PL201738B1

PL201738B1 - Cząsteczka rekombinowanego RNA, komórka rekombinowana, chimeryczny wirus, sposób wytwarzania chimerycznego wirusa i preparat szczepionki

Info

Publication number: PL201738B1
Application number: PL355963A
Authority: PL
Inventors: Adolfo Garcia-Sastre; Peter Palese
Original assignee: Sinai School Medicine
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2009-05-29
Also published as: NO330233B1; KR20020013469A; DE69941820D1; CN1268747C; RU2270864C2; CY1110704T1; BRPI9913721B8; HK1159188A1; KR20070073970A; NO20011294L; NZ510746A; DK2336370T3; WO2000015853A9; CA2343653C; CA2343653A1; ES2340345T3; ATE452210T1; US20030078410A1; EP2336370A2; US6451323B1

Abstract

1. Cz asteczka rekombinowanego RNA, znamienna tym, ze obejmuje miejsce wi azania swoiste wzgl edem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygna ly potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których po sredniczy NDV, operatywnie zwi azane z sekwencj a heterologicznego RNA, przy czym miejsce wi azania specyficz- ne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygna lów wymaganych do replikacji w której po sredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekoduj acym regionie flankuj acym RNA wirusowego genomu NDV. 12. Sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA "minus", znamienny tym, ze transfekuje si e ko- mórk e gospodarza sekwencjami nukleotydów koduj acymi rekombinowan a cz asteczk e RNA zawieraj ac a miejsce wi azania swoiste wzgl edem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygna ly potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których po sredniczy NDV, operatywnie zwi azane z sekwencj a genomem wirusa choroby New- castle, przy czym cz asteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wi azania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygna lów wymaganych do replikacji w której po sredniczy NDV i tran- skrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekoduj acym regionie flankuj acym RNA wirusowego genomu NDV. 13. Preparat szczepionki, znamienny tym, ze zawiera wytworzonego metodami in zynierii genetycznej wirusa choroby Newcastle, zawieraj acego cz asteczk e rekombinowanego RNA zawieraj ac a miejsce wi azania swoiste wzgl e- dem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygna ly potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których po sredniczy NDV, operatywnie zwi azane z sekwencj a genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cz a- steczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wi azania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygna lów wymaganych do replikacji w której po sredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekoduj acym regionie flankuj acym RNA wirusowego genomu NDV, i przy czym ta cz asteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, prowadz ace do atenuowanego fenotypu, lub zwi ekszonej im- munogeniczno sci, oraz fizjologicznie dozwolon a zaróbk e. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

1. Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka rekombinowanego RNA, komórka rekombinowana, chimeryczny wirus, sposób wytwarzania chimerycznego wirusa i preparat szczepionki. Szczegółowo zaś, niniejszy wynalazek zajmuje się dziedziną rekombinowanych matryc wirusa RNA choroby Newcastle, które mogą zostać użyte celem ekspresji produktów genów heterologicznych w odpowiednich systemach komórek gospodarza i/lub celem skonstruowania rekombinowanych wirusów, które produkują, pakują i/lub prezentują produkt genu heterologicznego. Produkty ekspresji oraz chimeryczne wirusy mogą zostać korzystnie zastosowane w szczepionkach. Wyprodukowane metodami inżynierii genetycznej rekombinowane wirusy choroby Newcastle, zawierające modyfikacje i/lub mutacje umożliwiają zastosowanie tego wirusa w szczepionkach. Modyfikacje te, to atenuowany fenotyp i zwiększona immunogeniczność. Rekombinowane wirusy choroby Newcastle, indukują interferon oraz szlaki pokrewne. Niniejszy wynalazek służy do zastosowania rekombinowanych wirusów choroby Newcastle oraz wektorów wirusowych przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów i/lub antygenów, w tym nowotworowo-specyficznych antygenów. Wynalazek został zaprezentowany na drodze przykładów, w których skonstruowano matryce RNA rekombinowanego wirusa choroby Newcastle zawierające sekwencje kodujące heterologiczny gen o ujemnej polarnoś ci. W dalszej kolejnoś ci wynalazek pozwala na konstruowanie matryc RNA rekombinowanego wirusa choroby Newcastle, które zawierają sekwencje kodujące heterologiczny gen o pozytywnej polarności. Sekwencje genu heterologicznego dotyczą sekwencji otrzymanych z ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego.

2.Tło wynalazku

Celem bezpośredniej ekspresji heterologicznych białek w systemach komórek gospodarza poddano genetycznej modyfikacji szereg wirusów DNA (np. wirus wakcinii, bakulowirus, itd.). Ostatnio poczyniono postępy w zakresie pozytywno-niciowych wirusów (np. poliowirus). Uważa się, że produkty genów heterologicznych lub chimeryczne wirusy dające produkt genu heterologicznego są potencjalnie korzystne jako szczepionki (zarówno jako podjednostki lub całościowe szczepionki wirusowe). Jedyną wadą użycia wirusów takich jak wakcinia celem skonstruowania rekombinowanych lub chimerycznych wirusów jest brak zróżnicowania głównych epitopów wakcinii. Brak zróżnicowania wśród szczepów wirusowych nakłada znaczne ograniczenia na ciągłe stosowanie chimer wakcinii, ponieważ wielokrotne szczepienia doprowadzą do wytworzenia odporności gospodarza na dany szczep, uniemożliwiającej zakażenie gospodarza inokulowanym wirusem. Inokulacja chimeryczną wakcinią jednostki odpornej nie doprowadzi tym samym do indukcji odpowiedzi immunologicznej.

Dla kontrastu, ujemnoniciowe wirusy RNA mogą być atrakcyjnymi kandydatami do konstrukcji chierycznych wirusów stosowanych jako szczepionki. Przykładowo, szczególnie pożądanym wirusem jest ujemnoniciowy wirus RNA grypy, ponieważ jego znaczna zmienność genetyczna pozwala na skonstruowanie rozległego repertuaru szczepionek stymulujących odporność bez ryzyka rozwinięcia się tolerancji. Ostatnio udało się skonstruować przy użyciu wirusa grypy zakaźne rekombinowane lub chimeryczne ujemnoniciowe cząsteczki RNA (U.S Patent nr 5,166,057 do Palesc i wsp., włączony tutaj w całości poprzez odniesienie).

2.1. Wirus choroby Newcastle

Rodziny wirusów, zawierających jednoniciowe RNA jako antysensowny genom, zostały zaklasyfikowane do grup mających genomy niepodzielne (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) lub podzielne genomy (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae oraz Arenaviridae). Szczegółowo opisana poniżej oraz zastosowana w niniejszych przykładach rodzina Paramyxoviridae zawiera wirus choroby Newcastle (NDV), wirus paragrypy, wirus Sendai, szympans wirus 5 oraz wirus świnki. Wirus choroby Newcastle jest wirusem otoczkowym zawierającym liniowy, jednoniciowy genom zbudowany z ujemnoniciowego RNA. Genomowe RNA zawiera opisane szczegółowo geny w kolejnoś ci 3'-NP-P-M-F-HN-L. Genomowe RNA zawiera również sekwencję liderową na 3' końcu. Strukturalne elementy wirionu dotyczą otoczki wirusowej stanowiącej dwuwarstwową błonę pochodzącą z błony komórkowej. Glikoproteina, hemaglutynimo-neuramidaza (HN) wystaje z otoczki umożliwiając posiadanie przez wirusa zarówno aktywności hemaglutyniny jak i neuramidazy. Fuzyjna glikoproteina (F), która oddziałuje również z błoną wirusa jest w pierwszej kolejności produkowana jako nieaktywny prekursor, a następnie cięta post-translacyjnie celem wytworzenia dwóch polipeptyPL 201 738 B1 dów połączonych mostkiem siarczkowym. Aktywne białko F bierze udział w penetracji NDV do komórek gospodarza poprzez ułatwianie fuzji otoczki wirusowej z błoną komórkową gospodarza. Białko matriks (M) bierze udział w składaniu wirusa oraz oddziałuje zarówno z otoczką wirusa jak i biał kami nukleokapsydu.

Główną podjednostkę białkową nukleokapsydu stanowi białko nukleokapsydu (NP), które nadaje kapsydowi symetrię helikalną. Białka P i L występują w połączeniu z nukleokapsydem. Uważa się, że podlegające fosforylacji fosfobiałko (P) odgrywa rolę w regulacji transkrypcji oraz może również brać udział w metylacji, fosforylacji i poliadenylacji. Gen L, kodujący zależną od RNA polimerazę RNA, jest wraz z białkiem P niezbędny do syntezy wirusowego RNA. Białko L, zabierające niemal połowę genomu wirusa, jest największym białkiem wirusowym oraz odgrywa istotną rolę zarówno w transkrypcji jak i replikacji.

Replikacja wszystkich ujemnoniciowych wirusów RNA, w tym NDV, jest utrudniona ze względu na brak komórkowej maszynerii wymaganej do replikacji RNA. Dodatkowo, ujemnoniciowy genom nie może bezpośrednio ulegać translacji do białek, ale musi najpierw ulec transkrypcji do pozytywnoniciowej kopii (mRNA). A zatem, po wejściu do komórki gospodarza, genomowe RNA nie może samodzielnie przeprowadzić syntezy potrzebnej polimerazy RNA zależnej od RNA. Białka L, P i NP. muszą wnikać do komórki w trakcie infekcji razem z genomem.

Uważa się, że większość lub wszystkie białka wirusowe, które przeprowadzają transkrypcje mRNA NDV, przeprowadzają również jego replikację. Nie zidentyfikowano dotychczas w sposób jasny mechanizmu regulującego alternatywne zastosowania (tj. trakskrypcję lub replikację) tych samych komplementarnych białek ale wydaje się, że biorą w tym udział trzy formy jednego lub więcej białek nukleokapsydu, w szczególności NP. Bezpośrednio po penetracji wirusa, transkrypcja ulega inicjacji przez białko L korzystające z ujemnoniciowego RNA jako matrycy. Synteza wirusowego RNA jest regulowana w taki sposób, że prowadzi to do powstania podczas transkrypcji monocistronicznego mRNA.

Po zajściu transkrypcji, replikacja genomu wirusowego jest drugim zasadniczym wydarzeniem podczas infekcji przez ujemnoniciowe wirusy RNA. Jak w przypadku innych ujemnoniciowych wirusów RNA, replikacja genomu wirusa choroby Newcastle (NDV) jest przeprowadzana przez białka. Pierwszymi produktami replikatywnej syntezy RNA są komplementarne kopie (tj. o dodatniej polarnoś ci) genomu RNA wirusa NDV (cRNA). Te dodatnioniciowe kopie (antygenomy) różnią się od dodatnioniciowych transkryptów mRNA strukturą ich zakończeń. W przeciwieństwie do transkryptów mRNA, anty-genomowe cRNA nie mają czapeczki, ani nie są metylowane na 5' końcu oraz nie ulegają skróceniu ani poliadenylacji na 3' końcu. cRNA są koterminalne z ich ujemnoniciowymi matrycami oraz zawierają wszystkie informacje genetyczne w każ dym segmencie genomowego RNA w postaci komplementarnej. cRNA służą jako matryce do syntezy ujemnoniciowych genomów wirusa NDV (vRNA).

Zarówno ujemnoniciowe genomy NDV (vRNA) jak i antygenomy (cRNA) ulegają enkapsydacji poprzez białka nukleokapsydu; jedynymi rodzajami RNA nie ulegającego enkapsydacji są wirusowe mRNA. Dla NDV miejscem replikacji dla wirusowego RNA jest cytoplazma, podobnie jak miejscem do transkrypcji. Składanie elementów wirusa zachodzi przy błonie komórkowej gospodarza, zaś dojrzały wirus jest uwalniany przez wypączkowywanie.

2.2. Konstruowanie ujemnoniciowych wirusów RNA.

Sterowane przez RNA polimerazy RNA z wirusów były intensywnie badane w odniesieniu do wielu aspektów struktury białek i warunków reakcji. Jednakże, elementy matrycy RNA, które kierują optymalną ekspresją polimerazy mogą zostać zbadane jedynie poprzez oddziaływania z wykorzystaniem istniejących sekwencji wirusowego RNA. Analiza promotora jest szczególnie interesująca ze względu na brak wiedzy w zakresie sposobu na jaki polimeraza wirusowa rozpoznaje specyficzne wirusowe RNA spośród wielu kodowanych przez gospodarza RNA, odnajdywanych na terenie zakażonej komórki.

