KR20020013469A - 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 ｒｎａ 발현계 및 백신 - Google Patents

재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 ｒｎａ 발현계 및 백신 Download PDF

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KR20020013469A
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Abstract

본 발명은 이형성 유전자, 돌연변이된 뉴캐슬 질병 바이러스 유전자 또는 뉴캐슬 질병 바이러스의 상이한 균주로부터 유래된 바이러스 유전자의 복합체를 발현하는 유전자조작된 뉴캐슬 질병 바이러스와 바이러스 벡터에 관한다. 본 발명은 적당한 숙주세포에서 이형성 유전자 산물을 발현하고 바이러스 입자에서 이형성 유전자를 회수하기 위하여, 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소와 함께 사용할 수 있는 재조합 네거티브 가닥 RNA 주형의 작제와 용도에 관한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 이형성 유전자 산물은 사람 면역결핍 바이러스의 게놈으로부터 유래된 펩티드 또는 단백질이다. 본 발명의 RNA 주형은 DNA-의존성 RNA 중합효소, 예를 들면, T7, T3, SP6 중합효소 또는 진핵 중합효소 I을 이용한 적당한 DNA 서열의 전사로 만들 수 있다.

Description

재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 ＲＮＡ 발현계 및 백신{RECOMBINANT NEWCASTLE DISEASE VIRUS RNA EXPRESSION SYSTEMS AND VACCINES}
2. 본 발명의 배경기술
숙주 세포계에서 이형성 단백질의 발현을 유도하기 위하여 다수의 DNA 바이러스(예, 우두 바이러스, 바쿨로바이러스등)의 유전자를 조작하였다. 최근에는 파지티브-가닥 RNA 바이러스(예, 폴리오바이러스)에 상당한 진보가 이루어지고 있다. 이들 구조체의 발현 산물, 다시 말하면, 이형성 유전자 산물 또는 이형성 유전자 산물을 발현하는 키메라 바이러스는 백신조성물(서브유니트 또는 전체 바이러스 백신)에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 백신에 사용하는 재조합 또는 키메라 바이러스의 작제에 우두와 같은 바이러스를 사용할 때의 단점은 주요 에피토프의 변이가 부족하다는 점이다. 이런 바이러스 균주의 다양성 부족은 키메라 단백질의 반복적인 사용을 극히 제한하는데, 그 이유는 다중 예방주사가 균주에 대한 숙주-저항성을 유발하여 접종된 바이러스가 숙주를 감염시킬 수 없기 때문이다. 따라서, 저항 개체에 키메라 우두를 접종하여도 면역자극이 유도되지 않는다.
대조적으로, 네거티브-가닥 RNA 바이러스는 백신용 키메라 바이러스를 작제하기 위한 매력적인 후보다. 네거티브-가닥 RNA 바이러스(예, 인플루엔자 바이러스)는 광범위한 유전적 변이로 인해, 내성 발달의 위험없이 면역을 자극하는 백신조성물의 다양한 레퍼토리를 작제할 수 있어 바람직하다. 최근에, 인플루엔자 바이러스를 이용하여 감염성 재조합 또는 키메라 네거티브-가닥 RNA 입자를 작제하였다(U.S 특허 No. 5,166,057, Palese et al).
2.1. 뉴캐슬 질병 바이러스
네거티브-센스 게놈의 외피형 단일-가닥 RNA를 보유한 바이러스과는 비-분절된 게놈을 보유한 군(파라믹소바이러스과, 라브도바이러스과) 또는 분절된 게놈을 보유한 군(오르토믹소바이러스과, 부니야바이러스과, 아레나바이러스과)으로 구분한다. 하기에 상술하고 실시예에서 사용한 파라믹소바이러스과에는 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV), 파라인플루엔자 바이러스, 센다이 바이러스, 유인원 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스가 포함된다.
뉴캐슬 질병 바이러스는 선형, 단일-가닥, 비분절된, 네거티브 센스 RNA 게놈을 보유한 외피형 바이러스다. 게놈 RNA는 하기에 상술한 3'-NP-P-M-F-HN-L의 순서로 유전자를 보유한다. 게놈 RNA는 또한, 3'말단에 리드 서열을 보유한다.
비리온의 구조요소에는 세포 혈장막으로부터 유래된 지질이중층의 바이러스 외피가 포함된다. 당단백질인 혈액응혈인자-뉴우라미니다제(HN)는 외피로부터 돌출되어 있는데, 이로써 바이러스는 혈액응혈 및 뉴우라미니다제 활성을 보일 수 있다. 바이러스막과 상호작용하는 융합 당단백질(F)은 먼저, 활성전구체로 생산되고, 번역후 절단되어 2개의 이황화결합된 폴리펩티드를 만든다. 활성 F 단백질은 바이러스 외피와 숙주 세포 혈장막의 융합을 용이하게 하여, NDV가 숙주 세포에 침투하도록 하는데 관여한다. 매트릭스 단백질(M)은 바이러스 조합에 관여하고, 바이러스막 및 뉴클레오캡시드 단백질과 상호작용한다.
뉴클레오캡시드의 주요 단백질 서브유니트는 캡시드상에 나선형 대칭구조를제공하는 뉴클레오캡시드 단백질(NP)이다. 인산화의 표적이 되는 인단백질(P)은 전사에서 조절역할을 하는 것으로 생각되고, 또한 메틸화, 인산화, 폴리아데닐화에도 관여하는 것으로 보인다. RNA-의존성 RNA 중합효소를 인코드하는 L 유전자는 P 단백질과 함께 RNA 합성에 필요하다. 바이러스 게놈의 코딩능력의 거의 절반을 차지하는 L 단백질은 바이러스 단백질중 가장 큰 것으로, 전사와 복제에서 중요한 역할을 한다.
NDV를 비롯한 모든 네거티브-가닥 RNA 바이러스의 복제는 RNA를 복제하는데 필요한 세포 기구가 없어 복잡하다. 또한, 네거티브-가닥 게놈은 단백질로 직접 번역될 수는 없어, 먼저 파지티브-가닥(mRNA) 사본으로 전사되어야 한다. 따라서, 게놈 RNA 단독은 숙주세포로 진입한 직후, 필요한 RNA-의존성 RNA 중합효소를 합성할 수 없다. 감염시 L, P, NP 단백질이 게놈과 함께 세포로 도입되어야 한다.
NDV mRNA를 전사하는 대부분 또는 모든 바이러스 단백질 또한, 이들의 복제를 실행시키는 것으로 추정된다. 동일한 단백질 보체의 다른 용도(즉, 전사 또는 복제)를 조절하는 기작은 명확하게 확인되진 않았지만 자유 형태의 하나 또는 복수 뉴클레오캡시드 단백질, 특히 NP의 양에 관여하는 것으로 보인다. 바이러스의 침투직후, 뉴클레오캡시드상의 네거티브-센스 RNA를 주형으로 이용하여, L 단백질에 의해 전사가 개시된다. 바이러스 RNA 합성은 전사동안 모노시스트론 mRNA가 생산되도록 조절된다.
네거티브-가닥 RNA 바이러스에 의한 감염에서 전사후, 바이러스 게놈 복제가 발생한다. 다른 네거티브-가닥 RNA 바이러스와 같이, 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV)에서 바이러스 게놈 복제는 바이러스-특이적 단백질에 의해 매개된다. 복제성 RNA 합성의 제 1 산물은 NDV 게놈 RNA(cRNA)의 상보성 사본(즉, 플러스-극성)이다. 이들 플러스-가닥 사본(안티-게놈)은 말단 구조에서 플러스-가닥 mRNA 전사체와 상이하다. mRNA 전사체와는 달리, 안티-게놈 cRNA는 5'말단에서 캡핑 및 메틸화되지 않고, 3'말단에서 절단 및 폴리아데닐화되지 않는다. 상기 cRNA는 네거티브 가닥 주형과 말단이 동일하고, 상보형태로 각 게놈 RNA 분절에서 동일한 유전자정보를 보유한다. cRNA는 NDV 네거티브-가닥 바이러스 게놈(vRNAs)에 대한 주형역할을 한다.
NDV 네거티브 가닥 게놈(vRNAs)과 안티게놈(cRNAs)은 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 캡시드화된다; 유일하게 캡시드화되지 않는 RNA 종류는 바이러스 mRNA다. NDV의 경우, 세포질은 전사 위치인 동시에 바이러스 RNA 복제의 위치가 된다. 바이러스 성분의 조합은 숙주 세포혈장막에서 일어나는 것으로 보이는데, 성숙 바이러스는 출아에 의해 방출된다.
2.2. 네거티브 가닥 RNA 바이러스 조작
동물 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소는 다양한 측면의 단백질 구조와 반응조건에 대하여 광범위하게 조사되었다. 하지만, 중합효소에 의한 최적 발현을 촉진하는 주형 RNA의 요소는 기존의 바이러스 RNA 서열을 이용한 추론에 의해서만 연구할 수 있었다. 바이러스 중합효소가 감염된 세포에서 다수의 숙주-인코드된 RNA중에서 특정 바이러스 RNA를 인식하는 방법을 알 수 없기 때문에, 프로모터 분석이 주목을 받고 있다.
플러스-센스 게놈 RNA를 보유한 동물 바이러스는 플라스미드-유래된 RNA가 트랜스펙션에 의해 세포로 도입되는 경우, 복제된다(Racaniello et al., 1981, Science 214:916-919; Levis, et al., 1986, Cell 44:137-145), 폴리오바이러스의 경우에, 정제된 중합효소는 시험관내 반응동안 게놈 RNA를 복제할 수 있고, 이런 플러스-센스 RNA 제조물은 세포로 트랜스펙션되는 경우 전염성을 나타낸다(Kaplan, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8424-8428). 하지만, RNA 동종중합체가 복제되는 경우에도, 폴리오바이러스-인코드된 중합효소에 대한 전사 프로모터 역할을 하는 주형 요소는 알 수 없다(Ward, et al., 1988, J. Virol. 62:558-562). SP6 전사체는 신드비스 바이러스 게놈에 대한 모델 결함성 간섭(DI) RNA를 만드는데 사용하고 있다. 감염된 세포에 도입된 RNA는 복제되고 패킹된다. 신드비스 바이러스 중합효소에 의한 인식 및 게놈의 바이러스입자로의 패킹을 주관하는 RNA 서열은 게놈의 5'말단의 162개 뉴클레오티드(nt)와 3'말단의 19nt사이에 있는 것으로 밝혀졌다(Levis, et al., 1986, Cell 44:137-145). 파지티브 가닥 RNA 식물 바이러스인 브롬 모자이크 바이러스(BMV)의 경우에, SP6 전사체는 135 nt tRNA-형 3'말단으로 프로모터를 인식하는데 사용하고 있다(Dreher, and Hall, 1988, J. Mol. Biol. 201:31-40). 중합효소 인식과 합성은 서열과 이차 구조 특성에 의존하는 것으로 밝혀졌다(Dreher, et al., 1984, Nature 311:171-175).
네거티브-센스 RNA 바이러스는 레플리카아제의 서열 요구를 연구하기가 어렵다. 수포성 구내염 바이러스의 정제된 중합효소는 바이러스-유래된 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)가 주형으로 포함되는 경우에만 활성을 나타낸다(De andBanerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:40-69; Emerson and Yu, 1975, J. Virol. 15:1348-1356; Naito and Ishihama, 1975, J. Biol. Chem. 251:4307-4314). 인플루엔자 바이러스의 경우, RNP를 재구성하는데 바이러스로부터 정제된 나신 RNA를 사용하였다. 바이러스 뉴클레오캡시드와 중합효소 단백질은 겔-정제하고, 티오레독신을 이용하여 바이러스 RNA에서 원형복원하였다(Szewczyk, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7907-7911). 하지만, 이들 연자는 제조물 활성이 인플루엔자 바이러스 RNA에 특이적이라는 것을 제시하지 않았고, 또한 전사를 촉진하는 신호를 분석하지도 않았다.
