MXPA02009091A - Anticuerpos monoclonales para el receptor humano para lipoproteinas de baja densidad, su produccion y uso. - Google Patents

Abstract

Se proveen anticuerpos monoclonales para el receptor LDL que son utiles para la identificacion y purificacion de LDL en el tratamiento de, por ejemplo, infeccion por hepatitis C.

Description

ANTICUERPOS MONOCLQNALES PARA EL RECEPTOR HUMANO PARA LIPOP OTEINAS DE BAJA DENSIDAD. SU PRODUCCION Y USO ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente al receptor humano para lipoproteínas de baja densidad (LDLR). Estos anticuerpos son útiles por ejemplo, para la identificación y purificación de LDLR soluble humano (hsLDLR) en los procedimientos de producción así como en la identificación y tratamiento de enfermedades tales como infección por hepatitis C (HCV).

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El colesterol, un componente de todas las membranas plasmáticas eucarióticas, es esencial para el crecimiento y viabilidad de las células en organismos superiores. Sin embargo, los niveles elevados de colesterol en el suero ocasionan enfermedad y muerte por la contribución de la formación de placas ateroscleróticas en arterias en todo del cuerpo. El sitio principal de síntesis de colesterol en los mamíferos es el hígado. También el intestino forma cantidades apreciabies de colesterol. La velocidad de la formación de colesterol por estos órganos es responsable en gran medida de la cantidad de colesterol absorbido por las fuentes de alimentos. Las células fuera del hígado y del intestino adquieren el colesterol del plasma más que por síntesis de novo de éste. El colesterol y otros líquidos son transportados en fluidos corporales por lipoproteínas, las cuales se clasifican de acuerdo con el incremento en densidad. Una lipoproteína es una partícula que consiste de un núcleo de lípidos hidrófobos rodeado por una cubierta de lípidos polares y apoproteínas. Estas lipoproteínas tienen dos funciones: solubilizan a los lípidos altamente hidrófobos y pueden contener señales que regulan el movimiento de los lípidos particulares dentro y fuera de células y tejidos objetivo específicos. El colesterol es transportado en los fluidos corporales por lipoproteínas de baja densidad (LDL), las cuales se unen a un receptor específico sobre la membrana plasmática de células no hepáticas. El complejo receptor-LDL es internalizado luego dentro de las células mediante un mecanismo de transporte conocido como endocitosis mediada por receptor (Goldstein et al. 1979). El receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) es el prototipo de una familia de receptores de superficie celular estructuralmente relacionados que median la endocitosis de múltiples ligandos en células de mamífero. El receptor de LDL consiste de 822 residuos de aminoácidos y exhibe un peso molecular de 164,000. Esta compuesto de varios dominios algunos de los cuales comparten homología de secuencia con otras proteínas. Su dominio NH2-terminal de unión al ligando consiste de 292 residuos, dispuestos en 7 repeticiones imperfectas ricos en cisteína. Cada repetición contiene seis residuos de cisteína que están unidos por un enlace disulfuro en el patrón uno a tres, dos a cinco, y cuatro a seis. (Bieri et al. 1995). Este dominio es seguido por cuatro dominios adicionales: el primero consiste de 400 residuos de aminoácidos y es homólogo al receptor de EGF, el segundo consiste de 58 residuos de aminoácidos ricos en azúcares con unión O, el tercero es un único dominio transmembranal de 22 residuos de aminoácidos y el cuarto es un dominio citoplásmico de 50 residuos de aminoácidos (Sudhof et al. 1985), (Brown et al. 1986). La importancia fisiológica del receptor LDL fue revelada por los estudios de Brown y Goldstein sobre hipercolesterolemia familiar (FH). Se encontró que la enfermedad se debe a un defecto genético molecular que da como resultado la ausencia o deficiencia de receptores funcionales para LDL (Brown et al. 1976). Se han caracterizado varias clases de mutaciones de FH. (Goldstein et al. 1975). Una forma soluble del LDLRs que presenta actividad antiviral se identificó y aisló a partir del sobrenadante de cultivo de células inducidas con interferón (Fischer et al. 1993) y en fluidos corporales (Fisher et al. 1994). Se han identificado varias proteínas inducidas por interferón que son útiles para inducir del estado antiviral por IFN. Una de dichas proteínas que presenta actividad antiviral se produjo y acumuló en el sobrenadante de cultivo de células WISH de amnios humano. Esta proteína se purificó hasta homogeneidad y se identificó como el LDLRs (véase EP 0 553 667 y Fisher et al. 1993). Se encontró que el LDLRs es secretado al medio por células de mamífero que entran a un estado antiviral en respuesta al interferón. En contraste al interferón, el LDLRs no induce un estado antiviral en las células pero es antiviral por sí mismo. Se encontró que el LDLRs aparentemente tiene que estar presente a todo lo largo del proceso de maduración de la replicación y gemación viral sugiriendo que éste puede estar implicado en un proceso complejo que lleva a la inhibición del ensamblaje del virus o de la gemación (datos no publicados). Recientemente se ha mostrado que la endocitosis del virus de hepatitis C está mediada por receptores de LDL en células en cultivo (Angello et al. 1999). Estos y otros hallazgos sugieren que la familia de receptores de LDL pueden servir como receptores virales. Por lo tanto, los anticuerpos generados en contra del receptor de LDLRs pueden bloquear la entrada y gemación de partículas virales mediante la unión al receptor de LDL celular. El único anticuerpo monoclonal disponible para LDLR conocido hasta ahora es C7, un anticuerpo a LDLR de bovino (Beisiegel et al. 1981 , comércialmente disponible de Amersham, RU), el cual se preparó mediante inmunización de ratones con LDLR de corteza suprarrenal de bovino purificado hasta homogeneidad. Las membranas a partir de la corteza suprarrenal de bovino se solubilizaron y el receptor se purificó parcialmente mediante elución a partir de una columna de DEAE-celulosa (Beisiegel et ai. 1981 ). El anticuerpo al LDLR de bovino solamente reacciona débilmente de manera cruzada con LDLR humano. De hecho, se encontró que el ab C7 a LDLR de bovino tiene desventajas significativas cuando se utiliza para la detección y cuantificación de LDLR recombinante humano: a) tiene muy poca afinidad al LDLR humano b) reacciona significativamente de manera cruzada con las impurezas derivadas del cultivo celular Los anticuerpos específicos a LDLR humano no estuvieron previamente disponibles. Esto parece sorprendente puesto que es muy común generar anticuerpos contra proteínas novedosas, ya sea por purificación, identificación o para propósitos de desarrollo de la prueba. Es posible que dichos anticuerpos no hayan sido generados hasta ahora, puesto que una condición para generar anticuerpos monoclonales es la disponibilidad de cantidades suficientemente grandes de antígeno altamente purificado lo cual permite una inmunización eficiente de los ratones. Un antígeno altamente purificado es aquel que aparece como un único pico principal en RP-HPLC. Los métodos adicionales para identificación y cuantificación del antígeno durante los procedimientos de purificación no fueron fáciles de establecer. De conformidad con la invención, la prueba de actividad antiviral descrita en la presente invención se empleó para la identificación de LDLR durante los procedimientos de purificación. Existe una necesidad para generar Mab específicos a LDLR soluble humano para proveer los medios para desarrollar un inmunoensayo eficiente (ELISA) y para identificación de la proteína en Western blot. Estos anticuerpos se requieren para el monitoreo y cuantificación del LDLR recombinante soluble humano durante el desarrollo de los procedimientos de producción y purificación de la proteína recombinante y para la detección de la proteína natural.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención permite la generación de líneas celulares de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales capaces de reconocer y unirse específicamente al receptor LDL humano y a fragmentos del mismo. Más específicamente, la presente invención permite la generación de líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales capaces de conocer y unirse específicamente al receptor de LDL soluble humano. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo anti-anti-ld o fragmento del mismo, el cual reconoce y se une específicamente al receptor LDL humano y a fragmentos del mismo, excepto el anticuerpo monoclonal C7. La presente invención provee dichos anticuerpos monoclonales que reconocen y se unen al LDLR soluble humano y satisfacen las siguientes necesidades: 1. Mabs que pueden ser utilizados como un par en una prueba de ELISA, por ejemplo, una prueba de ELISA intercalada (prueba ¡nmunoabsorbente asociada a enzima) para detección de LDLR soluble humano. 2. abs que pueden ser utilizados para la identificación del LDLR en análisis de Western blot. 3. Mabs que pueden ser utilizados para neutralizar la actividad biológica antiviral del LDLR soluble humano. 4. Mabs que pueden ser utilizados para inhibir la infección viral, tal como HCV. La presente invención provee, además, un método para la detección y/o la cuantificación de LDLR humano que comprende el uso de anticuerpos monoclonales específicos de conformidad con la invención de manera conocida para ese propósito. La presente invención también provee hibridoma clonado que comprende una célula de bazo a partir de un mamífero inmunizado con LDLR recombinante humano y una célula linfoide homogénica o heterogénica. Un anticuerpo monoclonal de conformidad con la invención se prepara de manera convencional, por ejemplo, haciendo crecer un hibridoma clonado que comprende una célula del bazo de un mamífero inmunizado con hsLDL y una célula linfoide homogénica o heterogénica en un medio líquido o en el abdomen de un mamífero para permitir que el hibridoma produzca y acumule el anticuerpo monoclonal. En otro aspecto, la invención provee un método para purificar el LDLR humano, que consiste en poner en contacto un material que contiene LDLR sin purificar con un anticuerpo monoclonal de conformidad con la invención. Una columna con anticuerpo monoclonal adsorbido específico para LDLR puede ser utilizada como un paso para purificación por afinidad, en el procedimiento de purificación de la proteína recombinante. Un método para detectar y medir LDLR recombinante humano que consiste en utilizar como anticuerpo el anticuerpo monoclonal de la presente invención en una prueba de ELISA como se describió en el ejemplo 5. Como el LDLR o fragmento de un LDLR para inmunizar animales se puede usar cualquier LDLR siempre y cuando sea el LDLR de un mamífero de sangre caliente. También se puede usar una muteína de LDLR. Un ejemplo representativo de dicho LDLR soluble de mamífero humano es la forma soluble LDLR + 291 que incluye la secuencia de aminoácidos que inicia en el aminoácido Asp en la posición +4 y termina con el aminoácido Glu en la posición +291 de la secuencia del LDLR humano; también se puede usar alguna otra forma, tal como la forma + 292, etc.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra un diagrama de flujo que ilustra el desarrollo de anticuerpos monoclonales a r-hsLDLR. La figura 2 muestra un análisis de Western blot de la forma +291 de r-hsLDLR en la línea 1 , el hsLDLR de orina en la línea 2 y el receptor TNF p55 humano como un control negativo (TBPh-1-r) en la línea 3, con los anticuerpos monoclonales indicados debajo cada tira. Las flechas a la izquierda de la figura indican la posición de los marcadores de peso molecular y las flechas a la derecha de la figura apuntan a la posición de la forma hsLDLR indicada arriba de cada flecha. La figura 3 muestra el efecto de Mabs 12.6, 28 y 29.8 sobre la producción de cadenas HCV (+) y (-) en cultivo de FT167. Las células se trataron 30 minutos antes de la inyección con MAb anti-LDLR (8 ó 2 µg/ml). Luego, las células se infectaron durante la noche con 25 µ? de suero HCV (+) (No 42; 1 b). El día antes de la infección, se llevaron a cabo tres lavados y se añadió un medio nuevo y se cambió cada 48 horas. Cinco días después de la infección, los hepatocitos se cosecharon, el ARN se purificó y 1 µg de ARN celular se analizó mediante rTth RT-PCR (Perkin Elmer). Las pruebas se llevaron a cabo por duplicado. + SP: prueba de ARN de cadena positiva; -SP: prueba de ARN de cadena negativa; X: blanco.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se generaron los anticuerpos monoclonales (Mabs) para LDLR soluble humano (hsLDLR). Utilizando estos anticuerpos monoclonales, se desarrollaron una prueba de ELISA y un procedimiento de Western blot para la identificación de hsLDLR y una prueba de neutralización para la actividad antiviral de hsLDLR.

