	322	232	160	106	1838	1388	866	446
NIH-5	9,5	9,4	6,5	6,1	913	427	143	123	1066	1842	723	629
NIH-6	9,2	8,6	7,2	7,4	663	355	242	303	1672	1367	1315	428
NIH-7	9,5	8,4	7,4	6,6	802	366	295	215	384	315	306	345
UTSW-1	9,5	8,1	7,5	7,3	995	827	383	192	560	360	525	560
UTSW-2⁵	5,4	4,8	5,0	5,1	447	656	276	424	520	630	1690	1310

PL 214 862 B1 ₁ ¹ Poziomy triglicerydów w osoczu na czczo, współczynnik konwersji do mmol/l: 0,1129X, norma 35-155 mg/dl ² Poziomy wolnych kwasów tłuszczowych na czczo, norma 135-550 pmol/l ³ Miesiąc leczenia, 0 odnosi się do wyjściowego okresu oceny ⁴ U tego pacjenta wystąpiło niestosowanie się do zaleceń pomiędzy 3 i 4 miesiącem leczenia. Po dwóch miesiącach ścisłej współpracy, udokumentowanej poprzez zużyte fiolki leku, odnotowane parametry wynosiły odpowiednio: 7,3%, 283 mg/dl i 799 pmol/l ⁵ Pacjent bez cukrzycy

Zmiany objętości wątroby i testy czynności wątroby

Wyjściowa średnia objętość wątroby wynosiła 3097±391 ml (około 4-krotnie podwyższona w porównaniu z osobami dopasowanymi pod względem wieku i płci o normalnej masie ciała). Leptyna zmniejszyła objętość wątroby o średnio 28% (Cl, 20 do 36%) od wartości wyjściowych. Średnie zmniejszenie objętości wątroby wynosiło 987 ml (Cl, 546 do 1428 ml, p=0,0024). Poprawa wielkości wątroby była związana z poprawą wyników testów czynności wątroby. Wyjściowe stężenia transaminazy alaninowej obniżyły się od 66±16 U/l do 24±4 U/l po 4 miesiącach (p=0,023). Podobnie, osoczowe stężenia transaminazy asparaginianowej wynosiły 53±12 U/l w warunkach wyjściowych i 21±2 U/l po 4 miesiącach (p=0,03).

Zmiany w równowadze energii

Notowany przez pacjentów dzienny pobór kalorii znacznie zmniejszył się w stosunku do wartości wyjściowej równej 2680±250 kcal/dzień do 1600±150 kcal/dzień (p=0,005, n=7). Występował równoległy spadek zmierzonej spoczynkowej przemiany materii 1920±150 kcal/dzień do 1580±80 kcal/dzień (p=0,003, n=9).

U wszystkich z wyjątkiem jednego (NIH-3) pacjenta wystąpił spadek masy ciała po 4 miesiącach. Średni spadek masy wynosił 3,6±0,9 kg z zakresem pomiędzy -1,7 a 7,3 kg. Znaczącą część spadku masy (50-65%) można przypisać spadkowi masy wątroby.

Tolerancja i zdarzenia niepożądane

Nie opisano ani nie obserwowano żadnych reakcji skórnych w miejscach wstrzyknięć. Nie występowały trendy do zdarzeń niepożądanych w zakresie rutynowych parametrów biochemicznych lub hematologicznych. Pacjent NIH-1 miał ostry epizod nudności i wymiotów po pierwszej dawce. Pacjent NIH-6 miał zaostrzenie nadciśnienia po drugiej dawce związane z przewodnieniem.

Pacjenta NIH-7 hospitalizowano z uwagi na zakażenie paciorkowcem w trzecim miesiącu leczenia. Żadne spośród tych zdarzeń nie wystąpiło ponownie podczas kontynuacji leczenia.

