CN104353070B - 一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：S1：扩增传染性支气管炎病毒H120毒株S1基因和H3N2流感病毒HA2基因；S2：构建S1基因和不同长度HA2基因的嵌合基因；S3：将嵌合基因***pFastBac^TM1载体中，转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒穿梭载体；S4：表达重组蛋白；S5：灭活重组杆状病毒和制备油乳化疫苗。通过本发明制备方法制得的疫苗可以显著提高S1蛋白的免疫原性。本疫苗安全、高效能对鸡传染性支气管炎呼吸型强毒M41毒株提供免疫保护。

Description

一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备 方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

传染性支气管炎(IB)是鸡的一种急性、高度接触传染性疾病，由传染性支气管炎病毒(IBV)引起。该病主要侵害鸡的呼吸***、泌尿***和消化***，表现出广泛的组织嗜性和高度的遗传变异性，可导致不同日龄、性别和品种的鸡只发生不同程度的疾病，死亡率较高，有报道腺胃型IB导致的雏鸡死亡率可达95％。除此外，IBV还可侵害肾脏、生殖道、肠道、肌肉等，引起鸡的增重和饲料报酬率降低，产蛋鸡的产蛋量及产蛋品质下降，给养鸡生产带来巨大的损失。该病广泛流行于世界各地，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。

目前，疫苗免疫是对IB防控最有效的手段，其中最常用的是灭活疫苗和减毒活疫苗，另外还有现在比较热门的基因工程疫苗，然而使用的效果一直不够理想。由于IB血清型众多，各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，从而给本病防治带来很大困难，该病的爆发时有发生。现有传染性支气管炎灭活疫苗的免疫效果不理想，对同血清型的毒株的攻毒保护率很少超过50％，主要原因是现有灭活疫苗不能诱导足够高的抗体，因此急需开发安全有效的新型IB疫苗。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种高效的鸡传染性支气管炎病毒疫苗及其制备方法，尤其是一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法。本发明鸡传染性支气管炎病毒S1与H3N2流感病毒HA2融合基因工程亚单位灭活疫苗，该疫苗对鸡传染性支气管炎病具有良好的预防和控制效果。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1：分别扩增传染性支气管炎病毒H120毒株S1基因和H3N2流感病毒HA2基因；

S2：通过overlapping方法构建S1基因和不同长度的HA2基因的嵌合基因S1/HA2；

S3：将嵌合基因S1/HA2***pFastBac^TM1载体中，得到重组载体；将重组载体转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒穿梭载体；

S4：利用昆虫杆状病毒表达***得到重组杆状病毒并表达重组蛋白；

S5：灭活重组杆状病毒和制备油乳化疫苗。

优选地，所述步骤S1包括以下步骤：

S11：抽提传染性支气管炎病毒H120毒株全基因组RNA，将所抽提的全基因组RNA反转录为cDNA及PCR扩增S1基因；

S12：合成H3N2流感病毒HA基因，PCR扩增HA2基因。

优选地，所述步骤S2包括以下步骤：

S21：以S1基因PCR产物为模板扩增得到片段S1；

S22：以HA2基因PCR产物为模板扩增得到不同长度的片段HA2；

S23：以片段S1和不同长度的HA2为模板，以引物S1-F，引物HA2-R为引物，进行Overlapping PCR扩增得到嵌合基因S1/HA2。

优选地，所述步骤S3包括以下步骤：

S31：用SalI和HindIII在37℃分别消化质粒pFastBac^TM1和嵌合基因的PCR产物，在T4连接酶的作用之下，连接各个已消化基因的PCR产物和质粒；

S32：用连接产物转化大肠杆菌DH5α，经Ampr抗性筛选，获得***了不同基因的转化子，对含有转化子的单克隆菌液进行PCR筛选、测序；

S33：将测序正确的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid。

优选地，所述步骤S5包括以下步骤：

S51：灭活重组杆状病毒，灭活剂最终体积浓度为0.1％，37℃灭活16-24小时；

S52：制备油乳化疫苗。

优选地，本发明鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法中使用的表达***为昆虫杆状病毒表达***。