최근에, 재조합 역유전학 방식을 이용하여 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 회수할 수 있게 되었다(U.S. 특허 No. 5,166,057, Palese et al.). 이 방법은 원래 인플루엔자 바이러스 게놈을 조작하기 위하여 적용되었지만(Luytjes et al. 1989, Cell 59:1107-1113; Enami et al. 1990, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:11563-11567), 광견병 바이러스(Schnell et al. 1994, EMBO J. 13:4195-4203); 호흡기 합포체 바이러스(Collins et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667), 센다이 바이러스(Park et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5537-5541; Kato et al., 1996, Genes Cells 1:569-579)를 비롯한 다양한 분절과 비분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스에 성공적으로 적용되고 있다. 하지만, 이런 방식은 뉴캐슬 질병 바이러스 RNA 게놈에는 적용되지 않고 있다.
3. 본 발명의 요약
적당한 숙주 세포에서 이형성 유전자 산물을 발현하고 바이러스 입자에서 이형성 유전자를 회수하기 위하여, RNA-의존성 RNA 중합효소를 함께 사용할 수 있는 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 RNA 주형을 기술한다. 한 구체예에서, 본 발명은 인터페론 및 관련 경로를 유도하는 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 관한다. 본 발명은 재조합 바이러스를 백신조성물에 사용하기 적합하도록 하는 변형, 예를 들면, 약독화된 표현형 또는 강화된 변역원성을 보유한 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 관한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 다른 바이러스의 유전자, 병원균, 세포내 유전자, 종양 항원등을 비롯한 이형성 유전자를 보유한 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 및 바이러스 벡터를 조작하는 것에 관한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스와 바이러스 벡터를 백신으로 제조하는 것에 관한다. 본 발명은 사람 및 수의용도의 투여에 적합한 백신 조성물에 관한다. 본 발명의 백신은 개와 고양이를 비롯한 가축; 여우와 너구리를 비롯한 야생동물; 말, 소, 양, 칠면조, 닭을 비롯한 가축과 가금에 투여한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 돌연변이 뉴캐슬 질병 바이러스 유전자를 인코드하거나 또는 뉴캐슬 질병 바이러스의 다른 균주의 유전자의 복합체를 인코드하도록 조작된 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 벡터에 관한다. 본 발명의 RNA 주형은 적당한 DNA 서열을 DNA-의존성 RNA 중합효소로 전사시켜 만든다. 생성된 RNA 주형은 네거티브-극성으로, 바이러스 RNA-합성 장치가 주형을 인식할 수 있도록 하는 적당한 말단 서열을 보유한다. 대안으로, 바이러스 RNA 합성 장치가 주형을 인식할 수 있도록 하는 적당한 말단 서열을 보유한 파지티브-극성 RNA 주형을 사용할수 있다. 파지티브 극성 RNA 주형으로부터 발현은 DNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터를 보유한 플라스미드로 트랜스펙션시켜 달성할 수 있다. 가령, T7 프로모터의 조절하에 파지티브 RNA 주형을 인코드하는 플라스미드 DNA는 우두 바이러스 T7 시스템과 병용할 수 있다.
바이러스 서열 번역의 내부 개시가 가능하고 정규 말단 개시부위로부터 외래 단백질 코딩 서열의 발현이 가능한 이중 시스트론 mRNA를 작제할 수 있다. 대안으로, 외래 단백질은 내부 전사 단위로부터 발현시킬 수 있는데, 여기서 전사 단위는 개시 부위와 폴리아데닐화 부위를 보유한다. 다른 구체예에서, 외래 유전자는 NDV 유전자에 삽입하는데 생성된 발현 단백질은 융합 단백질이 된다.
본 발명의 재조합 돌연변이 뉴캐슬 질병 바이러스 RNA 주형은 RNA 의존성 RNA-중합효소를 발현하고 상보성을 가능하게 하는 형질전환된 세포주를 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있다. 대안으로, 특이적(키메라) RNA 트랜스펙션을 위해 적당한 프로모터로부터 발현하는 플라스미드를 사용할 수 있다. 상보성은 RNA 의존성 RNA-중합효소를 제공하는 보조 바이러스를 사용하여 달성할 수 있다. 또한, 뉴캐슬 질병 바이러스에 대한 비-바이러스 의존성 복제 시스템을 제시한다. 바이러스의 특이적 복제와 발현에 필요한 뉴캐슬 질병 바이러스 단백질의 최소 집합은 L, P, NP로, 이들은 우두 바이러스 T7 시스템으로 플라스미드로부터 발현시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, NDV 게놈의 안티게놈 사본을 인코드하는 플라스미드를 사용하여 바이러스 게놈을 제공하는 경우 바이러스의 특이적인 복제와 발현에 필요한 뉴캐슬 질병 바이러스 단백질의 최소 집합은 L과 P 단백질이다. NDV 게놈의 안티게놈 사본을 전사하는 경우, NP 중합효소 단백질이 제일 먼저 전사되는 단백질이고, 따라서 NP 중합효소를 추가로 제공할 필요가 없다.
수득된 발현 산물 또는 키메라 비리온은 백신조성물에 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 발현 산물과 키메라 비리온은 자가면역 질환에 관여하는 바이러스 항원, 종양 항원, 자가 항원을 비롯한 광범위한 병원균에 대항하는 백신을 만드는데 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 키메라 비리온을 조작하여 안티-HIV 백신을 만들 수 있는데, 여기서 gp160 또는 HIV의 내부 단백질의 면역원성 폴리펩티드는 당단백질 HN 단백질내로 조작하여, 척추동물 체액반응과 세포-매개된 면역반응을 유도할 수 있는 백신을 작제한다. 이런 목적에 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스를 이용하는 것은 뉴캐슬 질병 바이러스가 인체에서 병원균이 아니라는 점에서 특히 매력적이다. 종양 항원을 전달하는데 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스를 이용하는 것은 상기 바이러스의 항신생물특성 및 면역증강활성을 고려할 때, 특히 매력적이다.
3.1. 정의
이 글에서, 다음의 용어는 하기와 같은 의미를 갖는다:
cRNA = 안티-게놈 RNA
HIV = 사람 면역결핍 바이러스
L = 거대 단백질
M = 매트릭스 단백질(외피내 계통)
MDCK = Madin Darby 개 신장 세포
MDBK = Madin Darby 소 신장 세포
moi = 다중 감염
NA = 뉴우라미니다제(외피 당단백질)
NDV = 뉴캐슬 질병 바이러스
NP = 핵단백질(RNA와 관련, 중합효소 활성에 필요)
NS = 비구조 단백질(기능 미정)
nt = 뉴클레오티드
PA, PB1, PB2 = RNA-의존성 RNA 중합효소 성분
RNP = 리보뉴클레오단백질
rRNP = 재조합 RNP
vRNA = 게놈 바이러스 RNA
WSN = 인플루엔자 A/WSN/33 바이러스
WSN-HK 바이러스: WSN 바이러스의 7개 유전자 및 인플루엔자 A/HK/8/68 바이러스의 NA 유전자를 보유한 유전자재배열 바이러스
본 출원은 1998년 9월 14일 출원된 09/152,846의 일부-계속 출원이다.
1.도입
본 발명은 적당한 숙주세포계에서 이형성 유전자 산물을 발현하거나 또는 이형성 유전자 산물을 발현하고 패킹하고 제공하는 재조합 바이러스를 작제하는데 사용할 수 있는 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 RNA에 관한다. 발현 산물 및 키메라 바이러스는 백신조성물에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 재조합 바이러스를 백신조성물에 사용하기 적합하도록 하는 변형 또는 돌연변이, 예를 들면, 약독화된 표현형 또는 강화된 변역원성을 보유한 유전자조작된 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 관한다.
본 발명은 인터페론 및 관련된 경로를 유도하는 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 관한다. 본 발명은 종양 특이적 항원을 비롯한 광범위한 범위의 병원균 또는 항원에 반하는 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 및 바이러스 벡터의 용도에 관한다. 본 발명은 실시예로 예시하는데, 여기서 네거티브-극성의 이형성 유전자 코딩 서열을 보유한 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 RNA 주형을 작제하였다. 본 발명은 또한, 파지티브-극성의 이형성 유전자 코딩 서열을 보유한 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스RNA 주형의 작제에 관한다. 이런 이형성 유전자 서열에는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 서열이 포함된다.
도1은 NDV 미니게놈의 개요도를 보여준다. 상부 도면은 T7 프로모터; 5' 말단 서열(게놈 RNA의 5'말단, 191nt); 삽입된 뉴클레오티드(CTTAA); CAT ORF의 667nt; 3'말단 서열(게놈 RNA의 3'말단, 121nt), Bbs1 뉴클레아제 부위를 보유한 PNDVCAT를 보여준다. 하부 도면은 시험관내 전사로부터 생성된 키메라 NDV-CAT RNA를 보여준다. NDV-CAT 키메라 미니게놈의 NDV-기초한 증폭과 전사의 결과로, 트랜스펙션된 세포에서 CAT 활성이 탐지된다.
도2A-C는 PTMI 발현 벡터의 개요도를 보여준다.
PTM1-NP은 NDV NP 단백질은 인코드한다.
PTM1-P은 NDV P 단백질을 인코드한다.
PTM1-L은 NDV L 단백질을 인코드한다.
도3은 NDV 5'와 3'비-코딩 말단 영역의 RNA 서열(플러스-센스)을 보여준다. CAT 유전자의 5' 서열은 65nt 리드 서열(굵은 선)과 이후의 56nt NP유전자 UTR로 구성된 NDV 플러스 센스 게놈의 121nt 5' 비-코딩 말단 영역을 나타낸다. CAT 유전자의 3' 서열은 127nt L유전자 UTR과 이후의 64nt 트레일러 영역(굵은 선)으로 구성된 NDV 플러스 센스 게놈의 191nt 비-코딩 말단 영역 및 삽입된 뉴클레오티드 cuuaa(아래쪽 케이스)를 나타낸다.
도4A-B는 재조합 NDV 클론 구조의 개요도를 보여준다. 도4B는 HIV Env와 Gag를 발현하는 전염성 NDV를 보여준다. HIV Env와 Gag는 M과 L 유전자사이에 위치한다(상부 패널). HIV Env와 Gag는 NP 유전자의 3'에 위치한다(하부 패널).
도5는 Kurilla et al. 1985 Virology 145:203-212(3'말단)과 Yusoff et al. 1987 Nucleic Acids Research 15:3961-3976(5'말단)의 서열로 정렬된 NDV의 3'와 5'말단의 개요도를 보여준다.
도6은 외래 유전자의 NDV-기초한 발현을 위한 플라스미드-기초의 역유전학 방법을 보여준다. 세포는 T7 중합효소를 발현하는 재조합 우두 바이러스로 감염시킨다. 또한, 세포는 1) T7 프로모터(각각, pTM1-L, pTM1-NP, pTM1-P)의 전사조절하에 NDV의 L, NP, P 단백질을 인코드하는 플라스미드 DNA 및 2) T7 프로모터(pT7-NDV-CAT-RB)의 전사조절하에 키메라 NDV-CAT 미니게놈을 인코드하는 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시킨다. NDV-CAT 미니게놈의 적절한 3'말단은 리보자임 서열(RB)로 절단하여 달성한다. NDV-CAT 키메라 미니게놈을 증폭하고 전사하면, 트랜스펙션된 세포에서 탐지가능한 CAT 활성이 나타난다. NDV-CAT 미니게놈의 3'와 5'말단에서 비코딩 영역은 검은색 박스로 표시한다.