Omówienie

W tym badaniu, substytucja leptyny prowadziła do wyraźnych i wyraźnie widocznych korzyści metabolicznych w grupie pacjentek z lipodystrofią i niedoborem leptyny. Podczas badania, substytucja rekombinowaną leptyną dawała w wyniku poprawę o 1,9 punkta procentowego w HbA1c, co jak się przewiduje zmniejszy względne ryzyko rozwoju retinopatii o około 22% w populacji cukrzyków (UK PDS, 1998). Ponadto, poziomy triglicerydów spadły o 60%, co jak się przewiduje zmniejszy względne ryzyko incydentów sercowo-naczyniowych w populacji ogólnej o 35-65% (Kreisberg, 1998; Garg, 2000).

Te wyniki przedstawiają nowy wgląd w mechanizmy działania leptyny. Sygnał leptyny, oprócz swojej znanej roli w kontroli homeostazy energetycznej, wydaje się regulować ogólną wrażliwość organizmu na insulinę i poziomy triglicerydów. To badanie jest pierwszym dowodem, że leptyna działa jako środek uwrażliwiający na insulinę i oszczędzający insulinę in vivo u ludzi.

Chociaż w badaniu nie stosowano randomizacji, waga dowodu sugeruje, że ulepszona kontrola metaboliczna była spowodowana raczej przez leptynę niż lepsze stosowanie się do zaleceń związane z uczestnictwem w badaniu. Po pierwsze, wielkość i odtwarzalność poprawy HbA1c są najbardziej zbieżne raczej z wpływem leku niż efektem placebo. Pomimo niejednorodności pacjentek włączonych do badania, obserwowano jednolitą poprawę kontroli metabolicznej u wszystkich pacjentek z cukrzycą. U pacjenta NIH-2 udowodniono niestosowanie się do zaleceń, wyjaśniające pogorszenie jej HbA1c pomiędzy 2 a 4 miesiącem, które skorygowano przedłużonym leczeniem (Tabela 3). To poprawione przez pacjenta odstawienie leku jest silnym dowodem, że efekt poprawionych poziomów HbA1c jest spowodowany podawaniem leptyny.

Wpływ leptyny na przyjmowanie pożywienia

Uznaje się, że ograniczanie poboru kalorii w cukrzycy z lipoatrofią poprawia nieprawidłowości związane z glukozą i lipidami (Trygstad i in., 1977). Jednakże, pacjenci mają trudność w stosowaniu się do ograniczeń w posiłkach z uwagi na ich apetyt. Leptyna wyraźnie zmniejszała przyjmowanie

PL 214 862 B1 pożywienia u tych pacjentów. U Pacjenta NIH-1 przeprowadzono ograniczone badanie w celu określenia wkładu obniżonego przyjmowania pożywienia na parametry metaboliczne. W szpitalu został poddany 9-dniowemu odstawieniu leptyny z ograniczeniem poboru kalorii na poziomie sprzed odstawienia. Pomimo, że był na niezmiennej diecie, jego insulina na czczo, stężenia triglicerydów i glukozy wzrosły w ciągu 48 godzin. Te obserwacje wskazują, że leptyna wpływa na wrażliwość na insulinę i metabolizm triglicerydów niezależnie od jej wpływów na przyjmowanie pożywienia. Zgłaszano podobne dane z zastosowaniem doświadczeń karmienia parami u myszy z lipoatrofią, z lub bez podawania leptyny (Shimomura i in., 1999; Ebihara i in., 2001).

Korelacja z modelami mysimi

Różne mysie modele lipoatrofii sugerowały, że brak tkanki tłuszczowej jest przyczyną oporności na insulinę w tym zespole (Burant i in., 1997; Moitra i in., 1998; Shimomura i in., 2000). Wykazanie, że transplantacja tkanki tłuszczowej myszom z lipoatrofią dramatycznie poprawia oporność na insulinę i poprawia kontrolę metaboliczną, silnie wspiera tę hipotezę (Gavrilova i in., 2000). Jednakże, pozostawało niejasne, dlaczego tkanka tłuszczowa jest wymagana do utrzymania wrażliwości całego organizmu na insulinę. Obserwacje i wyniki omówione powyżej, razem z Shimomura i in. powyżej, sugerują, że większość działania regulacyjnego tkanki tłuszczowej na wrażliwość całego organizmu na insulinę odbywa się poprzez leptynę.

