JP6573746B1 - 組み換え鳥パラミクソウイルス - Google Patents

Abstract

外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスであって、前記外来転写単位は、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドは、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列及び遺伝子終結配列に作動可能に連結しており、前記遺伝子開始配列と前記ヌクレオチドと前記遺伝子終結配列との各々の間に、鳥パラミクソウイルスの非翻訳領域が挿入されており、かつ、前記外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡに挿入されている、宿主細胞において外来タンパク質を高発現させることを可能とする、組み換え鳥パラミクソウイルス。

Description

本発明は、組み換え鳥パラミクソウイルス、及び該ウイルスを有効成分とするワクチン用組成物に関する。また、本発明は、前記ウイルスを製造するためのヌクレオチド構築物、該構築物を含む前記ウイルスを製造するためのキット、並びに前記ウイルスを製造するための方法に関する。

インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる、上気道炎症状、呼吸器疾患等を伴う急性感染症であり、感染力が強いものであれば、感染者の症状は重篤となり、死に至る場合もある。

インフルエンザウイルスの天然の宿主は、主に水鳥等の野鳥であり、家禽であるニワトリ等含め、トリの間で流行していきながら、ウイルス系列が進化し、様々な宿主（ブタ、ヒト）に馴化し、種間伝染が発生することになる。

例えば、高病原性鳥インフルエンザ（ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ＨＰＡＩ）ウイルス（ＨＰＡＩＶ）亜型のＨ５Ｎ１ウイルスによって、アジア、ヨーロッパ及びアフリカの多くの国々において数百万の家禽が死に至っており、さらに、１９９７年に流行して以来、臨床的に重大で致死的なヒトの感染をもたらすＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１のトリからヒトへの伝染の数は増え続けている。

ヒトを含む動物のＨＰＡＩＶに対する感受性も鑑みるに、当該ウイルスのトリにおける感染及びその拡大を防御する手段は必須であり、ＨＰＡＩＶに対する有効なワクチンが希求される。

ＨＰＡＩＶに対するワクチンとして、ニューカッスル病（ＮＤ）ウイルス（ＮＤＶ）をベクターとする組み換えワクチンが開発されている。当該ウイルスにＨＰＡＩＶのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子等の抗原遺伝子を挿入した組み換えワクチン（組み換えウイルス）は、飲水、噴霧投与等の省力的なワクチン接種が可能であると共に、ＨＰＡＩＶと同様に呼吸器粘膜に感染するため、局所免疫の誘導が期待できる等の利点がある。

また、ＮＤＶを基にする組み換えウイルスは、ＮＤＶ中のいずれかの転写単位における３’非翻訳領域に、ＮＤＶの内在性のいずれかの遺伝子開始配列及び遺伝子終結配列と、抗原遺伝子とからなる転写単位を挿入することによって作製されている（非特許文献１〜５）。さらに、これら組み換えウイルスにおいては、抗原遺伝子の開始コドンの直前に、真核細胞内で翻訳効率を高める配列として知られているＫｏｚａｋ配列が挿入されており（非特許文献１及び３）、これが抗原遺伝子ｍＲＮＡの翻訳効率を高めていると想定される。

しかしながら、投与対象であるニワトリ等において、基にしているＮＤＶに対する抗体が生成されていると、ワクチン効果が減弱されるという問題がある。養鶏産業ではニワトリに対して経時的にＮＤワクチンを投与しているため、ＮＤＶを基とする組み換えワクチンは、ＨＰＡＩ発生時における緊急用ワクチンとして有効でないことが想定される。そのため、ＮＤワクチンで免疫されたニワトリにおいても使用可能なワクチンの開発が望まれている。

この問題を解決するため、本発明者らは、ＮＤＶの代わりに、当該ウイルスと同じ属（パラミクソウイルス科エイブラウイルス属）に属する別種のウイルス（鳥パラミクソウイルス、ＡＰＭＶ）をベクターとする組み換えワクチンの開発を試みている。そして、ＡＰＭＶの血清型２、６及び１０（ＡＰＭＶ−２、ＡＰＭＶ−６及びＡＰＭＶ−１０）を接種し、これらのウイルスが、ＮＤＶに対する抗体の存在に関わらず、ニワトリの体内で効率良く増殖することを見出している。さらに、これらＡＰＭＶを基にした組み換えウイルスが、ＮＤＶに対する抗体を既に有するニワトリに対しても、抗インフルエンザウイルス活性を付与するためのワクチンとして有望であることも、本発明者らは報告している（非特許文献６）。

しかしながら、ＡＰＭＶ−１０をベクターとし、そのゲノムのＰ遺伝子とＭ遺伝子の間にある非翻訳領域（Ｐ遺伝子のＯＲＦと遺伝子終結配列との間）に、ＨＰＡＩＶのＨＡ遺伝子を挿入した組み換えワクチン ＡＰＭＶ−１０／ＨＡを作製し、当該ワクチンをＮＤワクチンで免疫したニワトリに接種した結果、ＨＰＡＩＶ感染に対する一定の防御効果が認めらたものの、その防御効果（感染単位：１０^６ＥＩＤ_５０のＡＰＭＶ−１０／ＨＡ接種後、ＨＰＡＩＶで攻撃した場合のニワトリの生存率）は２５％と低く、十分なワクチン効果が得られたとは言えないものであった（非特許文献７）。

このような現状故、ＡＰＭＶを基にする組み換えウイルスの実用化には、ワクチン効果を増強することが必要であり、例えばＨＡ等の抗原の発現量を増加させることが考えられる。しかしながら、そのような方法は開発されていなかった。

Ｎａｋａｙａ Ｔ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、２００１年１２月、７５（２３）、１１８６８〜１１８７３ページ Ｚｈａｏ Ｈ．ら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、２００３年４月、８４（Ｐｔ ４）、７８１〜７８８ページ Ｎａｙａｋ Ｂ．ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００９年８月５日、４（８）、ｅ６５０９． Ｚｈａｏ Ｗ．ら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、２０１５年１月、９６（Ｐｔ １）、４０〜４５ページ Ａｎ Ｙ．ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２０１６年、２３：５５ Ｔｓｕｎｅｋｕｎｉ Ｒ．ら、Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、２０１４年８月１５日、１６０（３−４）、１８４〜１９１ページ Ｔｓｕｎｅｋｕｎｉ Ｒ．ら、Ｗ２−Ｅ−０８「鳥パラミクソウイルス２、６および１０をベクターにした鳥インフルエンザワクチンはニューカッスル病ワクチンで免疫したニワトリに対して使用可能である」、第６３回日本ウイルス学会学術集会 抄録、第１５９ページ

本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、宿主細胞において、病原体抗原等の外来タンパク質の発現量を増加させ、病原体に対するワクチン効果の増強を可能とする、組み換え鳥パラミクソウイルスを提供することを目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、以下の特徴を有する、外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが挿入されている組み換えＡＰＭＶ−１０（組み換え鳥パラミクソウイルス）を、作製するに至った。
（１）前記外来転写単位は、ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質（外来タンパク質）をコードするヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドが、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列及び遺伝子終結配列に作動可能に連結している。
（２）前記遺伝子開始配列と前記ヌクレオチドの開始コドンとの間に、鳥パラミクソウイルスの５’非翻訳領域が挿入されている。
（３）前記ヌクレオチドの終止コドンと前記遺伝子終結配列との間に、鳥パラミクソウイルスの３’非翻訳領域が挿入されている。
（４）さらに、前記外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡは、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡに挿入されている。

そして、この組み換え鳥パラミクソウイルスを、ニワトリ初代培養細胞に感染させた結果、当該細胞において外来タンパク質の高い発現が認められた。

一方、非特許文献７に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス、すなわち外来転写単位が、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位中の非翻訳領域に挿入されている組み換えウイルスでは、感染させた細胞における外来タンパク質の発現は殆ど認められなかった。また、鳥パラミクソウイルスの非翻訳領域を含まない外来転写単位が、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域に挿入されている組み換えウイルスでも、感染させた細胞における外来タンパク質の発現は殆ど認められなかった。

また、前記組み換え鳥パラミクソウイルスのワクチン効果を試験すべく、ニワトリにＮＤＶを予め感染させた上で、これら組み換えウイルスを各々投与し、さらにＨＰＡＩＶを感染させた。

その結果、従前の、外来転写単位が内在性転写単位間にある遺伝子間領域に挿入されている組み換え鳥パラミクソウイルスを用いた場合には、ＨＰＡＩＶ感染後のニワトリの生存率は２５％又は５０％であった。また、当該ニワトリの全個体からＨＰＡＩＶの***が認められた。さらに、攻撃時のＨＰＡＩＶに対する抗体価は、殆どのニワトリにおいて検出限界以下であった。また、鳥パラミクソウイルスの非翻訳領域を含まない外来転写単位が、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域に挿入されている組み換えウイルスを用いた場合にも、攻撃時のＨＰＡＩＶに対する抗体価は、殆どのニワトリにおいて検出限界以下であった。

