PL212483B1 - Sposób wytwarzania czasteczek, czasteczki odpowiednie do dostarczania, pojemnik, urzadzenie do dostarczania czasteczek i zastosowanie tych czasteczek - Google Patents

Sposób wytwarzania czasteczek, czasteczki odpowiednie do dostarczania, pojemnik, urzadzenie do dostarczania czasteczek i zastosowanie tych czasteczek

Info

Publication number
PL212483B1
PL212483B1 PL375782A PL37578203A PL212483B1 PL 212483 B1 PL212483 B1 PL 212483B1 PL 375782 A PL375782 A PL 375782A PL 37578203 A PL37578203 A PL 37578203A PL 212483 B1 PL212483 B1 PL 212483B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
particles
nucleic acid
molecules
dna
trehalose
Prior art date
Application number
PL375782A
Other languages
English (en)
Other versions
PL375782A1 (pl
Inventor
Chris Robert Lively
Robert Delong
Original Assignee
Powderject Res Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32043345&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL212483(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Powderject Res Ltd filed Critical Powderject Res Ltd
Publication of PL375782A1 publication Critical patent/PL375782A1/pl
Publication of PL212483B1 publication Critical patent/PL212483B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C12N15/895—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection using biolistic methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A61K9/1676—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface having a drug-free core with discrete complete coating layer containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1611—Inorganic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis wynalazku
Dziedzina techniki
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania cząsteczek, cząsteczek odpowiednich do dostarczania, pojemnika, urządzenia do dostarczania cząsteczek i zastosowania tych cząsteczek. Wynalazek dotyczy zwłaszcza cząsteczek opłaszczonych kwasami nukleinowymi, które są wykorzystywane do bezigłowego dostarczania kwasów nukleinowych za pomocą tych cząsteczek. W szczególności, wynalazek dotyczy użycia tych cząsteczek do dostarczania cząsteczek kwasów nukleinowych do tkanek ssaczych in vivo i ex vivo.
Stan techniki
Terapia genowa i immunizacja kwasami nukleinowymi są obiecującymi technikami w leczeniu i zapobieganiu chorobom nabytym oraz wrodzonym. Techniki te zapewniają transfer pożądanego kwasu nukleinowego do osobnika z późniejszą jego ekspresją in vivo. Transfer może być dokonywany poprzez transfekcję komórek lub tkanek osobnika ex vivo i ponowne wprowadzenie stransformowanego materiału do gospodarza. Alternatywnie, kwas nukleinowy może być podawany in vivo bezpośrednio do odbiorcy. Jednakże, ten sposób dostarczania in vivo musi pozwalać na wejście kwasu nukleinowego do komórek odbiorcy w taki sposób, że kwas nukleinowy ulega ekspresji.
W tym kontekście rozwinięto szereg sposobów dostarczania genów. Spośród tych technik, transdermalne dostarczanie kwasów nukleinowych daje wiele korzyści w porównaniu do technik dostarczania doustnego lub pozajelitowego.
W szczególności, dostarczanie transdermalne stanowi bezpieczną, wygodną i nieinwazyjną opcję w stosunku do konwencjonalnych systemów podawania, co pozwala na uniknięcie głównych problemów związanych z dostarczaniem doustnym (np. zmieniające się rzędy absorpcji, degradacja i metabolizm w żołądku, efekt pierwszego przejścia przez wątrobę, uczulenie pokarmowe i/lub gorzki lub nieprzyjemny smak) lub z dostarczaniem pozajelitowym, (np. ból przy ukłuciu, ryzyko wprowadzenia infekcji do osób leczonych lub personelu medycznego spowodowanej przypadkowym ukłuciem i wyrzucaniem zużytych igieł).
Transdermalne dostarczanie kwasów nukleinowych również dostarcza szeregu problemów. Pasywne dostarczanie przez nienaruszoną skórę obejmuje transport cząsteczek przez szereg strukturalnie rożnych tkanek. Te mogą obejmować warstwę rogową (główna bariera), żywy naskórek, skórę właściwą lub ściany naczyń włosowatych. Systemy dostarczania transdermalnego muszą tym samym być zdolne do pokonania różnych przeszkód stawianych przez każdy typ tkanki.
Z tego powodu opracowano szereg alternatywnych sposobów pasywnego dostarczania transdermalnego. Obejmują one użycie czynników zwiększających penetrację skóry lub „wzmacniaczy przepuszczalności” celem zwiększenia przepuszczalności skóry, jak również sposoby nie chemiczne, takie jak jonoforeza, elektroporacja lub ultradźwięki. Tego rodzaju alternatywne techniki prowadzą jednak do szeregu efektów ubocznych, takich jak podrażnienie i uwrażliwienie skóry.
Ostatnio opracowano techniki trasdermalnego dostarczania kwasów nukleinowych oparte na cząsteczkach. Cząsteczki niosące pożądane kwasy nukleinowe są przyspieszane do dużej prędkości i wstrzeliwane do tkanki docelowej przy użyciu urządzenia przyspieszającego cząsteczki in vivo. Cząsteczki te mogą zostać wystrzelone bezpośrednio do komórek docelowych, unikając konieczności pobrania przez komórkę obcego kwasu nukleinowego.
Fachowcom znane są różne urządzenia służące do przyspieszania cząsteczek. Istniejące urządzenia wykorzystują wyładowanie eksplozyjne, elektryczne lub gazowe do przyspieszania opłaszczonych cząsteczek w kierunku komórek docelowych. Urządzenie Biolistic®, przykładowo, dostarcza mikroskopijnych kulek złota pokrytych DNA bezpośrednio do komórek naskórka (Yang i wsp., (1990) PNAS USA 87:9568-9572). Cząsteczki mogą być również dostarczane przy użyciu bezigłowej strzykawki takiej jak ta opisana w patencie USA nr 5630796 dla Bellhouse i wsp. (bezigłowa strzykawka PowderJect©).
Urządzenia wykorzystujące cząsteczki umożliwiają bezpieczne i łatwe dostarczanie kwasów nukleinowych. Jednak fizyczne cechy cząsteczek muszą zostać dopracowane tak, aby spełniały wymagania bezigłowego podawania, podczas którego cząsteczki są zazwyczaj wystrzeliwane przy bardzo dużej prędkości. Cząsteczki muszą wykazywać taką integralność strukturalną, aby przetrwały działanie, przykładowo, gazu ze strzykawki lub impetu balistycznego w zetknięciu ze skórą lub błonami śluzowymi. Ważne jest również, aby cząsteczki posiadały gęstość pozwalającą im na osiągnięcie wystarczającego momentu pędu, umożliwiającego penetrację tkanki. Jednakże przy dostarczaniu
PL 212 483 B1 kwasów nukleinowych, cząsteczki powinny mieć wielkość mniejszą od komórek tak, aby penetrowały błony komórkowe bez rozbijania tych komórek. Same kwasy nukleinowe są wrażliwe na degradację podczas przechowywania. Tym samym, po związaniu z cząsteczką kwasy nukleinowe muszą być przechowywane w stabilnych warunkach. Związanie kwasu nukleinowego z cząsteczką powinno również pozwalać na wydajną ekspresję kwasu nukleinowego po dostarczeniu do komórki docelowej. Jeśli kwas nukleinowy koduje antygen, sposoby wiązania powinny również zapewniać immunogenność antygenu w podmiocie.
Według jednej z technik, cząsteczki odpowiednie do podawania za pomocą cząsteczek mogą być utworzone poprzez pokrywanie cząsteczkami kwasu nukleinowego nośnikowych cząsteczek z obojętnego metalu. Cząsteczki nośnikowe są wybrane z materiałów o odpowiedniej gęstości i rozmiarze, takich jak złoto lub wolfram. Znanych jest szereg sposobów pokrywania lub precypitacji DNA lub RNA na cząsteczkach złota lub wolframu. Sposoby te ogólnie polegają na połączeniu określonej ilości złota lub wolframu z plazmidowym DNA, CaCl2 i spermidyną. Powstający roztwór jest w sposób ciągły mieszany podczas procedury pokrywania, tak, aby zapewnić jednorodność mieszaniny reakcyjnej. Po precypitacji kwasu nukleinowego, opłaszczone cząsteczki mogą być przenoszone do odpowiednich błon i pozostawiane do wyschnięcia, wykorzystywane do pokrycia powierzchni kasety lub modułu próbki bądź ładowane do kasety dostarczającej, wykorzystywanej w danym urządzeniu do podawania.
Podsumowanie wynalazku
Opracowano nowy preparat mający na celu optymalizację stabilności kwasu nukleinowego przyłączonego do cząsteczki nośnikowej, co umożliwia przedłużenie czasu przechowywania cząsteczek oraz zwiększa ilość nienaruszonego kwasu nukleinowego dostarczanego do tkanek, jak również ekspresję i fizjologiczną aktywność kwasu nukleinowego dostarczonego do tkanek docelowych. W szczególności, stwierdzono, że kwasy nukleinowe mogą być stabilnie przyłączone do cząsteczek nośników z obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwas nukleinowy oraz czynnika chelatującego jony metali.
Kwasy nukleinowe mogą tym samym, zostać precypitowane na cząsteczki nośnika przy pH raczej obojętnym, niżeli alkalicznym, co pozwala na zachowanie integralności kwasu nukleinowego. Co więcej, cząsteczki mogą zostać następnie przepłukane w roztworach wodnych lub alkoholowych, bez utraty kwasu nukleinowego, ułatwiając inkorporację czynników zwiększających stabilność. Kondensacja kwasu nukleinowego, wraz z chemicznym działaniem czynnika chelatującego chroni kwas nukleinowy przed zniszczeniem fizycznym i chemicznym, przykładowo przed utlenieniem przez wolne rodniki lub strawieniem przez endonukleazy. Cząsteczki według wynalazku mogą być dostarczane do komórek dzięki efektywnemu dostarczaniu cząsteczek. Pomimo stabilności opłaszczonych cząsteczek kwasu nukleinowego, wykazano, że istnieje wydajna ekspresja kwasu nukleinowego w komórkach docelowych. Co więcej, wykazano immunogenność antygenów kodowanych przez kwasy nukleinowe.
Odpowiednio zatem przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cząsteczek odpowiednich do dostarczania przez urządzenie, do dostarczania cząsteczek, polegający na tym, że:
(i) dokonuje się precypitacji kwasu nukleinowego na cząsteczkach nośnikowych z obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwasy nukleinowe i czynnika chelatującego jony metali, przy czym wspomniany czynnik kondensujący kwasy nukleinowe jest homopolimerem argininy o wzorze (Arg)x gdzie x posiada wartość od 2 do 10, lub jego fizjologicznie akceptowalną solą; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
Korzystnie na etapie (i) sposobu, czynnik kondensujący kwas nukleinowy jest dodawany do mieszaniny, zawierającej cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu oraz kwas nukleinowy.
Również korzystnie cząsteczki nośnika z obojętnego metalu wybiera się z grupy składającej się z cząsteczek złota, wolframu, platyny i irydu.
Bardziej korzystnie cząsteczki nośnika z obojętnego metalu są cząsteczkami złota o średnicy od 1 do 3 μm.
W innym korzystnym wykonaniu sposobu, kwas nukleinowy koduje antygen, który w bardziej korzystnym rozwiązaniu jest wybrany z grupy składającej się z antygenów wirusowych, bakteryjnych i grzybowych. Także korzystnie kwas nukleinowy koduje polipeptyd terapeutyczny.
Korzystnie kwasem nukleinowym jest DNA.
W następnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku homopolimerem argininy jest (Arg)4 lub (Arg)6.
PL 212 483 B1
W sposobie według wynalazku korzystnie, czynnik chelatujący jony metali jest wybrany z grupy składającej się z kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), kwasu dietylenoetriamino pentaoctowego (DTPA), kwasu nitrilotrójoctowego (NTA), heksafosforanu inozytolu, tripolifosforanu, kwasu polifosforowego, bursztynianu sodu, bursztynianu potasu, bursztynianu litu, maleinianu sodu, maleinianu potasu, maleinianu litu, desferalu kwasu etylenodiammo-di-(o-hydroksyfenylooctowego) (EDDHA).
W sposobie według wynalazku etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednego lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
Bardziej korzystnie jeden lub więcej cukrów jest wybranych z grupy składającej się z trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy.
Bardziej korzystnie jeden lub więcej cukrów jest mieszaniną sacharozy i rafinozy.
W sposobie według wynalazku etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednej lub więcej soli. Korzystnie jedną lub więcej soli wybiera się z octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu i chlorku magnezu.
W korzystnym wykonaniu sposobu, według wynalazku otrzymywane podczas etapu (i) cząsteczki są doprowadzane do kontaktu z przeciwutleniaczami, przeciwutleniacz bardziej korzystnie jest wybrany z etanolu, witaminy A, witaminy C i witaminy E.
W sposobie według wynalazku, korzystnie (i) dokonuje się precypitacji DNA na obojętnych cząsteczkach złota w obecności wspomnianego homopolimeru argininy lub jego soli, EDTA oraz sacharozy; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
Bardziej korzystnie homopolimerem argininy jest (Arg)4, wspomnianym czynnikiem chelatującym jony metali jest kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), wspomnianym cukrem jest trehaloza.
Przedmiotem wynalazku są także cząsteczki odpowiednie do dostarczania za pomocą urządzenia dostarczającego cząsteczki, które to cząsteczki otrzymywane są sposobem jak zdefiniowano powyżej.
Przedmiotem wynalazku są także cząsteczki, odpowiednie do dostarczania przez urządzenie do dostarczania cząsteczek, które obejmują cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu mające na swojej powierzchni kwas nukleinowy, homopolimer argininy o wzorze (Arg)x, gdzie x posiada wartość od 2 do 10 lub jego fizjologicznie akceptowalną sól i czynnik chelatujący jony metali.
Korzystnie, cząsteczki według wynalazku zawierają cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu, mające na swojej powierzchni jeden lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
W bardziej korzystnej postaci wynalazku wspomnianym cukrem jest trehaloza.
Cząsteczki według wynalazku charakteryzują się ponadto tym, że cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu posiadają ponadto na swojej powierzchni jedną lub więcej soli.
Przedmiotem wynalazku jest także pojemnik na dawkę dla urządzenia do dostarczania cząsteczek, przy czym pojemnik zawiera cząsteczki, jak zdefiniowano powyżej.
Wynalazkiem jest także urządzenie do dostarczania cząsteczek, załadowane cząsteczkami, jak zdefiniowano powyżej.
Korzystnie, urządzenie do dostarczania cząsteczek stanowi bezigłowa strzykawka.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczek jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania urządzenie do dostarczania cząsteczek dla dostarczania tych cząsteczek osobnikowi.