Możliwy mechanizm regulacji przez leptynę zarówno wrażliwości na insulinę jak i metabolizmu lipidów może być oparty na SREBP1c, czynniku transkrypcji stymulującym lipogenezę. W wątrobie, SREBP1c podlega regulacji w górę przez hiperinsulinemię obserwowaną w lipoatrofii. Niedobór leptyny i hiperinsulinemia powodują regulację w dół substratu receptora insulinowego, IRS-2, upośledzając działanie insuliny i zwiększając wytwarzanie glukozy przez wątrobę. Zwiększona lipogeneza i wytwarzanie glukozy przez wątrobę tworzą błędne koło. Zwiększone poziomy lipidów w tkankach są związane z obniżoną wrażliwością całego organizmu na insulinę a więc większym wytwarzaniem glukozy przez wątrobę. Wykazano, że substytucja leptyny koryguje to błędne koło. Podczas gdy szybkość syntezy triglicerydów nie była badana u ludzi z lipoatrofią, pośrednie badania kalorymetryczne dostarczają pewnych dowodów, że lipogeneza może w rzeczywistości być rozregulowana (Arioglu i in., 2000). Inną obserwacją był spadek spoczynkowego zużycia energii u pacjentek leczonych w tym badaniu. Może być to spowodowane obniżonym przyjmowaniem pożywienia prowadzącym w efekcie do zmniejszonej termogenezy wywołanej dietą.

Leptyna: Hormon przeciw stłuszczeniu

Doniesiono, że podawanie leptyny u szczurów Zuckera prowadzi do korekcji stłuszczenia w rozmaitych narządach, które działają jako miejsca gromadzenia lipidów; takich jak komórki wysepek wątroby lub komórki serca (Unger, 1995; Unger i in., 1999). Nagromadzenie lipidów poza adipocytami może być zjawiskiem przepełnienia wynikającym z osiągnięcia przez adipocyty maksymalnej pojemności magazynowania triglicerydów. W lipodystrofii te narządy są jedynymi miejscami, które mogą magazynować lipidy. Leczenie leptyną u myszy z lipodystrofią powoduje dramatyczny spadek zapasów triglicerydów w wątrobie. Równolegle, leczenie leptyną u ludzi z lipodystrofią powoduje godne uwagi, bardzo istotne zmniejszenie objętości wątroby.

Wybór odpowiedniego momentu dla substytucji leptyny

Koncepcja, że tkanka tłuszczowa jest narządem wewnątrzwydzielniczym była silnie podparta odkryciem leptyny. Leptyna wpływa, zarówno bezpośrednio jak i/lub pośrednio, na kluczowe narządy metabolizmu, w tym mózg, wątrobę, mięśnie, tłuszcz i trzustkę. Leptyna na pewno nie jest jedynym krążącym sygnałem dla adipocytów. Innym hormonem adipocytów jest przykładowo specyficzne dla adipocytów białko związane z dopełniaczem (ang. adipocyte specific complement related protein, ACRP) 30/Adiponektyna/AdipoQ, które wydaje się być ważne w indukowaniu utleniania tłuszczu w mięśniach i wątrobie (Yamauchi i in., 2001; Fruebis i in., 2001; Berg i in., 2001). Wynikiem braku adipocytów powinien być niedobór wszystkich znanych i jeszcze nieodkrytych sygnałów pochodzących z tkanki tłuszczowej, przyczyniając się w ten sposób do wielu nieprawidłowości obserwowanych w zespołach cechujących się brakiem tkanki tłuszczowej. To badanie jest pierwszym badaniem na ludziach obserwującym skuteczność metaboliczną substytucji hormonu pochodzącego z tkanki tłuszczowej w stanie niedoboru tkanki tłuszczowej. Wydaje się, że niedobór leptyny jest głównym (lecz prawdopodobnie nie jedynym) czynnikiem przyczyniającym się do nieprawidłowości metabolicznych współistniejących z lipoatrofią. Jako takie, to badanie podkreśla ważną przyczynę rozważenia leczenia substytucyjnego leptyną u ludzi; mianowicie ciężką lipodystrofię.

