CN107208145A - 多重定量pcr - Google Patents

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Abstract

公开了用于在针对每种靶核酸使用单独检测标记的单个孔中通过计算相对于第二靶核酸和第三靶核酸的平均丰度(S)的第一靶核酸的丰度(T)来确定第一靶核酸的平均长度或丰度的方法和组合物。在各个方面，第一靶核酸为端粒。在示例性方面，所公开的方法和组合物可用于确定生物样品的平均端粒长度。使用所公开的方法和组合物确定的平均端粒长度可以与多种临床上重要的病状和指标相关联。本摘要意欲作为搜索工具以在特定领域进行检索，而并不意欲限制本发明。

Description

多重定量PCR
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年12月30日提交的美国临时申请号62/098,057和于2015年5月19日提交的美国临时申请号62/163,434的权益，每个所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
对通过EFS-WEB以文本文件提交的序列表的引用
以名为“37502.0004U3_ST25.txt”的文本文件于2015年6月22日提交的序列表(于2015年6月22日创建并具有5,057字节大小)依据美国法典第37篇第1.52条(e)款(5)以引用的方式并入本文。
发明背景
背景中的叙述不一定意味着认可所引用参考文献中的特征。
端粒即真核生物染色体的尖端保护染色体免于溶核退化、末端-末端融合(end-to-end fusion)和重组。端粒是在染色体末端的结构，其特征为核苷酸序列(5'-TTAGGG-3')n的重复序列。端粒由于正常的细胞***而缩短并且非常短的端粒导致细胞衰老或细胞凋亡。过去十年中在人类中的丰富的流行病学和临床研究已将短端粒长度与年龄相关疾病的高风险和全因死亡率联系起来(Puterman，E.和E.Epel，Soc Personal PsycholCompass，2012.6(11)807-825；Zhu，H.，M.Belcher和P.van der Harst，Clin Sci(Lond)，2011.120(10)427-40；以及Fyhrquist，F.和O.Saijonmaa.Ann Med，2012.44增刊1S138-42)。遗传、环境、生活方式和行为因素共同影响端粒长度。因此，端粒长度已成为总体健康、疾病和死亡风险的指标。
虽然平均端粒长度在几乎所有公布的临床研究中被测量并且已在分层患者疾病和死亡风险方面展示出效用，但是最近在小鼠中的工作也已显示短端粒群体是衰老或细胞凋亡的触发信号(Hemann，M.T.等人Cell，2001.107(1)67-77)，并且由此是疾病和死亡风险的触发信号。在由Hemann等人报告的研究中，将具有短端粒的第6代端粒酶RNA敲出小鼠(mTR-/-G6)与具有长端粒的端粒酶杂合型小鼠(mTR+/-)进行杂交。尽管端粒酶缺失后代的端粒中的一半是长的，但是其表型反映mTR-/-母本的表型，这表明短端粒的数量而非平均端粒长度对于细胞活力和染色体稳定性是关键的。在服用天然产物来源的端粒酶激活剂的人中，在白细胞中检测到短(<3或<4kbp)端粒的百分比显著降低(如通过定量FISH技术测定的；参见(Canela，A.等人Proc Natl Acad Sci USA，2007.104(13)5300-5)，但是未看到平均端粒长度的变化(Harley，C.B.等人，Rejuvenation Res.2011.14(1)45-56)。因此短端粒丰度百分比的变化被预期为生活方式和药物或其他干预对端粒的影响的更灵敏量度。另一项研究(Vera等人,“The Rate of Increase of Short TelomeresPredicts Longevity in Mammals”，Cell Reports(2012)，world wide web URL：dx.doi.org/10.1016/.celrep.2012.08.023)发现“短端粒丰度的增加速率是寿命的预测指标”。
已开发用于测量端粒长度的各种方法，包括DNA印迹(Kimura，M.等人，NatureProtocols，2010，5:1596-1607)、Q-FISH(Rufer，N.等人，Nat.Biotechnol.，1998，16:743-747)、流式FISH(Baerlocher，G.M.等人，Cytometry，2002，47:89-99)、Q-FISH测定的高通量改良型(HTQ-FISH；参见Canela，A.等人，PNAS，2007，104：5300-5305)、双标记着丝粒和端粒FISH(Cen/Tel FISH)(Vander Griend D.L等人Prostate 2009年10月1日；69(14)：1557-64.doi：10.1002/pros.21001)、斑点印迹(Kimura M.Aviv A.2011NAR)以及qPCR(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47；和Cawthon RM.Nucleic Acids Res.2009，37(3):e21)。
q-PCR-端粒长度(qPCR-TL)测定了用单拷贝基因归一化的平均端粒丰度，表达为T/S比。为了将T/S比转换为bp数的绝对长度即端粒限制性片段长度(TRF)，已报道了各种方法。例如，先前报道这种转换可通过DNA印迹分析确定并且与T/S比进行比较(Cawthon，同上)。获得线性回归公式并且基于其T/S比使用所述线性回归公式计算未知样品的TRF长度。关于这种转换的一个重要问题是TRF在其着丝粒端部含有非端粒序列的区域(子端粒序列)。因为子端粒序列的长度在个体之间不同，所以基于TRF从T/S比转换的bp仅是近视值。
因此，尽管在用于简便地确定相对端粒长度或丰度的材料和方法方面有所进展，但是仍需要用于确定受试者的端粒长度或丰度相比于适当的对照群体的差异的改进方法和材料。具体地，仍然需要以高准确度确定受试者的相对端粒长度或丰度的差异，以便改善那些相同受试者的临床评估和/或治疗方案。本发明满足这些需求和其他需求。
发明概要
根据如本文呈现和广义所述的本发明目的，在一方面，本发明涉及用于在针对每种靶核酸序列利用不同的检测标记的单一qPCR多重反应中确定至少三种靶核酸序列的平均长度或丰度的方法和组合物。在一方面，三种靶核酸序列中的一种是端粒序列并且另两种靶核酸序列是已知很少发生拷贝数变异的不同的低拷贝数基因。在另一方面，平均端粒长度或丰度与另两种核酸序列的平均丰度的平均值的比，即T/S比可以用于使平均端粒长度或丰度与临床风险或优化的治疗方案相关联。在再另一方面，低拷贝数基因是单拷贝基因。
公开了用于确定平均端粒长度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸与第一引物组接触、使第二靶核酸与第二组引物组接触并且使第三靶核酸靶标与第三引物组接触；(i)其中第一引物组包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物组包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物组包括第三正向引物和第三反向引物；并且(iv)其中第一靶核酸包含端粒重复序列；(b)通过聚合酶链式反应用第一引物组选择性地扩增第一靶核酸以形成第一扩增子、用第二引物组选择性地扩增第二靶核酸以形成第二扩增子，并且用第三引物组选择性地扩增第三靶核酸以形成第三扩增子；(c)确定聚合酶链式反应的一个或多个循环过程中的第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的量；(i)其中使用第一检测标记检测第一扩增子；(ii)其中使用第二检测标记检测第二扩增子；并且(iii)其中使用第三检测标记检测第三扩增子；并且(d)确定第一扩增子的平均长度或丰度。
还公开了用于同种异体移植造血干细胞供体选择的方法，所述方法包括：(a)从一名或多名HLA匹配的潜在供体受试者获得样品；(b)通过所公开的方法确定每名HLA匹配的供体受试者的第一扩增子的平均长度或丰度；(c)鉴定出具有比年龄匹配的对照高25个百分位数的第一扩增子平均长度或丰度的一名或多名供体受试者；(d)从鉴定出的供体受试者获得可移植的造血干细胞样品；并且(e)将造血干细胞样品移植到受体受试者。
还公开了用于再分级心血管疾病风险的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品，其中受试者已被诊断为符合针对低强度他汀类疗法的2013ACC/AHA治疗血液胆固醇之指南标准；(b)通过所公开的方法确定样品中的第一扩增子的平均长度或丰度；(c)当样品被确定出具有比年龄匹配的对照低25个百分位数的第一扩增子平均长度或丰度时将受试者诊断为处于较高的心血管风险下；并且(d)向被诊断为处于较高的心血管风险下的受试者施用以下项：(i)修改的他汀类疗法；和/或(ii)已知用于治疗心血管疾病的第二治疗剂。
虽然可以用特定的法定类别(诸如***法定类别)对本公开的方面进行描述和要求保护，但这仅是为了方便，并且本领域技术人员将理解到可以用任何的法定类别对本公开的各方面进行描述和要求保护。除非另外明确说明，否则决不意图将本文陈述的任何方法或方面解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求项在权利要求书或说明书中没有具体陈述各步骤限于特定顺序的情况下，绝非意图指在任何方面推断顺序。这适用于任何可能的用于解释的非表达基础，包括相对于步骤安排或操作流程的逻辑事项、从语法组织或标点符号得到的清晰含义、或者在说明书中描述的方面的数量或类型。
附图简述
并入本说明书且构成其一部分的附图说明了若干个方面，并连同描述一起用于解释本发明的原理。
图1A-图1C示出用于扩增靶序列的代表性的示意性方案。图1A示出扩增的第一循环。简而言之，TelG修饰型引物(“Tel G修饰型”)沿天然端粒结合在多个端粒位点，而TelC修饰型引物(“Tel C修饰型”)不能沿天然端粒位点结合，这是由于Tel C修饰型引物的3'末端处的失配。因此，Tel G修饰型延伸产物的丰度与C链端粒DNA的丰度成正比。图1B显示TelG修饰型引物和Tel C修饰型引物不能形成引物二聚体，这是由于特别是在每种引物的3'末端处的失配。来自无模板对照(NTC)的数据证实在不存在端粒DNA时这些引物不扩增。图1C示出扩增的第二循环。简而言之，在第一扩增循环1中由Tel G修饰型引物合成的多种延伸产物提供针对Tel C修饰型引物的结合位点。结合的Tel C修饰型引物可被延伸至来自第一扩增循环通过Tel G修饰型引物引发的延伸产物的5'末端。因此，在第3循环以及后来循环中，优先扩增86bp双链体。这种扩增子的丰度被设计为与基因组DNA样品中的双链端粒DNA的丰度成正比。
图2A-图2F显示在人基因组靶DNA(嵌合型(mosaic)男性基因组DNA)存在下使用的B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的扩增的代表性的解链曲线数据。Tel G修饰型引物和Tel C修饰型引物的浓度如图中所指示那样变化。B2M-F和B2M-R引物的浓度在300nM处保持恒定，并且B2M探针以100nM的浓度存在。
图3A-图3C示出针对人基因组靶DNA(嵌合型男性基因组DNA)、RNA酶P基因和β2-微球蛋白基因的交点(“Cp”)相对于靶DNA的log(浓度)的代表性线性回归线，所述人基因组靶DNA包含针对端粒序列的靶核酸序列。使用Roche LC480 Light Cycler仪器的二阶导数程序计算Cp。图3A示出针对使用Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的端粒靶核酸的Cp相对于log(浓度)的曲线。图3B示出针对使用RNAP-F和RNAP-R引物的RNA酶P靶核酸的Cp相对于log(浓度)的曲线。图3C示出针对使用B2M-F和B2M-R引物的β2-微球蛋白靶核酸的Cp相对于log(浓度)的曲线。在上述中，log(浓度)措辞中使用的浓度的单位为ng/μL。
图4A-图4C示出使用人基因组靶DNA(嵌合型男性基因组DNA)进行的扩增反应的代表性扩增曲线。图4A示出使用Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的扩增曲线。如图4A中所示，端粒DNA通常在20-25的Cp范围内扩增产生显著信号(荧光信号>25单位)，而NTC基本上示出背景噪音(荧光单位低于1，甚至在30个循环或更多个下)。这表明在整个qPCR扩增的相关循环中不存在非特异性扩增。图4B示出使用RNAP-F和RNAP-R引物的扩增曲线。图4C示出使用B2M-F和B2M-R引物的扩增曲线。
图5A-图5C示出来自在人基因组DNA不存在下使用进行的扩增反应(即无模板对照反应)的代表性扩增曲线。图5A示出在靶基因组DNA不存下使用Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的扩增曲线。需注意，基本上不存在任何DNA的扩增，直到第30循环之后。图5B示出使用RNAP-F和RNAP-R引物的扩增曲线。图5C示出使用B2M-F和B2M-R引物的扩增曲线。
图6A示出在对来自研究受试者的163个独立样品进行的反应中使用B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的情况下，使用所公开的方法确定的T/S比的代表性直方图。T/S比通过使来自qPCR反应的端粒DNA扩增子的浓度除以来自qPCR反应的RNA酶P和β2-微球蛋白扩增子的平均浓度来确定，其中所有三种扩增子在单一反应孔中。图示出T:S比的对数正态分布，如对端粒长度的分布所预期的。图6B示出在对来自健康研究参与者的163个样品进行的反应中使用B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的情况下，使用所公开的方法确定的T/S比相对于年龄的代表性图。
图7A示出测定间CV值相对于T/S比的代表性图。在对来自健康研究参与者的163个样品进行的反应中使用B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的情况下，使用所公开的方法确定的T/S比。数据显示，所公开的三重qPCR测定的针对板间变异的中值CV为约1.5％，其显著低于旧型式的单色测定或单色多重测定的中值CV(通常在5％范围内或更高)。
图7B显示针对获自163个研究受试者样品的结果的测定间CV相对于T:S比的代表性直方图。在使用B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的情况下使用所公开的方法获得用于确定测定间CV的数据。数据表明测定间CV不是T:S比的函数，换句话讲，测定间CV不随端粒长度增大或减小。
图8A示出使用9个研究受试者样品获得的针对T/S比的测定内CV估计值，所述受试者样品由三个独立的操作器在不同的5天中的每一天以每天一式三份进行分析用于实验确定。CV使用随机效应模型计算，其中“样品运行”是模型中的随机效应。在使用B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的情况下使用所公开的方法确定T/S比。针对T:S比的测定内CV(技术复制品即理论上相同的样品之间的变异系数)为2-3％。
图8B示出使用9个患者样品获得的针对T/S比的测定间CV估计值(即板间变异)，所述患者样品由三个独立的操作器在不同的5天中的每一天以每天一式三份进行分析用于实验确定。CV使用随机效应模型计算，其中“样品运行”是模型中的随机效应。在使用B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的情况下使用所公开的方法确定T/S比。数据显示非常低的CV(在不同的5天内使用3个不同的操作器的情况下不同天的样品轮次变异性为大约0-2.5％)。据我们所知，这是对于ATL曾经报道的最低板间CV。
图8C示出使用相同的9个患者样品获得的针对T/S比的总CV估计值，所述受试者样品由三个独立的操作器在不同的5天中的每一天以每天一式三份进行分析用于实验确定。CV使用随机效应模型计算，其中“样品运行”是模型中的随机效应。在使用B2M-F、B2M-R、RNAP-F、RNAP-R、Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的情况下使用所公开的方法确定T/S比。数据显示总测定CV在2-4％的范围内。
图9示出8点标准曲线，其具有Y3-质粒克隆(含有包含135bp端粒DNA的286个扩增子的质粒(SEQ ID NO：12)，Y3克隆)的3倍系列稀释点。基于标准曲线的斜率的qPCR效率为91.6％+/-6％标准偏差(4个测量值的平均值)。R2线性大于0.99。
图10示出作为T/S比的函数的平均端粒长度(千碱基对，“kbp”)曲线，所述平均端粒长度使用作为标准物的Y3-质粒克隆和本文所述的本公开的三重qPCR测定来确定。回归线的斜率为2.46，表明基于这种方法，一个T:S单位代表2.46kbp。三个数据点来自代表低等端粒长度、中等端粒长度和高等端粒长度的3个质量控制样品的分析。
图11示出针对来源于单一细胞系(UMUC-3膀胱癌系)的5个样品的作为T/S比的函数的平均端粒长度(kbp)曲线，所述样品通过用端粒(hTER)的RNA亚基转染细胞系而经历端粒延伸。使用本文所述的本公开的三重qPCR测定来确定平均端粒长度。端粒长度从大约2.8kbp的初始值增加至4.6kbp，其中在基线和细胞培养过程中的4个另外的点处收集数据。回归线的斜率为2.59，表明基于这种方法，一个T:S单位代表2.59kbp。
图12示出作为T:S比的函数的平均端粒长度(kbp)曲线，所述平均端粒长度使用DNA印迹方法测定。基于这种比较，在回归线斜率为2.15的情况下，一个T:S单位代表2.15kbp。用于这种比较的样品与用于图11的那些相同。
图13A-13D示出比较了在使用下述引物的情况下使用本文所述的本公开三重qPCR测定对典型端粒重复序列(CCCTAA)15的扩增的数据：使用Tel lb和Tel 2b引物(分别为SEQID NO：20和21)或使用Tel G修饰型和Tel C修饰型引物(分别为SEQ ID NO：1和2)。含有Tellb和Tel 2b引物的反应在图中用“TT”指示，并且含有Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的反应在图中用“ATL”指示。图13A示出针对在含有1X DNA(1.67ng/μL)的反应中的每种引物获得的结果，而图13B处于相同条件下，不同的是使用7X DNA(11.69ng/μL)。图13C和图13D示出分别使用图13A和图13B中的数据计算的平均端粒浓度。
图14A-14C示出以上针对图13A-13D所述的实验类似的实验。扩增反应在相同条件下进行，不同的是靶模板是富含G的靶序列(CCCTCA)15。含有Tel lb和Tel 2b引物的反应在图中用“TT”指示，并且含有Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的反应在图中用“ATL”指示。图14A示出针对在含有1X DNA(1.67ng/μL)的反应中的每种引物获得的结果，而图14B处于相同条件下，不同的是使用7X DNA(11.69ng/μL)。图14C示出使用图14A和图14B中的数据计算的平均端粒浓度。
图15A-15C示出与以上针对图13A-13D所述的实验类似的实验。扩增反应在相同条件下进行，不同的是靶模板是富含G的靶序列(CCCTGA)15。含有Tel lb和Tel 2b引物的反应在图中用“TT”指示，并且含有Tel G修饰型和Tel C修饰型引物的反应在图中用“ATL”指示。图15A示出针对在含有1X DNA(1.67ng/μL)的反应中的每种引物获得的结果，而图15B处于相同条件下，不同的是使用7X DNA(11.69ng/μL)。图15C示出使用图15A和图15B中的数据计算的平均端粒浓度。
图16示出获自在Cawthon 2002测定和本文所述的本公开三重qPCR测定中测试的311个正常人全血样品的T/S比数据的QQ绘图。在两次测定中获得的T/S比之间的关系的最佳拟合方程为：Y＝1.13x-0.06，其中R2＝0.81。
本发明的另外的优点将部分陈述在以下描述中，并且部分将从所述描述中看出或者可通过实践本发明来得知。本发明的优点将借助所附权利要求书中具体指出的元件和组合来实现并达成。要理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。
具体实施方案
通过参考以下发明详述和其中包括的实施例可以更容易理解本公开。