도7은 합성 DNA로부터 NDV 회수를 보여준다. 세포는 T7 중합효소를 발현하는 재조합 우두 바이러스로 감염시킨다. 또한, 세포는 1) T7 프로모터(각각, pTM1-L, pTM1-NP, pTM1-P)의 전사조절하에 NDV의 L, NP, P 단백질을 인코드하는 플라스미드 DNA 및 2) T7 프로모터(pT7-NDV+-RB)의 전사조절하에 NDV 안티게놈을 인코드하는 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시킨다. NDV 안티게놈의 적절한 3'말단은 리보자임 서열(RB)로 절단하여 달성한다. NDV 안티게놈을 증폭하고 전사하여 전염성 NDV 바이러스를 회수한다. NDV 안티게놈의 3'와 5'말단에서 비코딩 영역은 검은색 박스로 표시한다.
도8은 NDV 안티게놈내에 내부 전사 단위로 삽입된 외래 유전자의 NDV-기초한 발현을 보여준다. 세포는 T7 중합효소를 발현하는 재조합 우두 바이러스로 감염시킨다. 또한, 세포는 1) T7 프로모터(각각, pTM1-L, pTM1-NP, pTM1-P)의 전사조절하에 NDV의 L, NP, P 단백질을 인코드하는 플라스미드 DNA 및 2) T7 프로모터(pT7-NDV-CAT-RB)의 전사조절하에 키메라 NDV-CAT 안티게놈을 인코드하는 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시킨다. 키메라 NDV-CAT 안티게놈에서, CAT 개방해독틀은 야생형 NDV의 자연발생 개방해독틀로 구성된다. 키메라 NDV-CAT 안티게놈의 적절한 3'말단은 리보자임 서열(RB)로 절단하여 얻는다. 키메라 NDV-CAT 안티게놈을 증폭하고 전사하면, 트랜스펙션된 세포에서 탐지가능한 CAT 활성이 나타난다. 키메라 NDV-CAT 안티게놈의 3'와 5'말단에서 비코딩 영역은 검은색 박스로 표시한다.
5. 본 발명의 설명
본 발명은 이형성 유전자, 돌연변이된 뉴캐슬 질병 바이러스 유전자 또는 상이한 균주에서 유래된 바이러스 유전자의 복합체를 발현하는 유전자조작된 뉴캐슬 질병 바이러스및 바이러스 벡터에 관한다. 본 발명은 적당한 숙주세포에서 이형성 유전자 산물을 발현하고, 바이러스 입자에서 이형성 유전자를 회수하기 위하여, 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소와 함께 사용되는 재조합 네거티브 가닥 NDV 바이러스 RNA 주형의 작제와 용도에 관한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 이형성 유전자 산물은 사람 면역결핍 바이러스의 게놈으로부터 유래된 펩티드 또는 단백질이다. 본 발명의 RNA 주형은 DNA-의존성 RNA 중합효소, 예를 들면, 박테리오파아지 T7, T3, SP6 중합효소 또는 진핵 중합효소(중합효소 I)를 이용한 적절한 DNA 서열의 전사로, 시험관내 또는 생체내에서 만들 수 있다.
재조합 RNA 중합효소는 상보성을 가능하게 하는 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 발현하는 연속/트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있는데, 여기서, NDV-CL(캘리포니아 균주/11914/1944-유사 균주)(Meindl et al., 1974 Virology 58:457-463) RNA의 5'말단과 3'말단 뉴클레오티드가 측면에 접한 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자의 코딩 영역(네거티브 센스 방향)을 보유한 클로된 DNA의 RNA 전사체는 DNA 중합효소 단백질을 발현하는 세포로 트랜스펙션시켰다. 적절한 구체예에서, 키메라 NDV를 회수하기 위하여 비-바이러스 의존성 복제 시스템을 사용하는데, 여기서, NDV 게놈 또는 안티게놈을 인코드하는 플라스미드 DNA는 바이러스의 특이적 복제와 발현에 필요한 뉴캐슬 질병 바이러스 단백질의 최소 집합을 인코드하는 플라스미드 DNA와 동시 발현시킨다.
생체내에서 NDV를 재구성하는 능력은 외래 유전자를 발현하는 또는 돌연변이 NDV 유전자를 발현하는 신규한 키메라 NDV 바이러스의 고안을 가능하게 한다. 생체내에서 NDV를 재구성하는 능력은 NDV의 상이한 균주로부터 유전자를 발현하는 신규한 키메라 NDV의 고안을 가능하게 한다. 이런 목적을 달성하는 한가지 방법은 기존의 NDV 유전자를 변형시키는 것이다. 가령, HN 유전자를 변형시켜, 외부 도메인상의 외래 서열을 보유하도록 한다. 이형성 서열이 병원균의 에피토프 또는 항원인 경우, 이들 키메라 바이러스는 이들 결정부위가 유래된 질병원에 대한 보호 면역 반응을 유도하는데 사용할 수 있다.
본 발명에 따라, 키메라 RNA을 작제하는데, 여기서 사람 면역결핍 바이러스의 gp160 코딩 영역으로부터 유래된 코딩 서열은 NDV의 HN 코딩 서열로 삽입시키고 이런 키메라 RNA의 트랜스펙션으로부터 만들어진 키메라 바이러스 분절은 야생형 NDV로 감염시킨 숙주 세포에 넣는다. 게다가, 이런 키메라 바이러스는 척추동물 체액반응과 세포-매개된 면역반응을 유도할 수 있어야 한다. 본 발명은 또한, 재조합 또는 키메라 NDV 바이러스에 의한 인터페론 및 관련 경로의 유도에 관한다.
본 발명은 종양 항원을 비롯한 광범위한 바이러스 또는 항원에 대항하는 백신을 제조하는데 사용되는 본 발명의 바이러스 벡터와 키메라 바이러스의 용도에 관한다. 본 발명의 바이러스 벡터와 키메라 바이러스는 체액면역반응, 세포 면역반응을 촉진하여 또는 항원에 대한 관용을 촉진하여 개체의 면역계를 조정하는데 사용할 수 있다. 이 글에서 개체는 사람, 영장류, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이, 조류, 설치류를 의미한다. 종양 항원을 전달하는 본 발명의 백신은 면역 매개된 거부반응에 기인한 질병, 예를 들면, 비-충실암 또는 소형의 충실암에 걸린 개체를 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 이 글에서 밝힌 바이러스 벡터와 키메라 바이러스를 이용한 종양 항원의 전달은 이후의 치료 내지 대형 충실암의 제거에 유용할 것으로 생각된다. 본 발명은 또한, 암에 걸릴 위험성이 높은 개체를 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 설명의 목적으로 다음의 단계로 구분할 수 있지만, 이들에 국한시키지 않는다: (a) 재조합 RNA 주형의 작제; (b) 재조합 RNA 주형을 이용한 이형성 유전자 산물의 발현; (c) 재조합 바이러스 입자에서 이형성 유전자의 회수. 본 발명을 명확하게 하기 위한 작업 실시예에서 NDV-CL(캘리포니아 균주/11914/1944-유사 균주)를 사용하지만, 임의의 NDV 균주를 사용할 수 있다.
5.1. 재조합 RNA 주형의 작제
본 발명의 특정 구체예는 NDV의 네거티브-센스 게놈 RNA의 5'와 3'말단의 정확한 뉴클레오티드 서열의 확인이다. 본 발명의 NDV 네거티브-센스 게놈 RNA의 5'와 3'말단의 뉴클레오티드 서열은 도5에서 전술한 NDV 3'말단 서열과 상당히 상이하다. NDV 5'와 3'말단의 정확한 뉴클레오티드 서열의 확인은 재조합 NDV RNA 주형의 가공, 재조합 RNA 주형의 발현, 재조합 NDV 입자의 회수를 가능하게 한다. 본 발명에는 도5에서 보인 뉴클레오티드 서열을 보유한 5'와 3'말단뿐만 아니라, 말단에 대한 임의의 변형이나 돌연변이 또는 야생형 말단의 기능, 다시 말하면, 주형을 인식하는 바이러스 RNA-합성 장치에 필요한 신호를 계속 보유하는 임의의 단편이 포함된다.
바이러스 중합효소 결합부위/프로모터의 상보체, 예를 들면 본 발명의 3'-NDV 바이러스 말단의 상보체 또는 3'와 5'-NDV 바이러스 말단의 상보체가 측면에 접한 이형성 유전자 코딩 서열은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 작제할 수 있다. 생성된 RNA 주형은 네거티브-극성으로, 바이러스 RNA-합성 장치가 주형을 인식할 수 있도록 하는 적당한 말단 서열을 보유한다. 대안으로, 바이러스 RNA-합성 장치가 주형을 인식할 수 있도록 하는 적당한 말단 서열을 보유한 파지티브-극성 RNA 주형을 사용할 수 있다. 이들 하이브리드 서열을 보유한 재조합 DNA 분자는 DNA-의존성 RNA 중합효소, 예를 들면, 박테리오파아지 T7, T3, SP6 중합효소 또는 진핵중합효소(중합효소 I)등으로 클론하고 전사시켜, 바이러스 중합효소 인식과 활성을 가능하게 하는 적당한 바이러스 서열을 보유한 재조합 RNA 주형을 시험관내 또는 생체내에서 만들 수 있다.
또 다른구체예에서, 본 발명의 키메라 바이러스내에 거의 모든 이형성 서열을 작제할 수 있는데, 이런 서열의 예로는 1) 병원균의 특이적인 항원; 2) 자가면역 질환의 특이적인 항원; 3) 알레르기원의 특이적인 항원; 4) 종양의 특이적인 항원을 들 수 있지만, 이들에 국한시키지 않는다. 가령, 본 발명의 키메라 바이러스로 조작해 넣을 수 있는 이형성 유전자 서열에는 사람 면역결핍 바이러스의 에피토프(HIV)(예, gp160); B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg); 헤르페스 바이러스의 당단백질(예, gD, gE); 폴리오바이러스의 VP1; 비바이러스(예, 몇몇 박테리아 기생충) 병원균의 결정부위가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.
자가면역질환의 특이적인 항원은 포유동물 조직의 세포표면, 세포질, 핵, 미토콘드리아등으로부터 유래한 것인데, 이런 항원에는 당뇨병, 다발성경화증, 전신 홍반성 루프스, 류마티스 관절염, 비타민12결핍성, 아디슨 병, 경피증, 자가면역성 위축성 위염, 청소년 당뇨, 디스콜드 홍반성 루프스의 특이적인 항원이 포함된다.
알레르기성 항원은 일반적으로 단백질 또는 당단백질인데, 여기에는 화분, 먼지, 곰팡이, 포자, 비듬, 곤충, 음식으로부터 유래된 항원이 포함된다.
종양 항원에 특이적인 항원은 종양 조직의 세포표면, 세포질, 핵, 소기관, 세포등으로부터 유래한 것이다. 여기에는 종양 단백질의 특이적인 항원(돌연변이된 종양 유전자에 의해 인코드되는 단백질 포함); 종양과 관련된 바이러스 단백질; 당단백질이 포함된다. 종양에는 여러 형태: 입, 비인두, 인두와 구강, 식도, 위, 결장, 직장, 간, 방광, 췌장, 후두, 폐, 기관지에서 유래된 종양; 피부, 유방, 목, 자궁, 난소, 방광, 신장, 뇌와 신경계, 흉선, 전립선, 고환의 흑색종; 홉킨슨씨 병; 비-홉킨스씨 림프종; 다발성 경화증; 백혈병이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.
본 발명의 특정 구체예에서, 이형성 서열은 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 가급적 사람 면역결핍 바이러스-1 또는 사람 면역결핍 바이러스-2로부터 유래한 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 이형성 코딩 서열은 NDV 유전자 코딩 서열내에 삽입하여, NDV 바이러스 단백질내에 이형성 펩티드 서열을 보유하는 키메라 유전자 산물을 발현시킨다. 본 발명의 이런 구체예에서, 이형성 서열은 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 가급적 사람 면역결핍 바이러스-1 또는 사람 면역결핍 바이러스-2로부터 얻을 수 있다.