一方、外来転写単位が内在性転写単位間にある遺伝子間領域に挿入されている組み換え鳥パラミクソウイルスを用いた場合には、ＨＰＡＩＶ感染後のニワトリの生存率は１００％であった。また、当該ニワトリにおけるＨＰＡＩＶの***は殆ど認められず、認められたとしても、そのウイルス力価は低かった。さらに、攻撃時のＨＰＡＩＶに対する抗体価は、前記組換えウイルスで免疫した多くの個体で検出された。

また、このような高いワクチン効果は、鳥パラミクソウイルスにおいて、外来転写単位を挿入する遺伝子間領域を変更しても奏されることを確認した。さらに、外来タンパク質がＨＡタンパク質以外のタンパク質であっても、当該タンパク質の発現量は、上述のＨＡタンパク質を組み換え鳥パラミクソウイルスを用いて発現させた場合同様に、増加できることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、組み換え鳥パラミクソウイルス、及び該ウイルス有効成分とするワクチン用組成物に関する。また、本発明は、前記ウイルスを製造するためのヌクレオチド構築物、該構築物を含む前記ウイルスを製造するためのキット、並びにそれらを用いた前記ウイルスを製造するための方法に関し、より具体的には以下を提供する。
＜１＞ 鳥パラミクソウイルスをコードするマイナス鎖ＲＮＡに、外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスであって、
前記外来転写単位において、５’側から順に、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列と、鳥パラミクソウイルスの５’非翻訳領域と、外来タンパク質をコードするヌクレオチドと、鳥パラミクソウイルスの３’非翻訳領域と、鳥パラミクソウイルスの遺伝子終結配列とが連結しており、かつ、
前記外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡに挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルス。
＜２＞ 鳥パラミクソウイルス血清型１０に由来する、＜１＞に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス。
＜３＞ 前記５’非翻訳領域が、配列番号：１〜６のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる領域であり、前記３’非翻訳領域が、配列番号：７〜１２のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる領域である、＜１＞又は＜２＞に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス。
＜４＞ 前記外来タンパク質が、病原体由来の抗原タンパク質である、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス。
＜５＞ 前記外来タンパク質が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質である、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス。
＜６＞ ＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルスを有効成分として含有する、ワクチン用組成物。
＜７＞ 鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドに、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを挿入するための部位を含むクローニング領域が、挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチド構築物であって、
前記クローニング領域において、５’側から順に、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列と、鳥パラミクソウイルスの５’非翻訳領域と、前記部位と、鳥パラミクソウイルスの３’非翻訳領域と、鳥パラミクソウイルスの遺伝子終結配列とが連結しており、かつ、
前記クローニング領域が、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするヌクレオチドに挿入されている、ヌクレオチド構築物。
＜８＞ 前記鳥パラミクソウイルスが鳥パラミクソウイルス血清型１０である、請求項７に記載のヌクレオチド構築物。
＜９＞ 前記５’非翻訳領域が、配列番号：１〜６のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる領域であり、前記３’非翻訳領域が、配列番号：７〜１２のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる領域である、＜７＞又は＜８＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜１０＞ 更に、前記鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドの５’末側に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター配列が連結しており、該ヌクレオチドの３’末側に、５’側から順に、リボザイム配列と前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するターミネーター配列とが連結している、＜７＞〜＜９＞のうちのいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物。
＜１１＞ 外来タンパク質をコードするヌクレオチドが前記部位に挿入されている、＜１０＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜１２＞ 前記外来タンパク質が、病原体由来の抗原タンパク質である、＜１１＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜１３＞ 前記外来タンパク質が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質である、＜１１＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜１４＞ ＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルスを製造するための方法であって、
前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質とを発現する形質転換細胞に、＜１１＞〜＜１３＞のうちのいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を導入する工程と、
前記組み換え鳥パラミクソウイルスを、前記細胞の培養物から回収する工程とを含む、方法。
＜１５＞ 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルスを製造するためのキット
（ａ）＜１０＞〜＜１３＞のうちのいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物
（ｂ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現することができるヌクレオチド構築物
（ｃ）前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質を発現することができるヌクレオチド構築物
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のヌクレオチド構築物を導入するための細胞
（ｅ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質とを発現する形質転換細胞。

なお、本発明の組み換えウイルスの基となる「鳥パラミクソウイルス」は、モノネガウイルス目、パラミクソウイルス科、エイブラウイルス属、鳥パラミクソウイルス種に属するウイルスであり、マイナス鎖の一本鎖ＲＮＡをゲノムとして保持する。

鳥パラミクソウイルスのＲＮＡゲノムは、３’末側に位置するリーダー配列と、５’ 末側に位置するトレーラー配列と、それら配列に挟まれた主要な６つの転写単位（ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬタンパク質の転写単位）をコードするマイナス鎖ＲＮＡとから構成される（なお、ＡＰＭＶ−６においては、ＦとＨＮの間にＳＨタンパク質の転写単位を更に有する）。それらがコードするタンパク質のうち、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを構成するホスホタンパク質（Ｐ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）の３種類のタンパク質（コアタンパク質）は、ゲノムＲＮＡと共に、自律複製可能なレプリコンである複合体（リボヌクレオタンパク質複合体、ＲＮＰ複合体）を形成する。また、マトリックス（Ｍ）タンパク質、並びにウイルスの集合、出芽及びウイルスの細胞付着及び／又は侵入において役割を果たしている膜貫通糖タンパク質（ＨＮ及びＦタンパク質）から構成されるエンベロープによって、前述のＲＮＰ複合体が包まれることによって、鳥パラミクソウイルスの基本構造（ウイルス粒子）が形成される。

また、鳥パラミクソウイルスのゲノムにおいて、転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡの順序は極めて高度に保存されており、３’側から、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬの順に、各転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが直列に配置されている（ＡＰＭＶ−６においては、更にＦとＨＮの間にＳＨが配置れている）。

各転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡは各々、３’末側から順に、遺伝子開始配列（ＧＳ：ｇｅｎｅ ｓｔａｒｔ）をコードするマイナス鎖ＲＮＡ、５’非翻訳領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡ、翻訳領域（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）をコードするマイナス鎖ＲＮＡ、３’非翻訳領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡが、直列的に配置されることによって構成される。さらに、直列に配置された転写単位間は転写されない遺伝子間領域（ＩＧＲ）によって全て隔てられている。

本発明によれば、宿主において、病原体抗原等の外来タンパク質の発現量を増加させ、ひいては病原体に対するワクチン効果を増強することが可能となる。特に、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に対する抗体を保持するニワトリにおいても、本発明によれば、高病原性鳥インフルエンザウイルス（ＨＰＡＩＶ）に対するワクチン効果を発揮させることが可能となる。

鳥パラミクソウイルス（ＡＰＭＶ−１０）ゲノムＲＮＡを転写するためのベクターの概略を示す模式図である。 外来転写単位をＰ遺伝子の転写単位（遺伝子終結配列：ＧＥ）とＭ遺伝子の転写単位（遺伝子開始配列：ＧＳ）との間に挿入したＡＰＭＶ−１０ゲノムと、当該外来転写単位（図中、ｃｏｎｔｒｏｌ〜Ｌ−ＮＣＲ）との、概略を示す模式図である。 外来転写単位をＰ遺伝子の非翻訳領域（Ｐ ＮＣＲ）中に挿入したＡＰＭＶ−１０ゲノムの概略を示す模式図である。 ＡＰＭＶ−１０のＮＰタンパク質、Ｐタンパク質又はＬタンパク質を発現させるためのベクターの概略を示す模式図である。 組み換え鳥パラミクソウイルス（ｐＡＰＭＶ１０／ＨＡ等）を、培養細胞において複製する工程を示す、模式図である。 組み換え鳥パラミクソウイルスを感染させた宿主細胞における、各ウイルスがコードする外来タンパク質の発現量（ＨＡタンパク質）を示す、グラフである。図中、横軸は、宿主細胞に感染させた組み換え鳥パラミクソウイルスを示す（図２及び３参照）。縦軸において、各宿主細胞においてアクチンタンパク質の発現量で補正したＨＡタンパク質の発現量を、さらにｃｏｎｔｒｏｌにおけるそれを基準とした相対値で表す。 ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集試験によってウイルスの増殖性（力価）を測定した結果を示す、グラフである。図中、横軸は、各組み換え鳥パラミクソウイルスを発育鶏卵の漿尿膜腔に接種してからの時間を示し、縦軸は、回収した漿尿膜腔液におけるウイルス力価を示す。 外来転写単位をＦ遺伝子の転写単位（遺伝子終結配列：ＧＥ）とＨＮ遺伝子の転写単位（遺伝子開始配列：ＧＳ）との間に挿入したＡＰＭＶ−１０ゲノムと、当該外来転写単位（図中、ＦＨＮ−ＨＡ〜ＦＨＮ−Ｍ−ＮＣＲ）との、概略を示す模式図である。 組み換え鳥パラミクソウイルスを感染させた宿主細胞における、各ウイルスがコードする外来タンパク質の発現量（ＨＡタンパク質）を示す、グラフである。図中、横軸は、宿主細胞に感染させた組み換え鳥パラミクソウイルスを示す（図８参照）。縦軸において、各宿主細胞においてアクチンタンパク質の発現量で補正したＨＡタンパク質の発現量を示す。 外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を発現させるための、ＡＰＭＶ−１０ゲノムを模したミニゲノム転写系の概略と、当該ミニゲノム転写系を発現させた培養細胞の培養液におけるルシフェラーゼ活性を測定する工程を示す、模式図である。 ＡＰＭＶ−１０ゲノムを模したミニゲノム転写プラスミド（Ｌｕｃ−Ｆ−ＮＣＲ、Ｌｕｃ−ＨＮ−ＮＣＲ及びＬｕｃ−ｂｌａｎｋ）に各々挿入した、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする外来転写単位の概略を示す、模式図である。 ＡＰＭＶ−１０ゲノムを模したミニゲノム転写プラスミド（Ｌｕｃ−Ｆ−ＮＣＲ、Ｌｕｃ−ＨＮ−ＮＣＲ及びＬｕｃ−ｂｌａｎｋ）を各々導入した培養細胞の培養液におけるルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す、グラフである。図中、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ミニゲノムを導入していない培養細胞の培養液におけるルシフェラーゼ活性を示す。また、縦軸に示した「ルシフェラーゼ活性」は、Ｌｕｃ−ｂｌａｎｋ導入細胞における測定値を１とした場合の比率を示す。

