PL206041B1 - Przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimerowe, całkowicie humanizowane przeciwciało, przeciwciało anty-anty-ID albo jego fragment oraz ich zastosowanie, klony hybrydoma, sposób wykrywania i/albo analizy ilościowej ludzkiego LDLR, sposób oczyszczania oraz sposób hamowania in vitro replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimerowe, całkowicie humanizowane przeciwciało, przeciwciało anty-anty-ID albo jego fragment o oraz ich zastosowanie, klony hybrydoma, sposób wykrywania i/albo analizy ilościowej ludzkiego LDLR, sposób oczyszczania oraz sposób hamowania in vitro replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C.

W szczególnoś ci niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał monoklonalnych, które specyficznie rozpoznają ludzki receptor lipoprotein o małej gęstości (LDLR).

Cholesterol, składnik wszystkich błon plazmatycznych eukariota, jest niezbędny dla wzrostu oraz żywotności komórek wyższych organizmów. Jednakże, wysokie stężenie cholesterolu w surowicy powoduje formowanie zmian miażdżycowych w tętnicach w obrębie całego organizmu, co prowadzi do choroby i śmierci. Głównym miejscem syntezy cholesterolu w organizmach ssaków jest wątroba. Istotne ilości cholesterolu są wytwarzane także w obrębie jelita. Ilość wytwarzanego przez te organy cholesterolu jest w znacznym stopniu odpowiadająca ilości cholesterolu absorbowanego z pożywienia. Komórki spoza wątroby oraz jelita pobierają raczej cholesterol z osocza, a nie syntetyzują go de novo. Cholesterol jak i inne lipidy jest transportowany w płynach ustrojowych poprzez lipopoteiny, które sklasyfikowano według wzrastającej gęstości. Lipoproteina jest cząsteczką złożoną z hydrofobowego rdzenia lipidów otoczonego powłoką polarnych lipidów i apoprotein. Lipoproteiny te pełnią dwie funkcje: rozpuszczają wysoce hydrofobowe lipidy oraz zawierają sygnały regulujące transport poszczególnych lipidów do i ze specyficznych docelowych komórek i tkanek. Cholesterol jest transportowany w pł ynach ustrojowych poprzez lipoproteiny o mał ej gę stości (LDL), które wiążą się ze specyficznym receptorem w błonie komórkowej komórek niewątrobowych. Kompleks receptor-LDL wnika do wnętrza komórek na drodze mechanizmu przenoszenia znanego, jako endocytoza za pośrednictwem receptora (Goldstein i wsp. 1979). Receptor lipoproteid małej gęstości, (LDL) jest prototypem rodziny podobnych strukturalnie receptorów powierzchniowych pośredniczących w endocytozie licznych ligandów w komórkach ssaków.

Receptor LDL jest zbudowany z 822 reszt aminokwasowych i wykazuje masę molową 164000. Jest on złożony z kilku domen, przy czym niektóre z nich mają wspólną sekwencję homologiczną z innymi białkami. Jego NH2-końcowa, wiążąca ligandy domena składa się z 292 reszt, ułożonych w 7 bogatych w cysteinę niedoskonałych powtórzeń. Każde z powtórzeń zawiera sześć reszt cysternowych związanych ze sobą mostkami disiarczkowymi w układzie pierwsza z trzecią druga z piątą i czwarta z szóstą (Bieri i wsp.). Domena ta jest uzupełniana przez cztery dodatkowe domeny: pierwsza składa się z 400 reszt aminokwasowych i jest homologiczna do receptora EGF, druga składa się 58 reszt aminokwasowych bogatych w cukry związanych z białkiem wiązaniem O-glikozydowym, trzecia będącą pojedynczą domeną transbłonową składa się z 22 reszt aminokwasowych, a czwarta jest domeną cytoplazmatyczną zbudowaną z 50 reszt aminokwasowych (Sudhof i wsp. 1985), (Brown i wsp. 1986).

Znaczenie fizjologiczne receptora LDL zostało ujawnione dzięki badaniom Browna i Goldsteina nad rodzinną hipercholesterolemią (FH). Ujawniono, że choroba jest wynikiem molekularnego defektu genetycznego wywodzącego się z braku lub niedoboru funkcjonalnych receptorów LDL (Brown i wsp.). Opisano kilka klas mutacji FH (Goldstein i wsp. 1975).

Rozpuszczalna postać sLDLR, wykazująca aktywność przeciwwirusową została oznaczona i wyizolowana z supernatantu znad hodowli komórek indukowanych interferonem (Fischer i wsp. 1993) oraz płynów ustrojowych (Fischer i wsp. 1994). Kilka indukowanych interferonem białek zidentyfikowano jako podstawowe w procesie indukcji stanu przeciwwirusowego przez IFN. Jedno z takich białek wykazujące aktywność przeciwwirusową wytworzono i zgromadzono w supernatancie hodowli komórek ludzkiej owodni WISH. Białko to oczyszczono do jednorodności i oznaczono jako sLDLR (patrz EP 0 553 667 oraz Fischer i wsp. 1993). Ujawniono, że sLDLR jest wydzielany do pożywki przez komórki ssaków, które osiągają stan przeciwwirusowy jako odpowiedź na działanie interferonu. W odróż nieniu do interferonu sLDLR nie wzbudza stanu przeciwwirusowego w komórkach, ale sam jest przeciwwirusowy. Wykazano, że sLDLR najwyraźniej musi być obecny podczas całego procesu replikacji, dojrzewania i pączkowania wirusa, co sugeruje, że może on być zaangażowany w skomplikowany proces prowadzący do hamowania składania wirusa lub jego pączkowania (dane niepublikowane). Ostatnio wykazano, że receptor LDL pośredniczy w endocytozie wirusa zapalenia wątroby typu C w hodowli komórkowej (Agnello i wsp. 1999). Zarówno te, jak i inne ujawnienia sugerują że rodzina receptorów LDL może działać jako receptory wirusowe. Dlatego też, przeciwciała wytworzone przeciw

PL 206 041 B1 sLDLR mogą blokować wejście i pączkowanie cząsteczek wirusa przez wiązanie z komórkowym receptorem LDL.

Jedynym znanym jak dotychczas przeciwciałem monoklonalnym wobec LDLR jest C7, przeciwciało przeciwko bydlęcemu LDLR (Beisiegel i wsp. 1981, dostępne na rynku z Amersham, UK), które wytworzono przez immunizację myszy oczyszczonym do homogeniczności bydlęcym LDLR wyizolowanym z komórek kory nadnerczy. Błony bydlęcych komórek kory nadnerczy rozpuszczono, a receptor częściowo oczyszczono poprzez wymywanie z kolumny DEAE-celuloza (Beisiegel i wsp. 1981). Przciwciało skierowane przeciwko bydlęcemu LDLR jedynie słabo oddziaływuje z ludzkim LDLR.

W istocie ujawniono, ż e C7 Mab przeciwko bydlęcemu LDLR posiada istotne wady, podczas gdy jest wykorzystywane do detekcji i oznaczenia ilościowego rekombinowanego ludzkiego LDLR:

a) ma bardzo niskie powinowactwo do ludzkiego LDLR

b) w sposób istotny reaguje krzyżowo z zanieczyszczeniami hodowli komórkowej.

Swoiste przeciwciała przeciwko ludzkiemu LDLR nie były dotychczas dostępne. Wydaje się to zaskakujące w sytuacji, gdy powszechne jest otrzymywanie przeciwciał przeciwko nowym białkom, w celu ich oczyszczania, identyfikacji lub opracowywania metod oznaczania. Jest możliwe, że takie przeciwciała nie zostały dotychczas wytworzone, ponieważ warunkiem wytwarzania przeciwciał monoklonalnych jest dostępność dostatecznie dużych ilości wysoce oczyszczonego antygenu, pozwalającego na efektywną immunizację myszy. Wysoce oczyszczony antygen to taki, który ujawnia się, jako pojedynczy główny sygnał w RP-HPLC. Dodatkowo sposoby identyfikacji oraz oznaczania ilościowego antygenu w procesie oczyszczania nie były łatwe do ustalenia. Opisany niniejszym test aktywności antywirusowej zastosowano w celu identyfikacji LDLR w procesie oczyszczania.

Istnieje potrzeba wytworzenia specyficznych Mab skierowanych przeciwko ludzkiemu rozpuszczalnenu LDLR, aby dostarczyć środków do opracowania efektywnego testu immunologicznego (ELI-SA) oraz do identyfikacji białek w analizie Western biot. Przeciwciała te są niezbędne do monitorowania oraz oznaczania ilościowego rekombinowanego ludzkiego rozpuszczalnego LDLR w sposobach wytwarzania i oczyszczania rekombinowanych białek oraz do wykrywania białek naturalnych.

Niniejszy wynalazek pozwala na otrzymywanie linii komórek hybrydoma wytwarzających przeciwciała monoklonalne zdolne do specyficznego rozpoznawania i wiązania ludzkiego receptora LDL i jego fragmentów.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają otrzymywanie linii komórek hybrydoma wytwarzających przeciwciała monoklonalne zdolne do specyficznego rozpoznawania i wiązania ludzkiego rozpuszczalnego receptora LDL.

Tak wiec, obecny wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego, przeciwciała chimerowego, przeciwciała humanizowanego, przeciwciała anty-anty-Id lub ich fragmentów, za wyjątkiem przeciwciała monoklonalnego C7, które jest zdolne do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C i które uzyskuje się poprzez immunizację zwierząt ludzkim rozpuszczalnym LDLR+291, to jest postacią ludzkiego rozpuszczalnego receptora zawierającą sekwencję aminokwasową Asp+4 do Glu+291 sekwencji ludzkiego rozpuszczalnego LDLR.

Korzystnie przeciwciało według wynalazku jest wytwarzane przez klon hybrydoma 12,6 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2390, klon hybrydoma 28 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2391, klon hybrydoma 29,8 zdeponowany w CNCM pod numerem I-2392, klon hybrydoma 50.30 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2393, oraz klon hybrydoma 30 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2394.

Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie należy do izotypu immunoglobulin IgG1 albo IgM.

Przedmiotem wynalazku są również wskazane powyżej klony hybrydoma.

Tak, więc niniejszy wynalazek dostarcza takich przeciwciał monoklonalnych (Mab), które rozpoznają i wiążą ludzki rozpuszczalny LDLR i spełniają następujące warunki:

1. mogą być wykorzystywane, jako para w testach ELISA np. w teście kanapkowym ELISA (ang. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), w celu wykrywania ludzkiego rozpuszczalnego LDLR.

2. mogą być wykorzystywane w celu rozpoznawania LDLR w analizie Western błot.

3. mogą być wykorzystywane do neutralizacji biologicznej aktywności antywirusowej ludzkiego rozpuszczalnego LDLR.

4. mogą być wykorzystywane do hamowania infekcji wirusowych, takich jak HCV.

Ponadto, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wykrywania i/lub analizy ilościowej ludzkiego LDLR, który obejmuje wykorzystanie specyficznych przeciwciał monoklonalnych według wynalazku.