Wirusy zwierzęce zawierające pozytywnoniciowe genomy RNA mogą ulegać replikacji jedynie po wprowadzeniu otrzymanego z plazmidu RNA do komórki na drodze transfekcji (przykładowo, Racaniello i wsp., 1981, 25 Science 214:916-919; Levis. i wsp., 1986, Cell 44: 137-145). W przypadku poliowirusa, oczyszczona polimeraza będzie replikować genomowe RNA w reakcjach in vitro, a po wprowadzeniu droga traksfekcji do komórek to pozytywnoniciowe RNA jest zakaźne (Kaplan, i wsp., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8424-8428). Jednakże, nieznane są elementy matrycy służące jako promotor transkrypcji dla kodowanej przez poliowirusa polimerazy,

PL 201 738 B1 ponieważ nawet homopolimery RNA mogą ulec skopiowaniu (Ward, i wsp., 1988, J. Virol. 62: 558-562). Transkrypty SP6 również były stosowane do produkcji modelu defektywnie interferujących cząsteczek RNA dla genomu wirusa Sindbis. Po wprowadzeniu do zakażanej komórki, RNA ulega replikacji i zapakowaniu. Sekwencje RNA, odpowiedzialne za zarówno rozpoznanie polimerazy wirusa Sindbis oraz pakowanie genomu do cząsteczek wirusa, okazały się znajdować wewnątrz 162 nukleotydów (nt) na 5' końcu oraz 19 nt na 3' końcu genomu (Levis, i wsp., 1986, Cell 44:137-145). W przypadku wirusa mozaiki rodzaju Bromus (BMV), pozytywnoniciowego RNA wirusa roślin, zastosowano transkrypty SP6 celem zidentyfikowania promotora jako 134 nt 3' końca przypominającego tRNA (Dreher, and Hall, 1988, J. Mol. Biol. 201: 31-40). Rozpoznawanie przez polimerazę oraz synteza okazała się być niezależna zarówno od cech sekwencji jak i struktury dwurzędowej (Dreher, i wsp., 1984, Nature 311:171-175).

Ujemnoniciowe wirusy RNA okazały się odporne na badania wymagań strukturalnych replikazy. Oczyszczona polimeraza wirusa pęcherzykowego zapalenia żołądka jest aktywna jedynie jeśli jako matryce załączone są otrzymane z wirusa kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) (De i Banerjee, 1985, Biochem, Biophys. Res- Commun. 126:40-49; Emerson i Yu, 1975, J. Virol. 15: 1348-1356; Naito i Ishihama, 1976, J. Biol. Chem. 251: 4307-4314). W odniesieniu do wirusa grypy, wykazano, że gołe oczyszczone RNA z wirusa może zostać użyte do rekonstytucji RNP. Wirusowy nukleokapsyd oraz białka polimerazy były oczyszczane na żelu i renaturowane na wirusowym RNA przy użyciu tioredoksyny (Szewczyk, i wsp., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7907-7911). Jednakże, autorzy ci nie wykazali, czy aktywność preparatu była specyficzna dla RNA wirusa grypy oraz nie zanalizowali sygnałów kierujących transkrypcją.

Dopiero ostatnio możliwym stało się odzyskanie ujemnoniciowych wirusów RNA przy użyciu odwróconego podejścia rekombinowanej genetyki (U.S. Patent nr 5,166,057 do Palese i wsp.). Chociaż metoda ta została oryginalnie zastosowana do modyfikacji genomu wirusa grypy (Luytjes i wsp. 1989. Cell 59:1107-1113; Enami i wsp. 1990, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:11563-11567), została również z powodzeniem użyta dla różnorodnych ujemnoniciowych wirusów RNA, segmentowanych i niesegmentowanych), w tym w ś cieklizny (Schnell i wsp. 1994, EMBO J. 13:4195-4203); wirusa syncytialnego dróg oddechowych (Collins i wsp. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667); oraz wirusa Sendai (Park i wsp. 1991, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 88:5537-5541; Kato i wsp., 1996, Genes Cells 1:569-579). Jednakże, nie zastosowano do tej pory tego sposobu w odniesieniu do genomów RNA wirusa choroby Newcastle.

3. Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka rekombinowanego RNA, która obejmuje miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodują cym regionie flankują cym RNA wirusowego genomu NDV.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka rekombinowanego RNA, która obejmuje miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV.

W cząsteczce rekombinowanego RNA według wynalazku regiony takie jak, 3' i 5'-niekodujący region flankujący ma sensowną sekwencję wirusa, pokazaną na fig. 3. Cząsteczka rekombinowanego RNA charakteryzuje się ponadto tym, że heterologiczny RNA koduje wirusowy antygen. W bardziej korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka rekombinowanego według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniany wirusowy antygen pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa siatkowicy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń.

PL 201 738 B1

Przedmiotem wynalazku jest również komórka rekombinowana, która zawiera sekwencje nukleotydów kodujące cząsteczkę rekombinowanego NDV jak zdefiniowano poprzednio oraz białka P i L polimerazy RNA NDV.

Przedmiotem wynalazku jest również chimeryczny wirus, który stanowi wirus o nici RNA minus, zawierający cząsteczkę rekombinowanego RNA jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, w chimerycznym wirusie wedł ug wynalazku heterologiczny RNA pochodzi z wirusowego antygenu, a bardziej korzystnie pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa retikuloendoteliozy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń.

W innym takż e korzystnym wykonaniu chimeryczny wirus wedł ug wynalazku charakteryzuje się tym, że heterologiczny RNA zawarty jest w genie HN wirusa choroby Newcastle.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA minus, polegający na tym, że transfekuje się komórkę gospodarza sekwencjami nukleotydów kodującymi rekombinowaną cząsteczkę RNA zawierającą wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, oraz wyodrębnia się chimerycznego wirusa z hodowli.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA minus, polegający na tym, że transfekuje się komórkę gospodarza sekwencjami nukleotydów kodującymi rekombinowaną cząsteczkę RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującycm regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV.

Następnym przedmiotem wynalazku jest preparat szczepionki, zawierający wytworzonego metodami inżynierii genetycznej wirusa choroby Newcastle, zawierającego cząsteczkę rekombinowanego RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującycm regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, i przy czym ta cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, prowadzące do atenuowanego fenotypu, lub zwiększonej immunogeniczności, oraz fizjologicznie dozwoloną zaróbkę.

Przedmiotem wynalazku jest również preparat szczepionki, który zawiera wytworzonego metodami inżynierii genetycznej chimerycznego wirusa choroby Newcastle, zawierającego cząsteczkę rekombinowanego RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której poś redniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodują cym regionie flankują cym RNA wirusowego genomu NDV, którego genom koduje epitop heterologiczny, oraz farmaceutycznie dozwoloną zaróbkę.

W korzystnym rozwią zaniu preparatu szczepionki, epitopem heterologicznym jest antygen wirusowy, a w jeszcze bardzie korzystnym rozwiązaniu preparat szczepionki zawiera wirusowy antygen, który pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapale6

PL 201 738 B1 nia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa retikuloendoteliozy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń.

W innym korzystnym rozwiązaniu, preparat szczepionki charakteryzuje się tym, ż e epitopem heterologicznym jest białko wzmagające reaktywność immunologiczną wybrane z grupy obejmującej cytokiny, interferon, czynnik tworzący kolonie i interleukiny, lub także korzystnie, epitopem heterologicznym jest antygen nowotworowy.

Niniejszy wynalazek odnosi się do szczepionek, które mogą być podawane ludziom, jak również w celach weterynaryjnych. Szczepionki niniejszego wynalazku mogą być zaprojektowane do podawania zwierzętom domowym, w tym psom, kotom i dzikim zwierzętom, w tym lisom i skunksom, zwierzętom gospodarskim i ptactwu, w tym koniom, bydłu, owcom, indykom i kurom.

Wynalazek dotyczy rekombinowanych wektorów wirusa choroby Newcastle oraz wirusów zmodyfikowanych tak, aby kodować zmutowane geny wirusa choroby Newcastle, bądź kodować kombinacje genów z różnych szczepów wirusa choroby Newcastle. Matryce RNA wytwarzane w niniejszym wynalazku zostały przygotowane poprzez transkrypcje odpowiednich sekwencji DNA za pomocą kierowanej przez DNA polimerazy RNA. Powstające matryce RNA mają ujemną polarność oraz zawierają odpowiednie sekwencje końcowe umożliwiające rozpoznanie matrycy przez aparat syntetyzujący RNA wirusa. Alternatywnie, zastosowane mogą zostać również matryce RNA o pozytywnej polarnoś ci, które zawierają odpowiednie sekwencje koń cowe umoż liwiają ce aparatowi syntetyzującemu RNA rozpoznanie matrycy. Ekspresja z matryc RNA o pozytywnej polarności może zostać uzyskana poprzez transfekcję plazmidami posiadającymi promotory rozpoznawane przez zależną od DNA polimerazę RNA. Przykładowo, plazmidowe DNA kodujące matryce pozytywnego RNA pod kontrolą promotora T7 mogą zostać zastosowane w połączeniu z systemem T7 wirusa wakcinii.

Bicistroniczne RNA mogą zostać skonstruowane celem umożliwienia wewnętrznej inicjacji translacji sekwencji wirusowych oraz celem umożliwienia ekspresji sekwencji kodujących obce białka z regularnego miejsca inicjacji transkrypcji lub vice versa. Alternatywnie, obce białko moż e ulegać ekspresji z wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, w której to jednostka transkrypcji ma miejsce inicjacji oraz poliadenylacji. W kolejnym wykonaniu, obcy gen jest wstawiony do genu NDV, w taki sposób, że powstające białko jest białkiem fuzyjnym.

Matryce wirusowego RNA rekombinowanych mutantów wirusa choroby Newcastle z niniejszego wynalazku mogą zostać zastosowane do transfekcji stransformowanej linii komórkowej, produkującej zależną od RNA polimerazę RNA oraz umożliwiającej komplementację. Alternatywnie, plazmid ulegający ekspresji pod odpowiednim promotorem może zostać zastosowany do wirusowo specyficznej (chimerycznej) transfekcji RNA. Komplementacja może zostać osiągnięta również poprzez zastosowanie wirusa pomocniczego dostarczającego zależną od RNA polimerazę RNA. Dodatkowo, opisany został również niezależny od wirusa system replikacji dla wirusa choroby Newcastle. Minimalna liczba białek wirusa choroby Newcastle wymaganych do specyficznej replikacji i ekspresji wirusa to trzy białka L, P i NP, które mogą ulegać ekspresji z plazmidów poprzez system T7 wakcinii. W kolejnym wykonaniu, jeśli do uzupełnienia wirusowego genomu zastosowane zostaną plazmidy kodujące antygenomową kopię genomu NDV, minimalnym zestawem wymaganym do specyficznej replikacji i ekspresji wirusa są białka L i P. Kiedy antygenomowa kopia genomu NDV ulega transkrypcji, białko polimerazy np. jest pierwszym białkiem ulegającym transkrypcji, a zatem nie jest koniecznym dostarczanie dodatkowej polimerazy NP w pozycji trans.

Ekspresja produktów ekspresji oraz/i chimerycznych wirionów otrzymanych może w sposób korzystny zostać zastosowana w szczepionkach. Produkty ekspresji i chimeryczne wiriony niniejszego wynalazku mogą zostać zmodyfikowane, tak aby stworzyć szczepionki przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów, w tym antygenów wirusowych, nowotworowych oraz autoantygenów biorących udział w chorobach autoimmunologicznych.

W szczególności, chimeryczne wiriony niniejszego wynalazku mogą zostać zmodyfikowane tak aby stworzyć szczepionki przeciwko HIV, gdzie immunogenny poliopeptyd z gp 160, oraz/lub z wewnętrznych białek HIV jest wprowadzony do białka glikoproteiny HN celem stworzenia szczepionki zdolnej do wzbudzania odpowiedzi immunologicznej zarówno typu humoralnego jak i komórkowego. Zastosowanie wirusa choroby Newcastle do tego celu jest szczególnie atrakcyjne, ponieważ wirus choroby Newcastle nie jest patogenny dla człowieka. Zastosowanie rekombinowanego wirusa choroby Newcastle, celem podawania antygenów nowotworowych, jest szczególnie atrakcyjne wziąwszy pod uwagę znane właściwości antyneoplastyczne oraz immunostymulujące tego wirusa.