Szczegółowy opis korzystnych wykonań
Praktyczna część niniejszego wynalazku obejmuje, o ile nie zaznaczono inaczej, wykorzystanie konwencjonalnych metod wirusologicznych, mikrobiologicznych, metod biologii molekularnej, technik rekombinowanego DNA oraz technik immunologicznych, znanych fachowcom. Tego rodzaju techniki są wyjaśnione w dostępnej literaturze. Patrz, np., Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (wyd. drugie, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, tom I i II (ed. D. Glover); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, wyd. 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); oraz Fundamental Virology, wyd. drugie, tom I i II (ed. B.N. Fields i D.M. Knipe).
Jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie użyte w niniejszym, opisie terminy techniczne i naukowe, mają to samo znaczenie, co terminy powszechnie stosowane przez fachowców.
PL 212 483 B1
A. Definicje
Opisując niniejszy wynalazek, zastosowane zostaną następujące terminy, które zostaną zdefiniowane poniżej.
Stosowane niniejszym zamiennie terminy „cząsteczka kwasu nukleinowego” i „polinukleotyd” odnoszą się do polimerycznych form nukleotydów o każdej długości, rybonukleotydów lub deoksyrybonukleotydów lub ich analogów. Polinukleotydy, mogą przyjąć każdą strukturę trzeciorzędową oraz mogą pełnić jakąkolwiek funkcję, znaną lub nieznaną. Nieograniczające przykłady polinukleotydów obejmują gen, fragment genu, eksony, introny, informacyjny RNA (mRNA), transportujący RNA (tRNA), rybosomalny RNA, rybozymy, cDNA, rekombinowane polinukleotydy, rozgałęzione polinukleotydy, plazmidy, wektory, izolowane DNA o każdej sekwencji, izolowane RNA o każdej sekwencji, sondy kwasów nukleinowych lub starterów.
Polinukleotyd, zazwyczaj składa się ze specyficznej sekwencji czterech zasad azotowych: adeniny (A); cytozyny (C); guaniny (G) oraz tymidyny (T) (uracylu (U) dla tymidyny, jeśli polinukleotyd stanowi RNA). Tymi samym, termin sekwencja kwasu nukleinowego stanowi alfabetyczną reprezentację cząsteczki polinukleotydu. Tego rodzaju alfabetyczna reprezentacja może być wprowadzona do komputerowej bazy danych posiadającej centralną jednostkę procesorową, wykorzystywanej do zastosowań bioinformatycznych, takich jak poszukiwanie homologii i genomika funkcjonalna.
Sekwencja kwasu nukleinowego, która „koduje” wybrany antygen stanowi cząsteczkę kwasu nukleinowego, ulegającego transkrypcji (w przypadku DNA) oraz translacji (w przypadku mRNA) in vivo do polipeptydu, po umieszczeniu pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulatorowych. Granice sekwencji kodującej są określane przez kodon start na 5' końcu (N-końcu) oraz kodon stop translacji na 3' końcu (C-końcu). Dla celów wynalazku, tego rodzaju sekwencje kwasów nukleinowych mogą obejmować, cDNA z wirusowego, prokariotycznego lub eukariotycznego mRNA, sekwencje genomowe z wirusowego lub prokariotycznego DNA lub RNA, a nawet syntetycze sekwencje DNA. Sekwencja terminacji transkrypcji może być zlokalizowana 3' w stosunku do sekwencji kodującej.
„Wektor” jest zdolny do transferu sekwencji kwasu nukleinowego do komórek docelowych (np. wektory wirusowe, wektory nie-wirusowe, poszczególne nośniki i liposom). Zazwyczaj, „konstrukt wektorowy”, „wektor ekspresyjny” i „wektor do transferu genów” oznacza jakikolwiek konstrukt kwasu nukleinowego zdolny do kierowania ekspresją pożądanego genu oraz, który może przekazywać sekwencje genów do komórek docelowych. Tym samym, termin ten obejmuje klonowanie i nośniki ekspresji. „Plazmid” stanowi wektor w postaci pozachromosomalnego elementu genetycznego.
„Promotor” stanowi sekwencję nukleotydową, która inicjuje i reguluje transkrypcję polinukleotydu. Promotory mogą obejmować promotory indukowalne (w których ekspresja sekwencji polinukleotydu operacyjnie połączonego z promotorem jest indukowana przez analit, kofaktor, białko regulatorów itp.), promotory, ulegające represji (w których ekspresja sekwencji polinukleotydu operacyjnie połączonego z promotorem jest hamowana przez analit, kofaktor, białko regulatorowe itp.) oraz promotory konstytutywne. Zakłada się, że termin „promotor” lub „element kontrolny” obejmuje region pełnej długości promotora oraz segmenty funkcjonalne tych regionów (np. kontrolujące translację i transkrypcję).
„Operacyjnie połączony” odnosi się do takiego ułożenia elementów, w którym składniki te są skonfigurowane tak, aby spełniały swoje zwykłe funkcje. Tym samym, dany promotor operacyjny połączony z sekwencją kwasu nukleinowego jest zdolny do wpływania na ekspresję tej sekwencji, jeśli obecne są odpowiednie enzymy. Promotor nie musi sąsiadować z sekwencją tak długo, jak długo kieruje jego ekspresją. Tym samym, przykładowo, przeplatanie się sekwencji jeszcze bez translacji, ale już po transkrypcji może zachodzić pomiędzy sekwencją promotora a sekwencją kwasu nukleinowego, i sekwencja promotora może być ciągle uważana za „operacyjnie połączoną” z sekwencją kodującą.
„Rekombinowany”, jak użyto w niniejszym. opisie, opisuje cząsteczkę kwasu nukleinowego (polinukleotydu) pochodzenia genomowego, cDNA, semisyntetycznego lub syntetycznego, która na wskutek pochodzenia lub manipulacji nie jest związana z całością lub częścią polinukleotydu, z którym pozostaje związana w naturze i/lub jest połączona z polinukleotydem innym, niż ten występujący w naturze. Dwie sekwencje kwasów nukleinowych, które są zawarte w pojedynczej cząsteczce rekombinowanego kwasu nukleinowego są „heterologiczne” w stosunku do siebie, jeśli w naturze nie pozostają ze sobą związane.
„Polipeptyd” jest stosowany w najszerszym znaczeniu w odniesieniu do związku dwóch lub więcej podjednostek aminokwasów, analogów aminokwasów lub innych peptydomimetyków. Podjednostki mogą być podłączone wiązaniami peptydowymi lub innymi wiązaniami, przykładowo, estrowymi,
PL 212 483 B1 eterowymi itp. Jak zastosowano w niniejszym opisie, termin „aminokwas odnosi się do naturalnych i/lub nienaturalnych lub syntetycznych aminokwasów, w tym glicyny, zarówno izomerów optycznych D, jak i L oraz analogów aminokwasów i peptydomimetyków. Peptyd składający się z trzech lub więcej aminokwasów jest zwyczajowo nazywany oligopeptydem, jeśli łańcuch peptydowy jest krótki. Jeśli łańcuch peptydowy jest długi, peptyd zwyczajowo nazywa się polipeptydem lub białkiem.
„Antygen” odnosi się do jakiegokolwiek czynnika, ogólnie makrocząsteczki, która może wzbudzać odpowiedź immunologiczną u osobnika. Termin może być stosowany w odniesieniu do pojedynczej makromoIekuły lub homogennej, bądź heterogennej populacji makrocząsteczek antygenów. Jak niniejszym zastosowano, „antygen” ogólnie odnosi się do cząsteczki białka lub jego części, zawierającej jeden lub więcej epitopów. Dla celów niniejszego wynalazku, antygeny mogą być otrzymane 1Ub mogą pochodzić z każdego odpowiedniego źródła. Co więcej, dla celów niniejszego wynalazku, „antygen” obejmuje białko z modyfikacjami, takimi jak delecje, addycje i substytucje (ogólnie o charakterze konserwatywnym) w stosunku do sekwencji natywnej, tak długo, jak długo białko zachowuje wystarczającą immiunogenność. Modyfikacje te mogą być celowe, przykładowo na drodze ukierunkowanej mutagenezy lub mogą być przypadkowe, takie jak mutacje gospodarza produkującego antygen.
„Odpowiedź immunologiczna” przeciwko pożądanemu antygenowi stanowi rozwój w osobniku odpowiedzi komórkowej i/lub humoralnej na dany antygen. Dla celów niniejszego wynalazku, „immunologiczna odpowiedź humoralna, stanowi odpowiedź indukowaną przez limfocyty oraz/lub inne leukocyty krwi.
Termin „immunizacja kwasem nukleinowym” odnosi się w niniejszym opisie do wprowadzania cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej jeden lub więcej wybranych antygenów do komórki gospodarza, celem ekspresji antygenu lub antygenów in vivo. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być wprowadzana bezpośrednio do osobnika docelowego za pośrednictwem transdermalnego dostarczania cząsteczek. Alternatywnie, cząsteczka może zostać wprowadzona ex vivo do komórek, które usunięto z danego osobnika. W tym ostatnim przypadku, komórki zawierające pożądaną cząsteczkę kwasu nukleinowego mogą zostać ponownie wprowadzone do osobnika w taki sposób, aby doszło do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenowi kodowanemu przez cząsteczkę kwasu nukleinowego. Cząsteczki kwasu nukleinowego stosowane w takiej immunizacji są tutaj ogólnie określane jako „szczepionki z kwasów nukleinowych”.
Termin „dostarczanie trasdermalne” oznacza podawanie śródskórne (np. do skóry właściwej lub naskórka), przezskórne (np. przez nienaruszoną skórę) oraz podawanie przez błony śluzowe, tj. dostarczanie poprzez przemieszczanie czynnika do lub przez skórę lub błonę śluzową. Patrz, np., Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft i Guy (ed.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson i Lee (ed.). Marcel Dekker me., (1987); oraz Transdermal Delivery of Drugs, tomy 1-3, Kydonieus i Berner (ed.), CRC Press, (1987). Tym samymi, termin obejmuje dostarczanie za pomocą bezigłowej strzykawki, jak opisano w patencie USA nr 5360796, jak również za pomocą dostarczania przy użyciu cząsteczek, jak opisano w US. Patent nr 5865796.
„Bezigłowa strzykawka” oznacza urządzenie dostarczające dany preparat transdermalnie bez pomocy konwencjonalnej igły przebijającej skórę. Bezigłowe strzykawki stosowane w niniejszym wynalazku są opisane w niniejszymi dokumencie.
Terminy „jednostka” i „osobnik” są w niniejszym opisie stosowane zamiennie w odniesieniu do jakiegokolwiek przedstawiciela podkrólestwa strunowców, w tym do ludzi i innych naczelnych takich jak szympansy i inne gatunki małp i małpiatek, zwierząt gospodarskich takich jak bydło, owce, świnie, kozy i konie, zwierząt domowych takich jak koty i psy, zwierząt laboratoryjnych, w tym gryzoni takich jak myszy, szczury, świnki morskie, ptaków w tym domowych, dzikich i łownych takich jak kurczaki, indyczki oraz inne kurowate, kaczki, gęsi, i inne. Termin ten nie podaje określonego wieku. Tym samym, obejmuje zarówno osobniki dorosłe, jak i nowonarodzone.
Opisane sposoby mogą być stosowane dla każdego z powyższych gatunków kręgowców, ponieważ systemy immunologiczne wszystkich tych kręgowców pracują podobnie.
B. Metody ogólne
Wynalazek opisuje dostarczanie kwasów nukleinowych za pomocą cząsteczek. W szczególności, wynalazek dotyczy cząsteczek, które są odpowiednie do dostarczania z urządzenia podającego cząsteczki, oraz cząsteczek, które są otrzymywane w sposobie obejmującymi, lub w niektórych wykonaniach składającym się zasadniczo z nakładania kwasu nukleinowego na cząsteczki metalu obojętnego w obecności czynnika kondensującego kwas nukleinowy oraz czynnika chelatującego jony metali.
PL 212 483 B1
Cząsteczki nośnikowe są wybrane spośród metali o odpowiedniej gęstości i odpowiedniej wielkości cząsteczek do podawania wewnątrzkomórkowego za pomocą urządzenia podającego cząsteczki. Korzystnie, gęstość cząsteczek wynosi przykładowo od około 15 do 25g/ml, od około 15 do 23 g/ml lub od około 16 do 20 g/ml. Cząsteczki nośnika mają średnicę od około 0,5 do 10 μm, przykładowo od około 1 do 5 μm. Szczególnie korzystnym jest, aby cząsteczki nośnika miały średnicę od około 0,5 do 3 μm, np. od około 1 do 3 μm lub od 0,5 do 2 μm.
Cząsteczki nośnika metalowego są obojętne chemicznie, to znaczy są nie reaktywne w komórkach ex vivo lub w ciele osobnika, do którego cząsteczki są podawane. Typowo, stosowane są cząsteczki nośnika ze złota, wolframu, platyny lub irydu. Korzystne są cząsteczki złota lub wolframu. Cząsteczki złota mogą stanowić cząsteczki złota koloidalnego. Cząsteczki złota zapewniają jednakową wielkość (dostępne w Alpha Chemicals w postaci cząsteczek o wielkości 1 do 3 μm, lub w Degusssa, South Plainfield, NJ w zakresie cząsteczek obejmującym 0,95 μm) i zredukowaną toksyczność. Złoto mikrokrystaliczne (np. złoty proszek A1570, dostępny w Engelhard Corp., East Newark, NJ) zapewnia zróżnicowaną dystrybucję wielkości cząsteczek, zazwyczaj w zakresie od około 0,1 do 5 μm. Jednakże nieregularna powierzchnia złota mikrokrystalicznego zapewnia wysoce wydajne pokrycie przez kwasy nukleinowe. Cząsteczki wolframu są łatwo dostępne w rozmiarach średnio około 0,5 do 2 μm średnicy.
Zazwyczaj, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera terapeutycznie właściwą sekwencję nukleotydową, dostarczaną do osobnika. Korzystnym jest, aby niniejsze cząsteczki były odpowiednie do stosowania w terapii immunizacji kwasem nukleinowym lub do terapii genowej. Kwas nukleinowy może tym samym zawierać sekwencję zdolną do zapewniania immunizacji, przykładowo sekwencję immunogenną wzbudzającą komórkową i/Iub humoralną odpowiedź immunologiczną, po dostarczeniu do osobnika. AIternatywnie, kwas nukleinowy może zawierać jeden lub więcej genów kodujących terapeutyczny polipeptyd, np. białko defektywne lub którego brak w docelowym genomie bądź nienatywne białko wykazujące pożądane działanie biologiczne lub terapeutyczne (np., funkcję przeciwwirusową). Kwas nukleinowy może zawierać sekwencję kodującą cząsteczkę posiadającą funkcje antysensowe lub rybozymowe. Do leczenia chorób genetycznych, podmiotowi mogą być podawane funkcjonalne geny odpowiadające genom, o którym wiadomo, że ich brak stanowi o danej chorobie.