Los Mabs se generaron en ratones, inmunizados con la forma recombinante +291 de hsLDLR, que consiste del dominio de unión del ligando N-terminal del LDLRHS soluble humano, de Asp+4 a Glu +291. La forma recombinante +291 de hsLDLR, se produjo en células de CHO y se purificó hasta hacerse homogénea. Los ratones inmunizados produjeron títulos significativos de anticuerpos específicos. Después de la selección de hibridomas, se identificaron cinco clones (números 12, 28, 29, 30 y 50) como los mayores productores de anticuerpo. Estos clones se seleccionaron para subclonación adicional. Después de la subclonación, se aislaron 29 subclones que tenían una elevada productividad de anticuerpo y se congelaron ampolletas de los clones parentales y de los subclones. Un par de anticuerpos monoclonales se eligieron para la prueba de ELISA para el r-hsLDLR. Mab 28 se seleccionó como el anticuerpo de revestimiento, y Mab 29.8 marcado con biotina, se eligió como el anticuerpo secundario. Mab 12.6 y 29.8 se encontraron adecuados para la identificación de hsLDLR sin afección y recombinante en análisis de Western blot y Mab 28 y 30 se encontraron adecuados para la identificación del hsLDLR en análisis de Western blot Los Mabs 12.6 y 50.30 se encontraron adecuados para la inhibición de la actividad antiviral de hsLDLR. También se encontró de conformidad con la invención que los Mabs 12.6, 28 y 28.9 inhiben la replicación del genoma viral del virus de hepatitis C (HCV) en cultivos primarios de hepatocitos humanos. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden ser utilizados para el tratamiento de la infección por hepatitis C (figura 3). Se determinó el isotipo de las subclases del Mab producido por los clones. Los clones 12.6, 28, 29.8 y 30 se identificaron como IgGi mientras que el clon 50.30 se encontró que era IgM. Los Mabs, desarrollados contra la forma + 291 del hsLDLR también reconocieron otras formas del hsLDLR, por ejemplo la forma + 292 y la forma + 331 del hsLDLR producidas en células de CHO recombinantes, en prueba de ELISA y en análisis de Western blot. La forma + 292 comprende la parte N-terminal de receptor del residuo de aminoácido Asp +4 a Cys +292 y la forma + 331 comprende la parte N-terminal de receptor del residuo de aminoácido Asp +4 a Cys +331. El antígeno utilizado para inmunizar ratones para generar anticuerpos monoclonales fue la forma + 291 de hsLDLR, que se produjo en células CHO. La producción del r-hsLDLR se llevó a cabo en biorreactores, utilizando el sistema de matriz Fibracel en fase estacionaría. El r-hsLDLR se purificó hasta hacerse homogéneo y se utilizó para inmunizar ratones. Las células inmunes del bazo del ratón que respondió de la mejor manera se utilizaron para la fusión y generación de hibñdomas. Con respecto a los anticuerpos mencionados a lo largo de la presente descripción, el término "anticuerpo monoclonal" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanizados, anticuerpos para anticuerpos anti-idiotípicos (anticuerpos anti- anti-ld) que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos provistos mediante cualquier técnica conocida, tal como, pero sin limitarse a digestión enzimática, síntesis peptídica o técnicas de recombinación. Un anticuerpo monoclonal contiene una población substancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, cuyas poblaciones contienen sitios de unión a epítope substancialmente similares. Los Mabs pueden obtenerse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); patente de E.U.A. No. 4, 376, 1 10; Ausubel et al., eds., Harlow y Lañe ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), el contenido de dichas referencias se incorpora en su totalidad aquí por referencia. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produce un Mab de la presente invención puede cultivarse in vitro, in situ o in vivo. La producción de altos títulos de Mab in vivo o in situ hace de éste el método de producción actualmente preferido. Los anticuerpos quiméricos son moléculas de las cuales porciones diferentes se derivan de especies animales diferentes, tales como aquellas que tienen la región variable derivada de un Mab murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se utilizan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para incrementar el rendimiento en la producción, por ejemplo, en donde los Mabs murinos tienen rendimientos superiores a partir de hibridomas pero mayores inmunogenicidades en humanos, de manera que se utilizan dichos Mabs quiméricos humanos/murino. Los anticuerpos quiméricos y métodos para su producción se conocen en la técnica (Cabilly et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 : 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada el 14 de noviembre de 1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1975); Taniguchi et al., Solicitud de Patente Europea 171 96 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger et al., Solicitud PCT WO 8601533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo et al., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 1 de junio de 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., Solicitud de Patente Internacional No. WO 8702671 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); Riechmann et al., Nature 332: 323-327, y Harlow y Lañe, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente mencionado. Estas referencias se incorporan en su totalidad en la presente descripción por referencia. "Anticuerpos completamente humanizados" son moléculas que contienen tanto la región variable como la región constante de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos completamente humanizados pueden ser potenciaimente utilizados para uso terapéutico, en donde se requieren los tratamientos repetidos para enfermedades crónicas y recurrentes tales como enfermedades autoinmunes. Un método para la preparación de anticuerpos completamente humanos consiste en la "humanización" del sistema inmune humoral de ratón, es decir la producción de cepas de ratón capaces de producir Ig humana (Xeno-ratones), mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) dentro de ratones en los que los genes endógenos para Ig han sido inactivados. Los loci Ig son excedentemente complejos en términos tanto de su estructura física como del proceso de redisposición y expresión de genes requeridos para producir finalmente una amplia respuesta inmune. La diversidad de anticuerpos es generada principalmente por la redisposición combinatoria entre diferentes genes V, D, y J en los loci Ig. Estos loci también contienen los elementos reguladores intercalados, los cuales controlan la expresión del anticuerpo, la exclusión alélica, cambio de clase y maduración por afinidad. La introducción de transgenes Ig humanos no redispuestos dentro de ratones ha demostrado que la maquinaría de recombinación del ratón es compatible con los genes humanos. Además, los hibridomas que secretan antígeno específico para mAb-hu de varios isotipos pueden obtenerse mediante inmunización de Xeno-ratones con el antígeno. Los anticuerpos completamente humanizados y los métodos para su producción se conocen en la técnica (Méndez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997); Buggermann et al., Eur. J. Immunol. 21 : 1323-1326 (1991); Tomizuka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 97: 722- 727 (2000), Patente WO 98/24893. Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión el antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede prepararse mediante la inmunización de un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo cepa de ratón) como la fuente del ab para el cual se prepara un anti-ld. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante al producir un anticuerpo para estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-ld). Véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4, 699, 880, que se incorpora en su totalidad en la presente descripción por referencia. El anticuerpo anti-ld también puede ser utilizado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune incluso en otro animal, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-ld. El anti-anti-ld puede ser idéntico epitópicamente al Mab original, el cual induce el anti-ld. Por lo tanto, al utilizar anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un Mab, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad. Por consiguiente, los Mabs generados contra LDLR, sus isoformas, análogos, fragmentos o derivados de la presente invención pueden ser utilizados para inducir anticuerpos anti-ld en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Las células del bazo de dichos ratones inmunizados se utilizan para producir hibridomas anti-ld que secretan Mab anti-ld. Además, los Mab anti-ld pueden ser acoplados a un vehículo tal como hemocianina de lapa (KLH) y utilizarse para inmunizar ratones BALB/c adicionales. El suero de estos ratones contendrá anticuerpos anti-anti-ld que tienen las propiedades de unión del Mab original específico para un epítope de la proteína LDLR anteriormente mencionada, análogos, fragmentos y derivados de la misma. Los Mabs anti-ld por lo tanto tienen sus propios epítopes idiotípicos, o "idiotopos" estructuralmente similares al epítope a ser evaluado. El término "anticuerpo monoclonal" también se pretende que incluya tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, tal como, por ejemplo, Fab y F(ab')2, los cuales son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fe del anticuerpo intacto, desaparecen rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión no específica al tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Med. 24: 316-325 (1983)). Se apreciará de Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden ser utilizados para la detección y cuantificación de la proteína LDLR de conformidad con los métodos descritos en la presente invención para moléculas intactas de anticuerpo. Dichos fragmentos típicamente se producen por digestión proteolítica, utilizan enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Un anticuerpo monoclonal se dice que es "capaz de unir" una molécula si ésta es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para así unir la molécula al anticuerpo. El término "epítope" se pretende que se refiera a aquella porción de cualquier molécula capaz de ser unidad a un anticuerpo, la cual también puede ser reconocida por ese anticuerpo. Los epítopes o "determinantes antigénicos" usualmente consisten de agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activas tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Un "antígeno" es una molécula de una porción de una molécula capaz de ser unida a un anticuerpo, cuyo antígeno adicionalmente es capaz de inducir a un animal a que produzca anticuerpo capaz de unirse a un epítope de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítope. La reacción específica referida anteriormente se pretende que indique que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con un epítope en su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser producidos por otros antígenos. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención pueden utilizarse para detectar cuantitativamente o cualitativamente las proteínas LDLR en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan las proteínas LDLR de la presente invención. Esto puede lograrse mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo fluorescentemente marcado (véase más adelante) acoplado con detección por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, o fluorometría. Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden emplearse histológicamente, como en inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica, para detección in situ de las proteínas LDLR de la presente invención. La detección in situ puede lograrse mediante la remoción de un espécimen histológico de un paciente, y proveyendo el anticuerpo marcado de la presente invención a dicho espécimen. El anticuerpo (o fragmentos) preferiblemente se provee mediante la aplicación o mediante la sobreposición del anticuerpo marcado (o fragmentos) a una muestra biológica. A través del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de las proteínas LDLR sino también su distribución sobre el tejido examinado. Utilizando la presente invención, los expertos en la técnica percibirán fácilmente que cualesquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) pueden ser modificados con el objeto de lograr dicha detección in situ. Dichas pruebas para las proteínas LDLR de la presente invención típicamente comprenden la incubación de una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recientemente cosechadas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo de tejidos, en la presencia de anticuerpo marcado capaz de identificar las proteínas LDLR, y detectando el anticuerpo mediante cualesquiera de varias técnicas bien conocidas en la materia. La muestra biológica puede ser acoplada a un soporte de fase sólida o vehículo tal como nitrocelulosa, o a otras soporte sólido o vehículo que sea capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte o vehículo puede lavarse después con reguladores de pH adecuados, seguido de tratamiento con un anticuerpo marcado de conformidad con la presente invención, como se mencionó anteriormente. El soporte de fase sólida o vehículo puede lavarse después con el regulador de pH por segunda vez para remover el anticuerpo no unido. La cantidad de marca unida sobre dicho soporte sólido o vehículo puede detectarse luego mediante métodos convencionales. Por "soporte de fase sólida", "vehículo de fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo" se entiende cualquier soporte o vehículo capaz de unir antígeno o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos, incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrán, amilasas de nylon, celulosas naturales y modificadas, poliacrílamida, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser ya sea soluble hasta cierto grado o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible siempre y cuando la molécula acoplada sea capaz de unirse al antígeno o anticuerpo. Por lo tanto, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en un glóbulo, cilindrica, como en la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de un rodillo. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una lámina, tira de prueba, etcétera. Los soportes o vehículos preferidos incluyen glóbulos de poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros vehículos adecuados para la unión del anticuerpo o antígeno, o serán capaces de averiguar esto mediante el uso de experimentación de rutina. La actividad de unión de un grupo dado de anticuerpos de la invención, como se mencionó anteriormente, puede determinarse de conformidad con los métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones operativas y óptimas de prueba para cada determinación mediante el empleo de experimentación de rutina. Se pueden añadir otros pasos tales como lavado, agitación, sacudimiento, filtrado y similares a las pruebas según sea habitual o necesario para la situación particular. Uno de los modos en los cuales un anticuerpo de conformidad con la presente invención puede ser marcado es mediante la unión del mismo a una enzima y utilizándolo en un inmunoensayo enzimático (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando se expone posteriormente á un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de manera que produce una porción química que puede detectarse, por ejemplo, mediante espectrofotometría, fluorometría o mediante métodos visuales. Las enzimas que pueden ser utilizadas para marcar de manera detectable al anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenase, nucleasa estafilocócica, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenase, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa- 6- fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolin-estearasa. La detección puede lograrse mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también puede lograrse mediante comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar. La detección puede lograrse utilizando cualesquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante marcado radiactivo de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, es posible detectar R-PTPasa a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA). Una buena descripción de RIA puede encontrarse en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, por Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) con referencia particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" por Chard, incorporado por referencia en la presente descripción. El isótopo radiactivo puede ser detectado mediante cualesquiera métodos como el uso de un contador g o un contador de escintilación o mediante autorradiografía. También es posible marcar un anticuerpo de conformidad con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo fluorescentemente marcado se expone la luz de una longitud de onda adecuada, su presencia puede detectarse entonces debido a la fluorescencia. Entre los compuestos para marcado fluorescente más comúnmente utilizados está el isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, picocian, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo también puede marcarse de manera detectable utilizando metales que emiten fluorescencia tales como 152E, u otros de la serie de lantanidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo utilizando dichos grupos quelantes de metales como ácido dietilentríaminopentaacético (ETPA). El anticuerpo también puede marcarse de manera detectable mediante el acoplamiento de éste a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con quimioluminiscente se detecta entonces mediante la detección de la presencia de la luminiscencia que se genera durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcados con quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. De manera similar, un compuesto bioluminiscente puede ser utilizado para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioiuminiscencia que se encuentra en los sistemas biológicos en los que una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina mediante la detección de la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos de marcado son luciferina, lucíferasa y aecuorina. Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede adaptarse para utilización en una prueba inmunométrica, también conocida como prueba "de dos sitios" o "intercalada". En una prueba inmunométrica típica, una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) se une a un soporte sólido o vehículo y una cantidad de anticuerpo soluble detectablemente marcado se añade para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, antígeno, y anticuerpo marcado. Las pruebas inmunométricas típicas, y preferidas, incluyen pruebas "directas" en las cuales el anticuerpo unido a la fase sólida se pone en contacto inicialmente con la muestra a ser probada para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo binario anticuerpo-antígeno en fase sólida. Después de un período de incubación adecuado, el soporte sólido o vehículo se lava para remover el residuo de la muestra de fluido, incluyendo el antígeno que no reaccionó, si hay alguno, y luego se pone en contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (el cual funciona como una "molécula reportera"). Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado se forme en un complejo con el antígeno unido al soporte sólido o vehículo a través del anticuerpo no marcado, el soporte sólido o vehículo se lava una segunda vez para remover el anticuerpo marcado que no reaccionó. En otro tipo de prueba "intercalada", el cual también puede ser útil con los antígenos de la presente invención, se utilizan las pruebas denominadas "simultáneas" y "reversas". Una prueba simultánea implica un único paso de incubación conforme el anticuerpo unido al soporte sólido o vehículo y anticuerpo marcado se añaden ambos a la muestra a ser probada al mismo tiempo. Después de que la incubación se ha terminado, el soporte sólido o vehículo se lava para remover el residuo de muestra de fluido y el anticuerpo marcado que no ha formado complejos. La presencia del anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido o vehículo se determina luego, como podría ser en una prueba intercalada "directa".convencional. En la prueba "reversa", se utilizan la adición paso a paso primero de una solución de anticuerpo marcado a la muestra de fluido seguida por la adición de anticuerpo no marcado unido a un soporte sólido o vehículo después de un período de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de manera convencional para liberar el residuo de la muestra a ser probada y la solución de anticuerpo marcado que no ha reaccionado. La determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte sólido o vehículo se determina luego como en las pruebas "simultáneas" y "directas". La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de r-hsLDLR de CHO Células de CHO estables recombinantes que expresan LDLR soluble humano se generaron mediante la co-transfección de células CHO-DUKX que carecen del gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub, G. et al., 1980) con dos vectores de expresión: psLDLROI que contiene el dominio N-termina! de unión al ligando del LDLR, iniciando en el residuo de aminoácido Asp (+4) hasta Glu 291 (+ 291), y pDHFR, que contiene el gen de murino para DHFR, ambos controlados por el promotor y elementos de terminación de la transcripción de la región temprana de SV40. La transfección se llevó a cabo mediante liposomas catíónicos utilizando LipofectAmina (Gibco BRL), de conformidad con el protocolo descrito por el fabricante. Setenta y dos horas después las células transfectadas se transfirieron a un medio de selección que carece de desoxi y ríbonucleósidos y complementado con 10% de FCS dializado. Las células que expresan actividad r-hsLDLR (forma + 291) se produjeron con células de un clon estable de CHO productor designado #33-10-29-21 , en un biorreactor CelliGan de 5 litros en medio libre de suero (Gibco CHO-A-SE No. de catálogo 95-0091 DJ). El cosechado sin purificar se clarificó mediante filtración a través de un filtro de cartucho de 0.8-0.2 µ (Gelman No. de catálogo CSS92DSCCK) y se concentró 100 veces sobre una membrana de 5 kDa. La forma +291 del r-hsLDLR utilizada para las primeras inmunizaciones, se purificó utilizando un procedimiento de purificación a pequeña escala. En este procedimiento, se usó una columna de intercambio catiónico de DEAE-Sepharose, continuado por un paso de interacción hidrófoba en una columna de Butil-TSK seguido por una columna HTP y un paso de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) en una columna de Sephacryl 00. La fracción #27 de la SEC, se eligió, puesto que ésta contenía una actividad específica antiviral de 780 unidades/ng detectada en la prueba antiviral descrita en el ejemplo 9 a continuación. La proteína en esta fracción se identificó como un r-hsLDLR mediante análisis N-terminal. Un segundo lote, de r-hsLDLR de CHO +291 se purificó y se utilizó para inyecciones de refuerzo a los ratones. Este se purificó utilizando un procedimiento refinado que tiene un rendimiento mejorado que incluyó los siguientes pasos: a) clarificación y concentración x100 de la cosecha sin purificar; b) una columna de intercambio aniónico HQ POROS, y c) dos pasos de interacción hidrófobas (HIC): captura sobre una columna de Butil-TSK y flujo a través de una columna de Fenil 5PW. La fracción no unida a partir del último paso HIC se dializó y se purificó en una columna de intercambio catiónico HS-POROS. El último paso fue una columna de hidroxiapatita (HTP). El r-hsLDLR así obtenido se purificó a aproximadamente 90%, eluyendo como un pico principal único en RP-HPLC.