PL 201 738 B1

3.1 Definicje

Jak zastosowano tutaj, następujące terminy mają wskazane znaczenie:

cRNA = anty-genomowe RNA

HIV = ludzki wirus niedoboru immunologicznego

L = duż e biał ko

M = biał ko matriks (znajduje się wewną trz otoczki)

MDCK = komórki końskiej nerki Madin Darby

MDBK = komórki nerki bydlęcej Madin Darby moi = wielokrotność infekcji

NA = neuraminidaza (glikoproteina otoczkowa)

NDV = wirus choroby Newcastle

NP = nukleobiałko (związane z RNA i wymagane do aktywności polimerazy RNA)

NS = białko niestrukturalne (o nieznanej funkcji) nt = nukleotyd

PA, PB1, PB2 = kierowane przez RNA komponenty polimerazy RNA

RNP = rybonukleoproteina rRNP = rekombinowana RNP vRNA = genomowe RNA wirusa WSN = wirus grypy A/WSN/33 wirus WSN-HK: ponownie złożony wirus zawierający siedem genów z wirusa WSN oraz gen NA z wirusa grypy A/HK/8/68.

4. Opis rycin

Fig. 1. Schemat minigenomu NDV. Górna ilustracja przedstawia plazmid PNDVCAT zawierający promotor T7; sekwencję końcową 5' (5' koniec genomowego RNA, 191nt); wstawione nukleotydy (CTTAA) ; 667nt z CAT ORF; 3' końcowa sekwencja (3' koniec genomowego RNA, 121 nt) miejsca dla Bbsl i nukleaz. Niższa ilustracja przedstawia chimericzne NDV-CAT RNA powstające z transkrypcji in vitro. W wyniku opartej na NDV-amplifikacji oraz transkrypcji chimerycznego NDV-CAT minigenomu, aktywność CAT jest wykrywana w stransfekowanych komórkach.

Fig. 2A-C. Schemat wektorów ekspresyjnych PTM1. PTM1-NP koduje białko NP z NDV. PTM1-P koduje białko P z NDV P. PTM1-L koduje białko L z NDV.

Fig. 3. Sekwencja RNA z 5' i 3' niekodujących regionów NDV (+ sens) Sekwencje 5' do genu CAT stanowią 121 nt z 5' niekodującego regionu końcowego z pozytywnego genomu NDV zawierającej 65 nt sekwencji liderowej (wytłuszczone) oraz 56 nt z UTR genu Np. Sekwencje 3' do genu CAT stanowią wstawione nukleotydy cuuaa (poniżej) oraz 191 nt z niekodującego regionu pozytywnego genomu NDV zawierające 127 nt z UTR genu dla L, po których następuje 64 nt regionu zapowiadającego (wytłuszczony).

Fig. 4A-B Schemat struktury rekombinowanych klonów NDV. RYC 4B, stanowi zakaźny NDV produkujący Env i Gag z HIV. Górny panel, Env I Gag z HIV znajdują się pomiędzy genami M i L. Niższy panel, Env i Gag z HIV są 3' do genu NP.

Fig. 5 Schemat 3' i 5' końców z NDV porównanych z sekwencją Kurilla i wsp. 1985 Virology 145:203-212 (3 ' koniec) oraz Yusoff i wsp. 1987 Nucleic Acids Research 15:3961-3976 (5' koniec)

Fig. 6 Oparta na plazmidzie technika odwrócenia dla opartej na NDV ekspresji obcego genu. Komórki są infekowane rekombinowanym wirusem wakcinii produkującym polimerazę T7. Dodatkowo, komórki są transfekowane 1) DNA plazmidowym kodującym białka L, NP i P z NDV pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (pTM1-L, pTM1-NP i pTM1-P, odpowiednio) oraz 2) plazmid DNA kodujący chimeryczny minigenom NDV-CAT pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (pT7-NDV-CAT-RB). Właściwy koniec 3' z minigenomie NDV-CAT został osiągnięty w oparciu o cięcie ułatwione sekwencją rybozymu (KB). Amplifikacja i transkrypcja chimerycznego genomu NDV-CAT prowadzi do aktywności CAT wykrywalnej w stransfekowanych komórkach. Nie kodujące regiony na 3' i 5' końcach minigenomu NDV-CAT są przedstawione jako czarne kwadraty.

Fig. 7 Uwalnianie NDV z syntetycznego DNA. Komórki są infekowane rekombinowanym wirusem wakcinii produkującym polimerazę T7. Dodatkowo, komórki są transfekowane 1) DNA plazmidowym kodującym białka L, NP I P z NDV pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (pTM1-L, pTM1-NP i pTM1-P, odpowiednio) oraz 2) plazmid DNA kodujący chimeryczny minigenom NDV-CAT pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (pT7-NDV+-RB). Właściwy koniec 3' z antygenomie NDV został osiągnięty w oparciu o cięcie ułatwione sekwencją rybozymu (RB). Amplifikacja i transkrypcja antygenomu

PL 201 738 B1

NDV prowadzi do uwolnienia zakaźnych wirusów NDV. Niekodujące regiony na 3' i 5' końcach antygenomu NDV są przedstawione jako czarne kwadraty.

5. Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy genetycznie zmodyfikowanych wirusów choroby Newcastle oraz wektorów wirusowych, które mają ekspresję dla heterologicznych genów lub zmutowanych genów wirusa choroby Newcastle lub dla kombinacji genów wirusowych otrzymanych z różnych szczepów wirusa choroby Newcastle. Wynalazek dotyczy konstrukcji i zastosowania rekombinowanych ujemnoniciowych matryc wirusowego RNA dla NDV, które mogą być użyte wraz z zależną od wirusowego RNA polimerazą RNA, celem ekspresji produktów genów heterologicznych w odpowiednich komórkach gospodarza i/lub celem uwolnienia heterologicznego genu w cząsteczkach wirusa. Produkt genu heterologicznego jest peptydem lub białkiem otrzymanym z genomu ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego. Matryce RNA niniejszego wynalazku mogą zostać przygotowane zarówno in vitro jak i in vivo poprzez transkrypcje odpowiednich sekwencji DNA przy uż yciu zależ nej od DNA polimerazy RNA, takiej jak ta z bakteriofaga T7, T3, polimerazy SP6 lub polimerazy eukariotycznej takiej jak polimeraza I.

Rekombinowane matryce RNA mogą być zastosowane do transfekcji stabilnych/stransfekowanych linii komórkowych, które produkują białka zależnej od RNA polimerazy RNA umożliwiającej komplemetację, jak pokazano na drodze praktycznych przykładów. Transkrypty RNA ze sklonowanego DNA zawierającego region kodujący - w orientacji antysensownej - z genu acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) oflankowanej 3' i 5' końcowymi nukleotydami z NDV-CL RNA (California szczep/I 1914/1944- szczep) (Meindl i wsp., 1974 Virology 58:457-463) były transfekowane do komórek produkujących białka polimerazy NDV.

W korzystnym wykonaniu, zastosowany jest nie-wirusowy system replikacji celem odzyskania chimerycznego NDV, w którym palzmidowe DNA kodujące genom lub antygenom NDV ulega koekspresji z DNA plazmidowym kodującym minimalny zestaw białek wirusa choroby Newcastle wymaganych do specyficznej replikacji i ekspresji wirusa, jak pokazano na drodze praktycznych przykładów opisanych infra.

Zdolność do rekonstytucji NDV in vivo pozwala na zaprojektowanie nowych chimerycznych wirusów NDV, w których dochodzi do ekspresji obcych genów lub które mają ekspresję zmutowanych genów NDV. Zdolność do rekonstytucji NDV in vivo pozwala również na zaprojektowanie nowych chimerycznych NDV, w których dochodzi do ekspresji genów z różnych szczepów NDV. Jednym ze sposobów tego celu jest modyfikacja istniejących genów NDV. Przykładowo, gen HN może zostać zmodyfikowany celem, zawarcia obcych sekwencji w domenach zewnętrznych. Tam gdzie sekwencje heterologiczne są epitopami lub antygenami patogenów, tego rodzaju chimeryczne wirusy mogą być stosowane do indukcji ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko czynnikowi chorobowemu, z którego otrzymano dane determinanty.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, chimeryczne RNA jest konstruowane w taki sposób, że sekwencja kodująca otrzymana z regionu kodującego gp 160 z ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego jest wstawiona do sekwencji kodującej HN a NDV, zaś chimeryczny wirus jest produkowany poprzez transfekcję tego chimerycznego segmentu RNA do komórki gospodarza zainfekowanej dzikim typem NDV. W dalszej kolejności, takie chimeryczne wirusy powinny być zdolne do wzbudzania zarówno odpowiedzi humoralnej jak i komórkowej. Niniejszy wynalazek dotyczy również indukcji inteferonu i szlaków pokrewnych poprzez rekombinowane lub chimeryczne wirusy NDV.

Niniejszy wynalazek pozwala na zastosowanie wektorów wirusowych oraz chimerycznych wirusów, celem stworzenia szczepionek przeciwko szerokiemu zakresowi wirusów i/lub antygenów, w tym antygenów nowotworowych. Wektory wirusowe i chimeryczne wirusy niniejszego wynalazku mogą być zastosowane celem modulacji układu immunologicznego podmiotu poprzez stymulacje odpowiedzi humoralnej, komórkowej lub poprzez stymulacje tolerancji na antygen. Jak użyto tutaj, podmioty oznaczają: ludzi, naczelne, konie, krowy, owce, świnie, kozy, psy, koty, ptactwo i gryzonie. Przy dostarczaniu antygenów nowotworowych wynalazek może być zastosowany do leczenia podmiotów mających chorobę poddającą się odrzuceniu immunologicznemu, taką jak guzy rozlane lub małe guzy lite. Uważa się, że dostarczanie antygenów nowotworowych poprzez wektory wirusowe i opisane tu wirusy chimeryczne może być korzystnym środkiem leczenia stosowanym po usunięciu dużych guzów litych. Wynalazek może być również zastosowany do leczenia podmiotów u których podejrzewa się chorobę nowotworową.

PL 201 738 B1

Wynalazek w praktycznych przykładach jest zilustrowany przy użyciu NDV-CL (California szczep/1914/1944-szczep), jednakże, może zostać zastosowany jakikolwiek szczep NDV.

5.1. Konstrukcja rekombinowanych matryc RNA.

Zidentyfikowano prawidłową sekwencję nukleotydową 5' i 3' końca antysensownych genomów RNA z NDV. Sekwencja nukleotydowa 5' i 3' końców antysensownego genomu RNA znacząco różni się od sekwencji 3' końca NDV poprzednio opisanej jak pokazano na Ryc 5. Identyfikacja właściwej sekwencji nukleotydowej 5' i 3' końców pozwala po raz pierwszy na modyfikacje rekombinowanych matryc RNA dla NDV, ekspresję rekombinowanych matryc RNA oraz uwalnianie rekombinowanych cząsteczek NDV. Niniejszy wynalazek obejmuje nie tylko końce 3' i 5' mające sekwencję nukleotydową pokazaną na Fig. 5, ale również jakiekolwiek modyfikacje lub mutacje dotyczące tych końców lub jakichkolwiek ich fragmentów, które wciąż zachowują funkcje końców dzikiego typu, tj. sygnały wymagane przez aparat syntetyzujący wirusowy RNA do rozpoznania matrycy.

Sekwencje kodujące heterologiczny gen oflankowane przez komplementarne wirusowe miejsce wiązania polimerazy/promotor, tj. komplementarny wirusowy 3'-NDV koniec lub komplementarne końce wirusowe 3' i 5' mogą zostać skonstruowane stosując techniki znane fachowcom. Powstające matryce mogą być negatywnie polarne i zawierać odpowiednie sekwencje terminalne, umożliwiające rozpoznanie matrycy przez aparat syntetyzujący wirusowy RNA. Alternatywnie, zastosowane mogą zostać pozytywnie-polarne matryce RNA, które zawierają odpowiednie sekwencje końcowe umożliwiające rozpoznanie przez aparat syntetyzujący RNA rozpoznanie matrycy. Cząsteczki rekombinowanego DNA zawierające te sekwencje hybrydowe mogą być wklonowane i ulegać transkrypcji przez zależną od DNA polimerazę RNA, taką jak polimerazy bakteriofaga T7, T3, polimerazy SP6 lub polimerazy eukariotycznej takiej jak polimeraza I i tym podobnych, celem produkcji in vitro lub in vivo rekombinowanych matryc RNA, które posiadają odpowiednie sekwencje wirusowe pozwalające na rozpoznanie przez polimerazę i aktywność.

