JP3863559B2 - 乳頭腫ウィルスワクチン - Google Patents

Description

発明の分野
乳頭腫ウィルスのＬ１およびＬ２タンパク質をコードする組換え発現ベクター、その組換えタンパク質を製造する方法およびその組換えタンパク質を用いる方法を提供する。
発明の背景
乳頭腫ウィルスの感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビおよびウシを含む種々の動物において起こる。乳頭腫ウィルスは上皮細胞に感染し、通常、感染部位において良性の上皮または線維性上皮腫瘍を誘発する。乳頭腫ウィルスは種特異性感染因子であり、ヒト乳頭腫ウィルスはヒト以外の動物に感染することができない。
乳頭腫ウィルスは、感染する宿主により異なる群に分類することができる。ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）は、さらに、ＤＮＡ配列相同性により６０を越えるタイプに分類される（総説に関しては、パピロ−マバイラシズ・アンド・ヒューマン・キャンサー（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ）、Ｈ．フィスター（Ｈ．Ｐｆｉｓｔｅｒ）編、シー・アールー・シー・プレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、１９９０を参照されたい。）。乳頭腫ウィルスタイプは、ある一つのタイプの乳頭腫ウィルスへの感染に対する中和免疫が別のタイプの乳頭腫ウィルスに対する免疫を賦与しないことにおいてタイプ特異的免疫原のようである。
ヒトにおいて、異なるＨＰＶタイプは異なる病気を引き起こす。ＨＰＶタイプ１，２，３，４，７，１０および２６〜２９は、免疫無防備状態および通常の両方の個体において良性のいぼを発生させる。ＨＰＶタイプ５，８，９，１２，１４，１５，１７，１９〜２５，３６および４６〜５０は、免疫無防備状態個体において扁平病巣を生じさせる。ＨＰＶタイプ６，１１，３４，３９，４１〜４４および５１〜５５は、性器または呼吸器の粘膜の非悪性コンジロームを引き起こす。ＨＰＶタイプ１６および１８は、性器粘膜の上皮異形成を引き起し、頸、膣、外陰および肛門管のその場の侵襲性癌の大部分と関係している。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、全てのコンジローム（性器いぼ）および喉頭乳頭腫の９０％以上に対する原因因子である。ＨＰＶタイプ６の最も多いサブタイプはＨＰＶ６ａである。
動物における免疫学的研究は、乳頭腫ウィルス抗原に対する中和抗体の産生が同種のウィルスによる感染を防止することを示している。有効な乳頭腫ウィルスワクチンの開発は、生体外における乳頭腫ウィルスの培養の難しさのために遅れてきた。有効なＨＰＶワクチンの開発は、特に、適当な動物モデルの不存在により遅れてきた。
抗体による乳頭腫ウィルスの中和は、タイプ特異的であり、ウィルスの表面における立体配座エピトープに依存するようである。
乳頭腫ウィルスは、小さく（５０〜６０ｎｍ）、外被がなく、正十二面体のＤＮＡウィルスであり、８つ以下の初期遺伝子および２つの後期遺伝子をコードしている。ウィルスゲノムの読取り枠（ＯＲＦ）は、Ｅ１〜Ｅ７およびＬ１およびＬ２と称され、ここで「Ｅ」は初期、および「Ｌ」は後期を意味する。Ｌ１およびＬ２は、ウィルスカプシドタンパクをコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウィルス複製および細胞トランスフォーメーションのような機能と関係する。
Ｌ１タンパクは、主要なカプシドタンパクであり、５５〜６０ｋＤａの分子量を有する。Ｌ２タンパクは、少ない方のカプシドタンパクであり、５５〜６０ｋＤａの予想分子量を有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で決められる７５〜１００ｋＤａの見掛分子量を有する。免疫学のデータは、Ｌ２タンパクの大部分がＬ１タンパクの内側にあることを示している。Ｌ２タンパクは、異なる乳頭腫ウィルス間で、特にＣ末端における１０個の塩基性アミノ酸間で高度に保存されている。Ｌ１ＯＲＦは異なる乳頭腫ウィルス間に高度に保存されている。
Ｌ１およびＬ２遺伝子は、動物における乳頭腫ウィルス感染の予防および治療のためのワクチンの製造に用いられてきた。ゾウ（Ｚｈｏｕ）らは（１９９１年および１９９２年）、ＨＰＶタイプ１６Ｌ１およびＬ２遺伝子をワクシニアウィルスベクター中にクローニングし、ＣＶ−１哺乳動物細胞に組換えベクターを感染させてウィルス状粒子（ＶＬＰ）を作製した。
バクテリア由来の組換えウシ乳頭腫ウィルスＬ１およびＬ２が作製されてきた。組換えバクテリアタンパクに対する中和血清は天然のウィルスと低い水準で交差反応するが、それは多分、天然タンパクとバクテリア由来タンパクとの立体構造の相違によるものであろう。
昆虫ＳＦ９細胞を感染させＬ１およびＬ２タンパクを製造するために、ＨＰＶ６Ｌ１、ＨＰＶ１１Ｌ１、ＨＰＶ１６Ｌ１、ＨＰＶ１８Ｌ１、ＨＰＶ３１Ｌ１またはＨＰＶ１６Ｌ２のＯＲＦを発現する組換えバキュロウィルスが使用されてきた。ウエスタンブロット分析は、バキュロウィルス由来のＬ１およびＬ２タンパクが、ＨＰＶ１６に対する抗体と反応することを示した。
このバキュロウィルス由来Ｌ１はＶＬＰを形成する。
カーター（Ｃａｒｔｅｒ）らは（１９９１年）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換え菌株によるＨＰＶ１６Ｌ１およびＨＰＶ１６Ｌ２タンパクの製造を示した。カーターらは、また、ＨＰＶ６ｂＬ１およびＬ２タンパクの製造を示した。ＨＰＶ６ｂＬ１タンパクは、全長Ｌ１タンパクではない。この組換えタンパクは、分泌生成物のみならず細胞内生成物として生成された。この組換えＬ１およびＬ２タンパクは、天然タンパクに類似の分子量を有するものであった。このタンパクが細胞内に発現される場合、変性剤の不存在下に細胞を溶解するとタンパクの大部分は不溶性であることがわかった。この不溶性はタンパクの精製を容易にし得るが、該タンパクの天然エピトープ分析を妨げ得る。
酵母から分泌された組換えタンパクは、酵母由来の炭水化物を含むことが示された。これらのＮ−結合オリゴ糖の存在は、天然エピトープをマスクするかもしれない。また、分泌された組換えタンパクは、分泌リーダー配列の保持のような他の改変を含むかもしれない。
組換え酵母の培養により任意の種およびタイプの乳頭腫ウィルスタンパクを多量に製造する方法を開発することが有用であろう。天然タンパクの立体構造のような天然タンパクの免疫賦与特性を有する乳頭腫ウィルスタンパクを多量に製造することも有用であろう。
本発明は、天然乳頭腫ウィルスタンパクの免疫賦与特性を有する組換え乳頭腫ウィルスタンパクの製造、ならびに、その製造および使用方法に関するものである。本発明は、乳頭腫ウィルス感染のための予防用および場合によっては治療用のワクチンの製造に関する。本発明の組換えタンパクは、ウィルス状粒子を製造することができる。これらのＶＬＰは、免疫原性であり動物モデルにおいていぼの形成を防止する。本発明は、モデル系としてワタオウサギ（ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌ ｒａｂｂｉｔ）乳頭腫ウィルス（ＣＲＰＶ）およびＨＰＶタイプ６（サブタイプ６ａ）を用いる。
発明の概要
乳頭腫ウィルスのＬ１およびＬ２タンパクをコードする組換え発現ベクター、その組換えタンパクを製造する方法、およびその組換えタンパクを使用する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、乳頭腫ウィルスＬ１および／またはＬ２カプシドタンパクの発現に用いられる両方向酵母発現ベクターを示す。
図２は、酵母におけるＨＰＶ６ａＬ１の発現を示す（イムノブロット）。
図３は、酵母におけるＨＰＶ６ａＬ２の発現を示す。
酵母において発現されたＨＰＶ６ａＬ２のイムノブロット；レーン１，分子量マーカー；レーン２，陽性対照としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて発現されたｔｒｐＥ−Ｌ２融合タンパク；レーン４，陰性対照として酵母において発現されたＨＰＶ６ａＬ１；レーン５，酵母において発現されたＨＰＶ６ａＬ２（実験の詳細は本文を参照されたい）。
図４は、酵母において発現されたＨＰＶ６ａＬ１ ＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
図５は、酵母において発現されたＨＰＶ６ａＬ１／Ｌ２ ＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