EJEMPLO 2 Inmunización de ratones 0 µ9 de r-hsLDLR purificado de la fracción #27 de la columna SEC del ejemplo 1 anteriormente mencionado, a una concentración de 100 µ9/???, se homogeneizaron con Adyuvante Completo de Freund (CFA, 30% v/v) y se inyectaron dentro de la almohadilla de la pata de cada uno de los cinco ratones hembras Balb/C de 7 semanas de edad. Cuatro semanas después de la primera inmunización, los ratones se reforzaron, intramuscularmente con 10 µg de la misma fracción de r-hsLDLR purificado, en una solución al 50% (v/v) de CFA. Dos semanas después de la segunda dirección el suero de los ratones se evaluó para anticuerpos a r-hsLDLR, utilizando la prueba de ELISA directa descrita en el ejemplo 3 a continuación. Los dos ratones -1 y M-2, con la ¡nmunoreactividad específica más significativa a r-hsLDLR se reforzaron adicionalmente, 10 semanas después de la segunda inyección, con 10 µ9 del r-hsLDLR purificado obtenido en el procedimiento de purificación refinada descrita en el ejemplo 1 anteriormente mencionado. Los ratones fueron sangrados 14 semanas después y se evaluaron para anticuerpos para r-hsLDLR. A éstos se les dieron dos refuerzos adicionales de 50 ? de r-hsLDLR en PBS: el primero por vfa intraperitoneai y el segundo, dos días después, tanto por vía intraperitoneal como por vía intravenosa. A los ratones se les extrajo sangre dos semanas después de la segunda inyección y el antisuero se evaluó para actividad anti-r-hsLDLR mediante el ELISA directo del ejemplo 3 siguiente. Cada antisuero se diluyó en serie 1 :100-1 :32,000 y se aplicó en duplicados a placas de 96 pozos cubiertas con 10 U/pozo de r-hsLDLR purificado utilizando el procedimiento de purificación refinada descrito en el ejemplo 1 anteriormente mencionado. El regulador de pH para prueba y DMEM + 10% de HS que contenía PBS + 1 % de BSA o Gelatina + 0.05% de Tween 20 + 0.05% de Timerosal se utilizaron como blancos en el primer pozo de cada hilera. El suero de ratón normal (NMS) se aplicó en el mismo intervalo de dilución en las últimas dos líneas como controles negativos. La absorbencia de la reacción enzimática se midió con un lector de ELISA a 492 y 405 nm. Los resultados de esta prueba indicaron que el suero del ratón -1 tuvo una mayor inmunoreactividad específica con r-hsLDLR y por lo tanto fue sacrificado y las células del bazo se recolectaron para fusionarse con células de mieloma (Eshhar Z, 1985).

EJEMPLO 3 ELISA directo para prueba de antisuero y selección de clones de hibridoma La prueba de ELISA directa para selección de antisuero positivo se llevó a cabo como se describe a continuación: placas de 96 pozos se cubrieron con 100 µ? de r-hsLDLR (purificado mediante el procedimiento de purificación refinada del ejemplo 1 ) 100 unidades/ml (10 U/pozo) en PBS + 1% de Gelatina (Sigma, No. de catálogo G-7765) +0.9 mM Ca2+ y 0.5 mM g2+, pH 5.6, de aquí en adelante referido como regulador de pH para prueba, durante 90 minutos a 37°C con agitación. Las placas se lavaron seis veces en PBS + 0.05% de Tween 20 (Monolaurato de polioxietilen-sorbitano - Sigma P-1379), en adelante referido como solución de lavado. Las muestras de antisuero a partir de ratones inmunizados en serié diluidas 1 :100-1 :32,000 o el sobrenadante a partir de cultivos de células de hibridoma se añadieron a los pozos y se incubaron durante 90 minutos a 37°C, mientras se agitaba, seguido por seis lavados en solución de lavado. 100 µ? de anticuerpo de cada conjugado con APA-peroxidasa de rábano (HRP) a Fab de ratones (Sigma-No. de catálogo 4601-1 ) diluido 1 :1 ,200 se añadieron a los pozos y se incubaron por 90 minutos a 37°C, mientras se agitaba, y luego se lavaron seis veces con solución de lavado. 100 µ? de solución del sustrato (preparado mediante la disolución de una tableta de OPD y una tableta de H2O2 en 20 mi de agua) se añadieron a los pozos y se incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 100 µ? ???? de HCI 4N. La absorbancia en las placas de 96 pozos se leyó utilizando un lector de ELISA a 492 y 405 nm y los resultados se calcularon utilizando los cuatro algoritmos logísticos paramétrícos, mediante el software MultiCalc de la computadora personal conectada al lector de ELISA.

EJEMPLO 4 Fusión, preparación de hibrídoma. selección de clones v purificación de anticuerpos a partir de fluidos de ascitis El procedimiento de fusión y la selección de células de hibrídoma se llevaron a cabo de conformidad con los protocolos descritos en Eshhar Z., 1985. En breve, las células del bazo del ratón M-1 , reforzado 2-4 días después de la fusión, se fusionaron con células de mieloma mediante una corta incubación con PEG. El PEG se diluyó lentamente primero con DMEM y luego se removió completamente mediante centrifugación. Las células se re-suspendieron en medio DMEM-HAT, se distribuyeron en placas de 96 pozos a una concentración aproximadamente 3.4 x 104 células/pozo y se incubaron durante 10-14 días en una incubadora con CO2 al 8% a 37°C. El medio en todos los pozos de hibrídoma se cambió a DMEM complementado con 10% de Suero de Caballo (HS) durante 10 días. Las muestras de sobrenadante de cultivo de hibrídoma se seleccionaron para la presencia de Mab a r-hsLDLR mediante la prueba de ELISA directa descrita en el ejemplo 3 anteriormente mencionado. El regulador de pH para prueba y D EM + 10% de HS se utilizaron como blancos, ab C7 (comercialmente disponible a partir de Amersham) y el antisuero de la ratona M-1 se utilizaron como controles positivos, mientras que un anticuerpo monoclonal al receptor soluble p55 TNF se utilizó como un control negativo. Las células de los pozos, en los cuales la presencia de anticuerpos se detectó en el sobrenadante de cultivo, se transfirieron a placas de 24 pozos y luego a botellas T de 25 cm2. Los cultivos expandidos se monitorearon para secreción de Mabs a r-hsLDLR. Ampolletas de células a partir de los cultivos positivos se congelaron y almacenaron en nitrógeno líquido. Un total de aproximadamente 1000 cultivos se seleccionaron para detectar anticuerpos a r-hsLDLR. 54 cultivos con la mayor inmuno-actividad se probaron de nuevo varias veces. Cinco cultivos (12, 28, 29, 30 y 50) con la mayor actividad se clonaron mediante dilución limitante en placas de 96 pozos. Los sobrenadantes de los clones en crecimiento se probaron varias veces para anticuerpos a r-hsLDLR mediante el ELISA directo. Las células de clones de hibridoma positivos se crecieron en botellas de cultivo de tejidos en DMEM que contenía 15% de suero de caballo y las ampolletas se congelaron a partir de una parte de los cultivos. En paralelo, las células de diferentes clones de hibridoma se inyectaron, a 2-4 ratones cada uno, para obtener fluidos de ascitis. Los anticuerpos se purificaron a partir de fluido de ascitis ya sea mediante precipitación en sulfato de amonio o en una columna de proteína G. Brevemente 7.5 mi de fluido de ascitis se diluyeron a 1 :3 en 20 mM de regulador de pH de fosfato pH 7 y se cargaron sobre una columna de 5 mi de proteína G (C10/10). La columna se lavó con regulador de pH de fosfato 20 mM pH 7 y los Mabs se eluyeron con regulador de pH de Glicina 00 mM pH 2.7. El pH de la fracción de elución se ajustó a 7-7.5 con regulador de pH de Tris 1 pH 9.3.

EJEMPLO 5: Selección para pares de Mabs a ser utilizados en ELISA y optimización de los parámetros de la prueba de ELISA Los Mabs purificados a partir de fluidos de ascitis como en el ejemplo 4 anteriormente mencionado se utilizaron para llevar a cabo una serie de experimentos en un formato de matriz para seleccionar el par de Mabs más adecuado para ser utilizado como anticuerpos primario y secundario en la prueba de ELISA intercalada para r-hsLDLR descrito en el ejemplo 6 a continuación. Brevemente, placas de 96 pozos se cubrieron con fluidos de ascitis derivados a partir de cinco hibridomas (# 12, 23.28, 29.08, 30 y 50.05) purificados ya sea mediante precipitación en sulfato de amonio o sobre una columna de proteína T. Los anticuerpos se seleccionaron utilizando la forma + 291 así como las formas + 292 (a partir del residuo de aminoácido Asp +4 a Cys + 292) y + 331 (a partir del residuo de aminoácido Asp +4 a Cys + 331 ) de r-hsLDLR producido en células CHO, como antígenos. Un mi de cada uno de los Mabs parcialmente purificados anteriores se marcó con biotina para una selección rápida de su adecuación como anticuerpos secundarios en una prueba de ELISA intercalada. Brevemente 1.5 mg de Mabs purificados mediante precipitación con sulfato de amonio se ajustaron a pH 8.5 con 30 µ? de NaHC03 0.5 M. 0.75 mg de Biotin-OSu N-Hidroxisuccinimido-Biotina (Blotin-Osu, Sigma, No. de catálogo H 1759, a partir de una solución de 5 mg en 200 µ? de DMSO) se añadieron a la solución del anticuerpo y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave, seguido por incubación durante la noche a 2-8°C. La solución de reacción se cargó sobre una columna de Sephadex G-25M (Pharmacia No. de catálogo 17-0851-01 ) PD10 para separar entre los Mab biotinilados y el exceso de Biotin-OSu que no había reaccionado. Los primeros experimentos preliminares indicaron que los Mabs 29.08 y 30 produjeron la mayor señal por arriba del fondo, cuando se utilizaron como anticuerpos secundarios en el ELISA. La reacción de los dos clones se evaluó de nuevo como segundos anticuerpos con los anticuerpos 12, 28, 29.08 y 50 utilizados para revestimiento de placas. Los resultados de este experimento claramente demostraron que el Mab 28 fue el anticuerpo más adecuado para revestimiento. Los mejores resultados, en términos de intensidad de señal y especificidad, se obtuvieron con el Mab 28 utilizado para revestir la placa de microtitulación, y el Mab 29.08, marcado con biotina, como un anticuerpo secundario. Utilizando estos Mabs se obtuvieron buenos resultados con todas las tres formas (+ 291 , + 292 y + 331) del r-hsLDLR. Con todas las formas, la absorbancia a 492/405 nm fue de aproximadamente 1.3 D.O. Las tres formas del antígeno r-hsLDLR se analizaron en diluciones seriales en un intervalo de concentración de 0.9 - 1000 ng/ml. Se obtuvo una curva dosis respuesta con Mab 28 utilizado para revestir y Mab 29.08 biotinilado como un anticuerpo secundario. Esta combinación dio una respuesta lineal a un intervalo de concentración de 1-10 ng/ml de r-hsLDLR. Los distintos parámetros que pueden afectar la prueba de ELISA tales como la concentración de los reactivos, períodos de incubación, selección del regulador de pH y placas se optimizaron probando los siguientes parámetros: ? Revestimiento de pozos de placas de microtitulación con 5-10 µg/ml de Mab 28 en PBS. ? Composición del regulador de pH: a) PBS + Tween 20 b) Tris + Ca2+ + NaCI + Tween 20 ? Soluciones de bloqueo: a) 1% de Gelatina en PBS, 0.05% de Tween, 0.005% de Timerosal b) 1 % de BSA en PBS, 0.05% de Tween, 0.005% de Timerosal c) 1% de FBS en PBS, 0.05% de Tween, 0.005% de Timerosal d) 1 % de leche en PBS, 0.05% de Tween, 0.005% de Timerosal e) I Bloque, Hy Pep y Hy de levadura. ? El Mab secundario 29.08, marcado con biotina, a concentraciones de 1 :500, 1 :1000, 1 :2000, 1 :4000, 1 :8000, 1 :10,000 equivalente a un intervalo de concentración de 10.74 - 0.537 µ9/p??. ? Concentraciones de extravidina: 1:500, 1:1000, 1 :2000, 1 :4000, 1:8000, 1:10,000 equivalente a un intervalo de concentración de 4-02 µ?/Gt??. Con base en éstos experimentos se estableció el procedimiento final para la prueba de ELISA intercalado descrito en el ejemplo 6 a continuación.

EJEMPLO 6 Establecimiento de una prueba de ELISA intercalada para r-hsLDLR Una prueba de ELISA intercalada para el r-hsLDLR se estableció utilizando Mabs 28 y 29.08. Brevemente placas de 96 pozos se revistieron con 100 µ? de un Mab 28 purificado mediante proteína G (5 µ?/?t??) durante la noche a 2-8°C o 3 horas a 37X. Las placas se lavaron luego cinco veces con PBS + 0.05% de Tween 20. Las placas se incubaron con 200 µ? de solución de bloqueo (PBS + 1% de BSA o Gelatina + 0.05% de Tween 20 + Timerosal 0.05% durante una hora a 37°C o durante la noche a 4°C y se lavaron cinco veces con PBS + 0.05% de Tween 20, 100 µ? de muestras o de antígeno para curva de calibración (r-hsLDLR de CHO + 291, 0.5-32 ng/ml diluido en solución de bloqueo), se añadieron a los pozos y se incubaron por 90 minutos a 37°C, con agitación. Las placas se lavaron luego 5 veces con PBS + 0.05% de Tween 20. 100 µ?/???? de Mab 29.08 biotinilado (0.67 µg ml) en solución de bloqueo se añadieron, y se incubaron con agitación por una hora a 37°C. Las placas se lavaron cinco veces con PBS + 0.05% de Tween 20. 100 µ? de un conjugado comercial de extravidina-peroxidasa, (ExtrAvidin TM-Peroxidase BioMakor, No. de catálogo 0645-1 ) diluido 1 : 10,000 se añadieron a los pozos y se incubaron con agitación durante una hora a 37°C. Las placas se lavaron después cinco veces con PBS + 0.05% de Tween 20. 125 µ? de la solución del sustrato anteriormente mencionada se añadieron a cada pozo y se incubaron durante aproximadamente 10 minutos hasta que el color se desarrolló hasta la intensidad deseada. La reacción se detuvo mediante la adición de 125 µ? de HCI 4N. La absorbancia en las placas de 96 pozos se leyó utilizando un lector de ELISA a longitudes de onda de 492 y 405 nm y los resultados se calcularon mediante el software MultiCalc de la computadora PC conectada al lector de ELISA.

EJEMPLO 7 Isotipo de anticuerpos monoclonales El isotipo de anticuerpos Ig monoclonales se determinó utilizando un equipo comercial para isotipificación (PharMingen International) de conformidad con el procedimiento prueba del fabricante. Los clones 12.6, 28, 29.8 y 30 se identificaron como Igd mientras que el clon 50.30 se encontró que era de la clase IgM.

EJEMPLO 8 Análisis de Western blot en PAGE-SDS La forma + 291 del r-hsLDLR y la forma nativa LDLR purificada de orina humana se analizaron mediante análisis de Western blot con los anticuerpos monoclonales desarrollados al r-hsLDLR. Brevemente, un gel de poliacrilamida-SDS al 12% se cargó con 100 ng/línea de la forma + 291 de CHO del r-hsLDLR, o hsLDLR nativo de orina o TBP-1 de cosecha sin purificar (como control negativo) bajo condiciones reductoras (DTT 40 mM). Una línea se cargó con Marcadores de Bajo Peso Molecular (BPM). Esta serie de muestras se corrió cinco veces. Las proteínas separadas en ios geles se transfirieron mediante electroelución a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en PBS que contenía 10% de leche descremada, 0.1% de Tween 20, por 16 horas. Las membranas de cortaron en tiras y cada tira se incubó por dos horas a temperatura ambiente con uno de los cinco Mabs seleccionados: 12.6, 30, 50.30, 28 o 29.08 (fluido de ascitis diluido 1 : 4000). Las tiras de membranas se lavaron con PBS que contenía 0.1 % de Tween 20 (3 x 15 minutos) y se incubaron durante una hora con el anticuerpo secundario-cabra anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina-peroxidasa de rábano (diluido 1 : 10,000, BioMakor) por dos horas a temperatura ambiente. Las tiras se lavaron con PBS que contenía 0.1 % de Tween 20 (3 x 15 minutos). Las bandas positivas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL, Amersham). Los anticuerpos monoclonales #12.6 y #29.8 reconocieron tanto el r-hsLDLR purificado de orina así como la forma + 291 en el análisis de Western blot (figura 2). Los Mabs 28 y 30 reconocieron la forma + 291 del r-hsLDLR purificado.

EJEMPLO 9 Inhibición de la actividad antiviral de r-hsLDLR mediante anticuerpos monoclonales Los Mabs que reaccionan específicamente con r-hsLDLR se probaron por su capacidad para bloquear la actividad antiviral de r-hsLDLR (forma + 291 ) in vitro, utilizando una prueba de inhibición de efecto citopático (CPE) en un sistema VSV/WISH. Las células WISH (de origen de amnios humano) se cultivaron en MEM complementado con 10% de FBS y glutamina 4 mM en una incubadora con 5% de CO2 a 37°C. Las células en crecimiento exponencial se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos, a una densidad de 40,000 células/pozo por 24 horas antes del inicio de la prueba. Las muestras a ser evaluadas y los estándares se diluyeron y se dispensaron dentro de los pozos que contenían células. VSV se añadió inmediatamente a los pozos, a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.5 pfu/células. Las placas se incubaron 16-18 horas a 37°C y luego se lavaron con etanol. La monocapa de células supervivientes se observó mediante tinción Gram Cristal Violeta. La cuantificación del efecto citopático con relación al estándar se llevó a cabo mediante graficación de la densidad del color contra la concentración del estándar. Para analizar el efecto neutralizante de los anticuerpos, r-hsLDLR se pre-incubó durante 30 minutos a 37°C, con concentraciones en incremento de fluido de ascitis del Mab probado. Estas soluciones se añadieron luego a los cultivos de células WISH en placas de microtitulación de 96 pozos, seguido por la adición de virus de estomatitis vesicular (VSV). Después de incubación durante 18 horas, la lisis celular mediada por VSV se determinó mediante tinción de las células remanentes con cristal violeta. La semi-cuantifícación del efecto citopático relativo al estándar se llevó a cabo mediante graficación de la intensidad del color (determinado mediante un lector de ELISA) contra la concentración estándar. El efecto de los Mabs se evaluó con concentraciones en incremento de r-hsLDLR. Como se muestra en el cuadro 1 , se encontró que dos Mabs (12.6 y 50.30) presentan actividad neutralizante. En el experimento mostrado en el cuadro 1 , el efecto inhibidor de los dos Mabs se evaluó a una dilución de 1 :40 de los fluidos de ascitis. A esta dilución, el Mab 12.6 presentó actividad de alguna forma superior a la de Mab 50.30. Esto puede resultar a partir de las propiedades de los Mabs, así como a partir de diferencias en su concentración en el fluido de ascitis. El efecto inhibidor de los Mabs pudo superarse al incrementar r-hsLDLR con relación a la concentración de los Mabs. De hecho, a las concentraciones de r-hsLDLR de 6.25 U/ml ningún Mab tiene ningún alguno sobre la actividad r-hsLDLR en la concentración analizada de anticuerpos.

CUADRO 1 Inhibición de la actividad antiviral de r-hsl_DLR por clones 12.6 y 50.30 ( ) Inhibición de la actividad antiviral de r-hsLDLR contra lisis celular de células WISH mediada por VSV. El efecto inhibidor de los Mabs se determinó a una dilución de 1 :40 de fluido de ascitis. El número de células viables está representado en el cuadro en valores de D.O. Los números entre corchetes representan una repetición llevada a cabo a las concentraciones de 0 y 12.5 U/ml de LDLR. La inhibición de la actividad antiviral de r-hsLDLR se determinó utilizando concentraciones en incremento de los Mabs 12.6 y 50.30. El Mab 12.6 inhibió la actividad antiviral de r-hsLDLR, por -50% a una dilución de 1 :40 (de fluido de ascitis) y por -35% a una dilución de 1 : 20, 500. El clon 50.30 inhibió la actividad de r-hsLDLR por -45% a la dilución de 1 :40 y por -15% a la dilución de 1 :20, 500. La curva de dosis-respuesta, obtenida con ambos Mabs, y la observación de sus efectos inhibidores se deterioró por el exceso de r-hsLDLR, lo que sugiere que los Mabs ejercen sus efectos mediante la unión a r-hsLDLR.

EJEMPLO 10 Inhibición de la replicación de HCV por anticuerpos monoclonales Los Mabs específicos para r-hsLDLR se probaron por su capacidad para inhibir la replicación de HCV en cultivos primarios de hepatocitos humanos. El cultivo de células FT167 se deriva de un paciente varón de 57 años de edad que requería resección por lobectomía para propósitos médicos (metástasis de un tumor de colon, lóbulo derecho). Los cultivos primarios de hepatocitos humanos se prepararon mediante el método de perfusión con colagenasa en dos pasos (Maurel P. Adv. Drug Del. Rev. 22. 103-132 (1996), Pichard L. et al. Mol. Pharmacol. 41 : 1047-1055 (1992), Ferrini JB. et al., Chem-Biol. Interactions 107: 31-45 (1997)). La viabilidad de las células antes de sembrarlas se determinó utilizando la prueba de exclusión de azul de trípano. Cuatro millones de células en 3 mi de medio de cultivo se sembraron en cajas de plástico de 60 mm pre-revestidas con colágeno. El medio de cultivo libre de suero a largo plazo consistió de Williams' E, complementado como se publicó (Lanford R. et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 25: 174-182 (1989)). Este medio se renovó subsecuentemente cada 48 horas. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en una atmósfera de aire húmedo y 5% de dióxido de carbono. Bajo estas condiciones de cultivo, los hepatocitos humanos retienen su fenotipo diferenciado al menos durante 35 días (Ferrini JB. et al., Chem-Biol Interactions 107: 31-45 (1997)) y son sensibles a infección por HCV y permisivos para la replicación del genoma viral (Foumier C. et al., J. Gen. Viral. 79: 2367-2374 (1998)). Muestra de suero positiva a HCV: se ha establecido un banco de suero humano a partir de pacientes probados positivos al anticuerpo anti-HCV por el EIA HCV 3.0 y Chiron RIBA HCV 3.0 SIA. Ninguno de estos pacientes fue co-infectado con HBV o VIH. En cada muestra de suero se cuantifico el ARN de HCV por el monitor Roche y se genotipificó mediante una prueba de sonda en línea (Inno-üpa HCV II, Innogenetics). Las muestras de suero se almacenaron a -80°C, en pequeñas alícuotas con el fin de evitar ciclos de congelamiento-descongelamiento. En estos experimentos se utilizó la muestra S42 (genotipo 1 ; carga viral: 410,000 copias/ml). Para la infección y tratamientos subsecuentes, los cultivos hepáticos se transfirieron bajo condiciones estériles a un laboratorio P3 (alto confinamiento para microorganismos infecciosos para humanos). Tres días después de sembradas, cuando las células se habían recuperado del traumatismo de aislamiento, la infección in vitro de los hepatocitos se llevó a cabo mediante una incubación durante la noche con 25 µ? de muestra de suero positiva a HCV (S42). En 3 mi de medio, después de la infección, las células se lavaron tres veces con 3 mi de medio fresco y el cultivo se continuó bajo condiciones normales en medio de cultivo a largo plazo. Las células se trataron con tres diferentes Mabs contra r-hsLDLR, Mab 12.6, Mab 28 y Mab 29.8. Treinta minutos antes de la infección, las células se expusieron a 2 u 8 µg/m\ de los diferentes Mabs. Luego las células se infectaron como se describió anteriormente. Los cultivos control se infectaron bajo condiciones similares pero en la ausencia de tratamiento antiviral. En experimentos paralelos, los mismos cultivos se trataron con 5000 U/ml de IFNa, bajo condiciones similares para comparación (IFNa inhibe fuertemente la replicación de HCV en las células de referencia). Todos los tratamientos se llevaron a cabo por duplicado. Al día 5 post-infección, el medio se removió y los cultivos se lavaron tres veces con solución salina en frío regulada en su pH con fosfato. El ARN se purificó a partir de 4 x 106 hepatocitos utilizando un procedimiento de extracción con isotiocianato de guanidina-fenol ácido (Chomczynski PN, y Sacchi N. Analyt. Biochem. 162: 156-159 (1987)). El ARN precipitado se disolvió en 50 µ?_ de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) y se cuantificó. Un µg de ADN celular se analizó en la prueba de RT-PCR Tthr específica de cadena. Para evitar la posible contaminación, la prueba de RT-PCR específica de cadena se llevó a cabo secuencialmente utilizando tres cuartos diferentes: un cuarto pre-PCR, un cuarto de PCR y un cuarto post-PCR. El ARN disuelto en 10 µ? de agua tratada con DEPC se cubrió con aceite mineral y se calentó a 95X por 1 minuto. La temperatura s e disminuyó a 70°C y se añadieron 10 µ? de mezcla de reacción recalentada de ADNc. La temperatura se disminuyó entonces a 60°C durante 2 minutos para fijación y la reacción del ADNc se llevó a cabo durante 20 minutos a 70°C utilizando la ADN polimerasa Tthr (Perkin-Elmer). La temperatura se mantuvo a 70°C mientras que se añadían 40 µ? de regulador de pH precalentado que contenía EGTA como quelante de Mn2+ para suprimir la actividad de RT Tthr. Los tubos de reacción se mantuvieron a 70eC mientras se añadían 40 µ? de mezcla de PCR precalentada. Las condiciones del PCR, llevadas a cabo en un sistema Gene Amp ® PCR a-System 9600 (Perkin-Elmer), consistieron en un ciclo inicial a 94°C durante 1 minuto, 50 ciclos a 94°C durante 15 segundos, 58°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos y un paso final de extensión a 72°C durante 7 minutos. Para la prueba de ARN de HCV para cadena positiva, la secuencia nucleotídica del iniciador reverso P3 es: 5'-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTG-3' (nucleótidos 342-320) y el del iniciador directo P4 es: 5'CACTCCCCTGTGAGGAACT-3' (nucleótidos 38-56), (Laskus T. et al., J. Gen. Viral. 78: 2747-2750 (1997)). Los mismos iniciadores se utilizaron en el orden reverso para detectar la cadena negativa. Un décimo del producto amplificado se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa (2%), seguido por coloración con BET y fotografía bajo luz UV. En todas las series de experimentos, se realizaron las diluciones de ARN sintético de HCV de las cadenas (+) y (-) y se añadió 1 µg de ARN total de hígado para imitar las condiciones para análisis de hepatocitos cultivados. Estas mezclas se utilizaron como controles positivos para prueba y análisis de RT-PCR. La figura 3 muestra que la producción de la cadena negativa de HCV, en presencia de los Mabs contra LDLr, se inhibió completamente en cultivo de FT167. Por lo tanto, se inhibió fuertemente la replicación del genoma viral. Los resultados fueron consistentes con la consideración de que el LDLR puede ser un receptor para HCV.

EJEMPLO 11 Producción de anticuerpos quiméricos a LDLR El ARNm se purificó a partir de una línea de hibridoma que produce Mab específico para LDLR. El ADNc específico se sintetizó con oligonucleótidos complementarios al extremo 5' de exón CH1 a partir del dominio variable de la cadena pesada (oligo ) y la partir del extremo 5' del exón Ckh del dominio variable de la cadena ligera (oligo 2) utilizando el ARNm purificado como ei molde. Se obtuvieron dos ADNc, uno de los cuales codifica la región variable (específica para LDLR) de la cadena pesada, y el otro la región variable (específica para el LDLR) de la cadena ligera. Los ADNc se clonaron y secuenciaron. Para la construcción de la cadena quimérica pesada, la región variable de un gen clonado de cadena pesada de Ig humana, y la otra región variable se intercambiaron (utilizando manipulaciones genéticas) para el ADN clonado que codifica el dominio variable del ratón (específico para LDLR) de la cadena pesada. Las manipulaciones genéticas incluyeron la excisión de la región variable a partir de la Ig humana, utilizando enzimas de restricción específicas y ligación de la región variable del ratón. El mismo procedimiento se llevó a cabo para obtener la cadena quimérica ligera. Se construyeron dos plásmidos de expresión para mamíferos, uno que incluía el gen quimérico de la cadena pesada y el otro que incluía el gen quimérico de la cadena ligera. Ambos vectores se utilizaron para co-transfectar la línea celular de hibridoma (SP6). La producción de la Ig específica para LDLR se probó mediante ELISA o Western blot utilizando caldos de cultivo de células transfectadas como anticuerpo secundario. La afinidad del anticuerpo quimérico a su ligando se monitoreó mediante Biacore.

EJEMPLO 12 Preparación de ratones transaénicos que están diseñados para que contengan loci del gen de inmunoglobulina humana (xeno-ratones) y preparación de Mab humano contra LDLRh La preparación de xeno-ratones se describe en WO 98/248913 y Méndez M.J. et al. Nature genetics 15: 146-56 (1997). Las genotecas humanas de cromosoma artificial de levadura (YAC) se seleccionaron para YAC que contienen la región variable de la cadena pesada humana (aproximadamente 1000 kb) (el método de clonación por YAC es el método de elección cuando se requieren tamaños de insertos mayores de 100 kb). Los YAC se caracterizan por análisis de Southern blot y mediante Electroforesis de Pulso en Campo (PFGE). Los YAC deben incluir las regiones ?µ C5, Dh y Vh en la configuración de la línea germinal. A través de la utilización de las secuencias sobrepuestas contenidas en los YAC, los YAC se recombinan en levadura mediante estrategia de recombinación paso a paso. Antes de la recombinación del extremo 3' de YAC (con la región V) se ligó al marcador de selección HPRT. La estructura del YAC recombinado se confirmó mediante PFGE y análisis de Southern blot (presencia del locus de la cadena pesada humana a partir de la región C a la región Vh en la configuración de línea germinal). El brazo acéntrico de YAC se marcó con un vector que contiene la región constante ?2 completa, potenciador de ratón, gen de resistencia a neomicina, para producir la cadena pesada final que contiene la región variable completa, es decir 82 genes Vh, 6 genes Jh y 3 diferentes regiones constantes ?µ C5 Cy con sus correspondientes secuencias reguladoras. Este YAC se designa yH2. Esta construcción se utiliza para la producción de los xeno-ratones. Una estrategia similar a aquella utilizada anteriormente se utilizó para la construcción de los loci kappa, solamente que: el marcador de selección para neomicina se ligó al YAC reconstruido que contiene los loci kappa totales. Este YAC se designó yK2. Los YAC que contienen el yH2 se introdujeron dentro de células ES mediante la fusión de YAC que contiene esferoplastos de levadura con células ES de ratón E14.TG3B deficientes en HPRT. Se seleccionaron las células positivas a HPRT. Los clones positivos se propagaron y analizaron mediante Southern blot y mediante análisis de CHEF blot. Se seleccionaron los clones que contenían el YAC yH2 intacto. La introducción de selección de YAC yK2 en células ES se llevó a cabo de manera similar como se describió para YAC yH2. Las células ES que contienen yH2 se microinyectaron dentro de blastocistos de ratón C57BL/6J. Los machos quiméricos producidos se evaluaron a partir de la transmisión de la línea germinal a los descendientes. Los ratones transgénicos para yH2 y o yK2 se cruzaron con ratones DI (homocigotos para los loci de cadena pesada y cadena kappa de ratón inactivado por gen dirigido). Cada una de las cepas transgénicas yH2;DI se cruzaron con la cepa transgénica yK2;DI para generar cepas de Xeno-ratones. La reconstitución del desarrollo de la célula B y de la producción del anticuerpo en los Xeno-ratones se evaluó mediante citometría de flujo y ELISA. La inmunización de los xeno-ratones se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 2. Los métodos para la preparación de hibridoma y selección de clones positivos son similares a aquellos descritos en los ejemplos 3 y 4. Los clones 12.6, 28, 29.8, 30 y 50.30 de hibridoma se depositaron en el Collection Nationale de Culture de Microorganismes -Depósito Nacional de Cultivo de Microorganismos - (CNCM), Instituto Pasteur, París, bajo el Tratado de Budapest y fueron de acuerdo con los depósitos Nos. I-2390, 1-2391 , 1-2392, 1-2393 y I-2394, respectivamente.

REFERENCIAS Agnello. V., Abel, G., Elfahal, M., Knight, G. B., y Zhang. Q. X. (1999). "Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor [In Process Citation]." Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A, 96(22), 12766-71. Beisiegel. U., Schneider, W. J., Goldstein. J. L., Anderson, R. G. y Brown. M. S. (1981 ). Monoclonal antibodies to the low density lipoprotein receptor as probes for study of receptor-mediated endocytosis and the genetics of familial hypercholesterolemia". J Biol Chem, 256(22), 11923-31. Bieri. S., Djordjevic, J. T., Daly, N. L, Smith, R, y Kroon, P. A. (1995). Disulfide bridges of a cysteine-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain." Biochemistry, 34(40), 13059-65. Brown, M. S., y Goldstein, J. L. (1976). "Familial hypercholesterolemia: A genetic defect in the low-density lipoprotein receptor." N Engl J Med, 294(25), 1386-90. Brown, M. S., y Goldstein, J. L. (1986). "A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis." Science, 232(4746), 34-47. Chomczynski, P.N., y Sacchi, N. (1987). "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction". Analyt. Biochem. 162:156-9. Eshhar Z, 1985 "Monoclonal Antibody Strategy and Techniques" en "Hybrídoma technobgy in the bioscience and medicine", editada por Timothy A. Springer (Plenum Publishing Corporation, 1985; capítulo 1). Fischer, D, G., Tal, N., Novick, D., Barak, S., y Rubinstein, M. (1993). "An antiviral soluble form of the LDL receptor ¡nduced by interferon". Science, 262(5131), 250-3. Fischer, D.G., Novick, D., Cohén, B, Rubinstein, M. (1994), "Isolation and characterization of a soluble form of the LDL receptor, an interferon-induced antiviral protein". Proc Soc Exp Biol Med 206(3), 228-32. Ferrini, J.B., Pichard. L., Domergue, J., y Maurel, P. (1997). "Long-term primary cultures of adult human hepatocytes". Chem-Biol Interactions 107:31 -45. Fournier, C, Sureau, C, Coste, J., Ducos, J., Pageaux, G., Larrey, D., Domergue, J., y Maurel, P. (1998). "In vitro infection of adult normal human hepatocytes in primary culture by hepatitis C virus". J. Gen Viral. 79:2367-74. Goldstein, J. L., Anderson, R. G., y Brown, M. S. (1979), "Coated pits, coated vesicles, and receptor-mediated endocytosis". Nature, 279(5715), 679-85. Goldstein, J. L., Dana, S. E., Brunschede, G. Y., y Brown. M. S. (1975). "Genetic heterogeneity in familial hypercholesterolemía: evidence for two different mutations affecting functions of low-density lipoprotein receptor." Proc NatlAcad Sci USA, 72(3), 1092-6. Lanford R.E., Carey, K.D., Estlack. L.E., Smith, G.C., y Hay, R.V. (1989) "Analysis of plasma protein and lipoprotein synthesis in long-term primary cultures of baboon hepatocytes maintained in serum-free médium" En Vitro Cell Dev. Biol. 25:174-82. Laskus T., Radkowski, M., Wang, L.F., Cianciara, J., Vargas, H., y Rakela. J. ( 997). "Hepatitis C virus negative strand RNA is not detected in peripheral blood mononuclear cells and viral sequences are identical to those in serum: a case against extrahepatic replication". J. Gen. Viral. 78:2747-50. Maurel P. (1996) "The use of adult human hepatocytes in primary culture and other in vitro systems to investígate drug metabolism in man". Adv. Drug Del. Rev. 22:105-132. Méndez, M. M„ Green, L. L, Corvalan, J. R. F., Jia X-C, Maynard-Currie, E. E., Yang, X-D., Gallo, M. L, Louie, D. M., Lee, D. V., Erickson, K. L, Luna, J., Roy, C-M-N., Abderrahim, H., Kirshenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D. M., Fukushima, A., Hales, J. F., Flner, M.H., Davis, C.G., Zsebo, K. M. y Jakobovits, A. (1997). "Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice". Nature Genetics, 15, 146-56. Pichara", L., Fabre, I., Daujat, M., Domergue, J., Joyeux, H„ y Maurel, P. (1992). "Effect of corticosteroids on the expression of cytochromes P450 and on cyclosporin A oxidase activity in primary cultures of human hepatocytes". Mol. Pharmacol. 41 :1047-55. Riachmann, L., Clark, M., Waldmann. H., y Winter, G. (1988). "Reshaping human antibodies for therapy." Nature, 332,323-27. Sudhof. T. C, Goldstein, J. L., Brown, M. S., y Russell, D. W. (1985). "The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins" Science, 228(4701 ), 815-22. Uriaub, G. y Chasin, L.A. (1980) Isolation of Chínese Hámster Cell Mutants Deficient in Dihydrofolate Reducíase Activity. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo completamente humanizado, anticuerpo anti-anti-ID o fragmento de los mismos los cuales reconocen específicamente y se unen al receptor LDL humano y fragmentos del mismo, excepto el anticuerpo monoclonal C7. 2 - El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque reconoce y se une específicamente al receptor LDL soluble humano. 3.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es el Mab expresado por el clon de hibridoma 12.6 depositado en el CNCM bajo el No. I-2390. 4.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es el Mab expresado por el clon de hibridoma 28 depositado en el CNCM bajo el No. 1-1291. 5. - El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicadón 1 , caracterizado además porque es el Mab expresado por el clon de hibridoma 29.8 depositado en el CNCM bajo el No. I-2392. 6. - El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es el Mab expresado por el clon de hibridoma 30 depositado en el CNCM bajo el No. I-2393. 7. - El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es el Mab expresado por el clon de hibridoma 50.30 depositado en el CNCM bajo el No. I-2394. 8. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3-7, caracterizados además porque pertenecen al isotipo lgG1 o IgM de inmunoglobulina. 9. - Un método para la detección y/o la cuantificación de LDLR humano que comprende el uso de un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 10.- Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizados además porque son capaces de ser utilizados como un par en una prueba de ELISA. 11. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 10, caracterizados además porque son anticuerpos monoclonales generados por el clon 28 o clon 29.8 de hibridoma. 12. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizados además porque son capaces de identificar LDLR en análisis de Western blot. 13. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 12, caracterizados además porque son anticuerpos monoclonales generados por el clon 12.6, clon 28, clon 29.8 o clon 30 de hibridoma. 14. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizados además porque son capaces de neutralizar la actividad biológica antiviral de r-hsLDLR. 15. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 14, caracterizados además porque son anticuerpos monoclonales generados por el clon 2.6 o clon 50.30 de hibridoma. 16. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizados además porque son capaces de inhibir la replicación del virus de la hepatitis C. 17. - Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la reivindicación 16, caracterizados además porque son anticuerpos monoclonales generados por el clon 12.6, clon 28 o clon 29.8 de hibridoma. 18. - El clon 12.6 de hibridoma depositado en el CNCM bajo el No. I-2390. 19. - El clon 28 de hibridoma depositado en el CNCM bajo el No. 1-2391. 20. - El clon 29.8 de hibridoma depositado en el CNCM bajo el No. I-2392. 21. - El clon 30 de hibridoma depositado en el CNCM bajo el No. I-2393. 22.- El clon 50.30 de hibridoma depositado en el CNCM bajo el No. I-2394. 23.- Un método para preparar un anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque consiste en hacer crecer un hibrídoma clonado que comprende una célula de bazo de un mamífero inmunizado con hsLDL y una célula linfoíde homogénica o heterogénica en medio líquido en el abdomen de un mamífero para permitir que el hibrídoma produzca y acumule el anticuerpo monoclonal. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el inmunógeno LDLR es LDLR humano altamente purificado. 25. - Un método para purificar LDLR humano que consiste en poner en contacto un material que contiene LDLR humano con un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.