이형성 서열이 HIV-유래한 경우, 이런 이형성 서열에는 env 유전자로부터 유래된 서열(즉, gp160, gp120, 또는 gp41의 전체 또는 일부를 인코드하는 서열), pol 유전자(즉, 역전사효소, 엔도뉴클레아제, 프로테아제 또는 인테그라제의 전체 또는 일부를 인코드하는 서열), gag 유전자(p7, p6, p55, p17/18, p24/25, tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, 또는 vpx의 전체 또는 일부를 인코드하는 서열)가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.
또 다른 구체예에서, 키메라 바이러스로 조작해 넣을 수 있는 이형성 유전자 서열에는 면역증강활성을 갖는 단백질을 인코드하는 서열이 포함된다. 면역증강활성 단백질의 예로는 사이토킨, 1형 인터페론, 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터루킨 -1, -2, -4, -5, -6, -12을 들 수 있지만, 이들에 국한시키지 않는다.
이들 하이브리들 분자를 작제하는 한가지 방식은 이형성 코딩 서열을 NDV 유전자의 DNA 상보체에 삽입하여, 이형성 서열의 측면에 바이러스 중합효소 활성을 위해 필요한 바이러스 서열; 다시 말하면 바이러스 중합효소 결합 부위/프로모터(이후 바이러스 중합효소 결합 부위와 폴리아데닐화 부위로 총칭)이 위치하도록 하는 것이다. 적절한 구체예에서, 이형성 코딩 서열의 측면에는 5'와 3'말단의 복제프로모터, 유전자 개시와 종결 서열, 5' 및/또는 3' 말단에서 관찰되는 패킹 신호로 구성되는 바이러스 서열이 위치한다. 대안으로, 바이러스 중합효소 결합 부위를 인코드하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 바이러스 게놈 분절의 3'말단 또는 양말단의 상보체와 이형성 코딩 서열을 결찰시켜 하이브리드 분자를 작제할 수 있다. 이전에 표적 서열내에 외래 유전자 또는 외래 유전자의 분절을 배치하려면, 표적 서열내 적당한 제한 효소 위치가 존재해야 했다. 하지만, 최근에는 분자생물학의 발전으로, 이런 문제가 상당히 줄어들었다. 제한 효소 위치는 특정 위치 돌연변이유발을 이용하여 표적 서열내 임의의 위치에 배치할 수 있다(Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82;488). 아래에서 설명하는 중합효소 사슬 반응(PCR) 기술을 변화시켜, 서열의 특정 부분(예를 들면 제한 효소 부위)을 삽입시킬 수 있고, 하이브리드 분자를 용이하게 작제시킬 수 있다. 또는 PCR 반응을 이용하여 클로닝 필요없이 재조합 주형을 만들 수 있다. 예를 들면, PCR 반응을 이용하여, DNA-관련된 RNA 중합효소 프로모터(가령, 박테리오파아지 T3, T7, SP6)를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자를 만들 수 있고, 이형 유전자 및 NDV 중합효소 결합 부위를 포함하는 하이브리드 서열을 만들 수 있다. 그 다음 RNA 주형은 이와 같은 재조합 DNA로부터 바로 전사시킨다. 또 다른 구체예에서, 재조합 RNA 주형은 이형 유전자의 네가티드 극성과 RNAs 결찰효소를 이용한 바이러스성 중합효소 결합 부위를 지정하는 RNA를 결찰시켜 준비할 수 있다. 바이러스 중합효소 활성에 서열 유고성 및 본 발명에서 이용되는 구조체에 대해서는 하기에서 논의한다.
5.1.1. 이형성 유전자 서열을 HN, P, NP, M, F, L 유전자로 삽입
이형성 유전자 생성물을 섭입하는데, HN, P, NP, M, F, L 단백질을 인코드하는 유전자 단편을 이용할 수 있다. 이들 단편의 임의 부분에 외부 유전자 서열을 삽입할려면, 외부 유전자를 바이러스 코딩 부분에 완전하게 치환시키거나 또는 부분적으로 치환시키면 된다. 완전한 치환은 PCR에 의한 돌연변이생성을 통하여 실시하는 것이 바람직하다. 간단하게 설명하면, PCR 프라이머 A에는 5' to 3' 단부방향으로 다음과 같은 부분을 포함할 수 있다; 클래스 IIS 제한 효소 부위(가령, "쉬프트" 효소; 이는 특정 서열을 인지하여, 이서열의 상류 또는 하류 부분 DNA를 절단한다); NDV 유전자 부분에 상보적인 뉴클레오티드 부분; 외부 유전자 생성물의 카르복시-말단 코딩 부분에 상보적인 뉴클레오티드 부분. PCR B 프라이머에는 5' to 3'방향으로 다음을 포함한다; 독특한 제한 효소 부위; NDV 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 부분; 외부 유전자의 5' 코딩 부분에 상응하는 뉴클레오티드 부분. 이와 같은 프라이머와 외부 유전자의 클론된 복사본을 이용한 PCR 반응 후에, 생성물을 잘라내어, 독특한 제한효소 부위를 이용하여 클론한다. 클래스 ⅡS 효소로 절단하고, 정제된 파아지 중합효소를 이용하여 전사시키면, 외부 유전자 삽입물이 있는 RNA 유전자의 정확한 해독안된 단부를 포함하는 RNA 분자를 만들 수 있다. 또 다른 구체예에서는, PCR 프라임된 부분을 이용하여, 박테리오파아지 프로모터 서열을 포함하는 이중 가닥의 DNA와 하이브리드 유전자 서열을 만들 수 있는 데, 이는 클로닝없이 직접 RNA 주형에서 전사될 수 있다.
5.1.2. HN 유전자내로 이형성 유전자 서열의 삽입
NDV의 헤마코글루티닌 및 뉴라미니다제 활성은 한 개 유전자 HN에 코드되어있다. HN 단백질은 바이러스의 주요 표면 당단백질이다. 바이러스의 다양성 가령, 인플루엔자등의 경우에, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 단백질은 다양한 항원 부위를 포함하고 있는 것으로 알려져있다. 결과적으로 이 단백질은 감염후에 체액 면역 반응의 잠재적인 표적이 된다. 따라서, HN내에 항원성 부분을 외부 단백질 일부로 대체하면 이와 같은 외부 펩티드에 대해 왕성한 체액 반응을 제공할 수 있다. 서열을 HN 분자내에 삽입하면, 이는 HN의 외 표면에 발현되어, 면역원성이 된다. 예를 들면, HIV의 gp160에서 유도된 펩티드가 HN 단백질의 항원성 부위에 대체되면, 두가지 체액 면역 반응을 유도할 수 있게 된다. 다른 방법으로, 외부 펩티드 서열을 임의 바이러스 서열을 결손시키지 않고 항원성 부분내에 합입시킬 수도 있다. 이와 같은 구조체의 발현 생성물은 외부 항원에 대한 백신에서 유용하게 이용될 수 있고, 처음에 언급한 것과 같은 문제점을 피할 수 있는데, 즉, 백신화된 숙주에서 재조합 바이러스가 증식하는 등의 문제를 회피할 수 있다. 항원성 부분만 치환된 고유 HN 분자는 HN 기능을 할 수 있기 때문에, 살아있는 바이러스 구조를 만들 수 있다. 따라서, 이와 같은 바이러스는 추가 헬퍼 기능없이도 생장할 수 있다. 이들 바이러스를 다른 방법으로 약독화시켜, 사고로 인해 빠져나올 경우등의 임의 위험을 피할 수 있다.
다른 하이브리드 구조체를 만들어서, 세포 표면에 단백질이 발현되도록 하거나 세포로부터 이들 단백질이 방출될 수 있도록 한다. 표면 당단백질로써, HN은 세포 표면으로 이동하는데 필수적인 아미노 말단 절단되는 시그날 서열을 가지고 있고, 막에 고정하는데 필수적인 카르복시-말단 서열도 가지고 있다. 세포 표면에고유 외부 단백질이 발현되도록 하기 위해서는 하이브리드 단백질을 만들기 위해 이와 같은 HN 시그날을 이용하는 것이 필수적이다. 이와 같은 경우에, 융합 단백질은 추가 내부 프로모터로부터 별도의 융합 단백질로 발현될 수 있다. 또는 이동 시그날만 있고, 막 고정 도메인이 없는 경우에는 단백질이 세포로부터 방출된다.
5.1.3. 이중 시스트론 RNA 작제 및 이형성 단백질 발현
이중 시스트론 mRNA를 작제하여, 바이러스 서열의 해독을 내부에서 개시하고, 정규 말단 개시 부위에서 외부 단백질 코딩 서열 발현을 시킨다. 또는, 이중 시스트론 mRNA 서열을 작제하는데, 이때 바이러스 서열은 정규 말단 오픈 리딩 프레임에서부터 해독되고, 외부 서열은 내부 부위에서부터 개시된다. 특정 내부 리보좀 유입 부위(IRES)를 이용할 수 있다. 선택된 IRES 서열은 뉴캐슬 질병 바이러스 포장 한계를 간섭하지 않을 정도로 짧아야 한다. 따라서, 이와 같은 이중 시스트론 방식에서 선택되는 IRES는 길이가 500개 뉴클레오티드를 넘지 않는 것이 바람직하고, 더욱 적절하게는 250개 뉴클레오티드가 되어야 한다. 또한, 이용되는 IRES는 피콘바이러스 요소와 서열을 공유하거나 구조적으로 상동성이 없는 것이 바람직하다. 적절한 IRES 요소에는 포유류 BiP IRES 및 간염 C 바이러스 IRES가 포함될 수 있으나, 이에 한정시키지는 않는다.
또는, 외부 단백질은 새로운 내부 전사 단위에서부터 발현될 수 있는데, 이때 전사 단위는 개시 부위 및 폴리아데닐화 부위를 가진다. 또 다른 구체예에서, 외부 유전자는 NDV 유전자에 삽입되어, 만들어진 발현된 단백질은 융합 단백질이 된다.
5.2. 재조합 RNA 주형을 이용한 이형 유전자 생성물의 발현
상기에서 설명한 것과 같은 재조합 주형은 적절한 숙주 세포에서 이형성 유전자 생성물을 발현시키거나 또는 이형성 유전자 생성물을 발현시키는 키메라 바이러스를 창조하는 등의 다양한 방법에서 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 재조합 주형을 이용하여 적절한 숙주 세포에 감염시키거나, 상당한 수준에서 이형성 유전자 생성물을 직접 발현시킬 수 있다. 상당한 수준으로 발현의 발현을 제공하는 숙주 세포 시스템에는 NDV로 초감염된 세포주와 같은 바이러스 기능을 공급하는 연속 세포주, NDV 기능을 보충하도록 조작된 세포주등이 포함된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 재조합 주형을 이용하여, 이형성 유전자 생성물을 발현시키기 위해, 바이러스성 중합효소 단백질을 발현시키는 세포주에 감염시킨다. 이를 위해, L 단백질과 같은 중합효소 단백질을 발현시키는 형질변환된 세포주를 적절한 숙주 세포로 이용할 수 있다. 숙주 세포를 유사하게 조작하여, 다른 바이러스 기능을 제공하거나 NP 또는 HN와 같은 추가 기능을 제공할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 헬퍼 바이러스는 세포가 이용하는 RNA 중합효소 단백질을 제공하여, 이형성 유전자 생성물을 발현시킬 수 있도록 한다.
또 다른 구체예에서, 세포에 NP, P, L 단백질과 같은 바이러스성 단백질을 인코드하는 벡터를 형질도입시킬 수 있다. 이와 같은 벡터는 도 2A-2C에서 예시하고 있다.