P r z y k ł a d III

PL 214 862 B1

Sekwencję aminokwasów dla dojrzałej, rekombinowanej metionylowanej ludzkiej leptyny przedstawiono tu jako numer identyfikacyjny sekwencji 1, gdzie pierwszy aminokwas dojrzałego białka to walina (w pozycji 1) i reszta metionylowa znajduje się w pozycji-1 (tu nazwana rHu-Leptyna 1-146, numer identyfikacyjny sekwencji 1).

DLENL P W A S G Y S T E V Q L D L S

V P I T R I N D L D F I p A V Y Q Q

R D L L H

L E T L D

V A L S R

P G C

Q K V Q D

I S Η T Q

G L Η P I

I L T S M

V L A F S S L G G V L Q G S L

D T K T L S V S S K L T L S K, P s R Ν V

K S C H L L E A S G Q D M L W

I K T I V Q K V T G M D Q T L I Q I S N

Alternatywnie, można zastosować naturalny wariant ludzkiej leptyny, który ma 145 aminokwasów, i, w porównaniu z rHu-Leptyną 1-146, nie ma glutaminy w pozycji 28, przedstawiony poniżej (tu nazwany rHu-Leptyna 1-145, numer identyfikacyjny sekwencji 2, w którym puste miejsce („*) wskazuje brak aminokwasu).

v

P

I

Q

K

V

Q

D

»j*ł

K

L

I

K

T

I

V

T

R

I

N

D

I

s

H

T

*

S

V

S

s

K

Q

K

V

*3?

G

L

D

P

I

P

G

L

H

P

I

L

T

L

s

K

M

D

Q

T

Ł

A

V

Y

Q

I

I.

T

s

M

P

s

R

N

V

I

Q

I

s

N

d

L

E

N

L

R

D

Ii

L

H

V

L

A

F

s

c

H

P

W

A

S

G

L

E

T

L

D

s

L

G

V

L

B

A

s

O

Y

s

T

B

V

A

L

S

R

L

Q

G

S

L

Q

D

M

L

W

Q

L

D

L

S

P

G

C

Inne przykłady białka leptyny, preparatów, środków, kompozycji farmaceutycznych, dawek i metod podawania opisano uprzednio w następujących zgłoszeniach PCT: PCT numer międzynarodowej publikacji WO 96/05309; 96/40912; 97/06816; 00/20872; 97/18833; 97/38014; 98/08512; 98/28427.

Białka leptyny opisano także w następujących publikacjach; jednakże, nie przedstawiono żadnych danych na temat aktywności jakiejkolwiek opisanej kompozycji:

Opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 5521283; 5525705; 5532336; 5552522; 5552523; 5552524; 5554727; 5559208; 5563243; 5563244; 5563245; 5567678; 5567803; 5569743; 5569744; 5574133; 5580954; 5594101; 5594104; 5605886; 5614379; 5691309; 5719266 (Eli Lilly and Company);

PCT WO 96/23513; WO96/23514; WO96/23515; WO96/23516; WO96/23517; WO96/23518; WO9623519; WO96/34111; WO 96 37517; WO96/27385; WP 97/00886; EP 725078; EP 725079; EP 744408; EP 745610; EP 835879 (Eli liLLy and Company);

PCT WO96/22308 (Zymogenetics);

PCT WO96/31526 (Amylin Pharmaceuticals, Inc.)