Korzystnie, kwasem nukleinowym jest DNA.
Kwasy nukleinowe odpowiednie do podawania obejmują kwasy nukleinowe stosowane do leczenia chorób zapalnych, chorób autoimmunologicznych, przewlekłych i zakaźnych, w tym chorób takich jak AIDS, nowotwory, choroby neurologiczne, naczyniowe, hipercholesterolemia, różne choroby krwi w tym różne anemie, talasemie i hemofilie, defekty genetyczne takie jak mukowiscydoza, choroba Gauchera, niedobór deaminazy adenozyny (ADA), odma, itp. Fachowcom znanych jest szereg antysensownych oligonukleotydów (np. krótkich oligonukleotydów komplementarnych do sekwencji w pobliżu miejsca inicjacji translacji (kodon AUG) mRNA), użytecznych w terapii antysensem chorób nowotworowych i wirusowych. Patrz, np. Han i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88,4313; Uhlmann i wsp. (1990) Chem. Rev. 90:543, Helene i wsp. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049:99: Agarwal i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079; oraz Heikkila i wsp. (1987) Nature 328:445. Opisano również szereg rybozymów, odpowiednich do zastosowania. Patrz, np. Chec i wsp. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17479 oraz patent U.S. nr 5.225.347 dla Goldberg i wsp.
Przykładowo, w sposobach leczenia guzów litych, geny kodujące peptydy toksyczne (tj. czynniki chemioterapeutyczne takie jak rycyna, toksyna tężca i czynnik jadu kobry), geny supresorowe nowotworów takie jak p53, geny kodujące sekwencje mRNA, które są antysensowne w stosunku do transformujących onkogenów, peptydy antyneoplastyczne, takie jak czynnik martwicy nowotworów (TNF) oraz inne cytokiny lub transdominujące mutanty negatywne dla onkogenów transformujących, mogą być dostarczane w celu ekspresji w miejscu lub w pobliżu nowotworu.
Podobnie, poddawane mogą być również kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy, o których wiadomo, że wykazują aktywność przeciwwirusową i/lub przeciwbakteryjną lub stymulujące układ immunologiczny gospodarza. Kwas nukleinowy może kodować jedną z szeregu cytokin (lub ich fragmentów funkcjonalnych), takich jak interleukiny, interferony i czynniki stymulujące wzrost kolonii. Kwas nukleinowy może kodować antygen do leczenia lub zapobiegania szeregu schorzeń, obejmujących nowotwory, alergie, toksyczności i zakażenia patogenami takimi jak: grzyby, wirusy, w tym ludzkie wirusy brodawczaków (HPV), HIV, HSV2/HSV1, wirus grypy (typ A, B i C), poliowirus, rinowirusy, wirus RS, rotawirusy, wirus zapalenia wątroby typu A, grupa wirusów Norwalk, enterowirusy, astrowirusy, wirus odry, wirus parainfluenzy, wirus świnki, wirus ospy wietrznej, cytomegalowirus,
PL 212 483 B1 wirus Epsteina Barr, adenowirusy, wirus różyczki, ludzki wirus T-Iimfotypowy typu I (HTLV-I), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus zapalenia wątroby typu D, pokswirus, wirusy Marburg i Ebola; bakterie w tym M. tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera, Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscelia tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (typy A i B), Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (typ b), Toxoplama gondii, Campylobacteriosis, Moraxella eatarrhalis, Donovanosis, i Actinomycosis; patogenów grzybiczych w tym Candidiasis i Aspergillosis, patogenów pasożytniczych w tym tasiemce, przywry, glisty, ameby, giardie, cryptosporidia, schistosomy, Pneumoeystis carinii, rzęsistkownica i włośnica. Kwas nukleinowy może być również wykorzystywany do zapewniania właściwej odpowiedzi immunologicznej w szeregu chorób weterynaryjnych, takich jak pryszczyca, zakażenia koronawirusami, Pasteurella multocida, Helicobaeter, Strongylus vulgaris, Actinobaeillus pleuropneumonia, wirus biegunki bydła (BVDV), Klebsiella pneumoniae, E. Coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis oraz Bordetella broehiseptica. Tym samym, w jednym aspekcie, cząsteczki według niniejszego wynalazku mogą mieć zastosowanie, jako szczepionka.
Wynalazek znajduje również zastosowanie w terapii antysensowej, np. do dostarczania oligonukleotydów zdolnych do hybrydyzacji ze specyficznymi sekwencjami komplementarnymi, co powoduje zahamowanie transkrypcji i/lub translacji tych sekwencji. Tym, samym, celem może być DNA lub RNA kodujące białka niezbędne dla postępu danej choroby, przez co przerwaniu ulega postęp choroby. Terapia antysenesem oraz liczne oligonukleotydy zdolne do specyficznego i przewidywalnego wiązania do określonych docelowych sekwencji kwasu nukleinowego i zahamowania lub modulacji ekspresji genów wywołujących choroby są znane fachowcom. Uhlmann i wsp. (1990) Chem Rev. 90; 543, Neckers i wsp (1992) Int. Rev. Oncogenesis 3, 175; Simons i wsp. (1992) Naturę 359, 67; Bayever i wsp. (1992) Antisense Res. Dev. 2: 109; Whitesell i wsp. (1991) Antisense Res. Dev. 1:. 343; Cook i wsp. (1991) Anti-cancer Drug Design 6: 585; Eguchi i wsp. (1991) Ann. Rev. Biochem. 60: 631. Odpowiednio, niniejszym dostarczono antysensownych oligonukleotydów zdolnych do selektywnego wiązania się do sekwencji docelowych w komórkach gospodarza, stosowanych jako terapeutyki antysensowne.
Zazwyczaj, kwas nukleinowy jest dostarczony, jako wektor ekspresyjny. Tego rodzaju wektory ekspresyjne mogą być rutynowo konstruowane przy użyciu technik biologii molekularnej i mogą przykładowo obejmować użycie plazmidowego DNA i odpowiednich inicjatorów, promotorów, wzmacniaczy i innych elementów, takich jak przykładowo, sygnały poliadenylacji, które mogą się okazać niezbędne oraz, które są umieszczone w odpowiedniej orientacji w celu umożliwienia ekspresji wstawianej sekwencji. Dla fachowców odpowiednie wektory będą oczywiste. Na drodze dalszego przykładu, niniejszym podane zostaje odniesienie do Sambrook i wsp. (1989).
Odpowiedni wektor ekspresyjny zawiera polinukleotyd do stosowania w niniejszym wynalazku, operacyjnie połączony z sekwencją kontrolną, zazwyczaj promotorem, która zdolna jest do zapewniania ekspresji polinukleotydu w komórce gospodarza. Korzystnie, wektor jest odpowiedni do użycia w metodzie terapii genowej lub do immunizacji kwasem nukleinowym. Wektor może zostać użyty ex vivo, przykładowo do transformacji komórki gospodarza, która następnie jest ponownie wprowadzana do podmiotu. Alternatywnie, wektor ten może zostać użyty in vivo do kierowania dostarczaniem do podmiotu.
Wektor jest zazwyczaj plazmidem posiadającym miejsce inicjacji replikacji, promotor do ekspresji polinukleotydu, i ewentualnie, regulator promotora. Wektory mogą zawierać jeden lub więcej genów dla markerów selekcyjnych, przykładowo gen odporności na ampicylinę.
Promotory i inne sygnały regulacji ekspresji są wybrane tak, aby były kompatybilne z przeznaczonymi do ekspresji komórkami gospodarza. Mogą zostać zastosowane promotory indukowalne, represyjne lub kontrolowane w inny sposób. Do ekspresji w komórkach lub organizmach ssaków, zastosowane mogą zostać elementy kontrolne zarówno eukariotyczne, jak i fagowe.
Odpowiednie promotory ssacze obejmują promotor metalotioneiny, który może być indukowany w odpowiedzi na metale ciężkie, takie jak kadm oraz promotory β-aktyny. Szczególnie korzystne są promotory tkankowo-specyficzne. Odpowiednie wektory wirusowe obejmują, przykładowo, długie powtórzenia wirusa mysiej białaczki Moloneya (MMLV LTR), promotor wirusa sarkomy Rousa (RSV)LTR, promotor SV40, geny wczesne ulegające natychmiastowej ekspresji (IE) promotor ludzkiego cytomegalowirusa (hCMV), promotory adenowirusów, HSV (takie jak promotory HSV IE) lub promotory HPV, w szczególności region regulatorowy upstream HPV (URR).
PL 212 483 B1
Wszystkie te promotory są z łatwością dostępne fachowcom.
Zazwyczaj, obecne są również sekwencje teminacji i poliadenyacji, zlokalizowane 3' w stosunku do każdego kodonu stop translacji.
Korzystnie, obecna jest również sekwencja do optymalizacji inicjacji translacji zlokalizowana 5' w stosunku do każdej sekwencji kodującej. Przykłady sygnałów terminacji transkrypcji/poliadenylacji obejmują sygnały otrzymane od SV40, jak opisano w Sambrook i wsp., jak również sekwencję terminatora bydlęcego czynnika wzrostu. W celu zwiększenia poziomów ekspresji dołączone mogą zostać elementy wzmacniające. Przykłady odpowiednich wzmacniaczy obejmują wzmacniacz wczesnego genu SV40 ((Dijkema i wsp. (1985) EMBOJ. 4:761), wzmacniacz/promotor otrzymany z długich końcowych powtórzeń wirusa sarkomy Rousa (LTR) (Gorman i wsp. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 6777) oraz elementy otrzymane z ludzkiego lub mysiego CMV (Boshart i wsp. (1985) Cell 41:521) przykładowo, elementy zawarte w sekwencji intronu A CMV.
Czynniki kondensujące kwasy nukleinowe stosowane w wynalazku oddziałują z kwasem nukleinowym, w taki sposób, że kwas nukleinowy kondensuje się, do bardziej zwartej struktury. Skondensowany kwas nukleinowy jest zazwyczaj bardziej stabilny niż forma nieskondensowana i zazwyczaj ma bardziej złożoną strukturę, przykładowo, kształt pierścieniowaty lub pałeczkowaty. Czynniki kondensujące są zazwyczaj podstawowymi cząsteczkami, które oddziałują elektrostatycznie z kwasem nukleinowym, przeciwdziałając ładunkowi ujemnemu kwasu nukleinowego.
Wykazano, przykładowo, że aby zaszła wydajna kondensacja, wymagane jest zneutralizowanie 88-90% ładunku (Deng H. i V.A. Bloomfield (1999) Biophys J 77:1556-61). Zazwyczaj, czynnik kondensujący wiąże się z kwasem nukleinowym z relatywnie wysoką wydajnością.
Użyty może zostać każdy odpowiedni czynnik kondensujący kwasy nukleinowe, w tym polimery kationowe i kationy poliwalencyjne. W jednym z wykonań, czynnik kondensujący stanowi polimer kationowy lub jego fizjologicznie akceptowalna sól. Tego rodzaju farmaceutycznie akceptowalne sole obejmują, przykładowo, sole kwasów mineralnych takie jak chlorowodorki, hydrobromki, fosforany, siarczany i tym podobne oraz sole kwasów organicznych takich jak octany, propioniany, maloniany, benzoesany i tym podobne. Zazwyczaj sól stanowi chlorowodorek lub siarczan.
Korzystnie, polimer kationowy stanowi poliamina. Stosowane poliaminy mogą obejmować protaminy, putrescynę, spermidynę, sperminę, poliargininy bromku heksadimetryny(Polybrene®) i polilizyny lub ich fizjologicznie akceptowalne sole. Kationowy polimer może stanowić peptyd, zawierający poliaminę.
Korzystnie, poliamina ta jest kationowym polimerem aminokwasów zasadowych.
Zazwyczaj, aminokwasy zasadowe są wybrane spośród lizyny, argininy i histydyny. Tego rodzaju kwasy poliaminowe są łatwo dostępne w Sigma-Aldrich.
Kwas poliaminowy może stanowić homopolimer aminokwasu zasadowego. Przykładowo, poliargininy, polilizyny lub polihistydyny. Alternatywnie, kwas poliaminowy może być polimerem jednego lub więcej aminokwasów zasadowych, opcjonalnie zawierającego również jeden lub więcej niezasadowych aminokwasów. Tym samym, kwas poliaminowy może zawierać jeden lub więcej zasadowych aminokwasów i opcjonalnie jeden lub więcej innych aminokwasów. Tego rodzaju kopolimer typowo zawiera większość zasadowych aminokwasów. Przykładowo, 50 do 100% aminokwasów w kopolimerze może mieć zasadowy charakter.
Korzystnie, 60 do 90% lub 70 do 80% aminokwasów jest zasadowa. W jednym z wykonań, co najmniej 75%, przykładowo co najmniej 85%, 95%, 98% lub 99% aminokwasów w kopolimerze może być zasadowa. Ogólnie, zasadowe aminokwasy zawierają jedną lub więcej lizynę, histydynę lub argininę. Jeśli kopolimer zawiera jeden lub więcej aminokwasów niezasadowych, korzystnie nie stanowią one aminokwasów kwaśnych, takich jak asparaginian lub glutaminian. Jeden lub więcej zasadowych aminokwasów może obejmować aminokwasy z alifatycznym lub aromatycznymi łańcuchem bocznym, przykładowo treoninę, prolinę, tryptofan, serynę lub fenyloalaninę.
Aminokwasy każdego z powyższych kwasów poliaminowych mogą stanowić D- lub L-amininokwasy.
Korzystnie, stosowane są L-aminokwasy.
W korzystnym wykonaniu, poliamina jest homopolimerem argininy (Arg)x lub lizyny (Lys)x.
Korzystne są poli-L-arginina lub poli-L-lizyna, w szczególności poli-L-arginina. Typowo, homopolimer ma masę cząsteczkową od około 500 do 15000, przykładowo od 500 do 10000, od 500 do 5000, lub od 500 do 1000. W jednym z wykonań x w powyższym wzorze, może się wahać od 2 do 100, przykładowo, od 2 do 50, od 2 do 30 lub od 2 do 20.