5.3.키메라성 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 준비
키메라 바이러스를 준비하기 위해, 플라스 및 마이너스 센스에서 NDV 게놈또는 외부 단백질을 코딩하는 변형된 NDV 바이러스 RNAs, cDNAs 또는 RNA를 이용하여 세포에 감염시키는데, 세포는 복제 및 탈출을 위한 바이러스성 단백질 및 기을을 제공하거나, "모체" NDV 바이러스로 감염시킨다. 또 다른 방식에서, 게놈 또는 항-게놈 NDV RNA(야생형 또는 변형된 형)을 인코드하는 플라스미드를 바이러스성 중합효소 단백질 가령, NP, P, L를 인코드하는 플라스미드와 같이 숙주 세포에 공동 감염시킨다. 또 다른 구체예에서, 항-게놈성 NDV RNA를 코딩하는 플라스미드를 바이러스성 중합효소 단백질 P, L를 인코드하는 플라스미드와 같이 공동 감염시키는데, NP 중합효소 단백질은 NDV 게놈의 항-게놈성 복사체에 의해 전사된 첫 번째 단백질이기 때문에, in trans에서 NP 중합효소를 추가로 제공할 필요가 없다.
본 발명의 구체예에서, 역 유전학 기술을 이용하여, 키메라 네거티브 RNA 바이러스를 조작할 수 있는데, 이 기술은 바이러스 중합효소가 인지할 수 있고, 성숙한 비리온을 만드는데 필수적인 포장 시그날의 필수부분인 네가키브 가닥 바이러스 RNA의 넌-코딩 부분을 포함하는 합성된 재조합 바이러스 RNA를 준비하는 것과 관계있다. 합성된 재조합 플라스미드 DNAs 및 RNAs는 복제되어, 당분야 임의 공지된 기술을 이용하여 감염성 바이러스 입자로 빠져나올 수 있다(U.S. Patent No. 5,166,057(November 24, 1992); U.S. Patent No. 5,854,037(December 29, 1998); European Patent Publication EP 0702085A1(February 20, 1996); U.S. Patent Application Serial No. 09/152,845; PCT WO97/12032(April 3, 1997); WO96/34625 (November 7, 1996); EP-A780457; WO 99/02657(January 21, 1999); WO 98/53078(November 26, 1998); WO 99/02530(January 22, 1998); WO 99/15672(April1, 1999); WO 98/13501(April 2, 1998); WO 97/06270(February 20, 1997); EPO 780 47SA1(June 25, 1997).
네거티브 가닥 RNA 바이러스를 빼내기 위해 역 유전학 기술을 적용시키는데는 다양한 방법이 있다. 우선, 조재합 DNA 주형에서 재조합 RNAs를 합성하고, 정제된 바이러스성 중합효소 복합체와 합께 in vitro에서 재구성시켜, 세포를 감염시키는데 이용할 수 있는 재조합 리보핵단백질(RNPs)를 만든다. 다른 방법으로, 바이러스성 중합효소 단백질이 in vitro 또는 in vivo에서 합성 RNAs 전사동안에 존재하는 경우에는 좀더 효과적인 트랜스펙션을 시킬 수 있다. 이와 같은 방식으로 합성된 RNAs는 cDNA 플라스미드에서 전사되고, 이때, 중합효소 단백질을 인코드하는 cDNA도 in vitro에서 함께 전사되거나 또는 중합효소 단백질 존재하에 in vivo에서 전사되는데, 예를 들면, 중합효소 단백질을 일시적으로 또는 구성요소로써 발현시키는 세포내에서 전사될 수 있다.
또 다른 방법에서, 역 유전학 기술 및 재분류 기술을 복합하여 자연 선별, 돌연변이생성에 의해 발생 또는 역 유전학 기술)이용함으로써, 단편 RNA 바이러스내에 원하는 에피토프를 가지는 약독화된 바이러스를 만들 수 있다. 예를 들면, 약독화된 바이러스(자연 선별, 돌연변이생성에 의해 발생 또는 역 유전학 기술에 의해 수득) 및 원하는 백신 에피토프를 가지는 가닥(자연 선별, 돌연변이생성에 의해 발생 또는 역 유전학 기술에 의해 수득)을 단편화된 게놈을 재분류할 수 있게 허용하는 숙주에 공동 감염시킬 수 있다. 약독화된 표현형 및 원하는 에피토프를 모두 나타내는 재분류된 부분을 선택할 수 있다.
재분류후에, 새로운 바이러스를 분리하여, 이들의 게놈을 하이브리드 분석을 통하여 확인할 수 있다. 여기에서 설명하는 추가 방법으로, 감염성 키메라 바이러스 생산은 NDV 바이러스 중합효소 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주 세포 시스템(가령, 바이러스/숙주 세포 발현 시스템; 중합효소 단백질을 발현시킬 수 있도록 조작된 형질변환된 세포주)에서 복제할 수 있어, 감염성 키메라 바이러스가 빠져나올 수 있다. 이와 같은 경우에, 헬퍼 바이러스를 이용하지 않아도 되는데, 그 이유는 이와 같은 기능은 발현된 바이러스성 중합효소 단백질에서 제공하기 때문이다.
본 발명에 따르면, 당분야에 공지된 임의 기술을 이용하여 키메라 바이러스의 복제 및 구출시킬 수 있다. 안 가지 방법은 숙주 세포에 트랜스펙션시키기 전에 in vitro에서 복제에 요구되는 바이러스 단백질 및 기능을 제공하는 것이다. 이와 같은 구체예에서, 바이러스 단백질은 야생형 바이러스, 헬퍼 바이러스, 또는 재조합에 의해 발현된 바이러스 단백질 형태로 공급될 수 있다. 바이러스 단백질은 키메라 바이러스를 인코드하는 합성 cDNAs 또는 RNAs의 전사 전후에 또는 전사 동안에 공급될 수 있다. 전체 혼합물을 이용하여, 숙주 세포를 감염시킬 수 있다. 또 다른 방식에서, 복제에 요구되는 바이러스 단백질 및 기능은 감염 또는 트랜스펙션을 통하여 숙주 세포로 도입되는 바이러스 단백질을 발현시키는 야생형 바이러스, 헬퍼 바이러스, 바이러스 추출물, 합성 cDNAs 또는 RNAs 형으로 공급된다. 이와 같은 감염/트랜스펙션은 키메라 바이러스를 인코드하는 합성 cDNAs 또는 RNAs 도입전에 또는 동시에 발생된다.
특히 바람직한 방법은 모든 NDV 바이러스 유전자를 발현시키도록 조작된 세포는 원하는 유전자형을 포함하는 감염성 키메라 바이러스를 생산하게 되어; 선별 시스템이 필요없다. 이론상으로, NDV의 6개 유전자중 임의 한 개 부분을 외부 서열로 대체시킬 수 있다. 그러나, 이부분의 필수 부분은 결손 바이러스를 증식시키는 능력이 있다(정상적인 바이러스 유전자가 결손되가나 변형되기 때문에 결손바이러스가 된다). 많은 가능한 방법이 이와 같은 문제를 우회할 수 있도록 한다. 한 가지 방식에서, 돌연변이 단백질를 가지는 바이러스는 동일한 야생형 단백질을 구조적으로 발현시킬 수 있도록 조작된 세포주에서 생장시킬 수 있다. 이와 같은 방식에 의해 세포주는 바이러스에 있는 돌연변이를 보상한다. 유사한 기술을 이용하여 NDV 유전자의 임의 유전자를 구조적으로 발현시키는 형질변환된 세포주를 작제할 수 있다. 바이러스 단백질을 발현하도록 만들어진 이와 같은 세포주를 이용하여 재조합 바이러스에 있는 결손을 보충시키고, 따라서 이를 증식시킨다. 또는, 특정 자연 숙주 범위 시스템을 이용하여 재조합 바이러스를 증식시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 복제에 요구되는 바이러스 단백질 및 기능을 합성 cDNAs 또는 RNAs 형의 유전자 물질로 공급할 수 있어, 이들은 키메라 바이러스를 인코드하는 합성 cDNAs 또는 RNAs와 함께 전사될 수 있다. 특히 바람직한 방식에서 키메라 바이러스, 바이러스성 중합효소 또는 다른 바이러스 기능을 발현시키는 플라스미드를 실시예에서 설명하는 것과 같은 숙주 세포에 공동 감염시킨다.
재조합 바이러스를 증식시키는 또 다른 방식은 야생형 바이러스와 공동 배양하는 것이다. 이는 재조합 바이러스를 단순히 취하여, 이것과 다른 야생형 바이러스(적절하게는 백신 균주)를 세포에 공동 감염시키면 된다. 이와 같은 야생형 바이러스는 결손 바이러스 유전자 생성물을 보충시킬 수 있고, 야생형 및 재조합 바이러스 모두를 생장시키게 한다. 또는, 헬퍼 바이러스를 이용하여 재조합 바이러스 증식을 지원할 수 있다.
또 다른 방식에서, 합성 주형이 NDV 바이러스 중합효소 단백질을 발현시키는 재조합 바이러스로 공동 감염된 세포에서 복제될 수도 있다. 사실, 이와 같은 방법을 이용하면, 본 발명에 따른 재조합 감염성 바이러스를 구출시킬 수 있다. 이를 위애, NDV 중합효소 단백질이 임의 발현 벡터/숙주 세포 시스템에서 발현될 수 있는데, 여기에는 바이러스 발현 벡터(가령, 종두 바이러스, 아데노바이러스, 베쿨로바이러스등) 또는 중합효소 단백질을 발현시키는 세포주등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다(Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2709-2713). 또한, 6개 모두 NDV 단백질을 발현하는 숙주 세포 감염으로 감염성 키메라 바이러스 입자를 생산하게 된다. 이와 같은 시스템으로 선별 시스템이 필요없게 되고, 생산된 재조합 바이러스도 원하는 유전자형이 된다. 바이러스 생존능에 변화없이 재조합 바이러스를 작제하는 것도 가능하다. 이와 같은 변형된 바이러스는 요구성으로 생장할 수 있고, 복제를 위해 헬퍼 기능이 요구되지도 않는다.
5.4. 키메라 바이러스를 이용한 백신 조성물
본 발명에는 본 발명의 조작된 네거티브 가닥 RNA 바이러스로 구성된 백신 조제물이 포함된다. 본 발명에는 NDV 감염에 대해 L-보호를 제공할 수 있도록 백신 조성물에 변형된 재조합 NDV 바이러스를 이용하는 것이 포함된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 NDV 바이러스를 운반체로 이용하여, 다양한 병인균에대해 보호 반응을 유도하는 외부 에피토프를 발현시킬 수 있다.
본 발명에는 사람 및 동물에 투여할 수 있는 백신 조제물이 포함된다. 특히, 본 발명에는 개, 고양이와 같은 집에서 기르는 동물; 여우, 너구리와 같은 야생 동물 및 소, 말, 돼지, 양, 염소등의 가축 및 닭 및 칠면조와 같은 가금류등이 포함된다.
본 발명에는 NDV, 전염성 마렉 질병 바이러스(MDV), 전염성 점액낭성 바이러스(IBDV), 전염성 후두기관염 바이러스(IBV), 전염성 점액낭염 바이러스(IBV), 닭 전염성 빈혈 바이러스(CAV), 전염성 후두염 바이러스(ILV), 조류 백혈병 바이러스(ALV), 세망내피증 바이러스(RV), 조류 인플루엔자 바이러스등을 일으키는 조류 질병에 유용하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에는 광견병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 고양이 디스템프 바이러스등을 포함하는 가축 질병에 유용한 백신 조성물이 포함된다. 또 다른 구체예에서 본 발명에는 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 우질 바이러스, 가두(swinepox)바이러스에 대해 가축류를 보호하는 백신 조성물 및 광견병에 대해 야생 동물을 보호하는 백신 조성물에 관한 것이다.