W wynalazku, jakakolwiek sekwencja heterologiczna moż e zostać wbudowana do chimerycznych wirusów niniejszego wynalazku, w tym nie ograniczając się do antygenów takich jak 1) antygeny charakterystyczne dla patogenu; 2) antygeny charakterystyczne dla choroby autoimmunizacyjnej; 3) antygenów charakterystycznych dla alergenów oraz 4) antygenów charakteryzujących nowotwory. Przykładowo, sekwencje genów heterologicznych, które mogą zostać zmodyfikowane do chimerycznych wirusów wynalazku dotyczą, ale nie ograniczają się do epitopów ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego (HIV) takich jak gp 160; antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBsAg); glikoprotein herpes wirusa (np. gD, gE); VP1 z poliowirusa oraz determinanty antygenowe takich patogenów niewirusowych jak bakterie i pasożyty, aby wspomnieć chociaż kilka.

Antygeny charakterystyczne dla chorób autoimmunologicznych będą zazwyczaj tymi otrzymanymi z powierzchni komórki, cytoplazmy, jądra komórkowego, mitochondriów i tym podobnych tkanek ssaczych, w tym antygeny charakterystyczne dla cukrzycy, stwardnienia rozsianego, tocznia układowego rumieniowatego, reumatycznego zapalenia stawów, anemii złośliwej, choroby Addisona, sklerodermy, cukrzycy młodzieńczej, atroficznego zapalenia przewodu pokarmowego.

Antygeny, które są alergenami są zazwyczaj białkami lub glikoproteinami, w tym antygenami otrzymanymi z pyłków, kurzu, pleśni, spór, insektów i żywności.

Antygeny, charakterystyczne dla nowotworów zazwyczaj będą otrzymywane z powierzchni komórki, cytoplazmy, jądra komórkowego, organelii i tym podobnych z komórek tkanki nowotworowej. Przykłady dotyczą antygenów charakterystycznych dla białek nowotworowych, w tym białek kodowanych przez mutowane onkogeny; białek wirusowych związanych z nowotworami, oraz glikoprotein. Nowotwory dotyczą ale nie są ograniczone do tych otrzymanych z nowotworów warg, nosogardzieli, krtani oraz jamy ustnej, przełyku, żołądka, odbytnicy, odbytu, okrężnicy, wątroby, pęcherza moczowego, trzustki, tchawicy, płuc oraz oskrzeli, malanomy skóry, raka piersi, macicy, jajowodów, jajników, nerek, mózgu i innych części układu nerwowego, tarczycy, prostaty, jąder, choroby Hodgkina, chłoniaków nie -Hodgkina , mielomy oraz białaczki.

W jednym specyficznym wykonaniu wynalazku, sekwencje heterologiczne są otrzymane z genomu ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego (HIV), korzystnie ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego 1 lub ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego 2. W kolejnym wykonaniu wynalazku, heterologiczne sekwencje kodujące mogą zostać wstawione do sekwencji kodujących gen NDV w taki sposób, że produkt genu chimerycznego jest produkowany wraz z heterologiczną sekwencją peptydową wewnątrz białka wirusowego NDV. W takim wykonaniu wynalazku sekwencje heterologiczne mogą być również otrzymane z genomu ludzkiego wirusa niedoboru immunologiczne10

PL 201 738 B1 go, korzystnie ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego -1 lub ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego -2.

W przypadku kiedy heterologiczne sekwencje pochodzą z HIV, takie sekwencje mogą dotyczyć, ale nie są ograniczone do sekwencji otrzymanych z genu env (tj. sekwencje kodujące całość lub część gp160, gp120, i/lub gp41), genu po1 (tj sekwencje kodujące całość lub część odwrotnej transkryptazy, enzodnukleazy, proteazy i/lub integrazy), gen gag, (tj. sekwencje kodujące całość lub część sekwencji kodujących p7. p6. p55, p17/18, p24/25) tat, rev, nef, vif; vpu, vpr, i/lub vpx.

W jeszcze innym wykonaniu sekwencje genu heterologicznego, które mogą zostać zmodyfikowane do chimerycznego wirusa dotyczą tych kodujących białka z aktywnościami immunowzmacniającymi. Przykładami immunomodulatorowych białek są cytokiny, interferon typu 1, gamma interferon, czynniki stymulujące wzrost kolonii, interleukina -1, -2, -4, -5, -6, -12.

Jednym ze sposobów konstrukcji tych molekuł hybrydowych jest wstawienie heterologicznej sekwencji kodującej do DNA komplementarnego genowi NDV, w taki sposób, że sekwencja heterologiczna jest oflankowana przez sekwencje wirusowe wymagane do aktywności polimerazy wirusowej., tj. miejsce wiązania polimerazy wirusowej/promotor, oznaczane tutaj jako miejsce wiązania polimerazy wirusowej, tj. miejsce wiązania polimerazy wirusowej/promotor, oznaczane tutaj jako miejsce wiązania polimerazy wirusowej oraz miejsce poliadenylacji. W preferowanym wykonaniu, heterologiczna sekwencja kodująca jest oflankowna przez sekwencje wirusowe, zawierające promotory replikacji z końca 5' i 3', sekwencje początku i końca genu oraz sygnały pakowania, które znajdują się na 5' i/lub 3' końcach.

W alternatywnym podejściu, oligonukleotydy kodujące miejsce wiązania polimerazy, tj. komplementarne do 3' końca lub obu końców segmentów genomowych wirusa mogą być wligowane do heterologicznej sekwencji kodującej celem skonstruowania cząsteczki hybrydowej. Umieszczenie obcego genu lub segmentu obcego genu wewnątrz sekwencji docelowej było wcześniej podyktowane przez obecności odpowiednich miejsc dla enzymów restrykcyjnych. Jednakże, ostatnie postępy w biologii molekularnej zmniejszyły ten problem w znacznym stopniu. Miejsca dla enzymów restrykcyjnych mogą być łatwo wprowadzone gdziekolwiek w sekwencji docelowej dzięki zastosowaniu ukierunkowanej mutagenezy np. patrz na przykład, techniki opisywane przez Klunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82,488). Zmiany w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), opisane tam, również umożliwiają specyficzne insercje sekwencji (tj. miejsc dla enzymów restrykcyjnych) oraz ułatwiają konstrukcję cząsteczek hybrydowych. Alternatywnie, reakcje PCR mogą być zastosowane celem przygotowania dwuniciowych cząsteczek DNA zawierających promotor kierowanej przez DNA polimerazy RNA. (np. bakteriofagów T3, T7 lub SP6) oraz sekwencję hybrydową zawierającą gen heterologiczny oraz miejsce wiązania polimerazy z NDV. Matryce RNA powinny następnie ulec transkrypcji bezpośrednio z tego rekombinowanego DNA. W jeszcze innym wykonaniu, rekombinowane matryce mogą być przygotowane poprzez zligowanie RNA pochodzących z genu heterologicznego o negatywnej polarności oraz wirusowego miejsca wiązania polimerazy przy użyciu ligazy RNA. Wymagania sekwencji dla aktywności wirusowej polimerazy oraz konstruktów stosowanych w wynalazku są opisane w podrozdziałach poniżej.

5.1.1 Wprowadzenie sekwencji genu heterologicznego do genów HP, P, NP, M, F oraz L.

Segmenty genu kodującego białka HP, P, NP, M, F oraz L mogą zostać zastosowane do wstawienia produktów genów heterologicznych. Wstawienie sekwencji obcego genu do któregokolwiek z tych segmentów może być uzyskane albo poprzez komplementarne zastą pienie wirusowego regionu kodującego genem obcym, bądź poprzez częściowe zastąpienie. Komplementarne zastąpienie najlepiej jest osiągane poprzez zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy PCR-em. Krótko, starter A powinien zawierać, od 5' do 3' końca: unikalne miejsce restrykcyjne takie jak miejsce restrykcyjne klasy IIS (tj. enzym „przenoszący, rozpoznający specyficzną sekwencję, ale tnący DNA - powyżej lub poniżej sekwencji), odcinek nukleotydów komplementarny do regionu genu NDV oraz odcinek nukleotydów komplementarny do C-końca kodującego odcinek produktu obcego genu. Starter B powinien zawierać od 5' do 3' końca: unikalne miejsce restrykcyjne, odcinek nukleotydów komplementarny do genu NDV oraz odcinek nukleotydów odpowiadający %' kodującej części obcego genu. Po reakcji PCR korzystającej z tych starterów oraz sklonowanej kopii obcego genu, produkt może zostać wycięty i sklonowany przy użyciu unikalnych miejsc restrykcyjnych. Trawienie enzymem klasy IIS oraz transkrypcja oczyszczona polimeraza fagowa powinno doprowadzić do cząsteczki RNA zawierającej dokładnie nie ulegające translacji końce genu NDV ze wstawką obcego genu. W alternatywnym wykonaniu, reakcje PCR powinny zostać zastosowane celem przygotowania dwuniciowego DNA zawieraPL 201 738 B1 jącego sekwencje promotora bakteriofaga oraz sekwencje genu hybrydowego, tak aby matryce RNA mogły być transkrybowane bezpośrednio bez klonowania.

5.1.2. Wstawienie sekwencji genu heterologicznego do genu HN.

Aktywności hemaglutyniny i neuramidazy z NDV są kodowane przez pojedynczy gen. Białko HN jest główną powierzchniową glikoproteiną wirusa. Dla wielu wirusów, takich jak wirus grypy, hemaglutynina i neuramidaza zawierają szereg miejsc antygenowych. W konsekwencji białko to jest potencjalnym celem odpowiedzi humoralnej po zakażeniu. A zatem, substytucja miejsc antygenowych wewnątrz HN częścią obcego białka może dostarczyć intensywnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko obcemu peptydowi. Jeśli sekwencja jest wstawiona wewnątrz cząsteczki HN i ulega ekspresji na zewną trz HN stanie się immunogenna. Przykładowo, peptyd otrzymany z gp 160 HIV może zastąpić miejsce antygenowe białka HN prowadząc do wzbudzenia odpowiedzi humoralnej. W innym podejściu, sekwencja obcego peptydu może zostać wstawiona wewnątrz miejsca antygenowego bez usuwania jakichkolwiek sekwencji wirusowych. Produkty ekspresji takich konstruktów mogą być użyteczne w szczepionkach przeciwko obcym antygenom, i mogą naprawdę pokonać dyskutowany wcześniej problem o propagacji rekombinowanego wirusa w szczepionym organizmie. Nienaruszona czą steczka HN z substytucją jedynie w miejscach antygenowych może umożliwiać funkcjonowanie HN, a zatem umożliwiać konstrukcje żywego wirusa. Tym samym wirus może być hodowany bez potrzeby dodatkowych funkcji pomocniczych. Wirus może również ulec atenuacji na inne sposoby celem uniknięcia jakiegokolwiek niebezpieczeństwa przypadkowej ucieczki.

Inne konstrukty hybrydowe mogą zostać wykonane celem uzyskania na powierzchni komórek i białek uwalnianych z komórki. Jako glikoproteina powierzchniowa HN ma sekwencję sygnałową cięcia niezbędną dla transportu do powierzchni komórek oraz sekwencje na C-końcu umożliwiając zakotwiczenie. Celem uzyskania pełnego białka na powierzchni komórki koniecznym może okazać się zastosowanie tych sygnałów HN celem stworzenia białka hybrydowego. W tym przypadku, białko fuzyjne może ulegać ekspresji jako oddzielne białko fuzyjne z dodatkowego promotora wewnętrznego. Alternatywnie, jeśli tylko obecne są sygnały transportowe i nieobecna jest domena kotwicząca, białko może być wydzielane poza komórkę.