PL 212 483 B1
W szczególności korzystne są małe homopolimery peptydowe, przykładowo, o masie cząsteczkowej w zakresie od 500 do 1500, takie jak 500 lub 1250, lub 700 do 1000. Zazwyczaj, w małymi peptydzie, x ma wartość od 2 do 10, przykładowo od 4 do 8. W niniejszym wynalazku szczególnie użyteczne są homopolimery gdzie x = 4 lub 6, przykładowo (Arg)4 lub (Arg)6.
Czynnik kondensujący może być przedstawicielem protaminowej rodziny białek, przykładowo siarczan protaminy. Protaminy są białkami zasadowymi, które wiążą się do DNA plemnika w miejscu histonów. Jądra plemników stanowią tym samym doskonałe źródło protamin, np., salmina ze spermy łososia, klupeina ze spermy śledzia, irydyna ze spermy pstrąga, sturyna ze spermy jesiotra oraz skombryna ze spermy makreli. Protamina, siarczan protaminy, fosforan protaminy i jądra plemników są łatwo dostępne w Sigma-Aldrich.
Inne odpowiednie poliaminy takie jak putrescyna, sperdimidyna i spermina wraz w ich fizjologicznie akceptowalnymi solami są łatwo dostępne, przykładowo, w Sigma-Mdrich.
Czynnik kondensujący może również zawierać poliwalentne kationy lub ich fizjologicznie akceptowalne sole. Tego rodzaju poliwalencyjne kationy obejmują, przykładowo, chlorek heksamina kobaltu(III) (Cohex), chlorek tris(etylenodiaminy) kobaltu(II) (Coen) oraz chlorek sepulchratu kobaltu(III) (Cosep). Odpowiednie fizjologiczne sole obejmują podane powyżej sole w odniesieniu do polimerów kationowych.
Fachowcy znają szereg testów, które mogą zostać użyte do identyfikacji czynników kondensujących kwasy nukleinowe. Testy te ogólnie badają zmianę właściwości badanej cząsteczki kwasu nukleinowego, gdzie zmiana jest związana z procesem kondensacji np. upakowania kwasu nukleinowego do postaci stałej, neutralizacji ładunku cząsteczki kwasu nukleinowego lub blokowania bądź zasłaniania poprzednio dostępnych miejsc rozpoznania dla czynników takich jak endonukleazy i czynniki transkrypcyjne.
Testy wskaźnikowe dla kondensacji płynnych preparatów kwasów nukleinowych obejmują, mikroskopię elektronową i mikroskopię sił atomowych, wielkość cząsteczki, potencjału zeta, spektrofluorometrię, test wykluczania bromku etydyny, test opóźnienia migracji w żelu, dichroizmu kołowego oraz rezonansu magnetycznego. Przykłady użytecznej literatury obejmują: J. Mol Biol (1978) 121, 311-326; Biophysical Journal (1996), 70, 2847-2856, Nucleic Acids Res (1999) 27 (8), 1943-1949; J. Amer. Chem. Soc., (1998) 120 (35), 8903-8909; J. Pharm. Sci. (1998) 87 (6), 678-683 i Int. J. Pharm. (2000) 210 (1-2), 97-107.
Czynnik chelatujący do stosowania w niniejszym wynalazku chelatuje jony metali w roztworze. Powszechnie występujące chelatowane jony metali obejmują jony Fe2+, Fe3+, Cr3+, Ca2+ i Na+.
Korzystnie, czynnik ten chelatuje jony Ca2+ i Na+.
Alternatywnie, korzystnym jest, aby czynnik ten chelatował jony Fe2+ i Fe3+. Czynnik może być mono lub poliwalentny.
Przykładowo, odpowiednie czynniki obejmują, ale nie są ograniczone do: kwasu wersenowego (EDTA), kwasu dietylenoetriamino penta-octowego (DTPA), kwasu nitrilotrójoctowego (NTA), heksafosforanu inozytolu, tripolifosforanu, kwasu polifosforowego, bursztynianu sodu, bursztynianu potasu, bursztynianu litu, maleinianu sodu, maleinianu potasu, maleinianu litu, desferalu i kwasu etylenodiamino-di-(o-hydroksyfenylooctowego).
Typowo, wykorzystywane są: EDTA, DTPA lub desferal, w szczególności EDTA lub jej sole, przykładowo sól disodowa kwasu wersenowego.
Korzystnym jest również, aby kwas nukleinowy był odkładany na cząsteczkach obojętnego metalu w obecności jednego lub więcej disacharydów i/lub trisacharydów. Jeden lub więcej cukrów pomaga zwiększać stabilność kwasu nukleinowego/cząsteczki metalu.
Odpowiednie cukry obejmują, sacharozę, manolaurynian sacharozy, trehalozę, laktozę, rafinozę i mannitol.
Korzystnie, cukier jest wybrany z trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy.
W jednym z wykonań, użyta została mieszanina jednego lub więcej cukrów podanych powyżej. Szczególnie korzystna jest mieszanina sacharoza/rafinoza. Typowo, sacharoza/rafinoza jest mieszana w proporcji 3:1 wagowo/wagowo.
Kwasy nukleinowe mogą być odkładane na cząsteczce z obojętnego metalu również w obecności jednej lub więcej soli. Ta jedna lub więcej soli dostarczają większej stabilności. Sól stanowi dodatek do jakiejkolwiek soli, która może być zastosowana według wynalazku, jako czynnik chelatujący. Dlatego sól ta jest solą niechelatującą.
PL 212 483 B1
Przykładowo, sól ta nie jest zazwyczaj ani maleinianem ani bursztynianem. Sól ta jest także dodatkiem do fizjologicznie akceptowalnej soli, która może być wykorzystywana według wynalazku, jako czynnik kondensujący kwasy nukleinowe.
W korzystnym wykonaniu, jedna lub więcej soli jest wybrana spośród chlorków, octanów, cytrynianów, azotanów, fosforanów i siarczanów. Odpowiednie sole obejmują octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu, chlorku sodu, siarczanu sodu i siarczanu potasu. Korzystnie, sól stanowi octan potasu.
W korzystnym wykonaniu, cząsteczki niosące kwas nukleinowy są doprowadzane do kontaktu z przeciwutleniaczem takim jak etanol lub witamina A, C lub witamina E. Zazwyczaj, poddawanie cząsteczek działaniu przeciwutleniacza zwiększa ich stabilność. Typowe działanie może obejmować przemywanie cząsteczek za pomocą przeciwutleniacza.
W jednym z wykonań, jeden lub więcej ze składników wykorzystywanych do przygotowywania cząsteczek pozostaje połączony lub związany z powstającą cząsteczką. Odpowiednio, dostarczane są cząsteczki, odpowiednie do dostarczania z urządzenia dostarczającego cząsteczki, zawierające lub czasami zasadniczo składające się z cząsteczek obojętnego metalu, posiadającego na powierzchni kwas nukleinowy, czynnik chelatujący jony metali oraz jeden lub więcej:
(a) czynnik kondensujący kwasy nukleinowe;
(b) jeden lub więcej disacharyd i/lub trisacharyd oraz (c) jedną lub więcej soli.
Każdy ze składników cząsteczek jest opisany poniżej.
Korzystnie cząsteczki obejmują, co najmniej (a) i/lub (b).
Wynalazek dostarcza również sposób przygotowania niniejszych cząsteczek. Sposób obejmuje lub w niektórych wykonaniach składa się zasadniczo z etapów:
(i) precypitacji kwasu nukleinowego na cząsteczkach nośnikowych obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwas nukleinowy oraz czynnika chelatującego jony metali; oraz (ii) zebrania powstających cząsteczek.
Typowo, etap (i) obejmuje kontaktowanie przez wymieszanie kwasu nukleinowego z cząsteczkami nośnikowymi z obojętnego metalu w obecności kondensującego kwasy nukleinowe i czynnika chelatującego jony metali.
Korzystne jest stałe mieszanie podczas procedury dodawania w celu zapewnienia jednorodności mieszaniny reakcyjnej.
Korzystnie, kwas nukleinowy i czynnik kondensujący kwasy nukleinowe są oddzielone od siebie (np. w postaci oddzielnych roztworów) aż do chwili wystąpienia kondensacji, przykładowo aż do chwili, gdy obecne są cząsteczki nośnikowe i czynnik chelatujący.
Szczególnie korzystnym jest dodawanie czynnika kondensującego do mieszaniny, zawierającej już cząsteczki nośnika oraz kwas nukleinowy, tak aby uniknąć przedwczesnej precypitacji kwasu nukleinowego. Czynnik chelatujący jony metali może być wówczas obecny zarówno w preparacie czynnika kondensującego, jak i w mieszaninie cząsteczek nośnika i kwasu nukleinowego. Czynnik kondensujący może być dodawany stopniowo, przykładowo kropla po kropli.
Alternatywnie, mieszanina czynnika kondensującego i cząsteczek nośnika może zostać dodana do preparatu kwasu nukleinowego.
Cząsteczki metalu, kwas nukleinowy, czynnik kondensujący kwas nukleinowy i czynnik chelatujący zostały opisane powyżej.
Mieszanina na etapie precypitacji może dodatkowo zawierać jeden lub więcej cukry disacharydowe i/lub trisacharydowe, przykładowo sacharozę, manolaurynian sacharozy, trehalozę, laktozę, rafinozę lub mannitol, bądź ich kombinację. Korzystnie, cukier ten jest wybrany spośród trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy lub ich kombinacji. Zastosowana może zostać mieszanina jednego lub więcej disacharydu i/lub trisacharydu. Przykładowo, zastosowana może zostać mieszanina jednego lub więcej z powyższych cukrów.
Szczególnie korzystna jest mieszanina sacharoza:rafinoza, zwłaszcza w stosunku 3:1 wagowo/wagowo.
Mieszanina na etapie precypitacji może dodatkowo zawierać jedną lub więcej soli. Sól ta stanowi dodatek do jakiejkolwiek soli wykorzystywanej według wynalazku, jako czynnik chelatujący. Dlatego sól ta jest ogólnie solą nie chelatującą.
PL 212 483 B1
Przykładowo, sól ta nie jest maleinianem i/lub bursztynianem. Sól ta jest także dodatkiem do fizjologicznie akceptowalnej soli, która może także być wykorzystywana według wynalazku, jako czynnik kondensujący kwasy nukleinowe.
W korzystnym wykonaniu, jedna lub więcej soli jest wybrana spośród chlorków, octanów, azotanów, fosforanów i siarczanów. Odpowiednie sole obejmują octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu, chlorku sodu, siarczanu sodu i siarczanu potasu. Zwykle, sól ta nie jest fosforanem glinu. Korzystnie, sól stanowi octan potasu.
Cukier i/lub sól mogą być obecne w obydwu lub w jednym z preparatów wyjściowych, będąc domieszane przykładowo w preparacie czynnika kondensującego lub w preparacie cząsteczki nośnika/kwasu nukleinowego.
W jednym z wykonań, roztwór zawierający wcześniej określone ilości czynnika kondensującego kwas nukleinowy, cukru i czynnika chelatującego jony metali jest stopniowo dodawany do roztworu zawierającego określone ilości cząsteczek nośników metali, kwasu nukleinowego, cukru i czynnika chelatującego jony metali. Sól może być obecna w jednym lub w obydwu roztworach.
Stężenia składników na etapie (i) mogą być zróżnicowane, co zasadniczo nie wpływa na stabilność kwasu nukleinowego na powstających cząsteczkach. Cząsteczki nośnika metalu mogą być obecne w każdej odpowiedniej ilości, przykładowo w roztworze od 0,1 do 100 mg/ml, tak jak - od 0,1 do 10 mg/ml lub 1 do 10 mg/ml. Korzystnie, stężenie kwasu nukleinowego wynosi od 0,01 do 10 mg/ml
- tak jak od 1 do 10 mg/ml. Typowo, czynnik kondensujący kwasy nukleinowe występuje w stężeniu od 0,1 do 10 mg/ml, przykładowo od 0,1 do 1 mg/ml.
Korzystnie, czynnik chelatujący jony metali występuje w stężeniu od 0,1 mM do 1 M, tak jak od 1 mM do 0,1 M, przykładowo od 10 do 50 mM. Cukier, jeśli obecny, może występować na przykład w stężeniu od 0,1 mg/ml do 1 mg/ml, korzystnie od 1 mg/ml do 0,1 mg/ml, przykładowo 10 do 50 mg/ml. Sól, jeśli obecna, występuje typowo w stężeniu od 0,1 mM do 1 M, przykładowo od 1 mM do 0,1 M,
- tak jak od 10 do 50 mM.
Sposób wynalazku może dodatkowo obejmować doprowadzenie do kontaktu cząsteczek kwasu nukleinowego z przeciwutleniaczem. Ogólnie, traktowanie to obejmuje przemycie cząsteczek roztworem, zawierającym przeciwutleniacz. Przykładowo może być zastosowany etanol. Korzystnie, etanol jest nasycony sacharozą. Inne odpowiednie przeciwutleniacze obejmują witaminę A, witaminę C i witaminę E. Dodatkowo, lub alternatywnie, cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być przemywane jeden lub wiele razy wodnym roztworem alkoholowym, takim jak woda lub izopropanol.
Opłaszczone, ewentualnie przemyte, cząsteczki mogą zostać przeniesione do odpowiednich błon i pozostawione do wyschnięcia przed użyciem, powleczone na powierzchnię modułu próbek lub kasetę bądź załadowane do kasety stosowane] w urządzeniu do dostarczania cząsteczek. Zastosowana może zostać każda odpowiednia metoda suszenia.
Korzystnie, suszenie prowadzi się pod strumieniem azotu.
Cząsteczki według wynalazku mogą zostać zapakowane do pojemników z pojedynczą dawką lub z dawką wielokrotną. Tego rodzaju pojemniki mogą się składać z hermetycznie zamkniętego pojemnika, zawierającego odpowiednią ilość cząsteczek. Cząsteczki mogą być zapakowane, jako sterylny preparat, zaś hermetycznie zamknięty pojemnik może zostać zaprojektowany tak, aby zapewniał sterylność postaci, aż do chwili użycia. Pojemniki są korzystnie zaadaptowane do bezpośredniego użycia w urządzeniu do dostarczania cząsteczek. Typowo, takie pojemniki przyjmują postać kapsułek, torebek foliowych, saszetek, kasetek, i tym podobnych. Urządzenia do dostarczania cząsteczek mogą również występować w postaci już napełnionej, zawierając odpowiednią dawkę opłaszczonych cząsteczek. Załadowane urządzenie może zostać również przepakowane do hermetycznie zamkniętego pojemnika.