PL 206 041 B1

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania przeciwciała według wynalazku obejmujący wzrost klonowanych hybrydoma, które zawierają komórki śledziony pochodzące od ssaka immunizowanego wysoce oczyszczonym ludzkim LDLR+291, to jest postacią ludzkiego rozpuszczalnego receptora zawierającą sekwencję aminokwasową Asp+4 do Glu+291 sekwencji ludzkiego rozpuszczalnego LDLR, i homogenne albo heterogenne komórki limfoidalne w ciekłej pożywce albo w jamie brzusznej ssaka, aby umoż liwić wytworzenie i zgromadzenie przeciwciał a monoklonalnego przez hybrydoma.

Dodatkowo, w innym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza sposobu oczyszczania ludzkiego LDLR obejmującego doprowadzenie do kontaktu materiału zawierającego nieoczyszczony LDLR z przeciwciałem wedł ug wynalazku. W procesie oczyszczania rekombinowanego biał ka, w etapie oczyszczania przez powinowactwo można wykorzystać kolumnę z zaadsorbowanym swoistym wobec LDLR przeciwciałem monoklonalnym.

Sposób wykrywania i pomiaru rekombinowanego ludzkiego LDLR, który obejmuje zastosowanie przeciwciała monoklonalnego według wynalazku w teście ELISA opisano w przykładzie 5.

Jako LDLR lub fragment LDLR do immunizacji zwierząt może być wykorzystany dowolny LDLR, po warunkiem, że LDLR pochodzi od ciepłokrwistego ssaka. Mogą być także wykorzystane muteiny LDLR. Reprezentatywnym przykładem takiego ludzkiego rozpuszczalnego LDLR jest rozpuszczalna postać LDLR +291, która zawiera sekwencje aminokwasów rozpoczynającą się od Asp w pozycji +4 i kończącą się na Glu w pozycji +291 sekwencji ludzkiego LDLR, przy czym dowolna inna postać może być również wykorzystana, tak jak na przykład +292 itp.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C in vitro obejmują cy przed zainfekowaniem wirusem zapalenia wą troby typu C kontaktowanie komórek z przeciwciałem według wynalazku w celu zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w komórkach.

Wynalazek dotyczy także zastosowania przeciwciała według wynalazku, jako leku oraz jego zastosowania do wytwarzania leku do leczenia zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia diagram przepływowy obrazujący otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko r-hsLDLR.

Figura 2 przedstawia analizę anizy Western biot postaci +291 r-hsLDLR - ścieżka 1, hsLDLR z moczu - ścieżka 2 oraz rekombinowanego ludzkiego receptora p55 TNF, jako negatywnej kontroli (r-hTBP-1) - ścieżka 3, z przeciwciałem monoklonalnym wskazanym na poniżej każdego paska. Strzałki po lewej stronie figury wskazują pozycję markerów masy cząsteczkowej, a strzałki po prawej stronie figury wskazują pozycję postaci hsLDLR wskazanej nad każdą strzałką.

Figura 3 przedstawia wpływ Mab 12,6, 28 i 29,8 na wytwarzanie nici HCV(+) i HCV(-) w hodowli

FT167. Na 30 minut przed zakażeniem komórki potraktowano Mab anty-LDLR (8 lub 2 μg/ml). Następnie komórki zakarzano przez noc 25 μl surowicy HCV(+)(Nr 42; 1b). Następnie, dzień po zakażeniu trzykrotnie przeprowadzono płukanie i dodano nową pożywkę, którą zmieniano co 48 godzin. Pięć dni po zakażeniu zebrano hepatocyty, RNA oczyszczono i 1 μg komórkowego RNA poddano analizie z wykorzystaniem rTth RT-PCR (Perkin Elmer). Test powtórzono dwukrotnie. +SP: test dodatniej nici RNA; -SP: test ujemnej nici RNA; X: puste.

Szczegółowy opis wynalazku

Wytworzono przeciwciała monoklonalne (Mab) skierowane przeciwko ludzkiemu rozpuszczalnemu LDLR (hsLDLR). Przy zastosowaniu tych przeciwciał monoklonalnych opracowano test ELISA oraz analizę Western blot do zidentyfikowania hsLDLR oraz test neutralizujący wobec antywirusowej aktywności hsLDLR.

Mab wytwarzano u myszy immunizowanych rekombinowanym +291 hsLDLR, składającym się z N-końcowej domeny wiążącej ligandy ludzkiego rozpuszczalnego LDLR, od Asp +4 do Glu +291. Rekombinowany +291 hsLDLR wytworzono w komórkach CHO i oczyszczono do jednorodności.

Immunizowana mysz wytwarzała znaczące ilości specyficznych przeciwciał. Po analizie przesiewowej pięć klonów komórek hybrydoma (o numerach 12, 28, 29, 30 i 50) zidentyfikowano, jako wytwarzające największą liczbę przeciwciał. Klony te wybrano w celu dalszego subklonowania. Po subklonowaniu wyizolowano 29 subklonów posiadających wysoką produktywność przeciwciał i ampułki zawierające zarówno macierzyste klony jak i subklony zamrożono.

Wybrano pary przeciwciał monoklonalnych do testu ELISA wobec r-hsLDLR. Jako przeciwciało opłaszczające wybrano Mab 28, a Mab 29,8 znakowane biotyną, wybrano, jako drugie przeciwciało.

PL 206 041 B1

Ujawniono, że Mab 12,6 i 29,8 są odpowiednie do identyfikacji natywnego i rekombinowanego hsL-DLR w analizie Western blot, a Mab 28 i 30 są odpowiednie do identyfikacji rekombinowanego hsL-DLR w analizie Western blot. Ujawniono, że Mab 12,6 oraz 50.30 są odpowiednie do hamowania aktywności przeciwwirusowej hsLDLR.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykazano także, że Mab 12,6, 28 oraz 29.8 blokują replikację genomu wirusowego wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) w pierwotnych hodowlach ludzkich hepatocytów. Tak więc, przeciwciała te mogą być stosowane w leczeniu wirusowego zapalenia wątroby typu C (figura 3).

Wyznaczono podklasę izotypów Mab wytwarzanych przez klony. Klony 12.6, 28, 29.8 oraz 30 zidentyfikowano, jako IgG1, podczas gdy, klon 50.30 był IgM.

Mab wytworzone przeciwko postaci +291 hsLDLR rozpoznaje także inne wytworzone w rekombinowanych komórkach CHO postacie hsLDLR, tj. postać +292 i +331 r-hsLDLR, w teście ELISA oraz analizie Western biot. Postać +292 obejmuje N-końcową część receptora od reszty aminokwasowej Asp +4 do Cys +292, a postać +331 obejmuje N-końcową część receptora od reszty aminokwasowej Asp +4 do Cys +331.

Antygenem stosowanym do immunizacji myszy w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych była postać +291 r-hsLDLR, którą wytworzono w komórkach CHO. Wytwarzanie r-hsLDLR prowadzono w bioreaktorze, wykorzystując, jako fazę stacjonarną układ matryc Fibracel. r-hsLDLR oczyszcono do jednorodności i wykorzystano do immunizacji myszy.

Komórki śledziony od myszy wytwarzających najlepszą odpowiedź zastosowano do fuzji i wytwarzania komórek hybrydoma.

W odniesieniu do nadmienianych w niniejszym zgł oszeniu przeciwciał , okreś lenie „przeciwciała monoklinalne” obejmuje zarówno przeciwciała monoklonalne, przeciwciała chimerowe, przeciwciała całkowicie humanizowane, przeciwciała przeciwko antyidiotypowym przeciwciałom (przeciwciała antyanty-Id), które mogą być znakowane, zarówno w rozpuszczalnej, jak również związanej formie, oraz ich fragmenty uzyskane dowolną znaną techniką, taką jak, na przykład, lecz nieograniczoną do, cięcia enzymatycznego, syntezy białek czy techniki rekombinacyjnej.

Przeciwciało monoklonalne obejmuje zasadniczo homogenną populację przeciwciał specyficznych wobec antygenów, których populacja obejmuje zasadniczo podobne miejsca wiążące epitopów. Mab mogą być otrzymywane sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie. Patrz, na przykład, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); U.S. Patent No. 4,376,110; Ausbel i wsp. wyd., Harlow and Lane Atibodies: A Labolatory Manual, Cold Spring Harbor Labolatory (1988); oraz Colligan i wsp., wyd., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. And Wiley Interscience N.Y., (1992-1996). Takimi przeciwciałami mogą być przeciwciała z dowolnej klasy immuglobulin, łącznie z IgG, IgM, IgE, IgA, GILD oraz ich podklasy. Hybrydoma wytwarzająca Mab według niniejszego wynalazku mogą być namnażane in vitro, in situ oraz in vivo. Wytwarzanie znacznych ilości Mab in vivo oraz in situ czyni sposób według niniejszego wynalazku korzystnym sposobem wytwarzania Mab.

Przeciwciała chimerowe są cząsteczkami, których różne fragmenty wywodzą się z różnych gatunków zwierząt, tak jak te, których region zmienny pochodzi z mysich Mab, a region stały wywodzi się z ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciała chimerowe są przede wszystkim wykorzystywane do zmniejszania immunogenności oraz do zwiększania wydajności w procesach wytwarzania. Na przykład, takie ludzko/mysie Mab wykorzystywane jest wówczas, gdy mysie Mab wykazuje wyższą wydajność w procesie wytwarzanie przez hybrydoma, ale wyższą immunogenność u ludzi. Przeciwciała chimerowe oraz sposoby ich wytwarzania są znane w dziedzinie (Cabilly i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81:3273-3277 (1984); Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne i wsp., Nature 312:643-646 (1984); Cabily i wsp. Europejskie Zgł oszenie Patentowe 125023 (opublikowane 14 listopada 1984 roku); Neugberger i wsp. Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi i wsp. Europejskie Zgłoszenie Patentowe 171496 (opublikowane 19 lutego 1985); Morrison i wsp., Europejskie Zgłoszenie Patentowe 173494 (opublikowane 5 marca 1986) Neuberger i wsp., Zgłoszenie PCT WO 8601533, (opublikowane 13 marca 1986); Kudo i wsp., Europejskie Zgłoszenie Patentowe 184187 (opublikowane 11 czerwca 1986); Sahagan i wsp., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson i wsp., Mię dzynarodowe Zg ł oszenie Patentowe No. WO8702671 (opublikowane 7 maja 1987); Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better i wsp., Science 240:1041-1043 (1988); Riechmann i wsp., Nature 332:323-327 oraz Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABOLATORY MANUAL, supra.

