PL188359B1 - Zastosowanie pochodnych cytozyny - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie pochodnych cytozyny w postaci enancjomeru ß-L zwiazku o wzorze 7, w którym R 1 i R 2 oznaczaja podstawniki wybrane z grupy obejmujacej wodór i grupe acy- lowa, wolnego co najmniej w 95% od odpowiedniego enancjomeru ß-D albo jego farma- ceutycznie dozwolonej soli, ewentualnie w farmaceutycznie dozwolonym nosniku, do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u gospodarzy zwierzecych, w tym u ludzi. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnych cytozyny, a zwłaszcza (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroksymetylo-l,3-dioksolan-4--ylo)cytozyna do wytwarzania leku do leczenia nowotworu, włącznie z nowotworem o charakterze raka i do leczenia nieprawidłowej lub niepożądanej proliferacji komórek u ludzi i zwierząt.

Nowotworem jest niekontrolowana, bezładna proliferacja wzrostu komórek. Jeżeli nowotwór odznacza się inwazyjnością lub tworzeniem przerzutów, wtedy stanowi on guz o charakterze złośliwym lub rakowaty. Inwazyjność odnosi się do przejawianej przez nowotwór tendencji do przenikania do tkanki otaczającej go i przerywania błon postawnych nabłonka wyznaczających granice tkanek, a przez to, częstokroć, do wnikania do układu krążenia organizmu. Tworzenie przez nowotwór przerzutów oznacza tendencję do jego migrowania do innych okolic ciała i do ustalania obszarów proliferacji w miejscach znajdujących się poza strefą pierwotnego wystąpienia.

Rak stanowi obecnie drugą pod względem ilości przypadków przyczynę śmierci ludzi w Stanach Zjednoczonych Ameryki. Na podstawie badań diagnostycznych, u ponad 8000000 osób stwierdzono raka, a na rok 1994 prognozuje się wystąpienie raka u dalszych 1208000 osób. W kraju tym ponad 500000 ludzi umiera co roku na wspomnianą chorobę.

Rak nie jest jeszcze dobrze poznany i rozumiany na poziomie molekularnym. Wiadomo, że ekspozycja komórki na oddziaływanie czynników kancerogennych, takich jak niektóre wirusy, pewne chemikalia lub promieniowanie, prowadzi do zmian w DNA, prowadzących do

188 359 inaktywacji genu „supresyjnego” lub aktywacji „onkogenu”. Genami supresyjnymi są geny regulujące wzrost komórki i po ich zmutowaniu nie mogą one dalej kontrolować jej wzrostu. Onkogenami są początkowo geny normalne (nazywane są wtedy preonkogenami), które jednak, po , zmutowaniu lub w warunkach zmienionego kontekstu ekspresji, stają się genami transformującymi. Produkty genów transformujących doprowadzają do niewłaściwego wzrostu komórki. Ponad dwadzieścia różnych genów normalnych może stać się onkogenami na zasadzie zmian genetycznych. Komórki transformowane różnią się od komórek normalnych pod wieloma względami, włączając w to morfologię komórki, wzajemne oddziaływania na siebie komórek, skład błon, strukturę cytoszkieletu, wydzielanie białek, ekspresję genów i śmiertelność (komórki transformowane mogą rozwijać się w nieskończoność).

Komórki wszystkich typów jakie występują w organizmie mogą ulegać transformacji z powstaniem komórek nowotworu dobrotliwego lub złośliwego. Najczęściej spotykanym miejscem występowania nowotworu jest płuco, następnie okrężnica\odbytnica, sutek, prostata, pęcherz, trzustka i wreszcie jajnik. Inne przeważające ilościowo typy raka to białaczka, raki układu nerwowego ośrodkowego, włączając w to raka mózgu, czerniak, chłoniak, przypadki choroby Di Guglielma, rak macicy oraz rak głowy i szyi.

Obecnie, do leczenia raka wykorzystuje się przede wszystkim jeden z trzech rodzajów terapii (lub ich kombinację), a mianowicie: chirurgię, napromienianie i chemoterapię. Chirurgia obejmuje całkowite usunięcie tkanki dotkniętej chorobą. Aczkolwiek chirurgia okazuje się niekiedy skuteczna, jeśli chodzi o usunięcie nowotworów umiejscowionych w określonych miejscach, na przykład w piersi, okrężnicy i skórze, to jednak nie da się jej stosować do leczenia nowotworów umiejscowionych w innych obszarach, takich jak kręgosłup, ani do leczenia nowotworów rozsianych, takich jak białaczka.

Chemoterapia obejmuje przerwanie replikacji komórek lub metabolizmu komórkowego. Stosuje się ją najczęściej w leczeniu białaczki, jak również w leczeniu raka sutka, płuca i jądra.

Istnieje pięć głównych grup środków chemoterapeutycznych, znajdujących się obecnie w użyciu przy leczeniu raka. Są to: produkty naturalne i ich pochodne; antracykliny; środki alkilujące; środki antyproliferacyjne (nazywane także antymetabolitami); oraz środki hormonalne. Środki chemoterapeutyczne często nazywane są środkami przeciwnowotworowymi.

Uważa się, że środki alkilujące działają przez alkilowanie i sieciowanie guaniny, a być może i innych zasad, w DNA, czego rezultatem jest zatrzymanie podziału komórek. Do typowych środków alkilujących należą: iperyt azotowy, związki typu etylenoiminy, siarczany alkilów, cysplatyna i rozmaite nitrozomoczniki. Wadą tych związków jest to, że atakują one nie tylko komórki rakowate, ale także i inne komórki, które dzielą się w sposób naturalny, takie jak komórki szpiku kostnego, skóry, błony śluzowej przewodu żołądkowo-jelitowego oraz komórki płodu.

Antymetabolitami są, typowo, odwracalne lub nieodwracalne inhibitory enzymów, albo związki, które w inny sposób zakłócają przebieg replikacji, translacji lub transkrypcji kwasów nukleinowych.

Zidentyfikowano szereg różnych nukleotydów syntetycznych, które przejawiają aktywność przeciwrakową. Dobrze poznaną pochodną nukleozydową o silnym działaniu przeciwrakowym jest 5-fluorouracyl. 5-Fluorouracyl stosowany jest klinicznie w leczeniu nowotworów złośliwych, włącznie, na przykład, z rakami, mięsakami, rakiem skóry, rakiem narządów trawiennych i rakiem sutka. Jednakże, 5-fluorouracyl wywołuje poważne reakcje szkodliwe, takie jak wymioty, łysienie, biegunka, zapalenie jamy ustnej, małopłytkowość leukocytowa, jadłowstręt, pigmentacja i obrzęk. W opisie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4336381 oraz w japońskich publikacjach patentowych nr nr 50-50383, 50-50384, 50-64281, 51-146482 i 53-84981 opisano pochodne 5-fluorouracylu o aktywności przeciwrakowej.

W patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4000137 ujawniono, że nadtlenkowy produkt utleniania inozyny, adenozyny lub cytydyny z udziałem metanolu lub etanolu wykazuje aktywność skierowaną przeciw białaczce limfocytowej.

Arabinozyd cytozyny (określany także jako Cytarabina, araC i Cytosar) jest analogiem nukleozydowym deoksycytydyny, który został zsyntetyzowany po raz pierwszy w roku 1950, a wprowadzony do medycyny klinicznej w roku 1963. Stanowi on obecnie ważny lek, jeśli

188 359 chodzi o leczenie białaczki szpikowej ostrej. Wykazuje on także aktywność w stosunku do białaczki limfocytowej ostrej, a w mniejszym zakresie jest użyteczny w leczeniu białaczki szpikowej przewlekłej i chłoniaka złośliwego nieziamiczego. Zasadniczą czynnością araC jest hamowanie syntezy jądrowego DNA. R. Handschumacher i Y. Cheng, „Purine and Pyrimidine Antimetabolites”, Cancer Medicine, rozdział XV-1, wydanie trzecie, red. J. Holland i in., Lea and Febigol, Publishers.

5-Azacytydyna jest analogiem cytydyny, stosowanym przede wszystkim do leczenia białaczki szpikowej ostrej i zespołu mielodysplazyjnego.

2-Fluoroadenozyno-5'-fosforan (Fludara, określany także jako FaraA) jest jednym z najbardziej aktywnych środków w leczeniu białaczki limfocytowej przewlekłej. Związek ten działa przez hamowanie syntezy DNA. Traktowanie komórek F-araA stowarzyszone jest z gromadzeniem się komórek na granicy Gl/faza S i w fazie S. Tak więc, jest on lekiem specyficznym w odniesieniu do fazy S cyklu komórkowego. Włączenie aktywnego metabolitu, F-araATP, opóźnia wydłużanie łańcucha DNA. F-araATP jest także silnym inhibitorem reduktazy rybonukleotydowej, kluczowego enzymu odpowiedzialnego za tworzenie dATP.

2-Chlorodeoksyadenozyna jest przydatna w leczeniu nowotworowego rozplemu komórek B o niskim stopniu zróżnicowania, takich jak białaczka limfocytowa przewlekła, chłoniak złośliwy nieziamiczy i białaczka kosmatokomórkowa. Jej spektrum aktywności jest podobne do spektrum aktywności preparatu Fludara. Związek ten hamuje syntezę DNA w rosnących komórkach i hamuje naprawę DNA w komórkach spoczynkowych.

Aczkolwiek obecnie zidentyfikowanych jest i stosowanych do leczenia raka szereg środków chemoterapeutycznych. poszukuje się wciąż nowych środków, które byłyby skuteczne, a zarazem przejawiały niski stopień toksyczności względem komórek zdrowych.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnych cytozyny w postaci enancjomeru β-L związku o wzorze 7, w którym Ri i R² oznaczają podstawniki wybrane z grupy obejmującej wodór i grupę acylową, wolnego co najmniej w 95% od odpowiedniego enancjomeru p-D albo jego farmaceutycznie dozwolonej soli, ewentualnie w farmaceutycznie dozwolonym nośniku, do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u gospodarzy zwierzęcych, w tym u ludzi.

Korzystnie stosuje się związek o wzorze 7, w którym R iR oznaczają wodór.

Także korzystnie stosuje się związek o wzorze 7, w którym grupa acylowa stanowi grupę o wzorze -C(0)R, w którym R oznacza grupę Ci-C5-alkilową, grupę fenylową lub grupę benzylową.