＜組み換え鳥パラミクソウイルス＞
本発明は、鳥パラミクソウイルスをコードするマイナス鎖ＲＮＡに、外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスであって、
前記外来転写単位において、５’側から順に、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列と、鳥パラミクソウイルスの５’非翻訳領域と、外来タンパク質をコードするヌクレオチドと、鳥パラミクソウイルスの３’非翻訳領域と、鳥パラミクソウイルスの遺伝子終結配列とが連結しており、かつ、
前記外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡに挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスを、提供する。

本発明において「組み換え鳥パラミクソウイルス」とは、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを宿主細胞に導入することができ、さらに該タンパク質を該細胞において発現させることができるように、遺伝子操作によって改変された鳥パラミクソウイルスを意味する。組み換え鳥パラミクソウイルスは、当該ウイルスのゲノムＲＮＡ（当該ウイルスをコードするマイナス鎖ＲＮＡ）とＮＰタンパク質とからなるヌクレオカプシドであってもよく、更にＰタンパク質及びＬタンパク質を備えたリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）であってもよく、更にエンベロープを備えたウイルス粒子であってもよい。

本発明の組み換えウイルスの基となる（由来とする）「鳥パラミクソウイルス」については、上述のとおりであり、例えば、鳥パラミクソウイルス種に属するウイルスとして、鳥パラミクソウイルスの血清型２〜１５（ＡＰＭＶ−２〜ＡＰＭＶ−１５）が挙げられる。これらにおいて、本発明の組み換えウイルスの由来は、ニワトリには感染はするが、病原性は低いという観点から、ＡＰＭＶ−２、ＡＰＭＶ−６又はＡＰＭＶ−１０が好ましく、ＡＰＭＶ−１０がより好ましい。

また、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスを設計、調製する際に必要となる、鳥パラミクソウイルスのゲノム配列は、本分野において公知である。このような情報は、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて、各ウイルスの配列情報（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ配列情報）を入手することができる。ＡＰＭＶ−２〜ＡＰＭＶ−１５の代表的なゲノム配列として、より具体的には以下が挙げられる。なお、ＮＣＢＩ等が提供する配列が、各ウイルスをコードするゲノムＲＮＡ（マイナス鎖ＲＮＡ）に相補的なＤＮＡの配列で表記されることを理解されたい。また現在、ＡＰＭＶ−１５のゲノム配列として、互いに相同性の低い異なる２つの配列が登録されているため、表１においてそれらを共に示す。

鳥パラミクソウイルスの内在性の転写単位（ＮＰ転写単位．Ｐ転写単位、Ｍ転写単位、Ｆ転写単位、ＨＮ転写単位、Ｌ転写単位等）及びそれらを構成する配列（遺伝子開始配列、５’非翻訳領域、オープンリーディングフレーム、３’非翻訳領域、遺伝子終結配列）、並びに各転写単位間を隔てる遺伝子間領域については上述のとおりである。また、これらの具体的な配列についても公知であり、例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを通じて入手することができる。以下に、表１にて例示するＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ配列情報に基づき、ＡＰＭＶ−１０の各配列を示す。なお、当該表において、ＮＰ転写単位におけるＩＧＲについては、配列番号ではなく、配列そのものを示す。

なお、ウイルスの配列は自然界において容易に変異し得る。したがって、当該配列は、表１及び２に示す代表的な配列に特定されず、天然に変異した配列も含まれるものであることは理解されたい。また、本発明において、組み換え鳥パラミクソウイルスには、鳥パラミクソウイルスのゲノム全長からなるものであってもよく、当該ゲノムの一部（例えば、ＮＰ転写単位、Ｐ転写単位、Ｍ転写単位、Ｆ転写単位、ＳＨ転写単位、ＨＮ転写単位及びＬ転写単位なる群から選択される少なくとも１の転写単位）が欠損しているもの（所謂、ミニゲノム）であってもよい。

本発明において、「外来転写単位」は、５’側から順に、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列と、鳥パラミクソウイルスの５’非翻訳領域と、外来タンパク質をコードするヌクレオチドと、鳥パラミクソウイルスの３’非翻訳領域と、鳥パラミクソウイルスの遺伝子終結配列とが連結してなる転写単位である。

これら配列及び領域間の結合は、直接的な結合であってもよく、また他のＲＮＡ配列（通常、１〜２０のＲＮＡ）を介した間接的な結合であってもよい。

「外来タンパク質」は、通常、鳥パラミクソウイルスの構成成分として本来存在しないタンパク質であり、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスを宿主細胞に感染させた際に、当該細胞において発現させることを所望するタンパク質であれば特に制限はなく、例えば、後述のとおり、組み換え鳥パラミクソウイルスをワクチンとして利用する場合には、感染症を引き起こす病原体の抗原タンパク質が挙げられる。

本発明において、外来転写単位に含まれる、遺伝子開始配列、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域及び遺伝子終結配列としては、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位（ＮＰ，Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌ等）に含まれる各配列であり、典型的には、表１に示すＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ情報に記載の各配列が挙げられる（ＡＰＭＶ−１０の各配列については、表２を参照のこと）。なお、ウイルスの配列は自然界において容易に変異し得る。したがって、前記各配列は、上記典型的は配列に特定されず、天然に変異した配列も含まれるものであることは理解されたい。

また、外来転写単位に含まれる前記各配列は、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスから外来タンパク質が発現され得る限り、各配列において１若しくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加した配列であってもよく、また各配列と高い相同性を有する配列であってもよい。ここで「複数」とは、外来タンパク質を発現し得る範囲において置換等されるヌクレオチドの個数であり、好ましくは置換等される配列における３０％以下の個数、より好ましくは該配列における２０％以下の個数、さらに好ましくは該配列における１０％以下の個数である。また「高い相同性」とは、例えば６０％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の相同性（例えば、９５％以上、９７％以上、９９％以上の相同性）である。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。かかるプログラムを用いた解析方法の具体的な手法は公知であり、デフォルトのパラメーターを用いて解析することができる。

外来転写単位に含まれる前記各配列の由来としては、鳥パラミクソウイルス由来である限り、組み換え鳥パラミクソウイルスの基となるウイルスの種類と異なっていてもよいが（例えば、前記配列の由来がＡＭＰＶ−２であり、組み換え鳥パラミクソウイルスの基となるウイルスがＡＭＰＶ−１０であってもよいが）、同一の鳥パラミクソウイルス由来であることが好ましく、共にＡＭＰＶ−１０由来であることがより好ましい。また、前記各配列が由来とする鳥パラミクソウイルスにおいても互いに異なっていてもよいが（例えば、遺伝子開始配列の由来がＡＭＰＶ−２であり、５’非翻訳領域の由来がＡＭＰＶ−１０であってもよいが）、全て同一の鳥パラミクソウイルス由来であることが好ましく、全てＡＭＰＶ−１０由来であることがより好ましい。