PL 206 041 B1 „Całkowicie humanizowane przeciwciała” są cząsteczkami posiadającymi zarówno stałe jak i zmienne regiony ludzkich immunoglobulin. Ca łkowicie humanizowane przeciwciał a mogą być potencjalnie wykorzystywane w terapii, gdy powtarzane leczenie jest wymagane w przewlekłych i nawracających chorobach, takich jak choroby autoimmunizacyjne. Jeden ze sposobów wytwarzania całkowicie humanizowanych przeciwciał obejmuje „humanizację” mysiego humoralnego układu immunologicznego, tj. wytwarzanie mysich szczepów zdolnych do wytwarzania ludzkiej Ig (ksenomyszy) poprzez wprowadzenie locus ludzkiej immogloguliny (Ig) do myszy, u której endogenne geny Ig zostały dezaktywowane. Loci Ig są niezmiernie złożone zarówno w odniesieniu do ich struktury fizycznej i reorganizacji genu, jak i do procesu ekspresji niezbędnego do ostatecznego powstawania silnej odpowiedzi immunologicznej. Zróżnicowanie przeciwciał jest przede wszystkim generowane poprzez kombinatoryczne przegrupowania pomiędzy różnymi genami V, D, i J obecnymi w loci Ig. Locus ten zawiera również urozmaicone elementy regulujące, które kontrolują ekspresję przeciwciał, eliminację allelową, przełączanie klas oraz dojrzewanie powinowactwa. Wprowadzenie nieprzegrupowanej ludzkiego transgenu Ig do myszy pokazało, że mechanizm rekombinacji u myszy jest zgodny z ludzkimi genami. Co więcej, hybrydoma wydzielające specyficzne wobec antygenów przeciwciała hu-mAb różnych izotypów mogą być otrzymane poprzez immunizację ksenomyszy antygenem.

Całkowicie humanizowane przeciwciała oraz sposoby ich wytwarzania są znane w dziedzinie (Mendez i wsp., Naturę Genetics 15:146-156 (1997); Buggemann i wsp., Eur. J.

Immunol. 21:1323-1326 (1991); Tomizuka i wsp. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 97:722-727 (2000) Patent WO 98/24893.

Przeciwciało anty-idiotypowe (anti-Id) jest przeciwciałem rozpoznającym swoiste determinanty zazwyczaj związane z miejscem wiążącym antygen przeciwciała. Przeciwciało Id może być wytworzone poprzez immunizację zwierzęcia tego samego gatunku i genotypu (np. rasy myszy), jako źródła Mab, przeciwko którym anty-Id jest wytwarzane. Immunizowane zwierzę rozpozna i odpowie na idiotypowe determinanty przeciwciała stosowanego do immunizacji poprzez wytwarzanie przeciwciał wobec tych idiotypowych determinant (przeciwciało anty-Id). Patrz, na przykład, U. S. Patent No. 4,699,880.

Przeciwciało anty-Id może być także wykorzystane, jako „immunogen” w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej u jeszcze innych zwierząt wytwarzając tak zwane przeciwciała anty-anty-Id. Tak więc, poprzez wykorzystanie przeciwciał do idiotypowych determinant Mab możliwe jest oznaczenie innych klonów wyrażających przeciwciała o identycznej specyficzności.

W związku z tym, Mab wytworzone przeciw LDLR, jego izoformom, analogom, fragmentom lub pochodnym może być stosowane do indukowania przeciwciał anty-Id u odpowiednich zwierząt, takich jak myszy BALB/c. Komórki śledziony pochodzące z tak immunizowanych myszy są wykorzystywane do wytwarzania hybrydoma anty-Id wydzielających Mab anty-Id. Ponadto, Mab anty-Id mogą być związane z nośnikiem, takim jak hemocyjanina wyizolowana z pancerzy mięczaka o angielskiej nazwie Keyhole Limpet (ang. keyhole limpet hemocyanin) i zastosowane do dodatkowej immunizacji myszy BALB/c. Surowica tych myszy będzie zawierać przeciwciała anty-anty-Id posiadające wiążące właściwości oryginalnego Mab specyficznego wobec epitopu omówionego wyżej białka LDLR, jego analogów, fragmentów oraz pochodnych.

Anty-Id Mab posiadają, zatem własne idiotypowe epitopy, bądź „idiotopy” podobne strukturalnie do uprzednio ocenianych epitopów. Termin „przeciwciało monoklinalne” obejmuje swym znaczeniem zarówno nietknięte cząsteczki, jak też ich fragmenty, takie jak, na przykład Fab i F(ab')2, które są zdolne do wiązania antygenu. Fragmenty Fab i F(ab')2 nieposiadające fragmentu Fc nietkniętego przeciwciała, są szybciej usuwane z krwioobiegu oraz mogą wykazywać wiązanie niespecyficzne do tkanki w mniejszym stopniu niż całe przeciwciała (Wahl i wsp., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1985)).

Będzie docenione to, że Fab i F(ab')2, oraz inne fragmenty przeciwciał użytecznych w niniejszym wynalazku mogą być wykorzystane do wykrywania i oznaczenia ilościowego białka LDLR zgodnie ze sposobem ujawnionym w niniejszym wynalazku dla całych cząsteczek przeciwciał. Fragmenty takie zazwyczaj są wytwarzane na drodze cięcia proteolitycznego z wykorzystaniem enzymów, takich jak papaina (z wytwarzeniem fragmentów Fab) czy pepsyna (z wytwarzaniem fragmentów F(ab')2).

Przeciwciało monoklonalne jest określane, jako „zdolne do wiązania” cząsteczek, jeżeli jest zdolne do specyficznego reagowania z cząsteczką, przez co ulega ona związaniu z przeciwciałem. Termin „epitop” odnosi się do tej części dowolnej cząsteczki zdolnej do wiązania się z przeciwciałem, która może być rozpoznawana przez przeciwciało. Epitopy lub „determinanty antygenowe” składają się zazwyczaj z aktywnych chemicznie powierzchniowych grup cząsteczek, takich jak aminokwasy czy

PL 206 041 B1 łańcuchy boczne cukrów i posiadają zarówno cechę specyficznej struktury przestrzennej, jak też specyficznego ładunku.

„Antygen” jest cząsteczką lub częścią cząsteczki zdolnej do wiązania się z przeciwciałem, który to antygen jest zdolny ponadto do wywołania u zwierzęcia wytwarzania przeciwciał zdolnych do wiązania się z epitopem tego antygenu. Antygen może posiadać jeden, lub więcej niż jeden epitop. Wspomniana powyżej specyficzna reakcja ma wskazywać, że antygen będzie reagował wysoce selektywnie, z epitopem odpowiadającego przeciwciała, a nie z wieloma innymi przeciwciałami, które mogą być wywoływane przez inne antygeny.

Przeciwciała, łącznie z fragmentami przeciwciał, użyteczne w niniejszym wynalazku mogą być wykorzystane do oznaczania ilościowego oraz wykrywania białek LDLR w próbce, lub do wykrywania obecności komórek wytwarzających białka LDLR według niniejszego wynalazku. Może to być zrealizowane z wykorzystaniem technik immunofluoroscencyjnych wykorzystujących fluorescencyjnie znakowane przeciwciała (patrz niżej) w kombinacji z mikroskopią fluorescencyjną cytometrią przepływową lub detekcją fiuorometryczną.

Przeciwciała (lub ich fragmenty) wykorzystywane w niniejszym wynalazku mogą być stosowane histologiczniejak w mikroskopii immunofluoresencyjnej lub immunolektronowej, w celu wykrywania in situ białek LDLR. Wykrywanie in situ może być realizowane przez pobranie próbek histologicznych od pacjenta i wprowadzenie znakowanych przeciwciał według wynalazku do takiej próbki. Przeciwciało (lub jego fragment) korzystnie jest dostarczane przez wprowadzenie do lub przez nałożenie znakowanego przeciwciała (lub jego fragmentu) na próbkę biologiczną. Dzięki zastosowaniu takiej procedury jest możliwe oznaczenie nie tylko obecności białek LDLR, ale również ich dystrybucji w obrębie badanego materiału tkankowego. W oparciu o niniejszy wynalazek, specjaliści w dziedzinie łatwo dostrzegą, że każda z szerokiej grupy metod histologicznych (takich jak metody znakowania) może zostać zmodyfikowana w celu osiągnięcia takiego wykrywania in situ.

Oznaczanie białek LDLR standardowo obejmuje inkubowanie biologicznej próbki, takiej jak płyn biologiczny, ekstrakt tkankowy, świeżo zebrane komórki, np. limfocyty lub leukocyty, lub komórki, które były inkubowane w hodowli tkankowej, w obecności znakowanego przecwiciała zdolnego do rozpoznawania białek LDLR, oraz wykrywanie przeciwciał dowolną z licznych technik znanych w dziedzinie.

Próbka biologiczna może być związana ze stałym podłożem lub nośnikiem, takim jak nitroceluloza, lub innym stałym nośnikiem, bądź nośnikiem zdolnym do unieruchomienia komórek, części komórek lub rozpuszczalnych białek. Stałe podłoże bądź nośnik może wówczas zostać przemyte odpowiednimi buforami, a następnie zgodnie z niniejszym wynalazkiem potraktowane znakowanymi przeciwciałami, co zaznaczono powyżej. Następnie stałe podłoże lub nośnik może zostać przemyte po raz wtóry buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Ilość związanych znaczników do stałego nośnika lub nośnika może zostać wówczas oznaczona konwencjonalnymi sposobami.

Poprzez termin „podłoże w fazie stałej”, „nośnik w fazie stałej”, „stałe podłoże”, „stały nośnik”, „podłoże” bądź „nośnik” jest określany dowolny nośnik zdolny do wiązania antygenu lub przeciwciała. Dobrze znane podłoża lub nośniki obejmują szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, amylazę nylonową naturalne i modyfikowane celulozy, poliakrylamidy, gabro oraz magnetyt. Nośnik do celów niniejszego wynalazku może być zarówno w pewnym stopniu rozpuszczalny, jak i nierozpuszczalny. Materiał nośnika może wykazywać praktycznie dowolną możliwą konfigurację strukturalną pod warunkiem, że związane z nim cząsteczki są zdolne do wiązania antygenu lub przeciwciała. Tak wiec, konfiguracja stałego podłoża lub nośnika może być kulista, jak w przypadku koralików, cylindryczna, jak w przypadku wewnętrznej strony probówki, bądź też zewnętrznej strony pręta. Alternatywnie powierzchnia może być płaska, jak arkusz, pasek testowy itp. Korzystne stałe podłoża i nośniki obejmują perełki polistyrenu. Specjaliści w dziedzinie będą znali liczne odpowiednie do wiązania przeciwciał lub antygenów nośniki, bądź będą w stanie ustalić stosowne nośniki poprzez zastosowanie rutynowych eksperymentów.

Aktywność wiążąca danej serii przeciwciał według wynalazku jak opisano powyżej może zostać określona zgodnie z powszechnie znanymi sposobami. Specjaliści w dziedzinie będą w stanie określić funkcjonalne i optymalne warunki prowadzenia badań dla każdego z oznaczeń, poprzez zastosowanie rutynowych eksperymentów.

Inne etapy, takie jak przemywanie, mieszanie, wytrząsanie, filtrowanie oraz tym podobne mogą być dodatkowo przeprowadzone w czasie analizy tak, jak jest przyjęte lub konieczne w konkretnej sytuacji.