図６は、酵母において発現されたＣＲＰＶ Ｌ１、Ｌ２およびＬ１＋Ｌ２タンパクのイムノブロットである。パネル（Ａ）：抗−ＣＲＰＶ Ｌ１抗血清との反応性により測定されるＣＲＰＶ Ｌ１の発現。パネル（Ｂ）：抗−ＣＲＰＶ Ｌ２抗血清との反応性により測定されるＣＲＰＶ Ｌ２の発現。レーン１，ｋＤａで示す分子量マーカー（アマーシャム・レインボウ（登録商標）マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｒａｉｎｂｏｗ^TM Ｍａｒｋｅｒｓ）、１４３００〜２０００００ダルトン）；レーン２，ＣＲＰＶ Ｌ１発現ベクターを含むＢＪ５４６２；レーン３，ＣＲＰＶ Ｌ２発現ベクターを含む菌株１５６９；レーン４および５，ＣＲＰＶ Ｌ１およびＣＲＰＶ Ｌ２の発現のための二つのプラスミドで同時形質転換した菌株１５６９の二つの単離物；レーン６〜８，ＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパクを同時発現するための単一ベクターを含む菌株１５６９の三つの単離物；レーン９および１０，ＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパクを同時発現するための単一ベクターを含むＢＪ５４６２の二つの単離物。Ｌ１およびＬ２の移動位置を、適当なパネルの右軸にマークしてある。
図７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株１５５８の構築の概略を示す。
図８は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株１５６９の構築の概略を示す。
図９は、精製手順における主な工程の概略を示す。
図１０は、菌株のリストである。
図１１は、酵母から精製されたＨＰＶ１６Ｌ１＋Ｌ２の一組のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。最終的に精製されたＶＬＰに加え、精製プロセスにおける中間工程からの保持物が含まれる。表は、各レーンにおけるサンプルの同定に関するものである。Ｌ１およびＬ２タンパクに対する抗血清をプローブとしたウエスタンブロットならびにコロイド状クマシー染色ゲルが含まれる。
図１２は、別のワタオウサギ乳頭腫ウィルスＬ１精製プロセスの概略である。
図１３および１４は、精製されたＶＬＰのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析結果である。
発明の詳細な説明
乳頭腫ウィルス（ＰＶ）感染の予防，特徴付け，検出および治療のための方法、組成物およびプロセスが提供される。この方法は、酵母内における組換えＬ１または組換えＬ２または組換えＬ１およびＬ２タンパクの製造に基づく。組換えタンパクは、天然ＰＶの立体配座の中和エピトープを模倣することができる。組換えＬ１またはＬ１およびＬ２タンパクは、ウィルス状粒子（ＶＬＰ）を形成することもできる。本発明の組成物は、限定されないが、Ｌ１またはＬ２またはＬ１およびＬ２タンパクをコードする組換えＤＮＡ分子、単独または他の組換えタンパクと組み合わせた組換えタンパク、少なくとも一つの組換えタンパクからなるＶＬＰ、組換えタンパクのフラグメント、組換えタンパクを含む医薬組成物、組換えタンパクを含むワクチン組成物、組換えタンパクまたはＶＬＰに対する抗体、少なくとも一つの組換えタンパクを含む免疫原性組成物、および組換えＤＮＡ分子または組換えタンパクを含む診断用キット（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔｓ）を含む。本発明のプロセスは、組換えＤＮＡ分子による適当な酵母宿主細胞の形質転換、組換えタンパクをコードするＤＮＡの発現を許容する条件下における形質転換酵母の培養、および組換えタンパクの精製、を包含する組換えタンパクの製造方法を含む。本発明のプロセスはまた、組換えタンパク、組換えタンパク組成物またはＶＬＰを、限定されないがヒトを含む動物に投与することも含む。適当な宿主細胞は、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母菌株を含む。
乳頭腫ウィルス感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビおよびウシを含む種々の動物において起こる。乳頭腫ウィルスは上皮細胞に感染し、通常、感染部位において良性の上皮または線維性上皮腫瘍を誘発する。
乳頭腫ウィルスは、感染する宿主に基づき異なる群に分類することができる。ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）は、さらに、ＤＮＡ配列相同性により６０を越えるタイプに分類される（総説については、パピロマバイラシズ・アンド・ヒューマン・キャンサー（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ）、Ｈ．フィスター（Ｈ．Ｐｆｉｓｔｅｒ）編、シー・アールー・シー・プレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、１９９０を参照されたい。）。乳頭腫ウィルスタイプは、ある一つのタイプの乳頭腫ウィルスへの感染に対する中和免疫が別のタイプの乳頭腫ウィルスに対する免疫を賦与しないことにおいてタイプ特異的免疫原であると考えられる。
ヒトにおいて、異なるＨＰＶタイプは異なる病気を引き起こす。ＨＰＶタイプ１，２，３，４，７，１０および２６〜２９は、免疫無防備状態および通常の両方の個体において良性のいぼを発生させる。ＨＰＶタイプ５，８，９，１２，１４，１５，１７，１９〜２５，３６および４６〜５０は、免疫無防備状態個体において扁平病巣を生じさせる。ＨＰＶタイプ６，１１，３４，３９，４１〜４４および５１〜５５は、生殖器または呼吸器の粘膜の非悪性コンジロームを引き起こす。ＨＰＶタイプ１６および１８は、生殖管の上皮異形成を引き起し、頸、膣、外陰および肛門管のその場の侵襲性癌の大部分と関係している。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、生殖器いぼおよび喉頭乳頭腫の大部分を引き起こす。
動物における免疫学的研究は、乳頭腫ウィルスカプシドタンパクに対する中和抗体の産生が、同種のウィルスによる感染を防止することを示している。有効な乳頭腫ウィルスワクチンの開発は、生体外における乳頭腫ウィルスの培養の難しさのために遅れてきた。有効なＨＰＶワクチンの開発は、特に、適当な動物モデルの不存在により遅れてきた。
抗体による乳頭腫ウィルスの中和は、タイプ特異的であり、ウィルスの表面における立体配座エピトープに依存するようである。
乳頭腫ウィルスは、小さく（５０〜６０ｎｍ）、外被がなく、正十二面体のＤＮＡウィルスであり、８つ以下の初期遺伝子および２つの後期遺伝子をコードしている。ウィルスゲノムの読取り枠（ＯＲＦ）は、Ｅ１〜Ｅ７およびＬ１およびＬ２と称され、ここで「Ｅ」は初期、および「Ｌ」は後期を意味する。Ｌ１およびＬ２は、ウィルスカプシドタンパクをコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウィルス複製およびトランスフォーメーションのような機能と関係する。
Ｌ１タンパクは、主要なカプシドタンパクであり、５５〜６０ｋＤａの分子量を有する。Ｌ２タンパクは、少ない方のカプシドタンパクであり、５５〜６０ｋＤａの予想分子量を有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で決められる７５〜１００ｋＤａの見掛分子量を有する。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換え菌株によるＨＰＶ１６Ｌ１、ＨＰＶ１６Ｌ２およびＨＰＶタイプ６Ｌ１タンパクの製造が報告されている。組換え酵母の培養により任意の種およびタイプの乳頭腫ウィルスタンパクを多量に製造する方法を開発することが有用であろう。天然タンパクの立体構造のような天然タンパクの免疫賦与特性を有する乳頭腫ウィルスタンパクを多量に製造することも有用であろう。
本発明は、天然乳頭腫ウィルスタンパクの免疫賦与特性を有する組換え乳頭腫ウィルスタンパクの製造、ならびに、その製造および使用方法に関するものである。本発明は、特に、乳頭腫ウィルス感染のための予防用ワクチンの製造に関する。本発明は、モデル系としてのヒト乳頭腫ウィルスタイプ６（ＨＰＶタイプ６またはＨＰＶ６）およびワタオウサギ乳頭腫ウィルス（ＣＲＰＶ）により例示される。例示は本発明の範囲を限定せず、本発明は他のタイプおよびサブタイプの乳頭腫ウィルス（ＰＶ）を含み、限定されないがＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６およびＨＰＶタイプ１８ならびにＨＰＶサブタイプ６ａおよびＨＰＶサブタイプ６ｂを含む。