为了公开和描述公布在引用时所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用方式并入本文。提供本文中讨论的公布仅仅是针对它们在本申请的提交日期之前的公开。本文中的任何内容都不应解释为承认本公开内容由于先前的发明而无权早于所述公布。此外，本文中提供的公布日期可能不同于实际的公布日期，它们可能需要单独确认。
如在本说明书和权利要求书中所用的术语“包含(comprising)”可以包括“由其组成”和“基本上由其组成”的方面。
如本文所用的对于包括有机化合物的化合物的命名法可使用常见名称、IUPAC、IUBMB或CAS关于命名法的推荐给出。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。在本说明书和以下权利要求书中，将参考将在本文中定义的许多术语。
如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式的“一个”、“一种”(a,an)以及“所述”(the)除非上下文另外清楚地指明，否则包括复数对象。因此，例如，关于“一种细胞”、“一种核苷酸”或“一种引物”包括两种或更多种此类细胞、核苷酸或引物等的混合物。
在本文中，范围可表达为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体值。当表示这样一个范围时，另外的方面包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，将理解的是特定值形成了另外方面。应进一步理解，该范围的每个端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是有意义的。还应理解，本文公开了多个值，并且在本文中每个值除所述值本身之外也公开为“约”所述特定值。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。还理解的是还公开了两个具体单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
如本文所用的术语“约”和“在或约”意指所讨论的量或值可以是指定近似或约相同的一些其他值的值。一般应当理解，如本文所用，除非另外指出或推测，否则标称值指示±10％的变化。所述术语旨在传达类似的值促进权利要求书中所叙述的相等结果或作用。即，应了解，量、大小、公式、参数和其他数量和特征不是且不必是确切的，而是可以是近似值和/或根据需要更大或更小，以反映容差、转换因子、四舍五入、测量误差等和本领域技术人员已知的其他因素。一般来讲，量、大小、公式、参数或其他数量或特征为“约”或“近似”，无论是否进行此类明确表述。应了解，除非另外特别说明，否则当“约”用在定量值前时，所述参数还包括特定的定量值本身。
说明书和最后的权利要求书中提及的组合物中的特定元素或组分的重量份表示组合物或制品中的所述元素或组分与任何其他元素或组分之间的重量关系，用重量份表示。因此，在包含2重量份的组分X和5重量份的组分Y的化合物中，X和Y以2:5的重量比存在，并且以这个比例存在而不管所述化合物中是否包含另外的组分。
除非特意相反地陈述，否则组分的重量百分比(重量％)是基于其中包含所述组分的制剂或组合物的总重量。
如本文所用的术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且这种描述包括其中所述事件或情况发生的实例和其中不发生的情况。
如本文所用的术语“有效量”是指足以实现组合物或方法的物理、化学或生物特性的所需改变的量。
如本文所用，“试剂盒”意指构成所述试剂盒的至少两种组分的集合。所述组分共同构成用于给定目的的功能单位。个别成员组分可以物理方式包装在一起或分开包装。例如，包括试剂盒的使用说明书的试剂盒可以物理方式包括或不包括与其他个别成员组分一起的说明书。相反地，说明书可以作为单独的成员组分，以纸张形式或可以提供在计算机可读存储装置上或从互联网网站下载的电子形式，或作为记录演示来提供。
如本文所用，“说明书”意指描述关于试剂盒的相关材料或方法的文件。这些材料可以包括以下项中的任何组合：背景信息、组分列表和其可用性信息(购买信息等)、试剂盒的简明或详细使用方案、问题解决、参考、技术支持和任何其他相关文件。说明书可以与试剂盒一起提供或作为单独的成员组分，以纸张形式或可以提供在计算机可读存储装置上或从互联网网站下载的电子形式或作为记录演示来提供。说明书可以包括一个或多个文件，并且意图包括未来的更新。
如本文所用的术语“受试者”可以是脊椎动物(如哺乳动物)、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文所公开的方法的受试者可以是人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、奶牛、猫、豚鼠或啮齿类动物。所述术语不指示特定年龄或性别。因此，用以包含无论雄性还是雌性的成年和新生的受试者以及胎儿。一方面，受试者是哺乳动物。患者是指受病状、疾病或病症折磨的受试者。术语“患者”包括人类和兽类受试者。在所公开的方法的一些方面中，已经诊断出受试者需要治疗与端粒长度改变相关联的一种或多种病症或疾病。例如，患有特定临床病状的受试者可含有具有下述染色体的细胞，所述染色体具有由端粒酶活性的功能障碍所导致的改变的端粒长度。在此类病状中，端粒酶活性的功能障碍导致非常短的端粒(“端粒疾病”)。
本文所用的术语“治疗”是指医学管理患者旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理病状或病症。该术语包括积极治疗，即治疗直接具体针对疾病、病理病状或病症的改善；以及包括病因治疗，即治疗针对于去除相关疾病、病理病状或病症的病因。另外，这个术语包括舒减治疗，即治疗设计用来减轻症状，而不是治愈疾病、病理病状或病症；预防性治疗，即治疗针对于使相关疾病、病理病状或病症的发展减到最小或部分或完全抑制相关疾病、病理病状或病症的发展；和支持治疗，即治疗用以补充针对改善相关疾病、病理病状或病症的另一特定疗法。在各个方面，所述术语涵盖受试者包括哺乳动物(例如人)的任何治疗，并且包括：(i)预防疾病在可能易于感染疾病但尚未诊断出患疾病的受试者中发生；(ii)抑制疾病，即阻止其发展；或(iii)减轻疾病，即使疾病消退。在一方面，所述受试者为哺乳动物，诸如灵长类动物，且在另一方面，所述受试者为人类。术语“受试者”也包括驯养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。
本文所用的术语“预防”是指特别是通过预先措施来排除、避开、避免、防止、阻止或妨碍某事发生。应了解，在本文使用降低、抑制或预防的情况下，除非另外具体指出，否则也明确公开了使用另外两个词语。
本文所用的术语“施用”是指向受试者提供药物制剂的任何方法。此类方法对于本领域技术人员而言是熟知的并且包括但不限于口服、经皮施用、经吸入施用、鼻施用、局部施用、叶鞘内施用、眼科施用、耳内施用、脑内施用、直肠施用、舌下施用、颊部施用和肠胃外施用，包括可注射施用，诸如静脉内施用、动脉内施用、肌肉内施用和皮下施用。施用可连续或间歇进行。在各种方面，制剂可治疗性施用，即，施用用以治疗现有疾病或病状。在其他各种方面，制剂可预防性施用，即，施用用以预防疾病或病状。
本文所用的术语“有效量”和“有效的量”是指足以实现所需结果或足以对不想要的病状起作用的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现所需治疗结果或对不想要的症状起作用、但通常不足以引起不利的负面作用的量。对于任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正治疗的病症、病症严重程度；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间；施用路径；所用特定化合物的***速率；治疗持续时间；组合或与所用特定化合物同时使用的药物和医学技术中熟知的类似因素。例如，以低于实现所需治疗作用所需要的水平开始将化合物给药并逐渐增加剂量直至实现所需作用完全在本领域的技术之内。如果需要，那么可将有效日剂量分成多剂量以便于施用。因此，单剂量组合物可含有构成日剂量的所述量或其约数。如果有任何禁忌症，那么剂量可由个别医师调节。剂量可变化，并且可以每日一个或多个剂量施用来施用，历时一天或几天。关于给定类别药物产品的适当剂量，指导可发现于文献中。在其他各种方面，制剂可以“预防有效量”施用；即以有效预防疾病或病状的量施用。
如本文所用，“延伸引物”意指用于进行由DNA聚合酶进行的限时延伸反应步骤的寡核苷酸引物。延伸引物可以包含3'部分和5'部分。例如，3'部分可以在退火条件下与3'突出中的端粒重复序列杂交，并且5'部分可以具有在退火条件下不与3'突出中的端粒重复序列杂交的锚定序列。
如本文所用，“端粒区域”意指位于染色体末端处的具有重复端粒序列(TTAGGG:CCCTAA重复序列)的双链DNA区段。
如本文所用，“子端粒区域”意指位于端粒的着丝粒侧处的紧邻端粒的DNA区段。子端粒区域常常含有简并的端粒重复序列。在人的情况下，TGAGGG和TCAGGG的重复序列可以存在于子端粒区域中。
如本文所用，“锚定序列”意指引物内的独特序列区段，其不存在于可以用于PCR反应中的模板基因组中或存在于预期扩增子的20kb内。例如，延伸引物的5'部分可以是锚定序列，所述锚定序列被配置成在退火条件下不与G链中的端粒重复序列(其与延伸引物的3'部分杂交)杂交并且不与20kb端粒重复序列内的模板序列中的任何其他序列杂交。
如本文所用，“染色体DNA的G链”意指具有3'突出的端粒的链，并且包含端粒重复序列5'-TTAGGG-3'。例如，“染色体DNA的G链”可以是指包含人和其他脊椎动物中的(TTAGGG)n端粒重复序列的染色体中的DNA链。
如本文所用，“染色体DNA的C链”意指与染色体DNA的G链互补的链，并且包含人和其他脊椎动物中的(CCCTAA)n端粒重复序列。
如本文所用，“嵌合组成物基因组DNA”意指为包含个别供体DNA样品的合并样品的基因组DNA。所述池包含获自至少两名不相关的样品供体的个别样品。通常，嵌合组成物基因组DNA为包含获自约50-100名个别不相关的样品供体的单个基因组DNA样品的合并样品。在一些情况下，个别不相关的样品供体具有单一性别，例如嵌合组成物基因组DNA仅获自个别不相关的男性供体。在其他情况下，个别不相关的样品供体来自两种性别。“嵌合组成物基因组DNA”可以与其他术语“嵌合型模板DNA”、“嵌合型基因组DNA”、“嵌合型DNA”等互换使用。
如本文所用，“聚合酶”是指催化核苷酸的聚合的酶。一般来讲，酶将在与核酸模板序列退火的引物的3'末端处引发合成。“DNA聚合酶”以序列特异性方式催化脱氧核糖核苷酸的聚合，从而补充与引物退火产生双链DNA分子的核酸。已知的DNA聚合酶包括例如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶(Lundberg等人，(1991)Gene 108:1)、大肠杆菌DNA聚合酶I(Lecomte和Doubleday(1983)Nucleic Acids Res.11:7505)、T7DNA聚合酶(Nordstrom等人(1981)J.Biol.Chem.256:3112)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶(Myers和Gelfand(1991)Biochemistry 30:7661)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶(Stenesh和McGowan(1977)Biochim BiophysActa 475:32)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)DNA聚合酶(也称之为VentDNA聚合酶，Cariello等人(1991)Nucleic Acids Res 19:4193)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)(Tma)DNA聚合酶(Diaz和Sabino(1998)Braz J.Med.Res 31:1239)，和水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Chien等人，(1976)J.Bacteoriol 127:1550)。任一上述酶的聚合酶活性可通过本领域熟知的手段来确定。
如本文所用，“热稳定的”DNA聚合酶活性意指相较于例如DNA聚合酶的非热稳定形式，对热相对稳定且在高温例如45-100℃，优选55-100℃、65-100℃、75-100℃、85-100℃或95-100℃下发挥作用的DNA聚合酶活性。
如本文所用，“引物”是指在诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，例如在四种不同的三磷酸核苷和延伸用试剂(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)的存在下，在适当的缓冲液中和合适的温度下能够作为DNA合成的起始点的寡核苷酸。引物不必反映模板核酸的确切序列，但是必须充分互补以与模板杂交。适用于扩增给定靶序列的引物的设计在本领域中是熟知的并且描述于本文所引用的文献中。
如本文所用，术语“靶标、“靶序列”、“靶区域”和“靶核酸”是同义的并且是指待扩增或检测的核酸的区域或子序列。
如本文所用，术语“杂交”是指两个单链核酸由于互补碱基配对而形成双链体结构。杂交可以在完全互补的核酸链之间或在含有少数错配区域的“大体上互补”的核酸链之间发生。使得只有完全互补的核酸链才会杂交的条件被称作“严格杂交条件条件”或“序列特异性杂交条件”。大体上互补的序列的稳定双链体可以在不太严格的杂交条件下实现；可以通过适当地调节杂交条件来控制可接受的错配度。核酸技术领域的技术人员可以根据由本领域所提供的指导凭经验确定双链体稳定性，这考虑到许多变量包括例如寡核苷酸的长度和碱基对组成、离子强度和错配碱基对的发生率(参见，例如Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning—A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.)；和Wetmur(1991)Critical Review in Biochem.and Mol.Biol.26(3/4):227-259；两个文献均以引用的方式并入)。
术语“扩增反应”是导致模板核酸序列的拷贝的增加或导致模板核酸的转录的任何化学反应，包括酶促反应。
聚合酶链式反应(PCR)是允许较长双链DNA分子内的DNA序列的指数扩增的方法。PCR需要使用一对引物，所述一对引物与DNA的两条链中的每一条上的限定序列互补，其中一种引物与一条链互补，另一种引物与靶序列的另一条链互补。这些引物通过DNA聚合酶延伸，使得拷贝由指定序列组成。在形成这种拷贝后，可以再次使用相同的引物，不仅形成input DNA链的另一个拷贝，而且形成在第一轮合成中形成的短拷贝(PCR扩增子)的拷贝。这导致对数扩增。因为需要在每一轮的扩增过程中提高温度以分离双链DNA的两条链，所以一个重要的进步是发现了从水生栖热菌(Thermus aquaticus)(一种在热水池中生长的细菌)分离出的热稳定性DNA聚合酶(Taq聚合酶)；因此不需要在每一轮扩增中加入新的聚合酶。在若干(常常为约20至40)轮扩增后，将PCR产物在琼脂糖凝胶上分析且其丰度足以利用DNA嵌入或结合染料，例如溴化乙锭、Green或染料检测。
应了解，实时PCR(又称作定量实时PCR(qRT-PCR))、定量PCR(Q-PCR/qPCR)或动态聚合酶链式反应是基于PCR的实验室技术，用于扩增且同时定量靶DNA分子。qPCR允许检测和定量DNA样品中的特定序列(作为拷贝的绝对数或当归一化至DNA input或另外的归一化基因时作为相对量)。
如本文所用，如果当在足够严格的条件下使用时引物主要只与靶核酸杂交，则引物对靶序列具有“特异性”。通常，如果引物-靶双链体稳定性大于在引物与样品中发现的任何其他序列之间形成的双链体的稳定性，则引物对靶序列具有特异性。本领域技术人员将认识到各种因素诸如盐条件以及引物的碱基组成和错配的位置将影响引物的特异性，并且在大多数情况下将需要引物特异性的常规实验确认。可以选择使得引物可以只与靶序列形成稳定双链体的杂交条件。因此，在适当严格的扩增条件下使用靶特异性引物使得能够进行包含靶引物结合位点的那些靶序列的特异性扩增。使用序列特异性扩增条件使得包含完全互补的引物结合位点的那些靶序列的特异性扩增。
术语“Tm”意指核酸双链体的解链温度或退火温度，在特定条件下在所述温度下一半的碱基对发生解离。核酸技术领域的技术人员可以凭经验确定双链体稳定性，这考虑到许多变量包括例如寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸的序列、离子强度和错配碱基对的发生率。如本文所用，“预测的Tm”意指预测引物和其互补模板序列足以稳定来允许通过PCR进行杂交和延伸所处于的温度，并且可使用最小距离算法来确定(Von-Ahsen N等人(1999)Clinical Chemistry，45(12):2094-2101)。用于确定寡核苷酸和引物的预测的Tm的示例性软件工具提供在销售寡核苷酸的许多供应商(例如Integrated DNA Technologies，Inc.)的网址上。
如本文所用，术语“探针”是指由于探针中的至少一种与靶区域中的序列的互补性而与靶核酸中的序列形成双链体结构的标记寡核苷酸。探针优选不含有与用于引发聚合酶链式反应的序列互补的序列。
如本文所用，“互补”是指一个核酸分子可以通过互补核苷或核苷酸之间的传统的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或其他非传统类型的配对(例如，霍氏(Hoogsteen)或逆向霍氏氢键结合)与另一核酸分子形成氢键。
如本文所用，“大体上互补”意指可形成的核酸分子与另一核酸之间的互补性足以使得在所需或指定条件下可发生杂交。因此，两条核酸链不必在两条链的每个核苷酸处是互补的。当术语“大体上互补”与引物一起使用时，其意指引物必须具有足够互补性以与其相应链杂交。因此，引物序列不必反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可连接至引物的5'末端，其中引物序列的剩余部分与链互补。在一些情况中，期望引物具有确切的互补性以获得最佳检测结果。然而，存在其他情况，其中期望引物具有随机错配或者特定错配被设计到引物中。
在本领域中应当理解，核酸分子不必与可特异性杂交的靶核酸序列100％互补。即，两个或更多个核酸分子可以小于完全互补并且由可以与第二核酸分子形成氢键的核酸分子中的连续残基的百分比指示。例如，如果第一核酸分子具有10个核苷酸并且第二核酸分子具有10个核苷酸，则第一核酸分子与第二核酸分子之间的5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对分别表示50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补性。“完美”或“完全”互补的核酸分子意指其中第一核酸分子的所有连续残基将与第二核酸分子中的相同数量的连续残基氢键结合的那些，其中核酸分子均具有相同数量的核苷酸(即，具有相同长度)或两个分子具有不同长度。
如本文所用，术语“非特异性扩增”是指非靶序列的核酸序列的扩增，这是由于引物与非靶序列的序列杂交并且然后作为引物延伸的底物所致。引物与非靶序列的杂交被称作“非特异性杂交”并且尤其易于在较低温度、低严格度的预扩增条件期间出现。
如本文所用，术语“引物二聚体”是指不依赖模板的非特异性扩增产物，据信它是由其中另一引物充当模板的引物延伸所致。尽管引物二聚体经常显现为两种引物的串联体即二聚体，但是还存在多于两种引物的串联体。术语“引物二聚体”在本文中被一般地用来包括不依赖于模板的非特异性扩增产物。
如本文所用，术语“反应混合物”是指含有进行给定反应所必需的试剂的溶液。“扩增反应混合物”是指含有进行扩增反应所必需的试剂的溶液，其通常含有于合适缓冲液中的寡核苷酸引物和DNA聚合酶。“PCR反应混合物”通常含有于合适缓冲液中的寡核苷酸引物、DNA聚合酶(最典型为热稳定性DNA聚合酶)、dNTP和二价金属阳离子。如果反应混合物含有使反应能够进行所必需的所有试剂，则称之为完全反应混合物，并且如果它只含有必需试剂的亚组，则称之为不完全反应混合物。本领域技术人员应该理解，出于方便、储存稳定性或允许依赖应用的组分浓度调整的原因，反应组分常规地储存为单独的溶液或储存在“混合母液”中，各自均含有总组分的亚组，并且在反应之前将反应组分合并以产生完全反应混合物。此外，本领域技术人员应理解的是，反应组分被单独地包装以用于商业化并且可用的商业试剂盒可含有反应组分的任何亚组，其中包括本公开的阻滞引物。
表1中描述的缩略语和术语用于整个本文中。
表1.