PL 206 041 B1

Jednym ze sposobów, w którym przeciwciało według wynalazku może być znakowane, jest związanie tego przeciwciała z enzymem i wykorzystanie go w teście immunoenzymatycznym (EIA). Enzym ten, z kolei, jeżeli wyeksponowany na działanie odpowiedniego substratu będzie reagował z tym substratem w taki sposób, aby wytworzyć ugrupowania chemiczne, które mogą być wykrywane, na przykład spektrofotometrycznie, fluorometrycznie, lub innymi metodami wizualnymi. Enzymy, które mogą być wykorzystane do wykrywalnego znakowania przeciwciał obejmują nieograniczająco dehydrogenazę jabłczanową, nukleazę gronkowcową izomerazę delta-5-steroidową dehydrogenazę alkoholową drożdży, dehydrogenazę alfa-glicerofosforanową izomerazę triozofoforanową, peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, asparaginazę, oksydazę glukozową, beta-galaktozydazę, rybonukleazę, ureazę, katalazę, dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, glukoamylazę oraz esterazę acetylocholinową. Detekcja może być prowadzona z zastosowaniem metod kolorymetrycznych, które wykorzystują chromoforowy substrat do wykrywania enzymu. Wykrywanie może być także prowadzone poprzez wizualne porównywanie wyniku reakcji enzymatycznej substratu z podobnie przygotowanymi standardami.

Wykrywanie może być także prowadzone z wykorzystaniem licznych innych testów immunologicznych. Dla przykładu, poprzez znakowanie przeciwciał lub ich fragmentów pierwiastkami promieniotwórczymi możliwe jest wykrycie R-PTPazy dzięki zastosowaniu testu radioimmunologicznego (RIA). Dobry opis RIA można znaleźć w „Labolatory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology” autorstwa T. S. Worka i wsp., North Holland Publishing Company, NY (1978), a dokładnie w rozdziale zatytułowanym „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques” autorstwa T. Charta. Radioaktywny izotop może zostać wykryty za pośrednictwem licznika g lub licznika scyntylacyjnego, bądź przez autoradiografię.

Możliwe jest także znakowanie przeciwciała według niniejszego wynalazku związkiem fluorescencyjnym. Wówczas, gdy oznakowane związkiem fluoroscencyjnym przeciwciało jest wystawione na promieniowanie o odpowiedniej długości fali, jego obecność może być wykryta dzięki fluorescencji. Do powszechnie wykorzystywanych związków fluorescencyjnych należą izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina, fikoerytryna, pikocyjanina, allofikocyjanina, o-ftaloaldehyd i fluoreskamina.

Przeciwciało może być także wykrywalnie oznakowane z zastosowaniem metali zdolnych do fluorescencji, takich jak ¹⁵²E czy inne lantanowce. Metale te mogą być przyłączone do przeciwciała za pomocą grup chelatujących, takich jak kwas dietylenotriaminopentaoctowy (ETPA).

Przeciwciało może być także wykrywalnie oznakowane poprzez związanie go ze związkiem chemiluminescencyjnym. Obecność oznakowanego chemiluscencyjnym związkiem przeciwciała jest wykrywana wówczas na podstawie zarejestrowanej luminescencji, która występuje podczas zachodzącej reakcji chemicznej. Przykładami takich szczególnie użytecznych znaczników chemiluminescencyjnych są luminol, izoluminol, teromatyczny ester akrydynowy, imidazol, sól akrydynowa oraz ester szczawiowy.

Podobnie, związki bioluminescencyjne mogą zostać wykorzystane do znakowania przeciwciała według niniejszego wynalazku. Bioluminescencja jest rodzajem chemiluminescencji występującej w układach biologicznych, w których białko katalizujące zwiększa efektywność reakcji chemiluminescencyjnej. Obecność bioluminescencyjnego białka jest wyznaczana poprzez obecność luminescencji. Istotnymi związkami bioluminescencyjnymi użytecznymi w procesie znakowania są lucyferyna, luceferaza oraz akworyna.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku może być przystosowane także do stosowania w te ś cie immunometrycznym, znanym zarówno, jako test „dwustronny” jak i test „kanapkowy”. W typowym teście immunometrycznym pewna ilość niewyznakowanych przeciwciał (lub fragmentów przeciwciał) jest związana ze stałym podłożem lub nośnikiem, a pewna ilość wykrywalnie wyznakowanego rozpuszczalnego przeciwciała jest dodawana, aby umożliwić detekcję i/lub oznaczenie ilościowe trójskładnikowego kompleksu utworzonego pomiędzy związanym z fazą stałą przeciwciałem, antygenem oraz wyznakowanym przeciwciałem.

Zazwyczaj, i korzystnie, test immunometryczny obejmuje test „forward”, w którym przeciwciało związane z fazą stałą jest najpierw kontaktowane z testowaną próbką w celu usunięcia z próbki antygenu poprzez utworzenie dwuskładnikowego kompleksu przeciwciało-antygen w fazie stałej. Po odpowiednim czasie inkubacji stałe podłoże bądź nośnik jest przemywane w celu usunięcia pozostałości ciekłej próbki, włączając w to nieprzereagowany antygen, jeśli jest on obecny, i wówczas kontaktowane z roztworem zawierającym nieznan ą ilość oznakowanych przeciwciał , (które funkcjonują jak „cząsteczki reporterowe”). Po drugim okresie inkubacji pozwalającym przeciwciału na utworzenie kompleksu

PL 206 041 B1 z antygenem związanym z fazą stałą lub nośnikiem poprzez nieoznakowane przeciwciało, stale podłoże bądź nośnik jest przemywane po raz drugi w celu usunięcia nieprzereagowanych cząsteczek oznakowanego przeciwciała.

W innym typie „testu kanapkowego”, który może być także użyteczny z antygenami według niniejszego wynalazku wykorzystywany jest tak zwany „jednoczesny” lub „odwrócony” test. Test jednoczesny wymaga jednego etapu inkubacji, w którym oba przeciwciała zarówno związane do stałego podłoża bądź nośnika oraz wyznakowane są jednocześnie dodawane do testowanej próbki. Po zakończonej inkubacji, stałe podłoże bądź nośnik jest przemywany w celu usunięcia płynnej próbki i niezwiązanego wyznakowanego przeciwciała. Obecność wyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym nośnikiem lub podłożem jest wówczas wyznaczana tak samo, jak w przypadku klasycznego testu kanapkowego „forward”.

W teście „odwróconym”, pierwszy jest etap dodawania roztworu znakowanego przeciwciała do płynnej próbki, po czym pod wykorzystaniu odpowiedniego czasu inkubacji następuje dodawanie niewyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym nośnikiem lub podłożem. Po drugiej inkubacji, faza stała jest przemywana konwencjonalną metodą, aby pozbyć się jakichkolwiek pozostałości testowanej próbki oraz roztworu nieprzereagowanych wyznakowanych przeciwciał. Wykrywanie wyznakowanych przeciwciał związanych ze stałym podłożem bądź nośnikiem jest prowadzone wówczas tak samo jak w przypadku testu „jednoczesnego” oraz „foreward”.

Wynalazek zostanie teraz zilustrowany poprzez następujące w żaden sposób nieograniczające go przykłady.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1 Wytwarzanie r-hsLDLR CHO

Trwale zrekombinowane komórki CHO wyrażające ludzki rozpuszczalny LDLR otrzymano przez równoczesną transfekcję komórek CHO-DUKX pozbawionych genu reduktazy dihydrofolanowej (DHFR) (Urlaub, G. i wsp., 1980) dwoma wektorami ekspresji: psLDLROl zawierającym N-końcową wiążącą ligand domenę LDLR, rozpoczynającą się resztą aminokwasową Asp (+4), a kończącą się resztą Glu 291 (+291) oraz pDHFR zawierającym mysi gen DHFR, oboma kontrolowanymi przez promotor i czynnik zakończenia transkrypcji wczesnego regionu SV40. Transfekcję prowadzono z wykorzystaniem kationowych liposomów używając LipofectAmine (Gibco BRL) zgodnie z protokołem dostarczonym przez wytwórcę. Siedemdziesiąt dwie godziny po transfekcji komórki przeniesiono do selektywnego podłoża pozbawionego deoksy- i rybonukleozydów oraz uzupełnionego 10% zdializowanym FCS. Komórki wykazujące aktywność DHFR były zdolne do utworzenia kolonii, które zostały wyizolowane poprzez podniesienie komórek z wykorzystaniem papierowych krążków nasączonych trypsyną. Komórki namnażano i poddawano badaniom pod kątem aktywności r-hsLDLR. Transfekowane komórki poddano wówczas amplifikacji genu z zastosowaniem MTX, po czym subklonowano i selekcjonowano stabilne klony.

r-hsLDLR (postać +291) wytworzono z komórek stabilnego klonu CHO oznaczanego #33-10-29-21 w 5 litrowym bioreaktorze CelliGen, na pożywce wolnej od surowicy (Gibco CHO-A-SFM Kat. Nr 95-0091DJ). Surowy zbiór sklarowano poprzez filtrację na filtrze z wkładem 0,8-02 u (Gelman Kat. Nr CSS92DSCCK) i zatężano 100-krotnie na 5-kDa membranie. Postać +291 r-hsLDLR wykorzystywaną do pierwszych immunizacji oczyszczono stosując proces oczyszczania na małą skalę. W procesie tym wykorzystano kolumnę kationowymienną DEAE-Sepharose, a następnie etap oparty na oddziaływaniach hydrofobowych na kolumnie Butyl-TSK, który poprzedzał zastosowanie kolumny HTP oraz chromatografii wykluczania ze względu na wielkość (SEC) na kolumnie Sephacryl 100. Zebraną w trakcie SEC frakcję oznaczoną numerem #27 wybrano, jako wykazującą specyficzną aktywność przeciwwirusową wynoszącą 780 jednostek^g jak oznaczono w teście przeciwwirusowym opisanym poniżej w przykładzie 9. Białko obecne w tej frakcji zidentyfikowano w analizie końca N, jako r-hsLDLR.

Drugą porcję CHO +291 r-hsLDLR oczyszczono i wykorzystano do wstrzyknięć myszom. Oczyszczono ją wykorzystując ulepszony proces o większej wydajności, który obejmuje następujące etapy: a) klarowania oraz 100-krotnego zatężania surowego zbioru; b) anionowymiennej kolumny HQ POROS i, c) dwa etapy oparte na oddziaływaniach hydrofobowych (HIC): zatrzymywanie na kolumnie Butyl-TSK oraz przepływanie przez kolumnę Phenyl 5PW. Niezwiązaną frakcję z ostatniego etapu HIC poddano dializie i oczyszczono na kolumnie kationowymiennej HS-POROS. Ostatnim etapem była kolumna hydroksyapatytowa (HTP). Tak otrzymany r-hsLDLR oczyszczono w 90% wymywając go w postaci pojedynczego piku na kolumnie RP-HPLC.

PL 206 041 B1

P r z y k ł a d 2 Immunizacja myszy μg oczyszczonego r-hsLDLR frakcji #27 zebranej z kolumny SEC, jak opisano powyżej w przykładzie 1, w stężeniu 100 μg/ml zhomogenizowano w kompletnym adiuwancie Freund'a (CFA, 50% obj./obj.) i wstrzyknięto w poduszeczki łap każdej z pięciu siedmiotygodniowych myszy Balb/C płci żeńskiej.

Cztery tygodnie po pierwszej immunizacji myszom wstrzyknięto domięśniowo 10 μg 50% roztworu (obj./obj.) tej samej frakcji oczyszczonego r-hsLDLR w CFA.