5.1.3. Konstrukcja bicistronicznego RNA i ekspresja białka heterologicznego.

Bicistroniczne mRMA może zostać skonstruowane celem umożliwienia wewnętrznej inicjacji translacji sekwencji wirusowych i umożliwienia ekspresji obcych białek kodujących sekwencje z regularnego końcowego miejsca inicjacji. Alternatywnie, sekwencja bicistronicznego mRNA może zostać skonstruowana tam gdzie dochodzi do translacji sekwencji wirusowej z regularnej końcowej otwartej ramki odczytu, podczas gdy sekwencja obca jest inicjowana z miejsca wewnętrznego. Zastosowane mogą zostać pewne wewnętrzne sekwencje wejścia rybosomu (IRES). Wybrane sekwencje IRES powinny być krótkie, tak aby nie wpływać na ograniczenia pakowania wirusa choroby Newcastle. A zatem, korzystnym jest jeśli IRES wybrany do takie bicistronicznego podejścia nie powinien mieć więcej niż 500 nukleotydów długości, z mniej niż 250 preferowanymi nukleotydami. Korzystne jest, aby zastosowane IRES nie miały wspólnych elementów lub homologii strukturalnej z elementami z pikornawirusów. Korzystne elementy IRES dotyczą, ale nie są ograniczone do ssaczych BiP IRES oraz IRES z wirusa zapalenia wątroby typu C. Alternatywnie, obce białko może ulegać ekspresji z nowej wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, w której jednostka transkrypcji ma miejsce inicjacji i poliadenylacji. W kolejnym wykonaniu, obcy gen jest wstawiony do genu NDV w taki sposób, że powstające białko jest białkiem fuzyjnym.

5.2 Ekspresja produktów genu heterologicznego przy użyciu rekombinowanej matrycy RNA.

Przygotowane rekombinowane matryce jak opisano powyżej, mogą być użyte na wiele sposobów celem ekspresji odpowiednich produktów genu heterologicznego. W jednym z wykonań rekombinowana matryca może być zastosowana do transfekcji odpowiednich komórek gospodarza, może kierować ekspresją produktu genu heterologicznego na wysokim poziomie. Systemy komórek gospodarza, które dostarczają wysokich poziomów ekspresji dotyczą ciągłych linii komórkowych, które uzupełniają funkcje wirusowe, takie jak np. linie superinfekowane NDV, liniie komórkowe zmodyfikowane tak aby pokrywać funkcje NDV, itp.

W alternatywnym wykonaniu wynalazku rekombinowane matryce mogą zostać zastosowane do transfekcji linii komórkowych, które produkują białko polimerazy wirusowej celem osiągnięcia ekspresji heterologicznego produktu genu. Do chwili obecnej, stransformowane linie komórkowe produkujące białko polimerazy takie jak białko L mogą być zastosowane jako odpowiednie komórki gospodarza.

PL 201 738 B1

Komórki gospodarza mogą być w podobny sposób zmodyfikowane celem dostarczenia dodatkowych funkcji wirusowych lub dodatkowych funkcji takich jak NP. lub HN.

W kolejnym wykonaniu, wirus pomocniczy moż e dostarczać biał ka polimerazy RNA wykorzystywanego przez komórki celem osiągnięcia ekspresji produktu genu heterologicznego.

W kolejnym wykonaniu, komórki mogą zostać stransfekowane biał kami takimi jak NP., P i L. Przykłady takich wektorów są przedstawione na FIG. 2a-2C.

5.3 Przygotowanie ujemnoniciowego chimerycznego wirusa RNA.

Celem przygotowania chimerycznego wirusa, zmodyfikowane RNA, cDNA lub RNA z NDV kodujące genom NDV i/lub obce białka w orientacji dodatniej i ujemnej mogą być zastosowane celem transfekcji komórek dostarczających białka wirusowe oraz funkcje wymagane do replikacji i uwolnienia, bądź takie zainfekowane „ojcowskim wirusem NDV. W podejściu alternatywnym, plazmidy kodujące genomowe lub antygenomowe NDV RNA, zarówno typu dzikiego jak i zmodyfikowanego, mogą zostać kotransfekowane do komórek gospodarza z plazmidami kodującymi białka polimerazy wirusowej P i L, a ponieważ białko polimerazy NP. jest pierwszym białkiem transkrybowanym poprzez antygenomową kopię NDV, nie jest koniecznym aby dodatkowo dostarczać polimerazę np. in trans.

W wykonaniu niniejszego wynalazku technika odwrócenia może zostać zastosowana celem skonstruowania chimerycznego, ujemnoniciowego wirusa RNA, który zawiera regiony niekodujące z ujemnoniciowego wirusa RNA, które są istotne dla rozpoznania przez wirusowe polimerazy oraz istotne dla sygnałów pakowania niezbędnych do powstania dojrzałego wirionu.

Syntetyczne rekombinowane DNA i RNA mogą ulec replikacji i uwolnieniu do zakaźnych cząstek wirusowych dzięki którejkolwiek z technik znanych fachowcom, jak opisano w U.S. Patent Nr 5,166,057 złożonym 24 listopada 1992; w U.S. Patent Nr 5,854,037 złożonym 29 grudnia 1998; w European Patent Publication EP 0702085A1, opublikowanym 20 lutego 1996; w U.S. Patent Application Serial Nr 09/152,845; w International Patent Publications PCT W097/12032 opublikowanych 3 kwietnia 1997; W096/34625 opublikowanym 7 listopada 1996; w European Patent Publication EP-A780475; WO 99/02657 opublikowanym 21 stycznia 1999; WO 98/53078 opublikowanym 26 listopada 1998; WO 98/02530 opublikowanym 22 stycznia 1998; WO 99/15672 opublikowanym 1 kwietnia 1999; WO 98/13501 opublikowanym 2 kwietnia 2,1998; WO 97/06270 opublikowanym 20 lutego 1997; oraz EPO 780 47SA1 opublikowanym 25 czerwca 1997, z których każdy jest tutaj zawarty poprzez odniesienie.

Istnieje szereg różnorodnych podejść, które mogą zostać zastosowane w metodzie odwróconej celem uwolnienia negatywnej nici wirusów RNA. Po pierwsze, rekombinowane RNA są syntetyzowane z rekombinowanej matrycy DNA i rekonstytuowane in vitro za pomocą oczyszczonego kompleksu polimerazy celem utworzenia rekombinowanych rybonukleoprotein (RNP), które mogą być zastosowane do transfekcji komórek. W kolejnym podejściu, osiągnięta została znacznie wyższa wydajność, jeśli białka polimerazy wirusowej są obecne podczas transkrypcji syntetycznego RNA zarówno in vitro jak i in vivo. Przy tym sposobie syntetyczne RNA mogą ulec transkrypcji z plazmidów cDNA, które są albo kotranskrybowane in vitro z palazmidami kodującymi białka polimerazy, lub transkrybowane in vivo w obecności białek polimerazy, tj. komórkach, w które w sposób chwilowy lub stały produkują białka polimerazy.

W alternatywnym wykonaniu, połączono techniki odwrotnej transkrypcji i ponownego skł adania co może zostać uzyskane celem stworzenia atenuowanych wirusów mających wymagane epitopy dla szczepionek w segmentowanych wirusach RNA. Przykładowo, atenuowany (wytworzone na drodze naturalnej selekcji, mutagenezy lub techniki odwróconej transkrypcji) oraz szczep niosący pożądany epitop szczepionki (wytworzone na drodze naturalnej mogą być ko-infekowane do gospodarza umożliwiającego ponowne złożenie po zajściu ponownego złożenia, nowe wirusy mogą zostać wyizolowane, a ich genom zidentyfikowany dzięki analizom hybrydyzacyjnym. W dodatkowych, opisywanych tutaj wykonaniach, produkcja zakaźnego chimerycznego wirusa może zostać replikowana w systemach komórek gospodarzy, które produkują białko polimerazy wirusa NDV (tj. systemy ekspresji wirus/gospodarz, stransformowane linie zmodyfikowane tak aby produkować białko polimerazy, itp.), tak aby chimeryczne zakaźne wirusy były uwalniane. W tym przypadku, nie musi być stosowany wirus pomocniczy ponieważ jego funkcje spełniają produkowane wirusowe białka polimerazy.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jakakolwiek technika znana fachowcom może zostać zastosowana celem osiągnięcia replikacji i uwolnienia chimerycznych wirusów. Jedno z podejść dotyczy dostarczenia białek wirusowych i funkcji wymaganych do replikacji in vitro zanim dojdzie do transfekcji

PL 201 738 B1 komórek gospodarza. W takim wykonaniu, białka wirusowe mogą być dostarczone w postaci wirusa dzikiego typu, wirusa pomocniczego, oczyszczonych białek wirusowych lub rekombinowanych białek wirusowych. Białka wirusowe mogą zostać dostarczone przed, w trakcie lub po transkrypcji syntetycznego cDNA lub RNA kodujących chimerycznego wirusa. Cała mieszanina może zostać użyta do stransfekowania komórek gospodarza.

W kolejnym wykonaniu, białka wirusowe i funkcje wymagane do replikacji mogą zostać dostarczone przed lub w trakcie transkrypcji syntetycznych cDNA lub RNA kodujących chimerycznego wirusa. W takim wykonaniu, białka wirusowe i funkcje wymagane do replikacji są dostarczane w postaci wirusa dzikiego typu, wirusa pomocniczego, ekstraktów wirusowych, syntetycznych DNA lub RNA, które produkują białka wirusowe są wprowadzane do komórki gospodarza na drodze infekcji lub transfekcji. Ta infekcja/transfekcja ma miejsce przez lub równocześnie do indukcji syntetycznych cDNA lub RNA kodujących chimerycznego wirusa.

W wynalazku, komórki zmodyfikowane celem ekspresji wszystkich genów wirusowych z NDV mogą prowadzić do produkcji zakaźnego wirusa chimerycznego zawierającego pożądany genotyp; tym samym unika się konieczności systemu selekcyjnego. Teoretycznie, można po kolei wymieniać jeden z sześciu genów lub NDV za pomocą obcej sekwencji. Jednakże, koniecznym elementem tego jest możliwość propagacji defektywnego wirusa (defektywnego ponieważ brak lub zahamowana jest ekspresja bułka). Istnieje szereg możliwych rozwiązań dla tego problemu. W jednym z podejść wirus posiadający zmutowane białko może być hodowany w liniach komórkowych, które są konstruowane celem stałej ekspresji dzikiego typu tego samego białka. W ten sposób, linia komórkowa komplementuje mutacje wirusa. Podobne techniki mogą zostać zastosowane celem skonstruowania stransformowanych linii komórkowych, które stale produkują którykolwiek z genów NDV. Linie komórkowe zmienione celem ekspresji białek wirusowych mogą być zastosowane celem zniesienia defektu rekombinowanego wirusa i tym samym propagować go.

Alternatywnie, pewne naturalne systemy gospodarzy mogą być dostępne celem propagacji rekombinowanego wirusa. W jeszcze innym wykonaniu, białka wirusowe i funkcje wymagane do replikacji mogą być dostarczone jako materiał genetyczny w formie syntetycznego cDNA lub RNA, tak że ulegają one ko-transkrypcji wraz z syntetycznym cDNA i RNA kodujących wirusa chimerycznego. W szczególnie korzystnym wykonaniu, plazmidy, które produkują chimerycznego wirusa i wirusowa polimerazę oraz/lub inne funkcje wirusowe są ko-transfekowane do komórek gospodarza, jak opisano w przykładach, patrz rozdział 11 poniżej. Kolejnym podejściem w propagacji rekombinowanego wirusa jest zastosowanie ko-kultywacji z wirusem typu dzikiego. Może to zostać wykonane poprzez proste wzięcie rekombinowanego wirusa i ko-infekcje komórek tym i innym wirusem typu dzikiego (korzystnie szczep szczepionkowy). Wirus dzikiego typu powinien komplementować defektywny produkt genu i umożliwić wzrost zarówno wirusa typu dzikiego jak i rekombinowanego wirusa. Alternatywnie, zastosowany może zostać wirus pomocniczy celem wzmocnienia propagacji rekombinowanego wirusa. W kolejnym wykonaniu, matryce syntetyczne mogą ulegać replikacji w komórkach koinfekowanych rekombinowanymi wirusami, które produkują białko polimerazy wirusa NDV. W rzeczywistości, metoda ta może zostać zastosowana celem uwolnienia rekombinowanych zakaźnych wirusów zgodnie z wynalazkiem. Do chwili obecnej, białka polimerazy NDV mogą być produkowane w jakimkolwiek wektorze/komórce gospodarza, w tym wektorach wirusowych (np. wirus wakcinii, adenowirus, bakulowirus, itp.) lub w liniach komórkowych produkujących białko polimerazy (np. patrz Krystal i wsp., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709-2713). Co więcej, infekcja komórek gospodarza produkujących wszystkich sześć białek NDV może doprowadzić do produkcji zakaźnych cząstek wirusa chimerycznego. System ten mógłby wyeliminować potrzebne systemu selekcyjnego ponieważ wszystkie powstające rekombinowane wirusy posiadałyby pożądany genotyp. Powinni się zauważyć, że możliwym jest skonstruowanie rekombinowanego wirusa bez zmiany żywotności wirusa. Te zmienione wirusy mogłyby być wówczas hodowane jako kompetentne i nie wymagać funkcji pomocniczych do replikacji.