Korzystnie stosuje się, w ilości skutecznej pod względem leczenia nowotworu u gospodarzy zwierzęcych, w tym u ludzi, powyższy związek albo jego farmaceutycznie dozwoloną sól wraz z farmaceutycznie dozwolonym nośnikiem, zwłaszcza nadającym się do podawania związku drogą doustną, drogą dożylną lub nadającym się do stosowania związku miejscowo lub przezskómie.

Korzystnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze 3, w którym R oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej H i F, a Ri i R² oznaczają podstawniki wybrane z grupy obejmującej wodór, grupę acylową, ugrupowanie monofosforanu, ugrupowanie difosforanu i ugrupowanie trifosforanu, albo jego farmaceutycznie dozwolonej soli, ewentualnie w farmaceutycznie dozwolonym nośniku do wytwarzania leku do leczenia raka.

Szczególnie korzystnie stosuje się związek o wzorze 3, w którym R oznacza fluor, a Ri i R2 oznaczają wodór.

W przypadku zastosowania związku o wzorze 3, korzystnie stosuje się nośnik nadający się do podawania związku drogą doustną, nośnik stanowiący kapsułkę lub nośnik w postaci tabletki.

Najkorzystniejszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroksymetylo-l,3-dioksolan-4-ylo)cytozyny i jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli albo jej enancjomeru (+) lub mieszaniny racemicznej oraz ich farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli do wytwarzania leku do leczenia nowotworu, włącznie z nowotworem o charakterze raka, a także zastosowanie (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroksymetylo-l,3-dioksolan-4-ylo)cytozyny i jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli albo jej enan188 359 cjomeru (+) lub mieszaniny racemicznej i ich farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli do wytwarzania leku do leczenia nieprawidłowej lub niepożądanej proliferacji komórek.

W korzystnym sposobie wykonania niniejszego wynalazku, (-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo)-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozynę stosuje się w postaci wskazanego enancjomeru (enancjomer L) i zasadniczo bez obecności jej odpowiedniego enancjomeru (a więc, w postaci enancjomerycznie wzbogaconej, w tym w postaci enacjomerycznie czystej).

Sądzi się, że (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytoz.yna jest pierwszym przykładem nukleozydu „L”, który przejawia aktywność przeciwnowotworową. (-)-(2S,4S)-1-(2-Hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozyna ma budowę przedstawioną wzorem 1.

Odkryto, że (-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozyna przejawia wybitną aktywność skierowaną przeciwko komórkom rakowym i wykazuje niski stopień toksyczności względem zdrowych komórek w organizmie gospodarza. Przykłady raków, które można leczyć tym związkiem obejmują (ale bez ograniczania się tylko do nich) raka płuca, raka okrężnicy/odbytnicy, raka sutka, raka prostaty, raka pęcherza, raka nosowo-gardłowego, raka trzustki, raka jajników, białaczki, chłoniaka, raka głowy i szyi, raka układu nerwowego ośrodkowego (włącznie z rakiem mózgu), raka szyjki macicy, czerniaka i raka wątrobowokomórkowego.

W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku stosuje się związek o wzorze 2, w którym R oznacza F, a R1 oznacza wodór, grupę acylową, ugrupowanie monofosforanu, ugrupowanie difosforanu lub ugrupowanie trifosforanu, albo jej farmaceutycznie dozwolonej pochodnej, ewentualnie w farmaceutycznie dozwolonym nośniku, korzystnie w postaci enancjomerycznie wzbogaconej.

Aczkolwiek korzystne wykonanie niniejszego wynalazku polega na zastosowaniu związków aktywnych, albo ich pochodnych lub ich soli, występujących w konfiguracji nienaturalnej (w konfiguracji L), związki ujawnione w niniejszym opisie, albo ich pochodne lub ich sole, mogą być stosowane także i wtedy, gdy występują w konfiguracji naturalnej (w konfiguracji D) lub w postaci mieszaniny racemicznej.

Każdy z ujawnionych w niniejszym opisie związków można stosować, w przeznaczeniu do leczenia nowotworów, w kombinacji lub w następstwie naprzemiennym z innymi farmaceutycznymi środkami przeciwnowotworowymi, w celu wzmożenia skuteczności terapii. Do przykładowych tego rodzaju środków należą produkty naturalne i ich pochodne; antracykliny; środki alkilujące; środki antyproliferacyjne (nazywane także antymetabolitami) oraz środki hormonalne. W szczególności, do środków tych należą (ale bez ograniczania się tylko do nich) iperyt azotowy, związki typu etylenoiminy, siarczany alkilowe, cysplatyna, nitrozomoczniki, 5-fluorouracyl, arabinozyd cytozyny, 5-azacytydyna, 2-fluoroadenozyno-5'-fosforan, 2-chlorodeoksyadenozyna, tamoksyfen, aktynomycyna, amsakryna, bleomycyna, karboplatyna, karmustyna, cyklofosfamid, cyklosporyna, daunorubicyna, doksyrubicyna, interleukina, lomustyna, merkaptopuryna, metotreksat, mitomycyna, tioguanina, winblastyna, czynniki wzrostowe, włączając w to GCSF, GMCSF i czynniki wzrostowe pochodzące z płytek; adriamycyna, WP-16, hydroksymocznik, etopozyd; interferony α, β i ζ, oraz winkrystyna. Sposoby stosowania skutecznych ilości tych środków można ustalić w łatwy sposób. Opisane są one, na przykład, w: The Physician's Desk Reference, wydanie ostatnie, opublikowane przez Medical Economics Data Production Company, oraz Martindale, The Extra Pharmacopoeia, wydanie ostatnie, opublikowane przez The Pharmaceutical Press. Metody te można modyfikować w sposób rutynowy w celu zoptymalizowania skuteczności terapii zespolonej lub naprzemiennej.

Figura 1 pokazuje ID50 (-)-OddC i kombinacji (-)-OddC + THU (tetrahydrourydyna, inhibitor deaminazy cytydynowej) w odniesieniu do komórek raka okrężnicy. Wykres przedstawia zahamowanie wzrostu jako procent wzrostu kontroli w funkcji stężenia (μΜ). Na wykresie, dane odnoszące się do (-)-OddC są uwidocznione przy pomocy znaku (·), a dane odnoszące się do (-)-OddC + THU są uwidocznione przez (--Δ--).

Figura 2 jest wykresem pokazującym zmiany masy nowotworu, w odniesieniu do raka mysiego (Colon 38) traktowanego dwa razy dziennie (-)-OddC w dawce wynoszącej 25 mg/kg b.i.d.

188 359

Wykres przedstawia wzrost nowotworu jako procent początkowej masy nowotworu w funkcji czasu (w dniach). Myszom podawano lek w dniach 1, 2, 3, 4 i 5. Na wykresie, dane odnoszące się do kontroli [bez podawania (-)-OddC] są uwidocznione przy pomocy znaku (•), a dane odnoszące się do (-)-OddC oznaczone są przez (--Δ--).

Figura 3 pokazuje stopień przeżywalności myszy z białaczką P388 potraktowanych (-)-OddC. Wykres przedstawia procent przeżycia w funkcji czasu (w dniach kuracji). Lek podawano myszom w dniach 1, 2, 3, 4 i 5. Na wykresie, stopień przeżywalności myszy kontrolnych [bez podawania (-)-OddC] jest uwidoczniony przy pomocy znaku (•), stopień przeżywalności myszy, którym podawano (-)-OddC w dawce wynoszącej 25 mg/kg b.i.d. dwa razy dziennie uwidoczniono przez (--Δ--), a stopień przeżywalności myszy, którym podawano (-)-OddC jeden raz dziennie w dawce wynoszącej 50 mg/kg b.i.d. uwidoczniono znakiem (o).

Figura 4 jest wykresem pokazującym względną wrażliwość niektórych linii komórek rakowych na (-)-OddC na podstawie GI50. Słupki wystające w prawo oznaczają wrażliwość linii komórkowej na (-)-OddC przekraczającą średnią wrażliwość wszystkich linii komórek poddawanych badaniu. Ponieważ skala słupkowa jest skałą logarytmiczną, słupek o 2 jednostkach na prawo nasuwa wniosek, że związek osiągnął GI50 dla linii komórek przy stężeniu 1/100 średniego stężenia potrzebnego dla wszystkich linii komórek, a zatem linia komórek jest niezwykle wrażliwa na działanie (-)-OddC. Odpowiednio, słupki wystające w lewo implikują wrażliwość mniejszą od średniej.

Figura 5 jest wykresem pokazującym zahamowanie wzrostu nowotworu ludzkiego [znak(·)]. Myszy nagie Ner, w wieku 3-6 tygodni, zaszczepiono podskórnie z każdego boku komórkami HepG2 lub DU-145, użytymi w ilości 2 x 10⁶. Leczenie rozpoczęto, gdy nowotwory znajdowały się w początkowym stadium wzrostu. Leki podawano dwa razy dziennie, w dniach 0 - 4, a rozmiary guzów mierzono w dniach wskazanych. Krzywe A i B przedstawiają skutki działania leku na nowotwory, odpowiednio, HepG2 i Du-145 [-o- Kontrola; -·- AraC 25 mg/kg, i.p.; -□- (-)-OddC, 25 mg/kg, p.o.; -□- (-)-OddC, 25 mg/kg, i.p.)]. Każdy punkt oznacza wartość średnią ± SD dla 10 (na wykresie A) i 6 nowotworów, na wykresie B).

(-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozynę określa się jako nukleozyd „L”. Ponieważ atomy węgla 2 i 5 pierścienia dioksolanowego są chiralne, ich podstawniki niewodorowe (odpowiednio CH2OH i cytozyna zasada) mogą mieć albo konfigurację cis (znajdują się po tej samej stronie), albo konfigurację trans (znajdują się po przeciwnych stronach) względem układu pierścieniowego dioksolanu. Tak więc, cztery izomery optyczne przedstawione są następującymi konfiguracjami (przy zorientowaniu ugrupowania dioksolanowego w płaszczyźnie poziomej tak, że tlen w pozycji 3 znajduje się z przodu): cis (z obiema grupami „w górę”, co odpowiada konfiguracji nukleozydów występujących w naturze, określanych jako nukleozydy „D”), cis (z obiema grupami „w dół”, co stanowi konfigurację nie spotykaną w naturze, z określeniem nukleozydy „L”), trans (z podstawnikiem przy C2 „w górę”, i podstawnikiem przy C5 „w dół”) i trans (z podstawnikiem przy C2 „w dół” i podstawnikem przy C5 „w górę”. Sądzi się, że (-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolano-4-ylo)cytozyna, lub jej pochodna, jest pierwszym przykładem nukleozydu „L”, który wykazuje aktywność przeciwnowotworową. Jest to zaskakujące z uwagi na fakt, że ta konfiguracja „L” nukleozydu nie występuje w naturze.