タンパクまたはＶＬＰを含む医薬上有用な組成物は、医薬上許容できる担体の混合によるような既知の方法に従って調製することができる。そのような担体および調製法の例は、レミントン・ファーマスーティカル・サイエンシィズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に見いだすことができる。効果的な投与に適当な医薬上許容できる組成物を調製するために、そのような組成物は有効量のタンパクまたはＶＬＰを含む。そのような組成物は、２以上のタイプのＨＰＶから誘導されるタンパクまたはＶＬＰを含み得る。
本発明の治療または診断組成物は、ＰＶ感染の治療または診断に充分な量で個体に投与される。有効量は、個体の症状、体重、性別および年齢のような種々の因子により変化し得る。他の因子は投与方式を含む。通常、この組成物は約１μｇ〜約２５０μｇの範囲の量で投与される。
薬剤組成物は、皮下、局所、経口、粘膜および筋肉内のような種々の経路により個体に提供され得る。
本発明のワクチンは、宿主内における中和抗体の形成を誘発するのに必要な抗原決定基を含む組換えタンパクまたはＶＬＰを含んでなる。そのようなワクチンは、また、臨床感染の危険性なく投与するのに充分に安全であり、毒性の副作用を有さず、効果的な経路により投与することができ、安定であり、ワクチン担体と適合性がある。
このワクチンは、経口、非経口、皮下、粘膜または筋肉内のような種々の経路により投与することができる。投与される量は、個体の症状、性別、体重および年齢；投与経路；およびワクチンのＰＶタイプにより変化し得る。このワクチンは、カプセル、懸濁液、エリキシルまたは液状溶液のような投与形状で用いることができる。ワクチンは、免疫学的に許容できる担体を用いて調製することができる。
ワクチンは、治療的に有効な量、すなわち免疫学的保護反応を生じさせるのに充分な量で投与される。治療的に有効な量はＰＶのタイプによって変化し得る。ワクチンは一回でまたは複数回に分けて投与することができる。
本発明の方法は、ＰＶ感染を予防するための亜ウィルスワクチンの調製を可能にする。その方法を用いて、一価または多価ＰＶワクチンを製造することができる。例えば、組換えＨＰＶ１６Ｌ１タンパクまたはＬ２タンパクまたはＬ１およびＬ２タンパクを調製することにより一価ＨＰＶタイプ１６ワクチンを製造することができる。また、Ｌ１またはＬ２またはＬ１およびＬ２タンパクあるいは異なるＨＰＶタイプ由来ＶＬＰを混合することにより多価ＨＰＶワクチンを調製することができる。
本発明の組換えタンパクおよびＶＬＰは、免疫原性組成物の調製において用いることができる。そのような組成物は、適当な宿主に導入した場合、宿主内において免疫学的反応を誘発し得る。
組換えタンパクおよびＶＬＰは、抗体を発生させるために用いることができる。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナルとモノクローナル抗体の両方、ならびにそれらのフラグメント、例えば抗原またはハプテンを結合できるＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントを含む。
本発明の組換えタンパク、ＶＬＰおよび抗体を用いてＨＰＶスクリーニングおよびＨＰＶ感染の血清型分類を行うことができる。組換えタンパク、ＶＬＰおよび抗体は、それ自体が、ＨＰＶの検出および血清型分類に適当なキットを形成する。そのようなキットは、少なくとも一つの容器を密閉的に保持するのに適当な区画化された担体を含む。担体は、さらに、種々のＨＰＶタイプの検出に適当な組換えＨＰＶタンパクまたはＶＬＰあるいは抗ＨＰＶ抗体のような試薬を含む。担体はまた、標識された抗原または酵素基質等のような検出のための手段も含み得る。
本発明の組換えタンパクおよびＶＬＰは分子量および分子サイズマーカーとしても有用である。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供されるが、これらの実施例の事項に発明を限定するものではない。
実施例１
酵母菌株Ｕ９の調製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株２１５０−２−３（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２−０４，ａｄｅ１，ｃｉｒ°）をレランド・ハートウェル（Ｌｅｌａｎｄ Ｈａｒｔｗｅｌｌ）博士（ワシントン州シアトルのワシント大学在）から得た。菌株２１５０−２−３の細胞を、ＹＥＨＤ培地（カーティー（Ｃａｒｔｙ）らのＪ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．第２巻（１９８７年）１１７〜１２１頁）５ｍＬ中で３０℃において一晩増殖させた。細胞を、滅菌蒸留水で３回洗い、滅菌蒸留水２ｍＬに再懸濁させ、ｕｒａ３突然変異体を選択するために六つの５−フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）プレートの各々に細胞懸濁液０．１ｍＬを置いた（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・マニュアル・フォア・イースト・ジェネティクス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。プレートを３０℃で培養した。培地は、蒸留水２５０ｍＬ当たり、３．５ｇのディフコ・イースト・ナイトロジェン・ベース（Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）（アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない）、０．５ｇの５−フルオロ−オロト酸、２５ｍｇのウラシル、および１０．０ｇのブドウ糖を含んでいた。
培地を０．２μｍの薄膜を通して濾過することにより滅菌し、次に、５０℃に維持された４％バクト−アガー（Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ）（ディフコ社（Ｄｉｆｃｏ）製）２５０ｍＬ、アデニンの１．２ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍＬおよびＬ−ロイシン溶液（１８０ｍｇ／５０ｍＬ）５ｍＬと混合した。得られた培地をペトリ皿当たり２０ｍＬとして分けた。
５日間培養後、多くのコロニーが出現した。最初のＦＯＡプレートから新しいＦＯＡプレートにコロニーを引き移すことにより単一のコロニーを単離し、それを次に３０℃で培養した。第２の組のＦＯＡプレートからの多くのコロニーについて、ＹＥＨＤプレートおよびウラシルマイナスプレートの両方にレプリカ−プレーティングするを置くことにより、ｕｒａ３突然変異が存在するか試験した。所望の結果は、ＹＥＨＤ上で良好に成長しウラシルマイナス培地において成長しないことであった。これらの特性を示す一つの単離体が得られた。それを、後に使用するために−７０℃で凍結グリセロールストック（菌株＃３２５）として貯蔵した。
実施例２
酵母ＭＮＮ９遺伝子破壊のためのベクターの調製
酵母ＭＮＮ９遺伝子の破壊のためのベクターを調製するために、まず、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡからＭＮＮ９遺伝子をクローニングすることが必要であった。これは、標準的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）技術により行った。全長ＭＮＮ９コード配列のＰＣＲのための５’センスプライマーおよび３’アンチセンスプライマーを、酵母ＭＮＮ９遺伝子の公表された配列に基づき設計した（ツァイモジェネティクス（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）：ＥＰＯ特許出願第８８１１７８３４．７号，公開第０−３１４−０９６−Ａ２号）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位（アンダーライン付）を隣接して含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いた：センスプライマー：５’−ＣＴＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＣＴ ＴＧＴ ＡＴＣ Ｇ−３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＧＡ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ−３’（配列番号２）