所公开的材料、组合物以及组分可用于所公开的方法和组合物，可与所公开的方法和组合物联用，可用来制备所公开的组合物，或者是所公开的方法和组合物的产品。本文公开这些和其他材料，并且应了解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可未明确公开这些化合物的每个不同个别和共同组合以及排列的特定提到，但是其各自在本文中特定涵盖和描述。因而，若公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并公开了一个组合分子实施例A-D，则即使没有单独列举每种情况，每种情况都单独和整体地包括在本发明的预想之中。因此，在这个实施例中，A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F这些组合中的每一个组合都具体地包括在本发明预想之中，应视为因A、B、C和D、E、F以及组合实施例A-D的公开而得到公开。同样地，这些分子的任何分组或组合也都具体地包括在本发明的预想之中并视为得到公开。因此，例如，分组A-E、B-F和C-E具体地包括在本发明的预想之中，应视为因A、B、C和D、E、F以及组合实施例A-D的公开而得到公开。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，若有多种额外步骤可进行，应了解，这些额外步骤中的每一步都可与所公开的方法的任意具体实施方案或实施方案的组合一起进行，并且这样的每种组合都具体地包括在本发明预想之中，应视为得到公开。
1.三重qPCR测定方法
本公开公开了用于确定染色体群体中的平均端粒长度或丰度的量度和使用这些量度来确定健康或疾病风险的量度或干预效果，或用于通过向医师提供通过基于端粒的指导添加的值来改善医学实践的方法和材料，所述干预增加或减小端粒长度并因此增加或减少健康，或相反地分别减少或增加未来疾病或死亡的风险。所述方法涉及在针对每种靶核酸序列利用不同的检测标记的单一qPCR多重反应中确定至少三种靶核酸序列的平均端粒长度或丰度。在一方面，三种靶核酸序列中的一种是端粒序列并且另两种靶核酸序列是已知很少发生拷贝数变异的不同的低拷贝数基因。在另一方面，低拷贝数基因是已知很少发生拷贝数变异的单拷贝基因。在另一方面，平均端粒长度或丰度与另两种核酸序列的平均丰度的平均值的比，即T/S比可以用于确定具体的临床风险，其中“S”是两种单低拷贝基因的平均值。另选地，T/S比可用于优化治疗方案。
在一方面，本公开涉及用于确定平均端粒长度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸与第一引物组接触、使第二靶核酸与第二组引物组接触并且使第三靶核酸靶标与第三引物组接触；(i)其中第一引物组包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物组包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物组包括第三正向引物和第三反向引物；并且(iv)其中第一靶核酸包含端粒重复序列；(b)通过聚合酶链式反应用第一引物组扩增第一靶核酸以形成第一扩增子、用第二引物组扩增第二靶核酸以形成第二扩增子，并且用第三引物组扩增第三靶核酸以形成第三扩增子；(c)确定聚合酶链式反应的一个或多个循环过程中的第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的量；(i)其中使用第一检测标记检测第一扩增子；(ii)其中使用第二检测标记检测第二扩增子；并且(iii)其中使用第三检测标记检测第三扩增子；并且(d)确定第一扩增子的平均长度或丰度。
在各个方面，确定第一扩增子的平均长度或丰度包括以下步骤：(a)通过与对照聚合酶链式反应比较确定第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的浓度；(b)确定第一扩增子的浓度与第二扩增子和第三扩增子的平均或加权浓度的比；和(c)将来自步骤(b)的比转换为端粒序列的碱基对/基因组。
在一方面，本公开涉及用于确定平均端粒长度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸与第一引物组接触、使第二靶核酸与第二组引物组接触、使第三靶核酸靶标与第三引物组接触；并且使第四靶核苷酸靶标与第四引物组接触；(i)其中第一引物组包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物组包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物组包括第三正向引物和第三反向引物；(iv)其中第四引物组包括第四正向引物和第四反向引物；并且(v)其中第一靶核酸包含端粒重复序列；(b)通过聚合酶链式反应用第一引物组扩增第一靶核酸以形成第一扩增子、用第二引物组扩增第二靶核酸以形成第二扩增子、用第三引物组扩增第三靶核酸以形成第三扩增子，并且用第四引物组扩增第四靶核酸以形成第四扩增子；(c)确定聚合酶链式反应的一个或多个循环过程中的第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的量；(i)其中使用第一检测标记检测第一扩增子；(ii)其中使用第二检测标记检测第二扩增子；(iii)其中使用第三检测标记检测第三扩增子；并且(iv)其中使用第四检测标记检测第四扩增子；并且(d)确定第一扩增子的平均长度或丰度。
在各个方面，确定第一扩增子的平均长度或丰度包括以下步骤：(a)通过与对照聚合酶链式反应比较确定第一扩增子、第二扩增子、第三扩增子和第四扩增子的浓度；(b)确定第一扩增子的浓度与第二扩增子、第三扩增子和第四扩增子的平均或加权浓度的比；和(c)将来自步骤(b)的比转换为端粒序列的碱基对/基因组。
在一方面，本公开涉及用于确定平均端粒长度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸与第一引物组接触、使第二靶核酸与第二组引物组接触、使第三靶核酸靶标与第三引物组接触、使第四靶核苷酸靶标与第四引物组接触，并且使第五靶核酸靶标与第五引物组接触；(i)其中第一引物组包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物组包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物组包括第三正向引物和第三反向引物；(iv)其中第四引物组包括第四正向引物和第四反向引物；(v)其中第五引物组包括第五正向引物和第五反向引物，并且(vi)其中第一靶核酸包含端粒重复序列；(b)通过聚合酶链式反应用第一引物组扩增第一靶核酸以形成第一扩增子、用第二引物组扩增第二靶核酸以形成第二扩增子、用第三引物组扩增第三靶核酸以形成第三扩增子，用第四引物组扩增第四靶核酸以形成第四扩增子并且用第五引物组扩增第五靶核酸以形成第五扩增子；(c)确定聚合酶链式反应的一个或多个循环过程中的第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的量；(i)其中使用第一检测标记检测第一扩增子；(ii)其中使用第二检测标记检测第二扩增子；(iii)其中使用第三检测标记检测第三扩增子；(iv)其中使用第四检测标记检测第四扩增子；并且(v)其中使用第五检测标记检测第五扩增子；并且(d)确定第一扩增子的平均长度或丰度。
在各个方面，确定第一扩增子的平均长度或丰度包括以下步骤：(a)通过与对照聚合酶链式反应比较确定第一扩增子、第二扩增子、第三扩增子和第四扩增子的浓度；(b)确定第一扩增子的浓度与第二扩增子、第三扩增子、第四扩增子和第五扩增子的平均或加权浓度的比；和(c)将来自步骤(b)的比转换为端粒序列的碱基对/基因组。
在各个方面，第一正向引物和第一反向引物中的每种包含：(a)3'部分，其在退火条件下与端粒重复序列杂交；和(b)5'部分，其具有不与端粒重复序列杂交的锚定序列。在另一方面，第一正向引物和第一反向引物的引物3'末端彼此互补。在再另一方面，第一反向引物是包含邻近或包括引物的3'末端的至少一个错配核苷酸的错配引物，其中至少一个错配核苷酸不与靶核酸互补，但是与第一正向引物的3'端核苷酸互补。在又另一方面，第一正向引物的延伸产物能够与第一反向引物(reverse prime)杂交。甚至在另一方面，第一正向引物的延伸产物能够与第一反向引物杂交但不形成引物二聚体。在再另一方面，第一正向引物包含SEQ ID NO.：1的序列；并且其中第一反向引物包含SEQ ID NO.：2的序列。在另一方面，第一反向引物被阻滞引发第一靶核酸。在再另一方面，第一反向引物通过末端3'错配碱基而被阻滞引发第一靶核酸。
在各个方面，第二靶核酸在已知拷贝数的基因内。在另一方面，第二靶核酸在低拷贝数基因内。在再另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内。
在各个方面，第二靶核酸在已知很少发生拷贝数变异的已知拷贝数的基因内。在另一方面，第二靶核酸在已知很少发生拷贝数变异的低拷贝数基因内。在再另一方面，第二靶核酸在已知很少发生拷贝数变异的单拷贝数基因内。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为β2-微球蛋白。在另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：3。在又另一方面，第二反向引物包含SEQ IDNO.：4。在再另一方面，第二正向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为PGK。在另一方面，第二正向引物包含与PGK基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与PGK基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为GAPDH。在另一方面，第二正向引物包含与GAPDH基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与GAPDH基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为hTERT。在另一方面，第二正向引物包含与hTERT基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与hTERT基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为ACTB。在另一方面，第二正向引物包含与ACTB基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与ACTB基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。
在各个方面，第二靶核酸位于人基因内。
在各个方面，第三靶核酸在已知拷贝数的基因内。在另一方面，第三靶核酸在低拷贝数基因内。在再另一方面，第三靶核酸在单拷贝数基因内。
在各个方面，第三靶核酸在已知很少发生拷贝数变异的已知拷贝数的基因内。在另一方面，第三靶核酸在已知很少发生拷贝数变异的低拷贝数基因内。在再另一方面，第三靶核酸在已知很少发生拷贝数变异的单拷贝数基因内。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为β2-微球蛋白，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为RNA酶P。在另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：3。在又另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：4。在再另一方面，第二正向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：6。在再另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：7。在又另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：9。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQID NO.：10。在再另一方面，第三正向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，第三反向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。另选地，针对RNA酶P且适用于所公开的方法中的引物和探针序列靶标通过Fan等人BMCInfectious Disease(2014)14:541得到描述。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为β2-微球蛋白，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为GAPDH。在另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：3。在又另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：4。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：26。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：27。在再另一方面，第二正向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与GAPDH中的序列互补的序列，第三反向引物包含与GAPDH中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为β2-微球蛋白，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为PGK。在另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：3。在又另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：4。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：22。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：23。在再另一方面，第二正向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与PGK中的序列互补的序列，第三反向引物包含与PGK中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为β2-微球蛋白，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为hTERT。在另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：3。在又另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：4。在再另一方面，第二正向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，第三反向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为β2-微球蛋白，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为ACTB。在另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：3。在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：4。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：25。在再另一方面，第二正向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，第二反向引物包含与β2-微球蛋白基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，第三反向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为RNA酶P，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为GAPDH。在另一方面，第二正向引物包含SEQID NO.：6。在再另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：7。在又另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：10。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：26。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：27。在再另一方面，第二正向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，第二反向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。另选地，针对RNA酶P且适用于所公开的方法中的引物和探针序列靶标通过Fan等人BMC InfectiousDisease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含与GAPDH中的序列互补的序列，第三反向引物包含与GAPDH中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为RNA酶P，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为PGK。在另一方面，第二正向引物包含SEQ IDNO.：6。在再另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：7。在又另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：10。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：22。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：23。在再另一方面，第二正向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，第二反向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。另选地，针对RNA酶P且适用于所公开的方法中的引物和探针序列靶标通过Fan等人BMC Infectious Disease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含与PGK中的序列互补的序列，第三反向引物包含与PGK中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为RNA酶P，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为hTERT。在另一方面，第二正向引物包含SEQID NO.：6。在再另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：7。在又另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：10。在再另一方面，第二正向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，第二反向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。另选地，针对RNA酶P且适用于所公开的方法中的引物和探针序列靶标通过Fan等人BMC Infectious Disease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，第三反向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为RNA酶P，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为ACTB。在另一方面，第二正向引物包含SEQ IDNO.：6。在再另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：7。在又另一方面，第二正向引物包含SEQ ID NO.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：10。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：25。在再另一方面，第二正向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，第二反向引物包含与RNA酶P中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。另选地，针对RNA酶P且适用于所公开的方法中的引物和探针序列靶标通过Fan等人BMC Infectious Disease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，第三反向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为GAPDH，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为PGK。在再另一方面，第二正向引物包含SEQID NO.：26。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：27。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：22。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：23。在另一方面，第二正向引物包含与GAPDH中的序列互补的序列，第二反向引物包含与GAPDH基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与PGK中的序列互补的序列，第三反向引物包含与PGK中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为GAPDH，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为hTERT。在另一方面，第二正向引物包含与GAPDH中的序列互补的序列，第二反向引物包含与GAPDH基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，第三反向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为GAPDH，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为ACTB。在再另一方面，第二正向引物包含SEQID NO.：26。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：27。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：25。在另一方面，第二正向引物包含与GAPDH中的序列互补的序列，第二反向引物包含与GAPDH基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，第三反向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为PGK，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为hTERT。在再另一方面，第二正向引物包含SEQID NO.：22。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：23。在另一方面，第二正向引物包含与PGK中的序列互补的序列，第二反向引物包含与PGK基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，第三反向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为PGK，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为ACTB。在再另一方面，第二正向引物包含SEQ IDNO.：22。甚至在另一方面，第二反向引物包含SEQ ID NO.：23。在再另一方面，第三正向引物包含SEQ ID NO.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：25。在另一方面，第二正向引物包含与PGK中的序列互补的序列，第二反向引物包含与PGK基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，第三反向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在另一方面，第二靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为hTERT，并且第三靶核酸在单拷贝数基因内，并且单拷贝基因为ACTB。在再另一方面，第三正向引物包含SEQID NO.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含SEQ ID NO.：25。在另一方面，第二正向引物包含与hTERT中的序列互补的序列，第二反向引物包含与hTERT基因中的序列互补的序列，并且第二正向引物和第二反向引物产生第二扩增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，第三反向引物包含与ACTB中的序列互补的序列，并且第三正向引物和第三反向引物产生第三扩增子。