Pojemnik, w którym są zapakowane cząsteczki może zostać w dalszej kolejności oznakowany w taki sposób, aby można było zidentyfikować kompozycję oraz uzyskać odpowiednie informacje, dotyczące dawkowania. Dodatkowo, pojemnik może zostać oznakowany za pomocą informacji agencji rządowej, przykładowo Food and Drug Administration, wskazującej na akceptację przez prawo federalne sposobu wytwarzania, użycia i sprzedaży zawartego w nim preparatu kwasu nukleinowego do podawania ludziom.
Urządzenia przyspieszające cząsteczki, odpowiednie do podawania cząsteczek są znane fachowcom. Obecne urządzenia typu strzelby genowej obejmują wyładowanie eksplozyjne, elektryczne lub gazowe przyspieszające opłaszczone cząsteczki nośnikowe w kierunku komórek docelowych. Opłaszczone cząsteczki nośnikowe mogą być swobodnie przyczepione do ruchomej płaszczyzny
PL 212 483 B1 nośnikowej lub swobodnie przyczepione do powierzchni, wzdłuż której przepływa strumień gazu, unosząc cząsteczki z powierzchni i przyspieszając je w kierunku celu. Przykładowo, urządzenie do wyładowania gazowego jest opisane w patencie U.S. nr 5204253. Urządzenie, wykorzystujące eksplozję jest opisane z patencie U.S. nr 4945050. Jeden przykład aparatu do wyładowania elektrycznego odpowiedniego do niniejszego użycia opisano w patencie U.S. nr 5120657. Kolejny aparat do wyładowań elektrycznych opisano w patencie U.S. nr 5149 655. Opisy wszystkich tych patentów są niniejszym włączone poprzez odniesienie.
Niniejsze opłaszczone cząsteczki mogą być również podawane przy użyciu bezigłowej strzykawki, takiej jak ta opisana w patencie U.S. nr 5630796 dla Bellhouse i wsp. (bezigłowe urządzenie PowderJet®) oraz w Publikacjach
Międzynarodowych nr WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 oraz WO 96/20022, które są niniejszym włączone w całości poprzez odniesienie.
Urządzenia takie jak to opisane w patencie U.S. nr 5630796 mogą być dostarczane, jako urządzenie w kształcie pióra, zawierające, w kolejności od szczytu do spodu, cylinder z gazem, pojemnik lub kasetę z cząsteczkami, dyszę ultradźwiękową wraz z dołączonym tłumikiem. Cząsteczki są podawane w odpowiednim pojemniku, np. kasetce uformowanej przez dwie podatne na zerwanie błony polimerowe, które na gorąco połączono z odstępnikiem w postaci uszczelki, tworząc zwartą, szczelną jednostkę. Materiały błon mogą zostać dobrane tak, aby osiągnąć odpowiedni sposób otwierania i ciśnienie wybuchu, które decydują o warunkach, w których inicjowany jest przepływ ultradźwięków.
Podczas działania, urządzenie jest uruchamiane tak, aby uwalniało sprężony gaz z cylindra do pojemnika ekspansji w obrębie urządzenia. Uwolniony gaz wchodzi w kontakt z kasetką, zawierającą cząsteczki i jeśli powstanie odpowiednie ciśnienie, dochodzi do naruszenia błon Kasetki i uniesienia cząsteczek do dyszy ultradźwiękowej, umożliwiającej dalsze dostarczanie. Dysza została zaprojektowana tak, aby możliwe było osiągnięcie odpowiedniej prędkości gazu oraz sposobu przepływu umożliwiających dostarczenie porcji cząsteczek na docelową powierzchnię zdefiniowanego obszaru. Tłumik ma za zadanie tłumić hałas, powstający w wyniku ultradźwiękowego przepływu gazu.
System dostarczania, opisany w Publikacji Międzynarodowej nr WO 96/20022 również wykorzystuje energię sprężonego gazu do przyspieszania i dostarczania sproszkowanych kompozycji.
Jednak różni się on od systemu z patentu US nr 5630796 poprzez użycie fali szokowej, zamiast przepływu gazu przyspieszającego cząsteczki. Bardziej szczegółowo, natychmiastowy wzrost ciśnienia spowodowany falą szokową wytworzoną za elastyczną kopułą powoduje uderzenie tylnej części kopuły i gwałtowne wywrócenie elastycznej kopuły w kierunku powierzchni docelowej. To nagłe wywrócenie wystrzela sproszkowaną kompozycję (zlokalizowaną na zewnątrz kopuły) przy odpowiedniej prędkości i pędzie w kierunku penetrowanej tkanki docelowej, np. tkanki śluzówkowej ust. Sproszkowana kompozycja jest uwalniana w chwili pełnego wywrócenia kopuły. Kopuła całkowicie zatrzymuje gaz o wysokim ciśnieniu, który nie wchodzi w ten sposób w kontakt z tkanką. Ponieważ nie dochodzi do uwolnienia gazu podczas operacji dostarczania, system jest całkowicie cichy. Tego rodzaju rozwiązanie może być wykorzystywane do innych zamkniętych i wrażliwych zastosowań, przykładowo do dostarczania cząsteczek do minimalnie inwazyjnych miejsc chirurgicznych.
Niniejsze powlekane cząsteczki mogą być dostarczane in vivo bezpośrednio do osobnika lub ex vivo do komórek pobranych od osobnika, zaś stransformowane komórki zostają ponownie wprowadzone do pacjenta. Przy dostarczaniu in vivo, cząsteczki wstrzykuje się zazwyczaj podskórnie, naskórkowo, śródskórnie, do błony śluzowej (np. donosowo, doodbytniczo i/lub dopochwowo), dootrzewnowo, dożylnie, doustnie lub domięśniowo.
Korzystnie, dostarczenie następuje do końcowo zróżnicowanych komórek, jednak cząsteczki mogą również zostać dostarczone do komórek niezróżnicowanych, częściowo zróżnicowanych takich jak komórki macierzyste krwi oraz fibroblasty skóry. Najkorzystniej, dostarczane są do komórek nabłonkowych.
Opłaszczone cząsteczki są podawane pacjentowi w sposób kompatybilny z postacią dawkowania oraz w ilości, która jest efektywna profilaktycznie i/lub terapeutycznie.
„Terapeutycznie efektywna ilość” niniejszych kompozycji cząsteczek jest wystarczająca do zapewnienia leczenia lub zapobiegania chorobie lub objawom choroby i mieści się we względnie szerokim zakresie wyznaczanym przez rutynowe badania. Ogólnie, cząsteczki są dostarczane w ilości od 0,001 do 1000 μg, korzystniej od 0,01 do 10,0 μg kwasu nukleinowego na dawkę. Jednak dokładna ilość będzie się wahać w zależności od wieku i stanu ogólnego osobnika poddawanego leczeniu, a w szczególności w zależności od wybranej sekwencji kwasu nukleinowego oraz innych czynników.
PL 212 483 B1
Odpowiednia efektywna ilość może zostać łatwo określona dzięki badaniu klinicznemu. W określaniu niezbędnej ilości użyteczne są „Physicians Desk Reference” oraz „Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics”.
C. Doświadczenia
Poniżej podano przykłady konkretnych wykonań dla sposobów według niniejszego wynalazku.
P r z y k ł a d 1
W celu oceny efektów różnorodnych cukrów, środków chelatujących i substancji dodatkowych/pomocniczych w trzech preparatach DNA/cząsteczki złota wykonano serię eksperymentów: „DSEP” (eksperyment A) „poli Arg” (eksperyment B) i „zmodyfikowana spermidyna” (eksperyment C).
Różnorodne cząsteczki oceniano według jednego lub większej liczby następujących kryteriów:
(i) ilość DNA opłaszczającego cząsteczki oceniano poprzez elucję oraz spektrofotometrycznie przy długości fali 260 nm lub fluorometrycznie, (ii) fizyczną stabilność DNA, pokrywającego cząsteczki oceniano przeprowadzając analizę elektroforetyczną w żelu lub za pomocą HPLC, (iii) zagęszczenie cząsteczek oceniano przy użyciu mikroskopu świetlnego lub poprzez ruchliwość w żelu, (iv) aktywność ekspresyjną DNA na cząsteczkach mierzono poprzez pomiar ekspresji genu reporterowego kodującego lucyferazę w komórkach CHO, po wprowadzeniu cząsteczek niosących gen do komórek, (v) właściwości immunogenne cząsteczek mierzono oznaczając miano przeciwciał w surowicach myszy, myszy szczepiono cząsteczkami opłaszczonymi DNA, który koduje antygen rozpoznawany przez specyficzne przeciwciało.
Dla każdego preparatu, cząsteczki grupowano wg w/w kryteriów:
Eksperyment A: Skład DSEP
Cząsteczki przygotowano według następującgo wzorca:
Cząsteczki złota-DNA-Cukier-Sól-Inne
Badane cukry wybrano z: monolaurynianu sacharozy, mannitolu, trehalozy, laktozy, rafinozy i monokaprynianu sacharozy. Badane sole wybrano z: octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu, fosforanu glinu, chlorku sodu, siarczanu sodu chlorku magnezu.
Zastosowano różne kombinacje cukrów i soli, które przedstawiono poniżej. Oceniano również wpływ płukania sacharozą nasyconą etanolem.
Wyniki pokazane poniżej są przedstawione dla kombinacji różnych cukrów lub soli, ranking uporządkowano dla wszystkich kryteriów od najbardziej skutecznych lub pożądanych do najmniej efektywnych. Przykładowo, najwyższe w tym rankingu cukry dla wydajności, co do DNA skutkują we względnie wysokich wydajnościach, co do DNA; cukry najwyżej w rankingu dla aglomeracji skutkują względnie niskimi poziomami aglomeracji:
(i) wydajność w odniesieniu do ilości DNA na cząsteczkach:
Cukier: sacharoza ~ sacharoza ~ monolaurynian ~ trehaloza ~ laktoza ~ rafinoza >>> monokaprynian sacharozy (brak DNA);
Sól: octan potasu ~ chlorek wapnia ~ chlorek litu ~ octan sodu ~ azotan magnezu ~ cytrynian sodu > fosforan sodu >>> fosforan glinu;
Inne: przemycie sacharozą wysyconą etanolem nie usuwa DNA z proszku złożonego z cząsteczek złota.
Nieobecność jakiejkolwiek soli znacznie obniża zawartość DNA:
(ii) fizyczna stabilność DNA na cząsteczkach:
Cukier: sacharoza > trehaloza > mannitol ~ laktoza ~ rafinoza > monolaurynian sacharozy > monokaprynian sacharozy;
Sól: octan potasu ~ octan sodu ~ cytrynian sodu ~ fosforan sodu > chlorek sodu > siarczan sodu > chlorek litu
Inne: przemycie sacharozą wysyconą etanolem przyczynia się do stabilności fosforanu glinu, który zapobiega wytrącaniu;
(iii) aglomeracja:
Cukier: monokaprynian sacharozy < rafinoza < laktoza ~ monolaurynian sacharozy < sacharoza ~ trenaloza;
PL 212 483 B1
Sól: octan potasu ~ chlorek litu ~ fosforan sodu ~ cytrynian sodu ~ chlorek sodu ~ siarczan sodu ~ chlorek wapnia ~ chlorek magnezu ~ azotan magnezu;
(iv) aktywność ekspresji DNA na cząsteczkach:
Sacharoza/octan sodu ~ octan potasu/rafinoza ~ sacharoza/azotan magnezu ~ octan potasu/monolaurynian sacharozy;
(v) immunopotencja u myszy.
Dla rzeczywistych czasów starzenia się preparatów przechowywanych w temperaturze pokojowej: sacharoza/octan sodu ~ spermidyna/CaCl2 cząsteczki kwasu nukleinowego przez 3 miesiące. Rafinoza/octan potasu ~ monolaurynian sacharozy/octan potasu ~ spermidyna/CaCl2 cząsteczki kwasu nukleinowego przez 1 miesiąc.
Eksperyment B: Preparat poli Arg
Cząsteczki przygotowano według następującego wzorca:
Cząsteczka złota-DNA-Cukier-Czynnik chelatujący-Peptyd argininowy.
Badane cukry wybrano spośród trehalozy, sacharozy i rafinozy. Badane czynniki chelatujące wybrano z EDTA, DTPA i desferalu (DFO). Badane peptydy poliargininowe wybrano z poliarginin o masie cząsteczkowej 13000, (Arg)6 i (Arg)4.
Przebadano różne kombinacje cukrów, czynników chelatujących i poliarginin.
Wyniki przedstawiono poniżej, i tak porządek w rankingu jest od najbardziej pożądanych do najmniej pożądanych lub efektywnych.
(i) wydajność w odniesieniu do ilości DNA na cząsteczkach:
Badane cukry: trehaloza, sacharoza, rafinoza
Chelatory: EDTA, DTPA, desferal (DFO)
Inne: peptydy poli-Arg, każdy 13,000 Mw, (Arg)6, (Arg)4.
Wydajności dla powyższych kombinacji przekraczają 50% wydajności teoretycznej.
(ii) fizyczna stabilność DNA na cząsteczkach:
Cukier: sacharoza > trehaloza > rafinoza
Chelatory: EDTA>DTPA>desferal (DFO)
Inne: wszystkie peptydy Poli-Arg dawały zbliżoną stabilność (iii) aglomeracja.
Nie stanowi problemu w odniesieniu do tego preparatu.
(iv) aktywność ekspresji DNA na cząsteczkach
Trehaloza/EDTA/(Arg)4, ~ Trehaloza/DTPA/(Arg)4.
Przygotowane cząsteczki z użyciem DNA, cząsteczek złota i spermidyny, wykazały podobny poziom aktywności ekspresji dla tych preparatów.
(v) immunopotencja myszy:
Sacharoza/EDTA/(Arg)4, > Trehaloza/EDTA/(Arg)4 > Trehaloza/DTPA/(Arg)4, > Sacharoza/DTPA/ (Arg)4.
Przygotowane cząsteczki z użyciem DNA, CaCl2 cząsteczek złota i spermidyny, wykazały podobną immunopotencję, co cząsteczki trehaloza/EDTA/(Arg)4.
Eksperyment C: Preparat ze zmodyfikowaną spermidyną
Cząsteczki przygotowano według następującego wzorca:
Cząsteczka złota-DNA-Spermidyna-Cukier-Sól-Inne.
Badane cukry wybrano spośród sacharozy, trehalozy, i rafinozy. Badane sole wybrano spośród chlorku magnezu, azotanu magnezu, chlorku wapnia, siarczanu sodu, siarczanu potasu i bromku sodu.
Zbadano również wpływ stężenia spermidyny i oddziaływania na cząsteczki za pomocą roztworów, zwłaszcza roztworu - woda/alkohol.