ＭＮＮ９遺伝子の開始メチオニンコドンを太字で強調した。ＰＣＲは、鋳型としてのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＪＲＹ１８８由来のゲノムＤＮＡ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）製）および２５サイクルの増幅（９４℃で１分、３７℃で２分、７２℃で３分）を用いて行った。得られた１．２ｋｂｐＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲルで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化アルカリホスファターゼ処理ＰＵＣ１３（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）と結合した。得られたプラスミドをＰ１１８３と表した。
酵母ＵＲＡ３遺伝子でＭＮＮ９遺伝子を破壊するために、プラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３（ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩ１部位内にサブクローニングされたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＵＲＡ３遺伝子をコードする１．１ＫｂｐＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含む）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐＤＮＡフラグメントをゲルで精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化し、次にＰｍｌＩ消化プラスミドｐ１１８３（ＰｍｌＩＭＮＮ９コード配列の内部を切断する）で結合した。得られたプラスミドｐ１１９９は機能性ＵＲＡ３遺伝子によるＭＮＮ９遺伝子の破壊を含む。
実施例３
ＭＮＮ９遺伝子の破壊を含むＵ９由来菌株１３７２の構築
菌株Ｕ９（＃３２５）内におけるＭＮＮ９遺伝子の破壊のために、プラスミドｐ１１９９の３０μｇをＨｉｎｄＩＩＩで消化して線状ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３破壊カセットを形成した。菌株３２５の細胞を、スフェロプラスト法（ハイネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ＆５：１９２９〜１９３３）によりＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐ１１９９ＤＮＡで形質転換し、形質転換したものを、ウラシルを含まず１．０Ｍソルビトールを含む合成寒天培地で選択した。合成培地は、蒸留水１リッター当たり、２０ｇの寒天、６．７ｇの酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ酸、０．０４ｇのアデニン、０．０５ｇのＬ−チロシン、１８２ｇのソルビトール、２０ｇのグルコース、および１０ｍｌのロイシンマイナス溶液＃２を含んでいた。ロイシンマイナス溶液＃２は、蒸留水１リッター当たり、２ｇのＬ−アルギニン、１ｇのＬ−ヒスチジン、６ｇのＬ−ロイシン、６ｇのＬ−イソロイシン、４ｇのＬ−リシン、１ｇのＬ−メチオニン、６ｇのＬ−フェニルアラニン、６ｇのＬ−トレオニン、４ｇのＬ−トリプトファンを含む。
プレートを３０℃で５日間培養し、その時点で多くのコロニーが出現した。１０個のコロニーから染色体ＤＮＡを調製し、次にＥｃｏＲＩプラスＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＤＮＡ消化物を、次に、プローブとして、ＭＮＮ９遺伝子（プラスミドｐ１１９９から単離したもの）を有する１．２ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを用いて、サザンブロット（Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），１９８９）により評価した。単離物を同定（菌株＃１３７２）すると、サザンブロットにおける予想されたＤＮＡバンドシフトならびにＭＮＮ９突然変異種により典型的に示される極端な塊状性が示された。
実施例４
酵母ＨＩＳ３遺伝子の破壊のためのベクターの構築
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＩＳ３遺伝子がＵＲＡ３遺伝子により破壊される破壊カセットを構築するために、プラスミドＹＥｐ６（ストルール（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ）ら，１９７９，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７６：１０３５）をＢａｍＨＩで消化した。ＨＩＳ３遺伝子を有する１．７ｋｂｐＢａｍＨＩフラグメントをゲルで精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化し、予めＢａｍＨＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理しておいたｐＵＣ１８と結合した。得られたプラスミド（Ｐ１５０１またはｐＵＣ１８−ＨＩＳ３と表す。）をＮｈｅＩ（ＨＩＳ３コード配列に切断する）で消化し、ベクターフラグメントをゲルで精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化し、次に子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。ＵＲＡ３遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりプラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３から単離し、ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐフラグメントをゲルで精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化し、前記ｐＵＣ１８−ＨＩＳ３ ＮｈｅＩフラグメントと結合した。得られたプラスミド（ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３またはｐ１５０５と表す）は、酵母ＨＩＳ３遺伝子が機能性ＵＲＡ３遺伝子により破壊される破壊カセットを含む。
実施例５
ＨＩＳ３遺伝子による酵母ＰＲＢ１遺伝子の破裂のためのベクターの構築
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＲＢ１遺伝子を有するプラスミドＦＰ８ΔＨは、カーネギーメロン大学のＥ．ジョーンズ（Ｅ．Ｊｏｎｅｓ）博士により提供された（Ｃ．Ｍ．メーレ（Ｃ．Ｍ．Ｍｏｅｈｌｅ）ら，１９８７，ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１１５：２５５〜２６３）。それをＨｉｎｄＩＩＩプラスＸｈｏＩで消化し、ＰＲＢ１遺伝子を有する３．２ｋｂｐＤＮＡフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端平滑化した。プラスミドｐＵＣ１８をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端平滑化した。得られたベクターフラグメントを前記ＰＲＢ１遺伝子フラグメントと結合してプラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を生成した。ＨＩＳ３遺伝子を含むプラミドＹＥｐ６を、ＢａｍＨＩで消化した。機能性ＨＩＳ３遺伝子を有する１．７ｋｂｐＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端平滑化した。ｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を、ＰＲＢ１コード配列内で切断し、プロテアーゼＢ活性部位およびフランキング配列を除去するＥｃｏＲＶプラスＮｃｏＩで消化した。ｐＵＣ１８内のＰＲＢ１コード配列の残留５’および３’−部分を有する５．７ｋｂｐＥｃｏＲＶ−ＮｃｏＩフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端平滑化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、前述の末端平滑化ＨＩＳ３フラグメントと結合した。得られたプラスミド（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３と表す，株＃１２４５）は、前述の除去されたＰＲＢ１遺伝子の部分の代わりに機能性ＨＩＳ３遺伝子を含む。