在各个方面，第三靶核酸位于人基因内。
在另一方面，第一检测标记、第二检测标记和第三检测标记可分别且同时地检测。在再另一方面，第一检测标记、第二检测标记和第三检测标记可分别且同时地检测，并且第一检测标记、第二检测标记和第三检测标记中的每个独立地包含荧光部分。
在另一方面，第一检测标记、第二检测标记、第三检测标记和第四检测标记可分别且同时地检测。在再另一方面，第一检测标记、第二检测标记、第三检测标记和第四检测标记可分别且同时地检测，并且第一检测标记、第二检测标记、第四检测标记和第四检测标记中的每个独立地包含荧光部分。
在另一方面，第一检测标记、第二检测标记、第三检测标记、第四检测标记和第五检测标记可分别且同时地检测。在再另一方面，第一检测标记、第二检测标记、第三检测标记、第四检测标记和第五检测标记可分别且同时地检测，并且第一检测标记、第二检测标记、第四检测标记、第四检测标记和第五检测标记中的每个独立地包含荧光部分。
例如，本文所述方法可使用优选结合PCR反应过程中的双链核酸扩增产物的荧光染料，从而提供产物合成的连续监测(参见Higuchi，R.等人Biotechnology 11：1026-1030(1993)；Morrison，T.B.等人，Biotechniques 24：954-962(1998))。
在另一方面，第一检测标记还包含DNA结合染料。在另一方面，荧光DNA结合染料为2-甲基-4,6-双(4-N,N-二甲氨基苯基)吡喃鎓碘化物、N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-l,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺、2-((2-(二乙氨基)-1-苯基-l,8a-二氢喹啉-4-基)甲基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓碘化物、(Z)-4-((3',6-噻唑-[2,6'-二苯并[d]噻唑]-2'(3'H)-亚基)甲基)-l-甲基吡啶-l-鎓碘化物或(Z)-4-((6-(苯并[d]噁唑-2-基)-3-甲基苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-l-甲基喹啉-l-鎓碘化物。
在另一方面，第二检测标记还包含寡核苷酸、荧光部分和荧光淬灭部分。在再另一方面，第二检测标记还包含寡核苷酸、连接至寡核苷酸的5'末端的荧光部分和在寡核苷酸探针的3'末端处的荧光淬灭部分。在又另一方面，第二检测标记还包含含有SEQ ID NO.：5序列的寡核苷酸。甚至在另一方面，第二检测标记还包含含有SEQ ID NO.：8序列的寡核苷酸。在又另一方面，第二检测标记还包含含有SEQ ID NO.：11序列的寡核苷酸。甚至在另一方面，第二检测标记还包含荧光部分，并且荧光部分包括花菁染料。在再另一方面，花菁染料为Cy5。在又另一方面，荧光淬灭部分为暗淬灭剂(dark quencher)。
另外适合的荧光标记的实例包括但不限于SYBR Green I(Invitrogen)、异硫氰酸荧光素(FITC)、5,6-羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、氨基-甲基香豆素(AMCA)、曙红、藻红、CascadeOregon芘、丽丝胺(lissamine)、呫吨(xanthenes)、吖啶、噁嗪、藻红蛋白、镧系元素离子的大环螯合剂如量子染料TM、荧光能量转移染料诸如噻唑橙-乙啡啶异源二聚体、以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5以及Cy7。其他特异性荧光标记的实例包括3-羟基芘5,8,10-三磺酸、5-羟基色胺(5-HT)、酸性品红、茜素络合酮(Alizarin Complexon)、茜红(Alizarin Red)、别藻蓝素(Allophycocyanin)、氨基香豆素(Aminocoumarin)、蒽基硬脂酸酯、Astrazon亮红4G、Astrazon橙R、Astrazon红6B、Astrazon黄7GLL、阿的平(Atabrine)、金胺(Auramine)、金膦(Aurophosphine)、金膦G、BAO 9(双氨基苯基噁二唑)、BCECF、硫酸黄连素、双苯甲酰胺、Blancophor FFG溶液、Blancophor SV、氟硼荧(Bodipy)F1、亮Sulphoflavin FF、钙黄绿素蓝(Calcien Blue)、钙绿(Calcium Green)、CalcofluorRW溶液、Calcofluor白、Calcophor白ABT溶液、Calcophor白标准溶液、Carbostyryl、Cascade黄、儿茶酚胺、奎纳克林(Chinacrine)、Coriphosphine O、香豆素-鬼笔环肽(Phalloidin)、CY3.1 8、CY5.1 8、CY7、Dans(1-二甲基氨基萘5磺酸)、Dansa(二氨基萘基磺酸)、丹酰NH-CH3、二氨基苯基噁二唑(DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二吡咯亚甲基二氟化硼、二苯基亮黄素7GFF、多巴胺、藻红ITC、吖啶橙、FIF(甲醛诱导的荧光)、Flazo橙、Fluo 3、荧光胺、Fura-2、Genacryl亮红B、Genacryl亮黄10GF、Genacryl粉3G、Genacryl黄5GF、乙醛酸(Gloxalic Acid)、粒状蓝、血卟啉(Haematoporphyrin)、Indo-1、Intrawhite Cf液体、Leucophor PAF、Leucophor SF、Leucophor WS、丽丝胺罗丹明B200(RD200)、荧光黄CH、荧光黄VS、萘红(Magdala Red)、Marina蓝、Maxilon亮黄素10GFF、Maxilon亮黄素8GFF、MPS(甲基绿派若宁二苯乙烯)、光辉霉素(Mithramycin)、NBD胺、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)、去甲肾上腺素、核固红、核黄、Nylosan亮黄素E8G、噁二唑、太平洋蓝(Pacific Blue)、碱性副品红(Pararosaniline)(Feulgen)、Phorwite AR溶液、PhorwiteBKL、Phorwite Rev、Phorwite RPA、Phosphine 3R、酞菁染料、藻红蛋白R、PolyazaindacenePontochrome蓝黑、卟啉(Porphyrin)、樱草灵(Primuline)、普施安黄(Procion Yellow)、派若宁、派若宁B、Pyrozal亮黄素7GF、氮芥喹吖因(Quinacrine Mustard)、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B 200、罗丹明B Extra、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明WT、血清素、Sevron亮红2B、Sevron亮红4G、Sevron亮红B、Sevron橙、Sevron黄L、SITS(樱草灵)、SITS(二苯乙烯异硫磺酸)、二苯乙烯、Snarf 1、磺基罗丹明B Can C、磺基罗丹明G Extra、四环素、噻嗪红R、硫磺素S、硫磺素TCN、硫磺素5、Thiolyte、Thiozol橙、Tinopol CBS、真蓝、Ultralite、荧光素钠(Uranine)B、Uvitex SFC、二甲苯橙以及XRITC。荧光标记可从多种商业来源获得，包括Invitrogen，Carlsbad，CA；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；Molecular Probes，Eugene，OR；以及Research Organics，Cleveland，Ohio。
在另一方面，第三检测标记还包含寡核苷酸、荧光部分和荧光淬灭部分。在再另一方面，第三检测标记还包含寡核苷酸、连接至寡核苷酸的5'末端的荧光部分和在寡核苷酸探针的3'末端处的荧光淬灭部分。在又另一方面，第三检测标记还包含含有SEQ ID NO.：8序列的寡核苷酸。在再另一方面，第三检测标记还包含含有SEQ ID NO.：11序列的寡核苷酸。甚至在另一方面，荧光部分包括VIC。在又另一方面，荧光淬灭部分为暗淬灭剂。甚至在另一方面，荧光淬灭部分为暗淬灭剂，并且暗淬灭剂为TAMRA。
在另一方面，第四检测标记还包含寡核苷酸、荧光部分和荧光淬灭部分。在再另一方面，第四检测标记还包含寡核苷酸、连接至寡核苷酸的5'末端的荧光部分和在寡核苷酸探针的3'末端处的荧光淬灭部分。
在另一方面，第五检测标记还包含寡核苷酸、荧光部分和荧光淬灭部分。在再另一方面，第五检测标记还包含寡核苷酸、连接至寡核苷酸的5'末端的荧光部分和在寡核苷酸探针的3'末端处的荧光淬灭部分。
在另一方面，第二扩增子的长度大于或等于约50bp。在再另一方面，第二扩增子的长度小于或等于约250bp。在又另一方面，第二扩增子的长度为约50至约60bp。甚至在另一方面，第二扩增子的长度为约50至约70bp。在再另一方面，第二扩增子的长度为约50至约80bp。在又另一方面，第二扩增子的长度为约50至约90bp。甚至在另一方面，第二扩增子的长度为约50至约100bp。在再另一方面，第二扩增子的长度为约50至约125bp。在又另一方面，第二扩增子的长度为约50至约150bp。甚至在另一方面，第二扩增子的长度为约50至约175bp。在再另一方面，第二扩增子的长度为约50至约200bp。在又另一方面，第二扩增子的长度为约50至约250bp。
在另一方面，第三扩增子的长度大于或等于约50bp。在再另一方面，第三扩增子的长度小于或等于约250bp。在又另一方面，第三扩增子的长度为约50至约60bp。甚至在另一方面，第三扩增子的长度为约50至约70bp。在再另一方面，第三扩增子的长度为约50至约80bp。在又另一方面，第三扩增子的长度为约50至约90bp。甚至在另一方面，第三扩增子的长度为约50至约100bp。在再另一方面，第三扩增子的长度为约50至约125bp。在又另一方面，第三扩增子的长度为约50至约150bp。甚至在另一方面，第三扩增子的长度为约50至约175bp。在再另一方面，第三扩增子的长度为约50至约200bp。在又另一方面，第三扩增子的长度为约50至约250bp。
在各个方面，通过与对照靶DNA比较来确定第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的浓度。
在另一方面，通过与对照靶DNA比较来确定第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的浓度，其中对照靶DNA为控制合成的靶DNA。在再另一方面，控制合成的靶DNA包含(TTAGGG)m，其中m为15至34的整数。在又另一方面，控制合成的靶DNA包含(CCCTAA)m，其中m为15至34的整数。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA为SEQ ID NO.：12。
在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少90个碱基对。在再另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少100个碱基对。在又另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少110个碱基对。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少120个碱基对。在再另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少130个碱基对。在又另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少140个碱基对。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少150个碱基对。在再另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少160个碱基对。在又另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少170个碱基对。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为至少180个碱基对。
在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约90个碱基对至约200个碱基对。在又另一方面，控制合成的靶DNA为SEQ ID NO.：12。在再另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约100个碱基对至约200个碱基对。在又另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约110个碱基对至约200个碱基对。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约120个碱基对至约200个碱基对。在再另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约130个碱基对至约200个碱基对。在又另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约140个碱基对至约200个碱基对。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约150个碱基对至约200个碱基对。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约175个碱基对至约200个碱基对。
甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约90个碱基对至约150个碱基对。在再另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约90个碱基对至约125个碱基对。在又另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约90个碱基对至约110个碱基对。甚至在另一方面，控制合成的靶DNA的长度为约90个碱基对至约175个碱基对。
在另一方面，通过与对照靶DNA比较来确定第一扩增子、第二扩增子和第三扩增子的浓度，其中为人基因组DNA。在又另一方面，人基因组DNA包含获自男性或女性供体的DNA。甚至在另一方面，人基因组DNA为男性和女性供体合起来的嵌合组成物，或为仅男性或仅女性供体的嵌合组成物。
根据本领域中熟知的程序进行扩增反应。用于PCR的程序广泛地得以使用和描述(参见，例如美国专利号4,683,195和4,683,202)。简单地说，双链靶核酸一般是通过在高到足以使链变性的温度下孵育而变性，然后在过量引物的存在下孵育，所述引物与单链靶核酸杂交(退火)。DNA聚合酶延伸杂交的引物，从而产生靶核酸的新拷贝。使所得双链体变性，并且重复杂交和延伸步骤。通过在用于互补靶链的第二引物的存在下反复进行变性、退火和延伸的步骤，被两种引物包围的靶核酸以指数方式扩增。引物延伸步骤的时间和温度将取决于聚合酶、被扩增的靶核酸的长度和序列组成以及用于扩增的引物序列。充分扩增靶核酸所需的反复步骤的数量将取决于扩增的效率。本领域技术人员应该理解，本公开不受扩增过程中所应用的时间、温度、缓冲条件和扩增周期的变化所限制。
变性步骤通常是PCR的重复循环中的第一步骤并且包括使反应加热至90-98℃，例如91、92、93、94、95、96、97或98℃的变性温度，持续1-35秒，优选15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35秒。变性步骤通过破坏互补碱基之间的氢键来解链(melt)DNA模板，从而产生单链DNA。
退火步骤通常是PCR的重复循环中的第二步骤并且包括使温度降低至45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃的退火温度，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45秒，从而使引物组中的引物退火以与靶核酸杂交。退火温度可以比使用的引物的双链体解链温度Tm低约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或高至15℃。当引物序列非常接近地匹配或在引物的3'末端处与模板序列的补体的一部分相同时形成稳定的DNA-DNA氢键。聚合酶结合引物-模板杂交体并且开始DNA合成。
延伸/延长步骤是核酸聚合酶通过以下方式合成与靶核酸链互补的新核酸链的步骤：添加沿5'至3'方向与靶核酸互补的dNTP，使dNTP的5'-磷酸基与初期(延伸的)靶核酸链的末端处的3'-羟基缩合。延伸时间取决于使用的核酸聚合酶和待扩增的靶核酸的长度。根据经验规则(rule-of-thumb)，在其最佳温度下，核酸聚合酶将聚合高达成千个碱基/分钟。在最佳条件下，即，如果没有归因于有限基底或试剂的限制，在每个延伸步骤下，靶核酸的量是加倍的，从而导致特定靶核酸的指数级(几何学)扩增。此步骤下的延长温度取决于使用的核酸聚合酶。例如，Taq聚合酶具有其75-80℃下的最佳活性温度，并且通常对这种酶使用72℃的温度
PCR还可包括最终的延长步骤。在最后PCR循环之后，可以在68、69、70、71、72、73、74或75℃的最终延长温度下进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟的最终延伸，以确保任何剩余的单链DNA被完全拷贝以形成双链DNA产物。
PCR还可包括信号采集步骤，其中可以确定检测标记的量。信号采集步骤可以在扩增靶序列的过程中进行。在一些方面，信号采集步骤紧随变性步骤、退火步骤和延长步骤。信号采集步骤在信号采集温度下进行。信号采集温度可以为任何温度并且可在PCR期间的一个或多个时间处进行。当两个或更多个靶核酸的拷贝数如本文所述那样确定时，信号采集温度应当是不同的，以便检测每种扩增子的检测标记。例如，对于两个或更多个信号采集温度，应当选择温度使得第一信号采集温度低于第一扩增子的Tm并且第二信号采集温度高于所述第一Tm并且低于第二扩增子的Tm。两个或更多个信号采集温度之间的差异可以为3、4、5、6、7、8、9或10℃。信号采集步骤可以在采集温度下进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15秒。
PCR还可包括最终的保温(hold)步骤。最终的保温步骤可以在约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15℃的最终的保持温度下持续不定时间。可以采用最终的保温步骤以短期储存反应。
聚合酶链式反应还可包括连续循环步骤。每个连续循环步骤可包括如上所述的一个或多个PCR步骤。每个连续循环步骤还可称之为PCR的“循环”。对于PCR的每个循环，每个连续循环步骤可以在相同或不同的温度下进行。PCR可以在改变PCR的一个或多个循环的退火温度的情况下运行。例如，PCR可以运行总共40个循环，其中第一循环步骤的退火温度是相同的，然后第二循环步骤的退火温度是升高的并且第三循环步骤的退火温度是降低的。
本文所述的方法允许通过针对每种扩增子的离散信号，即多重信号检测，定量一个或多个扩增循环中的多种扩增子。在各个方面，收集来自每个循环中的多种扩增子的信号包括使用多种荧光团，所述荧光团通过PCR仪器的光学***在不同波长下被检测到。在另外的方面，所公开的方法利用双链DNA结合或嵌入染料，例如溴化乙锭、Green或染料，和针对第二扩增子和第三扩增子(和第四扩增子、第五扩增子等，如果待扩增的是三种以上的扩增子的话)的探针。探针是具有报告染料和淬灭染料的寡核苷酸，所述报告染料共价连接至寡核苷酸的一端，所述淬灭染料共价连接至寡核苷酸的另一端。在各个方面，探针是具有连接至5'末端的报告染料和连接至3'末端的淬灭染料的寡核苷酸。在另一方面，反应中的所有扩增子可与DNA结合或嵌入染料产生信号，因此，第一扩增子应当在第二扩增子和第三扩增子(和第四扩增子、第五扩增子等，如果待扩增的是三种以上的扩增子的话)达到循环阈值的前至少五个扩增达到循环阈值。
本文所述的方法还可使用用于通过针对每种扩增子的分散信号定量每个扩增循环中的多种扩增子的其他方法进行。在另一方面，针对每种扩增子的第三引物可以连接至淬灭染料，并且淬灭剂在延伸反应过程中通过反应中的聚合酶裂解(即q-PCR探针)。在再另一方面，荧光团可连接至与扩增子杂交的寡核苷酸并且当与DNA链杂交时不淬灭(即分子信标)，并且可针对每种扩增子使用不同的分子信标。在又另一方面，聚合酶链式反应可包含DNA结合或嵌入荧光染料。当延伸循环结束所有扩增子是双链时收集DNA结合或嵌入荧光染料的信号。
在各个方面，本文所述方法呈现允许单独收集来自多种扩增子的信号的策略。在另一方面，第一循环的循环阈值(Ct)在来自第二扩增子和第三扩增子的信号还处于基线时的较早循环处收集。第二扩增子和第三扩增子(和第四扩增子、第五扩增子等，如果待扩增的是三种以上的扩增子的话)的Ct在大大高于第一扩增子的解链温度(Tm)的温度下收集，使得第一扩增子为单链的并使其信号成为基线。引物被设计使得两种扩增子较小，并且第二扩增子和第三扩增子可以是富GC的，从而升高其Tm。以高丰度和低丰度物质出现在生物样品中并且拷贝数范围没有重叠的模板对是用于这种方法的天然靶标
通过本领域中熟知的方法检测和分析扩增产物。扩增的产物可以在产物分离和/或纯化之后进行分析，或通过直接测定扩增反应中形成的产物进行分析。对于检测，产物可以使用荧光化合物，例如溴化乙锭、Green或或通过与标记核酸探针杂交来间接地鉴定。另选地，在扩增反应中使用标记的引物或标记的核苷酸来标记扩增产物。标记包括任何可检测的部分，包括荧光标记、放射性标记、电子标记以及间接标记诸如生物素或地高辛(digoxigenin)。
适于进行本公开的qPCR反应的仪器可获自许多商业来源(ABI Prism 7700，Applied Biosystems，Carlsbad，CA；LIGHTCYCLER 480，Roche Applied Science，Indianapolis，IN；Eco Real-Time PCR System，Illumina，Inc.，San Diego，CA；RoboCycler 40，Stratagene，Cedar Creek，TX)。
当使用实时定量PCR来检测和测量扩增产物时，各种算法被用来计算样本中的靶端粒的数目。(例如，参见ABI Prism 7700软件版本1.7；Lightcycler软件版本3)。定量可以涉及使用具有已知拷贝数的端粒核酸的标准样品以及从标准物的对数和循环阈值(Ct)生成的标准曲线。一般来说，Ct是PCR循环或部分PCR循环，其中由扩增产物产生的荧光是基线荧光之上的若干个偏差。
2.靶样品
靶样品可来源于具有或疑似具有靶分子的任何来源。靶样品可含有例如靶分子诸如核酸。靶样品可以是靶核酸的来源。靶样品可包含天然靶核酸、化学合成的靶核酸或两者。靶样品可以是例如来自一种或多种细胞、组织或体液(诸如血液、尿液、***、淋巴液、脑脊液或羊水)或其他生物样品(诸如组织培养细胞、口腔拭子、漱口液、粪便、组织切片、抽吸式活检和考古用样品诸如骨或木乃伊化的组织)的样品。可使用的靶样品的类型包括血液样品、尿液样品、***样品、淋巴液样品、脑脊液样品、羊水样品、生物活检样品、针吸活检样品、癌症样品、肿瘤样品、组织样品、细胞样品、细胞裂解液样品、粗制细胞裂解液样品、法医用样品、考古用样品、感染样品、医院内感染样品、生产样品、药物制剂样品、生物分子生产样品、蛋白质制剂样品、脂质制剂样品和/或碳水化合物制剂样品。
3.靶核酸
核酸样品可来源于具有或疑似具有靶核酸的任何来源。核酸样品是核酸分子和核酸序列诸如靶核酸的来源。核酸样品可含有RNA或DNA或两者。靶核酸还可以是cDNA。此外，mRNA可反转录形成cDNA，所述cDNA然后可用作用于本文所述的方法中的靶核酸。例如，天然双链状态下的染色体DNA可以从如以上本文所述的靶样品中获得。可以使用产生高分子量基因组DNA(大于20kb)的任何DNA纯化方法包括苯酚/氯仿萃取、氯化铯梯度和使用硅胶膜结合技术的商品试剂盒、选择性洗涤剂介导的DNA沉淀方法来获得染色体DNA。DNA纯化商品试剂盒的实例包括Agencourt DNAdvance和Agencourt Genfind(Beckman Coulter)、QIAamp试剂盒(Q1AGEN，Valencia，California)、QIAamp血液试剂盒(Q1AGEN)、QIAamp FFPE组织试剂盒Q1AGEN)、AHPrep试剂盒(QtAGEN)、Puregene试剂盒(QtAGEN)、PureLink andGeneCatcher(fnvitrogen)和Wizard(Promega)。