Dwa tygodnie po drugiej iniekcji surowica myszy została poddana testom na obecność przeciwciał przeciwko r-hsLDLR z wykorzystaniem testu ELISA opisanego poniżej w przykładzie 3.

Dwóm myszom M-1 oraz M-2 wykazującym najsilniej specyficzną reaktywność immunologiczną wobec r-hsLDLR w 10 tygodni po drugiej iniekcji wstrzyknięto po 10 μg oczyszczonego r-hsLDLR otrzymanego w procesie ulepszonego oczyszczania, jak opisano powyżej w przykładzie 1.

Myszom upuszczano krew 14 tygodni później i testowano na obecność przeciwciał wobec r-hsLDLR. Wówczas wstrzyknięto im dwie dodatkowe dawki 50 μg r-hsLDLR w PBS: pierwszą śródotrzewnowo, a drugą dwa dni później, zarówno śródotrzewnowo jak i dożylnie.

Myszom upuszczono krew dwa tygodnie po drugiej iniekcji i surowicę odpornościową przetestowano na aktywność anty-r-hsLDLR bezpośrednio w teście ELISA opisanym poniżej w przykładzie 3. Każdą z surowic odpornościowych seryjnie rozcieńczano 1:100-1:32,000 i nakładano w dwóch powtórzeniach na płytki o 96 studzienkach opłaszczonych 10U/studzienkę r-hsLDLR oczyszczonego w ulepszonym procesie oczyszczania, jak opisano powyżej w przykładzie 1. Jako ślepą próbę wykorzystano bufor testowy oraz DMEM + 10% HS zawierający PBS + 1% BSA lub żelatynę + 0,05% Tween 20 + 0,05% tiomersalu umieszczane w pierwszej studzience każdego rzędu. W dwóch ostatnich rzędach umieszczono normalną mysią surowicę (NMS), w takim samym rozcieńczeniu, jako kontrolę negatywną. Absorbancję reakcji enzymatycznej zmierzono wykorzystując czytnik ELISA w zakresie 492 do 405 nm.

Wyniki tego testu ujawniły, że surowica myszy M-1 posiadała wyższy specyficzny odczyn odpornościowy wobec r-hsLDLR i dlatego została uśmiercona w celu zebrania komórek śledzony do fuzji z komórkami szpiczaka (Eshhar Z., 1985).

P r z y k ł a d 3 Bezpośredni ELISA testujący surowicę odpornościową oraz badanie przesiewowe klonów hybrydoma

Bezpośredni test ELISA w celu selekcji pozytywnej surowicy odpornościowej przeprowadzono jak następuje: płytki o 96 studzienkach opłaszczono 100 μΐ r-hsLDLR (oczyszczonym w procesie ulepszonego oczyszczania z przykładu 1) o stężeniu 100 jednostek/ml (lOU/studzienkę) w buforze PBS + 1% żelatyna (Sigma, Kat. Nr G-7765) + 0,9 mM Ca²⁺ oraz 0,5 mM Mg²⁺, pH 5,6, nazywanym dalej buforem testowym, pozostawiając na 90 minut w temperaturze 37°C z wstrząsaniem. Płytki przepłukano sześciokrotnie PBS + 0,05% Tween 20 (polioksyetylen- sorbitan monolaureanianu - Sigma P-1379), określanym dalej roztworem przemywającym.

Rozcieńczone seryjnie w stosunku 1:100-1:32,000 próbki surowicy odpornościowej pobrane od immunizowanych myszy bądź supernatant znad hodowli komórek hybrydoma dodano do studzienek i inkubowano mieszając przez 90 min. w temperaturze 37°C, a następnie przemyto sześciokrotnie roztworem przemywającym.

Do studzienek dodano 100 μΐ peroksydazy chrzanowej skoniugowanej z przeciwciałem kozim przeciwko mysiemu Fab (HRP)-APA (Sigma, Kat., nr 4601-1), rozcieńczonej w stosunku 1:1,200 i inkubowano przez 90 min. w temperaturze 37°C ze wstrząsaniem, i wówczas przepłukano sześć razy roztworem przemywającym.

100 μΐ roztworu substratu (przygotowanego przez rozpuszczenie jednaj tabletki OPD i jednej tabletki h2o2 w 20 ml wody) dodano do studzienek i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Reakcja enzymatyczna została zatrzymana przez dodanie po 100 μl/studzienkę 4N HCl.

Absorbancję 96 studzienkowych płytek odczytano przy użyciu czytnika ELISA przy długościach 492 i 405 nm, a wyniki wyliczono w oparciu o algorytm z czterema zmiennymi parametrami korzystając z oprogramowania MultiCal działającego na komputerze klasy PC połączonym z czytnikiem ELISA.

P r z y k ł a d 4 Fuzja, wytwarzanie hybrydoma, selekcja klonów i oczyszczanie przeciwciał z płynów puchlinowych

Fuzję oraz selekcję komórek hybrydoma prowadzono zgodnie z protokołem Eshhara Z., 1985. Pokrótce, komórki śledziony myszy M-1, której podano dawkę przypominającą na 2-4 dni poprzedzające fuzję, wykorzystano do fuzji z komórkami szpiczaka prowadzonej na drodze krótkiej inkubacji

PL 206 041 B1 z PEG. PEG począ tkowo rozcieńczono powoli DMEM, a nastę pnie całkowicie usunięto poprzez odwirowanie. Komórki zawieszono ponownie w podłożu selektywnym DMEM-HAT, umieszczono na 96 studzienkowych płytkach w stężeniu około 3,4x10^-4 komórek/studzienkę i inkubowano przez 10-14 dni w atmosferze 8% CO2 w temperaturze 37°C. Nastę pnie, w przeciągu 10 dni poż ywkę we wszystkich dołkach hodowli hybrydoma zmieniono na DMEM wzbogacony 10% końską surowicą (HS). Próbki supernantantu znad hodowli komórek hybrydoma badano na obecność Mab przeciwko r-hsLDLR z wykorzystaniem bezpośredniego ELISA, jak opisano powyżej w przykładzie 3. Bufor testowy wraz z DMEM + 10% HS wykorzystano, jako ś lepą próbę , Mab C7 (dost ę pny komercyjnie z Amersham) i mysią surowicę odpornoś ciową M-1 uż yto, jako pozytywne kontrole, podczas gdy, przeciwciał o monoklonalne przeciwko rozpuszczalnemu receptorowi p55 TNF użyto, jako kontrolę negatywną. Komórki ze studzienek, w których supernatancie hodowli wykryto obecność przeciwciał przeniesiono do płytkek o 24 studzienkach, a następnie do kolb T o pojemności 25 cm. Wzrastające hodowle monitorowano pod kątem wydzielania Mab przeciwko r-hsLDLR. Ampułki komórek przygotowane z pozytywnych hodowli mrożono i przechowywano w ciekłym azocie.

Całość z około 1000 hodowli przebadano przesiewowo w celu wykrycia przeciwciał przeciwko r-hsLDLR. 54 hodowle wykazujące najwyższą aktywność immunologiczną testowano wielokrotnie. Pięć hodowli (12, 28, 29, 30 i 50) o najwyższej aktywności poddano klonowaniu poprzez ograniczone rozcieńczenie na 96 studzienkowych płytkach. Supernatanty znad wzrastających klonów przetestowano wielokrotnie na obecność przeciwciał przeciwko r-hsLDLR przez bezpośredni test ELISA.

Komórki pozytywnych klonów hybrydoma hodowano w kolbie hodowli tkankowej w DMEM zawierającym 15% końskiej surowicy, a ampułki części hodowli zamrożono. Równocześnie, komórki różnych klonów hybrydoma wstrzyknięto 2-4 myszom w celu uzyskania płynów puchlinowych. Przeciwciała oczyszczono z płynów puchlinowych zarówno na drodze strącania siarczanem amonu, jak też na kolumnie z białkiem G. Pokrótce, 7,5 ml płynów puchlinowych rozcieńczono w stosunku 1:3 20 mM buforem fosforanowym o pH 7 i nanoszono na 5 ml kolumnę z białkiem G (C10/10). Kolumnę wymywano 20 mM buforem fosforanowym o pH 7 i Mab wymywano 100 mM buforem glicynowym o pH 2,7. pH wymywanej frakcji doprowadzono do 7-7,5 1 M buforem Tris o pH 9,3.

P r z y k ł a d 5 Badanie przesiewowe pod kątem par Mab do wykorzystywania w teście ELISA i optymalizacja parametrów testu ELISA

Oczyszczone Mab z płynów puchlinowych jak opisano w przykładzie 4 użyto w serii eksperymentów w formie matrycy, w celu wyselekcjonowania najlepszej odpowiedniej pary Mab do wykorzystania, jako pierwsze i drugie przeciwciało w „kanapkowym” teście ELISA na r-hsLDLR opisanym w przykładzie 6 poniż ej. Pokrótce, 96 studzienkowe płytki opłaszczono płynami puchlinowymi pochodzącymi od pięciu hybrydoma (nr 12, 28,28, 29,08, 30 oraz 50,05) oczyszczonych zarówno poprzez strącanie siarczanem amonu, jak też na kolumnie z białkiem G. Przeciwciała poddano badaniu przesewowemu wykorzystując jako antygen zarówno postać +291, jak też postać +292 (od reszty aminokwasowej Asp +4 do Cys +292) oraz +331 (od reszty aminokwasowej Asp +4 do Cys+331) r-hsLDLR wytworzonego w komórkach CHO. Jeden ml każdego z wyżej wymienionych częściowo oczyszczonych Mab oznakowano biotyną, w celu szybkiego zbadania ich użyteczności, jako drugiego przeciwciała w „kanapkowym” teście ELISA. Pokrótce, 1,5 mg strąconego siarczanem amonu oczyszczonego Mab doprowadzono do pH 8,5 za pomocą 30 μΐ 0,5 M NaHCO₃. 0,75 mg, N-Hydroksysukcynoimidobiotyny Biotyny-OSu (Biotin-Osu, Sigma, Kat. nr H1759, z roztworu 5 mg w 200 μl DMSO) dodano do roztworu przeciwciała i inkubowano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając, po czym inkubowano w temperaturze 2-8°C. Roztwór reakcyjny naniesiono na kolumnę Sephadex G-25M (Pharmacia Kat. nr 17-0851-01) PD 10, w celu rozdzielenia biotynylowanych Mab i nadmiaru nieprzereagowanej biotyny-OSu.

Pierwsze wstępne eksperymenty wskazały, że Mab 29.08 oraz 30, gdy wykorzystane, jako drugie przeciwciało w „kanapkowym” ELISA dostarczają najwyższego sygnału ponad linię tła.

Reakcję tych dwóch klonów, jako drugich przeciwciał przetestowano ponownie z przeciwciałami 12, 28, 29.08 i 50 opłaszczającymi płytki. Rezultaty tych eksperymentów jasno wykazują, że Mab 28 było przeciwciałem najlepszym do opłaszczania.

Najlepsze wyniki, jeśli chodzi o intensywność i specyficzność sygnału, otrzymano z Mab 28 wykorzystanym do opłaszczania płytki mikrotitracyjnej, oraz Mab 29,08 znakowanym biotyną jako drugim przeciwciałem. Wykorzystując te Mab dobre wyniki są osiągane z wszystkimi trzema postaciami r-hsLDLR (+291, +292 oraz +331). Ze wszystkimi postaciami absorbancja przy 492/405 nm wynosiła ok. 1,3 OD.