また、外来転写単位に含まれる前記各配列は、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位由来である限り、互いに異なるものであってもよいが（例えば、遺伝子開始配列がＮＰ転写単位に由来し、５’非翻訳領域がＰ転写単位に由来するものであってもよいが）、これら全配列は同一の内在性転写単位由来であることが好ましい。より具体的に、前記各配列がＡＭＰＶ−１０の内在性転写単位由来である場合には、少なくとも、３’非翻訳領域として、配列番号：１〜６のいずれかに記載の配列を含み、かつ５’非翻訳領域として、配列番号：７〜１２のいずれかに記載の配列を含む外来転写単位であり、また、遺伝子開始配列として、配列番号：１３〜１５のいずれかに記載の配列であり、３’非翻訳領域として、配列番号：１〜６のいずれかに記載の配列を含み、５’非翻訳領域として、配列番号：７〜１２のいずれかに記載の配列を含み、かつ遺伝子終結配列として、配列番号：１６〜１８のいずれかに記載の配列を含む外来転写単位である。さらに、好ましくは、少なくとも配列番号：１及び配列番号：７に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＮＰ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位）、少なくとも配列番号：２及び配列番号：８に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＰ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位）、少なくとも配列番号：３及び配列番号：９に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＭ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位）、少なくとも配列番号：４及び配列番号：１０に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＦ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位）、少なくとも配列番号：５及び配列番号：１１に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＨＮ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位）、又は、少なくとも配列番号：６及び配列番号：１２に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＬ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位）であり、より好ましくは、配列番号：１３、配列番号：１、配列番号：７及び配列番号：１６に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＮＰ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位）、配列番号：１４、配列番号：２、配列番号：８及び配列番号：１７に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＰ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位）、配列番号：１５、配列番号：３、配列番号：９及び配列番号：１８に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＭ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位）、配列番号：１４、配列番号：４、配列番号：１０及び配列番号：１６に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＦ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位）、配列番号：１４、配列番号：５、配列番号：１１及び配列番号：１６に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＨＮ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位）、又は、配列番号：１４、配列番号：６、配列番号：１２及び配列番号：１６に記載の配列を含む外来転写単位（ＡＭＰＶ−１０のＬ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位）である。

また、組み換え鳥パラミクソウイルスから発現される外来タンパク質の発現量がより高い傾向にあるという観点から、前記ＡＭＰＶ−１０のＮＰ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位又は前記ＡＭＰＶ−１０のＭ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位が好ましく、前記ＡＭＰＶ−１０のＮＰ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位又は前記ＡＭＰＶ−１０のＭ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位が、より好ましい。

また、組み換え鳥パラミクソウイルスの力価がより高い傾向にあるという観点からは、前記ＡＭＰＶ−１０のＬ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位が好ましく、前記ＡＭＰＶ−１０のＬ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位が、より好ましい。

また、組み換え鳥パラミクソウイルスの増殖性がより高い傾向にあるという観点からは、前記ＡＭＰＶ−１０のＨＮ転写単位由来の非翻訳領域を含む外来転写単位が好ましく、前記ＡＭＰＶ−１０のＨＮ転写単位由来の各配列を含む外来転写単位が、より好ましい。

本発明にかかる外来転写単位において、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位に含まれる上述の各配列と、外来タンパク質をコードするヌクレオチドとは、当該タンパク質を発現できるよう、作動可能的に連結されていればよいが、パラミクソウイルスのゲノム配列は６の倍数である場合に、その複製（ＲＮＡ合成）は効率良く行なわれるという観点から、本発明にかかる外来転写単位を構成するヌクレオチド数は６の倍数であることが好ましく、組み換え鳥パラミクソウイルスを構成するヌクレオチド数も６の倍数であることがより好ましい（所謂パラミクソウイルスの６のルール（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ）については、Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ Ｄ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１９９８年２月、７２（２）、８９１〜８９９ページ 参照のこと）。

本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスにおいて、前述の外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡは、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡに挿入される。外来転写単位が挿入される遺伝子間領域としては特に制限はなく、ＮＰ転写単位の遺伝子終結配列とＰ転写単位の遺伝子開始配列との間にある遺伝子間領域（ＮＰ−Ｐ遺伝子間領域）、Ｐ転写単位の遺伝子終結配列とＭ転写単位の遺伝子開始配列との間にある遺伝子間領域（Ｐ−Ｍ遺伝子間領域）、Ｍ転写単位の遺伝子終結配列とＦ転写単位の遺伝子開始配列との間にある遺伝子間領域（Ｍ−Ｆ遺伝子間領域）、Ｆ転写単位の遺伝子終結配列とＨＮ転写単位の遺伝子開始配列との間にある遺伝子間領域（Ｆ−ＨＮ遺伝子間領域。なお、ＡＰＭＶ−６においては、Ｆ転写単位の遺伝子終結配列とＳＨ転写単位の遺伝子開始配列との間にある遺伝子間領域（Ｆ−ＳＨ遺伝子間領域）、ＳＨ転写単位の遺伝子終結配列とＨＮ転写単位の遺伝子開始配列との間にある遺伝子間領域（ＳＨ−ＨＮ遺伝子間領域））、ＨＮ転写単位の遺伝子終結配列とＬ転写単位の遺伝子開始配列との間にある遺伝子間領域（ＨＮ−Ｌ遺伝子間領域）の少なくともいずれかであれば良いが、タンパク質の発現効率がより良いという観点から、Ｐ−Ｍ遺伝子間領域が好ましく、またウイルスの増殖効率がより良いという観点から、Ｆ−ＨＮ遺伝子間領域が好ましい。また、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスが、上述のミニゲノムの形態をとる場合には、外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡは、リーダー配列とトレーラー配列との間に挿入されていてもよい。

なお、このような組み換え鳥パラミクソウイルスウイルスは、例えば、後述のヌクレオチド構築物及びそれを含むキット、並びにそれらを用いた方法を利用することにより、製造することができる。

＜ワクチン用組成物＞
後述の実施例に示すとおり、本発明によれば、上述の組み換え鳥パラミクソウイルスが感染した宿主細胞において、該ウイルスがコードする外来タンパク質を高発現させることができる。そのため、外来タンパク質を感染症を引き起こす病原体の抗原タンパク質とすることにより、前記宿主細胞における当該病原体に対するワクチン効果を増強させることができる。

したがって、本発明は、上述の組み換え鳥パラミクソウイルスを有効成分として含有する、ワクチン用組成物を提供する。

本発明において、「病原体」としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫が挙げられ、より具体的には、インフルエンザウイルス、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、レオウイルス、鳥類レトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、大腸菌、マイコプラズマ、サルモネラ、カンピロバクター、オルニトバクテリウム、パスツレラ、アイメリア、クリプトスポリジウム原虫が挙げられる。

また、これら病原体の抗原タンパク質としては、病原体を構成するタンパク質であり、病原体が感染した際に、その宿主の免疫応答を惹起するタンパク質であれば特に制限はなく、例えば、インフルエンザウイルスにおいては、ヘマグルチニン（ＨＡ前駆体、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６等）、マトリックスタンパク質（Ｍ１、Ｍ２等）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ１、ＮＡ２、ＮＡ３、ＮＡ４、ＮＡ５、ＮＡ６、ＮＡ７、ＮＡ８、ＮＡ９等）、非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２等）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ（ＰＡポリメラーゼ、ＰＢ１ポリメラーゼ１、ＰＢ２ポリメラーゼ２等）が挙げられる。

また、本発明にかかるインフルエンザウイルスとしては、例えば、ヘマグルチニンの構造の違いに基づき分けられるサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６等）、該オウイルスが産生するノイラミニダーゼの種類に応じてさらに分類される亜型（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ４、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ９Ｎ９等）、分離された場所、分離された順番、分離された年に応じて分類される株（分離株；Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／１９９７、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｖｉｅｔｎａｍ／２／２００７、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／２００３、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＣＤＣ５９６／２００６、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／ＣＤＣ９４０／２００６、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／１３９４−ＮＡＭＲＵ３／２００７、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｕｎａｎ／１２７／２００５、Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ａｋｉｔａ／１／２００８、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３０５５／２００５、Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／ＨＮ３１２４２／２００７、Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｙｕｎｎａｎ／４９３／２００５、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｙａｍａｇｕｃｈｉ／７／２００４、Ａ／Ｐｈｅａｓａｎｔ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／ＦＹ１５５／２００１、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｘｉ／９１４／２００４、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｕｂｅｉ／ｗｇ／２００２、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／０１／２００３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６１．９／２００２、Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｓｈａｎｔｏｕ／１６２１／２００５等）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

本発明のワクチン組成物においては、有効成分である上述の組み換え鳥パラミクソウイルスの他、薬理学上許容される担体又は媒体を含み得る。薬理学上許容される担体としては、例えば、安定剤、賦形剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤が挙げられる。また、薬理学上許容される媒体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液が挙げられる。これら担体及び媒体は、当業者であれば、ワクチン組成物の剤型、使用方法に応じて、当該分野に用いられる公知の物を適宜又は組み合わせて選択して用いることができる。

また、ワクチン組成物の形態としては、特に制限はなく、例えば、懸濁液の形態であってもよく、凍結乾燥された形態であってもよい。さらに、ワクチン効果を増強するという観点から、本発明のワクチン組成物はアジュバントも含有し得る。アジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、水中油又は油中水エマルジョン、サポニン、ミョウバン、ＣｐＧ ＤＮＡが挙げられる。

本発明のワクチン組成物に含まれる、組み換え鳥パラミクソウイルスの力価としては特に制限はないが、通常１０^５ＥＩＤ_５０／個体〜１０^７ＥＩＤ_５０／個体であり、好ましくは１０^５．５ＥＩＤ_５０／個体〜１０^６．５ＥＩＤ_５０／個体であり、より好ましくは１０^６ＥＩＤ_５０／個体である。