本发明还提供一种通过上述方法制备的疫苗。优选地，所示疫苗的序列如SEQ IDNO：3-5所示。

纤突蛋白S蛋白是传染性支气管炎病毒主要的免疫原性蛋白，含有多种抗原表位，其中位于头部的S1蛋白与诱导产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体有关。本实验室研究发现H3N2亚型流感病毒HA蛋白的跨膜区具有独特的结构，与HA蛋白的稳定性有关，能提高HA蛋白的免疫原性，并且增强HA蛋白的交叉保护效果。本发明使用目前应用最为广泛并且高度商品化的昆虫杆状病毒表达***(Invitrogen)，设计6段不同长度的HA2基因，与S1进行融合表达，然后筛选出能显著提高S1蛋白免疫原性的HA2基因的最佳长度，制备鸡传染性支气管炎病毒S1与H3N2流感病毒HA2融合基因工程亚单位灭活疫苗，该疫苗对鸡传染性支气管炎病具有良好的预防和控制效果。

本发明提供的鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗及其制备方法具有明显的优点和效果。本发明鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗的制备方法根据预测鸡传染性支气管炎主要免疫原性蛋白S1蛋白的免疫原性与H3N2流感病毒HA2氨基酸序列长度的关系，对HA2蛋白氨基酸长度进行调整，采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达***获得重组蛋白，发现了能显著提高S1蛋白的免疫原性的H3N2流感病毒HA2最佳氨基酸序列长度。与传统的传染性支气管炎全病毒灭活疫苗相比，本发明提供了一种安全、高效的鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗，能对鸡传染性支气管炎呼吸型强毒M41毒株提供免疫保护。

附图说明

图1为不同长度HA2基因的示意图。

图2为采用Overlapping PCR对传染性支气管炎病毒H120毒株S1基因及H3N2流感病毒HA2基因不同长度片段的PCR扩增结果。泳道1-6分别对应S1/HA2-(1-6)。

图3为载体pFastBac^TM1示意图。

图4为重组杆状病毒表达质粒rBacmid-S1/HA2-1、rBacmid-S1/HA2-2、rBacmid-S1/HA2-3、rBacmid-S1/HA2-4、rBacmid-S1/HA2-5、rBacmid-S1/HA2-6的PCR检测结果示意图。

图5是重组蛋白westernblot结果。泳道1-6分别对应第1-6种重组蛋白。NC为对照。

图6是鸡传染性支气管炎高效疫苗免疫SPF鸡血清中特异性IgG检测结果。图中1-6分别代表实施例1制备的6种疫苗，7为商业灭活苗对照，8为PBS对照。

具体实施方式

通过下面给出的某些实验的具体实施例子可以进一步清楚地理解本发明。但下述实施例子不是对本发明的限定。本发明中使用的试剂、生物材料，除非特别说明，均是本领域的常规试剂、材料。

实施例1

步骤S1：分别扩增传染性支气管炎病毒H120毒株S1基因和不同长度的H3N2流感病毒HA2基因。具体保护以下2个步骤：

S11、抽提传染性支气管炎病毒H120毒株(购自青岛易邦生物工程有限公司)全基因组RNA，将所抽提的全基因组RNA反转录为cDNA及PCR扩增S1基因；

S12、根据NCBI中序列号为FJ830855的基因序列由Invitrogen公司合成H3N2流感病毒HA基因，PCR扩增HA2基因。

作为本发明的一个优选实施方式，步骤S11具体包括以下步骤：

S111、Trizol法提取病毒全基因组RNA

用Trizol法从含有传染性支气管炎活疫苗(H120株)(购自青岛易邦生物工程有限公司)中提取病毒RNA。取含病毒的鸡胚尿囊液250μL加入到1.5mLRNase-free离心管中，向其中加入750μL的Trizol充分混合均匀，室温静置5min；加入150μL氯仿，剧烈振荡1min混匀，室温静置5min；4℃12000rpm离心15min；将上清液转移至新的1.5mL RNase-free离心管中，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置15min；4℃12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇700μL，轻轻混匀；洗涤1次，4℃12000rpm离心10min；弃去上清，将离心管倒置于滤纸上风干；用20μLDEPC处理水溶解沉淀，-70℃备用。