PCT WO96/34885; WO 97/46585 (SmithKline Beecham, PLC);

PCT WO96/35787 (Chiron Corporation);

PCT WO97/16550 (Bristol-Myers Squibb);

PCT WO97/20933 (Shering Corporation)

EP 73 6599 (Takeda);

EP 741187 (F. Hoffman La Roche).

PL 214 862 B1

W zakresie, w jakim te odsyłacze literaturowe przedstawiają przydatne białka leptyny lub kompozycje lub metody pokrewne, takie kompozycje i/lub metody można stosować w połączeniu z niniejszymi sposobami. Z powyższymi zastrzeżeniami, publikacje te załącza się tu na zasadzie odsyłacza.

P r z y k ł a d IV

Według jednego rozwiązania w celu określenia poziomów leptyny w osoczu pacjentów z lipoatrofią można stosować standardowy test immunoenzymo-adsprpcyjny (ELISA). Metoda ELISA może wykorzystywać oczyszczone szczurze przeciwciało monoklonalne anty-rmetHu-Leptyna w celu wychwycenia leptyny z osocza. Do wykrywania wychwyconej leptyny można także stosować oczyszczone metodą powinowactwa królicze przeciwciało poliklonalne anty-rmetHu-leptyna sprzężone z peroksydazą chrzanową. Granica wykrywania w wymienionym teście z zastosowaniem tych przeciwciał może być w zakresie 0,5-0,8 ng/ml. Chociaż można stosować pewne przeciwciała, zalecane przeciwciała to te, które specyficznie reagują z natywną ludzką leptyną, i są na tyle wrażliwe aby wykrywać ilości leptyny równe lub mniejsze niż 5 ng/ml osocza.

Moment określania wyjściowych poziomów leptyny u pacjenta dogodnie występuje po 8-12-godzinnym poszczeniu, tak jak w godzinach porannych. Poziomów wyjściowych leptyny nie należy mylić z podwyższającymi się poziomami, jak po posiłku, lub spowodowanymi wzrostem poziomu leptyny w czasie snu obserwowanym u większości osób (np. wzrost poziomów leptyny o 3.00. rano). Takie poziomy wyjściowe można stosować, tak jak obserwacją nocnego wzrostu poziomów leptyny, ale te poziomy należy porównać z podobnymi poziomami u pacjentów w podobnej sytuacji.

Na podstawie powyższych danych, sposób określania predyspozycji pacjentów z lipoatrofią do leczenia leptyną można przeprowadzić metodą określania poziomu leptyny odpowiadającego stężeniu leptyny w osoczu i upewnienia się, że stężenie leptyny w osoczu wynosi około 4 ng/ml lub mniej.

Cytowane odsyłacze literaturowe

1. Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Lepold L., Friedman JM. Positional clinong of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 1994; 372:425-32.

2. Cosidine RV, Sinha MK, Heiman ML, i in. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med 1996; 334:292-5.

3. Ahima RS, Prabakaran D, Mantzoros C, i in. Role of leptin in the neuroendocrine response to fasting. Nature 1996: 382:250-2.

4. Montague CT, Farooqi IS, Whitehead JP, i in. Congenital leptin deficiency is associated with severe early onset obesity in humans. Nature 1997; 387:903-8.

5. Farooqi IS, Jebb SA, Langmack G. i in. Effects of recombinant leptin therapy in a child with congenital leptin deficiency. N Engl J Med 1999; 341:879-84.

6. Reitman ML, Arioglu E, Gavrilova O, Taylor SI. Lipoatrophy revisited. Trends Endoctrinol Metab. 2000; 11:410-6.

7. Lawrence RD. Lipodystrophy and hepatomegaly with diabetes, lipaemia, and other metabolic disturbances: a case throwing new light on the action of insulin. Lancet 1946; 1:724-731 i 773-775.

8. Magre J. Delepine M. Khallouf E, i in. Identification of the gene altered in Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy on chromosome 11q13. Nat Genet 2001; 28:365-70.

9. Gavrilova O, Marcus-Samuela B; Graham D, i in. Surgical implantation of adipose tissue reverses diabetes in lipoatrophic mice. J Clin Invest 2000; 105: 271-8.