Stosowany w niniejszym opisie termin „wzbogacony enancjomerycznie” odnosi się do kompozycji nukleozydowej zawierającej co najmniej około 95%, a korzystnie około 97%, 98%, 99% lub 100% pojedynczego enancjomeru tego nukleozydu. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, (-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozyna, albo jej pochodna lub sól, występuje w kompozycji nukleozydowej złożonej zasadniczo z jednego enancjomeru, to znaczy jako wskazany enancjomer (enancjomer L) i zasadniczo w nieobecności odpowiadającego mu enancjomeru D (a więc w postaci enancjomerycznie wzbogaconej, włącznie z postacią enancjomerycznie czystą).

Związek aktywny można stosować w postaci dowolnej pochodnej, która po podaniu biorcy albo wykazuje zdolność odtwarzania, bezpośrednio lub pośrednio, wyjściowego związku (-)-L-OddC lub jego 5-podstawionej pochodnej, jak to zdefiniowano skądinąd w niniejszym opisie, albo która przejawia aktywność sama z siebie. Przykładami (ale bez ograni188 359 czania się tylko do nich) są tu farmaceutycznie dozwolone sole (alternatywnie określane jako „sole fizjologicznie dozwolone”) (-)-OddC, 5-pochodne, jak to objaśniono w powyższej części niniejszego opisu, oraz 5'- i N⁴-acylowane lub alkilowane pochodne związku aktywnego (alternatywnie określane jako „pochodne fizjologicznie aktywne”). Zgodnie z jednym z wykonań wynalazku, grupą acylową jest ugrupowanie estru kwasu karboksylowego [-C(O)R], w którym część niekarbonylowa grupy estrowej wybrana jest spośród grup takich jak grupa alkilowa o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym (typowo C1 do Ci 8, a bardziej typowo C1 do C5), grupa alkarylowa, grupa aralkilowa, grupa alkoksyalkilowa włącznie z grupą metoksymetylową, grupa aralkilowa włącznie z grupą benzylową, grupa alkilowa lub grupa C1-C4-alkoksylowa; ugrupowania estrów sulfonianowych, takie jak ugrupowania alkilo- lub aralkilosulfonylowe, włącznie z grupą metanosulfonylową, ugrupowania estru mono-, di- lub trifosforanowego, grupa tritylowa lub monometoksytritylowa, podstawiona grupa benzylowa, grupa trialkilosililowa (na przykład grupa dimetylo-tert-butylosililowa) lub grupa difenylometyłosililowa. Optymalnie, grupy arylowe w estrach obejmują grupę fenylową.

Do konkretnych przykładowych, farmaceutycznie dozwolonych pochodnych L-OddC należą (ale bez ograniczania się tylko do nich) związki o wzorze 3, w którym R oznacza F, a Ri i R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, i grupę acylową, a konkretnie oznaczają (ale bez ograniczania się tylko do nich), grupę benzoilową, grupę acetylową, grupę piwaloilową, grupę metanosulfonylową, grupę propionylową, grupę butyiylową, grupę walerylową, grupę heksanoilową, grupę oktanoilową, grupę dekanoilową, grupę lauroilową, grupę mirystoilową, grupę palmitoilową, grupę stearoilową, grupę oleilową, a także ugrupowania aminokwasów włącznie z (ale bez ograniczania się tylko do nich) grupą alanylową, grupą walinylową, grupą leucynylową, grupą izoleucynylową, grupą prolinylową, grupą fenyloalaninylową, grupą tryptofanylową, grupą metioninylową, grupą glicynylową, grupą serynylową, grupą treoninylową, grupą cysteinylową, grupą tyrozynylową, grupą asparaginylową, grupą glutaminylową, grupą aspartoilową, grupą glutamoilową, grupą lizynylową, grupą argininylową i grupą histydynylową. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, pochodna występuje jako enancjomer L, zasadniczo w nieobecności odpowiadającego mu enancjomeru (a więc w postaci enancjomerycznie wzbogaconej, włącznie z postacią enancjomerycznie czystą).

L-OddC, lub jej pochodna, może występować w postaci farmaceutycznie dozwolonych soli. Stosowany w niniejszym opisie termin „farmaceutycznie dozwolone sole lub kompleksy” odnosi się do soli lub kompleksów L-OddC, lub jej pochodnych, które utrzymują pożądaną aktywność biologiczną związku wyjściowego i nie przejawiają wcale, albo tylko w minimalnym stopniu, niepożądanego działania toksycznego. Przykładowymi solami tego rodzaju (ale bez ograniczania się tylko do nich) są : (a) kwaśne sole addycyjne utworzone z kwasami nieorganicznymi (na przykład z kwasem chlorowodorowym, kwasem bromowodorowym, kwasem siarkowym, kwasem fosforowym, kwasem azotowym itp.), oraz sole utworzone z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas 2,2'-dihydroksy-1,1'-dinafłylometano-3,3'-dihydroksylowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwasy naftalenosulfonowe i kwas poligalakturonowy; (b) zasadowe sole addycyjne, utworzone z kationami metali wielowartościowych, takich jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, sód, potas itp., albo z kationem organicznym wywodzącym się z N,N-dibenzyloetylenodiaminy, amonu lub etylenodiaminy; albo (c) kombinacje (a) z (b), na przykład taninian cynku lub temu podobne.

Modyfikowaniem związku aktywnego, zwłaszcza w pozycjach n4- i 5'-O, można wpływać na rozpuszczalność, dostępność biologiczną i szybkość metabolizowania związków aktywnych, zapewniając w ten sposób możliwość regulowanego dostarczania choremu związków aktywnych. Następnie, modyfikacje takie mogą wywierać wpływ na aktywność przeciwrakową związku, zwiększając w niektórych przypadkach ich aktywność ponad aktywność związku wyjściowego. Ocenić to można w łatwy sposób, za pomocą wytworzenia danej pochodnej i poddania jej badaniu pod względem aktywności przeciwrakowej, zgodnie z poniżej opisanymi sposobami przeprowadzania takich testów, albo zgodnie z innymi metodami znanymi fachowcom w tej dziedzinie wiedzy.

188 359

Podsumowując, najkorzystniejszym przedmiotem niniejszego wynalazku są:

Zastosowanie (-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozyny oraz jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli, albo jej enancjomeru (+) lub ich mieszanin racemicznych, a także ich farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia nowotworów, w tym nowotworów o charakterze raka i do leczenia nieprawidłowej lub niepożądanej proliferacji komórek u ludzi i zwierząt oraz zastosowanie (-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozyny oraz jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli, albo jej enancjomeru (+) lub ich mieszanin racemiczneych albo ich farmaceutycznie dozwolonych pochodnych lub soli, razem z farmaceutycznie dozwolonym nośnikiem, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia nowotworów, w tym nowotworów o charakterze raka i do leczenia nieprawidłowej lub niepożądanej proliferacji komórek u ludzi i zwierząt·

Opisane powyżej związki aktywne można wytworzyć sposobem opisanym skrótowo poniżej. Sposób ten jest przedmiotem opisu patentowego nr..........(P 358979), wydzielonym z niniejszego zgłoszenia.

Sposób wytwarzania (2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozyny, polega na tym, że :

(i) poddaje się ewentualnie zabezpieczoną cytozynę reakcji z 1,3-dioksolanem o wzorze 4, w którym Ru oznacza wodór lub grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową, włącznie z grupą acylową, a L oznacza grupę opuszczającą; oraz, ewentualnie, usuwa się jakąkolwiek obecną grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową.

(ii) poddaje się związek o wzorze 5 (w którym Ri ma wyżej podane znaczenie) reakcji ze środkiem służącym do przekształcenia grupy okso w pozycji 4 pierścienia uracylu w grupę aminową; usuwa się jakiekolwiek pozostałe grupy zabezpieczające z otrzymaniem pożądanego związku.

Sposób wytwarzania enancjomeru (-) lub (+) (2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)cytozyny, polega na tym, że poddaje się związek, lub jego pochodną (na przykład 5'-ester), występujący w postaci mieszaniny enancjomerów (-) i (+), wpływowi warunków, albo działaniu odczynników (na przykład na drodze reakcji z odpowiednim enzymem), sprzyjających rozdzieleniu enancjomerów oraz, jeżeli jest to konieczne, przekształca się utworzoną pochodną w związek wyjściowy. Alternatywnie, mieszaninę można przepuścić przez kolumnę do chiralnej chromatografii cieczowej, na której następuje rozdzielenie tego typu enancjomerów

Sposób wytwarzania (2S,4S)-1-(2-hydroksymetYlo)-1.3-dioksolan-4-ylo)cytozyny. polega na tym, że poddaje się zabezpieczony 1,3-dioksolan o wzorze 6 reakcji z zabezpieczoną cytozyną zasadą, ewentualnie podstawioną w pozycji 5, przy użyciu kwasu Lewisa nie racemizującego wytworzonego związku, takiego jak trifluorometanosulfonian trimetylosililu.

I. Wytwarzanie związków aktywnych (-)-L-OddC i jej pochodne można wytwarzać sposobem powyżej opisanym, zgodnie z metodą ujawnioną szczegółowo w PCT International Publication nr WO 92/18517, opublikowaną 29 października 1992, według metody przedstawionej na schemacie 1 i według poniższych przykładów 1-7 albo zgodnie z jakąkolwiek inną metodą znaną fachowcom w tej dziedzinie techniki. Sposoby te albo inne znane sposoby, można zaadaptować do wytwarzania podanych przykładowo pochodnych L-OddC (schemat 1).

Przykład 1. Wytwarzanie 6-anhydro-L-gulozy

6-Anhydro-L-gulozę (2) wytworzono w jednym etapie, z wydaj nością 60%, z L-gulozy (1) za pomocą poddania L-gulozy reakcji z kwasem, na przykład 0,5 N HCl [M.E. Evans i in., Carbohydr. Res./ 28, 359 (1973)]. Z pominięciem selektywnego zabezpieczania, jak tego dokonywano wcześniej [L.S. Jeong i in., Tetrahedron Lett., 33, 595 (1992) oraz J.W. Beach i in., J. Org. Chem., (1992, w druku)], związek (2) bezpośrednio przekształcono w dioksolanotriol (3) za pomocą utlenienia przy użyciu NaJOj, z następującą po tym redukcją z udziałem NaBHU, który, z pominięciem wyodrębniania, przekształcono w pochodną izopropylidenową (4). W rezultacie benzoilowania z wytworzeniem związku (5), odblokowania z wytworzeniem związku (6) i utlenienia diolu (6) otrzymano kwas (7). Związek (7) poddano dekarboksylacji

188 359 utleniającej przy użyciu Pb(OAc)ą, w środowisku suchego THF, w wyniku czego otrzymano, z dobrą wydajnością, octan (8), będący kluczowym związkiem pośrednim. Octan poddano kondensacji z pożądanymi pirymidynami (na przykład sililowaną tyminą i N-acetylocytozyną) w obecności TMSOTf, w wyniku czego otrzymano mieszaninę a, β, którą rozdzielono na kolumnie żelu krzemionkowego, w wyniku czego otrzymano pojedyncze izomery (9 i 10). Po odbenzoilowaniu przy użyciu metanolowego roztworu amoniaku otrzymano pożądaną (-)-OddC (11).