“靶核酸”或“靶序列”意指在双链或单链核酸上的核酸序列。“核酸”或“寡核苷酸”或在本文中的语法等同物意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，但是在一些情况下，包括的核酸类似物可以具有替代骨架，包括例如磷酰胺(Beaucage，S.L.等人，Tetrahedron 49：1925-63(1993)和其中的参考文献；Letsinger，R.L.等人，J.Org.Chem.35：3800-03(1970)；Sprinzl，M.等人，Eur.J.Biochem.81：579-89(1977)；Letsinger，R.L.等人，Nucleic Acids Res.14:3487-99(1986)；Sawai等人，Chem.Lett.805(1984)；Letsinger，R.L.等人，J.Am.Chem.Soc.110：4470(1988)；以及Pauwels等人，Chemica Scripta 26:141-49(1986))、硫代磷酸酯(Mag，M.等人，NucleicAcids Res.19:1437-41(1991)；和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯((Briu等人，J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989))、O-甲基亚磷酰胺键合(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press，1991)和肽核酸骨架和键合(Egholm，M.，Am.Chem.Soc.114:1895-97(1992)；Meier等人，Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992)；Egholm，M.，Nature 365：566-68(1993)；Carlsson，C.等人，Nature 380：207(1996)，所有文献以引用的方式并入)。其他类似核酸包括具有下述骨架的那些：正性骨架(Dempcy，R.O.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097-101(1995))；非离子骨架(美国专利号5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；Kiedrowshi等人，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30:423(1991)；Letsinger，R.L.等人，J.Am.Chem.Soc.110：4470(1988)；Letsinger，R.L.等人，Nucleoside&Nucleotide 13：1597(1994)；第2和3章，ASC Symposium Series 580，"Carbohydrate Modifications inAntisense Research"，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编；Mesmaeker等人，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4：395(1994)；Jeffs等人，J.Biomolecular NMR 34:17(1994))和非核糖骨架，包括描述于美国专利号5,235,033和5,034,506，和第6和7章，ASC SymposiumSeries 580，"Carbohydrate Modifications in Antisense Research"，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编中所述的那些核酸。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括于核酸的一个定义内(参见Jenkins等人，Chem.Soc.Rev.169-176(1995))，所有文献均以引用的方式并入本文。
力求测定、鉴定、检测的或力求确定其拷贝数的任何核酸序列可用作靶核酸序列。在本文所述的方法中，可存在多于一种的靶核酸序列。在存在两种靶核酸序列的事件中，将它们分别称为第一靶核酸序列和第二靶核酸序列。在存在三种靶核酸序列的事件中，将它们分别称为第一靶核酸序列、第二靶核酸序列和第三靶核酸序列，以此类推。本文所述的方法中描述的靶核酸可具有相同、类似或不同的拷贝数。例如，第一靶核酸是多个拷贝数的核酸序列并且第二靶核酸是单拷贝基因。例如，第一靶核酸可以是端粒重复序列、mtDNA、rDNA或Alu重复DNA。例如，第一靶核酸可以是从高拷贝数mRNA反转录的cDNA，而第二靶核酸可以是从低拷贝数mRNA反转录的cDNA。
单拷贝基因是每个单倍体基因组有单个拷贝的基因。因此单拷贝基因在每一细胞中有两个拷贝。单拷贝基因包括但不限于RNA酶P基因、β2-微球蛋白基因、白蛋白基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因、人端粒酶反转录酶、β-肌动蛋白(ACTB)基因和β-球蛋白基因。
端粒是在真核生物的线性染色体的末端发现的特化结构。端粒通常由短的串联重复序列组成，带有对这种生物体特有的端粒酶特异的重复序列单元。多种生物体的端粒重复序列是已知的。对于脊椎动物、植物、某些类型的霉菌以及一些原生动物而言，所述序列是完全的重复序列。例如，在人序列TTAGGG(SEQ ID NO.：13)中，出现的序列重复单元是(TTAGGG)n，其中n可以在1-1000或更多的范围内。在其他生物体中，重复序列是不规则的，诸如酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的重复序列，其中所述序列是可变的G1-3T/C1-3A。在一些真核生物体中，端粒不含短的串联重复序列，但具有用作端粒的序列元件。例如，在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中，端粒是逆转录转座子元件HeT-A和TART的复合物，而在冈比亚按蚊(mosquito Anopheles gambiae)中，端粒是一系列复杂串联重复序列。出于本发明的目的，不同结构的端粒被涵盖在本发明的范围内。
除所述重复序列之外，一些端粒的3'末端包含单链区，对于人类所述单链区定位于富含G的链上。单链由(TTAGGG)n重复序列组成，其中n为约50，但n可以明显小于或多于50。如本文所用，3'单链区的长度也可与死亡率或疾病风险相关联。
通常，DNA复制机制以5'至3'方向作用，并且通过使用在链合成后分解的短RNA引物，后随链的合成不连续地发生。因为对先前被RNA引物占有的区域的完整合成不能获得线性DNA的3'末端处序列，因此线性染色体的3'端区不被复制。这种“末端复制问题”通过端粒酶，一种端粒特异性核糖核蛋白反转录酶，的作用得以解决。端粒酶具有充当延伸端粒的3'末端的模板的不可或缺的RNA组分。通过端粒酶活性引起的反复延伸导致从端粒酶结合的RNA模板复制的端粒重复序列的产生。在由端粒酶引起的延长后，由DNA聚合酶引起的后随链合成完成双链端粒结构的形成。
在正常的人体细胞中，端粒酶不表达或者低水平表达。因此，每次细胞***端粒缩短约50-200bp，直到该细胞达到复制性衰老，在复制性衰老时细胞失去增殖能力。细胞复制的有限能力通常被称为Hayflick限制，并且可以为细胞提供一种对细胞***进行计数和调节细胞发育的计数机制，即有丝***钟。相应地，在缺乏端粒酶活性的细胞中端粒酶的活化，例如通过由组成型逆转录病毒启动子表达端粒酶，或内源性聚合酶的活化，使细胞保持增殖能力并且导致细胞无限增殖。
有趣地，具有非常短的端粒的细胞常常被延伸。这个现象表明，端粒酶防止短端粒进一步缩短，同时延长已经降到某一阈值长度下的端粒。因此，当端粒在某个长度时，端粒酶活性的存在似乎不是必要的，但是当长度降到临界极限下时，端粒酶活性对维持端粒完整性变得至关重要。
在本文所述的方法中，可以确定细胞中的单条染色体的端粒的丰度或平均长度。在一方面，测定单个细胞的端粒的平均拷贝数或平均端粒拷贝数。在另一实施方案中，测定细胞群体的端粒的平均拷贝数或平均端粒拷贝数。端粒拷贝数的变化是端粒拷贝数的增加或减少，尤其是平均端粒拷贝数的增加或减少。该变化可以与具体的时间点相关，即将生物体在时间t1的端粒拷贝数与在稍晚的时间(t2)的端粒长度比较。也可以将端粒拷贝数的变化或差异与具体细胞群体或生物群体的平均端粒拷贝数相比较。在一些方面，也可以将端粒拷贝数的变化或差异与未罹患疾病病状的群体的平均端粒拷贝数相比较。在某些实施方案中，对不同时间段下存在的群体来测定端粒拷贝数的变化。
尽管，可以确定所有真核生物的端粒拷贝数，但是在一方面，确定的是脊椎动物的端粒拷贝数，所述脊椎动物包括但不限于两栖动物、鸟类和哺乳动物例如啮齿类动物、有蹄类动物和灵长类动物，尤其是人类。也可以确定寿命具有期望特质或寿命和疾病的易感性与端粒长度相关联的生物体的端粒拷贝数。在另一方面，为了评估与这些生物体中改变的端粒完整性相关联的短期或长期死亡风险的概率或疾病易感性，可以测定克隆生物体的端粒。
端粒核酸序列(诸如上述那些)可用作靶序列。端粒核酸序列或任何其他重复或非重复靶核酸可以是任何长度，应理解越长的序列特异性越高。在一些实施方案中，可能希望将样品核酸***或裂解成100-10,000个碱基对的片段。在一方面，可以使用大致上500bp的片段。可以任意种本领域技术人员熟知的方式进行***或裂解，所述方法包括机械、化学和酶促方法。因此，可使核酸经历超声、弗氏压碎器(French press)、剪切或用核酸酶(例如DNA酶、限制性内切酶、RNA酶等)或化学裂解剂(例如，酸/哌啶、胼/哌啶、铁-EDTA复合物、1,10-菲咯啉-铜复合物等)处理。DNA的***可减少可阻碍准确测量靶序列长度或丰度的二级结构形成。
在各个方面，所公开的方法还包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分别与第一引物组、第二引物组和第三引物组接触之前获得染色体DNA样品的步骤；并且其中染色体DNA样品含有或包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸的至少一部分。在另一方面，染色体DNA获自固体、液体、半固体或气体样品。在再另一方面，染色体DNA获自液体样品；并且其中液体样品来自血液、唾液、尿液、血浆、血清、脑脊液(“CSF”)、痰或支气管肺泡灌洗液。在又另一方面，液体样品来自血液、血清或血浆。甚至在另一方面，染色体DNA获自固体样品；并且其中固体样品来自组织样品。在再另一方面，组织样品为组织生物活检。在又另一方面，组织生物活检来自肺、肌肉或皮肤。甚至在另一方面，染色体DNA获自骨髓。在再另一方面，染色体DNA获自脊椎动物。在又另一方面，脊椎动物为哺乳动物。甚至在另一方面，哺乳动物为灵长类动物。在再另一方面，灵长类动物为人。在其他方面，染色体DNA可来自非脊椎动物，例如来自植物。
在各个方面，所公开的方法还包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分别与第一引物组、第二引物组和第三引物组接触之前获得染色体DNA样品的步骤；并且其中染色体DNA样品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸。
在另一方面，所公开的方法还包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分别与第一引物组、第二引物组和第三引物组接触之前从血液、唾液、尿液、血浆、血清、脑脊液(“CSF”)、痰或支气管肺泡灌洗液获得染色体DNA样品的步骤；并且其中染色体DNA样品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸；并且其中获得了染色体DNA。
在另一方面，所公开的方法还包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分别与第一引物组、第二引物组和第三引物组接触之前从分离自血液、唾液、尿液、血浆、血清、脑脊液(“CSF”)、痰或支气管肺泡灌洗液的一种或多种细胞类型获得染色体DNA样品的步骤；其中染色体DNA样品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸；并且其中获得染色体DNA；并且其中分离的细胞类型包括循环肿瘤细胞、循环干细胞、淋巴细胞、粒细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和白细胞。
在另一方面，所公开的方法还包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分别与第一引物组、第二引物组和第三引物组接触之前从血液分离循环DNA片段样品的步骤；并且其中循环DNA片段样品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸；
所公开的方法的端粒产物可以由单端粒、单染色体、来自单一细胞的染色体群体或来自多个细胞的染色体群体产生。
4.聚合酶
在本文所述的方法中，需要扩增酶。例如，在使引物与靶核酸接触之后，可以用扩增酶处理反应。扩增酶通常是聚合酶，诸如DNA聚合酶。本领域中熟知多种合适的聚合酶，包括但不限于Taq DNA聚合酶、KlenTaq、Tfl聚合酶、DynaZyme等。通常，所有聚合酶均适用于本发明。在一方面，因为使用具有强3'至5'核酸外切酶活性的聚合酶倾向于去除错配的3'端核苷酸，但在一些应用中需要所述错配的3'端核苷酸阻止或延缓引物二聚体扩增，并且在其他应用中需要所述错配的3'端核苷酸进行等位基因特异扩增，因此聚合酶是缺少3'至5'核酸外切酶活性的热稳定聚合酶或被工程化为具有减弱或无功能性的3'至5'核酸外切酶活性的聚合酶(例如，Pfu(exo-)、Vent(exo-)、Pyra(exo-)等)。可用于最佳地延伸杂交引物的聚合酶混合物也可适用。在另一方面，对本发明有用的聚合酶被制成仅在适合扩增的温度下变得有活性。
在扩增温度下失去活性的聚合酶抑制抗体的存在或将所述酶隔离为使其不可用直到达到扩增温度时的形式都是合适的。这些聚合酶制剂使得可在单个反应容器中混合所有组分而防止引发非靶核酸序列。
此外，本领域技术人员应当理解，各种试剂可以被添加到反应以增加聚合酶的持续合成能力、稳定聚合酶从而避免失活、减少引物的非特异性杂交或增加复制效率。此类添加剂包括但不限于二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、甘油、聚乙二醇或蛋白制剂诸如大肠杆菌单链DNA结合蛋白、T4基因32蛋白、牛血清白蛋白、明胶等。在另一方面，本领域技术人员可以使用多种核苷酸类似物进行特定类型序列的扩增，例如富含GC的序列或重复序列。这些类似物包括但不限于c7-dGTP、羟甲基-dUTP、dITP、7-deaza-dGTP等。
5.引物
在一些方面，可以设计引物以除了一个构型之外的所有构型阻滞引物引发靶核酸延伸。例如，可以将引物组中的引物之一设计成通过在引物的3'末端创建错配碱基而阻滞引物引发靶核酸延伸。通过设计和利用这种引物，所述引物仍然能与其互补序列杂交；然而，其将仅以单一构型引发DNA合成，因此，可预测扩增子大小并且因此可预测扩增子的Tm。
例如，本文公开了这样的引物和引物组，其中，第一引物组的一种引物包含与引物的3'末端相邻的至少一个核苷酸，其中所述核苷酸与靶核酸是错配的、不互补的，但与引物组中另一种引物的3'末端的核苷酸互补。
本文还公开了这样的引物和引物组，其中，第一引物组的一种引物包含与引物的3'末端相邻的至少一个核苷酸，其中所述核苷酸与靶核酸是错配的、不互补的，但与引物组中另一种引物的3'端核苷酸互补，其中所述引物组的含有错配的引物的延伸产物可以与所述引物组中的另一种引物杂交，使得所述另一种引物可引发沿所述延伸产物的DNA合成。在一些方面，可使用所述方法来评估双链体DNA的具体链(例如染色体的“C”链或“G”链)上的端粒长度或丰度。
为了确保阻滞引物将仅以单一、特异性构型引发，可以对包括阻滞引物的引物组进行设计以使得所述引物组的引物在阻滞引物中存在的错配碱基的区域上以完全互补方式重叠。可以进行这种设计以便阻止引物二聚体形成并且使两种引物彼此引发的能力最小化。当靶核酸序列是包含多个重复序列的序列诸如在端粒中发现的重复序列(端粒序列)时，可以利用这种设计。本文他处描述了这种方法的实例，包括下文的实施例。
如本文所述，用于直接扩增端粒重复序列的引物可以包含与靶核酸的第一单链杂交的第一引物，以及与靶核酸的第二单链杂交的第二引物，其中第一链和第二链是大体上互补的。当引物与它们各自的链杂交时，引物能够通过聚合酶进行引物延伸。即，与靶核酸杂交的引物具有与靶核酸上的核苷酸残基互补的3'端核苷酸残基，使得引物可通过聚合酶延伸。选择的引物是与重复区域的重复单元互补的。例如，可以改变至少一种引物的至少一个核苷酸残基以与所述引物杂交的至少一个重复单元的核苷酸残基产生错配，其中当引物彼此杂交时，所改变的核苷酸残基还与其他引物的3'端核苷酸残基产生错配。错配的包含阻止或限制了引物延伸以及引物-引物杂交体(引物二聚体)。
用于直接扩增端粒重复序列的引物组可以包括这样的引物组，其中改变第一引物的至少一个核苷酸残基以在改变的残基与所述引物杂交的第一链的至少一个重复单元的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物彼此杂交时，所改变的核苷酸残基还与第二引物的3'端核苷酸残基产生错配。所改变的核苷酸残基可以是3'端核苷酸的一个或多个核苷酸残基，以使得当所改变的引物与靶核酸杂交时，聚合酶进行有效的延伸。例如，所改变的核苷酸残基可以是3'端核苷酸的至少1个核苷酸残基、至少2个核苷酸残基或至少3个核苷酸残基，以使得当所改变的引物与靶核酸杂交时，聚合酶进行有效的延伸。
如在本文他处讨论的，可以将引物组的引物设计成具有类似的解链温度(“Tm”)以限制不需要的扩增产物的产生并允许在单个反应体积中扩增和检测若干个靶核酸。此外，由于各种生物体的端粒具有不同的重复单元序列，因此扩增特定生物体的端粒将采用对每个不同生物体的重复单元特异的引物。人端粒序列在本文用于举例说明本发明用于直接扩增并定量串联重复的核酸序列的实施，但本发明不限于所公开的具体实施方案。
还公开了使所得扩增子的解链温度(Tm)提高至本文所述的方法的其他扩增子的解链温度之上的引物。这些引物可以被称作包含“GC-钳”的引物。“GC-钳”通常是指在引物3’末端的最后5个碱基内G或C碱基的存在，其由于G和C碱基更强的结合，而有助于促进在3’末端处的特异性结合。通常，在引物3’末端的最后5个碱基中应当避免多于3个G'或C'。然而，在本文所述的方法中，包含“GC-钳”的引物是包含5’标签序列(GC-钳)的引物，所述5’标签序列赋予所得PCR产物(扩增子)比在没有GC-钳的情况下的解链温度更高的解链温度。包含“GC-钳”的引物的5’标签序列在引物序列的5’末端上包含GC-钳，所述GC-钳与靶核酸序列的任何部分都不互补。“GC-钳”是可连接到引物的5’末端以提高扩增子的解链温度的一连串G和C核苷酸。GC钳可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸长。GC钳也可以称为富含GC的区域或富含GC的标签。
在本文所述的方法中可以使用GC-钳来提高一种扩增子的Tm。通过提高扩增子的Tm，可在高至足以使其他扩增子完全解链的温度下采集荧光信号，因此使得可在两个或更多个不同的温度下采集两个或更多个不同扩增子的荧光信号。可对GC-钳引物进行设计以用于同一个扩增反应中，由此使得不同引物上的GC-钳彼此是不相同的，以便防止能导致扩增反应停止的发夹形成或引物二聚体。
由于与靶核酸杂交的引物必须能够进行引物延伸，因此对第一引物和第二引物的改变必须是在重复单元的非互补核苷酸上。因此，在一方面，当第一引物和第二引物都包含改变的残基时，所述改变在与重复单元相邻的核苷酸位置处。在另一方面，所述改变位于不与重复单元相邻的核苷酸位置上。一般来讲，在相邻核苷酸位置处的错配提供所改变的核苷酸与3'端核苷酸之间最大数量的配对碱基或互补残基，这可能对有效地扩增短的重复序列(即3-6bp重复序列)是重要的。
引物可以被设计成与重复序列大体上互补。在一些方面，第一引物可含有与重复靶序列互补的三个重复序列并且可以相应地将多个错配引入到第一引物中。在另一方面，第二引物还可被设计成含有关于重复序列的错配，但是其被设计成使得不存在与第一引物的前几个核苷酸(例如5-7个核苷酸)的错配。因此，可使用上述的第一引物和第二引物扩增限定长度的扩增子。因此，产生的扩增子将是引物1加引物2减去2种引物之间的重叠的长度总和。这种策略排除了原始设计中产生的多种扩增子长度(Cawthon R.M.(2002).NucleicAcids Res.30，e47.doi:10.1093/nar/30.10.e47)，
引物与靶核酸的互补性不需要是完全的。在各个方面，可使用非完全互补序列来避免引物二聚体。因此，所谓的“互补”或“大体上互补”在本文中意指探针与靶序列足够互补以在正常反应条件下杂交，但不产生假阳性信号诸如引物二聚体。只要与完全互补的差异不足以完全阻止杂交，那么这种差异就是可允许的。然而，如果改变或突变的数量足以使得在最低严格度杂交条件(如下文所定义的)下都不发生杂交，那么所述序列就与靶序列不互补。
尽管引物通常是单链的，但是本文描述的核酸可以是单链或双链(如所指明的)，或包含双链或单链序列的部分。核酸可以是DNA、RNA或杂交体，在所述杂交体中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意组合以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷等)的任意组合。如本文所用，术语“核苷”包括核苷酸以及核苷和核苷酸类似物，和修饰核苷诸如氨基修饰核苷。另外，“核苷”包括非天然存在的类似结构。因此，例如，各自含有碱基的肽核酸的各个单元在本文中称为核苷。
引物核酸的大小可以变化，如本领域技术人员会理解的，长度通常在5至500个核苷酸范围内变化。例如，根据用途、所需的特异性以及扩增技术，可以使用在10与100个核苷酸之间、在12与75个核苷酸之间和15至50个核苷酸的引物。
对于任何引物对，引物彼此杂交的能力可以通过将第一引物的序列与第二引物的序列比对来进行检查。杂交体的稳定性，尤其热解链温度(Tm)，可以通过下述方法以及本领域中熟知的方法来确定。这些方法包括但不限于，最近邻域热力学计算(Breslauer，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8893-97(1986)；Wetmur，J.G.，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:227-59(1991)；Rychlik，W.等人，J.NIH Res.6:78(1994))、Wallace规则估算(Suggs，S.V.等人"Use of Syntheticoligodeoxribonucleotides for the isolation of specific cloned DNA sequences,"Developmental biology using purified genes，D.B.Brown编，第683-693页，AcademicPress，New York(1981)，和基于Bolton和McCarthy的Tm估算(参见Baldino，F.J.等人，Methods Enzymol.168：761-77(1989)；Sambrook，J.等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第10章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，(2001))。所有参考文献以引用的方式明确地并入本文。当评估杂交体稳定性时，要考虑到各个参数的影响，所述参数包括但不限于离子强度、探针长度、G/C含量和错配。这些因素的考虑对本领域技术人员来说是熟知的(参见例如，Sambrook，J.，同上)。
可以在本文所述的方法中使用的引物可以用于扩增各种靶核酸。单一引物组，例如一个引物对，可以用于扩增单一靶核酸。在另一个实施方案中，多个引物组可以用于扩增多个靶核酸。扩增可以对每个独特引物组分别进行或使用引物组的组合在单一反应容器中进行(在本领域中通常称为多路复用)。当在单一反应中使用多个引物组时，对引物进行设计以限制不需要的产物形成以及限制每个引物组的引物之间的干扰。
一般的PCR扩增反应可以根据本领域中熟知的程序进行，如上所述(参见，例如美国专利号4,683,195和4,683,202)。引物延伸步骤的时间和温度将取决于聚合酶、被扩增的靶核酸的长度和用于扩增的引物序列。充分扩增靶核酸所需的反复步骤的数量将取决于每个循环的扩增效率和靶核酸的起始拷贝数。如本领域所熟知的，这些参数可由技术人员进行调整以实现需要的扩增水平。本领域技术人员应当理解，本发明不受扩增过程中所应用的时间、温度、缓冲条件和扩增周期的变化所限制。
在使引物与靶核酸杂交中以及在所公开的扩增反应中，测定通常在严格条件下进行，所述严格条件允许在靶核酸存在的情况下形成杂交体。本领域技术人员可以改变温度、盐浓度、pH、有机溶剂、离液剂或其他变量的参数，以控制杂交严格度并且使引物与非特异性靶标的杂交最小化(即，通过使用“热启动”PCR或“降落”PCR)。
在一些方面，引物可包含可检测标记。在一些方面，引物对或引物组的一种引物或两种引物可包含可检测标记。
本文还公开了可用于实施本文所述方法的试剂盒。例如，本文公开了包括一种或多种本文描述的引物组的试剂盒。在一些方面，试剂盒可包括第一正向引物和第一反向引物，其中第一正向引物包含在退火条件下与端粒重复序列杂交的3'部分；并且其中第一反向引物包含具有不与端粒重复序列杂交的锚定序列的5'部分。
试剂盒还可包括缓冲剂、酶和用于进行扩增和扩增产物的分析的容器。
在一些方面，试剂盒可包括检测标记、聚合酶或本文所述的靶核酸中的一种或多种。
另外，本文所述的试剂盒可包括用于进行本文所述方法的任何产品和试剂以及说明书。
6.端粒长度与临床病状或最佳治疗方案的相关性
从基因组DNA确定的平均端粒长度/染色体末端是总端粒丰度的量度，并且已显示所述量度与若干个重要的生物学指标相关联。这些指标包括例如各种疾病病状的风险，例如心血管危险、癌症风险、肺纤维化风险、感染性疾病风险和死亡风险。端粒丰度还与实足年龄、体质指数、臀部/重量比和知觉应激相关联。平均端粒长度或丰度的一个量度是端粒/单拷贝(“T/S”)比。给定群体中的此类比率可以分成分位数，例如三分位数或四分位数。已经发现，由T/S比表示的端粒丰度在较低两个三分位数中的个体比在端粒长度的最高三分位数中的那些个体处于显著更高的心血管疾病风险下。
在所公开方法中，T/S比中的“S”表示至少两个低拷贝数基因的平均长度或丰度的平均值。在另一方面，T/S比中的“S”表示至少两个单拷贝基因的平均长度或丰度的平均值。在再另一方面，T/S比中的“S”表示两个低拷贝数基因的平均长度或丰度的平均值。在再另一方面，T/S比中的“S”表示两个单拷贝基因的平均长度或丰度的平均值。
一般来说，在群体中的平均端粒长度或丰度的量度(例如表示为参考群体的百分比的T/S值)的百分位数值(通常为端粒长度的最高三分位数或四分位数)与疾病风险负相关，即增加的平均端粒长度或丰度与较低疾病或死亡风险或改善的健康量度相关联，而较低的百分位数得分通常与降低的健康量度和增加的死亡和疾病风险(包括“端粒疾病”的存在)相关联，其中端粒由于基因中消极影响端粒活性或功能的突变或改变而在遗传上较短。