また、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスとして、さらに好ましくは、後述の実施例に示すように、当該ウイルスを１０^６ＥＩＤ_５０にて接種した場合に、ＨＰＡＩＶ感染後のニワトリの生存率が５０％以上（より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは１００％）となるウイルスである。

なお、「ＥＩＤ_５０」とは、発育鶏卵に接種した場合に、その５０％が感染するウイルス量を意味する。

＜病原体の感染等に対する予防方法＞
また、本発明は、動物における病原体の感染又は増殖を抑制する方法を提供する。すなわち、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルス又は当該ウイルスを有効成分として含有するワクチン組成物を、動物に接種する工程を含む、該動物における病原体の感染又は増殖を抑制する方法をも、本発明は提供する。

本発明において接種対象となる「動物」については、組み換え鳥パラミクソウイルスが感染し得る限り特に制限はないが、通常、鳥類であり、例えば、ニワトリ、アヒル、カモ、七面鳥、ウズラ、キジ、オウム、タカ、カラス、ダチョウが挙げられる。また後述の実施例において示すとおり、ＮＤＶに対する抗体が生成されている鳥類（ニワトリ等）に、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルス等は特に好適に用いられ得る。

組み換え鳥パラミクソウイルス等の動物への「接種」は、本分野における公知の方法を用いて行なうことができる。このような方法には、鼻内、経口、口鼻及び皮下並びに吸入、眼内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、非経口、坐薬又は経皮が含まれるが、これらに限定されない。また、かかる接種方法は、噴霧器、霧吹き、スプレー、注射器、無針注射用具又は微粒子遺伝子銃を用いることによって行なうことができる。

また、動物への接種スキームは、その剤型、動物の種類、齢及び体重等によって、適宜調整され、免疫学的に有効な量を当該動物に投与し得る限り特に制限はなく、単回又は複数回接種であってもよく、同時に又は順次に接種してもよい。

＜組み換え鳥パラミクソウイルス製造用ヌクレオチド構築物＞
本発明は、上述の組み換え鳥パラミクソウイルスの製造において有用な、下記ヌクレオチド構築物をも提供する。

鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドに、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを挿入するための部位を含むクローニング領域が、挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチド構築物であって、
前記クローニング領域において、５’側から順に、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列と、鳥パラミクソウイルスの５’非翻訳領域と、前記部位と、鳥パラミクソウイルスの３’非翻訳領域と、鳥パラミクソウイルスの遺伝子終結配列とが連結しており、かつ、
前記クローニング領域が、鳥パラミクソウイルスの内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするヌクレオチドに挿入されている、ヌクレオチド構築物。
なお、本発明のヌクレオチド構築物において、前記鳥パラミクソウイルスが、ミニゲノムの形態をとる場合には、クローニング領域は、リーダー配列をコードするヌクレオチドとトレーラー配列をコードするヌクレオチドとの間に挿入されていてもよい。

本発明において、ヌクレオチド構築物を構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ、二重鎖ＤＮＡ）であってもよく、またプラス鎖ＲＮＡであってもよいが、化学的に安定であるため、鳥パラミクソウイルスの配列を改変し易く、また後述の組み換え鳥パラミクソウイルスを生成し易いという観点から、ＤＮＡが好ましい。また、ＤＮＡによって構成される場合には、ヌクレオチド構築物は、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターの形態をとり得る。

「鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチド」は、例えば、当該ウイルスから抽出したゲノムＲＮＡ（マイナス鎖ＲＮＡ）を鋳型とし、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いた合成反応を行なうことによって、プラス鎖ＲＮＡとして得ることができる。また前記ゲノムＲＮＡ（マイナス鎖ＲＮＡ）を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた合成反応（逆転写反応）を行なうことによって、プラス鎖ＤＮＡ、ひいては二重鎖ＤＮＡとして得ることができる。なお、ウイルスからのゲノムＲＮＡ抽出及びＲＮＡ依存性ポリメラーゼを用いた合成方法は公知である。また、本発明において、「鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチド」は、鳥パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡ全長をコードするものであってもよく、当該ゲノムの一部（例えば、ＮＰ転写単位、Ｐ転写単位、Ｍ転写単位、Ｆ転写単位、ＳＨ転写単位、ＨＮ転写単位及びＬ転写単位なる群から選択される少なくとも１の転写単位）が欠損しているもの（所謂、ミニゲノム）をコードするものであってもよい。

また、鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドに挿入される「クローニング領域」は、鳥パラミクソウイルスの遺伝子開始配列、鳥パラミクソウイルスの５’非翻訳領域、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを挿入するための部位、鳥パラミクソウイルスの３’非翻訳領域及び鳥パラミクソウイルスの遺伝子終結配列の配列に基づき、当業者であれば、市販のＤＮＡ自動合成機を用いて、化学的に合成することができる。また、前述のとおり、調製した鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドを鋳型として、当業者であれば、公知の遺伝子組み換え技術（ＰＣＲ、制限酵素処理、部位特異的変異導入法等）を適宜用いて調製することもできる。なお、前記部位としては、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを挿入することができればよく特に制限はないが、通常、制限酵素認識配列が用いられ、また当該部位は、複数の制限酵素認識配列を有する部位（所謂、マルチクローニングサイト）であってもよい。

また、このようにして得られるクローニング領域の鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドへの挿入も、当業者であれば、公知の遺伝子組み換え技術（ＰＣＲ、制限酵素処理、部位特異的変異導入法等）を適宜用いて行なうことができる。

本発明において、前述のヌクレオチド構築物は、更に、前記鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドの５’末側に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター配列が連結しており、該ヌクレオチドの３’末側に、５’側から順に、リボザイム配列と前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するターミネーター配列とが連結していてもよい。

ヌクレオチド構築物がこのような構成をとることにより、後述の形質転換細胞に導入された場合、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーター配列を認識し、組み換え鳥パラミクソウイルスをコードするマイナス鎖ＲＮＡが転写される。さらに、当該組み換えウイルスが、感染サイクルを開始するためには、当該マイナス鎖ＲＮＡの３’末側の正確な切断が必要とされるが、当該切断は、前記リボザイムの自己切断によって達成されることになる。

したがって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター配列と前記鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドの５’末との結合は、当該プロモーター配列の制御下にて前記マイナス鎖ＲＮＡの転写が行われ得る限り、特に制限はなく、直接的な結合であってもよく、また他のヌクレオチドを介した間接的な結合であってもよい。

ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写できるポリメラーゼであれば特に制限はなく、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼ、真核生物由来のＲＮＡポリメラーゼＩ、II又はIIIが挙げられるが、より転写効率が高いという観点から、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが好ましい。

前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのターミネーターと前記鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチドの３’末との間に配置されるリボザイム配列としては、好ましくは、自己切断活性を有するリボザイム配列であり、より好ましくは、デルタ肝炎ウイルス由来のリボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ヘアピン型リボザイム配列が挙げられる。

また、本発明において、ヌクレオチド構築物は、上記配列の他、後述の実施例において示すとおり、大腸菌等を用いたクローニングのために、薬剤耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子等）、当該遺伝子の発現制御サイト（ＡｍｐＲプロモーター等）、複製起点（ｆ１複製起点、ｐＢＲ３２２複製起点等）を含むものであってもよい。

また、以下に示すように、組み換え鳥パラミクソウイルスを生成（製造）するためには、宿主において発現させることを所望する、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを、上述の部位に挿入する必要がある。

外来タンパク質については上述のとおりであり、該タンパク質をコードするヌクレオチドについても、特に制限はないが、宿主細胞における当該タンパク質の発現効率を向上させるという観点から、当該宿主におけるコドンの使用頻度に合わせて配列が改変（コドンが最適化）されたヌクレオチドであることが望ましい。

＜組み換え鳥パラミクソウイルスの製造方法＞
上述のヌクレオチド構築物を用いることによって、以下のようにして、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスを製造することができる。

前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質とを発現する形質転換細胞に、外来タンパク質をコードするヌクレオチドが前記部位に挿入されている上述のヌクレオチド構築物を導入する工程と、
前記組み換え鳥パラミクソウイルスを、前記細胞の培養物から回収する工程とを含む、方法。

本発明の製造方法において、上述のヌクレオチド構築物が導入される「細胞」としては、当該構築物がコードする組み換え鳥パラミクソウイルスを生成し得る限り、特に制限はなく、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＦ１細胞、ニワトリ初代培養細胞（ニワトリ胎児線維芽（ＣＥＦ）細胞、ニワトリ胎児（ＣＥＰ）細胞）、２９３Ｔ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞が挙げられるが、遺伝子導入効率及びウイルスの増殖効率がより良いという観点から、Ｖｅｒｏ細胞が好ましい。