10. Shimomura I, Hammer RE, Ikemoto S, Brown MS, Goldstein JL. c Leptin reverses insulin resistance and diabetes mellitus in mice with congenital lipodystrophy. Nature 1999; 401:73-6.

11. Peters AL, Schriger DL. The new diagnostic criteria for diabetes: the impact on management of diabetes and macrovascular risk factors. Am J Med 1998; 105:15s-19s.

12. Garg A, Fleckenstein JL, Peshock KM, Grundy SM. Peculiar distribution of adipose tissue in patients with congenital generalized lipodystrophy. J Clin Endocrinol Metab 1992; 75:358-61.

13. Garg A Peshock RM, Fleckenstein JL. Adopise tissue distribution pattern in patients with familiar partial lipodystrophy (Dunnigan variety). J Clin Endocrinol Metab 1999; 84:170-4.

14. Cao H, Hegele RA. Nuclear lamin A/C R482Q mutation in Canadian kindreds with Dunnigan-type familial partial lipodystrophy. Hum Mol Genent 2000; 9:109-12.

15. Harrision LC, Martin FI, Melick R4. Correlation between insulin receptor binding in isolated fat cells and insulin sensitivity in obese human subjects. J Clin Invest 1976; 58:1435-41.

16. Lambrinoudaki I, Georgiou E, Douskas G, Tsekes G, Kyriakidis M, Proukakis C. Body composition assesment by dual-energy x-ray absorptionmetry: comparison of prone and supine measurements. Metabolism 1998; 47:1379-82.

PL 214 862 B1

17. Abate N. Bums D, Peshock RM, Garg A, Grundy SM. Estimation of adipose tissue mass by magnetic resonance imaging: validation against dissection in human cadavers. J Lipid Res 1994; 35:1490-6.

18. Feskanich D, Rimm EB, Giovannucci EI, et a., Reproducibility and validity of food intake measurements from a semiquantitative food frequency questionnaire. J Am Diet Assoc 1993; 93:790-6.

19. Hahn G, Meeker W. Statistical Intervals: a guide to practitioners. New York: John Wiley and

Sons, 1991.

20. Manton ND, Lipsett J, Moore DJ, Davidson GP, Bourne AJ, Couper RT. Non-alcoholic steatohepatitis in children and adolescents, Med J Aust 2000; 173:476-9.

21. Berasain C. Betes M. Panizo A, et al. Patological and virological findings in patients with persistent hypertransaminasaemia of unknown etiology. Gut 2000:47:429-35.

22. Luyckx FH, Lefebvre PJ, Scheen AJ. Non-alcoholic steatohepatitis: association with obesity and insulin resistance, and influence of weight loss. Diabetes Metab 2000; 26:98-106.

23. Bolan C, Arioglu E, Gorden E, Taylor S, Lietman S. Intensive, long-term plasma exchange therapy for severe hypertriglyceridemia in acquired generalized lipoatrophy. J Clin Endocrin and Metab (w edycji).

24. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Gorup. Lancet 1998; 352:837-53 .

25. Kreisberg RA. Diabetic dyslipidemia. Am J Cardiol 1998; 82:67U-73U

26. Gotto AM, Jr. Triglyceride as a risk factor for coronary artery disease. Am J Cariol 1998; 82: 22Q25Q.

27. Garg A., Lipodystrophies, Am J Med 2000; 108:143-52.

28. Arioglu E, Duncan-Morin J, Sebring N, et al. Efficacy and safety of troglitazone in treatment of lipodystrophy syndromes. An Intern Med 2000; 133:263-74.

29. Trygstad O, Seip M. Oseid S. Lipodystrophic diabetes treated with fenfluramine. Int J Obes

1977:1:287-92.

30. Ebihara K, Ogawa Y, Masuzaki H, et al. Transgenic overexpression of leptin rescues insulin resistance and diabetes in a mouse model of lipoatrophic diabetes. Diabetes 2001; 50:1440-8.