在群体中，端粒长度通常随着年龄而减小。因此，个体的平均端粒长度或丰度的量度可以与群体中相同年龄范围内的个人(即年龄匹配的群体)的量度相比较。例如，30岁的个人的端粒丰度的量度可能约等于30岁的群体平均值，或等于20岁或40岁的群体平均值。当与年龄和性别匹配的群体的量度相比较时，平均端粒长度或丰度的量度与健康量度的相关性可能更加有用。年龄匹配的群体的范围可以是例如1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、7岁或10岁或高至80岁或更大年龄。
通过本公开的方法从受试者样品中测定的改变的平均端粒长度或丰度可以与健康量度相关联。特别受关注的是涉及知觉应激的健康量度。明显的端粒缩短可以由遗传和环境因素来加速，所述因素包括多种形式的应激诸如氧化损伤、生化应激源、慢性发炎和病毒感染(Epel，E.S.等人，Proa Natl.Acad.Sci.USA，2004，49:17312-15)。一般健康状况的方便量度是由John Ware开发的健康调查(参见例如万维网URL sf-36.org/tools/SF36.shtml)。SF-36是多目的、短型的健康调查，其中优选地由经过培训的个体向患者仅仅提出36个问题。所述健康调查提供了功能性健康和幸福感得分的8等级概况以及基于心理测量学的身心健康综合量度和基于偏好的健康效用指数。SF-36调查被用来估计疾病负担并且比较疾病特异性基准与一般群体标准。最频繁研究的疾病和病状包括关节炎、背痛、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病、抑郁、糖尿病、胃肠病、偏头痛、HIV/艾滋病、高血压、肠道易激综合征、肾病、下背痛、多发性硬化、肌肉骨骼病状、神经肌肉病状、骨关节炎、精神病诊断、类风湿性关节炎、睡眠障碍、脊髓损伤、中风、物质滥用、手术程序、移植和创伤(Turner-Bowker等人，Health Survey&“SF”Bibliography：Third Edition(1988-2000)，QualityMetric Incorporated，Lincoln，RI，2002)。本领域技术人员应了解，一般健康状况的其他调查方法例如RAND-36可以在本公开中得到应用。
在本公开的一个方面，随时间的推移收集受试者样品，并且从这些样品中确定改变的平均端粒长度或丰度的量度。用于收集多个样品的适当时间段包括但不限于1个月、3个月、6个月、1年、2年、5年和10年(例如，最早的样品与最后的样品之间的时间可以是大约这些时间段)。这种方法允许监测患者为了改善其一般健康状况和/或监测其健康状况和/或疾病风险所作的努力。因为缩短的端粒可引发细胞死亡或可有助于癌症诱导或进展的基因组不稳定性，所以缩短的端粒长度的百分比在个体内随时间降低或维持的发现指示健康改善，而缩短的端粒的百分比随时间增加表示健康减退或恶化。
测量端粒的重复单元数在医疗诊断(例如关于疾病风险的诊断)、疾病预后和治疗学中具有多种应用。具体来说，端粒长度的测量在评估导致疾病风险的病理病状中得到应用。在本公开的一个方面，疾病是与老龄化相关联的疾病，例如但不限于心血管疾病、糖尿病、癌症、肝纤维化和抑郁。
在一方面，本公开涉及用于同种异体移植造血干细胞供体选择的方法，所述方法包括：(a)从一名或多名HLA匹配的潜在供体受试者获得样品；(b)通过所公开的方法确定每名HLA匹配的供体受试者的第一扩增子的平均端粒长度或丰度；(c)鉴定出具有比年龄匹配的对照高25个百分位数、高50个百分位数或高75个百分位数的平均端粒长度或丰度的一名或多名供体受试者；(d)从鉴定出的供体受试者获得可移植的造血干细胞样品；并且(e)将造血干细胞样品移植到受体受试者。
在一方面，本公开涉及用于同种异体移植造血干细胞供体选择的方法，所述方法包括：(a)从一名或多名HLA匹配的潜在供体受试者获得样品；(b)通过所公开的方法确定每名HLA匹配的供体受试者的第一扩增子的平均端粒长度或丰度；(c)鉴定出具有比年龄匹配的对照高25个百分位数的平均端粒长度或丰度的一名或多名供体受试者；(d)从鉴定出的供体受试者获得可移植的造血干细胞样品；并且(e)将造血干细胞样品移植到受体受试者。
在一方面，本公开涉及用于同种异体移植造血干细胞供体选择的方法，所述方法包括：(a)从一名或多名HLA匹配的潜在供体受试者获得样品；(b)通过所公开的方法确定每名HLA匹配的供体受试者的第一扩增子的平均端粒长度或丰度；(c)鉴定出具有比年龄匹配的对照高50个百分位数的平均端粒长度或丰度的一名或多名供体受试者；(d)从鉴定出的供体受试者获得可移植的造血干细胞样品；并且(e)将造血干细胞样品移植到受体受试者。
在一方面，本公开涉及用于同种异体移植造血干细胞供体选择的方法，所述方法包括：(a)从一名或多名HLA匹配的潜在供体受试者获得样品；(b)通过所公开的方法确定每名HLA匹配的供体受试者的第一扩增子的平均端粒长度或丰度；(c)鉴定出具有比年龄匹配的对照高75个百分位数的平均端粒长度或丰度的一名或多名供体受试者；(d)从鉴定出的供体受试者获得可移植的造血干细胞样品；并且(e)将造血干细胞样品移植到受体受试者。
在另一方面，受体受试者已被诊断为患有癌症、心血管疾病或具有骨髓移植的需要。
在另一方面，受体受试者已被诊断为患有癌症。在再另一方面，癌症为白血病或淋巴瘤。在又另一方面，癌症为成神经细胞瘤。甚至在另一方面，癌症为多发性骨髓瘤。
在另一方面，受体受试者已接受放射疗法和/或化学疗法治疗。在再另一方面，受体受试者处于缓解期。
在另一方面，造血干细胞样品包括获自鉴定出的供体受试者的骨髓。在再另一方面，造血干细胞样品包括获自鉴定出的供体受试者的外周血干细胞。
在一方面，本公开在评估和监测心血管疾病中得到应用。已经显示，如通过血管造影术所确定，白血球中的端粒长度在患有严重三支冠状动脉疾病的患者中比其在具有正常冠状动脉的个体中更短(Samani，N.J.等人，Lancet，2001，358:472-73)，并且在50岁之前经历过早心肌梗塞的患者中的端粒长度与没有这种病史的年龄和性别匹配的个体相比也更短(Brouilette S.等人，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.，2003，23:842-46)。Brouilette等人(Lancet,2007，369:107-14)已经提出，在易患冠心病的人中较短的白细胞端粒可以指示其他心血管风险因子对端粒长度的累积影响。增加的氧化应激也造成动脉粥样硬化，并且已经显示增加的氧化剂应激增加体外的端粒耗损速率(Harrison，D.，Can.J.Cardiol.，1998，14(增刊D):30D-32D；von Zglinicki，T.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，2000，908:99-110)。在横向研究中，也已经报道了吸烟、体质指数和1型糖尿病与较短的白细胞端粒长度相关联(Valdes,A.等人，Lancet，2005，366:662-64；Jeanclos，E.等人，Diabetes，1998，47:482-86)。已经显示增加的生活应激(一种已知增加冠心病风险的因素)与较短的端粒相关联，这可能是由于增加的氧化应激(Epel，2004，同上)。因此，具有高体质指数、糖尿病和/或增加的生活应激的吸烟者和患者将全部受益于根据本公开的方法对其端粒丰度进行的确定和连续监测。
2型糖尿病的特征为较短的端粒(Salpea，K.和Humphries，S.E.，Atherosclerosis，2010，209(l):35-38)。较短的端粒在1型糖尿病患者中也已经被观察到(Uziel O.等人，Exper.Gerontology，2007，42:971-978)。1型糖尿病中的疾病病原学与2型糖尿病中的略有不同，但是在这两种情况下，β细胞衰竭是全面爆发的疾病的最终触发因子。端粒长度因此是糖尿病的有用标记物，因为其与疾病的进展相关联。Adaikalakoteswari等人(.Atherosclerosis，2007，195:83-89)已经显示，在具有糖尿病前期葡萄糖耐受性受损的患者中的端粒与对照相比更短。此外，端粒缩短已经与糖尿病并发症诸如糖尿病性肾病(Verzola D.等人，Am.J.Physiol.，2008，295:F1563-1573)、微量白蛋白尿(Tentolouris，N.等人，Diabetes Care，2007，30:2909-2915)和上皮癌(Sampson，M.J.等人，Diabetologia，2006，49:1726-1731)有关联，而端粒缩短似乎在糖尿病得到良好控制的患者中有所减弱(Uziel，2007，同上)。本公开的方法特别适用于监测糖尿病前期和糖尿病患者的状况，以提供这些并发症和其他疾病的早期警告。
本公开适用于确定各种类型的癌细胞的端粒长度，因为端粒酶活性的活化与细胞的永生化相关联。虽然正常人体细胞不表达或仅短暂表达端粒酶且因此随着每次细胞***缩短其端粒，但大多数人癌细胞通常表达高水平的端粒酶并且显示出不受限制的细胞增殖。高端粒酶表达使得细胞长期增殖并扩张并且因此支持肿瘤生长(Roth，A.等人,inSmall Molecules in Oncology，Recent Results in Cancer Research，U.M.Martens(编)，Springer Verlag，2010，第221-234页)。较短的端粒与癌症风险显著相关联，尤其是膀胱癌和肺癌、与吸烟有关的癌症、消化***和泌尿生殖***的癌症。过度的端粒缩短可能在加速肿瘤发作和进展方面起作用(Ma H.等人，PLoS ONE，2011，6(6)：e20466.doi:10.1371/journal.pone.0020466)。研究已经进一步显示，缩短的端粒对乳腺癌风险的影响对于某些群体子组诸如绝经前女性和具有较差抗氧化能力的女性来说是显著的(Shen J.等人，Int.J.Cancer，2009，124:1637-1643)。除了一般地评估和监测癌症以外，如果利用源自唾液样品的基因组DNA，则本公开特别适用于监测口腔癌。
肝硬化的特征为器官的纤维化渐增，其常常与显著的炎性浸润相关联。Wiemann等人(FASEB Journal,2002，16(9):935-982)已经显示，端粒缩短是人肝硬化的与疾病和年龄无关的征象。端粒缩短存在于由病毒性肝炎(慢性肝炎A和B)、毒性肝损伤(酒精中毒)、自体免疫和胆汁郁积(PBC和PSC)诱发的硬化中；端粒在与患者年龄无关的硬化中一律很短。端粒缩短和衰老特异性地影响硬化的肝中的肝细胞，并且所述两个参数与硬化期间的纤维化的进展强烈相关联。因此，本公开的方法在诊断和监测肝纤维化方面得到应用。
抑郁已经被比作“加速老龄化”的状态，并且抑郁的个体具有各种老龄化疾病诸如心血管和脑血管疾病、代谢综合征和痴呆的较高发病率。患有复发性抑郁的人或暴露于慢性应激的人表现出白血球中的较短端粒。较短的端粒长度与复发性抑郁和指示暴露于慢性应激的皮质醇水平相关联(Wikgren，M.等人，Biol.Psych.，2011，DOI：10.1016/j.biopsych.2011.09.015)。然而，并不是所有抑郁的个体都显示同等缩短的端粒，因为抑郁发作在一生中有很大变化。长期遭受抑郁的人当与对照群体相比时具有显著更短的端粒，这是由于较长时间暴露于氧化应激和由心理应激诱发的炎症(Wolkowitz等人，PLoSOne，2011，6(3):e17837)。因此，本公开的方法可以在监测抑郁方面得到应用。
异常端粒长度与慢性感染相关联，所述慢性感染包括HIV(Effros RB等人，AIDS.1996年7月；10(8):F17-22；Pommier等人Virology.1997，231(1)：148-54)；以及HBV、HCV和CMV(Telomere/telomerase dynamics within the human immune system：effectof chronic infection and stress.(Effros RB，Exp Gerontol.2011年2月-3月；46(2-3)：135-40。Rejuvenation Res.2011年2月；14(1):45-56.doi:10.1089rej.2010.1085.Epub 2010年9月7日。)
In Harley等人(“A natural product telomerase activator as part of ahealth maintenance program”，Harley CB、Liu W，Blasco M，Vera E，Andrews WH，BriggsLA,Raffaele JM，Rejuvenation Res.2011年2月；14(l):45-56)中，发现了CMV血清反应阳性的个体相比于CMV血清反应阴性的个体具有更短的端粒，而且，在降低衰老CD8+/CD28-细胞的丰度方面，CMV阳性受试者更可能响应于TA-65的营养补充方案(由天然产物衍生的端粒酶激活剂连同其他补充物)，这表明了结合施用产生较长端粒的端粒酶激活剂或其他药剂用于测量短端粒的平均端粒长度或丰度的伴随诊断应用。
平均端粒长度的测量可以被用作预后疾病进展和治疗结果的指标。
一项研究报道，在患有慢性HCV感染的患者中，CD4+细胞中的端粒长度与炎症等级、纤维化阶段、实验室严重度指数、随后的肝功能代偿不全和治疗结果有关(Hoare等人，J.Hepatol.，2010，53(2):252-260)。
在另一个报道中，较长的白细胞端粒长度预测乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌的风险增加(Liu等人，2011,117(18):4247-56。)
在HIV的情况下，端粒缩短是由病毒性感染引起。此外，用于治疗HIV的核苷类似物逆转录酶抑制剂是端粒酶抑制剂(Strahl和Blackburn，Mol Cell Biol.，1996，16(l):53-65；Hukezalie等人，PLoS One，2012，7(11):e47505)。短端粒丰度的测量可能有助于确定HAART治疗的副作用和功效。
本公开还在诊断与老龄化的早发有关的疾病方面得到了应用。例如，患有哈钦森-吉尔福特早衰症(Hutchinson-Gilford progeria)疾病的个体显示出过早老龄化以及与端粒长度损失相关联的成纤维细胞的增殖潜力下降(Allsopp,R.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89:10114-10118)。根据本公开的方法对端粒重复序列数进行扩增和定量可用于确定疾病风险或预后并采取如上所述的适当干预步骤。
在本公开的一个方面，端粒特异性疾病的存在和进展都可以使用样品来确定。端粒疾病与端粒的异常或过早缩短相关联，这可以例如起因于端粒酶活性的缺陷。端粒酶是真核细胞中端粒DNA的复制和保护所需要的核糖核蛋白复合物。缺乏端粒酶的细胞经历端粒DNA的渐进性损失，这导致活力损失并伴随有基因组不稳定性的增加。这些疾病可能是遗传的并且包括某些形式的先天性再生障碍性贫血，其中骨髓干细胞的细胞***不足导致严重贫血。皮肤和肺的某些遗传性疾病也是由端粒酶缺陷引起。对于端粒疾病来说，针对T/S<0.5的阈值适于一些病状。另外，常用的度量是针对年龄调整的百分位数端粒得分相对于正常群体小于<10％或优选<1％。
先天性角化不良(DKC)，又称为津-恩-科三氏综合征(Zinsser-Engman-Colesyndrome)，是一种罕见的进行性骨髓衰竭综合征，其特征为粘膜皮肤异常：网状皮肤色素沉着过度、指甲营养不良和口腔粘膜白斑病(JJyonouchi S.等人，Pediatr.AllergyImmunol.，2011，22(3):313-9；Bessler M.等人，Haematologica，2007，92(8)：1009-12)。有证据表明这种病症中存在端粒酶功能障碍、核糖体缺乏和蛋白质合成功能障碍。早期死亡常常与骨髓衰竭、感染、致命性肺并发症或恶性肿瘤相关联。这种疾病在以下三种类型之一中是遗传的：常染色体显性、常染色体隐性或最常见形式X连锁隐性(其中负责DC的基因由X染色体携带)。使用本公开的方法对疾病进展进行早期诊断和测量对于具有这些遗传特征的家族而言非常有益，从而使得利用合成代谢类固醇或骨髓刺激药物进行早期治疗可以有助于防止骨髓衰竭。本公开的非侵入性、对患者友好的唾液测试方法特别适用于DKC，因为婴儿和小孩需要测试和连续监测。
特发性间质性肺炎的特征为纤维化和炎症的组合对肺实质的损伤。特发性肺纤维化(IPF)是这些疾病的一个实例，其导致肺的渐进性瘢痕形成。纤维性瘢痕组织在肺中随着时间而累积，影响了其向身体提供足够氧的能力。端粒酶基因TERT和TERC的编码区中的杂合子突变已经在特发性间质性肺炎的家族性和散发性病例中被发现。带有突变的所有受影响患者都具有短端粒。患有IPF的个体中的大部分具有短的端粒长度，这无法由端粒酶中的编码突变来解释(Cronkhite，J.T.等人，Am.J.Resp.Crit.Care Med.，2008，178:729-737)。因此，端粒缩短可以被用作对这种年龄相关疾病的倾向增加的标志(Alder，J.K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2008，105(35)：13051-13056)。此外，IPF的过程因人而异。对于一些人来说，所述疾病可以历经多年缓慢和逐渐地进展，而对于其他人来说，其可以快速地进展。本发明的方法可以方便地用于监测肺纤维化的过程并且采取如上所述的适当干预步骤。
再生障碍性贫血是其中骨髓停止为身体制造足够的红血球、白血球和血小板的疾病。骨髓所制造的任何血细胞是正常的，但是并不足够。再生障碍性贫血可以是中度、严重或极度严重的。患有严重或极度严重的再生障碍性贫血的人处于威胁生命的感染或出血的风险下。患有再生障碍性贫血、具有短端粒或携带端粒酶突变的患者发展脊髓发育不良的风险和导致染色体异常和癌症的基因组不稳定增加(Calado等人Leukemia(2011)，1-8)。
端粒酶缺乏可以引起造血干细胞中不同程度的端粒缩短并且导致染色体不稳定和恶性转化(Calado，R.T.和Young，N.S.，The H ematologist，2010万维网URLhematology.org/Publications/Hematolo gist/2010/4849.aspx)。具有较短端粒的再生障碍性贫血患者具有较低生存率，并且在免疫疗法后比具有较长端粒的那些患者复发的可能性大得多。Scheinberg等人(JAMA，2010，304(12):1358-1364)发现，复发率随着端粒长度的增加而下降。具有最短端粒的患者组还处于转变成骨髓癌的较高风险下，并且具有最低的总体生存率。本公开的方法可以用于再生障碍性贫血患者中以监测发展主要并发症的风险，使得可以相应地调整个体的临床管理。
在另一方面，本公开可用于监测治疗剂的有效或筛选影响端粒长度或端粒酶活性的候选药物。监测端粒特征的能力可以提供用于检查特定疗法和药理学药剂的有效性的窗口。个体中的疾病状态对特定疗法的药物响应性可以通过本公开的方法来确定。例如，因为细胞的增殖潜力与端粒完整性的维持相关，所以本公开在监测癌症疗法的有效性方面得到应用。如上所述，虽然正常人体细胞不表达或仅短暂表达端粒酶且因此随着每次细胞***缩短其端粒，但大多数人癌细胞通常表达高水平的端粒酶并且显示出不受限制的细胞增殖。Roth等人(同上，2010)已经提出，在肿瘤中具有极短端粒(其中大多数细胞中的最短端粒接近于端粒功能障碍)且具有高端粒酶活性的癌症个体可能最得益于抗癌端粒酶抑制药物。因为端粒酶在大多数正常细胞中不被表达或被短暂表达并且处于极低水平下，所以端粒酶抑制疗法相比常规的化学疗法可能对正常细胞的毒性更小。此类药物的一个实例是基于短寡核苷酸的端粒酶抑制剂伊美司他(imetelstat)(先前名为GRN163L)。伊美司他是第一代寡核苷酸GRN163的新型基于脂质的缀合物(Asai，A.等人，Cancer Res.，2003，63:3931-3939)。然而，在正常血细胞(特别是粒细胞)中具有极短端粒的癌症患者处于伊美司他对增生组织诸如骨髓产生不良影响的较高风险下。Rattain等人(2008)发现，具有短粒细胞端粒长度的此类受试者更可能患上骨髓衰竭综合症，诸如中性粒细胞减少症或血小板减少症。在这种情况下，医生可能开出较低剂量的伊美司他、不同的药物，或更频繁地监测骨髓问题。
在其他方面，药物功效在于治疗老龄化疾病，例如但不限于心血管疾病、糖尿病、肺纤维化、肝纤维化、间质性肺炎和抑郁。在心血管疾病的情况下，Brouilette等人报告，相比对照组具有更短端粒长度的中年男性最得益于使用普伐他汀(pravastatin)的降脂疗法(Brouilette，S.W.等人，Lancet，2007，369:107-114)。Satoh等人(Clin.Sci.，2009，116:827-835)指示，当与经温和普伐他汀疗法治疗的患者相比时，在经阿托伐他汀(atorvastatin)疗法的患者中集中降脂疗法更好地保护端粒免遭侵蚀。本公开的方法可以用于监测他汀类在经治疗的患者中的功效，其中较短的端粒长度与较好的药物功效相关联。因为具有最长端粒的受试者平均来说未得益于预防性他汀类，所以医生可能建议患者要尤其顺应良好的生活方式***(amolopidine)(CADUET)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)(CRESTOR)、西他列汀(sitagliptin)/辛伐他汀(simvastatin)(JUVISYNC)、氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOL)、普伐他汀(PRAVACHOL)、阿托伐他汀(LIPITOR)、匹伐他汀(pitavastatin)(LIVALO)和依泽替米贝(ezetimibe)/辛伐他汀(VYTORIN)。
在一方面，本公开涉及用于再分级心血管疾病风险的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品，其中受试者已被诊断为符合针对低强度他汀类疗法的2013ACC/AHA治疗血液胆固醇之指南标准；(b)通过所公开的方法确定样品中的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子的平均长度或丰度；(c)当样品被确定出具有比年龄匹配的对照低25个百分位数、50个百分位数或75个百分位数的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子平均长度或丰度时将受试者诊断为处于较高的心血管风险下；并且(d)向被诊断为处于较高的心血管风险下的受试者施用以下项：(i)修改的他汀类疗法；和/或(ii)已知用于治疗心血管疾病的第二治疗剂。
在一方面，本公开涉及用于再分级心血管疾病风险的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品，其中受试者已被诊断为符合针对低强度他汀类疗法的2013 ACC/AHA治疗血液胆固醇之指南标准；(b)通过所公开的方法确定样品中的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子的平均长度或丰度；(c)当样品被确定出具有比年龄匹配的对照低25个百分位数的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子平均长度或丰度时将受试者诊断为处于较高的心血管风险下；并且(d)向被诊断为处于较高的心血管风险下的受试者施用以下项：(i)修改的他汀类疗法；和/或(ii)已知用于治疗心血管疾病的第二治疗剂。
在一方面，本公开涉及用于再分级心血管疾病风险的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品，其中受试者已被诊断为符合针对低强度他汀类疗法的2013 ACC/AHA治疗血液胆固醇之指南标准；(b)通过所公开的方法确定样品中的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子的平均长度或丰度；(c)当样品被确定出具有比年龄匹配的对照低50个百分位数的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子平均长度或丰度时将受试者诊断为处于较高的心血管风险下；并且(d)向被诊断为处于较高的心血管风险下的受试者施用以下项：(i)修改的他汀类疗法；和/或(ii)已知用于治疗心血管疾病的第二治疗剂。
在一方面，本公开涉及用于再分级心血管疾病风险的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品，其中受试者已被诊断为符合针对低强度他汀类疗法的2013 ACC/AHA治疗血液胆固醇之指南标准；(b)通过所公开的方法确定样品中的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子的平均长度或丰度；(c)当样品被确定出具有比年龄匹配的对照低75个百分位数的相对于第二扩增子和第三扩增子的平均丰度的第一扩增子平均长度或丰度时将受试者诊断为处于较高的心血管风险下；并且(d)向被诊断为处于较高的心血管风险下的受试者施用以下项：(i)修改的他汀类疗法；和/或(ii)已知用于治疗心血管疾病的第二治疗剂。
在其他方面，可以测定在端粒疾病(例如但不限于先天性角化不良、肺纤维化和再生障碍性贫血)治疗中的药物有效性。例如，先天性角化不良和肺纤维化都用高剂量的类固醇来治疗，众所周知，所述类固醇具有众多有害的副作用。因此非常期望使用最低可能的类固醇剂量，这使得本公开的方法成为用于监测这些患者的有价值工具。
在另一方面，本公开被用作筛选影响调节端粒长度(诸如端粒酶活性)的生物途径的候选药物、膳食补充剂和其他干预(包括生活方式改变)的一般方法。以定量方式快速和特异性地扩增端粒重复序列的能力提供了一种用于鉴定影响细胞中的端粒动力学的小分子、候选核酸和肽剂及其他产品或干预的高通量筛选法。对正常细胞具有正向端粒延长作用的候选药物或其他候选产品在治疗退行性病状或细胞衰老相关病状方面将优于具有端粒缩短(或端粒酶抑制)作用而其他方面都等同的那些药物或产品。在治疗癌症的情况下，尤其在癌细胞中具有负向的端粒缩短作用的药物将是优选的。
实施例
实施例1-三重qPCR测定
每个PCR反应在标准384孔测定板的10μL总体积/孔中进行。标准反应混合物含有以下组分：5ng靶DNA、1.0μM染料(Biotium，Hayward，California)、300nM TelG修饰型引物、300nM Tel C修饰型引物、300nM B2M-F引物、300nM B2M-R引物、100nM B2M探针、1X RNA酶P混合物(拷贝数参考测定RNA酶P，Thermo Fisher Scientific，Inc.)、1X Quantifast探针PCR主混合物(QIAGEN，Inc.，Germantown，Maryland)。下表2提供了各种引物序列。
表2.