S112、反转录为cDNA

在RNase-free PCR管按照如下进行配制体系：Total RNA10μL，dNTPs1μL，Random6mers1μL，DEPC-treatedH₂O3μL，总体系15μL，混匀后于65℃水浴反应5min，立刻将PCR管放置冰上2min后，依次加入：5×buffer4μl，RNase inhibitor0.5μl，PrimeScript IIRTase0.5μl，总体系20μL，最后在PCR仪上进行反应，30℃10min，50℃30min，70℃15min。将产物放于-20℃保存。

S113、PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒H120毒株S1基因

扩增S1基因片段的PCR反应体系(50μL)组成如下：5μl 10×PCRBuffer，3μlMgSO4，5μl dNTP(2.5mM)，1μl KOD Plus-Neo高保真酶，1μL引物S1-F，1μL引物S1-R，反转录的cDNA作为模板，最后加水至总体积达到50μL。PCR温度循环程序如下：95℃预变性2min，1个循环；98℃10sec，57℃30sec，68℃3min，30个循环；68℃延伸5min。扩增产物在4℃保存。

作为本发明的一个优选实施方式，步骤S12具体包括以下步骤：

S121、合成H3N2流感病毒的HA基因

根据NCBI中序列号为FJ830855的基因序列由Invitrogen公司合成H3N2流感病毒HA基因。

S122、PCR扩增H3N2流感病毒HA2基因

以人工合成H3N2流感病毒HA基因为模板，以引物HA2-F和引物HA2-R为上下游引物，ExTaqDNA聚合酶扩增目的基因HA2。PCR反应体系如下：5μl 10×ExTaq Buffer，4μldNTP(2.5mM)，1μl ExTaq酶，

1μl引物HA2-F(10μM)，1μl引物HA2-R(10μM)，2μl模板，灭菌双蒸水补足至50μl，瞬时离心混匀。PCR反应条件为：94℃预变性2min，1个循环；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。

步骤S2：Overlapping PCR法扩增融合基因S1/HA2-1、S1/HA2-2、S1/HA2-3、S1/HA2-4、S1/HA2-5、S1/HA2-6。具体包括以下步骤：

S21：以S1基因PCR产物为模板扩增得到片段S1

以S1基因PCR产物为模板，以表1中的引物S1-F为上游引物，以S1-(1-6)-R为下游引物分别扩增片段S1-(1-6)，采用的PCR反应体系和条件同步骤S113。

S22：以HA2基因PCR产物为模板扩增得到片段HA2

设计6段不同长度的HA2基因，片段2、3、4、5、6分别在片段1的基础上依次增加105bp的核苷酸，如图1所示。以步骤S122中HA2的PCR产物为模板，分别以引物HA2-(1-6)-F为上游引物、以引物HA2-R为下游引物(引物序列见表1)，ExTaq DNA聚合酶扩增6种不同长度的HA2基因，即基因HA2-(1-6)。PCR反应体系如下：5μl 10×ExTaq Buffer；4μl dNTP(2.5mM)；1μl引物HA2-(1-6)-F；1μl引物HA2-R；2μl模板；1μl ExTaq酶；灭菌双蒸水补足至50μl瞬时离心混匀。PCR反应条件为：94℃预变性2min，1个循环；94℃30sec，55℃45sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。