また、これら細胞においては、上記プロモーター制御下にてヌクレオチド構築物がコードするマイナス鎖ＲＮＡ（組み換え鳥パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡ）を発現させ、更に当該マイナス鎖ＲＮＡからプラス鎖ＲＮＡを転写させるために、上述のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質とが発現するように、形質を転換されている必要がある。

「コアタンパク質」としては、前記マイナス鎖ＲＮＡからプラス鎖ＲＮＡを転写させ得るタンパク質であればよく、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを構成するホスホタンパク質（Ｐ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）が挙げられる。また、これらは鳥パラミクソウイルス由来であればよいが、ヌクレオチド構築物がコードする組み換え鳥パラミクソウイルスと同じ由来であることが好ましい。

形質転換としては、特に制限はなく、これらタンパク質を前記細胞にて発現させることのできるヌクレオチド構築物（プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等）を、公知の手法を用い、当該細胞に導入することによって行なうことができる。

かかる形質転換は、組み換え鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチド構築物の導入の前に行なってもよく、同時に行なってもよく、また後に行なってもよい。

ヌクレオチド構築物を細胞に導入するための公知の手法としては、特に制限はなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。

このようにして、組み換え鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチド構築物が導入された形質転換細胞においては、前述のとおり、当該ウイルスをコードするプラス鎖ＲＮＡが転写され、更にそれを鋳型として、前記ウイルスがコードするウイルスタンパク質及び外来タンパク質が発現することとなる。そして、組み換え鳥パラミクソウイルスをコードするマイナス鎖ＲＮＡと当該ウイルスタンパク質とが結合等することにより、組み換え鳥パラミクソウイルスが、前記細胞の培養物において増殖することとなる。

細胞の「培養物」としては、組み換え鳥パラミクソウイルスを含有し得るものであればよく、形質転換細胞を培地で培養することによって得られる、当該ウイルスが感染した前記細胞、該細胞の分泌産物及び該細胞の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。

このような培養物から、組み換え鳥パラミクソウイルスを「回収」する方法としては特に制限はなく、濾過、遠心分離、吸着及びカラム精製等の公知のウイルス精製・分離方法を用いることによって、また適宜組み合わせて用いることによって行なうことができる。

さらに、本発明においては、このようにして得られた組み換え鳥パラミクソウイルスを、後述の実施例に示すとおり、ニワトリ初代培養細胞等の該ウイルスに感染し易い細胞を追播することにより、増殖させてもよい。また、かかる細胞の代わりに、または当該細胞と併せて、孵化卵(例えば、ニワトリの卵又はウズラの卵)に接種することにより、増殖させることができる。

＜組み換え鳥パラミクソウイルスを製造するためのキット＞
上述のとおり、本発明のヌクレオチド構築物等を用いることによって、組み換え鳥パラミクソウイルスを製造することができる。したがって、本発明は、以下の組み換え鳥パラミクソウイルスを製造するためのキットをも提供する。

下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスを製造するためのキット
（ａ）本発明のヌクレオチド構築物
（ｂ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現することができるヌクレオチド構築物
（ｃ）前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質を発現することができるヌクレオチド構築物
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のヌクレオチド構築物を導入するための細胞
（ｅ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質とを発現する形質転換細胞。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（組換えウイルスの作製）
ＡＰＭＶ−１０ゲノムを、ＲＴ−ＰＣＲにより４つの断片に分けて増幅し、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にクローニングした。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ゲノムをクローニングしているｐＮＤＶ／Ｂ１プラスミド（Ｎａｋａｙａ，Ｔ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：１１８６８−１１８７３．２００１ 参照）のベクター部分（すなわち、ｐＳＬ１１８０（アマシャム ファルマシア バイオテック社製））を制限酵素切断部位で切り出し、クローニングしたＡＰＭＶ−１０ゲノムを切り出したベクターにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いてアッセンブルした。このようにして構築したＡＰＭＶ−１０ゲノムＲＮＡ転写プラスミド ｐＡＰＭＶ−１０の模式図を、図１に示す。また、ＡＰＭＶ−１０ゲノムを構成する転写単位及びそれら転写単位間の領域（遺伝子間領域）の配列を、上記表２に示す。

図１に示すとおり、ｐＡＰＭＶ−１０は、ｐＳＬ１１８０に、Ｔ７プロモーター配列、ＡＰＭＶ−１０の全長ゲノム、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイム配列及びＴ７ターミネーター配列を、挿入してなるものである。なお、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイム配列は、転写されたＲＮＡの３’端を切断するためのものであり、組換えウイルスゲノムには含まれない。また、本実施例で用いるＡＰＭＶ−１０のゲノムには、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間にある非翻訳領域（Ｐ遺伝子ＯＲＦと終結配列との間）に制限酵素（ＲｓｒII）切断配列を挿入している。

さらに、ｐＡＰＭＶ−１０のＰ−Ｍ遺伝子間に、ＰＴ−ＰＣＲにより増幅した外来遺伝子（抗原遺伝子）を挿入し、抗原遺伝子を含む完全長ＡＰＭＶ−１０ゲノムＲＮＡ転写プラスミドｐＡＰＭＶ−１０／ＨＡを構築した。抗原遺伝子には、ニワトリコドンに最適化した高病原性鳥インフルエンザウイルス（ＨＰＡＩＶ）ＨＡ遺伝子を用い、両隣にＡＰＭＶ−１０内在性の各転写単位における非翻訳領域（ＮＣＲ）を、その両端を遺伝子開始配列（ＧＳ）及び遺伝子終結配列（ＧＥ）で挟んだものを用いた（図２ 参照）。

また、対照実験用の組換えウイルスとして、Ｐ遺伝子の後ろのＮＣＲにあるＲｓｒII切断配列に抗原遺伝子を挿入した組換えウイルス（１０／ＨＡ及び１０／ｏｐＨＡ）を作製した。図３に示すとおり、これらの組み換えウイルスにおいて、抗原遺伝子は、その開始コドンとＧＳとの前に２ｂｐのＮＣＲ、終止コドンとＧＥとの間に１１３ｂｐのＮＣＲを備え、Ｐ遺伝子の転写単位中に挿入されたことになる。

各組換えウイルスに挿入した外来転写単位の配列を表３示す。

なお、表３の「外来遺伝子」の項目において、「ＨＡ」は高病原性鳥インフルエンザウイルス（ＨＰＡＩＶ）ＨＡ遺伝子そのものを各組換えウイルスにおいて挿入したことを示し、「ｏｐＨＡ」は、ニワトリコドンに最適化したＨＰＡＩＶのＨＡ遺伝子を各組換えウイルスにおいて挿入したことを示す。また、当該表に示すとおり、ＮＣＲを組み込んだ組換えウイルスは、各ＮＣＲと対応するＧＳ及びＧＥを使用した（表２ 参照）。１０／ＨＡ、１０／ｏｐＨＡ及びｃｏｎｔｒｏｌにおけるＧＳ及びＧＥとして、Ｍ遺伝子の転写単位におけるそれらを用いた。

また、図４に示すとおり、ＡＰＭＶ−１０のＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、タンパク質発現用ベクターｐＣＡＧＧＳに挿入し、ＣＭＶエンハンサー及びチキンβアクチンプロモーター下流に、クローニング部位に挿入されたＡＰＭＶ−１０の各遺伝子及びＰｏｌｙＡを有する、タンパク質発現用プラスミド ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ及びｐＣＡＧＧＳ−Ｌを各々構築した。

そして、図５に示すとおり、以上のとおりにして調製したｐＡＰＭＶ又はｐＡＰＭＶ−１０／ＨＡと、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ及びｐＡＣＧＧＳ−Ｌとを、Ｔ７ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを感染させた培養細胞（Ｖｅｒｏ細胞）に、遺伝子導入試薬（Ｍｉｒｕｓ社製、製品名：ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１試薬）を用いてコトランスフェクションした。１日後、ニワトリ初代培養細胞（胎児線維芽（ＣＥＦ）細胞）を追播し、その１日後に上清及び細胞懸濁液を回収した。回収した上清及び細胞懸濁液を、１０日齢発育鶏卵の漿尿膜腔に接種し、３７℃で４８時間培養した後、冷却し、漿尿膜腔液を回収した。回収した漿尿膜腔液をウイルス液とし、各種試験に用いた。

なお、上記工程にて、ワクシニアウイルスＭＶＡ／Ｔ７株が感染した培養細胞内では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが発現し、Ｔ７プロモーターを有するｐＡＰＭＶ又はｐＡＰＭＶ／ＨＡから完全長ＡＰＭＶゲノムＲＮＡが合成される。また、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ及びｐＣＡＧＧＳ−Ｌからは、ＡＰＭＶ−１０のＮＰタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質が合成される。ＮＰ、Ｐ及びＬタンパク質はウイルスＲＮＡの転写複製に関わるタンパク質であるため、前記完全長ＡＰＭＶ−１０ゲノムＲＮＡを鋳型として、ＡＰＭＶ−１０ウイルスのｍＲＮＡ転写及びＲＮＡゲノム複製が開始される。そして、各ウイルスタンパク質の合成が起こり、最終的に組換えＡＰＭＶ又はｐＡＰＭＶ／ＨＡが培養細胞内で作出される。さらに、これらの組換えＡＰＭＶ又はＡＰＭＶ／ＨＡは、株化細胞及びニワトリ初代培養細胞に感染し、増殖する。