Przykład 2. Wytwarzanie (-)-1,6-anhydro-a-L-gulopyranozy (2)

Mieszaninę 33 g (0,127 mola) L-gulozy (1) i 330 ml (0,165 mola) 0,5 N HCl ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w ciągu 20 godzin. Następnie mieszaninę oziębiono i zobojętniono do pH 6 przy użyciu żywicy (Dowex-2, forma HCO3) z przepuszczaniem powietrza przez bełkotkę. Żywicę zawracano do procesu po przemyciu 10% HCl, wodą, metanolem i nasyconym roztworem NaHCO3. Mieszaninę reakcyjną przesączono i żywicę przemyto 500 ml wody. Połączone przesącze zatężono do sucha i wysuszono przez noc pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość poddano oczyszczaniu na 5 cm kolumnie (żel krzemionkowy, mesh, CHCI3-CH3OH, 10:1), w wyniku czego otrzymano ciało stałe o barwie lekko żółtej, które poddano rekrystalizacji z alkoholu absolutnego, w wyniku czego otrzymano 7,3 g (35,52%) bezbarwnego ciała stałego (2) [Rf = 0,43 (CHCI3-CH3OH. 5:1). Otrzymaną L-gulozę (11 g, Rf = 0,07) zawrócono do procesu, w wyniku czego otrzymano 5 g związku (2) (wydajność ogólna 60%).

Temperatura topnienia : 142,5 - 145°C.

’H NMR (DMSO-d6) δ : 3,22-3,68 (m, 4H, H-2, -3, -4 i -6a), 3,83 (d, J6b,6a = 7,25 Hz, 1H, Hb-6), 4,22 (pseudo t, J5_;6a = 4,61 i 4,18 Hz, H, H-5), 4,46 (d, J2-OH2 = 6,59 Hz, 1H, 2-OH, wymienialny z D₂O), 4,62 (d, T-ohj = 5,28 Hz, 1H, 3-Oh, wymienialny z D₂O), 5,07 (d, J4-OH4 = 4.84 Hz, 1H, 4-OH, wymienialny z D₂O), 5,20 (d, J12 = 2,19 Hz, 1H, H-1).

’ [α]ο -50,011 (c, 1,61, CH3OH). ’

Przykład 3. Wytwarzanie (-)-(TS,2S,4S)-4-(1,2-dihydroksyetylo-1,2-O-izopropylideno)-2-hydroksymetylo)dioksolanu (4)

Do roztworu 11,3 g (0,07 mola) związku (2) w 350 ml metanolu oziębionego do temperatury 0°C, wkroplono, w ciągu 10 minut, roztwór 22,36 g (0,1 mola) NaJO4 w 300 ml wody. Utworzoną mieszaninę mieszano mechanicznie w ciągu 15 minut. Do mieszaniny tej dodano 7,91 g (0,21 mola) NaBH4 i otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 10 minut w temperaturze 0°C. Utworzone ciało stałe o barwie białej odsączono i przemyto 300 ml metanolu. Połączone przesącze zobojętniono za pomocą dodania około 200 ml 0,5 N HCl i zatężono do sucha. Otrzymaną pozostałość wysuszono przez noc pod zmniejszonym ciśnieniem. Utworzoną pozostałość o konsystencji syropu ucierano z 1200 ml mieszaniny metanolu i acetonu (1:5) przy użyciu mieszadła mechanicznego w ciągu 5 godzin, po czym ciało stałe o barwie białej (pierwszy rzut) odsączono. Przesącz zatężono do sucha i pozostałość rozpuszczono w 500 ml acetonu, po czym dodano 6,63 g (0,035 mola) kwasu p-toluenosulfonowego. Po mieszaniu w ciągu 6 godzin, otrzymaną mieszaninę zobojętniono przy użyciu trietyloaminy i odsączono ciało stałe (drugi rzut). Przesącz zatężono do sucha i otrzymaną pozostałość rozpuszczono w 350 ml octanu etylu. Po przemyciu 2 razy po 50 ml wody, osuszeniu (MgSO4), przesączeniu i odparowaniu, otrzymano 3,6 g produktu surowego (4) w postaci syropu o barwie żółtawej. Warstwę wodną zatężono do sucha i pozostałość wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany produkt (rzuty pierwszy i drugi) połączono z pozostałością po wysuszeniu warstwy wodnej i zawrócono do procesu przez mieszanie w ciągu godziny w 900 ml 10% metanolu-acetonie w obecności 16 g (0,084 mola) kwasu p-toluenosulfonowego, w wyniku czego otrzymano 5,6 g produktu surowego (4). Produkt surowy (4) poddano oczyszczaniu na suchej kolumnie żelu krzemionkowego (CH3OH-CHO3, 1% - 5%), w wyniku czego otrzymano 8,8 g (61,84%) związku (4) [Rf = 0,82 (CHO3-CH3OH, 10:1)], w postaci bezbarwnego oleju.

'Η NMR (DMSO-d6) δ : 1,26 i 1,32 (2 x s, 2 x 3H, izopropylidenu), 3,41 (dd, Jch2Ohoh = 6,04 Hz, Jch2oh,2 = 3,96 Hz, 2H, CH₂OH), 3,56 - 4,16 (m, 6H, H-4, -5, -1' i 2'), 4,82’(t,

188 359

Joh,ch2 =6,0 Hz, 1H, CH2OH, wymienialny z D2O), 4,85 (t, J2OHCH2OH = 3,96 HZ, 1H, H-2). [a]_D -12,48 (c, 1,11, CHCla).

Analiza elementarna.

Obliczono dla C9H16O5 : C 52,93; H 7,90.

Znaleziono : C 52,95; H 7,86.

Przykład 4. Wytwarzanie (+)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-dihydroksymetylo-1,2-O-izopropylideno)-2-(0-benzoiloksymetylo)dioksolanu (5)

Do roztworu 8,5 g (0,042 mola) związku (4) w 120 ml mieszaniny pirydyny i CH2G2 (1 : 2), wkroplono, w temperaturze 0°C, 6,5 ml (0,056 mola) chlorku benzoilu, po czym temperaturę podwyższono do temperatury pokojowej. Po mieszaniu w ciągu 2 godzin, mieszaninę reakcyjną szybko zadano 10 ml metanolu i utworzoną mieszaninę zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość rozpuszczono w 300 ml CH2G2. Po przemyciu 2 razy po 100 ml wody oraz wodnym roztworem chlorku sodowego, osuszeniu (MgSOfi, przesączeniu i odparowaniu, otrzymano pozostałość o konsystencji syropu, o barwie żółtawej, którą poddano oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (EtOAc-heksan 4%-30%), w wyniku czego otrzymano 10,7 g (83,4%) związku (5) [Rf = 0,45 (heksan-EtOAc, 3 : 1)] w postaci bezbarwnego oleju.

^lH NMR (CDCb) δ : 1,35 i 1,44 (2 x s, 2 x 3H, izopropylidenu), 3,3-4,35 (m, 6H, H-4, -5, -1' i -2'), 4,44 (d, J = 3,96 Hz, 2H, CH2-OBz), 5,29 (t, J = 3,74 Hz, 1H, H-2), 7,3-7,64, 8,02 - 8,18 (m, 3H, 2H, -OBz).

(«h?⁵ +10,73 (c, 1,75, CH3OH).

Analiza elementarna.

Obliczono dla C^tA : C 62,33; H 6,54.

Znaleziono : C 62,39; H 6,54.

Przykład 5. Wytwarzanie (+)-(1'S,2S,4S)-4-(1,2-dihydroksyetylo)-2-(O-benzoiloksymetylo)dioksolanu (6)

Mieszaninę 5,7 g (0,018 mola) związku (5) i 1,05 g (0,0055 mola) kwasu p-toluenosulfonowego w 70 ml metanolu mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 2 godzin. Ponieważ reakcja nie zaszła do końca, rozpuszczalnik odparowano do połowy początkowej objętości, po czym dodano jeszcze 50 ml metanolu i 0,7 g (3,68 mmola) kwasu p-toluenosulfonowego. Po mieszaniu w ciągu jeszcze jednej godziny, mieszaninę reakcyjną zobojętniono za pomocą dodania trietyloaminy i rozpuszczalnik odparowano do sucha.

Pozostałość poddano oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (heksan-EtOAc, 10%-33%), w wyniku czego otrzymano 4,92 g (99,2%) związku (6) [Rf = 0,15 (heksan-EtOAcc, 1:1)] w postaci bezbarwnego syropu.

1H NMR (DMSO-d6 δ : 3,43 (m, 2H, H-2'), 3,67-4,1 (m, 4H, H-4, -5 i -1'), 4,32 (d, J = 3,73 Hz, 2H, CH2-OBZ), 4,60 (t, J = 5,72 Hz, 2'-OH, wymienialny z D2O), 5,23 (t, J = 3,96 Hz, 1H, H-2), 7,45-7,7, 7,93-8,04 (m, 3H, 2H, -OBz).

[δ]₀2⁵ +9,16 (c, 1,01, CHCb).

Analiza elementarna.

Obliczono dla C13H16O6: C 58,20; H 6,01.

Znaleziono : C 58,02; H 6,04.

Przykład 6. Wytwarzanie (-)-(2S,4S)- i (2S,4R)-4-acetoksy-2-(O-benzoiloksymetylo)dioksolanu (8)

Do roztworu 3,04 g (0,011 mola) związku (6) w 160 ml mieszaniny CCb i CH3CN (1:1) wprowadzono roztwór 10,18 g (0,048 mola) NaJO4 w 120 ml wody, a następnie 0,02 g hydratu RuO2. Mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 5 godzin, po czym utworzone ciało stałe usunięto za pomocą odsączenia na Celite i przesącz odparowano do 1/3 objętości. Otrzymaną pozostałość rozpuszczono w 100 ml CH2G2 i warstwę wodną poddano ekstrakcji 2 razy po 100 ml CIHCb. Połączone warstwy organiczne przemyto 50 ml wodnego roztworu chlorku sodowego, osuszono (MgSO4), przesączono i odparowano do sucha, po czym pozostałość wysuszono w ciągu 16 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 2,6 g (91%) surowego związku (7).