(i) zawartość DNA na cząsteczkach:
Cukry: rafinoza > trehaloza > sacharoza
Sole: MgCl2 ~ MgNO3 ~ CaCl2 > siarczan sodu ~ siarczan potasu ~ bromek sodu;
Inne: stężenie spermidyny i zawartość % alkoholu/wody mają wpływ na wydajność.
(ii) fizyczna stabilność DNA na cząsteczkach:
Cukier: rafinoza > trehaloza > sacharoza
Sól: MgCl2 > MgNO3 > CaCl2 > siarczan sodu ~ siarczan potasu ~ bromek sodu (iii) aglomeracja
Nie stanowi problemu w odniesieniu do tego preparatu.
PL 212 483 B1
P r z y k ł a d 2
Badanie stabilności różnorodnych cząsteczek opłaszczonych DNA
Cząsteczki opłaszczone przygotowano używając różnych proporcji siarczanu protaminy, EDTA, wody i jednego z cukrów: trehalozy, sacharozy czy laktozy. Cząsteczki przygotowano według dziesięciu różnych proporcji, jak zestawiono w dziesięciu preparatach w tabeli 1. Stabilność cząsteczek przygotowanych według każdej z tych proporcji była badana w 4°C i 60°C w punktach czasowych - 0, 7 i 14 dniu.
Sposób
Dla każdej proporcji Probówka A i B była przygotowana według tabeli 1. Zawartość probówki A i B zwirowano przy dużej szybkości przez 10 s, do momentu, kiedy każdy roztwór był dobrze wymieszany. Podczas mieszania przy średniej prędkości probówki A, zawartość probówki B dodano kroplami używając 5ml pipety (typu pipetman). Probówkę A mieszano przez następne 15s i pozostawiono na 5 min. Z probówki A usunięto supernatant, a pozostały osad przemyto 1 ml 100% izopropanolu. Zawartość probówki wymieszano i osadzono osad. Izopropanol usunięto a osad wysuszono na proszek w strumieniu azotu.
3-5mg cząsteczek każdego z preparatów ważono w 1,5 ml probówkach wirówkowych i inkubowano w 4°C i 60°C. Stabilność DNA w każdym z preparatów cząsteczek badano w punktach czasowych - 0, 7 i 14 dniu przy pomocy elektroforezy w żelu agarozowym i HPLC.
Wyniki
Przygotowane preparaty cząsteczek wykazywały podczas testowania podobną stabilność. Do dalszych badań wybrano cząsteczki sporządzone według „proporcji 4” (Preparat 4, tabela 1).
P r z y k ł a d 3
Dalsze badania stabilności w oparciu o cząsteczki przygotowanych według „proporcji 4” (Preparat 4)
Cząsteczki przygotowano tak samo, jak w przykładzie 2 według proporcji 4 w tabeli 1, ale na większą skalę (350 mg złotych cząsteczek) oraz z dodatkiem:
a) bez dwucukrów (kontrola), lub
b) trehaloza; lub
c) sacharozy; lub
d) laktoza.
Cząsteczki inkubowano w 4°C i w 60°C, a stabilność DNA oceniano po 8 tygodniach elektroforetycznie na żelu agarozowym.
P r z y k ł a d 4
Opracowanie preparatu tetraargininowego
Po wypróbowaniu kilku preparatów w celu weryfikacji czy poliargininy rożnej długości posiadają zdolność do precypitacji DNA na złotych mikrocząsteczkach, przygotowano eksperyment do zbadania długości poliargininy do użycia w badaniu wydajności i stabilności. Przebadano również dobór cukrów i chelatora, które zwiększają stabilność w poprzednich praparatach.
Wyniki pokazały, że poliargininy o 4 i 6 monomerach były lepszymi dla stabilności niż polimery o masie cząsteczkowej 13000 (około 80 monomerów). Przebadane cukry i chelatory działały porównywalnie. Za dobre cukry uznano trehalozę i sacharozę. Za dobre chelatory EDTA i DTPA. Tetramer argininowy wybrano ze względu na jego szybsze oddysocjowywanie od DNA, jak również na prawdopodobieństwo tworzenia form mniej zdegradowanych produktów niż 6-merowe.
Otrzymane preparaty do dalszych badań nazwano TA101.1 (DNA, sacharoza, EDTA), TA101.2 (DNA, sacharoza, DTPA), TA101.3 (DNA, trehaloza, EDTA), TA101.4 (DNA, trehaloza, DTPA).
Powyższe cztery preparaty przeznaczano do długoterminowego przechowywania i badano pomiędzy sobą oraz w stosunku do kontroli spermidyna/CaCl2 (w której spermidynę i chlorek wapnia wykorzystano do strącenia DNA na mikrocząsteczkach złota) w 4, 25 i 40 stopniach Celsjusza. Ich stabilność pokazano w Tabeli 2. Preparaty te testowano również pod kątem ich biologicznej aktywności w badaniach nad myszami i w badaniach nad ekspresją lucyferazy (DNA kodowało lucyferazę).
PL 212 483 B1
Doświadczalna DOE użyta do optymalizacji stężeń cukrów i EDTA przy przygotowywaniu cząsteczek. Liczby na górze tabeli oznaczają stężenia cukru i EDTA w każdej próbce.
PL 212 483 B1
T a b e l a 2
Szybkość rozpadu serii TA101 (pasmo SC)
Preparat Seria nr Temp (°C) k (dni 1) Okres półtrwania (d)
spm/CaCl2 2251-45 25 0,0121 57
TA101.1 2251-28-I 25 0,0043 161
TA101.2 2251-28-III 25 0,0 0 92 75
TA101.3 2251-28-III 25 0,0045 154
TA101.4 2251-28-IV 25 0,0113 61
spm/CaCI2 2251-45 40 0,0373 19
TA101.1 2251-28-I 40 0,0107 65
TA101.2 2251-28-II 40 0,0261 27
TA101.3 2251-28-III 40 0,0117 59
TA101.4 2251-28-IV 40 0,0421 16
Eksperymenty nad aktywnością pokazały, że wszystkie serie 101 były aktywne, wykazywały ekspresję i były niemal podobne do spermidyny/CaCl2. Stabilność preparatów TA101.1 i TA101.3 była wyższa niż TA101.2 i TA101.4, co wskazuje, że chelator EDTA był bardziej stabilizujący niż DTPA, ale niewielkie różnice zanotowano pomiędzy trehalozą (3 i 4) a sacharozą (1 i 2), użytych do utworzenia tych proszków.
Skład kompozycji serii 101 tetrargin przedstawiono w Tabeli 3.
T a b e l a 3 Preparaty serii 101
Preparat Cukier (30% v/v) Chelator 5 mM Etanol % (Arg)4 mg/ml
TA101.1 Sacharoza EDTA 0 0,3
TA101.2 Sacharoza DTPA 0 0,3
TA101.3 Trehaloza EDTA 0 0,3
TA101.4 Trehaloza DPTA 0 0,3
Następnie, przeprowadzono dwa eksperymenty, w których zastosowano poziomy nasycenia trehalozy i EDTA jako środowisko preparatu. Wraz z tym zastosowano wielokrotne poziomy etanolu. Preparaty te wykorzystywały zasadę, że niemal nasycone roztwory mogą precypitować na złocie więcej stabilizatorów. Preparaty przygotowano dla różnych poziomów wody i gęstości, dzięki użyciu etanolu o różnym stężeniu procentowym. Preparaty sporządzone w danych środowiskach były bardziej stabilne niż seria preparatów 101.
Zapoczątkowano następnie doświadczenia przeznaczone do zbadania optymalizacji poziomów etanolu, EDTA, trehalozy i tetraargininy. Doświadczenie to przeprowadzono przy zmiennych stężeniach składników (tetraargininy, EtOH, EDTA, trehalozy) w pięciu specyficznych zakresach zmienności. Wykorzystano mieszaninę DNA, zawierającą 10% DNA kodującego lucyferazę. Umożliwiło to zbadanie stabilności i aktywności w jednym doświadczeniu.
Optymalne preparaty wybrano po przeanalizowaniu wyników, jak również modelując dane przy pomocy równań kwadratowych w celu przewidywania stabilności i ekspresji w całym zakresie eksperymentu. Otrzymane do dalszych badań preparaty nazwano TA201.2, TA201.5, TA201.11 i TA201.15.
Skład tych czterech preparatów pokazano w Tabeli 4. Preparaty te są kompozycjami środowiskowymi, czyli nie ostatecznymi proszkami. Tabela 3 pokazuje, że w preparatach tych wykorzystano etanol, jako wysokoprocentowy rozpuszczalnik. Główną różnicę pomiędzy 201.5 a 201.11 stanowi poziom trehalozy ale poziom tetraargininy jest również trzy razy wyższy w 201.5. Jedyną różnicę pomiędzy 201.2 a 201.15 stanowi obecność EDTA w 201.15.
PL 212 483 B1
Preparat TA201.5 jest optymalnym preparatem według programów optymalizacji przy jednoczesnej optymalizacji kryteriów ekspresji i stabilności. Pozostałe umieszczono dla porównania. TA201.2 był preparatem o największej ekspresji i w daIszych badaniach posłużył do ustawienia największej wartości ekspresji.
Preparat TA201.5 był centralnym punktem eksperymentu i był tworzony wielokrotnie. Preparat ten zatem dostarczył danych o największej powtarzalnej stabilności i aktywności i posłużył jako dobry punkt wyjścia do sprawdzenia czy trendy były powtarzalne przy dalszym badaniu preparatu.
T a b e l a 4 Kompozycje serii 201
Preparat Trehaloza mg/ml EDTA mM Etanol % (Arg)4 mg/ml
TA201.5 40,05 37,5 52,5 1,13
TA201.15 80,1 25 35 0,75
TA201.11 120,15 37,5 52,5 0,38
TA201.2 80,1 0 35 0,75
Preparaty TA201.5, ΤA201.15 i TA201.11 były bardzo stabilne. Właściwe pomiarów szybkości rozpadu w temperaturze 25°C po 6 miesiącach nie dało się otrzymać. Temperatura ta jest najbliższa warunkom rzeczywistym, jakim podlega preparat podczas przechowywania. Stabilność preparatu TA201.5 testowano w wyższych temperaturach. Porównanie względnej szybkości rozkładu w wyższych temperaturach wskazuje na względną stabilność w niższych temperaturach. Tabela 5 pokazuje stabilność preparatów w rożnych temperaturach.
T a b e l a 5
Stabilności preparatów „TA” w różnych temperaturach
Seria nr Preparat Temperatura k (dni _1) Okres półtrwania (d)
1 2 3 4 5
2251-136-sp spm/CaCl2 4 0,0052 133,3
2251-136-sp spm/CaCl2 25 0,0366 13,9
2251-136-sp spm/CaCl2 40 0,2264 3,1
2251-136-2 TA201.2 4 0,0071 97,6
2251-136-2 TA201.2 25 0,0229 30,3
2251-136-2 TA201.2 40 0,2247 3,1
2251-110-15 TA201.15 60 0,0437 15,9
2251-110-11 TA201.11 60 0,0161 43,1
2334-18-11 TA201.11 60 0,0235 29,5
2251-110-5 TA201.5 60 0,0362 19,1
2334-80-n TA201.5 60 0,0275 25,3
2334-30-m TA201.5 60 0,0252 27,6
2251-156-5.1 TA201.5 60 0,0528 16,4
2251-156-5.2 TA201.5 60 0,0625 14,8
2251-156-5.3 TA201,5 60 0,0504 13,9
2334-101-1 TA201.5 60 0,0744 9,3
2334-101-2 TA201.5 60 0,726 9,5
2334-101-3 TA201.5 60 0,0781 8,9
PL 212 483 B1 cd. Tabeli 5
1 2 3 4 5
2334-101-4 TA201.5 60 0,0645 10,8
2334-101-5 TA201.5 60 0,0530 13,1
2334-101-6 TA201.5 60 0,0735 9,4
2334-101-7 TA201.5 60 0,0514 13,5
2334-101-8 TA201.5 60 0,0719 9,6
2334-101-9 TA201.5 60 0,0241 28,7
2334-101-10 TA201.5 60 0,0163 42,6
2251-136-5 TA201.5 40 0,0027 253,9
2251-183-5 TA201.5 40 0,0029 236,6
Oceniono fizyczną toksyczność preparatów TA201.5 i TA201.11 dla skóry. Nie zaobserwowano reakcji niekorzystnych. Zbadano aktywności białek kodowanych przez DNA znajdujące się w preparacie. Zaobserwowano ekspresję lucyferazy kodowanej przez wykorzystywany DNA. Tabela 6 pokazuje wyniki badań nad zwierzętami, w których wykorzystano DNA kodujący rdzeniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (Cag) i powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (Sag).
T a b e l a 6
Podsumowanie wyników badań nad zwierzętami
Badania na zwierzętach (myszy oraz czas i temperatura, w której przechowywano proszki, jeśli należało) Sag ELISA Cag ELISA Sag ELISPOT Cag ELISPOT
M103 201,5 > Spm 201,5 > Spm 201,5 < Spm n.b.
M103 201,5 < Spm 201,5 > Spm 201,5 > Spm 201,5 > Spm
M110, czas 0 201,5 < Spm* 201,5 > Spm* 201,5 > Spm* 201,5 > Spm*
M110, 1 miesiąc w 25°C 201,5 > Spm* 201,5 = Spm* 201,5 = Spm* 2 01,3 > S pm*
M110, 3 miesiące w 25°C 201,5 > Spm* 201,5 = Spm* 201,5 > Spm* 2 01,5 > Spm*
G014 201,5 > Spm 201.5 = Spm n.b. n.b.
M114, 3 miesiące w 25°C 201,5 < Spm* 201,5 < Spm* 201,5.5 > Spm* 201,5 > Spm*
M114, 4 miesiące w 40°C 201,5 < Spm* 201,5 > Spm* 2 01,5 > Spm* 201,5 > Spm*
M114, 6 miesięcy w 40°C 201,5 < Spm* 201,5 > Spm* 201,5 > Spm* 201,5 > Spm*
M116, 2 tygodnie w 60°C 201,5 < Spm 201,5 < Spm 201,5 = Spm 201,5 = Spm
świeża spermidyna/CaCl2. Zastosowano również starą spermidynę/CaCl2 w M110 i M114
Dane te w oczywisty sposób pokazują, że preparat TA201.5 był konkurencyjny wobec preparatu spermidyny/CaCl2 w odniesieniu do testów produkcji przeciwciał ELISA i ELISPOT w zwierzętach
ND5.5 transfekowanych dawką 2 μg DNA dla 1 mg cząsteczek nośnika. Preparat ten wykazywał równą lub większą wydajność w stosunku do spermidyny/CaCl2; w odniesieniu do danych ELISPOT (kryteria wg Mann-Whitney). Zmierzono końcowy skład preparatu TA201.5.