S23：以片段S1和不同长度的片段HA2为模板，以引物S1-F和引物HA2-R分别为上下游引物，进行Overlapping PCR扩增得到嵌合基因S1/HA2

以片段S1-1(1611bp)和片段HA2-1为模板，以引物S1-F和引物HA2-R为引物，进行Overlapping PCR扩增得到嵌合基因S1/HA2-1(1752bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1)。同样的，分别以片段S1-2(1611bp)和片段HA2-2(246bp)、片段S1-3(1611bp)和片段HA2-3(351bp)、片段S1-4(1611bp)和片段HA2-4(456bp)、片段S1-5(1611bp)和片段HA2-5(561bp)以及片段S1-6(1611bp)和片段HA2-6(666bp)为模板，以引物S1-F和引物HA2-R为引物，进行Overlapping PCR扩增得到嵌合基因S1/HA2-2(1857bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2)、嵌合基因S1/HA2-3(1962bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：7)、嵌合基因S1/HA2-4(2067bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：4，氨基酸序列为SEQ ID NO：8)、嵌合基因S1/HA2-5嵌合基因(2172bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5，氨基酸序列为SEQ ID NO：9)和嵌合基因S1/HA2-6(2277bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6)。引物两端分别加上Sal I和Hind III酶切位点。具体引物序列见表1。

PCR反应体系如下：5μl10×PCRBuffer；3μl MgSO4；5μldNTP(2.5mM)；1.5μlS1-F(10μM)；1.5μl HA2-R(10μM)；1μl片段1；1μl片段2；1μlKODPlus-Neo高保真酶；灭菌双蒸水补足50μl，瞬时离心混匀。PCR反应条件为：95℃预变性2min，1个循环；98℃10sec，57℃30sec，68℃3min，30个循环；68℃延伸5min。

各嵌合基因的扩增结果如图2，其中1泳道表示嵌合基因S1/HA2-1(1752bp)，2泳道表示嵌合基因S1/HA2-2(1857bp)，3泳道表示嵌合基因S1/HA2-3(1962bp)，4泳道表示嵌合基因S1/HA2-4(2067bp)，5泳道表示嵌合基因S1/HA2-5(2172bp)，6泳道表示嵌合基因S1/HA2-6(2277bp)。观察到相应的特异性条带，各基因片段均PCR扩增成功。

表1 PCR扩增引物表

步骤S3：分别将6种嵌合基因基因***pFastBac^TM1载体。具体包括以下步骤：

S31、用SalI和HindIII在37℃分别消化质粒pFastBac^TM1(购自Invitrogen公司，其结构如图3所示)和各嵌合基因的PCR产物，接着在T4连接酶的作用之下，分别连接各个已消化基因的PCR产物和质粒。

S32、用连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自Takara公司)，经Ampr抗性筛选，获得***了不同基因的转化子。然后用特异性引物对含有不同基因的转化子进行PCR筛选。检测PCR反应体系(20μL)组成如下：2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL上游引物(引物S1-F)，0.5μL下游引物(引物HA2-R)，1μL待检菌液，最后加水至总体积达到20μL。PCR温度循环程序如下：循环1：94℃3min；循环2～26：94℃40sec，56℃40sec，72℃2min；循环27：72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行检测。将PCR鉴定为阳性的克隆，进行质粒的抽提和双酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒送英潍捷基(上海)公司进行序列测定。重组质粒命名为pFastBac1-S1/HA2-1、pFastBac1-S1/HA2-2、pFastBac1-S1/HA2-3、pFastBac1-S1/HA2-4、pFastBac1-S1/HA2-5、pFastBac1-S1/HA2-6。