역 유전학 방식에 의해 만들어지는 약독화된 바이러스를 여기에서 설명하는 백신 및 제약학적으로 조성물에 이용할 수 있다. 역 유전학 기술을 이용하여, 백신 생산에 중요한 다른 바이러스 유전자에 추가 돌연변이를 만들 수 있는데, 예를 들면, 유용한 백신 변이체의 에피토프를 약독화된 바이러스내로 조작할 수 있다.또는, 다른 바이러스 또는 비-바이러스성 병인균에서 유도된 항원을 포함하는 완전한 외부 에피토프를 약독화된 균주내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 관련없는 바이러스 예를 들면, HIV(gp160,gp120,gp41), 기생충 항원(가령, 말라리아), 세균성 또는 곰팡이 항원 또는 종양 항원과 같은 바이러스의 항원을 약독화된 균주로내 도입시킬 수도 있다. 또는 in vivo에서 바이러스의 트로피즘을 변경시키는 에피토프를 본 발명의 키메라 감소된 바이러스내로 도입시킬 수 있다.
실제, 임의 이형성 유전자 서열을 백신에 이용할 수 있도록 하기 위해 본 발명의 키메라 바이러스에서 작제시킬 수 있다. 적절하게는 임의 다양한 병인균에 대해 보호성 면역 반응을 유도하는 에피토프 또는 중화 항체에 결합할 수 있는 항원이 키메라 바이러스에 의해 또는 이의 일부에 의해 발현될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 바이러스내로 작제될 수 있는 이형성 유전자 서열에는 인플루엔자 당단백질을 포함하나 이에 국한되지는 않는데, 특히, 헤마글루티닌 H5, H7, 마렉스 질병 바이러스 에피토프; 전염성 점액낭성 바이러스(IBDV)에 대한 에피토프, 전염성 후두기관염 바이러스(IBV) 에피토프, 전염성 점액낭염 바이러스(IBV) 에피토프, 닭 전염성 빈혈 바이러스(CAV) 에피토프, 전염성 후두염 바이러스(ILV) 에피토프, 조류 백혈병 바이러스(ALV) 에피토프, 세망내피증 바이러스(RV) 에피토프, 조류 인플루엔자 바이러스(AIV) 에피토프, 광견병 바이러스 에피토프, 고양이 백혈병 바이러스 에피토프, 고양이 디스템프 바이러스 에피토프, 수포성 구내염 바이러스 에피토프, 우질 바이러스 에피토프, 가두(swinepox)바이러스 에피토프등이 포함된다; Fields et al., (ed), 1991, Fundamental Virology, Second Edition RavenPress, New York)
본 발명의 또 다른 구체예에서, 키메라 바이러스내로 조작될 수 있는 ld형성 유전자 서열에는 면역 강화 활성을 가지는 단백질을 인코드하는 것이 포함된다. 이와 같은 면역강화 단백질로는 사이토킨, 인터페론 1, 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터루킨 -1,-2,-4,-5,-6,-12등이 포함된다.
또한, 백신에 이용할 수 있는 본 발명의 키메라 바이러스내로 작제될 수 있는 이형성 유전자에는 사람의 면역결핍 바이러스(HIV) 적절하게는 타입 1 또는 2에서 유도된 서열이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 적절한 구체예에서, 항원의 원료로 이용될 수 있는 면역원성 HIV-유도된 펩티드를 척추동물 면역 반응을 유도하는데 이용될 수 있는 키메라 NDV내에 작제시킬 수 있다. 이와 같은 HIV-유도된 펩티드에는 env 유전자(가령, gp160,gp120, gp41의 전부 또는 일부를 인코딩하는 서열); pol 유전자(가령, 역 전사효소, 엔도뉴클레아제, 프로테아제, 인테그라제 전부 또는 일부를 인코드하는 서열); gag 유전자(가령, p7,p6,p55,p16/18,p24/25의 일부 또는 전부를 인코드하는 서열); tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, vpx등이 포함되나 이에 국한시키지 않는다.
다른 이형성 서열은 간염 B 바이러스 표면 항원(HBsAG); 간염 A 또는 C 바이러스 표면 항원; 입스타인 바(Epstein Barr) 바이러스의 당단백질, 사람의 파필로마바이러스의 당단백질; 호흡기 합포체 바이러스의 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스, 센다이 바이러스, 원숭이바이러스 5, 또는 유행성이하선염 바이러스; 인플루엔자 바이러스의 당단백질; 허피스 바이러스의 당단백질(gD, gE); 폴리오바이러스의 VP1; 박테리아 또는 기생충등과 같은 비-병인성 바이러스의 항원 결정체등에서 유도될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 면역글로블린 유전자의 일부 또는 전부가 발현될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 에피토프를 닮은 항-이디오타입 면역글로블린의 다양한 부분이 본 발명의 키메라 바이러스내에 작제될 수 있다.
종양 항원에서 다른 이형성 서열을 유도할 수도 있어, 생성된 키메라 바이러스는 종양 세포에 대해 면역 반응을 발생시키는데 이용되어, in vivo에서 종양의 퇴행을 유도한다. 이와 같은 백신은 다른 치료섭생과 병행할 수 있는데 예를 들면, 화학요법, 방사능요법, 외과술, 골수 이식등 종양을 치료하는데 이용되는 요법등이 포함된다. 본 발명에 따르면, 재조합 바이러스를 조작하여, 종양-관련된 항원(TAAs)을 발현시키는데, 예를 들면 T 세포가 인지하는 사람 종양 항원(Robbins and Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628-636); 흑혈구 세포계 단백질 gp100, MART-1/MelanA, TRP-1(gp75), 티로시나제; 종양 특이적으로 다양하게 공유되는 항원, MAGE-1,MAGE-3,BAGE,GAGE-1,GAGE-1, N-아세틸글루토사미닐트란스퍼라제-V, p15; 종양-특이적으로 돌연변이된 항원, β-카테인, MUM-1, CDK4; 유방, 난소, 골의 비-흑색종 항원, 췌장 암종, HER-2/neu, 사람의 파필로마바이러스-E6,-E7, MUC-1 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
살아있는 재조합 바이러스 백신 또는 비활성화된 재조합 바이러스 백신이 만들어질 수 있다. 숙주에서 복제함으로써 유사한 종류의 자극을 연장시킬 수 있고, 자연 감염에서 발생할 수 있는 정도로 하여, 실질적으로 상당시간동안 지족되는 면역성을 제공하기 때문에 살아있는 백신이 바람직하다. 이와 같은 살아있는 재조합바이러스 백신 조제물을 생산하는데에는 세포 배양물에서 바이러스를 증식시키는 통상적인 방법 또는 병아리 배의 요막에서 바이러스를 증식시킨 후에 정제하는 방법으로 실시할 수 있다. 또한, NDV는 사람에게는 바-병인성으로 알려져있기 때문에, 이와 같은 바이러스가 살아있는 백신으로 매우 적합하다.
이에 대해, 백신용으로 유전적으로 조작된 NDV(벡터)는 이와 같은 균주에서 약독화된 성질이 있는 것이 바람직하다. 트랜스펙션에 이용되는 주형내로 적절한 돌연변이(가령, 결손)을 도입시키면, 약독화된 성질을 가지는 신규한 바이러스를 제공할 수 있다. 예를 들면, 온도 감응성 또는 차가운 환경에 적응할 수 있는 것과 연관된 특정 미스센스 돌연변이를 결손 돌연변이내에 만들 수 있다. 이와 같은 돌연변이는 차가운 또는 온도 감응성 돌연변이보다도 안정적이고, 역전 빈도도 상당히 낮다.
또는 "자살" 특징을 가지는 키메라 바이러스를 작제할 수 있다. 이와 같은 바이러스는 숙주내에 단 1회 또는 수회 복제과정을 거친다. 백신으로 이용할 경우에, 재조합 바이러스는 제한된 복제 과정을 거치고, 충분한 면역 반응 수준을 유도한 후에 사람 숙주에서는 더 이상 복제하지 못하고, 질병을 일으킨다. NDV 유전자의 한 개 이상이 부족한 재조합 바이러스 또는 돌연변이된 NDV 유전자를 가지는 재조합 바이러스는 연속적인 복제 과정에 돌입할 수는 없다. 결손 바이러스는 이와 같은 유전자를 영구적으로 발현시키는 세포주에서 생산될 수도 있다. 필수 유전자가 부족한 바이러스는 이와 같은 세포주에서는 복제될 수 있으나, 사람에게 투여되었을 때, 복제 과정을 마칠수는 없다. 이와 같은 조제물은 비진행적인 과정으로전사 및 해독되나, 면역 반응을 유도할 수 있을 정도는 된다. 또는 다량의 균주를 투여하였을 경우에, 이와 같은 조제물은 비활성화된(죽은) 바이러스 백신으로 작용한다. 비활성화된 백신의 경우에, 이형성 유전자 생성물은 바이러스 성분으로 발현되어, 유전자 생성물은 비리온과 연합되는 것이 바람직하다. 이와 같은 조제물의 장점은 고유 단백질을 포함하고 있고, 포르말린 또는 죽은 바이러스 백신을 제조하는데 이용되는 다른 물질로 처리하는 비활성화 과정이 필요없다는 것이다. 또는, cDNA에서 만들어진 돌연변이된 NDV는 상당히 약독화되어 있어, 단지 수차례만 복제한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 비활성화된 백신 조제물은 통상의 기술을 이용하여 키메라 바이러스를 죽일 수 있도록 만들 수 있다. 비활성화된 백신은 이들의 감염성이 파괴되었기 때문에 "죽은" 것이라고 할 수 있다. 이상적으로 바이러스의 감염성은 이의 면역원성에 영향을 주지않고 파괴할 수 있다. 비활성화된 백신을 준비하기 위해, 키메라 바이러스는 세포 배양물 또는 병아리 배 요막에서 생장시킬 수 있고, 구역 한외원심분리를 이용하여 정제하고, 포름알데히드 또는 β-프로피로락톤등으로 비활성화시킬 수 있다. 생성된 백신을 근육내로 접종한다.
비활성화된 바이러스는 면역학적 반응을 강화시키기 위해 적절한 어쥬번트와 함께 조제한다. 이와 같은 어쥬번트에는 미네랄 겔 가령, 수산화 알루미늄; 리소레시틴, 플로닉 폴리올, 폴리안이온과 같은 표면 활성 물질; 펩티드; 오일 에멸젼; BCG 및 코리네박테리윰 파르붐과 같은 유용한 사람 어쥬번트등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
다양한 방법을 이용하여 상기에서 설명하는 백신 조제물을 도입시킬 수 있는데, 예를 들면, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 경로를 이용할 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다. 적절하게는 특정 병인균에 맞게 고안된 백신은 병인균의 자연 감염 경로를 통하여 키메라 바이러스 백신을 도입시키는 것이다.
6. 실시예; 재조합 NDV에 의한 외부 유전자의 발현 및 포장
NDV 미니게옴을 이용한 클로람페니콜 전이 효소 유전자(CAT) 발현을 설명한다. NDV 미니게놈은 CAT 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pNDVCAT를 이용하여 준비하였다. pNDVCAT 플라스미드는 다음의 서열을 차례로 포함하는 pUC19 플라스미드이다; T7-프로모터; NDV RNA 넌코딩 서열의 191개 뉴클레오티드로 구성된 NDV 게놈 RNA의 5'말단; 5개의 삽입된 뉴클레오티드(3'CTTAA); 역순의 상조적인 순서로된 클로람페니콜 전이 효소(CAT) 유전자의 완전한 코딩 서열; NDV RNA 넌코딩 서열의 121개 뉴클레오티드로 구성된 NDV 게놈 RNA의 3'말단; BbsI 클로닝 부위 및 주형의 런-오프 전사를 허용할 몇 개의 제한효소 부위. pNDVCAT는 T7 중합효소를 이용하여 전사시켜, 역방향으로 CAT 유전자 주변에 인접한 뉴캐슬 질병 바이러스-센스를 가지는 RNA를 만든다.