実施例６
ＭＮＮ９およびＰＲＢ１遺伝子の両方の破壊を含むＵ９−関連酵母菌株の構築
ＭＮＮ９遺伝子の破壊を含むＵ９−関連菌株１３７２は実施例３に記載したものである。菌株１３７２のクローン単離物をＦＯＡプレートを通過させてｕｒａ３突然変異種を選択した。菌株１３７２の多くのｕｒａ３単離物を得、一つの単離物（菌株１２９３０−１９０−Ｓ１−１）を、次のＨＩＳ３遺伝子の破壊のために選択した。ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３遺伝子破壊ベクター（ｐ１５０５）をＸｂａＩプラスＥｃｏＲＩで消化して線状ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３破壊カセットを生成し、酢酸リチウム法（メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｘｚｙｍｏｌｏｇｙ），第１９４巻：２９０（１９９１））による菌株１２９３０−１９０−Ｓ１−１の形質転換に用いた。ウラシルを含まない合成寒天培地においてＵｒａ⁺形質転換体を選択し、同じ培地上でクローン単離物のために再び画線し、ウラシルまたはヒスチジンを含まない培地にレプリカ−プレティングし、ともにＵｒａ⁺およびＨｉｓ^-である単離物のスクリーニングを行った。一つの単離物（菌株１２９３０−２３０−１）を、つぎのＰＲＢ１遺伝子の破壊のために選択した。ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクター（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３，株＃１２４５）を、ＳａｃＩプラスＸｂａＩで消化して線状ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊カセットを生成し、酢酸リチウム法による菌株１２９３０−２３０−１の形質転換に用いた。Ｈｉｓ⁺形質転換体を、ヒスチジンを含まない寒天培地上で選択し、クローン単離物のために同じ培地上に再び画線した。得られた多くのＨｉｓ⁺単離物からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化し、次に０．８％アガロースゲル上で電気泳動させた。次に、以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲから調製されたＰＲＢ１遺伝子のために放射性標識６１７ｂｐプローブを用いてサザンブロット分析を行った。５’ＴＧＧ ＴＣＡ ＴＣＣ ＣＡＡ ＡＴＣ ＴＴＧ ＡＡＡ ３’（配列番号３）
５’ＣＡＣ ＣＧＴ ＡＧＴ ＧＴＴ ＴＧＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ３’（配列番号４）
プローブと２．４４ｋｂｐ ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３ ＤＮＡフラグメントとの予想されたハイブリッド形成を示す１１個の単離物を得た。これは、野性型ＰＲＢ１遺伝子の１．５９ｋｂｐフラグメントとプローブとのハイブリッド形成と対照的であった。所望のｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊を含むこれらの単離物の一つを、さらに用いるために選択し、菌株＃１５５８と表した。
実施例７
酵母ＰＥＰ４遺伝子の破壊のためのベクターの構築
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＥＰ４遺伝子を、以下の方法により酵母ゲノムライブラリーからクローニングした。酵母ゲノムライブラリーｐＬＳ１０１（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）およびフリーセン（Ｆｒｉｅｓｅｎ），１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第１５５巻：８〜１４頁）を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地５ｍＬ中で一晩増殖させた。この培地から、１０^-4および１０^-5希釈物を、ＬＢプラスアンピシリンプレート上に載せた。ニトロセルロースフィルターを用いてコロニープレートリフト（ｌｉｆｔ）を調製した。酵母ＰＥＰ４遺伝子のための６００ｂｐプローブを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｐＬＳ１０１酵母ライブラリーからの全プラスミドＤＮＡ、およびＰＥＰ４の公表されているＤＮＡ配列に基づき設計した以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより調製した（Ｃ．Ａ．ウルフォード（Ｃ．Ａ．Ｗｏｏｌｆｏｒｄ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，第６巻：２５００（１９８６））。
センスプライマー：５’−ＧＡＧ ＧＣＴ ＡＣＣ ＡＧＣ ＧＡＧ ＣＣＧ ＧＧＣ−３’（配列番号５）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＧＣＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ＴＴＣ−３’（配列番号６）
ＰＣＲは２５サイクルの増幅（９４℃で１分、３７℃で２分、７２℃で３分）により行った。ＰＣＲプローブをゲル生成し、放射性標識し、前記コロニーフィルターとハイブリッド形成した。幾つかのコロニーは、ＰＥＰ４プローブとのハイブリッド形成について陽性であり、単一コロニーのためにＬＢプラスアンピシリンプレート上に再画線した。単離物の幾つかからアルカリ−ＳＤＳ溶解（前記サムブルックら）によりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢａｍＨＩで消化した。予想された１４ｋｂｐベクターバンドおよび６．９ｋｂｐＰＥＰ４挿入バンドが観察された。ＥｃｏＲＩプラスＸｈｏＩを用いた二重消化の際に、予想されたＰＥＰ４の１．５ｋｂｐバンドが観察された。予想された結果を示す一つの単離物（菌株＃８６０）を、さらに使用するために選択した。菌株＃８６０からのプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、染色体ＰＥＰ４遺伝子を有する６．９ｋｂｐＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１３のＢａｍＨＩ部位内にサブクローニングしてプラスミドｐ８９０を形成した。次に、プラスミドｐ８９０をＮｃｏｌ（ＰＥＰ４コード配列内を切断する）で消化し、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端平滑化し、機能性ＵＲＡ３遺伝子（実施例２と同様に調製した）を有する１．１ｋｂｐ末端平滑化フラグメントと結合した。ＵＲＡ３遺伝子により破壊されたＰＥＰ４遺伝子を含む得られたプラスミドをｐＵＣ１３−ｐｅｐ４：：ＵＲＡ３（菌株＃９０６）と表す。
実施例８
ｐｒｂ１およびｐｅｐ４突然変異種の両方を含む菌株Ｕ９の誘導体である酵母菌株＃１５６９の構築
菌株Ｕ９内のＨＩＳ３遺伝子を破壊するために、破壊ベクターｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３をＥｃｏＲＩプラスＸｂａＩで消化し、次に、酢酸リチウム法により菌株Ｕ９を形質転換するために用いた。ウラシルを含まない寒天培地上でＵｒａ⁺形質転換体を選択し、クローン単離物のために同じ培地上に再画線した。得られたＵｒａ⁺単離物の多くを、ウラシルまたはヒスチジンを含まない寒天培地上にレプリカ−プレーティングし、Ｕｒａ⁺およびＨｉｓ^-の両方についてスクリーニングした。一つの単離物（菌株＃１５２４）を、次のＰＲＢ１遺伝子の破壊のために選択した。ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクターｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３をＳａｃＩプラスＸｂａＩで消化し、次に酢酸リチウム法により菌株＃１５２４を形質転換するために用いた。ヒスチジンを含まない寒天培地上でＨｉｓ⁺形質転換体を選択し、同じ培地上でクローン単離物のために再画線した。多くのＨｉｓ⁺単離物からゲノムＤＮＡを調製し、放射性標識ＰＲＢ１プローブを用いてサザンブロットハイブリダイゼーションにより評価した。ＨＩＳ３（すなわちｐｒｂ１：：ＨＩＳ３）によりＰＲＢ１遺伝子の所望の破壊を示す単離物の一つ（菌株＃１５３７）を、次のＰＥＰ４遺伝子の破壊のために選択した。ｕｒａ３単離物を得るために菌株＃１５３７をＦＯＡプレートを通過させ、一つの単離物（菌株＃１５４１）をさらなる使用のために選択した。