Tabela 7 ukazuje zakresy pełnego składu zmierzonego dla proszków TA201.5.
PL 212 483 B1
T a b e l a 7
Końcowe pełne składy i zakresy dla TA201.5
Składnik μg/mg proszku Wzór chemiczny, masa cząsteczkowa.
Preparat cząsteczek złota ~1 mg Średnica Aun ~ 2 μιτι
p DNA ~2 około 5-10K par zasad
H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH 0,2-0,8 C24H50N16O5, 642,8 g/mol
*EDTA 4(-) 0,2-1,2 C10H12N2O8, 290 g/mol
D (+)Trehaloza 1,0-4,0 C12H22O11 *2H2O 378,3 g/mol
* EDTA mierzono w stanie 4(-), i podano jako masa tego rodzaju związku (bez sodu, wody lub wodoru, jak widać w F.W. masa na opakowaniu).
Tabela 8 pokazuje materiały które zostały wykorzystane do wyrobu preparatów tetraargininowych.
T a b e l a 8 Materiały
Materiał Dostawca Numer katalogowy
1 2 3
p DNA GSK, Aldevron, PJV, etc. N/A
Tetraarginina BaChem H-4464
Na2EDTA Sigma E-7889
Trehaloza Sigma T-9531
Etanol Spectrum ET107
H2O (do roztworów) R.O.D.I. N/A
Cząsteczki złota 10 k Degussa RDAU010KM
W celu utworzenia TA201,5 przy skali 35 mg złotego proszku zastosowano następującą procedurę:
Sprzęt • Skala, • Wytrząsarka, • Sonikator, • Wirówka, • Probówki Eppendorfa na 2ml, • Pipety na 1 ml, 200 μ|, • Strumień powietrza.
Przygotowanie odczynników
11,3 mg/ml tetraargininy (seria 523352): odważano 0,8 do 1 mg tetraargininy. Dodawano 88,5 μl H2O na mg odważki. Zmienne dla serii z różną zawartością.
Roztwór trehalozy: odważano przynajmniej 30 mg trehalozy (wg listy materiałów dostawcy). Dodawano 120 μl H2O na 30 mg odważki, lub cztery części wody na jedną część trehalozy (w masie lub μ( od 1 mg^l).
500 mM Na2EDTA: zalecany roztwór firmy Sigma (patrz numer katalogowy na liście materiałów). Procedura
Probówka B: probówka B była przygotowana przed dodaniem etanolu i DNA do probówki A. Dodawano roztwór chelatujący, roztwór cukru, roztwór EtOH i tetraargininy. Mocno mieszano przez 10 sekund.
Probówka A: odważano złote kulki do probówki i dodawano roztwory chelatora i cukru. Sonikowano 30 sekund, mocno mieszając przez 1 minutę. Nakraplano EtOH podczas mieszania. Dodawano roztwór DNA. Po dodaniu roztworu DNA łączono zawartość probówki A i B jak opisano poniżej.
Etapy przygotowania preparatu: podczas mieszania przy średniej prędkości probówki A (upewniano się czy złoto miesza się z roztworem) dodawano kroplami zawartość probówki B.
PL 212 483 B1
Po całkowitym dodaniu probówki B do probówki A mocno mieszano przez 1 minutę probówkę A, zawierającą końcowy preparat tetraargininowy. Pozostawiano preparat na 5 minut. Mieszano i wirowano przez 10 sekund. Usuwano pipetą supernatant i zachowywano do analizy. Osad przepłukiwano 250 μl alkoholu etylowego. Mieszano przez 30 sekund i sonikowano przez 3 sekundy. Zwirowywano osad przez 10 sekund i odciągano alkohol etylowy. Ponownie przepłukiwano osad 250 μl alkoholu etylowego. Mieszano przez 30 sekund i sonikowano przez 3 sekundy. Zwirowywano osad przez 10 sekund i odciągano alkohol etylowy. Osad suszono na proszek w strumieniu powietrza o szybkości przepływu 0,5 l/min, przez 2 godziny.
Probówka A • proszek zawierający cząsteczki złota, 35 mg, • EDTA, 26,25 pi, • Trehaloza 70 pi, • Sonikować 30 sek, mieszać 1 min, • EtOH, dodawać kroplami 183,75 pl, mieszając, • DNA 70 pl.
Probówka B • EDTA, 26,25 pl, • Trehaloza 70 pl, • Tetraarginina, 70 pl, • EtOH, 183,75 pl, • Mieszać 10 sek.
Probówka A i B • Dodawano kroplami zawartość probówki B do probówki A mieszając, • Mieszano 1 min, • Pozostawiano na 5 min (aby składniki preparatu się odstały), • Wirowano przez 10 s i usuwano supernatant, • Przepłukiwano alkoholem etylowym, 250 pl, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, wirowano 10 s, usuwano alkohol, • Przepłukiwano alkoholem etylowym, 250 pl, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, wirowano 10 s, usuwano alkohol, • Suszono pod strumieniem powietrza lub azotu przez 2 godziny.
Podczas opracowywania preparatu TA201.5 procedura polegała w pierwszej kolejności na wykonaniu roztworów wyjściowych dla każdego składnika, a następnie na dodawaniu ich do probówek preparatów w odpowiedniej kolejności. Wytwarzanie w czystym pokoju danego preparatu wymaga jednak etapu filtracji. Aby zbadać tę konieczność (NB2334-80), rozpoczęto doświadczenie „mieszaniny wzorcowej. Strategia ta wykorzystuje mieszaniny wzorcowe wszystkich składników wodnych w probówce A (mieszanina wzorcowa A) oraz w probówce B (mieszanina wzorcowa B). Mieszaniny te są następnie sterylizowane za pomocą filtrów strzykawkowych, a przefiltrowany materiał wędruje do probówek, w których przygotowuje się preparat. Doświadczenie mieszanin wzorcowych porównywało proszki wytworzone za pomocą procedury mieszanin wzorcowych oraz procedur standardowych w odniesieniu do stabilności i pełnego s kładu.
T a b e l a 9
Końcowe kompozycje w eksperymencie z mieszaniną wzorcową
Proszek Wydajność DNA (%) Trehaloza (gg/mg) EDTA (gg/mg) ARG4 (gg/mg)
Standardowy-2334-N 96,2 3,2 1,05 0,48
Wzorcowy-2334-M 96,3 3,2 0,97 0,45
PL 212 483 B1
T a b e l a 10
Stabilności wzorców w porównaniu ze standardami
5-21-02, t = 18 dni
Preparat ng OC ng L ng SC Całkowita % SC % SC 60/% SC 4 t 1/2
Standardowy, 4 6,1 0,7 43,5 50,3 86,5
Standardowy, 60 14,5 0,5 23,1 38,1 60,7 0,70 25,3
Wzorcowy, 4 6,3 0,8 49,2 56,2 87,5
Wzorcowy, 60 24,6 1,0 31,5 57,1 55,2 0,63 27,6
Czasy półtrwania w Tabeli 10 zostały wyliczone poprzez uśrednienie wyliczeń dla dwóch czasów półtrwania. Jeden otrzymano na podstawie szybkości rozpadu ng SC (60 w odniesieniu do 4), zaś drugi otrzymano z szybkości rozpadu % SC60 w stosunku do 4).
Ponieważ te dwie procedury dały ten sam produkt końcowy, strategia z użyciem mieszaniny wzorcowej może być uważana, jako nieproblematyczna i może być stosowana do preparatów proszkowych następnych proszków TA201.5. Przeprowadzono dalsze doświadczenia w celu rozstrzygnięcia który etap tego sposobu był krytyczny:
Tok eksperymentu
Preparaty 1-9 wykonano na skalę 70 mg z tych samych roztworów wyjściowych. Mieszaninę wzorcową dla probówki A wykonano poprzez zmieszanie EDTA, trehalozy i roztworów DNA w proporcjach preparatu i przefiltrowano przez strzykawkę. Mieszaninę wzorcową dla probówki B osiągnięto poprzez zmieszanie EDTA, trehalozy i roztworów tetraarginin w proporcjach preparatu i przefiltrowano strzykawką. Preparat 1 otrzymano zgodnie z następującym sposobem:
Przygotowanie odczynników (dla 10, 70 mg prep)
DNA: Roztwory wyjściowe plazmidu i DNA kodującego lucyferazę dostarczono w stężeniu 1 mg/ml. Zmieszano te dwa roztwory DNA przy stosunku objętościowym SC18 do DNA kodującego lucyferazę jak 9:1.
1500 μl SC18 + 166,7 μl DNA kodującego lucyferazę.
11,3 mg/ml tetraargininy: Zważono 20 mg tetraargininy. Dodawano 88,5 μl H2O na mg odważki.
Roztwór trehalozy: Odważano przynajmniej 700mg trehalozy. Dodawano 140 μl H2O na 35 mg odważki, lub cztery części wody na jedną część trehalozy (wagowo lub objętościowo) 500 mM EDTA: Może być użyty roztwór z firmy Sigma (kat. E- 7889).
Stosunki objętościowe w roztworze wzorcowym A: 1500 μl trehalozy, 562,5 μl EDTA, 1500 μl DNA (1 mg/ml)
Filtr strzykawkowy wzornik A
Stosunki objętościowe w roztworze wzorcowym B: 1500 μl trehalozy, 562,5 μl EDTA, 1500 μl tetraargininy
Filtr strzykawkowy wzornik B
Probówka A • 70 mg złoto, • 332.5 μl mieszaniny wzorcowej A, • 367.5 μl EtOH dodawano kroplami mieszając, • Sonikowano 30 s, mieszanie 10 s.
Probówka B • 332,5 μl mieszaniny wzorcowej B, • 367.5 μl EtOH mieszanie 10 s.
Probówka A i Probówka B
Dodawano zawartość probówki B do probówki A kroplami mieszając.
Po całkowitym dodaniu B, mocno mieszano przez 1 minutę Pozostawiano na 5 minut, w celu osadzenia. Mieszano 5 s, następnie zwirowywano przez 10 s, *usuwano supernatant.
Przemywano 500 μl EtOH, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, zwirowywano 10 s, *usuwano supernatant i powtarzano ostatni krok jeden raz.
Suszono osad powietrzem przez 1 godz. Przy 0,5 l/min.
PL 212 483 B1
Sposób ten jest kontrolnym tworzeniem preparatu. Poniższa tabela ukazuje różne warianty sposobów dla proszków 2-9.
Osad suszono pod strumieniem Preparat Wariant Kontro!a
Dodawano B do A 2 Całość B do A jednym strumieniem B do A krop!ami ciągle
3 B do A krop!ami/przerwa 5 s miedzy krop!ami
Mieszano po dodaniu B do A 4 3 minuty mocno mieszano 1 minutę mocno mieszano
5 Nie mieszano, pozwa!ano na osadzanie po dodaniu całości B do A
Czas osadzania 6 10 minut osadzano Osadzano 5 minut
7 Nie osadzano, zwirowywano po minucie mieszania
Liczba płukań 8 4 płukania Przepłukiwano 2 dwa razy
9 Nie płukano, suszono po usunięciu supernatantu
Pozostały preparat stanowił kompozycję, w której zmieniano porządek dodawania komponentów w celu oceny możliwości mieszaniny wzorcowej 1 w tym preparacie. Sposób był podobny do kontrolnego.
Stosunki objętościowe użytych składników w roztworze wzorcowym • 400 μΐ trehalozy, • 150 μΐ EDTA, • 200 μΐ tetraargininy, • Filtr strzykawkowy mieszaniny wzorcowej.
Preparat 10 • 70 mg złota, • 525 μΐ mieszaniny wzorcowej, • 735 μΐ EtOH dodawano kroplami mieszając, • Sonikowano 30 s, mieszano 10 s, • 140 μl DNA nakraplano/powoli (nakraplano w odstępach 5-cio sekundowych), mieszając, • Po całkowitym dodaniu B, mocno mieszano przez 1 minutę, • Pozostawiano na 5 minut, w celu osadzenia, • Mieszano 5 s, zwirowywano przez 10 s i *usuwano supernatant, • Przemywano 500 μΐ EtOH, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, zwirowywano 10 s, *usuwano supernatant ostatni krok powtarzano jeden raz, • Suszono osad pod strumieniem powietrza 0,5 l/min przez 1 godzinę.
Usuwanie płynu z nad osadu po wirowaniu dokonano pipetą na 1000 μΐ w celu usunięcia większości płynu, a pozostałą resztę usuwano za pomocą pipety 200 μΐ. Jak najmniej płynu powinno pozostać na proszku.
* Wszystkie proszki były analizowane pod kątem całkowitej kompozycji, stabilności i ekspresji lucyferazy w komórkach CHO oraz zdjęć żeli.
PL 212 483 B1
T a b e l a 11
Preparaty w eksperymencie odporności procesu
Proszek (Arg)4 (Hg/mg) Trehaloza (Hg/mg) EDTA (Hg/mg)
2334-101-1 0,36 1,56 0,43
2334-101-2 0,32 1,53 0,47
2334-101-3 0,36 1,72 0,46
2334-101-4 0,29 1,64 0,39
2334-101-5 0,22 1,72 0,41
2334-101-6 0,26 1,54 0,41
2334-101-7 0,26 2,13 0,40
2334-101-8 0,26 1,15 0,19
2334-101-9 0,23 4,77 0,99
2334-101-10 0,21 2,25 0,40
T a b e l a 12
Stabilność w 60°C w eksperymencie odporności procesu
Preparat K t 1Z (dni)
1 0,0744 9,31
2 0,0726 9,55
3 0,0781 8,88
4 0,0645 10,75
5 0,0530 13,07
6 0,0735 9,43
7 0,0514 13,50
8 0,0719 9,64
9 0,0241 28,75
10 0,0163 42,61
Powyższe liczby wyliczono za pomocą zmian w nanogramach super zwiniętego DNA od daty preparatu do dnia 13 i dnia 20
Współczynniki i czasy półtrwania były do siebie bardzo zbliżone. Wskazuje to, że proces tworzenia preparatu jest odporny w odniesieniu do stabilności. Preparaty 5 i 7 wykazywały nieco lepsze stabilności niż inne, jednak preparaty 9 i 10 miały zdecydowanie lepszą stabilność (3X). Preparatu 9 nie przemywano (niewykonalne), zaś preparat 10 otrzymano poprzez zmianę kolejności dodawania.