5.4. Szczepionki z zastosowaniem chimerycznych wirusów.

Wynalazek obejmuje szczepionki zawierające zmodyfikowany ujemnoniciowy wirus RNA niniejszego wynalazku. Wynalazek obejmuje zastosowanie zmodyfikowanych rekombinowanych wirusów NDV, w szczepionkach nadających protekcje L przeciwko infekcjom NDV. W kolejnym wykonaniu, rekombinowane wirusy NDV niniejszego wynalazku mogą zostać wykorzystane jako wektory do produkcji obcych epitopów, które indukują odpowiedź odpornościową na jakikolwiek z szeregu patogenów. Wynalazek obejmuje szczepionki podawane ludziom i zwierzętom.

PL 201 738 B1

W szczególności wynalazek obejmuje szczepionki podawane zwierzętom domowym, w tym psom, kotom, dzikim zwierzętom, w tym lisom i skunksom; zwierzętom gospodarskim, w tym bydłu, koniom świniom, ptactwu, w tym kurom i indykom.

Wynalazek obejmuje szczepionkę skuteczną przeciwko ptasim czynnikom powodującym choroby w tym NDV, wirus choroby Mareka(MDV), Infectious Bursal Disease Virus (IBDV), Infectious Bronchitis Virus (IBV), Infectious Bursitis Virus, Chicken Anemia Virus (CAV), Infectious Laryngotracheitis Virus (ILV), Avian Leukosis Virus 20 (ALV), Reticuloendotheliosis Virus (RV) oraz Avian Influenza Virus.

W kolejnym wykonaniu, wynalazek obejmuje szczepionki korzystne przeciwko czynnikom powodującym choroby zwierząt domowych w tym wściekliźnie, nosówce i wirusowi białaczki kociej (FVL). W kolejnym wykonaniu wynalazek obejmuje szczepionki skuteczne celem obrony zwierząt gospodarskich przeciwko pryszczycy, wściekliźnie, księgosuszowi, ospie świń i w dalszej kolejności celem ochrony zwierząt dzikich przeciwko wirusowi wścieklizny. Atenuowane wirusy wytworzone dzięki metodzie odwrotnej mogą zostać zastosowane w opisywanych tutaj szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. Techniki metody odwróconej mogą być również zastosowane celem wytworzenia dodatkowych mutacji w innych genach ważnych do produkcji szczepionek tj. epitopy korzystnych szczepów szczepionkowych mogą być modyfikowane w atenuowane wirusy. Alternatywnie, całkowicie obce epitopy, w tym epitopy otrzymane z innych patogenów wirusowych i niewirusowych mogą zostać wprowadzone do atenuowanego szczepu. Przykładowo, antygeny niespokrewnionych wirusów takich jak HIV (gp160, gp120, gp41, antygeny pasożytów (np. malaria), antygeny bakteryjne lub grzybowe lub nowotworowe mogą być wstawione do atenuowanego szczepu. Alternatywnie, epitopy, które zmieniają tropizm wirusa in vivo mogą zostać włączone do chimerycznego atenuowanego wirusa wynalazku.

Jakakolwiek sekwencja genu heterologicznego może być wprowadzona do chimerycznych wirusów wynalazku celem zastosowania jako szczepionka. Korzystnie, epitopy indukujące protekcyjną odpowiedź immunologiczną wobec szeregu patogenów lub antygenów wiążących przeciwciała neutralizujące mogą ulegać ekspresji w rekombinowanym wirusie. Przykładowo, heterologiczne sekwencje genowe, które mogą być wbudowywane do chimerycznych wirusów dotyczą ale nie ograniczają się do: glikoprotein grypy, w szczególności H5, H7, epitop choroby Mareka, epitopów Infectious Bursal Disease Virus (EBDV), Infectious Bronchitis Virus (D3V), Chicken Anemia Virus (CAV), Infectious Laryngotracheitis Virus (ILV), Avian Leukosis Vims (ALV), Reticuloendotheliosis Virus (RV), Influenza

Virus (AIV), wirusa wścieklizny, wirusa białaczki kociej, nosówki, pryszcycy, księgosuszu i ospy świń (patrz. Fields i wsp. (ed.), 1991, Fundamental Virology. Second Edition. Raven Press, New York, włączone tutaj w całości przez odniesienie.

W kolejnym wykonaniu, sekwencje genu heterologicznego, które mogą być włączane do wirusów chimerycznych dotyczą tych, które kodują białka o aktywności immunostymulującej. Przykładami białek immunoaktywujących są cytokiny, interferon typu 1, gamma interferon, czynniki stymulujące wzrost kolonii, interleukina, interleukin -1, -2. -4, -5, -6, -12.

Dodatkowo, sekwencje genu heterologicznego, które mogą zostać wmontowane do chimerycznych wirusów wynalazku stosowanych w szczepionkach dotyczą sekwencji otrzymanych z ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego (HIV), korzystnie typu 1 lub typu 2. W preferowanym wykonaniu, immunogenny peptyd otrzymany z HIV, który może stanowić źródło antygenu może zostać wstawiony do chimerycznego NDV, tak że może wzbudzać odpowiedź immunologiczna. Takie otrzymane z HIV peptydy mogą dotyczyć, ale nie ograniczać się do sekwencji otrzymanych z genu env (tj kodujące wszystkie części gp160, gp120, i/lub r gp41), gen pol (tj., sekwencje kodujące całość lub część odwrotnej transkryptazy, endonukleazę, proteazę, i/lub integrazę), gen gag (tj. sekwencje kodujące całość lub część p7, p6, p55. pi 7/18, p24/25), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, i/lub vpx.

Inne sekwencje heterologiczne mogą być otrzymane z antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg); antygenów powierzchniowych wirusów zapalenia wątroby A lub C, glikoprotein wirusa Epstein Barr; glikoprotein ludzkiego brodawczaka; glikoprotein wirusa syncytialnego, wirusa paragrypy, wirusa Sendai, szympansiego wirusa 5 lub wirusa świnki; glikoprotein wirusa grypy, glikoprotein herpeswirusa (np. gD, gE); VP1 z poliowirusa, antygenowych determinant patogenów niewirusowych takich jak bakterie i pasożyty. W kolejnym wykonaniu, wszystkie fragmenty genów immunoglobulinowych mogą ulegać ekspresji. Przykładowo, regiony zmienne przeciwciał antyidiotypowych, które naśladują takie epitopy mogą zostać wstawione do chimerycznych wirusów wynalazku.

PL 201 738 B1

Inne sekwencje heterologiczne mogą być otrzymane z antygenów nowotworowych a powstające chimeryczne wirusy mogą być stosowane do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym prowadząc do regresji nowotworu in vivo. Takie szczepionki mogą być stosowane w połączeniu a innymi środkami terapeutycznymi, w tym chemioterapią, naświetlaniami, chirurgią, transplantacja szpiku kostnego, itp. Rekombinowane wirusy mogą być zmodyfikowane celem produkcji antygenów związanych z nowotworami *TAA) w tym, do ludzkich antygenów nowotworowych rozpoznawanych przez komórki T (Robbins i Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628-636, włączone tutaj przez odniesienie w całości), białka linii mielocytów, w tym gp 100, MART1/MelanA, TRP-1 (gp75), tyrozynaza, wspólne antygeny nowotworowe, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-1, N-acetylo glukozaminylotransferaza-V, p15; nowotworowo-specyficzne zmutowane antygeny, B-katenina, MUM-1, CDK4; antygeny niemialanomy dla raka piersi, jajników, macicy i trzustki, HER-2/neu, human papillomavirus -E6, -E7, MUC-1.

Stworzona może zostać żywa rekombinowana szczepionka wirusowa lub inaktywowana rekombinowana szczepionka wirusowa. Żywa szczepionka jest korzystna, ponieważ powielenie w gospodarzu prowadzi do przedłużonego bodźca podobnego rodzaju i siły do tego naturalnie występującego w naturalnych infekcjach i zatem, nadającego zasadniczą, długotrwałą odporność. Produkcja takiej żywej szczepionki może zostać osiągnięta przy zastosowaniu konwencjonalnych metod w tym namnażania wirusa w hodowli tkankowej lub w zarodkach kurzych, po których następuje oczyszczanie. Dodatkowo, ponieważ NDV jest niepatogenny dla ludzi, wirus ten jest szczególnie odpowiedni jako żywa szczepionka.

Z tego wzglę du, zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych wektorów (NDV) do celów szczepienia może wymagać obecności atenuacji charakterystycznej dla tych szczepów. Wprowadzenie odpowiednich mutacji (np. delecji) do matryc zastosowanych do transfekcji może dostarczyć nowych wirusów o charakterystyce atenuowanej. Przykładowo, specyficzne mutacje typu missense, które są związane z wrażliwością na temperaturę lub adaptację na zimno mogą być zmienione w mutacje delecyjne. Mutacje te powinny być bardziej stabilne niż mutacje punktowe związane z mutantami wrażliwymi na ciepło lub zimno, zaś częstość rewersji powinna być ekstremalnie niska. Alternatywnie, można skonstruować chimeryczne wirusy o charakterystyce samobójczej. Wirusy takie będą przechodzić tylko kilka rund replikacji wewnątrz gospodarza. Jeśli zostaną zastosowane jako szczepionki, rekombinowany wirus powinien przejść przez ograniczony cykl(e) replikacji i zaindukować odpowiedni poziom odpowiedzi immunologicznej ale nie rozwinie się u człowieka i nie spowoduje choroby. Wirusy rekombinowane, którym brakuje jednego lub więcej genów NDV lub te które posiadają zmutowane geny NDV nie mogą przejść sukcesywnych rund replikacji. Defektywne wirusy mogą zostać wyprodukowane w liniach komórkowych, które permanentnie produkują taki(e) gen(y). Wirusy, którym brakuje zasadniczych genów będą się replikowały w tych liniach komórkowych, ale kiedy zostaną podane człowiekowi, nie będą w stanie ukończyć pełnej rundy replikacji. Takie przygotowania mogą prowadzić do transkrypcji i translacji - w cią gu tego cyklu abortywnego-wystarczają cej liczby genów celem indukcji odpowiedzi immunologicznej. Alternatywnie, powinny być podawane duże ilości szczepów, w ten sposób preparaty te służą jako szczepionki z inaktywowanych (zabitych) wirusów. Dla szczepionek inaktywowanych korzystna jest ekspresja produktu genu heterologicznego jako składnika wirusa, w taki sposób, aby produkt genu był związany z wirionem. Korzyścią takich preparatów jest to, że zawierają one natywne białka i nie podlegają inaktywacji poprzez działania formaliny lub innych czynników stosowanych do wytwarzania szczepionek z zabitych wirusów, alternatywnie, zmutowane NDV wytworzone z cDNA mogą być w znacznym stopniu atenuowane, w sposób prowadzący tylko do kilku rund replikacji.

W kolejnym wykonaniu tego aspektu wynalazku, inaktywowane preparaty szczepionek mogą zostać przygotowane przy użyciu konwencjonalnej techniki „zabijania chimerycznych wirusów. Inaktywowane szczepionki są „martwe w znaczeniu, że ich infekcyjność została zniszczona.

Idealnie, infekcyjność wirusa jest zniszczona bez wpływu na jego immunogenność. W celu przygotowania inaktywowanych szczepionek, chimeryczny wirus może być namnażany w hodowli tkankowej lub w zarodkach kurzych, oczyszczany poprzez ultrawirowanie w gradiencie, inaktywowany poprzez formaldehyd lub B-propiolakton i zbierany. Powstająca szczepionka jest zazwyczaj inokulowana domięśniowo.

Inaktywowane wirusy mogą być łączone z odpowiednim adiuwantem celem zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Takie adiuwanty mogą dotyczyć ale nie są ograniczone do żeli mineralnych,

PL 201 738 B1 np. wodorotlenku aluminium, substancji aktywnych powierzchniowo takich jak lizolektyny, pluronicznych polioli, polianionów, peptydów, emulsji olejowych i potencjalnie korzystnych adiuwantów ludzkich, takich jak BCG i Corynebacterium parvum.