S33、将6种重组质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒穿梭载体。

将约1μg的测序正确的6种重组质粒分别转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen公司)，经3种抗菌素(庆大霉素、四环素和卡那霉素)的筛选及IPTG的诱导和X-Gal底物反应进行蓝白斑筛选。挑选的阳性克隆置于5ml的LB培养液中(含上述3种抗生素)，经37℃摇床培养16小时，按照实验手册标明的大分子质粒Bacmid小量制备法，提取纯化重组大分子质粒rBacmid。再经PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid，PCR鉴定的反应体系组成如下：2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物M13-F，0.5μL引物M13-R(具体序列见表1)，1μL待检重组大分子质粒，最后加水至总体积达到20μL；PCR温度循环程序如下：循环1：94℃3min；循环25：94℃40sec，56℃40sec，72℃5min：72℃10min。PCR鉴定结果如图4所示，各重组穿梭载体均构建成功，其中1泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-1(4052bp)，2泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-2(4157bp)，3泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-3(4262bp),4泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-4(4367bp)，5泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-5(4472bp)，6泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-1(4577bp)。

步骤S4：将6种重组质粒转染到sf9细胞，获得重组杆状病毒。具体包括以下步骤：

S41、具体转染过程如下：

将处于对数生长期的Sf9细胞接种于6孔板，每孔加入2ml完全Grace培养基(含10％FBS和双抗的1×Grace培养基)，细胞在28℃培养箱培养12h，细胞浓度约为1×10⁶/ml。采用脂质体转染法，将纯化的重组大分子质粒Bacmid与脂质溶液cellfectin(Invitrogen公司产品)混合，转染入sf9细胞中，27℃培养4至5天后，收集细胞培养上清液，3000rpm离心10分钟收集上清液，即为第一代重组病毒，记为P1。再用此上清液感染新培养的sf9细胞，3天后收集细胞培养上清液，为第二代病毒，记为P2。将收获的病毒按上述方法继续传代，得到第三代病毒，记为P3。将6种重组杆状病毒分别命名为rB-S1/HA2-1、rB-S1/HA2-2、rB-S1/HA2-3、rB-S1/HA2-4、rB-S1/HA2-5、rB-S1/HA2-6。对获取的用于放大培养和蛋白表达的重组昆虫杆状病毒进行蚀斑实验，确定病毒的噬斑形成单位(plaque forming units，PFU)。

S42、具体重组杆状病毒噬斑纯化和病毒滴度测定方法如下：

(1)将处于对数生长期的Sf9细胞接种于6孔板，每孔加入1ml完全培养基，细胞在28℃培养箱培养至细胞浓度约为1×10⁶/ml；

(2)用不完全Grace’s培养基将第三代重组病毒P3梯度稀释：10^-1～10^-8；

(3)弃去培养基，PBS洗细胞三次，弃去PBS，将上述稀释好的病毒液缓慢加入细胞表面，400μl/孔，每个稀释度做三个重复，并设正常细胞对照，28℃孵育1h；

(4)7ml2％的琼脂糖+7ml2×Grace’s培养基+1.4mlFBS+140μl的双抗，轻轻混匀；

(5)快速吸走孔中的病毒液，PBS洗细胞三次，将上述混合液缓慢加至细胞表面；

(6)4℃放10min，琼脂糖凝固后将6孔板倒置，28℃培养箱中培养7～10d；

(7)每孔加入1ml0.03％的中性红，28℃培养1h，去染色液，观察噬斑。挑取单个噬斑，加入到接种于对数生长期的Sf9细胞的6孔板中，72小时后，收集上清，PBS吹下细胞，并洗涤三次，超声波破碎细胞，-80℃保存备用；

(8)根据公式：病毒滴度(PFU)＝噬斑数×病毒稀释倍数×1/每孔病毒接种量，计算病毒滴度。

S43、6种重组蛋白在Sf9细胞中的表达及检测。

用经过噬斑纯化的病毒感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)为5的重组杆状病毒感染处于对数生长期的Sf9细胞，28℃培养箱中培养约72h，收集细胞上清，并用PBS吹散贴壁细胞，洗涤三次，超声波破碎细胞，-80℃保存备用。