菌株＃１５４１内のＰＥＰ４遺伝子を破壊するために、ＰＥＰ４遺伝子破壊ベクターｐＵＣ１３−ｐｅｐ４：：ＵＲＡ３をＸｈｏＩで消化して線状ｐｅｐ４：：ＵＲＡ３破壊カセットを生じさせ、酢酸リチウム法による菌株＃１５４１の形式質転換に用いた。ウラシルマイナス寒天培地上でＵｒａ⁺形質転換体を選択し、同じ培地上でクローン単離物のために画線した。多くのＵｒａ⁺形質転換体からゲノムＤＮＡを調製し、ＰＥＰ４遺伝子のための放射性標識プローブを用いてサザンブロットにより評価した。ＵＲＡ３遺伝子によるＰＥＰ４遺伝子の所望の破壊を示す一つの単離物（菌株＃１５６９）を、さらに用いるために選択した。
実施例９
ＣＲＰＶ Ｌ１発現ベクターの構築
ベント（Ｖｅｎｔ）ポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）製）を用いて完全ＣＲＰＶウィルスゲノム（ピーター・ホーリー（Ｐｅｔｅｒ Ｈｏｗｌｅｙ）博士，ＮＣＩ）を含むプラスミドｐＬＡＩＩからＰＣＲによりＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子を増幅した；ここで３５サイクルの増幅（９４℃で１分間；５０℃で１分間；７２℃で２分間）および以下のフランキングＢｇ１ＩＩ部位（アンダーライン付）を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いた：
センスプライマー：５’−ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＴＴ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＴＣＴ ＡＣ−３’（配列番号７）
アンチセンスプライ、アー：５’−ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＡＡ ＧＴＡ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＴＧ ＣＧＴ ＴＴＡＧ−３’（配列番号８）
センスプライマーは、ＣＲＰＶ Ｌ１開始メチオニンコドン（太字で強調している）の直ぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．６ｋｂＬ１ＰＣＲ生成物を、Ｂｇ１ＩＩで消化し、ゲル精製し、ベクターｐＳＰ７２（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）のＢｇ１ＩＩ部位内にサブクローニングしてプラスミドｐＳＰ７２−ＣＲＰＶ−Ｌ１（Ｐ１２９３０−３１４−４−１）を形成した。
一つのサブクローンを完全に配列決定し、公表されているＣＲＰＶ Ｌ１配列と４つのヌクレオチドにおいて異なることが分かった。その変化はアミノ酸の変化にはならない。Ｌ１遺伝子をｐＳＰ７２−ＣＲＰＶ−Ｌ１からＢｇ１ＩＩフラグメントとして切り出し、ＹＥｐ５２（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら，エクスプ・マニピュレーション・オブ・ジーン・エクスプレション（Ｅｘｐ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ），１９８３，第８３巻：８１〜１１６頁）からのＧＡＬ１０プローターおよびＡＤＨ１転写ターミネーターをｐＣ１／１ベクターバックボーンに含む酵母発現ベクターｐＣ１／１−ＧＡＬ１０ｐ−ＡＤＨ１ｔにおいて、酵母ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの間に位置する単一のＢａｍＨＩ部位内にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐ１２９３０−３２３−６−１と表した。
実施例１０
ＣＲＰＶ Ｌ２発現ベクターの構築
プラスミドをＳａｌＩで消化し、７．９Ｋｂフラグメントをゲル精製し、それ自体で結合した後に、プラスミドｐＬＡＩＩからベントポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）製）を用いてＰＣＲによりＣＲＰＶ Ｌ２遺伝子を増幅した。３５サイクルの増幅（９０℃で１分間；５０℃で１分間；７２℃で２分間）およびフランキングＥｃｏＲＩ部位（アンダーライン付）を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：
センスプライマー：５’−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＴＴＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＧＡＡ ＡＡＣ−３’（配列番号９）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＣＧＴ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＡＣ ＴＧ−３’（配列番号１０）
センスプライマーは、ＣＲＰＶ Ｌ１開始メチオニンコドン（太字で強調している）の直ぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．５ｋｂＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、発散（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）酵母ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターを含む両方向プロモーターベクターｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐのＥｃｏＲＩ部位内にサブクローニングした。このベクターは、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの第１のコピーとの間に単一のＢａｍＨＩ部位、および、ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの第２のコピーとの間に位置するともに単一のＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ部位を含む。得られる発現カセットを１．４ｋｂのＳｐｈＩフラグメントに保有させた。ＧＡＬ１０プロモーターに隣接する所望のＫ２挿入体を含む一つのクローン（ｐ１２９３０−２９５−２−２）を完全に配列決定すると、公表されている配列から変化下している６個のヌクレオチドを含み、そのうち４個がアミノ酸の変化であることが示された。最初の鋳型ＤＮＡの配列分析により、変化がｐＬＡＩＩにも存在しＰＣＲによって導入されないことが確認された。Ｌ２遺伝子を含むｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐベクターをＳｐｈＩで切断し、ＡＤＨ１ｔ−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐ−Ｌ２−ＡＤＨ１ｔ発現カセットを有する２．９ｋｂフラグメントを、酵母シャトルベクターｐＣ１／１の大きなＳｐｈ１フラグメントと結合した。得られるプラスミドをｐ１２９３０−３２３−２−３（ｐＣ１／１−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐ−ＣＲＰＶ−Ｌ２）と表した。
実施例１１
酵母内におけるＣＲＰＶ Ｌ１およびＣＲＰＶ Ｌ２カプシドタンパクの発現