Celem wprowadzenia szczepionek można zastosować wiele metod, które dotyczą, ale nie są ograniczone do drogi doustnej, doskórnej, domięśniowej, dootrzewnowej, dożylnej, podskórnej i donosowej. Korzystnym może być podanie szczepionki chimerycznego wirusa naturalną drogą infekcji patogenu dla którego zaprojektowano szczepionkę.

6. Przykład: ekspresja i pakowanie obcego genu przez rekombinowane NDV.

Opisana została ekspresja genu transferazy chloramfenikolu(CAT) przy użyciu minigenomu NDV. Minigenim NDV został przygotowany przy użyciu plazmidu pNDVCAT, zawierającego gen CAT. Plazmid pNDVCAT jest plazmidem pUC19 zawierającym w sekwencji: promotor TV; 5'-koniec genomowego RNA NDV zawierającego 191 nukleotydów niekodującej sekwencji NDV RNA; 5 wstawionych nukleotydów (3'CTTAA); kompletną sekwencję kodującą transferazę chloramfenikolu (CAT) w porządku odwróconym i kompletnym, 3'- koniec sekwencji genomowej NDV RNA zawierający 121 nukleotydów z niekodującej sekwencji NDV RNA ; miejsce klonowania Bbsl i kilka miejsc restrykcyjnych umożliwiających start transkrypcji z matrycy/ pNDVCAT może ulegać transkrypcji przy użyciu polimerazy T7 celem stworzenia RNA z sekwencjami flankującymi z wirusa choroby Newcastle otaczającymi gen CAT w odwróconej orientacji.

Długość RNA paramyxowirusa może być głównym czynnikiem, który determinuje poziom replikacji RNA, przy największej efektywności replikacji przy całkowitej ilości nukleotydów stanowiącej wielokrotność 6. Dla NDV kwestia istotności zasady sześciu była sprawdzana poprzez wytwarzanie minireplikonów CAT o różnej długości, różniących się jednym do pięciu nukleotydów. Jedynie jeden konstrukt, którego genom był podzielny przez 6, zdolny był do indukcji aktywności CAT.

6.1. Konstrukcja minigenomu wirusa choroby Newcastle

Celem skonstruowania minigenomu NDV, jak opisano powyżej, zastosowano następującą strategię. 5' końcowa sekwencja genomowego NDV RNA została otrzymana z RACE (Gibco, BRL) przy użyciu technik znanych fachowcom. Matrycą dla reakcji RACE było genomowe RNA oczyszczany z wirionów NDV (NDV-CL : California /11914/1944-). Jak pokazano na Fig. 3, ta sekwencja końcowa zawierała 64 nukleotydy sekwencji liderowej plus 127 nukleotydów regionu nieulegającego transkrypcji w genie L. W pobliżu tej nukleotydowej sekwencji wirusowej 191 wstawiono 5-nukleotydową sekwencję (3'CCTTAA). Gen CAT zawierał 667 nukleotydy z otwartej ramki odczytu CAT, która była umieszczona pomiędzy wirusowymi niekodującymi regionami 5'-3' końcowymi. Celem otrzymania 3' końcowego regionu sekwencji NDV, zastosowano RT-PCR. Matryca dla reakcji RT-PCR była in vitro poliadenylowanym genomowym RNA z NDV. Jak pokazano na Ryc3, końcowy region 3' z 121 nukleotydów zawierał 56 nukleotydów z nieulegającego translacji regionu genu NP. plus 65 nukleotydów z sekwencji liderowej. Powstający konstrukt minigenomu NDV jest pokazany na Fig. 1. Sekwencje nukleotydowe niekodujących regionów końcowych 3' i 5' pokazano na Ryc 3.

6.2. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych NDV NP, PAL

Jak opisano w rozdziale 5, transkrypcja lub replikacja ujemnoniciowego genomu RNA wymaga kilku komponentów białkowych wniesionych wraz z wirusem, w tym białka L, P i NP. Celem ułatwienia ekspresji z minigenomu NDV geny kodujące L, P i NP zostały wklonowane do wektorów ekspresyjnych pTM1, jak pokazano na Ryc 2A-C. Wektory ekspresyjne pTM1 zawierają promotor T7, kilka miejsc klonowania, kilka miejsc klonowania do insercji docelowego genu. (L, P lub NP), terminator T7, miejsce origin (ori) replikacji pUC19 oraz gen odporności na ampicylinę. Celem skonstruowania plazmidów ekspresyjnych, pełnej długości DNA nukleproteiny NP, fosfoproteiny P i polimerazy L zostały otrzymane drogą RT-PCR. Te DNA zostały sklonowane do wektora ekspresyjnego T7 pTMl, odpowiednio (Fig. 2A-C).

6.3. Transkrypcja minigenomu NDV

Transkrypcja RNA z minigenu plazmidu NDV była wykonywana zestawem Ribomax (Promega) jak przedstawiono w manuskryptach. Celem umożliwienia rozpoczęcia transkrypcji 1 μg plazmidu minigenomu NDV (pNDVCAT) było trawione Bbs.I. Linearyzowany plazmid był następnie używany jako matryca do reakcji transkrypcji (2 h w 37°C). Celem usunięcia matrycy DNA, powstająca mieszanina reakcyjna była traktowana wolna od RNaz DNAzą (15 min. w 37°C) i oczyszczana poprzez ekstrakcje fenol-chloroform, oraz wytrącanie etanolem.

PL 201 738 B1

6.4. Transfekcje komórek

Komórki Cos-1 lub 293T rosły na 35 mm płytkach i były infekowane wirusem pomocniczym rVV T7 przy wielokrotności zakażania moi= około 1 przez godzinę przed transfekcją. Komórki były następnie transfekowane wektorem ekspresyjnym kodującym białka NP, P i L z NDV. Specyficznie, transfekcje były wykonane za pomocą DOTAP (Boehringer Mannheim). Po infekcji fagiem pomocniczym, komórki były transferowane pTM1-NP (1 μg), pTMl-P (1 μg) i pTM1-L (0.1 μg) przez 4 h. Kontrolne transfekcje, bez białka L wykonywano na równoległym zestawie komórek pTM1-NP (1 μg), pTMl-P (1 μg) i pTM1-L (0 Lig). Po 4 godzinach inkubacji komórki transfekowano RNA 0.5 μg NDV-CAT chimerycznego (-) RNA (patrz Fig. 1). Po transfekcji RNA, komórki pozostawiono do inkubacji przez 18 godzin. Lizaty komórkowe były następnie poddane testom CAT.

6.5 Testy CAT

Testy CAT były wykonywane zgodnie ze standardowymi procedurami zaadoptowanymi z Gormana i wsp., 1982, Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051. Testy te zawierają 10 μg ¹⁴C chloramfenikol, (0.5 LiCi; 8.3 nM, NEN), 20 ml z 40mM acetylu CoA (Boehringer) i 50 μl ekstraktu komórkowego w 0.25 M buforze. Czas inkubacji 16-18 godzin.

6.6. Wyniki

W każdej linii komórkowej transfekowanej wektorami ekspresyjnymi NP, P, L oraz chimerycznym NDV-CAT RNA, otrzymano wysoki poziom ekspresji CAT w 18 godzin po infekcji. Dodatkowo komórki stransfekowane kontrolą w której brakowało białka L, nie produkowały CAT.

7. Uwalnianie infekcyjnych wirusów NDV używając RNA otrzymanego ze specyficznego rekombinowanego DNA.

Doświadczenia opisane w podrozdziale poniżej pokazują uwalnianie infekcyjnego NDV przy użyciu RNA otrzymanego ze specyficznego rekombinowanego RNA. RNA odpowiadające chimerycznemu NDV-CAT może być zastosowana do pokazania, że 191 nukleotydów z 5' końca i 121 nukleotydów z 3' końca wirusowego RNA zawiera wszystkie sygnały niezbędne do transkrypcji, replikacji i pakowania modelowego NDV RNA. RNA zawierające wszystkie jednostki transkrypcyjne z genomów NDV może ulegać ekspresji w transfekowanych plazmidach. A zatem technologia ta pozwala na modyfikowanie infekcyjnych wirusów NDV przy użyciu klonów cDNA i ukierunkowanej mutagenezy i genomów. Co więcej technologia ta może umożliwić konstrukcję chimerycznych wirusów NDV, które mogą być użyte jako wydajne wektory ekspresyjne w hodowlach tkankowych, zwierzętach i ludziach.

8. P r z y k ł a d: Rekombinowany wirus choroby Newcastle zawierający antygen HIV pg160 epitopowo wstawiony do genomu NDV

W przedstawionym tutaj przykładzie, chimerowy NDV jest konstruowany w celu ekspresji heterologicznego antygenu pochodzącego z gp160 HIV. Doświadczenie opisane w poniższych podrozdziałach przedstawia zastosowanie wzoru rekombinantowego RNA w celu wygenerowania chimerowego NDV, który posiada ekspresję pochodzącego od HIV gp160 peptydu wewnątrz genomu NDV i ponadto, który to NDV jest stosowany do ujawnienia odpowiedzi humoralnej i komórkowo sterowanej odpowiedzi immunologicznej.

8.1. Konstruowanie plazmidu

Klony cDNA rekombinowanego NDV, zapewniające ekspresję białek gp160 HIV, można skonstruować z wykorzystaniem różnych sposobów postępowania znanych w tej dziedzinie techniki. I tak, na przykład, jak to przedstawiono na fig. 4, białka HIV Env i Gag można wstawić do NDV w szeregu różnych pozycji. W jednym z przykładowych rozwiązań, białka Env i Gag wstawia się między geny M i L. W innym przykładowym wykonaniu, białka Env i Gag wstawia się w położeniu 3' w stosunku do genu NP (między sekwencję liderową a NP). Alternatywnie, wspomniane białka HIV włącza się między białka otoczki NDV (HN i F) a koniec 3'. Białka te można także wstawić do dowolnych genów NDV lub między te geny.

8.2. Wytwarzanie zakaźnego wirusa chimerycznego

Transfekcja RNA pochodzącego z plazmidu zawierającego genom rekombinowanego NDV można transfekować do komórek takich, jak, na przykład, COS, 293 MDBK, przy czym selekcji zakaźnego wirusa chimerycznego można dokonać sposobem poprzednio opisanym. Patrz: patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5166057, włączony w całości do niniejszego opisu jako odnośnik. RNA otrzymany w wyniku takiego postępowania można transfekować do komórek zakażonych wirusem typu dzikiego, z zastosowaniem metod podanych w typowym protokole transfekcji. Po transfekcji, supernatant można zebrać i użyć w różnych rozcieńczeniach do zakażenia komórek w obecności surowicy odpornościowej NDV. Supernatantu można także użyć do testów łysinkowych w obecności

PL 201 738 B1 tej samej surowicy odpornościowej. Następnie, uwolniony wirus można poddać oczyszczaniu i scharakteryzować, po czym wykorzystać, na przykład, w produkcji przeciwciała.

8.3. Badania nad hamowaniem hemaglutynacji i neutralizacją wirusa

Testy hamowania hemaglutynacji (HI) przeprowadza się sposobem poprzednio opisanym [D.F. Palmer i in., Immunol. Ser., 6, 51 - 52 (1975)]. Przeciwciała monoklonalne (2G9, 4B2, 2F10, 25-5) wytwarza się typowymi metodami przy użyciu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-gp120. Płyn puchlinowy zawierający przeciwciała monoklonalne poddaje się obróbce z udziałem enzymu niszczącego receptor, sposobem poprzednio opisanym [D.F. Palmer i in., Immunol. Ser., 6, 51 - 52 (1975)].

W celu przeprowadzenia testu neutralizacji wirusa, komórki znajdujące się w płytkach o średnicy 30 mm zakażono wirusem. Po zakończeniu jednogodzinnej adsorpcji, nawarstwia się agar zawierający przeciwciało w różnych rozcieńczeniach. Następnie, po upływie 72 godzin od zakażenia, monowarstwę komórek barwi się przy użyciu 0,1% fioletu krystalicznego.

8.4. Immunizacja

Myszy BALB/c w wieku 6 tygodni zakaża się albo drogą aerozolową wirusem, albo przez dootrzewnową (i.p.) immunizację przy użyciu 10 μg wirusa oczyszczonego. We wszystkich immunizacjach podtrzymujących, podaje się i.p. 10 μg wirusa oczyszczonego. Surowice zbiera się po upływie 7 dni od każdej immunizacji.