파라믹소바이러스 RNA 길이는 RNA 복제 수준을 결정하게 된 주요 인자가 되는데, 게놈 복제는 총 뉴클레오티드의 수가 6배수일 때 가장 효과적이다. NDV의 경우에, 복제에서 6배수 법칙이 중요한지를 검사하기 위해, 1 내지 5개 뉴클레오티드로 다양하게 한 다양한 길이의 CAT 미니-리플리콘을 만들어서 검사하였다. 6으로 나눌수 있는 개놈의 구조만이 높은 CAT 활성을 유도할 수 있었다.
6.1. 뉴캐슬 질병 바이러스 미니게놈의 작제
상기에서 설명한 것과 같이, NDV 미니게놈을 작제하기 위해, 다음의 전략을 이용하였다. 게놈 NDV RNA의 5'말단 서열은 당분야에 표준 기술을 이용하여 RACE(Gibco, BRL)에서 얻었다. RACE 반응의 주형은 NDV 비리온에서 정제한 RNA 게놈이다(NDV-CL:California/11914/1944-). 도 3에서 볼 수 있는 것과 같이 이와 같은 말단 서열은 64개의 뉴클레오티드로 된 추적 서열과 L 유전자의 해독안된 부분 127 뉴클레오티드로 구성된다. 191개 바이러스 뉴클레오티드 서열에 인접하게는 5개 뉴클레오티드 서열(3'CCTTAA)이 삽입되어 있다. CAT 유전자는 5' 및 3' 넌코딩 부분사이에 위치한 CAT 오픈 리딩 프레임의 667개 뉴클레오티드로 구성된다. NDV 서열의 3'말단 부분을 수득하기 위해서, RT-PCR를 이용하였다. in vitro에서 RT-PCR 반응의 주형은 NDV의 폴리아데닐화된 게놈 RNA이다. 도 3에서 설명한 것과 같이 121개 뉴클레오티드의 3'말단 부분은 NP db의 해독안된 부분의 56개 뉴클레오티드와 리더 서열의 65개 뉴클레오티드로 구성된다. 도 1에서는 NDV 미니게놈의 생성된 구조체를 보여준다. 도 3에서는 3'및 5'넌-코딩 말단 부분의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
6.2. NDV NP, P & L 발현 플라스미드의 작제
단락 5에서 설명한 것과 같이, 네가티드 가닥 RNA 게놈의 전사 또는 복제에는 바이러스내에 몇 가지 단백질 성분이 있어야 하는데, 예를 들면, L 단백질, P 단백질, NP 단백질등이 된다. NDV 미니게놈으로부터 발현시키기 위해서는 L, P,NP 단백질 각각을 인코드하는 유전자를 도 2A-2C에서 설명하는 것과 같은 pTM1 발현 벡터에 클론시킨다. pTM1 발현 벡터는 T7 프로모터, 원하는 유전자(L,P, NP)를 삽입하기 위한 몇 개의 클로닝 부위, T7 종료물질, 복제를 위한 pUC19 복제, 암피실린 저항 유전자등이 포함된다. 발현 플라스미드를 작제하기 위해, NDV 핵단백질(NP)의 전체 길이 DNA, 인단백질(P), 중합효소(L)등은 RT-PCR 증폭으로 얻을 수 있다. 이와 같은 DNA는 T7 중합효소 발현 벡터 pTM1에 각각 클론시킨다(도 2A-C).
6.3. NDV 미니게놈의 RNA 전사
NDV 미니유전자 플라스미드의 RNA전사는 제조업자가 지정한 것과 같이 Ribomax 키트(Promega)를 이용하여 실행하였다. 런-오프 전사를 허용하기 위해, 1㎍ NDV 미니유전자 플라스미드(pNDVCAT)를 Bbs I로 절단하였다. 선형화된 플라스미드를 전사 반응의 주형으로 이용하였다(37℃에서 2시간). 주형 DNA를 제거하기 위해, 생성된 반응 혼합물은 RNase-없는 DNAse로 처리하였다(15분간 37℃). 그리고 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전시켰다.
6.4. 세포 트랜스펙션
Cos-1 세포 또는 293T 세포를 35mm 배양접시에서 생장시키고, 트랜스펙션 1시간전에 약 1moi에서 헬퍼 바이러스 rVV T7로 감염시켰다. 세포는 그 다음 NDV의 Np,P,L를 인코드하는 발현벡터로 트렌스펙션시킨다. 특히, 트랜스펙션은 DOTAP(Boehringer Mannheim)으로 실행하였다. 헬퍼 바이러스 감염후에, 세포에 4시간동안 pTM1-NP(1㎍), pTM1-P(1㎍), pTM1-L(0.1㎍)를 감염시킨다. 기준 트랜스펙션으로는 L 단백질이 결핍된 것으로 이는 pTM1-NP(1㎍), pTM1-P(1㎍), 가짜 pTM1-L(0.1㎍)으로 세포에 나란하게 실행하였다. 4시간 배양 후에, 세포에 0.5㎍ NDV-CAT 키메라 (-)RNA로 RNA 트랜스펙션시킨다(도 1). RNA 트렌스펙션후에, 세포를 18시간동안 배양시킨다. 세포 용해물질은 수득하여 CAT 검사를 한다.
6.5. CAT 검사
표준 과정에 따라 CAT 검사를 실시한다(Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051). 검사에는 10㎕14C-클로람페니콜(0.5μCi;8.3nM; NEN), 20㎕ 40mM 아세틸-CoA(BOehringer), 50㎕ 세포추출물/0.25M Tris 완충액(pH7.5)이 포함된다. 배양 시간은 16~18시간이다.
6.6. 결과
NP,P,L 발현 벡터 및 NDV-CAT RNA로 감염된 각 세포에서, 감염후 18시간에 높은 CAT 발현 활성을 얻을 수 있었다. 또한, L-단백질이 결핍된 기준 세포에는 CAT 발현이 없었다.
7. 특정 재조합 DNA에서 유도된 RNA를 이용한 전염성 NDV 바이러스 구출
하기 단락에서 설명하는 실험은 특정 재조합 DNA에서 유도된 RNA를 이용한 전염성 NDV를 추출하는 것을 설명하는 것이다. 키메라 NDV-CAT RNA에 상응하는 RNA를 이용하면 바이러스 RNA의 5'말단의 191개 뉴클레오티드 및 3'말단의 121개 뉴클레오티드가 NDV RNAs의 전사, 복제, 포장에 필수적인 시그날을 포함한다는 것을 알 수 있다. NDV 게놈의 모든 전사 단위를 포함하는 RNA는 트랜스펙션된 플라스미드에서 발현된다. 따라서, 이와 같은 기술을 이용하면 이들 게놈의 부위-특이적인 돌연변이 생성 및 cDNA 클론을 이용하여 전염성 NDV 바이러스를 조작할 수 있다. 또한, 이와 같은 기술을 이용하여, 조직 배양, 동물 및 사람에서 유전자 발현을 위한 효과적인 벡터로 이용할 수 있는 전염성 키메라 NDV 바이러스를 작제할 수 있다.
8. 실시예: NDV 게놈내에 삽입된 HIV 항원 gp160 에피토프를 포함하는 뉴캐슬 질병 재조합 바이러스
여기에서 설명하는 실시예에서는 키메라 NDV를 작제하여, HIV의 gp160에서 유도된 이형성 항원을 발현시킨다. 하기에서 설명하는 실험에서는 재조합 RNA 주형을 이용하여, NDV 게놈내에 HIV gp160-유도된 펩티드를 발현시키는 키메라 NDV를 만들고, 이와 같은 키메라 NDV를 이용하여 척추동물 체액 및 세포-중개된 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.
8.1. 플라스미드 작제
HIV gp160 단백질을 발현시키는 NDV 재조합 cDNA 클론을 당분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 작제할 수 있다. 예를 들면, 도 4에서 설명하는 것과 같이, HIV Env 및 Gag 단백질을 다양한 위치에 NDV로 삽입시킬 수 있다. 한 예에서, Env 및 Gag 단백질은 M 및 L 유전자 사이에 삽입될 수 있고, 다른 실시예에서는 Env 및 Gag 단백질은 NP 유전자의 3'에 삽입될 수 있다(리더 서열과 NP 사이). 또는 이와 같은 HIV 단백질은 3' 말단에 있는 NDV 외피 단백질(HN 및 F)에 결합될 수 있다. 이와 같은 단백질은 NDV 유전자의 임의 부분에 삽입될 수 있다.
8.2. 전염성 키메라 바이러스의 생성
재조합 NDV 게놈을 포함하는 플라스미드에서 유도된 RNA 트랜스펙션은 COS, 293 MDBK와 같은 세포로 트랜스팩션될 수 있고, 기존에 설명한 것과 같이 전염성 키메라 바이러스를 선별할 수 있다(미국 특허 5,166,057 참고). 생성된 RNA는 표준 트랜스펙션 프로토콜을 이용하여 야생형 바이러스에 감염된 세포내로 트랜스펙션시킬 수 있다. 트랜스펙션 후에, 상청액은 수득하여, 다양한 희석비로 NDV 항혈청이 존재하에 새로운 세포에 겸염시킨다. 상청액은 또한 동일한 항혈청 존재하에 플락 검사에 이용할 수도 있다. 추출된 바이러스를 정제하고, 특징을 조사하여, 항체 생산에 이용할 수도 있다.
8.3. 헤마글루티닌 저해 및 바이러스 중화 검사
Palmer, D.F. et al., 1975, Immunol. Ser. 6:51-52에서 설명하는 것과 같이 헤마글루티닌 저해(HI)검사를 실행하였다. 단클론 항체(2G9, 4B2, 2F1O, 25-5)는 사람 항-gp120 단클론 항체를 이용한 표준 과정으로 준비할 수 있다. 단클론 항체를 포함하는 복수는 Palmer, D.F. et al., 1975, Immunol. Ser. 6:51-52에서 설명하는 것과 같은 수용체-파괴 효소로 처리한다.
바이러스 중화 검사에서는 30㎜ 직경의 배양 접시에 있는 세포에 바이러스를 감염시킨다. 1h 흡착후에, 다른 희석비를 이용하여 항체를 포함하는 한천을 덮는다. 그 다음 세포 단층은 감염 72시간에 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 착색시킨다.
8.4. 면역
6주된 BALB/c 생쥐는 에어로졸 루트를 통하여 바이러스로 감염시키거나 또는10㎍의 정제된 바이러스를 복강(i.p.)에 투여하여 면역한다. 모든 추가예방주사의 경우, 10㎍의 정제된 바이러스를 i.p에 주사한다. 혈청은 각 예방주사 7일후에 수거한다.
8.5. 방사면역분석
방사면역분석은 전술한 바와 같이 실시한다(zahouani, H. et al., 1991, Proc. NA시. Acad. Sci. USA 88:5645-6549). 간단히 말하면, 미소역가 평판은 5㎍/㎖ 펩티드-BSA 공액체로 피복하고, 인산염-완충 식염수(PBS)에 녹인 2% BSA로 포화시키고, 다양하게 희석한 혈청과 함께 배양하였다. 결합된 항체는125I 라벨된 안티생쥐 kappa 단클론 항체를 이용하여 노출시킨다.
8.6. 면역침강
H9 사람 T 세포주는 HIV로 활발하게 감염시킨다. 감염 4일후, 5x107감염된 세포는 ㎖당 100 μCi 동위원소를 함유한 배지에서, 2x106/㎖의35S-시스테인,35S-메티오닌,3H-이소루이신으로 라벨한다. 20시간의 대사라벨링후, 방사활성 비리온은 45,000rpm에서 1시간동안 원심분리하여 펠렛한다. 이후, 펠렛은 1% Triton X-100과 2mM 불화페닐메틸설포닐(PMSF)을 함유한 1.0㎖ 세포용해 완충액에서 재현탁시킨다. 대략 20㎕의 혈청 또는 0.5㎕의 단클론항체(20㎕ PBS)와 175㎕의 비리온 용해질은 0.5% 황산도데실나트륨(SDS), 1㎎/㎖ BSA, 2% Triton X-100, 50mM 인산나트륨(pH 7.4)을 함유한 0.5㎖ 면역침전 완충액에서 4℃로 하룻밤동안 배양한다.항원-항체 복합체는 단백질 A-세파로즈 비드에 결합시키고, 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔상에서 전기영동하여 분석한다.