プラスミドｐ１２９３０−３２３−６−１およびｐ１２９３０−３２３−２−３（ｐＣ１／１−ＧＡＬ１０ｐ−ＣＲＰＶ／Ｌ１およびｐＣ１／１−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐ−ＣＲＰＶ／Ｌ２）を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株＃１５６９，ＢＪ５４６２［Ｅ．Ｗ．ジョーンズ（Ｅ．Ｗ．Ｊｏｎｅｓ），メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），第１９４巻，（１９９１）４２８〜４５３頁］およびＢＪ１９９５［ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），上記同書］を形質転換した。クローン単離物を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地において３０℃で４８〜７２時間成長させた。細胞を採取した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、トリトンＸ−１００を０．５％の最終濃度になるように添加し、得られる細胞溶解物を、イムノブロット分析によりＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２の発現について評価した。全細胞性タンパク４０μｇを含むサンプルを、減圧および変性条件下に１２％トリス−グリシンゲル（Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ｇｅｌｓ）（ノヴェックス社（Ｎｏｖｅｘ）製）上で電気泳動させ、ＰＶＤＦ膜（ノヴェックス社製）上にエレクトロブロットした。ポリクローナルウサギ抗−Ｌ１または抗−Ｌ２抗血清（ハーシー・メディカル・センター（Ｈｅｒｓｈｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）のジョン・クライダー（Ｊｏｈｎ Ｋｒｅｉｄｅｒ）博士から入手）を第１抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）製）に結合したタンパクＡを第２抗体をして使用して、ＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパクを検出した。化学ルミネセントＥＣＬ^TM検出キット（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（アマーシャム社製）を用いて薄膜を処理した。Ｌ１発現プラスミドを有する全てのサンプルにおいて５５〜６１ｋＤａ Ｌ１タンパクバンドが検出され、Ｌ２発現プラスミドを有する酵母クローンからの全てのサンプルにおいて〜９０ｋＤａ Ｌ２タンパクバンドが検出された。抗−Ｌ２抗血清と共にＬ１発現プラスミドを有するかまたはその逆の酵母クローンに由来するサンプルにおいてシグナルは検出されなかった。
実施例１２
Ａ．組換えＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクの精製
特記しない限り全ての工程は４℃で行った。−７０℃に貯蔵した細胞を融解し、等容量の「Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＬ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞を、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中を１０回通過させることにより溶解した。溶解物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。上澄みを、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍクッションの上にのせ、Ｌ１を１０００００×ｇで４時間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１／１０容のＬ１緩衝液中に再懸濁させ、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。ツイーン−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）を、最終濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）になるように上清に添加し、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１０００樹脂（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）の１７００ｍｌカラム（５ｃｍＩＤ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより室温で上清を分画した。このカラムのランニング緩衝液は、燐酸ナトリウム１０ｍＭ，ｐＨ７．２、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、０．０１％（ｖ／ｖ）ツイーン−８０であった。イムノドットブロットによる免疫反応性物質を含むフラクションを溜め、７６ｍｍの直径のＹＭ−１００平坦シート薄膜（１０００００ＭＷＣＯ）を有するアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）攪拌セルを用いて限外濾過により１／６の容量に濃縮した。生成物を、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）−ＧＶ０．２２μｍ薄膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製）を通して滅菌濾過した。精製したＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクを水酸化アルミニウムに１００μｇ／ｍｌの濃度で吸着させた。
Ｂ．組換えＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクの特徴付け
最終生成物の同一性をウエスタンブロットおよびＮ−末端配列分析により確認した。純度をクーマシーおよび銀染色を用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより、および２１５ｎｍで光学的に検出する溶液篩キャピラリー電気泳動（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｉｅｖｉｎｇ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＳＳＣＥ）により調べた。調製物は、ＳＳＣＥによれば７５％純度Ｌ１であった。
実施例１３
組換えＣＲＰＶ Ｌ２カプシドタンパクの精製
特記しない限り全ての工程は４℃で行った。−７０℃に貯蔵した細胞を融解し、等容量の「Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＬ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞を、マイクロフルイダイザー中を１０回通過させることにより溶解した。溶解物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。上澄みを、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍクッションの上にのせ、Ｌ２を１０００００×ｇで４時間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１／１０容のＬ１緩衝液中に再懸濁させた。再懸濁ペレットを、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。ツイーン−８０を、最終濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）になるように上清に添加し、セファクリルＳ−１０００樹脂（ファーマシア社製）の１７００ｍｌカラム（５ｃｍＩＤ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより室温で上清を分画した。このカラムのランニング緩衝液は、燐酸ナトリウム１０ｍＭ，ｐＨ７．２、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、０．０１％（ｖ／ｖ）ツイーン−８０であった。イムノドットブロットによる免疫反応性物質を含むフラクションを溜めた。溜めたフラクションを、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（銀）およびウエスタンブロットにより分析した。
実施例１４
Ａ．組換えＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクの精製−スキーム１