188 359

Do roztworu 2,6 g (0,01 mola) surowego związku (7) w 60 ml THF wprowadzono, w atmosferze N2, 5,48 g (0,0124 mola) Pb(OAc)4 i 0,8- ml (0,010- mola) pirydyny. Utworzoną mieszaninę mieszano w ciągu 45 minut w atmosferze N2 i powstałe ciało stałe usunięto za pomocą odsączenia, po czym przemyto 60 ml octanu etylu. Połączone warstwy organiczne odparowano do sucha i otrzymaną pozostałość poddano oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (heksan-EtOAc, 2 : 1), w wyniku czego otrzymano 1,9 g (69,-4%) związku (8) w postaci bezbarwnego oleju.

'fi NMR (CDCl-) δ : 1,998, 2,11 (2 x s, -H, -OAc), -,9- - 4,-- (m, 2H, H-5), 4,4-, 4,48 (2 x d, J = -,7-, -,74 Hz, 2H, C+OBz), 5,46, 5,55 (2 xt,J = 4,18, 3,6- Hz, 1H, H-2), 6,42 (m, 1H, H-4), 7,--7,59, 8,00-8,15 (m, -H, 2H, -OBz).

[(+2⁵ -12,5- (c, 1,11, CHCl-).

Analiza elementarna.

Obliczono dla C13H14O6 : C 58,64; H 5,30.

Znaleziono : C 58,78; H 5^4.

Przykład 7. Wytwarzanie (-)-(2S,4S)-1-[2-(benzoilo)-1,3-dioksolan-4-ylo]cytozyny (9) i (+)-(2S,4R)-1-[2-(benzyloksy)-1,--dioksolan-4-ylo)cytozyny (10)

Mieszaninę złożoną z 1,24 g (7,52 mmola) N4-acetylocytozyny w 20 ml suchego dichlorometanu, 15 ml heksametylodisilazanu i katalitycznej ilości siarczanu amonowego, ogrzewano w ciągu 4 godzin w atmosferze azotu. Otrzymany tak przezroczysty roztwór oziębiono do temperatury pokojowej. Do tak utworzonej sililowanej acetylocytozyny dodano roztwór 1,0 g (-,76 mmola) związku (8) w 10 ml suchego dichlorometanu i 1,46 ml (7,55 mmola) TMSOTf. Otrzymaną mieszaninę mieszano w ciągu 6 godzin, po czym dodano 10 ml nasyconego roztworu NaHCO- i mieszaninę mieszano jeszcze w ciągu 15 minut, po czym przesączono przez warstwę Celite. Przesącz odparowano i stałą pozostałość rozpuszczono w EtOAc. Po przemyciu wodą i wodnym roztworem chlorku sodowego, osuszeniu, przesączeniu i odparowaniu, otrzymano produkt surowy. Produkt ten poddano oczyszczaniu na kolumnie krzemionki (5% CH-OH/CHCl-), w wyniku czego otrzymano 0,40 g (-0%) czystej mieszaniny α,β złożonej z (9) i (10) oraz 0,48 g (40%) mieszaniny α,β złożonej z (1-) i (14). Mieszaninę z (14) poddano ponownej acetylacji w celu wyodrębnienia i połączoną mieszaninę α,β wydzielono przy użyciu długiej kolumny krzemionki (-% CH-OH/CHCl-), w wyniku czego otrzymano 0,414 g (-0,7%) związku (9) w postaci piany i 0,481 g (-5,6%) związku (10) w postaci piany. Te produkty o konsystencji piany ucierano z CH-OH, w wyniku czego otrzymano ciała stałe o barwie białej.

Związek (9) : UV (CH-OH): X_max 298 nm;

Analiza elementarna: (C17H17N-O8) C, H, N.

Związek (10): UV (CH-OH): )m 298 nm.

Przykład 8. Wytwarzanie (-)-(2S,4S)-1-(2-hydroksymetylo-1,--dioksolan-4-ylo)cytozyny (11)

Roztwór 0,29 g (0,827) związku (9) w 50 ml CH-OH/NH- (nasycony w temperaturze 0°C) mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 10 godzin. Następnie rozpuszczalnik odparowano i surowy związek (11) poddano oczyszczaniu na preparatywnych płytkach pokrytych krzemionką (20% CH-OH/CHCl-), w wyniku czego otrzymano produkt o konsystencji oleju. Poddano go krystalizacji mieszaniny CH2O2 i heksanu, w wyniku czego otrzymano 0,1-6 g (77,7%) związku (11) w postaci ciała stałego o barwie białej.

UV : 278,0 nm (ε 11967) (pH 2), 270,0 nm (ε 774) (pH 7), 269,0 nm (s 8-79) (pH 11).

Analiza elementarna : (C8HnN-O4) C, H, N.

II. Kompozycje farmaceutyczne i ich zastosowanie w leczeniu

Ludzie, konie, króliki, bydło i inne zwierzęta, a w szczególności ssaki, cierpiące na choroby nowotworowe, a zwłaszcza na raka, można leczyć za pomocą podawania im, w skutecznej ilości, (-)-Oddc lub jej pochodnej, albo jej farmaceutycznie dozwolonej soli, ewentualnie w farmaceutycznie dozwolonym nośniku lub rozcieńczalniku, albo samej albo w kombinacji z innymi znanymi środkami przeciwrakowymi lub farmaceutycznymi. Tego rodzaju sposób leczenia można także zastosować w połączeniu z innymi typowymi rodzajami terapii raka, takimi jak napromienianie lub chirurgia.

188 359

Związek aktywny włączony jest do farmaceutycznie dozwolonego nośnika lub rozcieńczalnika w ilości wystarczającej do dostarczenia choremu leku w dawce terapeutycznie skutecznej z punktu widzenia przewidzianego wskazania, bez powodowania u poddawanego leczeniu pacjenta poważniejszych oddziaływań toksycznych. Korzystna dawka związku dla wszystkich stanów chorobowych wspomnianych w niniejszym opisie mieści się w zakresie od około 10 ng/kg do 300 mg/kg, korzystnie 0,1 do 100 mg/kg/dzień, a ogólniej w zakresie od 0,5 do około 25 mg/kg masy ciała biorcy/dzień. W przypadku stosowania miejscowego, typowe dawkowanie mieści się w zakresie od 0,01 do 3% wag/wag, z użyciem właściwego nośnika.

Związek dogodnie podaje się w dowolnej, stosownej postaci dawkowania, włączając w to (ale bez ograniczania się tylko do nich) postacie zawierające od 1 do 3000 mg, korzystnie 5 do 500 mg składnika aktywnego/postać dawki jednostkowej. Przy podawaniu doustnym, zazwyczaj dogodnym dawkowaniem jest dawkowanie mieszczące się w zakresie od 25 do 250 mg.

Korzystnie, składnik aktywny podaje się w taki sposób, aby uzyskać szczytowe stężenie składnika aktywnego w osoczu w zakresie około 0,00001-30 mM, korzystnie około 0,1-30 μΜ. Można to osiągnąć, na przykład, za pomocą dożylnego wstrzykiwania roztworu lub preparatu składnika aktywnego, ewentualnie w roztworze chlorku sodowego lub w ośrodku wodnym, albo przez podanie jednej większej dawki składnika aktywnego.

Stężenie składnika aktywnego w kompozycji leczniczej zależeć będzie od szybkości wchłaniania, rozprowadzania, inaktywacji i wydalania leku, jak również od innych czynników znanych fachowcom w tej dziedzinie wiedzy. Należy zauważyć, że wielkość dawkowania zmieniać się będzie także w zależności od ciężkości stanu, który ma ulec złagodzeniu. Dalej, należy rozumieć, że dla każdego poszczególnego chorego konkretny reżym dawkowania należy ustalać w miarę upływu czasu, odpowiednio do indywidualnego zapotrzebowania na lek i zgodnie z fachową oceną osoby podającej lek lub nadzorującej podawanie kompozycji. Także należy rozumieć, że wskazane w niniejszym opisie zakresy stężeń podano jedynie przykładowo i bez zamiaru ograniczania zakresu i praktyki stosowania zastrzeganej kompozycji. Składnik aktywny można podać jednorazowo, albo może on być podzielony na pewną ilość mniejszych dawek, przeznaczonych do podawania w zmiennych przedziałach czasowych.

Kompozycje do podawania drogą doustną będą, na ogół, zawierać obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą one być zamknięte w kapsułkach żelatynowych, albo sprasowane w tabletki. W celu podawania drogą doustną w przeznaczeniu leczniczym, składnik aktywny, albo jego pochodną stanowiącą jego prolek, można włączyć do zarobek i stosować w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. Do kompozycji, jako jej części składowe, można włączyć farmaceutycznie zgodne środki wiążące i/lub substancje adiuwantowe.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki itp. mogą zawierać jakikolwiek z podanych poniżej składników lub związków o podobnym charakterze. Mogą to być, na przykład, takie substancje jak : środek wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, żywica tragakantowa lub żelatyna; zaróbka, taka jak skrobia lub laktoza; środek dyspergujący, taki jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana; środek smarujący, taki jak stearynian magnezowy lub Sterotes; środek poślizgowy, taki jak krzemionka koloidalna; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna; albo środek aromatyzujący, taki jak mięta pieprzowa, salicylan metylu lub aromat pomarańczowy. W przypadku, gdy postacią dawki jednostkowej jest kapsułka, może ona zawierać, oprócz substancji powyżej wymienionych, także ciekły nośnik, taki jak tłuszcz ciekły. Poza tym, postacie dawek jednostkowych mogą zawierać rozmaite inne substancje, modyfikujące fizyczną postać dawki jednostkowej, na przykład materiały powłokowe (cukier, szelak lub środki dojelitowe).

Związek aktywny, lub jego farmaceutycznie dozwoloną sól, można stosować jako składnik eliksiru, zawiesiny, syropu; opłatka, gumy do żucia itp. Syrop może zawierać, oprócz składników aktywnych, także sacharozę jako środek słodzący oraz pewne środki konserwujące, barwniki i środki barwiące oraz środki aromatyzujące.