8.5. Test radioimmunologiczny

Test radioimmunologiczny przeprowadza się sposobem poprzednio opisanym [H. Zaghouani i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5645 - 6549 (1991)]. Mówiąc krótko, płytki do mikromiareczkowania pokrywa się 5 μg/ml koniugatu peptyd-BSA, nasyconego 2% BSA w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), i inkubuje z różnymi rozcieńczeniami surowicy. Przeciwciała związane wykazuje się przy użyciu monoklonalnego przeciwmysiego przeciwciała kappa znakowanego ¹²⁵J.

8.6. Radioimmunoprecypitacja

Linię ludzkich komórek T H9 zakaża się masywnie HIV. Po upływie 4 dni od zakażenia, 5 x 10⁷komórek znakuje się ³⁵S-cysteiną, ³⁵S-metioniną i ³H-izoleucyną przy 2 x 10⁶/ml w podłożach zawierających 100 μ Ci każdego izotopu/ml. Po upływie 20 godzin znakowania metabolicznego, radioaktywne wiriony osadza się za pomocą wirowania w ciągu godziny przy 45000 obr/min. Następnie, otrzymany osad zawiesza się w 1,0 ml buforu do lizy, zawierającego 1% Triton X-100 i 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF). Około 20 gl surowic lub 0,5 gg przeciwciała monoklonalnego (w 20 gl PBS) i 175 gl produktu lizy wirionu inkubuje się przez noc w temperaturze 4°C w 0,5 ml buforu do immunoprecypitacji zawierającego 0,5% siarczanu dodecylo-sodowego (SDS), 1 mg/ml BSA, 2% Triton X-100 i 50 mM fosforanu sodu (pH 7,4). Kompleksy antygen-przeciwciało wiąże się na kulkach Protein A-Sepharose i poddaje analizie metodą elektroforezy w 10% żelu SDS-poliakryloamidowym.

8.7. Test neutralizacji HIV-1

Test neutralizacji in vitro przeprowadza się sposobem poprzednio opisanym (P.L. Nara i in., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 3, 283 - 302 (1987)). Mówiąc krótko, kolejne dwukrotne rozcieńczenia surowicy inaktywowanej termicznie inkubuje się w ciągu godziny, w temperaturze pokojowej, ze 150 - 200 tworzącymi zespólnie jednostkami wirusa HIV wytworzonymi w komórkach H9. Mieszaninę wirus/surowica inkubuje się w ciągu godziny, w temperaturze 37° C, z 50000 komórek CEMss potraktowanych DEAE-Dextran (przytwierdzonych do płytek do mikromiareczkowania przy użyciu poli-L-lizyny), lub 50000 komórek H9 w zawiesinie. Po adsorpcji wirusa, wirusa nie związanego usuwa się i do każdej studzienki wprowadza po 200 gl podłoży. Po upływie 4 dni od zakażenia, pobiera się po 50 gl supernatantów w celu skwantyfikowania wirusowego białka p24^gag (Coulter Source, Inc.). Całkowitą liczbę zespólni w komórkach CEMss zlicza się po upływie 5 dni od zakażenia. Miano neutralizacji oblicza się przez porównanie ze studzienkami kontrolnymi, zawierającymi tylko wirus, i wyraża jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, które redukuje liczbę zespólni o więcej niż 50%, albo hamuje syntezę p24 o więcej niż 50%.

8.8. Indukowanie odpowiedzi CTL

Myszy BALB/c immunizuje się przy użyciu 0,2 ml zawiesiny wirusa zawierającej 10⁷ jednostek łysinkowych (PFU) chimerycznego wirusa NDV. Po upływie 7 dni, pobiera się komórki śledziony i restymuluje in vitro w ciągu 5 dni z udziałem napromienionych komórek śledziony, jako takich, albo pokrytych peptydami immunogennymi, w obecności 10% konkanawaliny A w supernatancie, jak to poprzednio opisano [H. Zaghouani i in. J, Immunol., 148, 3604 - 3609 (1992)].

PL 201 738 B1

8.9. Test cytolizy

Komórki docelowe pokryte peptydami znakuje się przy użyciu Na⁵¹Cr (100 LiCi/10⁶ komórek) w ciągu godziny, w temperaturze 37°C. Po dwukrotnym przemyciu, komórki przenosi się do 96-studzienkowych płytek o stożkowym dnie i dodaje komórki efektorowe, po czym płytki inkubuje w temperaturze 37°C w atmosferze 7 % CO2. Po upływie 4 godzin, zbiera się supernatant i dokonuje zliczania. Maksymalne uwolnienie chromu oznacza się za pomocą inkubowania komórek z udziałem 1% detergenta Nonidet P40. Procent specyficznej lizy oblicza się według następującego wzoru: [(cpm próbki - cpm spontaniczne uwolnienie)/(cpm maksymalne uwolnienie - cpm spontaniczne uwolnienie)] x 100.

9. Wewnątrzkomórkowa ekspresja chimerycznego RNA NDV-CAT

W celu zwiększenia efektywności ekspresji minogenomów NDV, skonstruowano plazmid (pT7-NDV-CAT-RB) do wewnątrzkomórkowej ekspresji RNA NDV-CAT. Osiągnięto to przez wstawienie rybozymu pochodzącego z wirusa zapalenia wątroby delta bezpośrednio po końcu 3' niekodującego regionu RNA NDV-CAT. Ko-transfekcja pTM1-NP, pTM1-P, pTM1-L i pT7-NDV-CAT RT) do 293, 293T, COS1, CV1 lub fibroblastu zarodka kurzego (CEF) uprzednio zakażonych rVV-T7 lub zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara zapewniającym ekspresję polimerazy T7 (MVA-T7), prowadziła do uzyskania wysokiego poziomu aktywności CAT (fig. 6) . Aktywność CAT była około 100 do 1000 razy większa od aktywności uzyskanej na drodze bezpośredniej transfekcji RNA z RNA NDV-CAT.

10. Uwolnienie zakaźnego wirusa NDV przy użyciu swoistego rekombinowanego DNA wywodzącego się z RNA

W celu uzyskania uwolnionego rekombinowanego wirusa z nie uzależnionego od wirusa układu pochodzącego od plazmidu, złożono plazmid umożliwiający wewnątrzkomórkową ekspresję antygenomu NDV o pełnej długości. cDNA NDV poddano procesowi RT-PCR z otrzymaniem kilku kawałków z oczyszczonego RNA z California-podobnego szczepu NDV (NDV-CL) [Meindl in., Virology, 58, 457 - 463 (1974)]. Kawałki cDNA zligowano i złożono w plazmid z flankującymi sekwencjami promotora T7 i rybozymu, w wyniku czego otrzymano plazmid pT7-NDV+RB. Mutację drzemiącą tworzącą nowe miejsce restrykcyjne Xmal wprowadzono w otwartą ramkę odczytu L pT7-NDV+-RB. Monowarstwy komórek CEF w 10 cm płytkach zakażono MVA-T7 przy wielokrotności zakażenia około 0,1. Po upływie godziny, komórki transfekowano (lipofekowano) przy użyciu 2,4 μg pTM1-NP, 1,2 μg pTM1-P, 1,2 μg pTM-1L i 1,5 μg pT7-NDV+-RB. Po upływie 8 godzin inkubacji, w temperaturze 37°C, dodano świeże podłoże. Po upływie 20 godzin od transfekcji, wprowadzono inhibitor wirusa krowianki, arabinozyd cytozyny (araC) w końcowym stężeniu wynoszącym 60 μg/ml. Po upływie 2 dni od transfekcji, dodano świeże podłoże zawierające 100 μg/ml araC. Supernatantu z komórek transfekowanych w 4 dniu od transfekcji użyto do zaszczepienia komory alantoinowej 10-dniowych, zawierających zarodek jaj kurzych. Po upływie dni inkubacji w temperaturze 37°C, płyn alantoinowy zebrano i za pomocą hemaglutynacji stwierdzono, że jest on pozytywny pod względem obecności wirusa NDV-CAT. Analiza RNA wyizolowanego z uwolnionego wirusa potwierdziła obecność nowo wstawionego miejsca Xmal, a to z kolei potwierdziło, że wirus pochodził z klonowanego plazmidowego cDNA. Sposób postępowania przy uwalnianiu wirusa przedstawiono schematycznie w formie protokołu na fig. 7.

11. Ekspresja obcego genu z wewnętrznego cistronu genomu chimerycznego NDV

Skonstruowano plazmid pT7-NNDV+-CAT/RN-RB za pomocą zastąpienia otwartej ramki odczytu HN w cDNA NDV-CL otwartą ramką odczytu CAT. Do regionów niekodujących wprowadzono dodatkowe nukleotydy w celu umożliwienia podzielności przez sześć całkowitej długości powstałego chimerycznego RNA NDV. Kontransfekcja pT7-NDV+-CAT/HN-RB razem z pTM1-NP, pTM1-P i pTM1-L do monowarstw CEF uprzednio zakażonych wirusem MVA-T7 doprowadziła do aktywności CAT, co stwierdzono pomiarem w drugim dniu po transfekcji (fig. 8). Wyniki te pokazują, że jest rzeczą możliwą użycie NDV jako wektora dla ekspresji obcych genów klonowanych jako jednostki transkrypcyjne do genomu NDV.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Cząsteczka rekombinowanego RNA, znamienna tym, że obejmuje miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego

PL 201 738 B1

RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV.
2. Cząsteczka rekombinowanego RNA, znamienna tym, że obejmuje miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV.
3. Cząsteczka rekombinowanego RNA według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że 3' i 5'-niekodujący region flankujący ma sensowną sekwencję wirusa, jak pokazano na fig. 13.
4. Cząsteczka rekombinowanego RNA według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że heterologiczny RNA koduje wirusowy antygen.
5. Cząsteczka rekombinowanego RNA według zastrz. 4, znamienna tym, że wirusowy antygen pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa siatkowicy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń.
6. Komórka rekombinowana, znamienna tym, że zawiera sekwencje nukleotydów kodujące cząsteczkę rekombinowanego NDV jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo 2 i białka P i L polimerazy RNA NDV.
7. Chimeryczny wirus, znamienny tym, że stanowi wirus o nici RNA minus, zawierający cząsteczkę rekombinowanego RNA jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo 2.
8. Chimeryczny wirus według zastrz. 7, znamienny tym, że heterologiczny RNA pochodzi z wirusowego antygenu.
9. Chimeryczny wirus według zastrz. 8, znamienny tym, że wirusowy antygen pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa retikuloendoteliozy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń.
10. Chimeryczny wirus według zastrz. 7, znamienny tym, że heterologiczny RNA zawarty jest w genie HN wirusa choroby Newcastle.
11. Sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA minus, znamienny tym, że transfekuje się komórkę gospodarza sekwencjami nukleotydów kodującymi rekombinowaną cząsteczkę RNA zawierającą wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, oraz wyodrębnia się chimerycznego wirusa z hodowli.
12. Sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA minus, znamienny tym, że transfekuje się komórkę gospodarza sekwencjami nukleotydów kodującymi rekombinowaną cząsteczkę RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomem wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV.
13. Preparat szczepionki, znamienny tym, że zawiera wytworzonego metodami inżynierii genetycznej wirusa choroby Newcastle, zawierającego cząsteczkę rekombinowanego RNA zawiePL 201 738 B1 rającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, i przy czym ta cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, prowadzące do atenuowanego fenotypu, lub zwiększonej immunogeniczności, oraz fizjologicznie dozwoloną zaróbkę.
14. Preparat szczepionki, znamienny tym, że zawiera wytworzonego metodami inżynierii genetycznej chimerycznego wirusa choroby Newcastle, zawierającego cząsteczkę rekombinowanego RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, którego genom koduje epitop heterologiczny, oraz farmaceutycznie dozwoloną zaróbkę.
15. Preparat szczepionki według zastrz. 15, znamienny tym, że epitopem heterologicznym jest antygen wirusowy.
16. Preparat szczepionki według zastrz. 16, znamienny tym, że wirusowy antygen pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa retikuloendoteliozy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń.
17. Preparat szczepionki według zastrz. 14, znamienny tym, że epitopem heterologicznym jest białko wzmagające reaktywność immunologiczną wybrane z grupy obejmującej cytokiny, interferon, czynnik tworzący kolonie i interleukiny.
18. Preparat szczepionki według zastrz. 14, znamienny tym, że epitopem heterologicznym jest antygen nowotworowy.