PL 206 041 B1

Trzy postacie antygenu r-hsLDLR badano w seryjnych rozcieńczeniach w zakresie stężeń od 0,9-1000 ng/ml. Krzywa odpowiedzi na dawkę otrzymana została z Mab 28, jako przeciwciałem związanym i biotynylowanym Mab 29,08, jako drugim przeciwciałem. Ta kombinacja dała liniową odpowiedź w zakresie stężeń od 1-10 mg/ml r-hsLDLR.

Liczne parametry mogące mieć wpływ na test ELISA, takie jak odczynniki, czas inkubacji, wybór buforu oraz płytek zoptymalizowano poprzez przetestowanie następujących parametrów:

Opłaszczenie studzienek płytki mikrotitracyjnej Mab 28 w PBS o stężeniu 5-10 μg/ml.

Skład buforu:

a) PBS + Tweed 20

b) Tris + Ca ²⁺ + NaCl + Tween 20

Roztwory blokujące:

a) 1% żelatyna w PBS, 0,05% Tween, 0,0005% tiomersal

b) 1% BSA w PBS, 0,05% Tween, 0,0005% tiomersal

c) 1% FBS w PBS, 0,05% Tween, 0,0005% tiomersal

d) 1% mleko w PBS, 0,05% Tween, 0,0005% tiomersal

e) I Block, Hy Pep i Hy Yeast

Drugie Mab znakowane biotyną stosowano w stężeniach 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10000 równoważnym zakresowi stężeń 10,74-0,537 μg/ml.

Ekstrawidynę o stężeniach 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10000 równoważnych zakresowi stężeń 4-0,2 μg/ml.

Ostatecznie za podstawową w tych badaniach przyjęto procedurę przeprowadzania kanapkowego ELISA opisaną w przykładzie 6 poniżej.

P r z y k ł a d 6 Ustalanie testu kanapkowego ELISA dla r-hsLDLR

Przyjęto kanapkowy test ELISA na r-hsLDLR z wykorzystaniem Mab 28 i 29,08. Pokrótce, 96 studzienkowe płytki opłaszczano 100 μΐ białka G i oczyszczonego Mab 28 (5 μg/ml) przez noc w temperaturze 2-8°C lub przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Płytki płukano wówczas pięciokrotnie PBS + 0,05% Tween 20. Płytki inkubowano z 200 μΐ roztworu blokującego (PBS + 1% BSA bądź żelatyna + 0,05% Tween 20 + 0,05% tiomersal) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C lub całą noc w temperaturze 4°C, a następnie przemyto pięciokrotnie PBS + 0,05% Tween 20. Do studzieniek dodano następnie po 100 μl próbki bądź antygenu krzywej kalibracyjnej (CHO +291 r-hsLDLR, 0,5-32 ng/ml rozpuszczone w roztworze blokującym) i inkubowano przez 90 minut w temperaturze 37°C ze wstrząsaniem. Płytki wówczas przemyto pięciokrotnie PBS + 0,05% Tween 20.

Dodano po 100 μl/studzienkę biotynylowanego Mab 29,08 (0,67 μg/ml) w roztworze blokującym i inkubowano wstrząsając przez godzinę w temperaturze 37°C. Płytki przemyto pięciokrotnie PBS + 0,05% Tween 20. Do studzienek dodano po 100 μl dostępnego na rynku koniugatu ekstrawidyna-peroksydaza (ExtrAvidin TM-Peroxidase BioMakor, Kat. nr 0645-1) rozcieńczonego 1:10,000 i inkubowano mieszając przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Płytki przemyto wówczas pięciokrotnie PBS + 0,05% Tween 20. Do każdej ze studzienek dodano następnie po 125 μl wspomnianego powyżej roztworu substratu i inkubowano przez 10 minut do czasu, gdy barwa roztworu osiągnęła pożądaną intensywność. Reakcję przerwano poprzez dodanie 125 μl 4N HCl. Absorbancję we wszystkich 96 studzienkach odczytywano używając czytnika ELISA przy długościach fali 492 i 405 nm, a wyniki obliczono stosując oprogramowanie MultiCal działające na komputerze klasy PC połączonym z czytnikiem ELISA.

P r z y k ł a d 7 Podklasa przeciwciał monoklonalnych

Podklasę przeciwciał monoklonalnych określono wykorzystując dostępny na rynku zestaw do określania podklasy (PharMingen International) zgodnie z procedurą testowania dostarczoną przez producenta. Klony 12,6, 28, 29,08 oraz 30 zidentyfikowano, jako IgG1, podczas gdy wykazano, że klon 50.30 należy do klasy IgM.

P r z y k ł a d 8 Analiza Western blot SDS-PAGE

Postać +291 oczyszczonego r-hslDLR oraz oczyszczone natywne LDLR pochodzące z ludzkiego moczu analizowano metodą immunoblottingu z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko r-hsLDLR. Pokrótce, 12% żel poliakrylamidowy w obecności SDS naniesiono wraz z 100 ng/ścieżkę postaci +291 r-hsLDLR CHO, lub z natywnym hsLDLR z moczu lub z surowym zbiorem TBP-1 (jako kontrolą negatywną) w warunkach redukujących (40 mM DTT). Jedną ścieżkę pokryto znacznikiem o małej masie cząsteczkowej (LMW). Taki zestaw próbek powtórzono pięciokrotnie. Białka rozdzielone na żelu przenoszono na membrany z nitrocelulozy. Membrany inkubowano w PBS zawierającym 10% odtłuszczone mleko, 0,1% Tween 20 przez 16 godzin. Membrany pocięto w paski i każdy z pasków inkubowano

PL 206 041 B1 przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z jednym z pięciu wybranych Mab: 12.6, 30, 50.30, 28, 29.08 (płyny puchlinowe rozcieńczone w stosunku 1:4000).

Paski membrany przemyto PBS zawierającym 0,1% Tween 20 (3 x 15 min) a następnie inkubowano przez godzinę z drugim przeciwciałem - kozim antymysim związanym z koniugatem peroksydaza chrzanowa-fosfataza alkaliczna (rozcieńczonym w stosunku 1:10000, BioMakor) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Paski przemyto PBS zawierającym 0,1% Tween 20 (3 x 15 min). Pozytywne pasma wykryto stosując wzmocnioną chemiluminescencję (ECL, Amersham).

Przeciwciała monoklonalne nr 12,6 oraz 29,8 w analizie Western blotingu rozpoznały zarówno r-hsLDLR z moczu, jak też postać +291 oczyszczonego r-hsLDLR (figura 2). Mab 28 i 30 rozpoznały postać +291 oczyszczonego r-hsLDLR.

P r z y k ł a d 9 Hamowanie przeciwwirusowej aktywnoś ci r-hsLDLR przez przeciwciał a monoklonalne

Mab, które specyficznie reagują z r-hsLDLR przetestowano in vitro pod kątem ich zdolności do blokowania przeciwwirusowej aktywności r-hsLDLR (forma +291) wykorzystując test inhibicji efektu cytopatycznego (CPE) w systemie VSV/WISH.

Komórki WISH (pochodzące z ludzkiej owodni) hodowano w pożywce MEM z 10% FBS oraz 4 mM glutaminą w 37°C, w inkubatorze w atmosferze 5% CO2. Wzrastają ce, eksponencjalnie komórki naniesiono na 96 studzienkowe płytki do hodowli tkankowych w zatężeniu 40000 komórek/studzienkę na dwadzieścia cztery godzin przed rozpoczęciem testu. Testowane próbki oraz standard rozcieńczono i rozdzielono do studzienek zawierających komórki. Do studzienek natychmiast dodano VSV w celu zwielokrotnienia infekcji (MOI) o 0,5 pfu/komórkę. Płytki inkubowano przez 16-18 godzin w temperaturze 37°C, a następnie przemyto etanolem. Monowarstwę przetrwałych komórek wybarwiono fioletem krystalicznym - Gram Crystal Violet. Oznaczenie ilościowe efektu cytopatycznego względem standardu przeprowadzono poprzez porównywanie intensywności koloru względem standardowych stężeń.

W celu zanalizowania efektu neutralizującego przeciwciał r-hsLDLR inkubowano wstę pnie w temperaturze 37°C przez 30 minut z pł ynami puchlinowymi testowanego Mab o wzrastają cym stę żeniu. Roztwory te następnie dodano do hodowli komórek WISH do 96 studzienkowych płytek mikrotitracyjnych, a następnie dodano wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Po 18 godzinach inkubacji rozpad komórek, któremu pośredniczył VSV oznaczono poprzez odbarwienie pozostałych komórek fioletem krystalicznym. Oznaczenie półilościowe efektu cytopatycznego względem standardu przeprowadzono poprzez porównywanie intensywności koloru (określanej przez czytnik ELISA) względem standardowych stężeń.

Działanie Mab przetestowano wraz ze wzrostem stężenia r-hsLDLR. Jak przedstawiono w tabeli 1 dwa Mab (12,6 i 50.30) wykazują aktywność neutralizując ą.

W eksperymencie przedstawionym w tabeli 1 efekt hamujący dwu Mab testowano przy rozcieńczeniu płynów puchlinowych 1:40. W takim rozcieńczeniu Mab 12,6 wykazuje w pewnym stopniu wyższą aktywność niż Mab 50.30. Może to być wynikiem zarówno właściwości Mab, jak też wynikać ze zróżnicowanych stężeń w płynach puchlinowych.

Efekt hamujący Mab może być przezwyciężony poprzez zwiększenie stężenia r-hsLDLR względem stężenia Mab. W rzeczywistości, w przypadku stężeń r-hsLDLR wyższych niż 62,5 U/ml nawet Mab nie ma żadnego wpływu na aktywność r-hsLDLR przy analizowanym stężeniu przeciwciała.

T a b e l a 1: Hamowanie aktywności przeciwwirusowej r-hsLDLR przez klony 12,6 oraz 50.30^(I)

VSV/Mab	Stężenie LDLR (U/ml)
	0	2,5	12,5	62,5
-VSV	1,5	1,2	1,6	1,5
+VSV	(0,25)	1	7 (1,7)	1,7
+VSV + Klon 50.30	6 (0,4)	0,88	(1,25)	1,62
+VSV + Klon 12.6	5(0,5)	0,77	7 (0,7)	1,67

(I) Hamowanie przeciwwirusowej aktywności r-hsLDLR przeciwko wywoływanemu przez VSV rozpadowi komórek WISH. Efekt hamujący Mab określano przy rozcieńczeniu płynów puchlinowych

PL 206 041 B1

1:40. Liczbę widocznych komórek przedstawiono w tabeli w wartościach OD. Liczby w nawiasach reprezentują liczbę powtórzeń wykonaną przy stężeniach LDLR 0 i 12,5 U/ml.

Hamowanie aktywności przeciwwirusowej określono stosując wzrastające stężenia Mab 12,6 oraz 50.30. Mab 12,6 hamuje aktywność przeciwwirusową r-hsLDLR w ~60% przy rozcieńczeniu (płynów puchlinowych) 1:40 i ~35% przy rozcieńczeniu 1:20500. Klon 50.30 blokuje aktywność przeciwwirusową r-hsLDLR ~45% przy rozcieńczeniu 1:40 oraz ~15% przy rozcieńczeniu 1:20500.