通过Western-blot实验检测重组蛋白表达情况，具体实验方法如下：将收集超声波破碎好的细胞，4℃，12,000g离心10min，取上清，加入上样缓冲液，煮沸10min，10％的SDS-PAGE电泳检测。用同样的方法处理感染空载体杆状病毒的细胞，作为阴性对照。SDS-PAGE电泳结束后，用半干法将蛋白转移至PVDF膜上。转膜完成后，取出PVDF膜，用1×TBST洗涤液洗膜1次；3％BSA封闭液，4℃封闭膜过夜；1×TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；加入抗IBV全病毒的鸡血清(1：3,000)，室温孵育2h；1XTBST洗涤液洗膜3次，每次5min；加入HRP标记的驴抗鸡二抗(1：5,000)，室温孵育1h；1×TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；ECL solution显色液显色，拍照。结果如图5所示，其中1泳道表示重组杆状病毒rBacmid-S1/HA2-1感染sf9细胞裂解物(约100KDa)，2泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-2感染sf9细胞裂解物(约105KDa)，3泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-3感染sf9细胞裂解物(约110KDa)，4泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-4感染sf9细胞裂解物(约115KDa)，5泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-5感染sf9细胞裂解物(约120KDa)，6泳道表示重组穿梭载体rBacmid-S1/HA2-6感染sf9细胞裂解物(约125KDa)。

步骤S5：油乳化灭活疫苗的制备

灭活重组杆状病毒和油乳化疫苗的制备，具体包括以下步骤：

S51、鉴定成功表达后采用甲醛溶液灭活重组杆状病毒，甲醛最终体积浓度为0.1％，37℃灭活16-24小时。

S52、油乳化疫苗的制备选用法国赛比克公司Montanide ISA71VG佐剂，按照其说明书制备疫苗，油相与水相比例为140g/60g。准备适量的佐剂Montanide ISA71VG置于400mL高型烧杯，将剪切头浸至佐剂中，控制两相温度在20℃以下。向正在剪切的油相中缓慢加入水相(即6种重组蛋白)，确保混合均匀，剪切头上的溢流孔部分应处于乳液页面以上。以剪切速度级别为B-14000×g进行剪切，沿搅拌头移动烧杯，确保乳化均匀。每隔30min用移液器吸出少量液体，滴于水面，观察液滴散开情况，以滴落液滴完全不散开判断为乳化完全。样品存放于4℃保存备用。

实施例2油乳化灭活疫苗免疫SPF鸡

75只SPF鸡购自新兴大华农禽蛋有限公司，于广东温氏食品集团股份有限公司动物实验中心隔离器中饲养。

(1)试验方法

免疫：将10日龄的SPF鸡随机分成7个试验组，每组10只，阴性对照组为5只。其中商用灭活疫苗为鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株+M41株)(购自青岛易邦生物工程有限公司)。疫苗进行颈部皮下接种，接种剂量0.3mL/只；免疫二次，间隔14天。用实施例1制备的各组免疫动物具体免疫实施方式见表2。鸡血清中IgG抗体水平的测定：二次免疫14天后用间接ELISA检测鸡血清中IgG抗体水平，对各组间进行差异显著性分析，*：p<0.05；**：p<0.01。

攻毒试验：试验组鸡免疫4周28天后进行攻毒，对各实验组的鸡用2×10⁴EID₅₀剂量的M41毒株(购自中国兽医药品监察所)通过点眼、滴鼻途径进行攻毒。从攻毒后第二天开始每日观察并记录各组试验鸡的发病情况。在攻毒后2d、4d、6d、8d、10d、12d等6个时间点，每组鸡采集气管棉拭样品进行排毒检测。采集的气管棉拭子样品反复冻融3次后弃去棉拭后1000×g离心10min取上清备用。处理好的样品经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每份样品接种3只鸡胚，弃去24h之内的死亡鸡胚，每日观察并记录鸡胚的死亡情况。接种后96h将所有活胚置于4℃冰箱冻死，无菌收获接种鸡胚尿囊液，打开鸡胚观察胚体病变，如出现充血、出血、水肿、尿酸盐沉积、发育不良等典型的病变特征则判定为病毒分离阳性；对于病毒分离阴性的鸡胚，取尿囊液用IBV M41株引物对其进行RT-PCR检测，对于检测阳性的也判定为病毒分离阳性。对于既无特征性病变，RT-PCR检测结果也为阴性的样品用10日龄SPF鸡胚继续盲传2代。统计最终的病毒分离结果。