（感染細胞での抗原発現量の比較）
ニワトリ初代培養細胞（ＣＥＦ細胞）に、ｍｏｉ＝１（細胞あたり１感染単位のウイルスが感染する量）を接種し、２４時間後に細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（ＡＴＴＯ社製、製品名：ＥｚＡｐｐｌｙ）で溶解して回収した。回収した溶解液を、全自動キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステム（製品名：Ｗｅｓ、プロテインシンプル社製）にて泳動し、抗ＨＡ２ニワトリモノクローナル抗体及びＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体を用い、抗原タンパク質を検出した。タンパク質量の測定は、Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（プロテインシンプル社製）を用いて行った。得られた結果を図６及び表４に示す。

図６及び表４に示すとおり、ＮＣＲを抗原遺伝子に加えたＮＰ−ＮＣＲ、Ｐ−ＮＣＲ、Ｍ−ＮＣＲ、Ｆ−ＮＣＲ、ＨＮ−ＮＣＲ、Ｌ−ＮＣＲは、１０／ＨＡ、１０／ｏｐＨＡ及びＮＣＲを含まないｃｏｎｔｒｏｌに比べて、それぞれ１１．６〜３１．８倍、１８．３〜５０．２倍及び１９９．３〜５４５．３倍の抗原タンパク質を感染細胞に発現することが明らかになった。

（発育鶏卵での増殖性）
１０日齢発育鶏卵の漿尿膜腔に１００ＥＩＤ_５０（感染単位）のウイルスを接種し、１２、２４、３６、４８時間後に漿尿膜腔液を回収した。回収した漿尿膜腔液の力価は、発育鶏卵を用いて測定した。漿尿膜腔をＰＢＳで１０倍階段希釈し、０．２ｍｌずつ各希釈５個の１０日齢発育鶏卵の漿尿膜腔に接種した。３７℃で４８時間培養した後、漿尿膜腔液を回収し、ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集試験によりウイルス増殖の有無を判定した。ウイルス力価の算出は、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈの計算方法により行った。得られた結果を図７に示す。

図７に示すとおり、ウイルス増殖がやや遅いものもあるが、４８時間後のウイルス力価は同程度であった。したがって、ＮＣＲを付与した組換えウイルスは、ＮＤＶ等と同様に発育鶏卵を使用してワクチンを製造することが可能であることが明らかになった。なお、Ｌ−ＮＣＲは、４８時間後のウイルス力価が最も高く、ワクチンの製造コストが安くなることが期待できる。また、ＨＮ−ＮＣＲ、１０／ｏｐＨＡ及びｃｏｎｔｒｏｌは、接種してから２４時間後において高い増殖性が認められた。一方、Ｍ−ＮＣＲ及びＮＰ−ＮＣＲは、接種してから２４時間後における増殖性は、他のウイルスと比べやや遅いものであった。

（ワクチン効果試験）
ＮＤＶに対する免疫の付与
先ず、２週齢のニワトリに弱毒ＮＤＶ Ｂ１株を１０^６ＥＩＤ_５０点眼投与し、２週間後の４週齢時にβプロピオラクトンで不活化したＮＤＶ Ｂ１株を１００００ＨＡＵ筋肉内投与した。

組換えウイルスでのワクチネーション
次に、３週間後の７週齢時に、翼静脈より血液を採取した後、組換えＡＰＭＶ−１０／ＨＡを１０^６ＥＩＤ_５０点眼投与した。

ＨＰＡＩＶでの攻撃
そして、ワクチン接種２週間後の９週齢時に、翼静脈より血液を採取した後、ＨＰＡＩＶ Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｙａｍａｇｕｃｈｉ／７／２００４（Ｈ５Ｎ１）株を１０^６ＥＩＤ_５０経鼻接種した。２日目及び４日目に、喉頭及び総***腔よりスワブを採取した。１０日間症状を観察し、死亡率を算出した。採取したスワブ中に含まれるウイルス力価は、発育鶏卵を用いて算出した。また、採取した血液中の抗体価は、赤血球凝集阻止（ＨＩ）試験によって測定した。得られた結果を表５に示す。

表５に示すとおり、ＮＣＲを付与した組換えウイルスで免疫したニワトリは、ＨＰＡＩＶで攻撃した場合、臨床症状を示すことなく、１００％生存した。ＨＰＡＩＶ攻撃後のウイルスの***は、ＮＰ−ＮＣＲ、Ｆ−ＮＣＲ及びＨＮ−ＮＣＲでは検出されず、Ｐ−ＮＣＲ、Ｍ−ＮＣＲ及びＬ−ＮＣＲでは、１０羽中１〜２羽より検出されたが、そのウイルス力価は低かった。攻撃時のＨＰＡＩＶに対するＨＩ抗体価は、ＮＣＲを付与した組換えウイルスで免疫した多くの個体で検出され、特にＨＮ−ＮＣＲでは１０羽中８羽でＨＩ抗体価の上昇が認められた。

ＮＣＲを付与していない１０／ＨＡ及び１０／ｏｐＨＡで免疫したニワトリは、ウイルス攻撃により２５％及び５０％にとどまり、感染ニワトリからのウイルス***が１００％確認された。また、ＨＰＡＩＶ攻撃時のＨＩ価はほとんどのニワトリにおいて検出限界以下であった。

これらのことから、ＮＣＲを付与した組換えウイルスは、付与していない組換えウイルスと比べ、そのワクチン効果が増強されていることが確認された。

（赤血球凝集阻止試験）
血清を５５℃で３０分間熱処理し、補体を非働化した。ＰＢＳで希釈した血清２５μＬに、８ＨＡに調整したＨＰＡＩＶ Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｙａｍａｇｕｃｈｉ／７／２００４（Ｈ５Ｎ１）株を２５μＬ加え、３０分間静置した。ＰＢＳに０．５５％の割合でニワトリ赤血球を加えた血球浮遊液を５０μＬ加え、４５分後に赤血球の凝集の有無を判定した。赤血球の凝集が起こらない血清の最大希釈を、ＨＩ抗体価とした。

（抗原遺伝子挿入部位の検討）
抗原遺伝子を挿入する部位がＰ−Ｍ間以外でも、ＮＣＲ挿入によって抗原の発現量が増加するかを調べるため、Ｆ−ＨＮ転写単位間に抗原遺伝子を挿入した組換えウイルスＦＨＮ−ＨＡ、ＦＨＮ−ｏｐＨＡ及びＦＨＮ−Ｍ−ＮＣＲを作製した（図８及び表６ 参照）。なお、表６において、組み換えウイルスＦＨＮ−ＨＡ及びＦＨＮ−ｏｐＨＡの３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域は、配列番号ではなく、配列そのものを示す。

そして、これらＦ−ＨＮ転写単位間に抗原遺伝子を挿入した組換えウイルスについて、感染細胞でのタンパク質発現量及びワクチン効果を調べた。得られた結果を図９及び表７に示す。

図９に示した結果から明らかなように、感染細胞におけるタンパク質発現量は、Ｍ遺伝子のＮＣＲを付与したものが他に比べ有意に高かった。また、抗原遺伝子の挿入位置をＰ−Ｍ転写単位間とした場合同様（表５等参照）に、挿入位置をＦ−ＨＮ転写単位間とした場合にも、表７に示すとおり、そのワクチン効果も高いことも明らかになった。

したがって、ＡＰＭＶの非翻訳領域によって挟まれた抗原遺伝子（外来遺伝子）を含む転写単位の挿入は、ＡＰＭＶの内在性の各転写単位間にある遺伝子間領域であれば特に制限されることなく、前記遺伝子がコードするタンパク質の発現量を向上できることが、確認された。

（抗原遺伝子についての検討）
上述のとおり、本発明によれば、ＨＡ遺伝子がコードするタンパク質の発現量を向上できることが明らかになった。そこで次に、外来遺伝子としてＨＡ遺伝子以外の遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）を用いた場合にも、本発明によれば、当該遺伝子がコードするタンパク質の発現量を向上することができることを、以下に示す方法にて確認した。

（ミニゲノム転写系の構築）
ルシフェラーゼ遺伝子がコードするタンパク質発現量における、ＡＰＭＶ−１０非翻訳領域による向上効果を確認するため、ＡＰＭＶ−１０のゲノムを模したミニゲノム転写系（ミニゲノム転写プラスミド）を用いた。