*B2M-P探针寡核苷酸具有共价连接至引物序列的5'端的Cy5基团和共价连接至引物序列的3'端的IowaRQ部分。
用于所公开的三重qPCR测定的标准循环条件是示出在表3中的那些。
表3.
*在这个步骤中进行信号数据采集。
用于所公开的三重qPCR测定中的引物、靶核酸和各种扩增子的检测通道在下表4中给出。利用二阶导数法使用Roche LC480中的绝对定量方法定量每种靶标。利用嵌合型男性基因组DNA的8点、2倍稀释液来生成标准曲线，从所述标准曲线计算针对每个样品的三个靶标中的每个的浓度。使用下述基因组DNA浓度的8点标准曲线在表4中示出。使用T、B和R的浓度计算平均端粒长度。
表4.
实施例2-评估Tel G修饰型和Tel C修饰型引物浓度的影响
使用上述的标准反应条件，不同的是改变了Tel G修饰型和Tel C修饰型的浓度。检查了下列浓度：400nM Tel G修饰型和400nM Tel C修饰型；300nM Tel G修饰型和100nMTel C修饰型；600nM Tel G修饰型和100nM Tel C修饰型；300nM Tel G修饰型和300nM TelC修饰型；和600nM Tel G修饰型和300nM Tel C修饰型。在前述Tel G修饰型/Tel C修饰型浓度条件下的反应的解链曲线示出在图2A-图2F中。数据显示，当反应在300nM Tel G修饰型和300nM Tel C修饰型条件下进行时，所有三个靶标具有类似的扩增幅度，这表明所有三个PCR反应产生大约类似量的产物并且测定达到三个靶标的所需平衡。当PCR反应结束达到平衡时的三种扩增子的相当量是PCR试剂(酶、核苷酸、引物)均未限制三个PCR产物中的任一种的指示。
实施例3-扩增效率
利用嵌合型男性基因组DNA的8点、2倍系列稀释液来计算PCR效率。针对每点的最终PCR反应中的DNA浓度示出在表5中。针对所测试的每种引物组合的每种靶标的PCR效率用Roche LC480程序中的绝对定量方法获得并且汇总在表6中。
表5.
标准点 PCR中的最终浓度(ng/μl)
Stdl 5
Std2 2.5
Std3 1.25
Std4 0.625
Std5 0.3125
Std6 0.1563
Std7 0.0781
Std8 0.0391
表6.
实施例4-扩增效率
在各种靶DNA(嵌合型M DNA)浓度下进行所公开的三重qPCR测定。交点(Cp)(根据二阶导数法通过Roche LC480程序计算的)相对于端粒、RNA酶P和β2-微球蛋白的input DNA的log(浓度)的线性回归线和数据示出在图3A-图3C中。针对三个靶标中的每个在0.0391ng/μL至5ng/μL靶DNA，即128倍范围下实现R2>0.999。因为在10μL PCR反应中使用3μL靶DNA，所以这对应于在添加至反应的3μL体积中的0.13ng/μL至16.7ng/μL靶DNA的范围。因此，所述测定可检测并定量至少低至0.13ng/μL的靶DNA，但是可能的是更低浓度的靶DNA可以在所公开的三重qPCR测定的条件下检测。在这个研究中使用的最高基因组DNA最终反应浓度为5ng/μL。据观察，RNA酶P和β2-微球蛋白靶标的扩增曲线的基线高于使用的最高基因组DNA浓度(嵌合型M DNA)下的标准曲线点的剩余部分(参见图4A-图4C)。
实施例5-在无模板对照条件下进行的测定
使用九个无模板对照(“NTC”)样品进行所公开的三重qPCR测定。在单一测定板中使用九个NTC样品进行实验。端粒与RNA酶P靶标的NTC Cp全部大于35；而对于B2M的9个孔中的三个具有5的伪像NTC Cp calling，并且其他6个孔不具有Cp calling。应当指出的是，尽管B2M孔具有5的伪像Cp calling，但是图5C示出的数据显示从扩增数据中观察到最小的扩增。这些数据表明在所公开的三重qPCR测定的条件下，几乎不存在NTC信号干扰样品Cp值的计算的风险。
实施例6-PCR效率
三个质量控制DNA样品、男性嵌合型参考DNA和四个患者DNA样品的PCR效率通过进行针对每个样品使用8点、2倍系列稀释的所公开的三重qPCR测定获得，其中最终PCR反应中的最高浓度为3ng/μL(参见表7)。稀释的DNA样品运行两次并且PCR效率汇总在表8中。当比较两次运行时，PCR效率存在显著量的变化。尽管PCR效率存在差异，但是当比较两次运行时获得针对RNA酶P的3.4％和针对B2M的3.1％的平均CV。表8示出了针对RNA酶P获得的CV值，并且表9示出了针对β2-微球蛋白靶标获得的CV值。表8和表9中的数据显示CV在较低浓度的靶DNA下较高。当去除最低浓度点时，平均CV对于RNA酶P降低至2.9％并且对于β2-微球蛋白降低至2.5％。基于β2-微球蛋白的CV值，最终PCR反应中的最佳浓度可以是0.5ng/μL(在标准点3与标准点4之间)。因此，患者样品的归一化源DNA最佳应当为约1.7ng/μL。
表7.
标准点 反应中的最终浓度(ng/μl)
Stdl 3
Std2 1.5
Std3 0.75
Std4 0.375
Std5 0.1875
Std6 0.09375
Std7 0.04688
Std8 0.02344
表8.
*T1和T2表示使用Tel G修饰型和Tel C修饰型引物进行的两个独立反应；R1和R2表示使用RNA酶P引物进行的两个独立反应；并且B1和B2表示使用β2-微球蛋白引物进行的两个独立反应。
表9.
表10.
QC1 QC2 QC3 PT1 PT2 PT3 PT4
Stdl 0.8％ 1.5％ 1.6％ 2.5％ 1.3％ 1.0％ 0.6％
Std2 1.8％ 1.4％ 1.6％ 1.7％ 2.3％ 0.9％ 1.4％
Std3 1.6％ 2.1％ 1.4％ 1.2％ 2.9％ 2.7％ 0.9％
Std4 1.7％ 1.4％ 1.5％ 1.3％ 2.1％ 1.6％ 2.6％
Std5 2.5％ 4.4％ 3.6％ 2.2％ 4.2％ 1.9％ 4.1％
Std6 1.9％ 2.8％ 1.9％ 2.6％ 5.4％ 1.0％ 2.8％
Std7 5.0％ 3.2％ 9.4％ 3.7％ 2.5％ 7.9％ 4.2％
Std8 11.3％ 4.4％ 10.3％ 5.0％ 6.0％ 7.7％ 4.9％
实施例7-使用所公开的三重qPCR测定方法在患者群体中进行T/S确定
如本文所述的所公开的三重qPCR测定方法使用来自无症状群体的163个患者DNA样品。DNA样品从获自每名患者的血液提取。结果建立了(图6A)中的0.61-1.55的T/S比范围。检查的患者群体具有21-78岁的年龄范围(平均51岁)，其中性别分布为82名女性和81名男性。观察到T/S比与年龄之间的强相关性(R2＝0.36，参见图6B)。所公开的三重qPCR方法显示出非常低的测定间CV值(参见图7A和图7B)。例如，甚至在PCR测定板手动地由单一个体移取出时，这163个样品的平均测定间CV为1.9％。相比之下，应当指出的是，当如由Cawthon(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47)所述那样进行测定时，典型的板间和操作器间变异性(CV值)在5-10％范围内。在由Martin-Ruiz等人(Int.J.Epidemiol.(2014)doi：10.1093/ije/dyul91)的最近公布中，作者报道在单个实验室CV内qPCR的批间和批内CV值在2.3％至28％”范围内。与先前所述的开发用于端粒长度测定的qPCR方法，例如，Cawthon的方法(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47)相比，使用本发明的方法获得的数据证明所公开的三重qPCR测定提供大许多的精确度。此外，与由Martin-Ruiz等人针对批间变异性报道的平均CV值(Int.J.Epidemiol.(2014)doi：10.1093/ije/dyu191)相比，由本文所述的数据提供显著改善的CV值。
实施例8-所公开的三重qPCR测定方法中的总变异性
在单一测定中一式三份地测定9个患者样品中的每个，所述单一测定在单一96孔板中由三个操作器进行。每个测定中患者样品的样品位置如表11中所示。对于三个复制品中的每个计算T/S比，提供“轮次内”变异性的估计值。然后在五个单独的天重复板布置，早晨一次，晚上一次，使用3个不同的操作器，每个方案总共10个板复制品，示出在表12中。十个板中有九个通过QC并且用于分析。
表11.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A APR_7 APR_7 APR_7
B APR 1 APR 8 APR 1 APR 8 APR 1
C APR 2 APR 9 APR 2 APR 8
D APR3 APR9 APR2 APR9
E APR4 APR3 APR3
F APR 5 APR 4 APR 4
G APR 6 APR 5 APR 5
H APR 6 APR 6
表12.
第1天 第2天 第3天 第4天 第5天
AM 操作器1 操作器3 操作器3 操作器1 操作器1
PM 操作器2 操作器2 操作器2 操作器3 操作器2
来自如上所述进行的多次测定的样品数据使用其中“运行”为随机效应的随机效应模型分析。获得轮次内变异性、轮次间变异性和总轮次变异性的估计值。研究设计和数据分析符合评价定量测定的精确性能的指南，所述指南概述在CLSI(先前称为NCCLS)指南中。在由9个样品覆盖的T/S范围内，测定内CV、测定间CV和总CV是优选的(图8A-图8C)。测定内CV和测定间CV在接近于0至2.9％的范围内，而总CV在-2.2％至3.5％的范围内。
实施例9-具有端粒序列的大肠杆菌克隆
通过扩增来自获自膀胱癌细胞系UMUC-3的基因组DNA的靶序列来制备PCR产物。PCR反应使用引物Tel-4rp(SEQ ID NO.：14；获自Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA，“IDT”)和SUS SEQ ID NO.：15；获自IDT；HPLC纯化的)。在以下条件下进行反应：40ng UMUC-3基因组DNA、1.5mM MgCl2、500nM SUS引物、500nM Tel-4rp、300μM dNTP(BioRad，目录号170-8874)、0.125U/μl铂Taq(Invitrogen)，于50μl反应中。PCR循环情况如下：94℃下1个循环，2min；94℃下35个循环，15s；65℃，30s；72℃，5min；以及72℃下1个循环，20min。使用0.8％E-凝胶(目录号G5018-08；Thermo Fisher Scientific Corporation，Carlsbad，CA)通过凝胶电泳纯化PCR产物，并且使用GeneClean Turbo试剂盒(目录号1102-200；MP Biomedicals，LLC，Santa Ana，CA)从凝胶中分离0.8-1.2kb大小范围的产物。然后，将PCR产物克隆到TA克隆载体(用于亚克隆的TA试剂盒；目录号K4510-20；Thermo Fisher Scientific Corporation，Carlsbad，CA)中。将具有克隆的PCR产物的载体转化到转化感受态大肠杆菌细胞中，并且在生长过夜之后，从转化琼脂板中挑拣处所选择的菌落。对于所选择菌落测定克隆到质粒中的DNA序列。一个克隆Y3(SEQ ID NO.：12)含有135bp端粒序列片段。选择这种克隆为绝对端粒长度参考源。
实例10-制备绝对端粒参考
使用获自上述Y3克隆的滚环扩增(“RCA”)的DNA作为PCR扩增的模板。使用两轮PCR扩增获得绝对端粒参考。在第一轮PCR扩增中，在具有1μl RCA产物材料的反应中使用M13正向引物(SEQ ID NO.：16)和M13反向引物(SEQ ID NO.：17)。用QIAquick PCR纯化试剂盒(目录号28104；QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化PCR扩增产物Y3-M13 PCR产物，然后通过nanodrop UV-Vis分光光度计(NanoDrop 8000，Thermo Fisher Scientific)定量。在第二轮PCR扩增中，将M13正向引物(SEQ ID NO.：16)和TeloAnchor引物(SEQ ID NO.：18)与5ng先前纯化的Y3-M13 PCR产物一起使用。第二轮PCR扩增的产物Y3-Telotail PCR产物通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化并且通过Picogreen测定(Quant-iTTMdsDNA试剂，目录号P11495，Thermo Fisher Scientific，Inc.)定量。使用Y3-Telotail PCR产物作为绝对端粒参考DNA。
实施例11-DNA印迹分析
根据进行稍微修改的已公布协议(Masayuki K.等人Nature Protocols 5，1596-1607(2010)进行DNA印迹分析。简而言之，从获自史丹佛血液中心(Stanford Bloodcenter)处的匿名供体的非选择血液样品提取基因组DNA并且分离出高分子量DNA。通过在40μL的反应体积中与20U HphI(目录号R0158S，New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA)和20U MnlI(目录号R0163S，New England Biolabs Inc.)一起在37℃下孵育6小时或过夜(≥16h)来消化基因组DNA(3-5μg)。在0.5X TBE存在下使用0.5％琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分离消化的基因组DNA，其中电泳在BioRad Sub-Cell GT凝胶装置中在40VDC下进行16小时。使用了DIG标记的尺寸标记III(目录号11218603910，Roche Applied Science，Indianapolis，IN)和VII(目录号11669940910，Roche Applied Science)。将凝胶中的DNA脱嘌呤化(0.25M HCl)、变性(0.5M NaOH，1.5M NaCl)并且转移至TurboBlotterTM***(目录号10416316，GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway，NJ)。在20X SSC转移缓冲液存在下转移到Nytran SPC膜上，并且进行4小时至过夜(约16小时)。通过在Stratagene交联剂中在120mJ cm-2下用DNA两次处理膜将DNA交联至膜，并且在DIG Easy Hyb(目录号11603558001，Roche Applied Science)中在37℃下预先杂交2小时，接着与2.5pmol DIG标记的TeloProbe(SEQ ID NO.：19；获自IDT和HPLC纯化的)/mL Easy Hyb溶液(使用总共30pmol探针或针对12mL使用6.6μL)在37℃下杂交过夜。通过抗地高辛-AP(目录号1109327491，Roche Applied Science)检测信号并且使用BioRad ChemiDoc成像仪捕捉图像。
实施例12-端粒限制性片段长度定量
利用ImageJ软件使用以下程序定量TRF(参见http://imagej.nih.gov/ij/)。
生成将移动性转换为分子量的标准曲线。在ImageJ程序中，从孔的顶部至底部划出一条直线，然后选择菜单选项：选择分析(Analyze)->绘制谱图(Plot Profile)、选择“列表(List)”,然后在新窗口中，“文件(File)->另存为(Save As)”并且保存分子梯的谱图。在Excel中打开谱图，用图表表示距离相对于强度的关系。人工找出对应于每个峰的距离/强度。用图表表示针对峰的距离相对于Log(分子量)的散点图并且生成线性公式Log(MW)＝A*距离+B。
每个泳道的端粒限制性片段(TRF)的生成。如上所述，在ImageJ中，针对每个泳道生成谱图并且通过应用上述公式针对每个数据点使用Excel将距离转化为Log(MW)，并且将Log(MW)数据转化为MW数据。我们然后通过将强度(来自Image J谱图)数据除以MW数据获得强度/MW数据。20kb和1kb位置基于MW数据组被识别出并且被用于使用20kb至1kb的数据点通过下述公式计算TRF长度(kbp)：TRF＝SUM(强度)/SUM(I强度/MW)。
实施例13-aTL标准曲线的PCR效率
通过将纯化的Y3-Telotail PCR产物稀释在DNA悬浮缓冲液(10mM Tris·HCl，0.1mM EDTA)中制备Y3-Telotail PCR产物的1ng/μl储备溶液(通过PicoGreen方法测定的)并且将所述储备溶液以20μL等分试样储存在-20℃下。用DNA悬浮缓冲液进行1:50稀释以制备20pg/μL的Y3-Telotail PCR产物。进一步进行3倍系列稀释液以创建8点标准曲线，其中20pg/μL为最高浓度。使用先前所述的Cawthon(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47)的qPCR测定确定Y3-Telotail PCR产物的8点系列稀释液的T/S比。利用绝对定量法和二阶导数法使用Roche LC480软件计算PCR效率。平均效率为91.6％(STDEV＝6％)。这稍微高于参考标准嵌合型男性基因组DNA的PCR效率(平均值88.4％)。所有四次运行具有大于0.99的线性R2(表13)。典型的标准曲线示出在图9中。
表13.
实施例14-测试样品中aTL的计算
A.将Y3-Telotail PCR DNA浓度转换为端粒序列浓度。
Y3-Telotail PCR产物为268bp长的双链扩增子，其中135bp的扩增子是完全的端粒重复序列(TTAGGG:CCCTAA)。这种扩增子的分子量(“MW”)为165477.2，并且一分子的扩增子的重量为MW除以阿佛加德罗常数(Avogadro's number)。因此，Y3-Telotail PCR产物标准物的重量为：
165477.2/6.02x1023＝2.74879x10-19g。
PCR反应中使用的标准物(STD1)的最高浓度为基于Picogreen测定的2pg/μL DNA。因此，提供STD1中的DNA分子数/μL的计算如下：
2x10-12/2.74879x10-19＝7275929。
因此，使上述值乘以135得出下述结果，在STD1中存在982250kb完全的端粒序列/μL。将使用Y3克隆标准物计算的端粒浓度转换为完全的端粒序列浓度(kb/μl)的公式：
B.使用人β球蛋白浓度计算基因组拷贝数浓度。
单倍体人基因组分子的重量为3.59x10-3ng。人β球蛋白浓度为人基因组中的单拷贝基因的一个量度。然后，对于单拷贝基因诸如β球蛋白，每单倍体基因组拷贝数浓度(拷贝数/μL)可以如下计算：
浓度(ng/uL)/(0.00359x2)(值B)。
C.绝对端粒长度的计算
绝对端粒序列/基因组(kb/基因组)等于完全的端粒序列浓度/基因组拷贝数浓度，其进而等于下述计算结果：
值A/值B，
其中值如以上本文所述那样计算。因此，染色体的每个末端上的aTL(kb)计算如下：
(值A/值B)/92。
实施例15-T/S值与aTL的相关性
使用本文所述的方法确定T/S比并且将所述T/S比与使用以上本文所述的计算导出的aTL值进行比较。三个QC样品的比较显示，所述值是高度相关的，具有0.99998的R2(图10)。基于这些数据，推导出以下公式：
kbp＝2.4555*(T/S)+0.005
此外，使用来源于用端粒酶hTER的RNA组分的基因感染的UMUC-3膀胱癌细胞系的一系列基因组DNA来比较T/S比和aTL。获得类似的结果并且针对这些数据推导出以下公式：
kbp＝2.589*(T/S)-0.074
使用刚制备的Y3标准物，来自两个独立运行的QC样品的T/S和aTL相关性示出在下表14中。
表14.