8.7. HIV-1 중화분석
시험관내 중화분석은 전술한 바와 같이 실시한다(Nara, P.L. et al., 1987, AIDS Res. Hum. Retroviruses 3:283-302). 간단히 말하면, 연속 2번 희석한 가열-불활화된 혈청은 H9 세포에서 생성된 HIV 바이러스의 152-200 합포체 형성 유니트와 함께 실온에서 1시간동안 배양한다. 바이러스/혈청 혼합물은 50,000 DEAE-덱스트란 처리한 CEMss 세포(폴리-L-리신을 이용하여 미세평판 접시에 부착) 또는 50,000 H9 현탁세포와 함께 37℃에서 1시간동안 배양한다. 바이러스 흡수후, 결합되지 않은 바이러스는 제거하고, 200㎕ 배지를 각 웰에 첨가한다. 감염 4일후, 50㎕의 상층배지는 바이러스 p24gag단백질 정량(Coulter Source, Inc.)을 위해 제거한다. CEMss 세포에서 합포체의 총수는 감염 5일후 계수한다. 중화역가는 바이러스 단독의 대조군 웰에 비교하여 계산하고, 50%이상 합포체 수를 감소시키거나 또는 50%이상 p25 합성을 저해하는 최대 혈청 희석의 역수로 표시한다.
8.8. CTL 반응의 유도
BALB/c 생쥐는 107PFU의 키메라 NDV 바이러스를 함유한 0.2㎖ 바이러스 현탁액으로 면역한다. 7일후, 비장세포를 수득하고, 전술한 바와 같이 상층액내 10% 콘카나발린 A의 존재하에 단독 또는 면역원성 펩티드로 피복한 방사선조사된 비장세포로 5일동안 시험관내에서 다시 자극한다(Zaghourni, H et al., 1992, J.Immunol. 148:3604-3609).
8.9 세포용해 분석
펩티드로 피복한 표적 세포는 37℃에서 1시간동안 Na51Cr4(100μCi/106세포)로 라벨한다. 세포는 2번 세척한 후, V-바닥 96-웰 평판으로 이전하고, 주효체 세포를 첨가하고, 37℃, 7% CO2에서 배양한다. 4시간후, 상층액은 수거하고 계수한다. 최대 크롬 방출은 1% Nodidet P40 세제와 함께 세포를 배양하여 측정한다. 특이적 세포용해의 퍼센트는 다음의 식에 따라 계산한다: [(cpm 샘플 - cpm 동시 방출)/(cpm 최대 방출 - cpm 동시 방출)]x100
9. 키메라 NDV-CAT RNA의 세포내 발현
NDV 미니게놈의 발현효율을 증가시키기 위하여, NDV-CAT RNA의 세포내 발현을 위한 플라스미드(pT7-NDV-CAT-RB)를 작제하였다. 이것은 NDV-CAT RNA의 3'말단직후에, 간염 델타 바이러스로부터 유래된 리보자임을 삽입하여 달성하였다. T7 중합효소(MVA-7A)를 발현하는 rVV-T7로 또는 변형된 Ankara 우두 바이러스로 사전 감염시킨 293, 293T, COS1, CV1 또는 닭 배아 섬유아세포(CEF)세포에 pTM1-NP, pTM1-P, pTM1-L, pT7-NDV-CAT-RT를 동시감염시켜, 높은 수준의 CAT 활성을 유도하였다(도6). CAT 활성은 NDV-CAT RNA의 RNA 직접 감염에 비하여 100 내지 1,000배정도 높았다.
10.RNA 유래된 특이적인 재조합 DNA을 이용한 전염성 NDV 바이러스의 회수
비-바이러스 의존성 플라스미드 유래된 시스템으로부터 재조합 바이러스를회수하기 위하여, NDV의 전장 안티게놈의 세포내 발현을 가능하게 하는 플라스미드를 조합하였다. NDV cDNA는 NDV(NDV-CL)의 캘리포니아형 균주(Meindl et al., 1974 Virology 58:457-463)의 정제된 RNA 일부 조각에서 RT-PCR하였다. cDNA 조각은 결찰하고, T7 프로모터와 리보자임 인접서열로 플라스미드내에 조합하여, 플라스미드 pT7-NDV+RB를 만들었다. pT7-NDV+RB의 L 개방해독틀에 새로운 Xmal 제한 위치를 만드는 침묵 돌연변이를 도입하였다. 10cm 접시에서 CEF 세포 단일층은 0.1의 다중 감염도로, MVA-T7로 감염시켰다. 1시간 후, 세포는 2.4㎍ pTM1-NP, 1.2㎍ pTM1-P, 1.2㎍ pTM1-IL, 1.5㎍ pT7-NDV+-RB로 트랜스펙션(리포펙션)시켰다. 37℃에서 8시간 배양후, 새로운 배지를 첨가하였다. 트랜스펙션 20시간후, 우두바이러스 저해물질 araC을 60㎍/㎖ 최종농도로 첨가하였다. 감염 2일후, 100㎍/㎖ araC를 함유한 새로운 배지를 첨가하였다. 감염 4일후 트랜스펙션된 세포의 상층액은 10일된 배발생 계란의 요막강에 접종하였다. 37℃에서 2일동안 배양한 후, 수거한 요막강액은 혈구응집반응으로 NDV-CAT 바이러스 존재에 대하여 양성임을 밝혔다. 회수된 바이러스로부터 분리된 RNA를 분석하여, 새로이 삽입된 Xmal 사이트의 존재를 확인하였는데, 이것은 바이러스가 클론된 플라스미드 cDNA로부터 유래되었다는 것을 시사한다. 회수 과정 프로토콜의 개요도는 도7에서 제시한다.
11. 키메라 NDV 게놈의 내부 시스트론으로부터 외래 유전자의 발현
플라스미드 pT7-NDV+-CAT/RN-RB는 NDV-CL cDNA상의 HN 개방해독틀을 CAT 개방해독틀로 대체하여 작제하였다. 다른 추가된 뉴클레오티드를 비코딩 영역에 첨가하여, 생성된 키메라 NDV RNA의 전체 뉴클레오티드 길이가 6개로 분할할 수 있도록 하였다. MVA-T7 바이러스로 사전 감염시킨 CEF 단일층에, pT7-NDV+-CAT/HN-RB,
pTM1-NP, pTM1-P, pTM1-L을 동시 감염시키면, 트랜스펙션 2일후에 측정한 것과 동일한 CAT활성이 유도되었다(도8). 이들 결과는 NDV 게놈에 전사단위로 클론된 외래 유전자의 발현을 위한 벡터로서 NDV를 사용할 수 있다는 것을 입증한다.
본 발명은 본 발명의 개별 특징을 설명하기 위한 특정 구체예의 범위로 국한하지 않고, 균등한 임의의 구조체, 바이러스 또는 효소는 본 발명의 범주에 포함된다. 실제로, 이 글에서 제시하고 밝힌 것이외에 본 발명의 다양한 개변은 전술한 명세서와 첨부된 도면으로부터 당업자에게 자명하다.
이 글에서 모든 참고자료는 순전히 참고자료로 한다.

Claims (19)

  1. 재조합 RNA 분자에 있어서, 상기 분자는 뉴캐슬 질병 바이러스의 RNA 중합효소에 특이적인 결합부위 및 NDV 매개된 복제와 전사에 필요한 신호로 구성되고, 이형성 RNA 서열에 연결되어 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 RNA 분자.
  2. 재조합 RNA 분자에 있어서, 상기 분자는 뉴캐슬 질병 바이러스의 RNA 중합효소에 특이적인 결합부위 및 NDV 매개된 복제와 전사에 필요한 신호로 구성되고, 뉴캐슬 질병 바이러스 유전자에 연결되어 효과를 나타내는데, 여기서 RNA 분자는 돌연변이, 삽입 또는 결실을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 RNA 분자.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 중합효소 결합부위는 뉴캐슬 질병 바이러스 RNA 게놈의 3'와 5'-비코딩 인접영역에 포함되어 중합효소 결합부위로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 RNA 분자.
  4. 제 3항에 있어서, 3'와 5'-비코딩 인접영역은 도1에서 보인 바이러스 센스 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 RNA 분자.
  5. 제 1항에 있어서, 이형성 RNA는 바이러스 항원을 인코드하는 것을 특징으로하는 재조합 RNA 분자.
  6. 제 5항에 있어서, 바이러스 항원은 사람 면역결핍 바이러스, 뉴캐슬 질병 바이러스, 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스, 마렉병 바이러스, 감보로병 바이러스, 전염성 점액낭염 바이러스, 닭 전염성 빈혈 바이러스, 전염성 후두기관염 바이러스, 닭 백혈병 바이러스, 세망내피증 바이러스, 닭 인플루엔자 바이러스, 광견병 바이러스, 고양이 디스템프 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 우질 바이러스 또는 가두(swinepox)바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 RNA 분자.
  7. 제 1항의 재조합 NDV 분자 및 NDV RNA 중합효소 단백질 P와 L을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  8. 제 1항 또는 2항의 재조합 RNA 분자를 보유한 네거티브 가닥 RNA 바이러스로 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 바이러스.
  9. 제 8항에 있어서, 이형성 RNA는 바이러스 항원으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 키메라 바이러스.
  10. 제 9항에 있어서, 바이러스 항원은 사람 면역결핍 바이러스, 뉴캐슬 질병 바이러스, 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스, 마렉병 바이러스, 감보로병 바이러스, 전염성 점액낭염 바이러스, 닭 전염성 빈혈 바이러스, 전염성 후두기관염 바이러스, 닭 백혈병 바이러스, 세망내피증 바이러스, 닭 인플루엔자 바이러스, 광견병 바이러스, 고양이 디스템프 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 우질 바이러스 또는 가두(swinepox)바이러스인 것을 특징으로 하는 키메라 바이러스.
  11. 제 8항에 있어서, 이형성 RNA는 뉴캐슬 질병 바이러스의 HN 유전자내에 존재하는 것을 특징으로 하는 키메라 바이러스.
  12. 키메라 네거티브-가닥 RNA 바이러스를 생산하는 방법에 있어서, 제 1항 또는 2항의 재조합 RNA 및 복제와 전사에 필요한 바이러스 기능체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 숙주세포를 트랜스펙션시키고, 배양물로부터 키메라 바이러스를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 약독화된 표현형을 유발하기 위한 변형을 보유한 유전자조작된 뉴캐슬 질병 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제로 구성되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 변형은 자연발생 변이체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 이형성 에피토프를 인코드하는 게놈을 보유한 유전자조작된 키메라 뉴캐슬 질병 바이러스 및 제약학적으로 수용가능한 부형제로 구성되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 이형성 에피토프는 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 바이러스 항원은 사람 면역결핍 바이러스, 뉴캐슬 질병 바이러스, 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스, 마렉병 바이러스, 감보로병 바이러스, 전염성 점액낭염 바이러스, 닭 전염성 빈혈 바이러스, 전염성 후두기관염 바이러스, 닭 백혈병 바이러스, 세망내피증 바이러스, 닭 인플루엔자 바이러스, 광견병 바이러스, 고양이 디스템프 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 우질 바이러스 또는 가두(swinepox)바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  18. 제 15항에 있어서, 이형성 에피토프는 면역증강활성 단백질인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  19. 제 15항에 있어서, 이형성 에피토프는 종양 항원인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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