31. Campfield LA, Smith FJ, Guisez Y, Devos R, Burn P. Recombinant mouse OB protein: evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks. Science 1995: 269:546-9.

32. Halaas JL. Gajiwala KS, Maffei M, et al. Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science 1995; 269:543-6.

33. Pelleymounter MA, Cullen JM, Baker MB, et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science 1995; 269:540-3.

34. Mantzoros CS, Flier JS. Editorial: leptin as a therapeutic agent - trials and tribulations. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85:4000-2.

35. Heymsfield SB, Greenberg AS, Fujioka K, et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial [patrz komentarze]. Jama 1999; 282:1568-75.

36. Burant CF, Sreenan S. Hirano K, et al. Troglitazone action is independent of adipose tissue.

J Clin Invest 1997; 100:2900-8.

37. Moitra J, Mason MM, Olive M, et al. Life without white fat: a transgenic mouse. Genes Dev

1998; 12:3168-81.

38. Shimomura 1, Hammer RE, Richardson JA, et al. Insulin resistance and diabetes in transgenic mice expressing nuclear SREBP-1c in adipose tissue: model for congenital generalized lipodystrophy. Genes Dev 1998; 12:3182-94.

39. Shimomura 1, Matsuda M. Hammer RE, Bashmakov Y, Brown MS, Goldstein JL. Decreased IRS-2 and increased SREBPlc lead to mixed insulin resistance and sensitivity in livers of lipodystrophic and ob/ob mice, Mol Cel 2000; 6:77-86.

40. Unger RH. Lipotoxicity in the patogenesis of obesity-dependent NIDDM, Genetic and cinical implications. Diabetes 1995; 44:863-70.

41. Unger RH, Zhou YT, Orci L. Regulation of fatty acids homeostasis in cells: novel role of leptin. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:2327-32.

42. Yamauchi T, Kamon J, Waki H, et al. The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity. Nat Med 2001; 7:941-6.

PL 214 862 B1

43. Fruebis J. Tsao TS, Javorschi S, et al. Proteolytic cleavage product of 30-kDa adipocyte complement-related protein increases fatty acids oxidation in muscle and causes weight loss in mice. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:2005-10.

44. Berg AH, Cumbs TP, Du X, Brownlee M, Scherer PE. The adipocyte-secreted protein Acrp30 enhances hepatic insulin action. Nat Med 2001; 7:947-53.

Lista, sekwencji <110> AMGEN, INC.

<120> Sposób in vitro do określania predyspozycji pacjenta ludzkiego z lipoatrofią do reagowania na leczenie białkiem leptyny, kompozycje farmaceutyczne do zastosowania do leczenia lipoatrofii i kompozycje farmaceutyczne zawierające białko leptyny <130> 54113.8005.WODO <140> jeszcze nieprzypisany <141> 2002-10-22 <150> opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 60/336394 <151>

2001-10-22 <160> 2 <170> Patentin wersja 3.1 <210> 1 <211> 146 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Rekombinowana leptyna ludzka 146 (rHu-Leptyna 1-146) <400> 1

Val

Pro

Tle

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

1

5

10

15

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

20

25

30

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

ile

35

40

45

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Tłu'

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Ile

50

55

6C

PL 214 862 B1

Leu

Thr

Ser Met

Pro

Ser Arg Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

65

70

75

80

Glu

Asn

Leu Arg

Asp

Leu Leu His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

85

90

95

His

Leu

Pro Trp

Ala

Ser Gly Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

100

105

110

Val

Leu

Glu Ala

Ser

Gly Tyr Ser

Thr

Glu

Val

Vał

Ala

Leu

Ser

Arg

115

120

12 5

Leu

Gin

Gly Ser

Leu

Gin Asp Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

130

135

140

Gly

Cys

145

<210>

2

<211>

145

<212>

PRT

<213>

Sekwencja sztuczna

<220>

<223> Rekombinowana leptyna ludzka 145 l	jrHu-Leptyna 1-145
<400> 2
Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr	Leu Ile Lys Thr
15 10	15
Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Ser	Val Ser Ser Lys
20 25	30
Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu	His Pro Ile Leu
35 40	45
Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr	Gin. Gin Ile Leu