实施例16-T/S和aTL与UMUC3-hTER系列的相关性
使用用端粒酶的RNA组分(TER)转导的细胞系(UMUC3)进一步评估端粒长度(kbp)与T/S比之间的关系(即确定kbp/T/S单位)，从而增加端粒酶活性并且将TTAGGG重复序列添加至染色体的末端。对这种细胞系进行命名(UMUC3-TER)。UMUC3-TER中端粒的长度因细胞在培养中扩增而随时间增加。使用通过Cawthon(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47)描述的测定确定T/S。对于图11中的每个数据点，y轴表示如本文所述那样测定的平均末端限制性片段长度(TRF)(kbp)，并且x轴表示所测定的DNA样品的T/S比。因为端粒酶仅将端粒DNA添加至染色体的末端，所以曲线斜率是端粒DNA/T/S单位的直接量度：其从这个实验产生2.45kbp/T/S单位。
实施例17-通过DNA印迹分析对T/S与TRF进行比较
作为验证决定端粒长度计算的第三独立方法，相同UMUC3-hTER系列的端粒长度使用DNA印迹分析测定。将基因组DNA用HphI和MnlI消化，在0.5％凝胶上运行，并且用包含四个端粒重复序列的寡核苷酸探测。为了计算端粒限制性片段，使用了由Harley等人(Nature(1990)345(6274):458-60)最初提出的公式。这个公式还由Cawthon等人用于比较T/S比与TRF(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47)。将使用由Cawthon(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47)描述的测定得出的T/S比与TRF结果比较得到以下公式：
TRF＝2.1518*(T/S)+1.4257(R2＝0.97283)。
这个公式中的Y截距表示子端粒区域的平均长度(Cawthon，R.M.，Nucleic.AcidsRes.，2002，30(10):e47),并且斜率代表用于将T/S比转换为bp的因子。因此，在这个测定中：
kbp＝2.1518*(T/S)，
其提供了2.15kbp/T/S单位的转换因子。
对来源于人肺成纤维细胞IMR90的基因组DNA的样品使用类似的方法。Farzaneh-Far R等人(参见Farazaneh-Far，R.等人(2010)PLoS ONE 5(1)：e8612.doi:10.1371/)journal.pone.0008612)报道：
TRF＝2.413*(T/S)+3.274。
因此，使用以上公式，存在2.41kbp/T/S单位，即：
kbp＝2.413*(T/S)。
这非常类似于上述的转换因子。不希望受特定理论的束缚，可能的是Y截距(子端粒区域长度)的差异是由于在Lin等人中，使用RsaI和HinfI消化基因组DNA的事实。已知HphI和MnlI(在这个报道中使用的)与RsaI和HinfI相比更靠近于端粒区域进行切割。此外，不希望受特定理论的束缚，在本文所述的研究中和在Farzaneh-Far R等人(参见Farazaneh-Far，R.等人，(2010)PLoS ONE 5(1)：e8612.doi:10.1371/journal.pone.0008612)中使用了两种不同的细胞系。因此，可能的是这些细胞系具有不同的子端粒长度。
实施例18-聚集型aTL转换因子
概括地说，使用了表15中的将T/S比转换为bp的聚集型端粒长度转换因子数据。来自表15中的四个结果值(来自四种不同的方法)的转换因子平均值为2.4kbp/T/S单位，对于4个估计值具有0.19的标准偏差。
表15.
*使用如本文所述的三个QC样品比较T/S比和aTL。
**使用如本文所述的UMUC3-hTER样品比较T/S比和aTL。
基于来自Cawthon，R.M.，Nucleic Acids Res.，2009，37(3):e21的数据。
基于来自Farzaneh-Far R等人(参见Farazaneh-Far，R.等人(2010)PLoS ONE 5(1)：e8612.doi:10.1371/joumal.pone.0008612)的数据。
实施例19-对定量典型端粒序列的引物影响
“变异序列”是一术语，所述术语是指常常见于DNA的子端粒区域内但不被认为是真正的端粒序列的DNA序列。真正的端粒重复序列由CCCTAA:TTAGGG单元组成，而变异序列可含有“简并”的类似端粒的序列。端粒长度测定的任何方法的一个挑战是区分“真正的”或典型的端粒和因与典型端粒序列的小数目碱基对，例如1-3个碱基对差异而与典型重复序列不同的一系列重复序列。这种变体或简并序列的具体实例包括TGAGGG、TCAGGG、TTGGGG、TTCGGG等。
进行实验以比较代表长度为90个核苷酸(合成的“ultramer”)的典型或简并的靶序列重复序列的三个不同模板的扩增。使用三个不同模板的等摩尔浓度进行研究，以便提供下述数据，所述数据显示与常常使用的先前标准物，即由Cawthon(Cawthon，R.M.，Nucleic.Acids Res.，2002，30(10):e47)描述的引物相比所公开的引物对典型端粒重复序列的特异性增强。使用的合成的ultramer示出在下表16中。
表16.
SEQ ID NO. Ultramer 序列
28 Tel-重复序列/端粒 (CCCTAA)15
29 富含G的变体/简并1 (CCCTCA)15
30 富含C的变体/简并2 (CCCTGA)15
使用下述引物使用以上本文所述的所公开的三重qPCR测定进行测定(参见实施例1)：使用Cawthon引物、TeloTest Tel 1b和Tel 2b引物(分别为SEQ ID NO：20和21)或使用Tel G修饰型和Tel C修饰型引物(分别为SEQ ID NO：1和2)。在图中，这些测定条件分别称之为“三重TT”或“ATL T”。
在第一组实验中，使用代表“真正的”端粒模板的Tel-重复序列/端粒ultramer(SEQ ID NO：28)。如上文所示，其典型由15个重复的典型CCCTAA端粒序列组成。使用所公开的三重qPCR测定对九个复制品的评价显示‘T’浓度一致地大于Cawthon 2002测定中看到的‘T’浓度(参见图13A)。应当指出的是，计算最初的(1X)ultramer DNA浓度(1.67ng/μL)以模拟3kb的平均基因组端粒长度。当使用高七倍的浓度的模板时，差异被放大((11.69ng/μL；参见图13B)。在最初的ultramer DNA浓度下，使用所公开的三重qPCR测定在以上本文所述的所公开的条件下确定九个Tel-重复序列复制品的平均T浓度，所述平均T浓度使用所述测定确定为0.15ng/μL(参见图13C)。相比之下，在Cawthon 2002测定的条件下，使用1X模板浓度将T浓度确定为0.11ng/μL(图13C)。然而，当将ultramer DNA浓度增加至7X时，对于所公开的三重qPCR测定和Cawthon 2002测定，平均T浓度分别为8.40ng/μL和1.83ng/μL(参见图13D)。这些数据表明，与TeloTest引物相比，tel G修饰型和tel C修饰型引物对典型端粒重复序列具有更大的特异性。
实施例20-对定量富含G的类似端粒的序列的引物影响
为了代表位于紧邻典型端粒重复序列的端粒相关区域中的一种最常见的变体重复序列中，使用了富含G的变体/简并ultramer(SEQ ID NO：29)。如上所述，这种ultramer序列由15个重复的CCCTCA序列组成。在1X(参见图14A)和7X(参见图14B)模板浓度下，与使用Tel G修饰型和Tel C修饰型引物相比，在所公开的三重qPCR测定中使用Cawthon 2002引物产生十倍过量扩增的富含G的模板。1X和7X模板浓度(分别为1.67和11.69ng/μL)具有与前一个实施例中所述相同的意义。在Cawthon 2002测定条件下九个富含G的变体复制品的平均T浓度为4.30x10-3ng/μL，相比之下，使用所公开的三重qPCR测定产生3.06x10-4ng/μL的T浓度(参见图14C)。当模板浓度增加至7X，即对于Cawthon 2002测定和所公开的三重qPCR测定分别为4.90x10-3ng/μL和5.34x10-4ng/μL时，看到类似的值(参见图14C)。这些数据表明，本发明的tel G修饰型和tel C修饰型引物不使用富含G的变体重复序列TGAGGG作为扩增模板。另外，这些数据与前述实施例中的数据一起表明，本发明的tel G修饰型和tel C修饰型引物对典型端粒重复序列具有更大的特异性。
实施例21-对定量富含C的类似端粒的序列的引物影响
端粒相关区域中的另一种常见的变体重复序列为富含C的变体，其由CCCTGA序列组成，通过富含C的变体/简并2ultramer(SEQ ID NO：30)表示。与使用富含G的变体作为模板产生的数据类似，在1X(参见图15A)和7X(参见图15B)模板浓度下，与所公开的三重qPCR测定相比，Cawthon 2002测定产生10倍过量扩增的富含C的模板。使用Cawthon 2002测定的九个富含C的变体复制品的平均T浓度为3.99x10-3ng/μL，相比之下，所公开的三重qPCR测定提供了3.06x10-4ng/μL的T浓度(参见图15C)。当模板浓度增加至7X，即对于Cawthon 2002测定和所公开的三重qPCR测定分别为4.69x10-3ng/μL和6.18x10-4ng/μL时，看到类似的值(参见图15C)。这些数据表明，本发明的tel G修饰型和tel C修饰型引物不使用富含C的变体重复序列TCAGGG作为扩增模板。这些数据进一步证明本发明的tel G修饰型和tel C修饰型引物对典型端粒重复序列具有更大的特异性。
基于这个实施例和前两个实施例中生成的数据，可以推断出Tel1b和Tel2b引物以比本发明的tel G修饰型和tel C修饰型引物高许多的水平扩增典型的端粒变体重复序列。此外，这些数据表明变体重复序列很可能有助于由Cawthon 2002测定报道的较高T/S比。总的来说，这些数据意想不到地显示，本发明的el G修饰型和tel C修饰型引物更特异性地扩增典型端粒重复序列。
实施例22-再现性和精确性
进行了评价用于测定端粒长度的本发明所公开的三重qPCR测定的总变异性的多天、多操作器研究。具体地，由单一操作器在单一运行上一式三份地测定40个全血供体样品中的每个。对于3个复制品中的每个计算T/S比，提供轮次内变异性的估计值。然后在20天内重复相同测定/板布置，早晨一次，晚上一次，使用3个不同的操作器，总共24个板复制品。进行二十四(24)个平均端粒长度(“ATL”)测定，针对样品1-20的12个ATL测定和针对样品21-40的12个ATL测定。来自多次运行的每个样品的测定值使用其中“运行”为随机效应的随机效应模型分析。获得轮次内变异性、轮次间变异性和总轮次变异性的估计值并且将结果在下表17中给出。
表17.
*使用Tel1b和Tel2b引物的Cawthon 2002测定。
**使用tel C修饰型和tel G修饰型引物和RNA酶P和B2M引物以及如以上本文所述的探针的本发明测定。
前述结果证明了所公开的三重qPCR测定用于临床环境中的优异性。例如，在定量T/S比，例如用于评估T/S与给定疾病的相关性的任何临床用途中，将存在特定T/S比下截止的阈值以辨别健康个体或个体群体与‘患病’个体或个体群体之间，或需要不同治疗(例如施用不同药物或治疗剂、治疗或剂量水平)的受试者或群体之间的差异。因此，测定方法关于这个截止值的再现性限定了将可靠地落入健康群体或处于风险下的群体中或需要特定治疗的个体或群体。应当理解，给定测试方法的CV/总误差越低，则使用所述方法报道的结果越具有再现性。在前述中，所公开的三重qPCR测定观察到的6％总误差/再现性为6/11，或者对Cawthon 2002测定的再现性增强大约二倍。因此，所公开的三重qPCR测定的临床效用将由于窄的“不确定”区而被增强大约这个相同量，并且因此，更多患者将被确定地报告为健康或患病样品或需要特定治疗。
实施例23-改善的扩增效率
扩增效率是指模板扩增与理论最大值(100％)的接近度如何，理论最大值是在每个qPCR循环期间扩增子模板浓度的准确加倍。在Cawthon 2002(TeloTest测定)的情况下，端粒和单拷贝基因扩增子的扩增效率通常分别在70-80％和85-95％范围内。相比之下，在所公开的三重qPCR测定的情况下，所有三种扩增子(即端粒扩增子和两种不同的单拷贝基因扩增子)的qPCR效率通常在95-110％范围内，并且常常在98-101％范围内(参见表5和8)。这表示关于TeloTest测定在定量端粒长度或端粒丰度方面的显著且意料不到的改善。
实施例24-使用正常受试者群体进行方法的比较
在如以上本文所述的Cawthon 2002测定和所公开的三重qPCR测定中测试311个正常人全血样品。对每次测定观察到的T/S比进行绘图并且数据示出在图16中。对于两次测定的T/S比结果之间的关系的最佳拟合方程为：
Y＝1.13x-0.06 R2＝0.81。
最佳拟合方程产生合理的R2和截距值，但是1.13斜率显示，Cawthon 2002测定报道了比更特异性所公开的三重qPCR测定更高的T/S结果。这与上文所述的关于引物特异性观察到的结果是一致的。观察到的平均T/S比之间的差异具有统计意义上的显著性，其中T/S的偏移为0.066，并且p＝4x10-6，这表明测定中的差异具有高度显著性。
进行313个正常血液样品结果的另外分析以评估在两种方法中的每种的情况下T/S比结果在统计学上的‘正态’分布如何。使用Shapiro-Wild正态性检验评估分布，其中较高的ρ值反映出更‘正态’分布。针对两种测定方法中的每种所确定的ρ值示出在下表18中，并且意想不到地，它们显示出所公开的三重qPCR测定的明显改善的正态分布。
表18.
*使用Tel1b和Tel2b引物的Cawthon 2002测定。
**使用tel C修饰型和tel G修饰型引物和RNA酶P和B2M引物以及如以上本文所述的探针的本发明测定。
本领域技术人员显而易知可产生本公开的各种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。在考虑到本发明的说明书和实践的情况下，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。意图仅将本说明书和实施例理解为示例性的，其中本发明的真实范围和精神由所附权利要求书来指示。
序列
各种核苷酸序列、其名字和相关SEQ ID NO提供在下表16中。
表16.
序列表
<110> Telomere Diagnostics, Inc.
Harley, Calvin
Lin, Jue
Guegler, Karl
<120> 多重定量PCR
<130> 37502.0004U3-
<150> 62/098,057
<151> 2014-12-30
<150> 62/163,434
<151> 2015-05-19
<160> 30
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 1
acacctcctc catggtttgg gtttgggttt gggtttgggt tagtg 45
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 2
tgttagcgac gcgatatccc tatccctatc cctatcccta aca 43
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 3
ccagcagaga atggaaagtc aa 22
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 4
tctctctcca ttcttcagta agtcaact 28
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 5
atgtgtctgg gtttcatcca tccgaca 27
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 6
gttctctggg aactcacctc c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 7
atgtcccttg ggaaggtctg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 8
cctaacaggg ctctccctga g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 9
tggccctagt ctcagacctt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 10
cggagggaag ctcatcagtg 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 11
ctgagtgcgt cctgtcac 18
<210> 12
<211> 140
<212> DNA
<213> 合成的
<400> 12
cctaacctaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc 60
ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc 120
ctaaccctaa ccctaaccct 140
<210> 13
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<212> DNA
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<400> 13
ttagggttag gg 12
<210> 14
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<212> DNA
<213> 合成的
<400> 14
tgctcggccg atctggcatc cctaacccta accctaaccc taacc 45
<210> 15
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<212> DNA
<213> 合成的
<400> 15
gatggatcct gagggtgagg gtgaggg 27
<210> 16
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<212> DNA
<213> 合成的
<400> 16
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<212> DNA
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tgctcggccg atctggcatc 20
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ccctaaccct aaccctaacc ctaa 24
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cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39
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<212> DNA
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ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39
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tggaggagtg ggtgtcgc 18
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<212> DNA
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ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa 90
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<212> DNA
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ccctcaccct caccctcacc ctcaccctca ccctcaccct caccctcacc ctcaccctca 60
ccctcaccct caccctcacc ctcaccctca 90
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<212> DNA
<213> 合成的
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ccctgaccct gaccctgacc ctgaccctga ccctgaccct gaccctgacc ctgaccctga 60
ccctgaccct gaccctgacc ctgaccctga 90

Claims (20)

1.一种用于确定平均端粒长度或丰度的方法，所述方法包括：
(a)使第一靶核酸与第一引物组接触、使第二靶核酸与第二组引物组接触，并且使第三靶核酸靶标与第三引物组接触；
i)其中所述第一引物组包括第一正向引物和第一反向引物；
ii)其中所述第二引物组包括第二正向引物和第二反向引物；
iii)其中所述第三引物组包括第三正向引物和第三反向引物；并且
iv)其中所述第一靶核酸包含端粒重复序列；
(b)通过聚合酶链式反应用所述第一引物组扩增所述第一靶核酸以形成第一扩增子、用所述第二引物组扩增所述第二靶核酸以形成第二扩增子，并且用所述第三引物组扩增所述第三靶核酸以形成第三扩增子；
(c)确定所述聚合酶链式反应过程中的所述第一扩增子、所述第二扩增子和所述第三扩增子的量；
i)其中所述第一扩增子使用第一检测标记检测；
ii)其中所述第二扩增子使用第二检测标记检测；并且
iii)其中所述第三扩增子使用第三检测标记检测；
(d)确定样品中端粒DNA的所述平均长度或丰度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物中的每种包含：
(a)在退火条件下与端粒重复序列杂交的3'部分；以及
(b)具有不与端粒重复序列杂交的锚定序列的5'部分。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反向引物是包含邻近或包括所述引物的3'末端的至少一个错配核苷酸的错配引物，并且其中所述至少一个错配核苷酸不与所述靶核酸互补，但是与所述第一正向引物的3'端核苷酸互补。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一正向引物包含SEQ ID NO.：1的序列；并且其中所述第一反向引物包含SEQ ID NO.：2的序列。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反向引物被阻滞引发所述第一靶核酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一反向引物通过3'端错配碱基而被阻滞引发所述第一靶核酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二靶核酸在已知拷贝数的基因内。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述已知拷贝数的基因为低拷贝数基因。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述第二靶核酸为单拷贝数基因。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述第二正向引物包含SEQ ID NO.：3；并且其中所述第二反向引物包含SEQ ID NO.：4。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一检测标记、所述第二检测标记和所述第三检测标记中的每个独立地包含荧光部分；并且其中每个所述荧光部分是可区分且同时地检测。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第二检测标记还包含含有SEQ ID NO.：5的序列的寡核苷酸。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述第二扩增子的长度为约50至约250bp；并且其中所述第三扩增子的长度为约50至约250bp。
14.如权利要求1所述的方法，其还包括在使所述第一靶核酸、所述第二靶核酸和所述第三靶核酸分别与所述第一引物组、所述第二引物组和所述第三引物组接触之前获得染色体DNA样品的步骤；并且其中所述染色体DNA样品包含所述第一靶核酸、所述第二靶核酸和所述第三靶核酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述获得染色体DNA样品的步骤包括从获自受试者的液体样品分离一种或多种细胞类型；并且其中所述分离的细胞类型包括循环肿瘤细胞、循环干细胞、淋巴细胞、粒细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板和白细胞。
16.如权利要求1所述的方法，其中通过与对照参考DNA比较来确定所述第一扩增子、所述第二扩增子和所述第三扩增子的浓度。
17.如权利要求1所述的方法，其中确定所述第一扩增子的所述平均长度或丰度包括以下步骤：
(a)通过与对照聚合酶链式反应比较确定所述第一扩增子、所述第二扩增子和所述第三扩增子的浓度；
(b)确定所述第一扩增子的浓度与所述第二扩增子和所述第三扩增子的平均或加权浓度的比；以及
(c)将来自步骤(b)的所述比转换为端粒序列的碱基对/基因组。
18.一种用于同种异体移植造血干细胞供体选择的方法，所述方法包括：
(a)从一名或多名HLA匹配的潜在供体受试者获得样品；
(b)通过如权利要求1所述的方法确定每名所述HLA匹配的供体受试者的端粒DNA的所述平均长度或丰度；
(c)鉴定出具有比年龄匹配的对照高25个百分位数的第一扩增子平均端粒长度或丰度的一名或多名供体受试者；
(d)从所述鉴定出的供体受试者获得可移植的造血干细胞样品；以及
(e)将所述造血干细胞样品移植到受体受试者。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述受体受试者已被诊断为患有癌症、心血管疾病或具有骨髓移植的需要。
20.一种用于再分级心血管疾病风险的方法，所述方法包括：
(a)从受试者获得样品，其中所述受试者已被诊断为符合针对低强度他汀类疗法的2013ACC/AHA治疗血液胆固醇之指南标准；
(b)通过如权利要求1所述的方法确定所述样品中的所述第一扩增子的所述平均长度或丰度；
(c)当所述样品被确定出具有比年龄匹配的对照低25个百分位数的第一扩增子平均长度或丰度时将所述受试者诊断为处于较高的心血管风险下；以及
(d)向被诊断为处于较高的心血管风险下的所述受试者施用以下项：
i)修改的他汀类疗法；和/或
ii)已知用于治疗心血管疾病的第二治疗剂。
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