Dane dotyczące ekspresji wskazywały na podobieństwo preparatów (300-400K zliczeń/sekundę). Preparat świeża spermidyna/CaCl2 był bardziej ekspresywny (albo materiał uległ większej ekspresji w czasie analizy komórek), ale był również wyższy jeśli chodzi o uwolnioną masę. Preparaty 10 i 7 wykazywały pewne korzyści w odniesieniu do ekspresji lucyferazy (450-600K zliczeń/sekundę) w stosunku do innych preparatów tetraargininy. Ogólnie, eksperyment udowodnił, że procesy tworzenia preparatów są bardzo odporne.
Innym przejawem odporności jest efekt zmiany kolejności dodawania oraz procesów wykorzystywanych do otrzymania preparatu. W jednym z eksperymentów (NB2251-124) zbadano różne sposoby tworzenia preparatu z dokładnie takich samych materiałów (ilości i stężenia). Eksperyment ten dotyczył jedynie stabilności preparatów, w których zaplanowano wytrącanie składników w różnej kolejności. Prawdopodobnie to mogłoby dawać duże efekty, ponieważ DNA mogłoby być precypitowane bezpośrednio na złoto, przed, jednocześnie lub po stabilizatorach.
PL 212 483 B1
Sposoby tworzenia preparatu
1. Połączenie zawartości probówek A i B. Probówki A i B mają ten sam skład z wyjątkiem tego, że probówka A zawiera DNA, a probówka B zawiera tetraargininę. Obydwie probówki zostały dobrze wymieszane i zawartość probówki B dodano kroplami do probówki A.
2. Połączenie innych probówek A i B. Tym razem do probówki A (ze złotem) dodano etanol wcześniej niż roztwór DNA tak, aby na kulkach złota powstała powłoka wstępna (podkładowa) z nadmiarowych ilości cukru dodanego przed dodaniem DNA. Następnie, DNA dodano do probówki A i natychmiast zawartość probówki B dodano do probówki A.
3. Połączenie to zaprojektowano w celu równoczesnego wytrącania DNA i stabilizatorów. Wszystkie składniki dodano do jednej probówki, z wyjątkiem DNA i etanolu. Następnie, DNA i etanol zmieszano ze sobą i dodawano.
4. Proces strącania DNA przed uprzednim dodaniem etanolu. Wszystkie składniki dodano do jednej probówki z wyjątkiem DNA, tetraargininy i etanolu. Kolejność dodawania składników była następująca: DNA, tetraarginina i etanol
5. Proces był taki sam jak w punkcie 4 z tą różnicą, że tetraarginina była dodana przed DNA. Etanol był dodany na końcu. Preparaty umieszczano w 4 i 60°C inkubatorze i analizowano po 2 tygodniach. Nie uzyskano żadnej różnicy pomiędzy proszkami analizowanymi elektroforetycznie na żelu agarozowym pomimo, że proszki 4 i 5 (etanol dodawany na końcu, kompleksowanie DNA:ARG4 przed dodaniem etanolu) wykazywały nieznacznie większą stabilność.
Opisano nowe cząsteczki opłaszczone kwasem nukleinowym, odpowiednie do dostarczania za pomocą urządzenia do dostarczania cząsteczek, sposób przygotowywania cząsteczek oraz sposoby terapii genowej i immunizacji za pomocą kwasów nukleinowych przy użyciu tych cząsteczek.

Claims (28)

1. Sposób wytwarzania cząsteczek odpowiednich do dostarczania przez urządzenie do dostarczania cząsteczek, znamienny tym, że:
(i) dokonuje się precypitacji kwasu nukleinowego na cząsteczkach nośnikowych z obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwasy nukleinowe i czynnika chelatującego jony metali, przy czym wspomniany czynnik kondensujący kwasy nukleinowe jest homopolimerem argininy o wzorze (Arg)x gdzie x posiada wartość od 2 do 10, lub jego fizjologicznie akceptowalną sól; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że na etapie (i) czynnik kondensujący kwas nukleinowy jest dodawany do mieszaniny, zawierającej cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu oraz kwas nukleinowy.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczki nośnika z obojętnego metalu są wybrane z grupy składającej się z cząsteczek złota, wolframu, platyny i irydu.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że cząsteczki nośnika z obojętnego metalu są cząsteczkami złota o średnicy od 1 do 3 pm.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kwas nukleinowy koduje antygen.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że antygen jest wybrany z grupy składającej się z antygenów wirusowych, bakteryjnych i grzybowych.
7. Sposób według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że kwas nukleinowy koduje polipeptyd terapeutyczny.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kwasem nukleinowym jest DNA.
9. Sposób według zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że homopolimerem argininy jest (Arg)4 lub (Arg)6.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik chelatujący jony metali jest wybrany z grupy składającej się z kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), kwasu dietylenoetriamino penta-octowego (DTPA), kwasu nitrilotrójoctowego (NTA), heksafosforanu inozytolu, tripolifosforanu, kwasu polifosforowego, bursztynianu sodu, bursztynianu potasu, bursztynianu litu, maleinianu sodu, maleinianu potasu, maleinianu litu, desferalu i kwasu etylenodiamino-di-(o-hydroksyfenylooctowego) (EDDHA).
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednego lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
PL 212 483 B1
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jeden lub więcej cukrów jest wybranych z grupy składającej się z trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jeden lub więcej cukrów jest mieszaniną sacharozy i rafinozy.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednej lub więcej soli.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jedna lub więcej soli jest wybrana z octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu i chlorku magnezu.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymywane podczas etapu (i) cząsteczki są doprowadzane do kontaktu z przeciwutleniaczami.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, przeciwutleniacz jest wybrany z etanolu, witaminy A, witaminy C i witaminy E.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że:
(i) dokonuje się precypitacji DNA na obojętnych cząsteczkach złota w obecności wspomnianego homopolimeru argininy lub jego soli, EDTA oraz sacharozy; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
19. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że homopolimerem argininy jest (Arg)4, wspomnianym czynnikiem chelatującym jony metali jest kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), wspomnianym cukrem jest trehaloza.
20. Cząsteczki odpowiednie do dostarczania za pomocą urządzenia dostarczającego cząsteczki, które to cząsteczki otrzymywane są sposobem, jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 19.
21. Cząsteczki, odpowiednie do dostarczania przez urządzenie do dostarczania cząsteczek, które obejmują cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu mające na swojej powierzchni kwas nukleinowy, homopolimer argininy o wzorze (Arg)x, gdzie x posiada wartość od 2 do 10 lub jego fizjologicznie akceptowalną sól i czynnik chelatujący jony metali.
22. Cząsteczki według zastrz. 21, znamienne tym, że zawierają cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu, mające na swojej powierzchni jeden lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
23. Cząsteczki według zastrz. 22, znamienne tym, że wspomnianym cukrem jest trehaloza.
24. Cząsteczki według zastrz. 21 do 23, znamienne tym, że cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu posiadają ponadto na swojej powierzchni jedną lub więcej soli.
25. Pojemnik na dawkę dla urządzenia do dostarczania cząsteczek, przy czym pojemnik zawiera cząsteczki jak zdefiniowano w jednym z zastrz. 21 do 24.
26. Urządzenie do dostarczania cząsteczek załadowane cząsteczkami, jak zdefiniowano w zastrz. 21 do 24.
27. Urządzenie do dostarczania cząsteczek według zastrz. 26, które stanowi bezigłowa strzykawka.
28. Zastosowanie cząsteczek jak zdefiniowano w zastrz. 21 do 24 do wytwarzania urządzenia do dostarczania cząsteczek dla dostarczania tych cząsteczek osobnikowi.
PL375782A 2002-09-27 2003-09-29 Sposób wytwarzania czasteczek, czasteczki odpowiednie do dostarczania, pojemnik, urzadzenie do dostarczania czasteczek i zastosowanie tych czasteczek PL212483B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41409702P 2002-09-27 2002-09-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL375782A1 PL375782A1 (pl) 2005-12-12
PL212483B1 true PL212483B1 (pl) 2012-10-31

Family

ID=32043345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL375782A PL212483B1 (pl) 2002-09-27 2003-09-29 Sposób wytwarzania czasteczek, czasteczki odpowiednie do dostarczania, pojemnik, urzadzenie do dostarczania czasteczek i zastosowanie tych czasteczek

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8349364B2 (pl)
EP (1) EP1545593A1 (pl)
JP (1) JP4791730B2 (pl)
KR (1) KR101152561B1 (pl)
CN (1) CN100542605C (pl)
AU (1) AU2003269213B2 (pl)
BR (1) BR0314751A (pl)
CA (1) CA2500215C (pl)
EA (1) EA010881B1 (pl)
GB (1) GB2410497B (pl)
HK (1) HK1073797A1 (pl)
IL (1) IL167635A (pl)
MX (1) MXPA05003222A (pl)
NZ (1) NZ539107A (pl)
PL (1) PL212483B1 (pl)
WO (1) WO2004028560A1 (pl)
ZA (1) ZA200503380B (pl)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2474822A1 (en) 2003-01-24 2012-07-11 University of Utah Methods of predicting mortality risk by determining telomere length
JP4793956B2 (ja) * 2005-12-29 2011-10-12 ニチコン株式会社 アルミニウム電解コンデンサの駆動用電解液、およびこれを用いたアルミニウム電解コンデンサ
ES2433718T3 (es) 2008-12-22 2013-12-12 University Of Utah Research Foundation PCR multiplex monocromática cuantitativa
GB0918679D0 (en) 2009-10-23 2009-12-09 Iqur Ltd Influenza vaccine
GB0918782D0 (en) 2009-10-26 2009-12-09 St Georges Hosp Medical School A protein as an adjuvant for a vaccine
CA2914555A1 (en) 2013-06-06 2014-12-11 David J Rowlands Single domain antibody display
CN103736090B (zh) * 2014-01-27 2016-03-02 中国医学科学院医学生物学研究所 甲磺酸去铁胺佐剂及含甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗
EP3164156A1 (en) 2014-07-04 2017-05-10 BioNTech AG Stabilised formulations of rna
CN107208145A (zh) 2014-12-30 2017-09-26 端粒诊断公司 多重定量pcr
WO2021061192A1 (en) * 2019-09-29 2021-04-01 Wjwu & Lynn Institute For Stem Cell Research Novel trimethylglycylglycerin compositions and their use in developing anti-cancer drugs and rna vaccines

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5120657A (en) 1986-12-05 1992-06-09 Agracetus, Inc. Apparatus for genetic transformation
KR900007952B1 (ko) 1988-11-18 1990-10-23 주식회사 녹십자 신규의 한탄바이러스 rok84/105 균주 및 이를 이용한 한탄바이러스 백신의 제조방법
US5204253A (en) * 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5149655A (en) 1990-06-21 1992-09-22 Agracetus, Inc. Apparatus for genetic transformation
CA2051092C (en) * 1990-09-12 2002-07-23 Stephen A. Livesey Method and apparatus for cryopreparation, dry stabilization and rehydration of biological suspensions
WO1992020809A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Agracetus, Inc. Method of creating a transformed rice plant
TW360548B (en) 1993-04-08 1999-06-11 Powderject Res Ltd Products for therapeutic use
GB2284208A (en) * 1993-11-25 1995-05-31 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogues with a chelating functionality for metal ions
AU674815B2 (en) 1994-01-21 1997-01-09 Powderject Vaccines, Inc. Gas driven gene delivery instrument
GB9416663D0 (en) 1994-08-17 1994-10-12 Oxford Bioscience Limited Particle delivery
EP0788386B1 (en) 1994-10-24 1999-01-13 PowderJect Research Limited Needleless syringe
GB9426379D0 (en) 1994-12-23 1995-03-01 Oxford Biosciences Ltd Particle delivery
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
DE69732029T2 (de) 1996-04-26 2006-02-23 Merck & Co., Inc. Dna enthaltende impfstoffen
IN184589B (pl) 1996-10-16 2000-09-09 Alza Corp
WO2000002591A1 (en) 1998-07-09 2000-01-20 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine formulations
ES2257879T3 (es) * 1998-11-05 2006-08-01 Powderject Vaccines, Inc. Productos de recombinacion de acido nucleico para inmunizacion genetica.
ATE342089T1 (de) * 1999-06-02 2006-11-15 Boston Scient Ltd Arzneimittelabgabevorrichtungen
EP1282640A2 (en) * 2000-05-01 2003-02-12 Powderject Vaccines, Inc. Nucleic acid immunization
AU6815901A (en) * 2000-06-02 2001-12-17 Zycos Inc Delivery systems for bioactive agents

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200503380B (en) 2007-11-28
IL167635A (en) 2011-07-31
HK1073797A1 (en) 2005-10-21
EA200500546A1 (ru) 2005-10-27
CA2500215A1 (en) 2004-04-08
GB0508549D0 (en) 2005-06-01
GB2410497A (en) 2005-08-03
AU2003269213A1 (en) 2004-04-19
WO2004028560A1 (en) 2004-04-08
GB2410497B (en) 2006-11-22
JP4791730B2 (ja) 2011-10-12
CN100542605C (zh) 2009-09-23
JP2006503063A (ja) 2006-01-26
EP1545593A1 (en) 2005-06-29
CN1694721A (zh) 2005-11-09
US8349364B2 (en) 2013-01-08
NZ539107A (en) 2008-11-28
CA2500215C (en) 2012-02-28
US20060153804A1 (en) 2006-07-13
BR0314751A (pt) 2005-07-26
AU2003269213B2 (en) 2008-11-13
KR20050070008A (ko) 2005-07-05
EA010881B1 (ru) 2008-12-30
MXPA05003222A (es) 2005-07-26
PL375782A1 (pl) 2005-12-12
KR101152561B1 (ko) 2012-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ZA200503380B (en) Nucleic acid coated particles
US20150290132A1 (en) Cell Transport Compositions and Uses Thereof
US6620617B2 (en) Polymeric gene delivery system
JP5560244B2 (ja) 医薬組成物
EP1335661B1 (en) Production of microspheres
TW555569B (en) Biodegradable microparticles for the sustained delivery of therapeutic drugs
AU2005209318B2 (en) Functionalized colloidal metal compositions and methods
EP2409686A1 (en) Cell transport compositions and uses thereof
JP2003528024A (ja) 製剤化された核酸分子の無針注入
AU2002220002A1 (en) Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
EP1353701A2 (en) Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
AU2007200363B2 (en) Colloidal metal compositions and methods
CA2700378A1 (en) Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods
WO1998010750A2 (en) Nucleic acid particle delivery
JP2002538195A (ja) 生物活性化合物の持続放出用の無針注射器を使用する微粒子製剤の送達
US20220370488A1 (en) Mucus penetrating particle compositions and methods of use thereof enhancing immune response
CN108743568B (zh) 用于降低气道高反应性的抗ngf抗体缓释微球及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification