ES2282238T3 - Anticuerpos monoclonales contra el receptor ldl humano, su produccion y uso. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales contra el receptor ldl humano, su produccion y uso. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo totalmente humanizado, anticuerpo anti-anti-ID o sus fragmentos, que reconocen específicamente y se unen al receptor de LDL humano soluble y sus fragmentos, que es capaz de inhibir la replicación del virus de la hepatitis C, y que es asequible inmunizando animales con LDLR +291 humano soluble, es decir, la forma del receptor humana soluble incluyendo la forma de la secuencia de aminoacios de Asp+4 a Glu+291 de la secuencia de LDLR humano soluble, excepto el anticuerpo monoclonal C7.
Description
Anticuerpos monoclonales contra el receptor LDL
humano, su producción y uso.
La presente invención se refiere a anticuerpos
monoclonales que reconocen específicamente el receptor humano para
lipoproteínas de baja densidad (LDLR). Estos anticuerpos son, por
ejemplo, útiles para la identificación y purificación de LDLR
humanas solubles (hsLDLR) en procedimientos de producción así como
en la identificación y el tratamiento de enfermedades, tales como,
la infección por hepatitis C (HCV).
El colesterol, un componente de todas las
membranas celulares eucariotas, es esencial para el crecimiento y
la viabilidad de las células en los organismos superiores. Sin
embargo, los altos niveles en suero del colesterol causan
enfermedad y la muerte contribuyendo a la formación de placas
ateroscleróticas en arterias en todas las partes del cuerpo. El
sitio principal de la síntesis del colesterol en mamíferos es el
hígado. También son formadas cantidades apreciables de colesterol
por el intestino. La velocidad de formación del colesterol por
estos órganos es altamente sensible a la cantidad del colesterol
absorbido a partir de las fuentes dietéticas. Las células fuera del
hígado y del intestino adquieren el colesterol más desde el plasma
que sintetizándolo de novo. El colesterol y otros lípidos
son transportados en los fluidos corporales por las lipoproteínas,
que son clasificadas de acuerdo con su densidad creciente. Una
lipoproteína es una partícula que consiste en un núcleo de lípidos
hidrófobos rodeados por una carcasa de lípidos polares y
apoproteínas. Estas lipoproteínas tienen dos papeles: solubilizan a
los lípidos altamente hidrófobos y contienen señales que regulan el
movimiento de lípidos particulares hacia dentro y hacia fuera de
células objetivo específicas y tejidos. El colesterol es
transportado en los fluidos de corporales por lipoproteínas de baja
densidad (LDL) que se unen a un receptor específico sobre la
membrana celular de las células no hepáticas. El complejo
receptor-LDL entonces se interioriza en las células
por un mecanismo de transporte conocido como endocitosis mediada por
receptor (Goldstein et al. 1979). El receptor de la
lipoproteína de baja densidad (LDL) es el prototipo de una familia
de receptores de membrana celular estructuralmente relacionados que
median la endocitosis de múltiples ligandos en células de
mamífero.
El receptor de LDL consiste en 822 restos de
aminoácidos y exhibe un peso molecular de 164 000. Está compuesto
de varios dominios algunos de los cuales comparten homología de
secuencia con otras proteínas. Su dominio de unión de ligando del
extremo NH_{2}-terminal consiste en 292 restos,
dispuestos en 7 repeticiones imperfectas ricas de cisteína. Cada
repetición contiene seis restos de cisteína que son unidas por
disulfuro en un modelo de uno a tres, dos a cinco, y cuatro a seis.
(Bieri et al. 1995). Este dominio es seguido de cuatro
dominios adicionales: el primero consiste en 400 restos de
aminoácidos y es homólogo al receptor de EGF, el segundo consiste
en 58 restos de aminoácidos ricos en azúcares
O-unidos, el tercero es un dominio de transmembrana
sencillo de 22 restos de aminoácidos y el cuarto es un dominio
citoplásmico de 50 restos de aminoácido (Sudhof et al.
1985), (Brown et al. 1986).
La importancia fisiológica del receptor de LDL
fue revelada por los estudios de Goldstein y Brown sobre la
hipercolesterolemia familiar (FH). Se encontró que la enfermedad era
debida a un defecto genético molecular que causa la ausencia o la
deficiencia de receptores funcionales para la LDL (Brown et
al. 1976). Varias clases de mutaciones de FH han sido
caracterizadas. (Goldstein et al. 1975).
Una forma soluble de los sLDLR que exhibe
actividad antiviral fue identificada y aislada a partir del
sobrenadante de un cultivo celular de células inducidas por
interferón (Fischer et al. 1993) y en fluidos corporales
(Fischer et al. 1994). Varias proteínas inducidas por
interferón han sido identificadas que operan en la inducción del
estado antiviral por los IFN. Una proteína tal que exhibía actividad
antiviral fue producida y acumulada en el sobrenadante de un
cultivo celular de células WISH de amnios humanas. Esta proteína fue
purificada hasta homogeneidad y fue identificada como sLDLR (véase
el documento EP 0 553 667 y Fischer et al. 1993). Se encontró
que los sLDLR se secretaban en el medio por células de mamífero que
entraban en un estado antiviral en respuesta al interferón. En
contraste con el interferón, los sLDLR no inducen un estado
antiviral en las células, aunque sean antivirales por sí mismos.
Fue encontrado que los sLDLR al parecer tenían que estar presentes
en todas las partes del proceso de maduración de replicación viral
y se sugirió que la génesis podía estar implicada en un proceso
complejo que conduce a la inhibición del ensamblaje del virus o su
génesis (datos inéditos). Recientemente se ha demostrado que la
endocitosis del virus de la hepatitis C está mediada por receptores
de LDL en células cultivadas (Agnello et al. 1999). Estas y
otras conclusiones sugieren que la familia de receptores de LDL
puede servir como receptores virales. Por lo tanto, los anticuerpos
generados contra el receptor de sLDLR pueden bloquear la entrada y
la génesis de partículas virales uniéndose al receptor de LDL
celular.
El único anticuerpo monoclonal disponible frente
a LDLR conocido hasta ahora es el C7, un anticuerpo de LDLR bovino
(Beisiegel et al. 1981, disponible en el comercio de
Amersham, Reino Unido) que fue preparado por la inmunización de
ratones con LDLR de corteza suprarrenal bovina purificado hasta la
homogeneidad. Las membranas de la corteza suprarrenal bovina fueron
solubilizadas y el receptor fue purificado parcialmente por la
elución en una columna de DEAE-celulosa (Beisiegel
et al. 1981). El anticuerpo frente a LDLR bovino sólo
reacciona débilmente con la LDLR humano.
De hecho, el anticuerpo monoclonal C7 frente a
LDLR bovino fue encontrado que tenía desventajas significativas
cuando se usaba para la detección y la cuantificación de LDLR humano
recombinante:
a) Tiene una afinidad muy baja frente a LDLR
humano
b) reacciona inespecíficamente
significativamente con impurezas derivadas del cultivo celular
I. Van Driel et al. The Journal of
Biological Chemistry, vol. 264, Nº 16, 5 de junio de 1989
(1989-06-05), págs.
9533-9538 describe un ensayo de unión de ligando en
fase sólida para el receptor de LDL, en el que son usados
anticuerpos cada uno dirigidos a un dominio respectivo del receptor.
Explícitamente se mencionan los anticuerpos monoclonales C7, 15C8,
HL1, y 4A4 usados contra el receptor de LDL humano.
Driel, I et al., The Journal of
Biological Chemistry, vol 262, Número 33,
16127-16134, 1987 describe el uso de los
anticuerpos monoclonales C7, 15C8 y HL1 en un estudio sobre el papel
del dominio citoplásmico del receptor de LDL en
auto-asociación en oligómeros y en aglomeración en
orificios revestidos.
Driel, I et al. The Journal of
Biological Chemistry, vol 262, Número 36,
17443-17449, 1987 describe la unión de la primera
repetición rica de cisteína del dominio de unión del ligando de LDLR
a los anticuerpos 15C8 y C7.
V. Agnello et al., Proceedings of the
National Academy of the Sciences of the USA, vol. 96, Nº
22, 26 de octubre de 1999
(1999-10-26), págs.
12766-12771 describe que la endocitosis del virus de
la hepatitis C es mediada por receptores de LDL en células
cultivadas. Dentro de los estudios presentados, un anticuerpo
monoclonal del receptor anti-LDL, es decir C7, es
usado para inhibir dicha endocitosis.
Aparte de estos anticuerpos, no había
anticuerpos específicos a LDLR humano no estaban disponibles con
anterioridad. Esto parece sorprendente ya que es muy común que
surgan anticuerpos frente a nuevas proteínas, sea para la
purificación, la identificación o para objetivos de desarrollo de
ensayos. Es posible que tales anticuerpos no hayan sido generados
hasta ahora, ya que una condición para generar anticuerpos
monoclonales es la disponibilidad de cantidades suficientes del
antígeno altamente purificado que permitan una inmunización
eficiente de ratones. Un antígeno altamente purificado es uno que
aparece como un solo pico principal en RP-HPLC.
Además, los métodos para la identificación y la cuantificación del
antígeno durante procedimientos de purificación no son fáciles de
evaluar. Conforme a la invención, el ensayo de actividad antiviral
descrito en este documento fue empleado para la identificación de
LDLR durante los procedimientos de purificación.
Existe una necesidad de generar anticuerpos
monoclonales específicos frente a LDLR humano soluble para
proporcionar un medio para desarrollar un inmunoensayo eficiente
(ELISA) y para la identificación de la proteína en western blot. Se
requieren estos anticuerpos para controlar y cuantificar los LDLR
recombinantes humano soluble durante el desarrollo de los
procedimientos de producción y purificación de la proteína
recombinante y para la detección de la proteína natural.
La presente invención permite la generación de
líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales
capaces de reconocer específicamente y unirse al receptor de LDL
humano y sus fragmentos.
Más específicamente, la presente invención
permite la generación de líneas celulares de hibridoma que producen
anticuerpos monoclonales capaces de reconocer específicamente y
unirse al receptor de LDL humano soluble.
Así, la presente invención se refiere a un
anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo totalmente
humanizado, anticuerpo anti-anti-ID
o sus fragmento, que reconoce específicamente y se une al receptor
de LDL humano soluble y sus fragmentos, que es capaz de inhibir la
replicación del virus de la hepatitis C, y que es fácil de
conseguir inmunizando animales con LDLR +291 humano soluble, es
decir, la forma del receptor humano soluble incluyendo la forma de
la secuencia de aminoácidos Asp+4 a Glu+291 de la secuencia de LDLR
humana soluble, excepto el anticuerpo monoclonal C7.
La presente invención proporciona anticuerpos
monoclonales tales que reconocen y se unen a LDLR humano soluble y
que satisfacen las siguientes necesidades:
1. Los anticuerpos monoclonales que pueden ser
usados como un par en un ELISA, por ejemplo, un ELISA sándwich
(Ensayo de Inmunoabsorción con Enzimas Ligadas) para la detección de
LDLR humano soluble.
2. Los anticuerpos monoclonales que pueden ser
usados para la identificación de LDLR por análisis western
blot.
3. Los anticuerpos monoclonales que pueden ser
usados para neutralizar la actividad biológica antiviral del LDLR
humano soluble.
4. Los anticuerpos monoclonales que pueden ser
usados para inhibir la infección de virus tales como HCV.
La presente invención proporciona un método
in vitro para inhibir la replicación del virus de la
hepatitis C, que comprende poner en contacto células con el
anticuerpo monoclonal de la invención antes de la infección por el
virus de la hepatitis C para inhibir la replicación de la hepatitis
C en las células así como el uso del anticuerpo monoclonal de la
invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento
de la infección por hepatitis
C.
C.
La presente invención además proporciona un
método para la detección y/o la cuantificación de LDLR humano que
comprende el uso de los anticuerpos monoclonales específicos de
acuerdo con la invención de una manera conocida para tal
objetivo.
La presente invención también proporciona un
hibridoma clonado que comprende células de bazo de un mamífero
inmunizado con LDLR recombinante humano y células linfoides
homogénicas o heterogénicas.
Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
invención se prepara de una manera convencional, por ejemplo,
cultivando un hibridoma clonado que comprende células de bazo de un
mamífero inmunizado con hsLDL y células linfoides homogénicas o
heterogénicas en un medio líquido o el abdomen de un mamífero para
permitir que el hibridoma produzca y acumule el anticuerpo
monoclonal.
La invención, en otro aspecto más, proporciona
un método para preparar un anticuerpo monoclonal que comprende
cultivar un hibridoma clonado que comprende células de bazo de un
mamífero inmunizado con LDLR +291 humano soluble altamente
purificado, es decir, la forma del receptor humano soluble
incluyendo la forma de la secuencia de aminoácidos Asp+4 a Glu+291
de la secuencia de LDLR humana soluble, y células linfoides
homogénicas o heterogénicas en medio líquido o el abdomen de un
mamífero que permita que el hibridoma produzca y acumule el
anticuerpo monoclonal.
También se proporciona un método para purificar
LDLR humano, que comprende poner en contacto un material que
contiene LDLR humano a granel con el anticuerpo monoclonal de la
presente invención.
Una columna con anticuerpo monoclonal específico
de LDLR adsorbido puede ser usada como una etapa de purificación de
afinidad, en el procedimiento de purificación de la proteína
recombinante.
Un método para detectar y medir LDLR humano
recombinante que comprende usar como anticuerpo los anticuerpos
monoclonales de la presente invención en un ensayo ELISA como se
describe en el ejemplo 5.
Como LDLR o fragmento de un LDLR para inmunizar
animales puede usarse cualquier LDLR mientras sea el LDLR de un
mamífero de sangre caliente. también puede usarse una muteína de
LDLR. Un ejemplo representativo de tal LDLR humana soluble de
mamífero es la forma LDLR soluble +291 que incluye la secuencia de
aminoácidos que comienza en el aminoácido Asp en la posición +4 y
termina con el aminoácido Glu en la position +291 de la secuencia
de LDLR humano. Cualquier otra forma puede ser usada también como la
forma +292, etc.
La figura 1 muestra un organigrama que
representa el desarrollo de anticuerpos monoclonales frente a
r-hsLDLR.
La figura 2 muestra un análisis western blot de
la forma +291 de r-hsLDLR en la linea 1, el hsLDLR
urinario en la linea 2 y el receptor TNF de p55 recombinante humano
como un control negativo (r-hTBP-1)
en la linea 3, con los anticuerpos monoclonales indicados bajo cada
tira. Las flechas a la izquierda de la figura indican la posición
de los marcadores de pesos moleculares y las flechas a la derecha de
la figura indican la posición de la forma hsLDLR que indicaba
anteriormente cada flecha.
La figura 3 muestra los efectos de los
anticuerpos monoclonales 12,6, 28 y 29,8 en la producción de las
cadenas (+) y (-) de HCV en un cultivo de FT167. Las células fueron
tratadas 30 minutos antes de la infección con el anticuerpo
monoclonal anti-LDLR (8 o 2 \mug/ml). Después, las
células fueron infectadas de la noche a la mañana con 25 \mul de
suero de HCV (+) (Nº 42; 1b). El día siguiente a la infección,
fueron realizados tres lavados y fue añadido nuevo medio y fue
cambiado cada 48 horas. Cinco días después de la infección, fueron
cultivados hepatocitos, el ARN fue purificado y 1 \mug de ARN
celular fue analizado por rTth RT-PCR (Perkin
Elmer).
Los ensayos fueron realizados por duplicado.
+ SP: ensayo de ARN de cadena positivo; -SP:
ensayo de ARN de cadena negativo; X: blanco.
Fueron generados anticuerpos monoclonales (Mabs)
contra el LDLR humano soluble (hsLDLR). Usando estos anticuerpos
monoclonales, fueron desarrollados un ELISA y un procedimiento de
western blot para la identificación de hsLDLR y un ensayo de
neutralización para la actividad antiviral de hsLDLR.
\newpage
Los anticuerpos monoclonales fueron generados en
ratones, inmunizados con la forma recombinante +291 de hsLDLR, que
consiste en el dominio de unión del ligando del extremo N del LDLR
humano soluble, de Asp +4 a Glu+291. La forma +291 recombinante de
hsLDLR fue producida en células CHO y purificada hasta
homogeneidad.
Los ratones inmunizados produjeron títulos
significativos de anticuerpos específicos. Después de la selección
de los hibridomas, cinco clones (números 12, 28, 29, 30 y 50) fueron
identificados como los productores del anticuerpo más altos. Estos
clones fueron seleccionados para una subclonación posterior. Después
de la subclonación, 29 subclones que tenían una alta productividad
del anticuerpo fueron aislados y fueron congeladas las ampollas de
los clones emparentados y de los subclones.
Un par de anticuerpos monoclonales fue escogido
para el ELISA frente a rhsLDLR. El anticuerpo monoclonal 28 fue
seleccionado como el anticuerpo de revestimiento, y el anticuerpo
monoclonal 29.8, marcado con biotina, fue escogido como el segundo
anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales 12.6 y 29.8 fueron
encontrados que eran adecuados para la identificación del hsLDLR
natural y recombinante en análisis western blot y los anticuerpos
monoclonales 28 y 30 fueron encontrados que eran adecuados para la
identificación del hsLDLR recombinante en el análisis western blot.
Los anticuerpos monoclonales 12.6 y 50.30 fueron encontrados que
eran adecuados para inhibir la actividad antiviral de hsLDLR.
También fue encontrado conforme a la invención
que los anticuerpos monoclonales 12.6, 28 y 29.8 inhibían la
replicación del genoma viral del virus de la hepatitis C (HCV) en
cultivos primarios de hepatocitos humanos. Así, estos anticuerpos
pueden ser usados para el tratamiento de la infección por hepatitis
C (Figura 3).
El isotipo subclase del anticuerpo monoclonal
producido por los clones fue determinado. Los clones 12.6, 28, 29.8
y 30 fueron identificados como IgG, mientras que el clon 50.30 fue
encontrado que era IgM.
Los anticuerpos monoclonales desarrollados
contra la forma +291 del hsLDLR reconocieron también otras formas
del hsLDLR, es decir, la forma +292 y la forma +331 del rhsLDLR
producido en células CHO recombinantes en ELISA y en análisis
western blot. La forma +292 comprende la parte del extremo N del
receptor del resto desde el aminoácido Asp +4 a Cys +292 y la forma
+331 comprende la parte del extremo N del receptor desde el resto
del aminoácido Asp +4 a Cys +331.
El antígeno usado para inmunizar ratones para
generar anticuerpos monoclonales era la forma +291 de
r-hsLDLR, que fue producida en células CHO. La
producción de r-hsLDLR fue realizada en
biorreactores utilizando el sistema de matriz Fibracel en fase
estacionaria. El r-hsLDLR fue purificado hasta
homogeneidad y usado para inmunizar ratones.
Fueron usadas células de bazo inmunes del mejor
ratón que respondía para la fusión y la generación de
hibridomas.
En cuanto a los anticuerpos mencionados en este
documento en todas partes, la expresión "anticuerpo monoclonal"
se entiende que incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos
quiméricos, anticuerpos totalmente humanizados, de anticuerpos a
anticuerpos anti-idiotípicos (anticuerpo
anti-anti-Id) que pueden marcarse en
forma soluble o unida, así como sus fragmentos proporcionados por
cualquier técnica conocida, tal como, pero no limitada con la
división enzimática, síntesis de péptidos o técnicas
recombinantes.
Un anticuerpo monoclonal contiene una población
sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos a antígenos,
cuyas poblaciones contienen sustancialmente similares sitios de
unión al epítopo. Los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos
por métodos conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por
ejemplo Kohler y Milstein. Nature,
256:495-497 (1975); patente de EE.UU. Nº
4.376.110; Ausubel et al., eds., Harlow y Lane, ANTIBODIES :
A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y
Colligan et al., eds., Current Protocols in
Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience N. Y.,
(1992-1996), cuyos contenidos son incorporados como
referencias completamente en este documento por referencia. Tales
anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina
incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquiera de sus subclases.
Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede ser cultivado in vitro, in situ o
in vivo. La producción de altos títulos de anticuerpos
monoclonales in vivo o in situ hace de este método de
producción el preferido en este momento.
Los anticuerpos quiméricos son moléculas de las
cuales diferentes partes son derivadas de especies animales
diferentes, como los que tienen una región variable derivada de un
anticuerpo monoclonal murino y una región constante de
inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos principalmente
son usados para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para
aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando los
anticuerpos monoclonales murinos tienen rendimientos más altos a
partir de hibridomas pero una inmunogenicidad más alta en seres
humanos, se usan tales anticuerpos monoclonales quiméricos
humano/murino. Se conocen anticuerpos quiméricos y métodos para su
producción en la técnica (Cabilly et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984):
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:
6851-6855 (1984): Boulianne et al.,
Nature 312:643-646 (1984); Cabilly
et al., solicitud de patente europea 125023 (publicada el 14
de noviembre de 1984); Neuberger et al. Nature
314:268-270 (1985); Taniguchi et al.
solicitud de patente europea 171496 (publicada el 19 de febrero de
1985): Morrison et al. solicitud de patente europea 173494
(publicada el 5 de marzo de 1986): Neuberger et al.
solicitud PCT WO 8601533, (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo
et al. solicitud de patente europea 184187 (publicada el 11
de junio de 1986); Sahagan et al., J. Immunol.
137:1066-1074 (1986); Robinson et
al., solicitud de patente internacional Nº WO8702671 (publicada
el 7 de mayo de 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84:3439-3443 (1987); Sun et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:214-218 (1987); Better et al.,
Science 240:1041-1043 (1988);
Riechmann et al., Nature
332:323-327. y Harlow y Lane, ANTIBODIES: A
LABORATORY MANUAL, supra. Estas referencias son incorporadas
completamente en este documento como referencia.
Los "anticuerpos totalmente humanizados"
son moléculas que contienen tanto la región variable como constante
de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos totalmente humanizados
pueden ser usados potencialmente para uso terapéutico, cuando se
requieran tratamientos repetidos para enfermedades crónicas y
reticentes tales como las enfermedades autoinmunes. Un método para
la preparación de anticuerpos totalmente humanos consiste en la
"humanización" del sistema inmunológico humoral de ratón, es
decir, la producción de cepas de ratón capaces de producir Ig
humano (Xenomice), por la introducción de loci de
inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los cuales los genes de
Ig endógenos han sido inactivados. Los loci de Ig son
altamente complejos tanto en términos de su estructura física como
en los procesos de transposición génica y de expresión requeridos
para producir en última instancia una amplia respuesta inmune. La
diversidad del anticuerpo principalmente es generada por
transposición combinatoria entre los diferente genes V, D, y J
presentes en los loci de Ig. Estos loci también
contienen los elementos reguladores esparcidos, que controlan la
expresión del anticuerpo, la exclusión alélica, la conmutación de
clase y la maduración de afinidad. La introducción de transgenes de
Ig humana no reorganizados en ratones ha demostrado que la
maquinaria de recombinación de ratón es compatible con los genes
humanos. Además, los hibridomas que secretan a los anticuerpos
monoclonales humanos específicos a antígeno de varios isotipos
pueden ser obtenidos por la inmunización del Xenomice con el
antígeno.
Se conocen anticuerpos totalmente humanizados y
métodos para su producción en la técnica (Mendez et al.
Nature Genetics 15:146-156 (1997):
Buggemann et al. Eur. J. Immunol.
21:1323-1326 (1991); Tomizuka et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727
(2000), patente WO 98/24893.
Un anticuerpo anti-idiotípico
(anti-Id) es un anticuerpo que reconoce
determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión
al antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede prepararse
inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por
ejemplo una cepa de ratón) como fuente del anticuerpo monoclonal al
cual un anti-Id está siendo preparado. El animal
inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos
del anticuerpo de inmunización produciendo un anticuerpo de estos
determinantes idiotípicos (anticuerpo anti-Id).
Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.699.880, que se
incorpora como referencia en este documento completamente.
El anticuerpo anti-Id también
puede ser usado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta
inmune en otro animal más, produciendo un anticuerpo denominado
anti-anti-Id. El
anti-anti-Id puede ser
epitópicamente idéntico al anticuerpo monoclonal original, que
indujo el anti-Id. Así, usando anticuerpos frente a
los determinantes idiotípicos de un anticuerpo monoclonal, es
posible identificar a otros clones que expresen los anticuerpos de
especificidad
idéntica.
idéntica.
En consecuencia, los anticuerpos monoclonales
generados contra LDLR, sus isoformas, análogos, fragmentos o
derivados de la presente invención pueden ser usados para inducir
anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales
como ratones BALB/c. Las células de bazo de tales ratones
inmunizados son usadas para producir hibridomas de
anti-Id que secretan anticuerpos monoclonales
anti-Id. Además, pueden unirse anticuerpos
monoclonales anti-Id a un vehículo tal como
hemocianina de lapa californiana (KLH) y usarse para inmunizar
ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán
los anticuerpos anti-anti-Id que
tienen las propiedades de unión del anticuerpo monoclonal
específico original para un epítopo de la proteína de LDLR anterior,
o sus análogos, fragmentos y derivados.
Los anticuerpos monoclonales
anti-Id tienen así sus propios epítopos idiotípicos,
o "idiotipos" estructuralmente similares al epítopo que se
está evaluando. La expresión "anticuerpo monoclonal" también
significa que se incluyen tanto moléculas intactas así como sus
fragmentos, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')2, que son
capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')2
carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclararan más
rápidamente en la circulación, y pueden tener una unión menos
específica en tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al.
J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).
Será apreciado que Fab y F(ab')2 y otros
fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden
ser usados para la detección y la cuantificación de la proteína de
LDLR de acuerdo con los métodos descritos en este documento para
moléculas de anticuerpo intactas. Tales fragmentos típicamente son
producidos por división proteolítica, usando enzimas tales como la
papaína (para producir fragmentos de Fab) o la pepsina (para
producir fragmentos de F(ab')2).
Un anticuerpo monoclonal, como se dice, es
"capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar
específicamente con la molécula para así unir la molécula al
anticuerpo. El término "epítopo" se propone para referirse a
aquella parte de cualquier molécula capaz de ser unida por un
anticuerpo, que también puede ser reconocido por aquel anticuerpo.
Los epítopos o "determinantes antígenos" por lo general
consisten en agrupaciones químicamente activas superficialmente de
moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y
tienen características estructurales tridimensionales específicas
así como características de carga específicas.
Un "antígeno" es una molécula o una parte
de una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo, cuyo antígeno
es además capaz de inducir a un animal a producir el anticuerpo
capaz de unirse a un epítopo de aquel antígeno. Un antígeno puede
tener uno o varios de un epítopo. La reacción específica referida
anteriormente se propone para indicar que el antígeno reaccionará,
de una manera altamente selectiva, con un epítopo sobre su
anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros
anticuerpos que puedan ser generados por otros antígenos.
Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de
anticuerpos, útiles en la presente invención pueden ser usados
cuantitativamente o cualitativamente para detectar las proteínas de
LDLR en una muestra o para detectar la presencia de las células que
expresan las proteínas de LDLR de la presente invención. Esto puede
ser logrado por técnicas de inmunofluorescencia que empleen un
anticuerpo fluorescentemente marcado (véase debajo) acoplado con
microscopía de fluorescencia, detección citométrica por flujo, o
fluorométrica.
Los anticuerpos (o sus fragmentan) útiles en la
presente invención pueden ser empleados histológicamente, tal como
en inmunofluorescencia o en microscopía inmunoelectrónica, para la
detección in situ de las proteínas de LDLR de la presente
invención. La detección in situ puede ser lograda eliminando
un espécimen histológico de un paciente, y proporcionando el
anticuerpo marcado de la presente invención a tal espécimen. El
anticuerpo (o el fragmento) preferiblemente se proporciona
aplicando o revistiendo el anticuerpo marcado (o el fragmento) a
una muestra biológica. Por el uso de tal procedimiento, es posible
determinar no sólo la presencia de las proteínas de LDLR, sino
también su distribución sobre el tejido examinado. Usando la
presente invención, los expertos ordinarios fácilmente percibirán
que cualquiera de la amplia variedad de métodos histológicos (tales
como los procedimientos de tinción) pueden ser modificados para
lograr tal detección in situ.
Tales ensayos para las proteínas de LDLR de la
presente invención típicamente comprenden incubar una muestra
biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido,
células recién cultivadas tales como linfocitos o leucocitos, o
células que hayan sido incubadas en cultivos de tejido, en presencia
de un anticuerpo marcado capaz de identificar las proteínas de
LDLR, y detectar el anticuerpo por cualquiera de un número de
técnicas conocidas en la técnica.
La muestra biológica puede ser unida a un
soporte en fase sólida o un vehículo tal como nitrocelulosa, o a
otro soporte sólido o vehículo que sea capaz de inmovilizar células,
partículas de células o proteínas solubles. El soporte o vehículo
entonces pueden ser lavado con tampones adecuados seguido del
tratamiento con un anticuerpo marcado conforme a la presente
invención, como se dice anteriormente. El soporte en fase sólida o
vehículo entonces puede ser lavado con tampón una segunda vez para
eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido
sobre dicho soporte sólido o vehículo puede ser detectada después
por medios convencionales.
Por "soporte en fase sólida", "vehículo
en fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido",
"soporte" o "vehículo" son denominados cualquier soporte
o vehículo capaz de unirse al antígeno o a los anticuerpos. Los
soportes o vehículos conocidos, incluyen vidrio, poliestireno,
polipropileno, polietileno, dextrano, amilasas de nilón, celulosas
naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La
naturaleza del vehículo puede ser soluble en cierta medida o
insoluble para los objetivos de la presente invención. El material
de soporte puede tener prácticamente cualquier configuración
estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de
unirse a un antígeno o al anticuerpo. Así, la configuración del
soporte o vehículo puede ser esférica, tal como en una perla,
cilíndrica, tal como en la superficie interior de un tubo de ensayo,
o la superficie externa de una barra. De forma alternativa, la
superficie puede ser plana tal como una hoja, tira de prueba, etc.
Los soportes preferidos o vehículos incluyen las perlas de
poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán que puede haber
otros vehículos adecuados para unir el anticuerpo o el antígeno, o
serán capaces de averiguar lo mismo mediante el uso de la
experimentación rutinaria.
La actividad de unión de una parte dada del
anticuerpo de la invención, como se dice anteriormente, puede ser
determinada de acuerdo con métodos conocidos. Los expertos en la
técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo
operativas y óptimas para cada determinación empleando la
experimentación rutinaria.
Otras etapas tales como el lavado, la agitación,
la filtración y similares pueden ser añadidas a los ensayos como
sea costumbre o sea necesario para cada situación particular.
Uno de los caminos por los cuales puede marcarse
un anticuerpo conforme a la presente invención es uniendo el mismo
a una enzima y usándolo en un inmunoensayo enzimático (EIA). Esta
enzima, a su vez, cuando más tarde este expuesta a un sustrato
apropiado, reaccionará con el sustrato de tal manera que producirá
un resto químico que puede ser detectado, por ejemplo, por un medio
espectrofotométrico, fluorométrico o visual. Las enzimas que pueden
ser usadas para marcar el anticuerpo de forma detectable incluyen,
pero no limitadas, son malato deshidrogenasa, estafilococo
nucleasa, delta-5-esteroide
isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura,
alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato
isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina,
asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa,
ribonucleasa, ureasa, catalasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
glucoamilasa y acetilcolin-esterasa. La detección
puede ser lograda por métodos colorimétricos que emplean un sustrato
cromogénico para la enzima. La detección también puede ser lograda
por comparación visual del grado de reacción enzimático de un
sustrato en comparación con estándares preparados de modo
similar.
La detección puede ser lograda usando cualquiera
de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, por marcaje
radiactivo de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, es posible
detectar la R-PTPasa por el uso de un
radioinmunoensayo (RIA). Una buena descripción de un RIA puede ser
encontrada en "Laboratory Techniques and Biochemistry in
Molecular Biology" de Work, T.S. et al., North Holland
Publishing Company, NY (1978) con referencia particular al capítulo
titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related
Techniques" de Chard T. incorporado como referencia en este
documento. El isótopo radiactivo puede ser detectado por un medio
tal como el uso de un contador g o un contador de centelleo o por
autoradiografía.
Es también posible marcar un anticuerpo conforme
a la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el
anticuerpo marcado fluorescente es expuesto a una luz de longitud de
onda apropiada, su presencia puede ser detectada entonces debido a
la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescente más
comúnmente usados están el isotiocianato de fluoresceina, la
rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina,
o-ftaldehído y la fluorescamina.
También puede marcarse el anticuerpo de forma
detectable usando metales que emiten fluorescencia tales como
^{152}E, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales
pueden ser unidos al anticuerpo usando grupos quelantes metálicos
tales como el ácido dietilentriamina penta-acetico
(ETPA).
También puede marcarse el anticuerpo de forma
detectable acoplándolo a un compuesto quimiluminiscente. La
presencia del anticuerpo quimiluminiscente marcado entonces se
determina detectando la presencia de luminescencia que surge
durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos
de marcaje quimiluminiscentes particularmente útiles son luminol,
isoluminol, éster de acridina teromático, imidazol, sal de acridina
y éster de oxalato.
De la misma manera, un compuesto bioluminiscente
puede ser usado para marcar el anticuerpo de la presente invención.
La bioluminiscencia es un tipo de quimiluminiscencia encontrada en
sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica aumenta
la eficacia de la reacción quimiluminiscente. La presencia de una
proteína bioluminiscente es determinada detectando la presencia de
luminescencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para los
objetivos de marcaje son la luciferina, la luciferasa y el
aequorin.
Una molécula de anticuerpo de la presente
invención puede ser adaptada para su utilización en un ensayo
inmunométrico, también conocido como un ensayo "de fase doble"
o "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad
de anticuerpo no marcado (o el fragmento del anticuerpo) se une a un
soporte sólido o vehículo y una cantidad de anticuerpo soluble
marcado de forma detectable es añadido para permitir la detección
y/o la cuantificación del complejo ternario formado entre el
anticuerpo de fase sólida, el antígeno, y el anticuerpo marcado.
Ensayos inmunométricos típicos, y preferidos,
incluyen los ensayos "directos" en los cuales el anticuerpo
unido a la fase sólida primero se pone en contacto con la muestra
que se analiza para extraer el antígeno de la muestra por la
formación de un complejo anticuerpo-antígeno en fase
sólida binaria. Después de un período de incubación adecuado, el
soporte sólido o vehículo se lava para eliminar el resto de la
muestra fluida, incluyendo el antígeno no reaccionado, si hubiera
alguno, y luego se pone en contacto con la solución que contiene
una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (que funciona como
"una molécula reportera"). Después de un segundo período de
incubación se permite que el anticuerpo marcado al complejo con el
antígeno unirse al soporte sólido o vehículo por el anticuerpo no
marcado, el soporte sólido o vehículo se lava un segunda vez para
eliminar el anticuerpo no reaccionado marcado.
En otro tipo de ensayo "sándwich", que
también puede ser útil con los antígenos de la presente invención,
son usados los ensayos denominados "simultáneos" e
"indirectos". El ensayo simultáneo implica una sola etapa de
incubación cuando el anticuerpo unido al soporte sólido o vehículo y
el anticuerpo marcado son ambos añadidos a la muestra que se
analiza al mismo tiempo. Después de que la incubación sea
completada, el soporte sólido o vehículo se lava para eliminar el
resto de muestra fluida y el anticuerpo marcado no complejado. La
presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido o
vehículo entonces se determina, como sería en un ensayo sándwich
"directo" convencional.
En el ensayo "inverso", se utiliza primero
la adición gradual de una solución de anticuerpo marcado a la
muestra del fluido seguido de la adición de anticuerpo no marcado
unido a un soporte sólido o vehículo después de un período de
incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase
sólida se lava de manera convencional para liberarla del resto de
la muestra que se analiza y la solución de anticuerpo marcado no
reaccionado. La determinación de anticuerpo marcado asociado con un
soporte sólido o vehículo entonces es determina como en los ensayos
"simultáneos" y "directos".
La invención será ilustrada a continuación por
los ejemplos siguientes no restrictivos.
Células de CHO recombinantes estables que
expresaban LDLR humano soluble fueron generadas por
co-transfección de células CHO-DUKX
que carecían del gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub.
G. et al. 1980) con dos vectores de expresión: psLDLR01 que
contenía el dominio de unión de ligando del extremo N del LDLR,
empezando por el resto del aminoácido Asp (+ 4) hasta Glu 291
(+291), y pDHFR, que contenía el gen murino para DHFR, ambos
controlados por el promotor y los elementos de terminación de la
transcripción de la región SV40 temprana. La transfección fue
realizada por liposomas catiónicos usando LipofectAmine (Gibco BRL),
de acuerdo con el protocolo descrito por el fabricante. Setenta y
dos horas después de la transfección, las células fueron
transferidas a un medio selectivo que carecía de desoxi y
ribonucleósidos y suplementado con FCS dializado del 10%. Células
que expresaban la actividad de DHFR fueron capaces de formar
colonias, que fueron aisladas cultivando las células con discos de
papel empapados con tripsina. Las células fueron cultivadas y
rastreadas respecto a la actividad de r-hsLDLR. Las
células transfectadas entonces fueron sometidas a amplificación
génica por MTX, seguido por la subclonación y la selección de los
clones productores estables.
Fue producido r-hsLDLR (forma
+291) con células de un clon productor de CHO estable designado con
el Nº. 33-30-29-21,
en un bioreactor de CelliGen de 5 litros en medio libre de suero
(Gibco CHO-A-SFM Nº de Cat.
95-0091DJ). El resultado del cultivo a granel fue
clarificado por filtración a través de un filtro de cartucho de
0,8-02 \mu. (Gelman Nº de Cat. CSS92DSCCK) y fue
concentrado 100 veces con una membrana de 5-kDa. La
forma +291 del r-hsLDLR, usada para las primeras
inmunizaciones, fue purificada usando un procedimiento de
purificación a pequeña escala. En este procedimiento fue usada una
columna de intercambio catiónico DEAE-Sepharose,
seguido de una etapa de interacción hidrófoba en una columna de
Butil-TSK seguido de una columna HTP y una etapa de
cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) en una columna de
Sephacryl 100. La fracción Nº. 27 de la SEC, fue escogida, porque
contenía una actividad antiviral específica de 780 units/\mug
detectada en un ensayo antiviral descrito en el Ejemplo 9 debajo.
La proteína en esta fracción fue identificada como el
r-hsLDLR mediante el análisis del extremo N.
Un segundo lote de r-hsLDLR +291
de CHO fue purificado y usado para inyecciones de revacunación de
los ratones. Fue purificado usando un procedimiento refinado que
proporciona un mejor rendimiento que incluyó las etapas siguientes:
a) clarificación y concentración x 100 del resultado del cultivo a
granel; b) una columna de intercambio aniónico HQ POROS, y c) dos
etapas de interacción hidrófoba (HIC): captura en una columna de
Butil-TSK y flujo a través de una columna de Fenilo
5PW. La fracción no unida de la última etapa de HIC fue dializada y
purificada en una columna de intercambio catiónico
HS-POROS. La última etapa era una columna de
Hidroxiapatito (HTP). El r-hsLDLR obtenido a partir
de ello fue purificado hasta aproximadamente el 90%, eluyendo como
un solo pico principal en RP-HPLC.
10 \mug del r-hsLDLR
purificado de la fracción Nº. 27 de la columna de SEC del Ejemplo 1
anterior, a una concentración de 100 \mug/ml, fueron
homogeneizados con Adyuvante de Freund Completo (CFA, 50% v/v) y
fueron inyectados en la planta del pié de cinco ratones Balb/C
hembra de 7 semanas.
Cuatro semanas después de la primera
inmunización, los ratones fueron revacunados, intramuscular con 10
\mug de la misma fracción de r-hsLDLR purificado,
en una solución de CFA del 50% (v/v).
Dos semanas después de la segunda inyección,
fueron analizados los sueros de los ratones respecto a los
anticuerpos frente a r-hsLDLR, usando el ELISA
directo descrito en el Ejemplo 3 debajo.
Los dos ratones M-1 y
M-2, con la inmunorreactividad específica más
significativa con r-hsLDLR fueron además
revacunados, 10 semanas después de la segunda inyección, con 10
\mug del r-hsLDLR purificado obtenido en el
procedimiento de purificación refinado descrito en el Ejemplo 1
anterior.
A los ratones se les tomó sangre 14 semanas más
tarde y fueron analizados respecto a los anticuerpos frente a
r-hsLDLR. Después, se les proporcionaron dos
revacunaciones adicionales de 50 \mug de r-hsLDLR
en PBS: la primera intraperitoneal y la segunda, dos días más
tarde, tanto intraperitoneal como intravenosa.
A los ratones se les tomó sangre dos semanas
después de la segunda inyección y el antisuero fue analizado
respecto a la actividad de
anti-r-hsLDLR por el ELISA directo
del Ejemplo 3, debajo. Cada antisuero fue diluido en serie
1:100-1:32,000 y fue aplicado por duplicado en una
placa de 96 pocillos revestida con 10 U/pocillo de
r-hsLDLR purificado usando el procedimiento de
purificación refinado descrito en el Ejemplo 1 anterior. Fueron
usados como blancos tampón de ensayo y DMEM + HS del 10% que
contenía PBS + BSA del 1% o Gelatina + Tween 20 del 0,05% +
Timerosal del 0,05% en el primero pocillo de cada fila. El Suero de
Ratón Normal (SRN) fue aplicado en el mismo intervalo de dilución
en las dos últimas filas como controles negativos. La absorbancia
de la reacción enzimática fue medida con un lector de ELISA a 492 y
405 nm.
Los resultados de este ensayo indicaron que los
sueros del ratón M-1 tenían una inmunorreactividad
específica más alta con r-hsLDLR y por lo tanto
fueron sacrificados y sus células del bazo fueron recogidas para la
fusión con células de mieloma (Eshhar Z, 1985).
Fue realizado el ELISA directo para rastrear el
antisuero positivo como sigue: fueron revestidas placas de 96
pocillos con 100 \mul de r-hsLDLR (purificado por
el procedimiento de purificación refinado del ejemplo 1) en 100
unidades/ml (10 U/pocillo) en PBS + Gelatina del 1% (Sigma, Nº de
Cat. G 7765) + Ca^{+2} 0,9 mM y Mg^{2+} 0,5 mM, pH 5,6,
denominado en este documento en adelante como tampón de ensayo,
durante 90 minutos a 37ºC con agitación. Las placas fueron lavadas
seis veces en PBS + Tween 20 del 0,05%
(Polioxietileno-Monolaurato de Sorbitán - Sigma
P-1379), denominado de en este documento en adelante
como solución de lavado.
Fueron añadidas muestras de
Anti-suero de los ratones inmunizados diluidas en
serie 1:100-1:32,000, o sobrenadante de cultivos de
células de hibridoma a los pocillos y fue incubado durante 90
minutos a 37ºC, agitando, seguido por seis lavados con solución de
lavado.
100 \mul de Peroxidasa de Rábano Picante
(HRP)-anticuerpo de cabra conjugado de APA frente a
Fab de ratón (Sigma-Nº. de Cat.
4601-1) diluidos 1:1,200 fueron añadidos a los
pocillos y fueron incubados durante 90 minutos a 37ºC, agitando, y
luego fue lavado seis veces con solución de lavado.
100 \mul de solución de sustrato (preparado
disolviendo un comprimido de OPD y un comprimido de H_{2}O_{2}
en 20 ml de agua) fueron añadidos a los pocillos y fueron incubados
a TA durante 30 minutos. La reacción enzimática fue parada por la
adición de 100 \mul/pocillo de HCl 4N.
La absorbancia en placas de 96 pocillos fue
leída usando un lector de ELISA a 492 y 405 nm y los resultados
fueron calculados usando el algoritmo logístico
cuatri-paramétrico, por el software MultiCalc del
ordenador personal unido al lector de ELISA.
Los procedimientos de fusión y selección de
células de hibridoma fueron realizados de acuerdo con los protocolos
de Eshhar Z, 1985. Brevemente, fueron fusionadas células de bazo
del ratón M-1, revacunado 2-4 días
antes de la fusión, con células de mieloma por una incubación corta
con PEG. Primero fue diluído despacio el PEG con DMEM y luego fue
completamente eliminado por centrifugación. Las células fueron
resuspendidas en medio DMEM-HAT, fueron
distribuidas en placas de 96 pocillos a una concentración de
aproximadamente 3,4 x 10^{4} células/pocillo y fueron incubadas
durante 10-14 días en una incubadora con CO_{2}
del 8% a 37ºC. El medio en todos los pocillos de hibridoma fue
cambiado a DMEM suplementado con Suero de Caballo del 10% (HS) a los
10 días. Las muestras del sobrenadante del cultivo de hibridoma
fueron rastreadas para analizar la presencia de anticuerpos
monoclonales frente a r-hsLDLR por el ELISA directo
descrito en el Ejemplo 3 anterior. Fueron usados tampón de ensayo y
DMEM + HS del 10% como blanco. Fueron usados el anticuerpo
monoclonal C7 (disponible en el comercio en Amersham) y antisuero
del ratón M-1 como controles positivos, mientras que
fue usado un anticuerpo monoclonal frente al receptor de TNF p55
soluble como control negativo. Las células de los pocillos, en los
cuales la presencia de anticuerpos fue detectada en el sobrenadante
del cultivo, fueron transferidas a placas de 24 pocillos y luego a
25 un matraz en T de 25 cm^{2}. Los cultivos expandidos fueron
controlados respecto a la secreción de anticuerpos monoclonales
frente a r-hsLDLR. Las ampollas de células de los
cultivos positivos fueron congeladas y almacenadas en
nitrógeno
líquido.
líquido.
Un total de aproximadamente 1000 cultivos fueron
rastreados para detectar anticuerpos frente a
r-hsLDLR. Fueron analizados de nuevo 54 cultivos
con la immuno-actividad más alta varias veces. Cinco
cultivos (12, 28, 29, 30 y 50) con la actividad más alta fueron
clonados por dilución limitante en placas de 96 pocillos. Los
sobrenadantes de los clones crecientes fueron analizados varias
veces respecto a los anticuerpos frente a r-hsLDLR,
por el ELISA directo.
Las células de los clones de hibridoma positivas
fueron cultivadas en frascos de cultivo de tejido en DMEM que
contenía suero de caballo del 15% y fueron congeladas ampollas a
partir de parte de los cultivos. En paralelo, fueron inyectadas
células de clones de hibridoma diferentes, a 2-4
ratones cada uno, para obtener los líquidos ascíticos. Los
anticuerpos fueron purificados del líquido ascítico por
precipitación con sulfato de amonio o en una columna de proteína G.
Brevemente, 7,5 ml de líquido ascítico fueron diluidos 1:3 en tampón
fosfato 20 mM pH 7 y fueron cargados en una columna de Proteína G
de 5 ml (C10/10). La columna fue lavada con tampón fosfato 20 mM pH
7 y los anticuerpos monoclonales fueron eluidos con tampón glicina
100 mM pH 2,7. El pH de la fracción de elución fue ajustado a
7-7,5 con tampón Tris 1 M pH 9,3.
Fueron usados los anticuerpos monoclonales
purificados a partir de los líquidos ascíticos, como en el ejemplo
4 anterior, para llevar a cabo un grupo de experimentos en un
formato de matriz para seleccionar el mejor par adecuado de
anticuerpos monoclonales para ser usados como primeros y segundos
anticuerpos en el ELISA sándwich para el r-hsLDLR
descrito en el Ejemplo 6 debajo. Brevemente, las placas de 96
pocillos fueron revestidas con los líquidos ascíticos derivados de
cinco hibridomas (Nº. 12, 28.28, 29.08, 30 y 50.05) purificados por
precipitación con sulfato de amonio o en una columna de proteína G.
Los anticuerpos fueron rastreados usando la forma +291 así como las
formas +292 (a partir del resto del aminoácido Asp + 4 a Cys + 292)
y +331 (a partir del resto del aminoácido
Asp + 4 a Cys + 331) de r-hsLDLR producido en células CHO, como antígenos. Un ml de cada uno de los anteriores anticuerpos monoclonales parcialmente purificado fue marcado con biotina para un rastreo rápido de su conveniencia como segundos anticuerpos en un ELISA sándwich. Brevemente, 1,5 mg de anticuerpos monoclonales purificados por precipitación con sulfato de amonio fueron ajustados a pH 8,5 con 30 \mul de NaHCO_{3} 0,5 M. 0,75 mg de Biotina-OSu N-Hidroxisuccinimida-Biotina (Biotina-OSu, Sigma, Nº. de Cat. H1759, a partir de una solución de 5 mg en 200 \mul de DMSO) fueron añadidos a la solución del anticuerpo y fueron incubados durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave, seguido por una incubación de una noche a 2-8ºC. La solución de reacción fue cargada en una columna PD10 G-25M de Sephadex (Pharmacia Nº. de Cat. 17-0851-01) para separar entre los anticuerpos monoclonales biotinilado y el exceso de biotina-OSu no reaccionada.
Asp + 4 a Cys + 331) de r-hsLDLR producido en células CHO, como antígenos. Un ml de cada uno de los anteriores anticuerpos monoclonales parcialmente purificado fue marcado con biotina para un rastreo rápido de su conveniencia como segundos anticuerpos en un ELISA sándwich. Brevemente, 1,5 mg de anticuerpos monoclonales purificados por precipitación con sulfato de amonio fueron ajustados a pH 8,5 con 30 \mul de NaHCO_{3} 0,5 M. 0,75 mg de Biotina-OSu N-Hidroxisuccinimida-Biotina (Biotina-OSu, Sigma, Nº. de Cat. H1759, a partir de una solución de 5 mg en 200 \mul de DMSO) fueron añadidos a la solución del anticuerpo y fueron incubados durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave, seguido por una incubación de una noche a 2-8ºC. La solución de reacción fue cargada en una columna PD10 G-25M de Sephadex (Pharmacia Nº. de Cat. 17-0851-01) para separar entre los anticuerpos monoclonales biotinilado y el exceso de biotina-OSu no reaccionada.
Los primeros experimentos preliminares indicaron
que los anticuerpos monoclonales 29.08 y 30 produjeron la señal de
fondo anterior más alta, cuando se usaban como segundos anticuerpos
en el ELISA.
La reacción de estos dos clones fue analizada de
nuevo como segundos anticuerpos con los anticuerpos 12. 28. 29.08 y
50 usados para revestir las placas. Los resultados de este
experimento mostraron claramente que el anticuerpo monoclonal 28
era el anticuerpo más adecuado para el revestimiento.
Los mejores resultados, en términos de
intensidad de señal y especificidad, fueron obtenidos con el
anticuerpo monoclonal 28 usado para revestir la placa de
microtítulo, y el anticuerpo monoclonal 29.08, marcado con biotina,
como un segundo anticuerpo. Usando a estos anticuerpos monoclonales
fueron obtenidos buenos resultados con las tres formas (+291, +292
y +331) del r-hsLDLR. Con todas las formas, la
absorbancia a 492/405 nm fue de aproximadamente 1,3 OD.
Las tres formas del antígeno del
r-hsLDLR fueron analizadas en diluciones sucesivas
en un intervalo de concentración de 0,9-1000 ng/ml.
Una curva respuesta de dosis fue obtenida con el anticuerpo
monoclonal 28 usado para el revestimiento y el anticuerpo
monoclonal biotinilado 29.08 como segundo anticuerpo. Esta
combinación dio una respuesta lineal en el intervalo de
concentración de 1-10 ng/ml de
r-hsLDLR.
Los diversos parámetros que pueden afectar al
ensayo ELISA, tales como la concentración del reactivo, períodos de
incubación, selección de tampones y placas fueron optimizados
analizando los parámetros siguientes:
- \bullet
- Revestimiento de los pocillos de la placa de microtítulo con 5-10 \mug/ml del anticuerpo monoclonal 28 en PBS.
- \bullet
- Composición del tampón:
- a)
- PBS + Tween 20
- b)
- Tris+Ca^{2+} + NaCl + Tween 20
- \bullet
- Soluciones de bloqueo:
- a)
- Gelatina del 1% en PBS, Tween del 0,05%, Timerosal del 0,005%
- b)
- BSA del 1% en PBS, Tween del 0,05%, Timerosal del 0,005%
- c)
- FBS del 1% en PBS, Tween del 0,05%, Timerosal del 0,005%
- d)
- Leche del 1% en PBS, Tween del 0,05%, Timerosal del 0,005%
- e)
- I Bloqueo. Hy Pep y Hy Levadura
- \bullet
- Segundo anticuerpo monoclonal 29.08, marcado con biotina, a las concentraciones de 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000. 1:8000. 1:10.000 equivalentes con un intervalo de concentración de 0,74-0,537 \mug/ml.
- \bullet
- Concentraciones de extravidina: 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10,000 equivalentes con un intervalo de concentración de 4-0,2 \mug/ml.
En base a estos experimentos, fue establecido el
procedimiento final para el ensayo ELISA sándwich descrito en el
Ejemplo 6 debajo.
Un ELISA sándwich frente a
r-hsLDLR fue establecido usando los anticuerpos
monoclonales 28 y 29.08. Brevemente, fue revestida una placa de 96
pocillos con 100 \mul de un anticuerpo monoclonal 28 purificado de
Proteína G (5 \mug/ml) de la noche a la mañana a
2-8ºC o 3 horas a 37ºC. Las placas entonces fueron
lavadas cinco veces con PBS+ Tween 20 del 0,05%. Las placas fueron
incubadas con 200 \mul de solución de bloqueo (PBS + BSA del 1% o
Gelatina +
Tween 20 del 0,05% + Timerosal del 0,05% durante una hora a 37ºC o a lo largo de la noche a 4ºC y fueron lavadas cinco veces con PBS + Tween 20 del 0,05%. 100 \mul de las muestras o del antígeno de la curva de calibración (+291 r-hsLDLR de CHO, 0,5-32 ng/ml diluidos en la solución de bloqueo), fueron añadidos a los pocillos y fueron incubados durante 90 minuto a 37ºC, con agitación. Las placas entonces fueron lavadas cinco veces con PBS + Tween 20 del 0,05%.
Tween 20 del 0,05% + Timerosal del 0,05% durante una hora a 37ºC o a lo largo de la noche a 4ºC y fueron lavadas cinco veces con PBS + Tween 20 del 0,05%. 100 \mul de las muestras o del antígeno de la curva de calibración (+291 r-hsLDLR de CHO, 0,5-32 ng/ml diluidos en la solución de bloqueo), fueron añadidos a los pocillos y fueron incubados durante 90 minuto a 37ºC, con agitación. Las placas entonces fueron lavadas cinco veces con PBS + Tween 20 del 0,05%.
Fueron añadidos 100 \mul/pocillo del
anticuerpo monoclonal biotinilado 29.08 (0,67 \mug/ml) en la
solución de bloqueo, y fueron incubados con agitación durante una
hora a 37ºC. Las placas fueron lavadas cinco veces con PBS + Tween
20 del 0,05%. Fueron añadidos 100 \mul de un conjugado de
extravidina - peroxidasa comercial, (ExtrAvidin
TM-Peroxidase BioMakor, Nº. de Cat.
0645-1) diluidos 1:10,000 a los pocillos y fueron
incubados con agitación durante una hora a 37ºC. Las placas
entonces fueron lavadas cinco veces con PBS + Tween 20 del 0,05%.
125 \mul de la solución de sustrato antedicha fueron añadidos a
cada pocillo y fueron incubados durante aproximadamente 10 minutos
hasta que el color se desarrolló a la intensidad deseada. La
reacción fue parada añadiendo 125 \mul de HCl 4 N. La absorbancia
en las placas de 96 pocillos fue leída usando un lector de ELISA a
longitudes de onda de 492 y 405 nm y los resultados fueron
calculados por el software MultiCalc del ordenador personal unido al
lector de ELISA.
El isotipo Ig de los anticuerpos monoclonales
fue determinado usando un kit comercial de isotipado (PharMingen
International) de acuerdo con el procedimiento de ensayo del
fabricante. Los clones 12.6, 28, 29.8 y 30 fueron identificados
como IgG_{1}, mientras que el clon 50.30 fue encontrado que era de
la clase IgM.
La forma +291 de r-hsLDLR
purificado y el LDLR natural purificado de orina humana fueron
analizados por análisis western blot con los anticuerpos
monoclonales desarrollados frente a r-hsLDLR.
Brevemente, fue cargado gel de poliacrilamida SDS del 12% con 100
ng/linea de la forma +291 de CHO de r-hsLDLR, o
hsLDLR nativa urinaria o el resultado del cultivo de
TBP-1 a granel (como control negativo) en
condiciones reductoras (DTT 40 mM). Una linea fue cargada con
marcadores de pesos moleculares bajos (LMW). Este grupo de muestras
fue corrido cinco veces. Las proteínas separadas en los geles
fueron transferidas por electroelución frente a membranas de
nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas en PBS que contenía
leche del 10% baja en grasas, Tween 20 del 0,1%, durante 16 h. Las
membranas fueron cortadas en tiras y cada tira fue incubada durante
2 horas a temperatura ambiente con de uno de cinco anticuerpos
monoclonales seleccionados: 12.6, 30, 50.30, 28 o 29.08 (líquido
ascítico diluido
1:4000).
1:4000).
Las tiras de la membrana fueron lavadas con PBS
que contenía Tween 20 del 0,1% (3 x 15 minuto) y fueron incubadas
durante una hora con el segundo anticuerpo - antiratón de cabra
conjugado con peroxidasa de rábano picante -
fosfatasa alcalina (diluido 1:10.000. BioMakor) durante 2 horas a temperatura ambiente.
fosfatasa alcalina (diluido 1:10.000. BioMakor) durante 2 horas a temperatura ambiente.
Las tiras fueron lavadas con PBS que contenía
Tween 20 del 0,1% (3 x 15 minutos). Las bandas positivas fueron
detectadas por quimiluminiscencia potenciada (ECL, Amersham).
Los anticuerpos monoclonales N^{os}. 12.6 y
29.8 reconocieron ambos la forma urinaria así como la +291 del
r-hsLDLR purificada en el análisis western blot
(Figura 2). Los anticuerpos monoclonales 28 y 30 reconocieron la
forma +291 del r-hsLDLR purificado.
Los anticuerpos monoclonales que reaccionaron
específicamente con la r-hsLDLR fueron analizados
para evaluar su capacidad de bloquear la actividad antiviral de
r-hsLDLR (forma +291) in vitro, usando un
ensayo de inhibición del efecto citopático (CPE) en un sistema
VSV/WISH.
Fueron cultivadas células WISH (de origen humano
amnios) en MEM suplementado con FBS del 10% y glutamina 4 mM en una
incubadora a 37ºC con CO_{2} del 5%. Las células exponencialmente
crecientes fueron cultivadas en placas de cultivo de tejido de 96
pocillos, a una densidad de 40.000 células/pocillo veinticuatro
horas antes de la iniciación del ensayo. Las muestras que se
analizaron y el estándar fueron diluidos y distribuidos en los
pocillos que contenían las células. Fue añadido VSV inmediatamente a
los pocillos, a una multiplicidad de infección (MOl) de 0,5
pfu/célula. Las placas fueron incubadas 16-18 horas
a 37ºC y después fueron lavadas con etanol. La monocapa de células
supervivientes fue vista por tinción de violeta de cristal Gram. La
cuantificación del efecto citopático en relación con el estándar
fue realizada representando la densidad de color frente a la
concentración
estándar.
estándar.
Para analizar el efecto de neutralización de los
anticuerpos, fue preincubado r-hsLDLR durante 30
minutos a 37ºC, con concentraciones crecientes de líquido ascítico
del anticuerpo monoclonal analizado. Estas soluciones entonces
fueron añadidas a cultivos de células WISH en placas de microtítulo
de 96 pocillos, seguido por la adición del virus de la estomatitis
vesicular (VSV). Después de una incubación de 18 horas, la lisis de
células mediada por VSV fue determinada tiñendo las células
restantes con violeta de cristal. La semicuantificación del efecto
citopático en relación con el estándar fue realizada representando
la intensidad del color (determinado por un lector de ELISA) frente
a la concentración estándar.
El efecto de los anticuerpos monoclonales fue
analizado con concentraciones crecientes de
r-hsLDLR. Como se muestra en la Tabla 1, fue
encontrado que dos anticuerpos monoclonales (12.6 y 50.30) mostraban
la actividad neutralizante.
En el experimento mostrado en la Tabla 1, fue
analizado el efecto inhibitorio de dos anticuerpos monoclonales con
una dilución 1:40 de los líquidos ascíticos. En esta dilución, el
anticuerpo monoclonal 12.6 mostraba una actividad algo más alta que
el anticuerpo monoclonal 50.30. Esto puede ser el resultado de las
propiedades de los anticuerpos monoclonales, así como de las
diferencias de su concentración en el líquido ascítico.
El efecto inhibitorio de los anticuerpos
monoclonales pudo ser superado aumentando la concentración de
r-hsLDLR en relación con los anticuerpos
monoclonales. De hecho, a las concentraciones de
r-hsLDLR de 62,5 U/ml, ningún anticuerpo monoclonal
tuvo ningún efecto sobre la actividad de r-hsLDLR a
la concentración del anticuerpo analizada.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}
\begin{minipage}[t]{150mm}Inhibición
de la actividad antiviral de r-hsLDLR frente a la
lisis de células mediada por VSV de células WISH. El efecto
inhibitorio de los anticuerpos monoclonales fue determinado a una
dilución 1:40 del líquido ascítico. El número de células viables se
representa en la tabla en valores de OD. Los números entre
paréntesis representan una repetición realizada a las
concentraciones de 0 y 12,5 U/ml de LDLR.\end{minipage}
\vskip1.000000\baselineskip
La inhibición de la actividad antiviral de
r-hsLDLR fue determinada usando concentraciones
crecientes de los anticuerpos monoclonales 12.6 y 50.30. El
anticuerpo monoclonal 12.6 inhibió la actividad antiviral de
r-hsLDLR en \sim60% a una dilución 1:40 (del
líquido ascítico) y en \sim35% a una dilución 1:20,500. El clon
50.30 inhibió la actividad de r-hsLDLR en \sim45%
a una dilución 1:40 y en \sim5% a una dilución 1:20,500.
La curva respuesta de la dosis, obtenida tanto
con anticuerpos monoclonales como con la observación de que su
efecto inhibitorio fue impedido por r-hsLDLR en
exceso, sugiere que los anticuerpos monoclonales ejercen su efecto
uniéndose a r-hsLDLR.
Fueron analizados anticuerpos monoclonales
específicos para r-hsLDLR por su capacidad de
inhibir la replicación de HCV en hepatocitos humanos en cultivo
primario. Fue derivado un cultivo celular de FT167 de un paciente
varón de 57 años que requería resección lobectomía con objetivos
médicos (metástasis de un tumor de colon, lóbulo derecho).
\newpage
Fueron preparados cultivos primarios de
hepatocitos humanos por el método de perfusión de colagenasa de dos
etapas (Maurel P., Adv. Drug Del. Rev.
22:105-132 (1996), Richard L. et al.
Mol. Pharmacol. 41: 1047-1055 (1992),
Ferrini JB et al., Chem Biol Interactions
107:31-45 (1997)). La viabilidad de las
células antes de ponerlas en la placa fue determinada usando el
ensayo de exclusión azul de tripano. Cuatro millones de células en
3 ml de medio de cultivo fueron coladas en placas de plástico de 60
mm pre-revestidas con colágeno. El medio de cultivo
sin suero a largo plazo consistió en medio Williams'E, suplementado
como se publica (Lanford R. et al. In Vitro Cell Dev.
Bio. 25: 174-182 (1989)). Este medio fue
renovado posteriormente cada 48 horas. Los cultivos fueron
mantenidos a 37ºC en una atmósfera húmeda de aire y dióxido de
carbono del 5%. En estas condiciones de cultivo, los hepatocitos
humanos conservan su fenotipo diferenciado durante al menos 35 días
(Ferrini J B. Chem Biol Interactions 107:
31-45 (1997)) y son sensibles a la infección por
HCV y permisivos con la replicación del genoma viral (Fournier C.
et al. J. Gen. Virol. 79:
2367-2374 (1998)).
Muestra de suero HCV-positiva:
Un banco de sueros humanos de pacientes analizados con anticuerpos
anti-HCV positivos por el EIA HCV 3.0 y Chiron RIBA
HCV 3.0 SIA ha sido establecido. Ninguno de estos pacientes fue
co-infectado por HBV o VIH. En cada muestra de
suero, fue cuantificado el ARN de HCV por el monitor de Roche y el
genotipo por un ensayo de sonda de línea (Inno-Lipa
HCVII, Innogenetics). Las muestras de suero fueron almacenadas a
-80ºC, en pequeñas alícuotas para evitar ciclos de
descongelación-congelación. En estos experimentos,
fue usada la muestra S42 (genotipo Ib; carga viral: 410 000
copias/ml).
Para la infección y los tratamientos
subsecuentes, fueron transferidos cultivos de hepatocitos en
condiciones estériles a un P3-laboratorio (alto
confinamiento para micro-organismos infecciosos en
humanos). Tres días después de ponerlo en placas, cuando las
células se habían repuesto del estrés por aislamiento, fue realizada
una infección de hepatocitos in vitro mediante una
incubación de una noche con 25 \mul de muestra de suero
HCV-positiva (S42) en 3 mL de medio. Después de la
infección, las células fueron lavadas tres veces con 3 mL de medio
recién preparado y el cultivo fue seguido en condiciones normales en
medio de cultivo a largo plazo.
Las células fueron tratadas con 3 anticuerpos
monoclonales diferentes contra r-hsLDLR, anticuerpo
monoclonal 12.6, anticuerpo monoclonal 28 y anticuerpo monoclonal
29.8. Treinta minutos antes de la infección, las células fueron
expuestas a 2 u 8 \mug/ml de los diferentes anticuerpos
monoclonales. Entonces, las células fueron infectadas como se
describe anteriormente.
Los cultivos de control fueron infectados en
condiciones similares, pero en ausencia del tratamiento antiviral.
En experimentos paralelos, los mismos cultivos fueron tratados con
5000 U/mL de IFN\alpha en condiciones similares para la
comparación (el IFN\alpha inhibe fuertemente la replicación de HCV
en las células referidas). Todos los tratamientos fueron llevados a
cabo por duplicado.
En el día 5 después de la infección, el medio
fue eliminado y los cultivos fueron lavados 3 veces con solución
salina fría tamponada de fosfato. El ARN fue purificado de 4 x
10^{6} hepatocitos usando un procedimiento de extracción de
isotiocianato de guanidina-fenol ácido (Chomczynski
PN. y N Sacchi. Analyt. Biochem. 162:
156-159 (1987)). El ARN precipitado fue disuelto en
50 \muL de dietilpirocarbonato (DEPC) - tratado con agua y
cuantificado. Un \mug de ARN celular fue analizado en el ensayo
RT-PCR de rTth específico de cadena.
Para evitar la posible contaminación, el ensayo
de RT-PCR específico de cadena fue llevado a cabo
secuencialmente usando tres cuartos diferentes: un cuarto
pre-PCR, un cuarto PCR y un cuarto
post-PCR. El ARN disuelto en 10 \mulL de
DEPC-tratado con agua fue revestido de aceite
mineral y calentado a 95ºC durante 1 minuto. La temperatura fue
bajada a 70ºC y fueron añadidos 10 \muL de la mezcla de reacción
de cDNA precalentada. La temperatura entonces fue bajada a 60ºC
durante 2 minutos para la hibridación y la reacción de cDNA fue
realizada durante 20 minutos a 70ºC utilizando la
ADN-polimerasa de rTth
(Perkin-Elmer). La temperatura fue mantenida a 70ºC
mientras que fueron añadidos 40 \mul de tampón precalentado que
contenía EGTA como quelante de Mn^{2+} para suprimir la actividad
de RT de rTth. Los tubos de reacción fueron mantenidos a 70ºC
mientras fueron añadidos 40 \mul de la mezcla de PCR
precalentada. Las condiciones de la PCR, realizadas en el Sistema
PCR 9600 de Gene Amp® (Perlein-Elmer) consistieron
en un ciclo inicial a 94ºC durante 1 minuto, 50 ciclos a 94ºC
durante 15 s, 58ºC durante 30 s, 72ºC durante 30 s y una etapa de
extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Para el ensayo de cadena
ARN positiva de HCV, la secuencia del nucleótido de cebador inverso
P3 fue:
5'-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3', (nt
342-320) y la del cebador directo P4 fue:
5'-CACTCCCCTGTGAGGAACT-3', (nt:
38-56), (Laskus T. et al. J. Gen.
Virol. 78: 2747-2750 (1997)). Los mismos
cebadores fueron usados en orden inverso para detectar la cadena
negativa. Un décimo del producto amplificado fue analizado por
electroforesis de gel sobre agarosa (2%), seguido por coloración
con BET y fotografía bajo luz UV. En toda la serie de experimentos,
fueron hechas diluciones de las cadenas de ARN sintético (+) y (-)
de HCV y fue añadido 1 \mug de ARN de hígado total para imitar las
condiciones para el análisis de los hepatocitos cultivados. Estas
mezclas fueron usadas como controles positivos para el ensayo de
RT-PCR y su
análisis.
análisis.
La figura 3 muestra que la producción de la
cadena negativa de HCV, en presencia de los anticuerpos monoclonales
frente a LDLr, fue inhibida totalmente en un cultivo de FT167. Por
lo tanto, la replicación del genoma viral fue fuertemente inhibida.
Los resultados fueron compatibles con la opinión de que el LDLR
podía ser un receptor para HCV.
El mRNA se purifica a partir de una línea de
hibridoma que produce mAb específicos para LDLR.
cDNA específico es sintetizado con
oligonucleotidos complementarios a los extremos 5' del exon CH1 a
partir del dominio variable de la cadena pesada (oligo 1) y de los
5' del C\kappahexon del dominio variable de la cadena ligera
(oligo 2) utilizando el mRNA purificado como plantilla.
Dos cDNAs son obtenidos, uno de los cuales
codifica la región variable (específica para LDLR) de la cadena
pesada, y el otro la región variable (específica para LDLR) de la
cadena ligera. Los cDNA se clonan y se secuencian.
Para la construcción de la cadena pesada
quimérica, la región variable de un gen de la cadena pesada de Ig
humana clonado se intercambia (utilizando manipulaciones genéticas)
con el ADN clonado que codifica el dominio variable de ratón
(específico para LDLR) de la cadena pesada. Las manipulaciones
genéticas incluyen la excisión de la región variable de Ig humano,
usando enzimas de restricción específicas y ligando la región
variable de ratón. El mismo procedimiento es realizado para obtener
la cadena ligera quimérica.
Dos plásmidos de expresión de mamífero son
construidos, uno incluyendo el gen de la cadena pesada quimérico y
el otro incluyendo el gen de la cadena ligera quimérico. Ambos
vectores son usados para cotransfectar la línea celular de hibridoma
(SP6).
La producción de Ig de LDLR específico es
analizada por ELISA o western blot usando una sopa de cultivo
celular transfectante como anticuerpo secundario. La afinidad del
anticuerpo quimérico a su ligando se controla por Biacore.
La preparación del xenomice está descrita en el
documento WO98/24893 y en Mendez, M.J. et al., Nature
genetics 15: 146-56 (1997).
Se rastrean genotecas de cromosoma artificial
humano-levadura (YAC) para los YAC que contenían la
región variable de la cadena pesada humana (aproximadamente 1000
kilobytes) (el método de clonación YAC es el método de opción
cuando se requieren tamaños de insertos más grandes de 100
kilobytes).
El YAC se caracteriza por el análisis de
southern blot y por la electroforesis con campo pulsante (PFGE). El
YAC debe incluir las regiones C\mu C\delta, Dh y Vh en la
configuración de la línea germinal.
Por la utilización de las secuencias que
sobrelapan contenidas en los YAC, los YAC se recombinan en levadura
según la estrategia de recombinación gradual. Antes de la
recombinación el YAC del extremo 3' (con la región V) es ligado al
marcador de HPRT seleccionable. El PFGE confirma la estructura de
YAC recombinado y el análisis de southern blot (la presencia del
locus de la cadena pesada humana de la región C a la región
Vh en la configuración de la línea germinal).
El brazo acéntrico del YAC se modifica con un
vector que lleva la región constante \gamma2 completa, potenciador
de ratón, gen de resistencia a la neomicina, para proporcionar la
cadena pesada final que contiene la región variable entera, es
decir, 82 genes Vh, 6 genes Jh y 3 regiones constantes diferentes
C\mu, C\delta, C\gamma con sus secuencias reguladoras
correspondientes. Este YAC es designado yH2. Este constructo es
usado para la producción del Xenomice.
Una estrategia similar a la usada anteriormente
es utilizada para la reconstrucción de loci kappa, sólo que
el marcador de selección de neomicina es ligado al YAC reconstruido
que contenía todos los loci kappa. Este YAC es designado
yK2.
Los YAC que contenían el yH2 son introducidos en
células ES vía la fusión de esferoplastos de levadura que contenían
YAC con células ES de ratón E14 TG3B HPRT deficientes.
Las células HPRT positivas son seleccionadas.
Los clones positivos son propagados y analizados por southern blot
y por análisis CHEF blot. Los clones que contienen YAC deyH2 intacto
son seleccionados.
La introducción y la selección de YAC de yK2 en
células ES se realiza de modo similar a como se describe para YAC de
yH2.
Las células ES que contienen YH2 son
microinyectadas en blastocitos C57BL/6J de ratón. Los machos
quiméricos producidos son evaluados para la transmisión de la línea
germinal al descendiente.
Los ratones yH2 o
yK2-transgénicos son cruzados con ratones DI
(homocigotos para loci de la cadena kappa y pesada de ratón
del gen inactivo-modificado). Cada una de las cepas
transgénicas yH2; DI se cruza con la cepa transgénica yK2; DI para
generar cepas de Xenomice.
La reconstitución del desarrollo de células B y
la producción de anticuerpos en Xenomice es evaluada por flujo de
citometría y ELISA.
La inmunización del xenomice es realizada como
se describe en el ejemplo 2.
Los métodos para la preparación de hibridoma y
el rastreo de clones positivos son similares a los descritos en los
ejemplos 3 y 4.
Los clones de hibridoma 12.6, 28, 29.8, 30 y
50.30 fueron depositados en la "Collection Nationale de Culture
de Microorganismes" (CNCM), Instituto Pasteur, París, bajo el
Tratado de Budapest y fueron concedidos los N^{os}. de depósito
I-2390, I-2391,
I-2392 I-2393 e
I-2394, respectivamente.
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Claims (19)
1. Un anticuerpo monoclonal, anticuerpo
quimérico, anticuerpo totalmente humanizado, anticuerpo
anti-anti-ID o sus fragmentos, que
reconocen específicamente y se unen al receptor de LDL humano
soluble y sus fragmentos, que es capaz de inhibir la replicación
del virus de la hepatitis C, y que es asequible inmunizando animales
con LDLR +291 humano soluble, es decir, la forma del receptor
humana soluble incluyendo la forma de la secuencia de aminoacios de
Asp+4 a Glu+291 de la secuencia de LDLR humano soluble, excepto el
anticuerpo monoclonal C7.
2. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal es generado
por el clon de hibridoma 12.6, depositado en el CNCM con el Nº
1-2390, clon 28, depositado en el CNCM con el Nº
1-2391, clon 29.8, depositado en el CNCM con el Nº
1-2392.
3. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 expresado por el clon del hibridoma 12.6 depositado
en el CNCM con el Nº 1-2390.
4. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 expresado por el clon del hibridoma 28 depositado
en el CNCM con el Nº 1-2391.
5. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 expresado por el clon del hibridoma 29.8 depositado
en el CNCM con el Nº 1-2392.
6. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 expresado por el clon del hibridoma 30 depositado
en el CNCM con el Nº 1-2393.
7. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 expresado por el clon del hibridoma 50.30
depositado en el CNCM con el Nº 1-2394.
8. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que pertenece al isotipo
de inmunoglobulina IgG_{1} o IgM.
9. Un clon del hibridoma 12.6 depositado en el
CNCM con el Nº 1-2390.
10. Un clon del hibridoma 28 depositado en el
CNCM con el Nº 1-2391.
11. Un clon del hibridoma 29.8 depositado en el
CNCM con el Nº 1-2392.
12. Un clon del hibridoma 30 depositado en el
CNCM con el Nº 1-2393.
13. Un clon del hibridoma 50.30 depositado en el
CNCM con el Nº 1-2394.
14. Un método para la detección y/o la
cuantificación de LDLR humano soluble, que comprende el uso de un
anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
15. Un método para preparar un anticuerpo
monoclonal que comprende cultivar un hibridoma clonado que comprende
células de bazo de un mamífero inmunizado con LDLR +291 altamente
purificado humano soluble, es decir, la forma del receptor humano
soluble incluyendo la forma de la secuencia de aminoácidos Asp+4 a
Glu+291 de la secuencia de LDLR humano soluble, y células linfoides
homogénicas o heterogénicas en medio líquido o en el abdomen de un
mamífero que permita que el hibridoma produzca y acumule el
anticuerpo monoclonal.
16. Un método para purificar LDLR humano, que
comprende poner en contacto un material que contiene LDLR humano a
granel con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 o con el anticuerpo monoclonal preparado por
el método de la reivindicación 15.
17. Un método in vitro para inhibir las
replicación del virus de la hepatitis C, que comprende poner en
contacto células con el anticuerpo monoclonal de las
reivindicaciones 1 a 8 antes de la infección por el virus de la
hepatitis C para inhibir la replicación de la hepatitis C en las
células.
18. El uso del anticuerpo monoclonal de acuerdo
con las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un medicamento
para el tratamiento por infección de la hepatitis C.
19. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 8 para uso como medicamento.
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