ＡＰＭＶ−１０のミニゲノム転写プラスミドは、図１０に示すとおり、ｐＣＭＶ−ＧＬｕｃ２（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ社製）のｐｏｌｙＡ配列とＣＭＶプロモーターとの間に、Ｄ型肝炎リボザイム配列、ＡＰＭＶ−１０のＬｅａｄｅｒ配列、ＡＰＭＶ−１０の遺伝子開始配列、ルシフェラーゼ遺伝子、ＡＰＭＶ−１０の遺伝子終結配列、ＡＰＭＶ−１０のＴｒａｉｌｅｒ配列及びハンマーヘッド型リボザイムを挿入することにより構築した。なお、前記ルシフェラーゼ遺伝子の配列は、ヒトコドンに最適化したガウシアルシフェラーゼ遺伝子を用いた。

ミニゲノム転写プラスミドにより転写されたＲＮＡは、リボザイムにより切断され、３‘末より順にＡＰＭＶ−１０のＬｅａｄｅｒ配列、ＡＰＭＶ−１０の遺伝子開始配列、ルシフェラーゼ遺伝子、ＡＰＭＶ−１０の遺伝子終結配列、ＡＰＭＶ−１０のＴｒａｉｌｅｒ配列が並んだＲＮＡとなる。

また、図１１及び表８に示すとおり、ルシフェラーゼ遺伝子がコードするタンパク質発現量における、ＡＰＭＶ−１０非翻訳領域による向上効果を確認するため、前述のミニゲノム転写プラスミドにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端にＡＰＭＶ−１０のＦ又はＨＮ遺伝子の非翻訳領域を付与し、２種類の転写プラスミド（Ｌｕｃ−Ｆ−ＮＣＲ及びＬｕｃ−ＨＮ−ＮＣＲ）を作製した。また、コントロールとして、非翻訳領域付与しない転写プラスミド（Ｌｕｃ−ｂｌａｎｋ）も作製した。

なお、表８において、「６の倍数への調整配列」については、配列番号ではなく、配列そのものを示す。また、当該配列は、上述の「パラミクソウイルスの６のルール」を充たすために各転写プラスミドに設けた。

（ルシフェラーゼ活性の測定）
図１１に示すとおり、前述の各ミニゲノム転写プラスミドと、ＡＰＭＶ−１０のポリメラーゼ発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ及びｐＣＡＧＧＳ−Ｌ）を、１２穴細胞培養プレートに２．８×１０^５／ｗｅｌｌで播種したＶｅｒｏ細胞に、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてトランスフェクションし、４８時間後に培養液を回収した。回収した培養液のルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標） Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて測定した。得られた結果を図１２に示す。

なお、前記試験（トランスフェクション、培養液の回収及びルシフェラーゼ活性の測定）は、各検体２ｗｅｌｌずつの細胞を対象として行ない、別々に3回の試験を実施した。

各ミニゲノム転写プラスミドを導入した培養細胞の細胞上清のルシフェラーゼ活性を測定した結果、図１２に示すとおり、ＡＰＭＶ−１０のＨＮ遺伝子の非翻訳領域がルシフェラーゼ遺伝子に付与してあるＬｕｃ−ＨＮ−ＮＣＲは、付与していないＬｕｃ−ｂｌａｎｋに比べ２０倍以上の高い活性を示した。また、Ｆ遺伝子の非翻訳領域がルシフェラーゼ遺伝子に付与ししてあるＬｕｃ−Ｆ−ＮＣＲにおいても、Ｌｕｃ−ｂｌａｎｋに比べ約３倍の高い活性を示した。

以上のことから、発現するタンパク質がルシフェラーゼの場合でも、ＡＰＭＶ−１０の非翻訳領域の付与により、高病原性鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子の場合と同様に、発現が増強されることが確認された。

以上説明したように、本発明によれば、宿主において、病原体抗原等の外来タンパク質の発現量を増加させ、ひいては病原体に対するワクチン効果を増強することが可能となる。特に、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に対する抗体を保持するニワトリにおいても、本発明によれば、高病原性鳥インフルエンザウイルス（ＨＰＡＩＶ）に対するワクチン効果を発揮させることが可能となる。

したがって、本発明の組み換え鳥パラミクソウイルスは、ＨＰＡＩＶの予防等において極めて有用である。

配列番号：２５
＜２２３＞ コドンが最適化された配列
配列番号：２６
＜２２３＞ 合成コンストラクト
配列番号：２９
＜２２３＞ ルシフェラーゼ遺伝子 合成コンストラクト
配列番号：３０
＜２２３＞ 合成コンストラクト

Claims (13)

1. 鳥パラミクソウイルス血清型１０をコードするマイナス鎖ＲＮＡに、外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスであって、
   前記外来転写単位において、５’側から順に、鳥パラミクソウイルス血清型１０の遺伝子開始配列と、鳥パラミクソウイルス血清型１０の５’非翻訳領域と、外来タンパク質をコードするヌクレオチドと、鳥パラミクソウイルス血清型１０の３’非翻訳領域と、鳥パラミクソウイルス血清型１０の遺伝子終結配列とが連結しており、
   前記外来転写単位をコードするマイナス鎖ＲＮＡが、鳥パラミクソウイルス血清型１０の内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするマイナス鎖ＲＮＡに挿入されており、かつ
   前記５’非翻訳領域及び前記３’非翻訳領域が、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＮＰ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＰ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＭ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＦ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＨＮ転写単位由来の非翻訳領域、又は、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＬ転写単位由来の非翻訳領域である、組み換え鳥パラミクソウイルス。
2. 前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＮＰ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：１に記載の配列からなる領域及び配列番号：７に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＰ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：２に記載の配列からなる領域及び配列番号：８に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＭ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：３に記載の配列からなる領域及び配列番号：９に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＦ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：４に記載の配列からなる領域及び配列番号：１０に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＨＮ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：５に記載の配列からなる領域及び配列番号：１１に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＬ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：６に記載の配列からなる領域及び配列番号：１２に記載の配列からなる領域である、請求項１に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス。
3. 前記外来タンパク質が、病原体由来の抗原タンパク質である、請求項１又は２に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス。
4. 前記外来タンパク質が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルス。
5. 請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルスを有効成分として含有する、ワクチン用組成物。
6. 鳥パラミクソウイルス血清型１０をコードするヌクレオチドに、外来タンパク質をコードするヌクレオチドを挿入するための部位を含むクローニング領域が、挿入されている、組み換え鳥パラミクソウイルスをコードするヌクレオチド構築物であって、
   前記クローニング領域において、５’側から順に、鳥パラミクソウイルス血清型１０の遺伝子開始配列と、鳥パラミクソウイルス血清型１０の５’非翻訳領域と、前記部位と、鳥パラミクソウイルス血清型１０の３’非翻訳領域と、鳥パラミクソウイルス血清型１０の遺伝子終結配列とが連結しており、
   前記クローニング領域が、鳥パラミクソウイルス血清型１０の内在性転写単位間にある遺伝子間領域をコードするヌクレオチドに挿入されており、かつ
   前記５’非翻訳領域及び前記３’非翻訳領域が、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＮＰ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＰ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＭ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＦ転写単位由来の非翻訳領域、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＨＮ転写単位由来の非翻訳領域、又は、共に鳥パラミクソウイルス血清型１０のＬ転写単位由来の非翻訳領域である、ヌクレオチド構築物。
7. 前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＮＰ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：１に記載の配列からなる領域及び配列番号：７に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＰ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：２に記載の配列からなる領域及び配列番号：８に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＭ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：３に記載の配列からなる領域及び配列番号：９に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＦ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：４に記載の配列からなる領域及び配列番号：１０に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＨＮ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：５に記載の配列からなる領域及び配列番号：１１に記載の配列からなる領域であり、
   前記鳥パラミクソウイルス血清型１０のＬ転写単位由来の３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域が、配列番号：６に記載の配列からなる領域及び配列番号：１２に記載の配列からなる領域である、請求項６に記載のヌクレオチド構築物。
8. 更に、前記鳥パラミクソウイルス血清型１０をコードするヌクレオチドの５’末側に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター配列が連結しており、該ヌクレオチドの３’末側に、５’側から順に、リボザイム配列と前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するターミネーター配列とが連結している、請求項６又は７に記載のヌクレオチド構築物。
9. 外来タンパク質をコードするヌクレオチドが前記部位に挿入されている、請求項８に記載のヌクレオチド構築物。
10. 前記外来タンパク質が、病原体由来の抗原タンパク質である、請求項９に記載のヌクレオチド構築物。
11. 前記外来タンパク質が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質である、請求項９に記載のヌクレオチド構築物。
12. 請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルスを製造するための方法であって、
    前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質とを発現する形質転換細胞に、請求項９〜１１のうちのいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を導入する工程と、
    前記組み換え鳥パラミクソウイルスを、前記細胞の培養物から回収する工程とを含む、方法。
13. 下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の組み換え鳥パラミクソウイルスを製造するためのキット
    （ａ）請求項８〜１１のうちのいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物
    （ｂ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現することができるヌクレオチド構築物
    （ｃ）前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質を発現することができるヌクレオチド構築物
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のヌクレオチド構築物を導入するための細胞
    （ｅ）前記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は前記鳥パラミクソウイルスのコアタンパク質とを発現する形質転換細胞。