表2 鸡传染性支气管炎高效疫苗免疫SPF鸡实验方案

(2)试验结果

用实施例1制备的不同疫苗对10日龄的SPF鸡进行免疫，用ELISA试验检测免疫鸡血清中IgG抗体水平结果见图6。结果如显示：一免14天，28天后第3、4、5组的抗体滴度显著高于第2、6组，极显著高于第1组。第3、4、5组之间的抗体滴度差异不显著。试验组鸡免疫4周后，对各实验组的鸡用2×10⁴EID₅₀剂量的M41毒株(呼吸型标准强毒株)通过点眼、滴鼻途径进行攻毒，攻毒后2-12d，每隔2d从每组分别随机抽取10只鸡采集气管棉拭样品进行病毒分离。结果显示：第3、4、5组于攻毒后4-6d可从气管分离到病毒；第1、2、6组于攻毒后4-8d可从气管分离到病毒；而第7组与PBS空白对照组于攻毒后4-10d可从气管分离到病毒，结果见表3。从IgG抗体水平和攻毒保护率来看，本发明研制的鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗的免疫效果优于商用鸡传染性支气管炎灭活疫苗；其中，第3、4、5实验组的IgG抗体水平较高，攻毒保护率较好，优于第1、2、6组实验组。从IgG抗体水平和攻毒保护率可见第3、4、5实验组的疫苗是最优的鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗。

表3 攻毒后试验鸡气管排毒情况

注：分母为接种鸡的数量，分子为病毒分离阳性鸡的数量。

Claims (8)

1.一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：分别扩增传染性支气管炎病毒H120毒株S1基因和H3N2流感病毒HA2基因；

S2：通过overlapping方法构建S1基因和不同长度的HA2基因的嵌合基因S1/HA2；所构建的嵌合基因序列包括：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5；

S3：将嵌合基因S1/HA2***pFastBac^TM1载体中，得到重组载体；将重组载体转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒穿梭载体；

S4：利用昆虫杆状病毒表达***得到重组杆状病毒并表达重组蛋白；

S5：灭活重组杆状病毒和制备油乳化疫苗。

2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：

S11：抽提传染性支气管炎病毒H120毒株全基因组RNA，将所抽提的全基因组RNA反转录为cDNA及PCR扩增S1基因；

S12：合成H3N2流感病毒HA基因，PCR扩增HA2基因。

3.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下步骤：

S21：以S1基因PCR产物为模板扩增得到片段S1；

S22：以HA2基因PCR产物为模板扩增得到不同长度的片段HA2；

S23：以片段S1和不同长度的HA2为模板，以基因序列为：ATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAG的引物S1-F和基因序列为：TCAGATGCAAATGTTGCACCTAATGT的引物HA2-R为引物，进行Overlapping PCR扩增得到嵌合基因S1/HA2。

4.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤：

S31：用SalI和HindIII在37℃分别消化质粒pFastBac^TM1和嵌合基因的PCR产物，在T4连接酶的作用之下，连接各个已消化基因的PCR产物和质粒；

S32：用连接产物转化大肠杆菌DH5α，经Ampr抗性筛选，获得***了不同基因的转化子，对含有转化子的单克隆菌液进行PCR筛选、测序；

S33：将测序正确的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid。

5.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S5包括以下步骤：

S51：灭活重组杆状病毒，灭活剂最终体积浓度为0.1％，37℃灭活16-24小时；

S52：制备油乳化疫苗。

6.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，使用的表达***为昆虫杆状病毒表达***。

7.一种权利要求1所示的制备方法制得的疫苗。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的序列如SEQ ID NO：3-5所示。