Krzywa odpowiedzi na dawkę uzyskana z obydwoma Mab oraz obserwacja, że efekt hamowania jest osłabiany poprzez nadmiar r-hsLDLR sugerują, że Mab mają wpływ na wiązanie do r-hsLDLR.

P r z y k ł a d 10 Zahamowanie replikacji HCV przez przeciwciała monoklonalne

Mab specyficzne wobec r-hsLDLR przetestowano pod kątem ich zdolności do hamowania replikacji HCV w ludzkich hepatocytach w hodowli pierwotnej. Hodowla komórek FT167 pochodziła od 57 letniej pacjentki wymagającej lobektomii z przyczyn medycznych (przeżuty raka okrężnicy do prawego płata).

Pierwotne hodowle ludzkich hepatocytów przygotowano dwustopniową metodą perfuzji kolagenazowej (Maurel P. Adv. Drug Del. Rev. 22:105-132 (1996), Pichard L. i wsp. Mol. Pharmacol. 41:1047-1055 (1992), Ferrini JB. I wsp., Chem-Biol. Interactions 107:31-45 (1997)). Żywotność komórek przed zaszczepieniem oznaczono stosując test eliminacji z użyciem błękitu tryptanowego. Cztery miliony komórek w 3 ml podłoża hodowlanego umieszczono w 60 mm szalkach z tworzywa sztucznego pokrytych uprzednio kolagenem. Wolna od surowicy pożywka hodowlana do długotrwałej hodowli składała się z podłoża Williamsa E uzupełnionego jak opublikowano (Lanford R. i wsp., In Vitro Cell Dev. Biol., 25:174-182 (1989)). Pożywkę tę wymieniano regularnie, co 48 godzin. Hodowlę utrzymywano w 37°C w wilgotnej atmosferze powietrza i 5% dwutlenku węgla. W tych warunkach hodowli ludzkie hepatocyty zachowują swój zróżnicowany fenotyp, przez co najmniej 35 dni (Ferrini JB. I wsp., Chem-Biol. Interactions 107:31-45 (1997)), są wrażliwe na zakażenie HCV oraz możliwa jest w nich replikacja genomu wirusa (Fournier C. i wsp., J. Gen Virol. 79:2367-2374 (1998)).

Próbka surowicy dodatnia względem HCV: Ustalono bank ludzkiej surowicy pochodzącej od pacjentów, u których wynik testu na obecność przeciwciał przeciw HCV, prowadzonego z użyciem EIA HCV 3,0 oraz Chiron RIBA HCV 3,0 SIA, był dodatni. Żaden z tych pacjentów nie był zakażony jednocześnie wirusem HBV lub HIV. W każdej próbce surowicy RNA HCV zliczono z użyciem monitora Roche', a genotyp określono stosując test liniowej sondy (ang. line probe assay) (Inno-Lipa HCV II, Innogenetics). Próbki surowicy przechowywano w temperaturze -80°C, w małych porcjach w celu uniknięcia cyklicznego zamrażania-odmrażania. Do tych eksperymentów wykorzystano próbkę S42 (genotyp 1b; obciążenie wirusem 410000 kopi/ml).

W celu zakażenia i póź niejszego leczenia hodowlę hepatocytów przeniesiono w sterylnych warunkach do laboratorium P3 (szczelnie zamknięte dla ludzkich-zakaźnych mikroorganizmów). Trzy dni po wysianiu, wówczas, gdy komórki powróciły do stanu prawidłowego po urazie doznanym w trakcie izolowania, przeprowadzono zakażenie in vitro hepatocytów poprzez całonocną inkubację z 25 μΐ próbki surowicy dodatniej względem HCV (S42) w 3 ml pożywki. Po zakażeniu komórki przemyto trzykrotnie 3 ml świeżej pożywki, a hodowlę kontynuowano w warunkach normalnych na pożywce hodowlanej do długotrwałych hodowli.

Komórki traktowano trzema różnymi Mab przeciwko r-hsLDLR, Mab 12,6, Mab 28 i Mab 29,8. Na trzydzieści minut przed zakażeniem komórki eksponowano na działanie 2 lub 8 μg/ml różnych Mab. Następnie komórki zakażono jak opisano powyżej.

Kontrolne hodowle zakażono w takich samych warunkach, jednakże z pominięciem etapu traktowania przeciwwirusowego. W równoległych eksperymentach prowadzonych dla porównania w tych samych warunkach, te same hodowle traktowano 5000 U/ml IFNa (IFNot silnie blokuje replikację HCV w komórkach). Wszystkie badania prowadzono w dwóch powtórzeniach.

Piątego dnia po zakażeniu pożywkę usunięto, a hodowle przemyto trzykrotnie zimnym, buforowanym fosforanem roztworem soli. RNA oczyszczono z 4 x 10⁶ hepatocytów na drodze ekstrakcji układem izotiocyjanian guanidyny - kwaśny fenol (Chomczynski PN., And. Sacchi N. Analyt. Biochem. 162:156-159 (1987)). Strącone RNA rozpuszczono w 50 μl wody traktowanej pirowęglanem dietylu (DEPC) i oznaczono ilościowo. Jeden μg komórkowego RNA poddano badaniom w specyficznym wobec nici teście rTth RT-PCR.

Aby zapobiec niepożądanemu zanieczyszczeniu specyficzny wobec nici test RT-PRC prowadzono w trzech oddzielnych pomieszczeniach: pomieszczeniu przed-PCR, pomieszczeniu PCR oraz pomieszczeniu po-PCR. RNA rozpuszczone w 10 μl wody traktowanej DEPC, pokryto olejem mineralnym i ogrzewano w temperaturze 95°C przez 1 min. Temperaturę obniżono do 70°C i dodano 10 μl

PL 206 041 B1 ogrzanej wcześniej mieszaniny reakcyjnej cDNA. Temperaturę obniżono wówczas do 60°C na 2 minuty w celu przyłączenia odcinków starterowych (ang. annealing), po czym prowadzono reakcję cDNA przez 20 minut w temperaturze 70°C używając polimerazy rTth DNA (Perkin-Elmer). Temperaturę utrzymywano na poziomie 70°C podczas dodawania 40 μΐ ogrzanego uprzednio buforu zawierającego, EGTA jako chelator jonów Mn, w celu stłumienia aktywności rTth RT. Gdy dodawano 40 μΐ ogrzanej wcześniej mieszaniny PCR, probówki reakcyjne utrzymywano w temperaturze 70°C. Reakcja PCR prowadzona w układzie Gene Amp ® PCR-System 96000 (Perkin-Elmer) w warunkach składających się z początkowego cyklu w temperaturze 94°C trwającego 1 min., 50 cykli w temperaturze 94°C trwających 15 sek., w 58°C przez 30 sek., 72°C przez 30 sek., oraz ostatecznego etapu wydłużenia w temperaturze 72°C przez 7 min. W teście dodatniej nici RNA HCV sekwencja nukleotydów startera P3 „w tył” jest 5'-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3' (nukleotydy 342-320), a startera P4 „w przód”: 5'-CACTCCCCTGTGAGGAACT-3' (nukleotydy: 38-56) (Laskus T. i wsp., J. Gen. Virol. 78:2747-2750 (1997)). Te same startery wykorzystano w odwrotnej kolejności, aby stwierdzić obecność ujemnej nici. Jedną dziesiątą amplifikowanego produktu zanalizowano przez elektroforezę na agorozie (2%), a następnie poddano koloryzacji BET i sfotografowano w świetle UV. W całej serii eksperymentów rozcieńczano zsyntetyzowane nici HCV RNA (+) i (-) i całkowicie dodano 1 μg wątrobowego RNA, aby naśladować warunki panujące podczas analizy hodowanych hepatocytów. Te mieszaniny zostały wykorzystana, jako pozytywne kontrole w teście RT-PCR oraz analizie.

Figura 3 pokazuje, że wytwarzanie ujemnej nici HCV w obecności Mab przeciwko LDLr jest całkowicie blokowane w hodowli FT167. Zatem replikacja genomu wirusa była silnie hamowana. Wyniki te są spójne z obserwacją, że LDLR może być receptorem na HCV.

P r z y k ł a d 11 Wytwarzanie chimerowych przeciwciał przeciwko LDLR mRNA oczyszczono z linii komórek hybrydoma wytwarzających Mab specyficzne wobec LDLR.

Specyficzne cDNA zsyntetyzowano z oligonukleotydów komplementarnych wobec końca 5' eksonu CHI z domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (oligo 1) oraz z 5' eksonu Cich domeny zmiennej łańcucha lekkiego (oligo 2) wykorzystując oczyszczone mRNA jako matrycę.

Otrzymano dwa cDNA, z których jeden koduje zamienny region (specyficzny wobec LDLR) łańcucha ciężkiego, a drugi zmienny region (specyficzny wobec LDLR) łańcucha lekkiego. cDNA sklonowano i zsekwencjonowano.

W celu wytworzenia chimerowego łańcucha ciężkiego gen zmiennego regionu łańcucha ciężkiego sklonowanego ludzkiego Ig wymieniono (stosując manipulacje genetyczne) na sklonownay DNA kodujący mysią zmienną domenę (specyficzną dla LDLR) łańcucha ciężkiego. Manipulacje genetyczne obejmują wycięcie zmiennego regionu ludzkiej Ig z wykorzystaniem specyficznych enzymów restrykcyjnych oraz ligację mysiego zmiennego regionu. Tą samą procedurę zastosowano w celu otrzymania chimerowego lekkiego łańcucha.

Skonstruowano ssacze plazmidy ekspresji, jedne zawierające genu łańcucha ciężkiego oraz inne zawierające genu chimerowego łańcucha lekkiego. Oba wektory wykorzystano do jednoczesnej transfekcji linii komórek hybrydoma (SP6).

Wytwarzanie swoistych wobec LDLR Ig przetestowano w teście ELISA albo w analizie Western blot, przy zastosowaniu, jako drugorzędowych przeciwciał bulionu hodowli transfekowanych komórek. Powinowactwo chimerowego przeciwciała do ligandu monitorowano przy zastosowaniu Biacore.

P r z y k ł a d 12 Przygotowanie transgenicznych myszy, które zawierają loci genu ludzkiej immunoglobuliny (ksenomyszy) oraz wytwarzanie ludzkiego Mab przeciwko hLDLR

Ksenomyszy przygotowano jak opisano w zgłoszeniu WO 98/24893 oraz przez Mandez'a M.J. i wsp. w Nature Genetics 15:146-56 (1997).

Biblioteki sztucznych ludzkich chromosomów drożdżowych (YAC) przeszukano w celu znalezienia YAC zwierających ludzki zmienny region łańcucha ciężkiego (około 1000 kb) (metoda klonowania YAC jest metodą wyboru wówczas, gdy pożądane są wstawki większe niż 100 kb).

YAC scharakteryzowano analizą Southern blot oraz metodą elektroforezy z plusacyjnym polem elektrycznym (PFGE). YAC powinny zawierać regiony Ο_μ, Ο·, D_h oraz V_h w konfiguracji linii zarodkowej.