55 60

PL 214 862 B1

Thr	Ser	Met	Pro	Ser Arg Asn Val	Ile Gin Ile	Ser	Asn	Asp	Leu	Glu
65				70	75					80
Asn	Leu	Arg	Asp	Leu Leu His Val	Leu Ala Phe	Ser	Lys	Ser	Cys	His
				85	90				95
Leu	Pro	Trp	Ala	Ser Gly Leu Glu	Thr Leu Asp	Ser	Leu	Gly	Gly	Val
			100		105			110
Leu	Glu	Ala	Ser	Gly Tyr Ser Thr	Glu Val Val	Ala	Leu	Ser	Arg	Leu
		115		120			125
Gin	Gly	Ser	Leu	Gin Asp Met Leu	Trp Gin Leu	Asp	Leu	Ser	Pro	Gly
	130			135		140
Cys
145
				Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób in vitro do określania predyspozycji pacjenta ludzkiego z lipoatrofią do reagowania na

Claims

1. Sposób in vitro do określania predyspozycji pacjenta ludzkiego z lipoatrofią do reagowania na leczenie białkiem leptyny, znamienny tym, że obejmuje etapy w których:

2. Sposób in vitro według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany pacjent jest mężczyzną a wspomniany poziom leptyny przed leczeniem jest niższy niż lub równy 2 ng/ml.

3. Sposób in vitro według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany pacjent jest kobietą.

4. Sposób in vitro według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że sposób ten obejmuje etapy, w których:

5. Sposób według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że wspomniany poziom leptyny określa się z użyciem testu immunologicznego z przeciwciałem.

6. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania do leczenia lipoatrofii u pacjenta ludzkiego, znamienna tym, że składa się z inhibitora proteazy i białka leptyny.

7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że wspomniane białko leptyny wybrane jest z grupy składającej się z dojrzałej rekombinowanej ludzkiej metionyloleptyny; sekwencji oznaczonych: NR ID. SEKW. :1 i NR ID. SEKW. :2.

PL 214 862 B1

8. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania do leczenia lipoatrofii u pacjenta ludzkiego, znamienna tym, że składa się z białka leptyny oraz co najmniej jednego związku wybranego z grupy składającej się z tiazolidynodionów, fibratów, statyn i metforminy.

9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że wspomniane białko leptyny wybrane jest z grupy składającej się z dojrzałej rekombinowanej ludzkiej metionyloleptyny; sekwencji oznaczonych: NR ID. SEKW. :1 i NR ID. SEKW. :2.

10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko leptyny do zastosowania do leczenia cukrzycy lub hipertriglicerydemii związanych z lipoatrofią u pacjenta ludzkiego.

11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że wspomniane białko leptyny wybrane jest z grupy składającej się z dojrzałej rekombinowanej ludzkiej metionyloleptyny; sekwencji oznaczonych: NR ID. SEKW. :1 i NR ID. SEKW. :2.

12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko leptyny do zastosowania do leczenia lipoatrofii nabytej u pacjenta ludzkiego.

13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że wspomniane białko leptyny wybrane jest z grupy składającej się z dojrzałej rekombinowanej ludzkiej metionyloleptyny; sekwencji oznaczonych: NR ID. SEKW. :1 i NR ID. SEKW. :2.

14. Kompozycja według zastrz. 12 albo 13, znamienna tym, że wspomnianym pacjentem ludzkim jest pacjent HIV-dodatni.

15. Kompozycja według jednego z zastrz. 12 do 14, znamienna tym, że postać nabyta lipoatrofii jest związana z leczeniem pacjenta HIV-dodatniego wysoce aktywnym leczeniem przeciwretrowiru-