Związek aktywny lub jego dozwolone sole można także zmieszać z innymi substancjami aktywnymi, które nie szkodzą pożądanemu działaniu, albo z substancjami uzupełniającymi pożądane działanie, takimi jak inne środki przeciwrakowe, antybiotyki, środki przeciwgrzybicze, środki przeciwzapalne lub związki o działaniu przeciwwirusowym.

188 359

Roztwory lub zawiesiny stosowane do podawania pozajelitowego, śródskórnego, podskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki : jałowy rozcieńczalnik taki, jak woda do wstrzykiwań, roztwór chlorku sodowego, oleje roślinne nielotne, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol propylenowy lub inne rozpuszczalniki syntetyczne; środki antybakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparabeny; przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy; środki chelatujące, takie jak kwas etyłenodiaminotetraoctowy; bufory·', takie jak octany, cytryniany lub fosforany oraz środki przeznaczone do korygowania toniczności, takie jak chlorek sodowy lub glukoza. Preparat do podawania pozajelitowego może być zamknięty w ampułkach, strzykawkach do jednorazowego użytku lub fiolkach do wielokrotnego dawkowania, wykonanych ze szkła lub z tworzywa sztucznego.

W przypadku podawania dożylnego, korzystnymi nośnikami są : fizjologiczny roztwór chlorku sodowego lub sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).

Zgodnie z jednym z wykonań wynalazku, składniki aktywne formułuje się z nośnikami, które będą zabezpieczać związek przed szybkim pozbywaniem się go przez organizm, z otrzymaniem takich postaci leku, jak preparat do spowolnionego uwalniania, włącznie z implantacyjnymi i mikrokapsułkowymi systemami dostarczania leku. Użyć tu można ulegających biodegradacji i biokompatybilnych polimerów, takich jak kopolimer etylenu z octanem winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania tego rodzaju preparatów są oczywiste dla fachowców w tej dziedzinie techniki.

Farmaceutycznie dozwolonymi nośnikami mogą być także zawiesiny liposomalne. Sporządzać je można z wykorzystaniem sposobów znanych fachowcom w tej dziedzinie techniki, na przykład tak, jak to opisano w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4522811 (włączonym w całości do niniejszego opisu jako odnośnik). I tak, na przykład, preparaty liposomalne można wytworzyć za pomocą rozpuszczenia odpowiedniego lipidu (odpowiednich lipidów) (takich jak stearoilofosfoatydyloetanoloamina, stearoilofosfatydylocholina, arachaidoiłofosfatydylocholina i cholesterol) w rozpuszczalniku organicznym, który następnie odparowuje się, z pozostawieniem cienkiej błonki wysuszonego lipidu na powierzchni pojemnika. Następnie do pojemnika wprowadza się wodny roztwór składnika aktywnego, po czym pojemnik miesza się ręcznie w celu uwolnienia substancji lipidowej ze ścian pojemnika i rozproszenia skupień lipidowych, w wyniku czego dochodzi do utworzenia zawiesiny liposomalnej.

III. Aktywność biologiczna

Dla oceny przeciwrakowej aktywności związków chemicznych przeprowadza się i akceptuje przez fachowców w tej dziedzinie wiedzy wiele rozmaitych testów biologicznych. Każdą z tych metod można wykorzystać do oceny aktywności związków ujawnionych w niniejszym opisie.

Jedną ze zwykle stosowanych metod oceny aktywności jest metoda stosowana w National Cancer Insitute („NCI”), obejmująca wykorzystanie zestawu testów dla linii komórek rakowych. Testy te umożliwiają in vitro ocenę aktywności przeciwrakowej poszczególnych związków i zapewniają uzyskanie danych umożliwiających prognozowanie stosowalności badanych związków in vivo. Inne testy obejmują ocenę in vivo działania związku na komórki nowotworów ludzkich lub mysich wszczepionych myszom nagim lub przeszczepionych na te myszy. (-)-OddC przebadano pod względem aktywności przeciwrakowej in vivo względem linii komórek białaczki P388 i linii komórek raka okrężnicy C38. W przykładach 9 i 10 podano szczegóły eksperymentów i uzyskane w tych testach wyniki.

Przykład 9. In vivo działanie (-)-OddC na komórki białaczki P388

Myszom BDF1, otrzymanym z Southern Research Institute, Alabama, wszczepiono 10⁶ komórek białaczki P388. (-)-OddC podawano dootrzewnowo (i.p.) dwa razy dziennie w ciągu 5 dni. Podawanie rozpoczynano po upływie jednego dnia od wszczepienia komórek nowotworu. Z zastosowaniem tego protokołu wykazano, że ilość wynosząca 75 mg/kg/dawkę jest dla myszy toksyczna.

Figura 3 i tabela 1 przedstawiają wyniki tych badań. Na fig. 3, znak (·) uwidacznia dane dla kontroli (zwierzęta nie potraktowane lekiem), (—Δ--) uwidacznia współczynnik przeżycia dla zwierząt, którym podawano (-)-OddC w dawce wynoszącej 25 mg/kg b.i.d. dwa razy dziennie, a znak (o) uwidacznia współczynnik przeżycia myszy, którym podawano (-)-OddC

188 359 raz dziennie w dawce wynoszącej 50 mg/kg b.i.d. Na sześć myszy potraktowanych (-)-OddC w ilości 25 mg/kg/dawkę, jedna okazała się osobnikiem o długim czasie przeżycia, a długość życia pozostałych pięciu myszy wydłużyła się o 103%.

Tabela 1

Grupa	Dawkowanie	Droga podawania	Średni czas przeżycia (dni)	ILSb (%)	Śmierć Czas (dzień)	Wyleezeniac/Ogółem
Kontrola	--	--	13,3	--	11,12,13 13,13,18	0/6
-OddC	25x2x5	i.p.	27	103	18,20,22 25,33,45	1/6

Inokulum : 10⁶ komórek P388 zaszczepiono i.p. każdej myszy w dniu 0. a : Lek podawano dwa razy dziennie w dniach 1-5. b : % zwiększenia długości życia powyżej kontroli, c : Myszy przeżywające czas o długości równej 45 dniom lub dłuższy.

Przykład 10 . In vivo działanie (-)-OddC na komórki nowotworu okrężnicy 38

Myszom BDF1 wszczepiono podskórnie (s.c.) komórki nowotworu okrężnicy 38. (-)-OddC podawano myszom dwa razy dziennie w ciągu 5 dni, w ilości wynoszącej 25 mg/kg/dawkę. Jak to pokazano na fig. 2, wzrost komórek nowotworu okrężnicy uległ zahamowaniu. Na fig. 2 znak (·) uwidacznia dane dla zwierząt kontrolnych, a znak (A) uwidacznia dane dla myszy potraktowanych (-)-OddC.

Przykład 11. Badanie (-)-OddC in vitro

Oceny (-)-OddC dokonano zgodnie z programem skriningu raka NCI. W teście mierzy się hamowanie rozmaitych linii komórek raka, przy różnych stężeniach (-)-OddC. Wyniki uzyskane dla poddanych badaniu linii komórek przedstawiono w tabeli 2.

W tabeli 2 pokazano także wartości stężeń, przy których obserwowano GI50 i TGI w badanych liniach. GI50, TGI i LC50 są to wartości przedstawiające stężenia, przy których PG (procent zahamowania wzrostu), zdefiniowany poniżej, wynosi, odpowiednio, +50, 0 i -50. Wartości te oznaczono za pomocą interpolacji z krzywych dawka-odpowiedź, wyprowadzonych dla każdej linii komórek i naniesionych na wykres jako funkcja PG względem logio stężenia (-)-OddC.

PG jest miarą działania (-)-OddC na linię komórek. Wartość tę obliczono według jednego z dwóch następujących wyrażeń :

Jeżeli (średnia ODtest - średnia ODzero) > 0, wtedy

PG = 100 x (średnia ODtest - średnia OD_Ute>)/(średnia OD_Cfl średnia ODtzero).

Jeżeli (średnia ODtest - średnia OD_tZe_ro) < 0, wtedy

PG - 100 x (średnia ODtest - średnia ODtzero)/(średnia ODtzero)

Przy czym :

Średnia ODtzero = średnia z pomiarów gęstości optycznej dla barwy pochodzącej od SRB, tuż przed ekspozycją komórek na działanie badanego związku.

Średnia ODtest = średnia z pomiarów gęstości optycznej dla barwy pochodzącej od SRB, po upływie 48 godzin ekspozycji komórek na działanie badanego związku.

Średnia ODctrl = średnia z pomiarów gęstości optycznej dla barwy pochodzącej od SRB, po upływie 48 godzin bez ekspozycji komórek na działanie badanego związku.

W tabeli 2 dwie pierwsze kolumny podają wykaz chorób (na przykład białaczkę) i linię komórek (na przykład CCRF-CEM), poddanych działaniu (-)-OddC. Kolumna 3 pokazuje logio, przy którym wystąpiło GI50. Kolumna 4 pokazuje logio, przy którym wystąpiło TGI. Jeżeli tych parametrów odpowiedzi nie można było otrzymać za pomocą interpolacji, wartość podana dla każdego parametru odpowiedzi stanowi najwyższe badane stężenie i jest poprzedzona znakiem „>”. I tak, na przykład, jeżeli wszystkie wartości PG dla wszystkich stężeń

188 359 (-)-OddC zaaplikowanej poszczególnym liniom komórek przekraczają +50, wtedy parametru tego nie można uzyskać na drodze interpolacji.