Poprzez wykorzystanie nakładających się na siebie sekwencji zawartych w YAC, poddano je rekombinacji w drożdżach stosując strategię rekombinacji etapowej. Przed rekombinacją koniec 3' YAC (z regionu V) ligowano do selektywnego markera HPRT. Strukturę rekombinowanego YAC potwierdzono metodami PFGE oraz Southern biot (obecność loci ludzkiego łańcucha ciężkiego z regionu C do regionu Vh w konfiguracji linii zarodkowej).

PL 206 041 B1

Acentryczne ramię YAC jest celem wektora niosącego całkowity stały region 72, mysi wzmacniacz, gen odporności na neomycynę, dając ostatecznie ciężki łańcuch zawierający cały region zmienny tj. 82 geny Vh, 6 genów Jh oraz 3 zróżnicowane stałe regiony Ο_μ, Ο_δ, C_Y z odpowiadającymi im regulatorowymi sekwencjami. YAC oznaczono yH2. Tę konstrukcję wykorzystano do wytwarzania ksenomyszy.

Podobną strategię do tej używanej powyżej wykorzystywano do rekonstrukcji loci kappa, z tym, że: marker selekcyjny neomycyny jest ligowany do zrekonstruowanego YAC zawierającego całe loci kappa. YAC oznaczono yK2.

YAC zawierające yH2 wprowadzono do komórek ES poprzez fuzję YAC zawierającego sferoplast drożdży z mysimi komórkami E3 E14.TG3B pozbawionymi HPRT. Wybrano komórki dodatnie względem HPRT. Dodatnie klony namnażano i analizowano Southern blot oraz analizą CHEF. Zebrano klony zawierające cały YAC yH2.

Wprowadzanie oraz wybór YAC K2 do komórek ES przeprowadzono podobnie jak opisano w przypadku YAC yH2.

Komórki ES zawierające YH2 poddano mikroiniekcji do mysich blastocytów C57BL/6J. Uzyskane chimerowe osobniki o męskim kariotypie oceniono pod kątem przenoszenia linii zarodkowej na potomstwo.

Transgeniczne myszy yH2 oraz yK2 rozmnożono z myszami DI (homozygoty ze względu na loci docelowo inaktywowanego genowo mysiego łańcucha ciężkiego oraz kappa). Każdą z yH2;DI transgenicznych odmian rozmnażano z yK2;DI transgeniczną odmianą w celu uzyskania odmiany ksenomyszy.

Rekonstytucję rozwoju komórek B oraz wytwarzanie przeciwciał przez ksenomyszy oceniano metodą cytometrii przepływowej oraz ELISA.

Immunizację ksenomyszy przeprowadzono jak opisano w przykładzie 2.

Sposoby wytwarzania hybrydoma oraz przesiewania pozytywnych klonów są podobne do tych, które opisano w przykładach 3 i 4.

Klony hybrydoma 12.6, 28, 29.8, 30 oraz 50.30 zdeponowano w Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris w oparciu o Traktat Budapesztański i przyporządkowano im następujące numery depozytów 1-2390, 1-2391,1-2392,1-2393 oraz 1-2394 odpowiednio.

Literatura

Agnello, V., Abel G., Elfahal M., Knight G. B., oraz Zhang Q. X., (1999), „Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via Iow density lipiprotein receptor” [w trakcie cytowania], Proc Natl Acad Sci USA, 96 (22) 12766-71.

Beisiegel U., Schneider W. J., Goldstein J. L., Anderson R. G., Brown M. S., (1981). “Monoclonal antibodies to the Iow density lipoprotein receptor as probes for study of receptor-mediated endocytosis and the genetics of familial hypercholesterolemia”: J. Biol Chem, 256(22), 11923-31.

Bieri S., Djordjevic J. T., Dały N. L., Smith R., i Kroon P. A., (1995). „Disulfide bridges of a cysteine-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain”, Biochemistry, 34 (40), 13059-65.

Brown M. S., i Goldstein J. L., (1976), „Familial hypercholesterolemia: A genetic defect in the low-density lipoprotein receptor”, N. Engl. J Med., 294 (25), 1386-90.

Brown M. S., i Goldstein J. L., (1986) „A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis”, Science, 232 (4746), 34-47.

Chomczynski P. N., i Sacchi N., (1987), „Single-step method of RNA isolation by acid duanidinium thicyanate-phenol-chloroform extraction”, Analyt. Biochem., 162:156-9.

Eshhar Z., 1985, „Monoclonal Antibody Strategy and Techniques” in „Hybridoma technology in the bioscience and medicine” wyd. Timothy A. Springer (Plenum Publishing Corporation, 1985; rozdz. 1)

Fischer D. G., Tal N., Novick D., Barak S., i Rubinstein M., (1993), „An antiviral soluble form of the LDL receptor induced by interferon”, Science, 262 (5131), 250-3.

Fisher D. G., Novick D., Cohen B., Rubinstein M., (1994), „Isolation and characterisation of a souluble form of the LDL receptor, an interferon-induced antiviral protein”, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 206 (3), 228-32.

Ferrini J. B., Pichard L., Domergue J., i Maurel P., (1997), „Long-term primary cultures of adult human hepatocytes”, Chem-Biol Interactions 107:31-45

Fournier C, Sureau C, Coste J., Ducos J., Pageaux G., Larrey D., Domerrgue J., i Maurel P., (1998). „In vitro infection of adult human hepatocytes”, Chem-Biol Interactions 107:31-45

PL 206 041 B1

Goldstein J. L., Anderson R. G., I Brown M. S. (1979). „Coated pits, coated vesicles and receptor-mediated endocytosis”, Nature, 279 (5715), 679-85.

Goldstein J. L., Dana S. E., Brunschede G. Y., i Brown M. S., (1975). „Genetic heterogenity in familial hypercholeterolemia: evidence for two different mutations functions of low-desity lipoprotein receptor”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 (3), 1092-6.

Lanford R. E., Carey K. D., Estlack L. E., Smith G. C, I Hay R. V., (1989), „Analysis of plasma protein and lipoprotein synthesis in long-term primary cultures of baboon hepatocytes maintained in serum-free medium” In Vitro Celi Dev. Biol, 25:174-82.

Laskus T., Radkowski M., Wang L. F., Cianciara J., Vargas H., i Rakela J., (1997). „Hepatitis C virus negative strand RNA is not detected in pheripheral blood mononuclear cells and viral sequences are identical to those in serum: a case against extrahepatic replication”, J. Gen. Virol, 78:2747-50.

Maurel P., (1996), „The use of adult human hepatocytes in primary culture and other in vitro systems to investigate drug metabolism in man”, Adv. Drug. Del. Rev. 22:105-132.

Mendez M. M., Green L. L., Corvalan J. R. F„ Jia X-C, Maynard-Curie E. E., Yang X-D., Galio M. L., Louie D. M., Lee D. V., Erickson K. L., Luna J., Roy C. M-N., Abderrahim H., Kirshenbaum F., Noguchi M., Smith D. M„ Fukushima A., Hales J. F., Finer M. H., Davis C. G., Zsebo K. M., i Jokobovits A., (1997). „Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice”, Nature Genetics, 15, 146-156.

Pichard L., Fabre I., Daujat M., Domergue J., Joyeux H., I Maurel P., (1992). „Effect of corticosteroids on the expression of cytochromes P450 and on cyclosporin A oxidase activity in primary cultures of human hepatocytes”, Mol. Pharmacol. 41:1047-55.

Riachmann L., Clark M., Waldmann H. i Winter G., (1988). „Reshaping human antibodies for therapy” Nature, 332, 323-27.

Sudhof T. C, Goldstein J. L., Brown M. S., I Russell D. W., (1985). „The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins”. Science, 228 (4701), 815-22.

Urlaub G. i Chasin L. A., (1980) Isolation of Chinese Hamster Celi Mutants Deficient in Dihydrofolate Reductase Activity., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220.

Claims (19)

1. Przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimerowe, całkowicie humanizowane przeciwciało, przeciwciało anty-anty-ID albo jego fragment specyficznie rozpoznające oraz wiążące ludzki rozpuszczalny receptor LDL albo jego fragmenty, które jest zdolne do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C i które uzyskuje się poprzez immunizację zwierząt ludzkim rozpuszczalnym LDLR+291, to jest postacią ludzkiego rozpuszczalnego receptora zawierającą sekwencję aminokwasową Asp+4 do Glu+291 sekwencji ludzkiego rozpuszczalnego LDLR, za wyjątkiem przeciwciała monoklonalnego Cl.

2. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wytwarzane przez klon hybrydoma 12.6 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2390, klon hybrydoma 28 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2391, klon hybrydoma 29.8 zdeponowany, w CNCM pod numerem 1-2392.

3. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wyrażane przez klon hybrydoma 12.6 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2390.

4. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wyrażane przez klon hybrydoma 28 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2391.

5. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wyrażane przez klon hybrydoma 29.8 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2392.

6. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wyrażane przez klon hybrydoma 30 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2393.

7. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wyrażane przez klon hybrydoma 50.30 zdeponowany, w CNCM pod numerem 1-2394.

8. Przeciwciał o monoklonalne wedł ug jednego z zastrz. 1 do 7, znamienne tym, ż e należ y do izotypu immunoglobulin IgG1 albo IgM.

9. Klon hybrydoma 12.6 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2390.

10. Klon hybrydoma 28 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2391.

11. Klon hybrydoma 29.8 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2392.

PL 206 041 B1

12. Klon hybrydoma 30 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2393.

13. Klon hybrydoma 50.30 zdeponowany w CNCM pod numerem 1-2394.

14. Sposób wykrywania i/albo analizy ilościowej ludzkiego LDLR, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie przeciwciała monoklonalnego określonego w jednym z zastrzeżeń 1 do 8.

15. Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje wzrost klonowanych hybrydoma obejmujących komórki śledziony pochodzące od ssaka immunizowanego wysoce oczyszczonym ludzkim LDLR+291, to jest postacią ludzkiego rozpuszczalnego receptora zawierającą sekwencję aminokwasową Asp+4 do Glu+291 sekwencji ludzkiego rozpuszczalnego LDLR, i homogenne albo heterogenne komórki limfoidalne w ciekłej pożywce albo w jamie brzusznej ssaka, aby umożliwić wytworzenie i zgromadzenie przeciwciała monoklonalnego przez hybrydoma.

16. Sposób oczyszczania ludzkiego LDLR, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu materiału zawierającego surowy ludzki LDLR z przeciwciałem monoklonalnym określonym w jednym z zastrzeżeń 1-8 lub z przeciwciałem monoklonalnym otrzymanym sposobem określonym w zastrz. 15.

17. Sposób in vitro hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C obejmujący przed zainfekowaniem wirusem zapalenia wątroby typu C kontaktowanie komórek z przeciwciałem monoklonalnym określonym w zastrz. 1 do 8 dla zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w komórkach.

18. Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego jak określone w zastrz. 1 do 8 do wytwarzania leku do leczenia zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C.

19. Przeciwciało monoklonalne jak określone w zastrz. 1 do 8 do stosowania, jako lek.