Tabela 2

Choroba	Linia komórek	Log,oGI5O	LoguTGI
1	2	3	4
Białaczka	CCRF-CEM	-6,64	>-4,00
	RL-60 (TB)	-6,28	>-4,00
	K-562	-4,59	>-400
	BSOLT-4	-6,66	-4,39
	RPMI-2,26	-4,03	>-400
	SR	-5,95	>-400
N iedrobnokomórkowy rak płuca	A549/ATCC	-6,01	>4,00
	BKVX	>-400	> -4,00
	HOP-62	-6,23	-4,71
	NCI-H23	-4,92	>-4,00
	NCI-H322M	>-4,00	>-4,00
	NCI-H460	-4,32	> -4,00
	NCI-H522	-6,06	>-4,00
Rak okrężnicy	COL0205	-4,03	>400
	HCT-116	-5,23	>-4,00
	HCT-15	-5,39	> -4,00
	HT29	> -4,00	>-4,00
	K2112	> -4,00	>-4,00
Rak układu nerwowego ośrodkowego	SP-268	-5,18	>4,00
	SP-295	-6,24	>4,00
	SNB-19	-5,71	>-4,00
	U251	-4,91	>-4,00
Czerniak	LOX D6VI	-6,39	> -4,00
	MALME-3M	-4,51	>-4,00
	M14	-6,27	-5,07
	SK-MEL-28	-4,31	> -4,00
	SKK-MEL-5	-4,91	>400
	UACC-257	-4,00	> -4,00
	UACC-62	-5,53	>400

188 359 cd. tabeli 2

1	2	3	4
Rak jajnika	OROV1	-4,03	> -4,00
	OVCAR-3	-4,00	> -4,00
	OVCAR-4	> -4,00	> -4,00
	OVCAR-5	-4,01	>4,00
	OVCAR-8	-5,82	> -4,00
	SK-OV-3	-5,35	> -4,00
Rak nerki	785-4	-5,36	>-4,00
	ACHN	-6,46	>-4,00
	CAKI-1	-6,65	-4,87
	RXF-393	-6,17	>-4,00
	SN12C	-6,27	> -4,00
	TK-30	>-4,00	> -4,00
	UO-31	-5,60	>-4,00
Rak prostaty	PC-3	-6,29	>-4,00
	DU-145	-6,97	> -4,00
Rak sutka	MCF7	-5,95	> -4,00
	MCF7/ADR-RES	-4,97	> -4,00
	MDA-MB-231/ATTC	>-4,00	> -4,00
	HS578T	> -4,00	> -4,00
	MDA-MB-435	-4,62	> -4,00
	MDA-N	-4,33	>-4,00
	BT-549	-4,59	> -4,00
	T-47D	> -4,00	> -4,00

Figura 4 stanowi wykres pokazujący względną selektywność oddziaływania (-)-OddC na konkretną linię komórek. Słupki wystające w prawo oznaczają wrażliwość linii komórek na (-)-OddC większą od średniej wrażliwości wszystkich poddanych badaniu linii komórek. Ponieważ skala słupkowa jest skalą logarytmiczną, słupek o 2 jednostkach na prawo nasuwa wniosek, że związek osiągnął GI50 dla linii komórek przy stężeniu 1/100 średniego stężenia wymaganego dla wszystkich linii komórek, a więc linia komórek jest niezwykle wrażliwa na działanie (-)-OddC. Odpowiednio, słupki wystające w lewo implikują wrażliwość mniejszą od średniej. Te linie komórek można łatwo ustalić na podstawie danych zamieszczonych w tabeli 2, ponieważ wartość logio stężenia jest poprzedzona znakiem „>”·

Jak widać z fig. 4, co najmniej jedna linia komórek z każdego typu przebadanych komórek rakowych wykazywała wrażliwość na (-)-OddC. Pewne linie komórek raka prostaty, linie komórek białaczki i linie komórek raka okrężnicy przejawiają nadzwyczajną wrażliwość na działanie (-)-OddC.

Przykład 12. Porównanie (-)-OddC z AraC

Jak to omówiono w punkcie „Tło wynalazku”, arabinozyd cytozyny (określany także jako Cytarabina, araC i Cytosar) jest analogiem nukleozydowym deoksycytydyny stosowanym

188 359 w leczeniu białaczki szpikowej ostrej. Przejawia on także aktywność w stosunku do ostrej białaczki limfocytowej i, w mniejszym zakresie, użyteczny jest w przypadku białaczki szpikowej przewlekłej i chłoniaka złośliwego nieziamiczego. Podstawowym działaniem araC jest hamowanie syntezy jądrowego DNA. Było rzeczą interesującą porównanie toksycznego działania (-)-OddC i AraC na komórki nowotworowe.

Komórki znajdujące się w logarytmicznej fazie wzrostu wysiano z gęstością 5000 komórek/ml/dołek na 24-dołkowe płytki. Leki dodawano do komórek w rozmaitych dawkach i hodowle utrzymywano przez okres trzech generacji. Na końcu tego okresu wykonano próby z użyciem błękitu metylenowego i/lub komórki policzono bezpośrednio. Błękit metylenowy jest barwnikiem, który wiąże się w sposób stechiometryczny z białkami żywotnych komórek i dlatego może być wykorzystany do pośredniej kwantyfikacji liczby komórek (Finlay, 1984). Wartości IC50 ustalono za pomocą interpolacji danych na wykresie. Każda pokazana wartość stanowi średnią ± odchylenie standardowe z pięciu eksperymentów, przy czym dane dla każdego punktu uzyskano z dwóch powtórzeń.

Stwierdzono, że u wszystkich poddanych badaniu linii komórek nowotworowych (-)-OddC okazała się bardziej toksyczna niż AraC. (-)-OddC była znacząco bardziej skuteczna niż AraC w przypadku linii komórek raka nosowo-gardłowego KB oraz w przypadku dwu linii raka prostaty, a mianowicie DU-145 i PC-3. Komórki HepG2 wywodzą się od raka wątrobowokomórkowego, a linia 2.2.15 pochodzi od komórek HepG2, które transfekowano kopią genomu wirusa zapalenia wątroby B. Komórki CEM pochodzą od ostrej białaczki limfoblastycznej. (-)-OddU, będąca związkiem powstającym na drodze deaminacji (-)-OddC, okazała się nietoksyczna w stosunku do wszystkich poddanych badaniu linii. Badania enzymatyczne wykazują, że, inaczej niż w przypadku AraC (której skuteczność kliniczna jest w znacznym stopniu pomniejszona przez jej podatność na deaminację), (-)-OddC nie stanowi substratu dla deaminazy.

Ustalono, że (-)-OddC może być fosforylowana in vivo do nukleotydów mono-, di- i trifosforanowych. Wydaje się, że (-)-OddC przejawia swą toksyczność komórkową w formie ufosforylowanej, ponieważ komórki, które są niezdolne do fosforylowania tego związku, są o wiele mniej wrażliwe na jego działanie. Pierwszym enzymem odpowiedzialnym za fosforylowanie omawianego związku jest ludzka kinaza deoksycytydynowa. Wyniki przeprowadzonych in vitro badań enzymatycznych wykazują, że (-)-OddC można fosforylować przy udziale tego enzymu.

Inaczej niż ma to miejsce w przypadku AraC, (-)-OddC nie ulega deaminacji w wyniku działania deaminazy cytydynowej. Obecność deaminazy cytydynowej w tkance guza litego może stanowić kluczowy, zaangażowany tu czynnik odpowiedzialny za brak aktywności AraC w odniesieniu do guzów litych. Może to częściowo wyjaśniać, dlaczego (-)-OddC jest aktywna w stosunku do komórek HepG2 u myszy nagich, podczas gdy araC nie posiada tej aktywności. Tłumaczy to także, dlaczego (-)-OddC ma spektrum aktywności przeciwnowotworowej odmienne od spektrum aktywności wykazywanej przez araC. Poza tym, obecność deaminazy cytydynowej w przewodzie żołądkowo-jelitowym może odgrywać ważną rolę w tym, że araC nie może być przyjmowana drogą doustną.

Biochemiczne badania (-)-OddC In vitro cytotoksyczność AraC, (-)-OddC i (-)-OddU

Linia komórek	AraC	ID50 (μΜ) (-)-OddC	(-)-OddU
KB	0,152±0,010	0,048±0,021	>30
DU-145	0,170±0,035	0,024±0,020	>30
PC-3	0,200±0,078	0,056±0,039	>30
HepG2	0,125±0,013	0,110±0,050	>30
2.2.15	0,145±0,007	0,110±0,011	>30
CEM	0,030±0,010	0,025±0,030	>30

188 359

Przykład 12. Badania in vivo

Myszy nagie NCr, w wieku 3-6 tygodni (Taconic Immunodeficient Mice and Rats) zaszczepiono s.c., z każdego boku, 2x10° komórek HepG2 lub DU-145 i nowotworom pozwolono rozwijać się. Leczenie rozpoczęto wtedy, gdy nowotwory osiągnęły masę 100 - 250 mg, według oznaczenia przy użyciu suwmiarki z przeliczeniem według wzoru :

Masa nowotworu (mg) = długość (mm) x szerokość (mm) 2.

Leki podawano we wskazanych dawkach w dniach 0, 1, 2, 3 i 4, a wielkość nowotworu mierzono co kilka dni. Krzywe wzrostu nowotworu wykreślano sposobem opisanym przez Bella i in. [Cancer (phila.), 36, 2437 - 2440 (1975)] i pokazano je na fig. fig. 5(a) i 5 (b).

Toksyczność oceniano na podstawie zmian masy ciała.

Aczkolwiek in vitro toksyczność AraC była podobna do toksyczności (L)-OddC, to jednak AraC okazała się nieskuteczna w omawianym modelu zwierzęcym. Analiza enzymatyczna ekstraktu z nowotworu wykazała, że nie wynika to ze zwiększonej aktywności dCD lub zmniejszonej aktywności dCK, ale może wynikać z ekstensywnego metabolizmu w wątrobie, w której poziom dCD jest wysoki. Inaczej niż w przypadku AraC, (L)-OddC jest skuteczna w stosunku do obu heteroprzeszczepów, tak HepG2 jak i DU-145. Zabicie komórek netto (log 10) obliczone dla nowotworów Hep2 wynosiło 0,67 i 0,87 przy podawaniu, odpowiednio, dootrzewnowym i doustnym. Rozmiary nowotworu DU-145 stawały się coraz to mniejsze, przy czym połowa z nich ulegała całkowitej regresj i do dnia 15. Nowotwory zaczynały pojawiać się powtórnie po upływie około 25 dni od ostatniego podania leku, ale wzrost ich zatrzymywał się znów po dniu 47. W dniu 60 zwierzęta uśmiercono i pobrano z nich nowotwory. Wykazywały one morfologię nekrotyczną, z bardzo małą ilością komórek zdolnych do eliminowania błękitu trypanowego. Oprócz tego, w tkance tej nie można było wykryć żadnej aktywności enzymatycznej. Zastosowane dawki AraC i (L)-OddC okazały się równie toksyczne, jak to wykazano przez zmniejszenie się masy ciała zwierząt. Wstępne eksperymenty przeprowadzone nad toksycznością sugerują, że dawka wynosząca 25 mg/kg, przy podawaniu dwa razy dziennie, może stanowić maksimum tolerowanego dawkowania dla pięciu kolejnych dni leczenia. Korzystny może okazać się protokół przewidujący stosowanie leku na zasadzie podawania go z przerwami.

Przedstawione w niniejszym opisie dane uzyskane w eksperymentach przeprowadzonych in vitro i in vivo wykazują, że (L)-OddC odznacza się wybitną aktywnością przeciwrakową i w wielu przypadkach może pod tym względem przewyższać dostępne obecnie analogi deoksycytydyny. Nie tylko jest ona pierwszym analogiem L-nukleozydowym kiedykolwiek przedstawionym jako odznaczający się aktywnością przeciwrakową, ale także jest ona pierwszym prawdziwym terminatorem łańcucha zdolnym do zahamowania wzrostu nowotworu. Aczkolwiek jej nienaturalna stereochemia nie chroni (L)-OddC przed zaktywowaniem przez enzymy metaboliczne albo przed włączeniem do DNA, to jednak może ona stanowić czynnik zabezpieczający ten związek przed rozłożeniem przez dCD. (L)-OddC jest unikalny także pod tym względem, że przejawia aktywność wobec guzów litych, zazwyczaj nie reagujących na terapię prowadzoną z zastosowaniem analoga nukleozydu. Lek gemcytabina (2',2'-difluorodeoksycytydyna), poddawana obecnie ocenie klinicznej z punktu widzenia leczenia guzów litych, zawsze jest podatna na inaktywację przez dCD (16). Z uwagi na to, że podwyższenie poziomu dCD oparte jest na mechanizmie nadającym komórkom oporność na analogi dCyd, takie jak AraC (17), (L)-OddC może okazać się użyteczna w leczeniu tych chorych, którzy nie reagują na działanie tych leków,

IV. Wykorzystanie (-)-OddC w oligonukleotydach i w technologii antysensownej

Technologia antysensowna dotyczy, ogólnie, modulowania ekspresji genów przez przeprowadzenie procesu, w którym syntetyczny oligonukleotyd jest hybrydyzowany do sekwencji komplementarnego kwasu nukleinowego w celu zahamowania transkrypcji lub replikacji (w przypadku, gdy docelową sekwencję stanowi DNA), zahamowania translacji (w przypadku, gdy docelową sekwencję stanowi RNA) lub zahamowania przebiegu procesu (w przypadku, gdy docelową sekwencję stanowi pre-RNA). Dzięki zastosowaniu tej techniki można modulować aktywność komórkową w szerokim zakresie różnych oddziaływań. Prostym przykładem jest w tym przypadku hamowanie biosyntezy białka przez antysensowny oligonukleotyd

188 359 związany z mRNA. W innym wykonaniu, syntetyczny oligonukleotyd poddaje się hybrydyzacji do specyficznej sekwencji genowej w dwuniciowym DNA, tworząc trójniciowy kompleks (trypleks), który hamuje ekspresję tej sekwencji genowej. Antysensownych oligonukleotydów można także użyć do zaktywowania ekspresji genów, albo pośrednio, przez stłumienie biosyntezy naturalnego represora, albo bezpośrednio, przez ograniczenie terminacji transkrypcji. Leczeniem antysensownymi oligonukleotydami (AOT) można posłużyć się w celu zahamowania ekspresji genów patogennych, włączając w to te geny, co do których sądzi się, że uczestniczą w niekontrolowanym wzroście komórek nowotworu dobrotliwego lub złośliwego, albo które zaangażowane są w replikacji wirusów, włącznie z HTV i HBV.

Stabilność oligonukleotydów względem nukleaz jest ważnym czynnikiem, jeśli chodzi o zastosowanie ich in vivo. Wiadomo, że aktywność 3'-egzonukleazy odpowiedzialna jest za większość procesów rozkładu niemodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych w surowicy [V.V. Vlassov i L.A. Yakubov w : Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS, 243 - 266, Wiłey-Liss, Inc., New York (1991); Nucleic Acid Res., 21,145 (1993)].

Zastąpienie nukleotydu na końcu 3' oligonukleotydu przez (-)-OddC, lub jej pochodną, może ustabilizować oligonukleotyd jeśli chodzi o rozkład powodowany działaniem 3'-egzonukleazy. Alternatywnie, albo oprócz tego, wewnętrzny nukleotyd można zastąpić przez (-)-OddC, lub jej pochodną, w celu powstrzymania rozkładu oligonukleotydu przez endonukleazy.

Dysponując ujawnieniem przedstawionym w niniejszym opisie, fachowiec w tej dziedzinie techniki będzie mógł zastosować (-)-OddC lub jej pochodną do stabilizowania wielu różnych oligonukleotydów pod względem odporności na rozkład powodowany działaniem tak egzonukleaz jak i endonukleaz, włączając nukleozydy stosowane w leczeniu antysensownymi oligonukleotydami. Uważa się, że wszystkie te sposoby realizacji znajdują się w zakresie niniejszego wynalazku. W przykładzie 13 podano jedno z przykładowych (ale nie ograniczających się tylko do niego) zastosowań (-)-OddC do powstrzymywania aktywności 3'-egzonukleazy.

Przykład 13. Oporność na działanie 3'-egzonukleazy nadana przez (-)-OddC

Aktywność ludzkiej egzonukłeazy cytosolowej z ludzkich komórek H9 (komórki białaczki limfocytowej typu T) określono w teście sekwencj ono wania w żelu. Mówiąc krótko, wytworzono 3'-zakończony substrat przy użyciu startera DNA o długości 20 lub 23 zasad, o następującej sekwencji:

3'-CAATTTTGAATTTCCTTAACTGCC-5'

1

Startery znakowano na końcu 5' przy użyciu [Y-³²P]ATP, przyłączano do matryc komplementarnego RNA i zakończano na końcu 3' dTTP (20-mer), dCTP (23-mer) łub (-)-OddCTP (23-mer) w warunkach reakcji typu „standing start” katalizowanej przez HTV-1 RT. W tych warunkach, 20-mer kończył się dTMP (A), a 23-mer kończył się dCMP (B) lub (-)-OddCMP (C). Te substraty jednoniciowego DNA zastosowano do badania ich wrażliwości na działanie endonukleazy cytoplazmatycznej. Reakcje przeprowadzano w mieszaninie reakcyjnej o objętości 10 μΐ, zawierającej 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM MgCB, 1 mM ditiotreitolu, 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,18 pCi/ml 3'-zakończonego substratu i 2 μΐ egzonukłeazy (0,03 jednostki). Mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze 37°C przez czas wskazany i reakcje kończono przez wprowadzenia 4 μΐ 98 % formamidu, 10 mM EDTA i 0,025% błękitu bromofenolowego. Próbki denaturowano w temperaturze 100°C w ciągu 5 minut, a następnie szybko schładzano na lodzie. Substancje nieprzereagowane, jak również produkty reakcji, rozdzielono na żelach sekwencjonujących 15% poliakryloamid/mocznik i wizualizowano metodą autoradiografii. Oligonukleotyd zawierający na końcu 3' (-)-OddC okazał się co najmniej 5 razy bardziej odporny na działanie 3'-egzonukłeazy niż inne oligonukleotydy. T-39533/AJ.

188 359

NH

O

WZÓR 5

188 359 _R,.o/>'^/OR'· WZÓR 6

WZÓR 7

188 359 |ϊ φ.

. oh ά.<£

ΙΟ ίΟ ο

(Ο ου αθ

3ο

73ζ ζο «1 tsK

Ζ

Ο

«ο

Ν_

Λ u

<

Su.

o-i-tr

188 359

Schemat 1 (2): Synteza (-) - OddC

188 359

FIGURA 1

STĘŻENIE (μΜ)

Zahamowanie wzrostu jako % kontroli

188 359

Procent początkowej masy nowotworu

Dni leczenia 1-5

188 359

Procent osobników przeżywających

Dni

188 359

FIGURA 4

Wykaz/Linia komórek oho

COUUCBM

HLUOfTRJ

MOLT-4

Rpwnni

SR

Białaczka

AMJ/ATCC

EKVX

H0M2

NCWOJ

NCKOOM

NCMHOO

ΝΟΜΗ»

Niedrobnokomórkowy rak płuca

COLO 333

HCMIl _ , . . .

mct-h Rak okrężnicy

ΗΓ»

KMW

sr-jei

SF-39S

SNB-19 wsi

LOXIMVJ

MALME-3M

MM

SK-MEUtt

SK-MEL-J

UACC437

UAOC4I κκσνι ovouw

OVCAK-4

CTVCAX-i

OVCAR.|

SKX>V.J

Rak ośrodkowego układu nerwowego

Czerniak

Rak jajnika

7*44

AON

CAD-J *»»»3 Rak nerki

JNIIC tk.io υο-ji

pc-s

DU-MJ

Rak prostaty

MCT7 mcfwdr-res

MDA-MB-Ul/ATCC HJJ7IT , ₄.

mda-mb-435 Rak sutka

MDA-N

ΒΤ-Μ»

TUTO

>1 ♦1 0

J_1_1 J

-3 -3 -4

188 359

FIGURA 5B

% początkowej masy nowotworu

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie pochodnych cytozyny w postaci enancjomeru p-L związku o wzorze 7, w którym R¹ i R² oznaczają podstawniki wybrane z grupy obejmującej wodór i grupę acylową, wolnego co najmniej w 95% od odpowiedniego enancjomeru β-D albo jego farmaceutycznie dozwolonej soli, ewentualnie w farmaceutycznie dozwolonym nośniku, do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u gospodarzy zwierzęcych, w tym u ludzi.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się związek o wzorze 7, w którym R¹ i R2 oznaczają wodór.

   -. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się związek o wzorze 7, w którym grupa acylowa stanowi grupę o wzorze -C(0)R, w którym R oznacza grupę C1-C5-alkilową, grupę fenylową lub grupę benzylową.
3. 4. Zastosowanie związku o wzorze -, w którym R oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej H i F, a R1 i R² oznaczają podstawniki wybrane z grupy obejmującej wodór, grupę acylową, ugrupowanie monofosforanu, ugrupowanie difosforanu i ugrupowanie trifosforanu, albo jego farmaceutycznie dozwolonej soli, ewentualnie w farmaceutycznie dozwolonym nośniku do wytwarzania leku do leczenia raka.
4. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że stosuje się związek o wzorze -, w którym R oznacza fluor, a R1 i R2 oznaczają wodór.
5. 6. Zastosowanie (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroksymetylo-l.--dioksolan-4-ylo)cytozYny i jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli albo jej enancjomeru (+) lub mieszaniny racemicznej oraz jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli do wytwarzania leku do leczenia nowotworu, włącznie z nowotworem o charakterze raka.
6. 7. Zastosowanie (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroksymetylo-l,--dioksolan-4-\io)cytozyny i jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli albo jej enancjomeru (+) lub mieszaniny racemicznej i jej farmaceutycznie dozwolonych pochodnych i soli do wytwarzania leku do leczenia nieprawidłowej lub niepożądanej proliferacji komórek.