−７０℃に貯蔵した細胞を溶解し、等容量のブレーキング緩衝液（Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＬ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞を、マイクロフルイダイザー中を１０回通過させることにより溶解した。溶解物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。上澄みを、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍクッションの上にのせ、Ｌ１を１０００００×ｇで４時間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１／１０容のＬ１緩衝液中に再懸濁させた。再懸濁ペレットを、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。ツイーン−８０を、最終濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）になるように上清に添加し、セファクリルＳ−１０００樹脂（ファーマシア社製）の１７００ｍｌカラム（５ｃｍＩＤ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより室温で上清を分画した。このカラムのランニング緩衝液は、燐酸ナトリウム１０ｍＭ，ｐＨ７．２、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、０．０１％ツイーン−８０であった。イムノドットブロットアッセイによる免疫反応性物質を含むフラクションを溜め、７６ｍｍの直径のＹＭ−１００平坦シート薄膜（１０００００ＭＷＣＯ）を有するアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）攪拌セルを用いて限外濾過により１／６の容量に濃縮した。生成物を、ミレックス−ＧＶ０．２２μｍ薄膜（ミリポア社製）を通して滅菌濾過した。
Ｂ．組換えＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクの特徴付け
最終生成物の同一性をウエスタンブロットおよびＮ−末端配列分析により確認した。純度をクーマシーおよび銀染色を用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより、および２１５ｎｍで光学的に検出する溶液篩キャピラリー電気泳動（ＳＳＣＥ）により調べた。Ｌ１は、ＳＳＣＥによれば７５％純度であった。電子顕微鏡法は、５０〜５５ｎｍの直径範囲のＶＬＰが存在することを示した。Ｃ．分析用サイズ排除ＨＰＬＣ
ＶＬＰについて調べるために、サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーにより寸法に従って分離した。２００マイクロリッターの注入ループを備えるＩＳＳ１００自動注入機を有するパーキン−エルマー・シリーズ・４１０・バイオポンプ・ＨＰＬＣ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４１０ Ｂｉｏｐｕｍｐ ＨＰＬＣ）を用いてクロマトグラフィーを行った。カラムは、ＴＳＫ−ゲル Ｇ５０００ＰＷ，７．５×６００ｍｍ（ペンシルバニア州モントゴメリービル在ＴＯＳＯＨＡＡＳ製）であった。カラムからのタンパクの溶出をモニターするために、パーキン−エルマー・ＬＣ−２３５・ダイオード・アレイ・デテクター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＣ−２３５ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて２８０ｎｍでの光学検出を行った。移動相は、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中０．５ＭＮａＣｌであった。流速は０．５ｍＬ／分であり、１ミリリッターのフラクションを集めた。シグマ社（Ｓｉｇｍａ）からのタンパク標準物および組換えＢ型肝炎表面抗原（ペンシルバニア州ウエストポイント在メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）製リコンビヴァックス（Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ））を用いてカラム検定を行った。溶出中に収集されたフラクション中の抗原の検出は、イムノドットブロットアッセイにより行った。
Ｄ．イムノドットブロットアッセイ
各フラクションの１０ミリリットルサンプルを、予め湿潤され湿ったブロット紙の上に置かれたＰＶＤＦ薄膜（マサチューセッツ州ベッドフォード在ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）製イモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ））の一片に塗布した。サンプルを薄膜にしみ込ませ、薄膜をブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．１５ＭのＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド，および０．０１Ｍ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２に溶解された脱脂粉乳５％（ｗ／ｖ））中に入れ、室温で穏やかに攪拌しながら少なくとも３時間培養した。ブロッキング溶液を傾瀉し、第１抗体溶液と置き換えた。
使用した第１抗体は、検出すべき抗原により変化する。
ＣＲＰＶ Ｌ１を、ウサギ抗−ＣＲＰＶ血清「遅反応」（メイン州ケンバンク在バイオデザイン・インターナショナル社（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）製）で調べた。ＣＲＰＶ Ｌ２を、ウサギ抗−ＣＲＰＶ Ｌ２血清で調べた。ＨＰＶ６ａＬ１を、モノクローナル抗体ＭＡＢ８３７（カリフォルニア州テメキュラ在ケミコン・インターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）製）で調べた。ＨＰＶ６ａＬ２を、マウス抗−ＨＰＶ６ａＬ２−ｔｒｐＥ融合体血清で調べた。
免疫複合体の視覚化を、アルカリホルファターゼに結合した第２抗体および色原体基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて標準的方法により行った。
Ｅ．溶液篩キャピラリー電気泳動（ＳＳＣＥ）
ＣＲＰＶ ＶＬＰ（〜０．２ミリグラム／ミリリッター）のサンプルを、１％２−メルカプトエタノールおよび１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で１００℃で１５分間加熱した。サンプルを、参照マーカーであるメリト酸と共に電気動力学的（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ）にシリカ溶融キャピラリー（４２ｃｍ（検出部分２２ｃｍ）×０．０５ｍｍＩ．Ｄ．，１０ルーメン容量の０．１Ｎ ＮａＯＨ、水およびプロソート（ＰｒｏＳｏｒｔ）篩剤（カリフォルニア州フォスターシティー在アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）で予め平衡させている）に添加した。アプライド・バイオシステムズ・モデル・２７０Ａ−ＨＴ ＣＥ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ２７０Ａ−ＨＴ ＣＥ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、分離電圧３００ボルト／ｃｍを印加した。サンプルの溶出を、２１５ｎｍでの吸収によりモニターし、ネルソン・ターボクロム（Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ）３ ソフトウェアを用いて集めた。
Ｆ．組換えＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクからのワクチンの調製
精製ＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクを、１００μｇ／ｍｌの濃度でＡｌ（ＯＨ）₃に吸着させた。
実施例１５
酵母由来ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰのワクチン接種によるＣＲＰＶにより引き起こされる乳頭腫発症に対する保護
５匹のニュージーランド白ウサギを、陰性対照としての、水酸化アルミニウムに吸着させた組換えＢ型肝炎表面抗原（純度９９％）１００ｍｇまたは明ばん（ａｌｕｍ）に吸着させたＬ１ ＶＬＰ（純度７５％、実施例１７を参照）１３５ｍｇを筋肉内に投与して免疫化した。動物は８週間の間に２回以上の追加抗原刺激を受けてから、最後の追加抗原刺激から１０日後にＣＲＰＶでチャレンジした。免疫化の前、各追加抗原刺激、チャレンジの前に血清を採取し、Ｌ１−ＶＬＰ特異性ＥＬＩＳＡにより分析した。間接的ＥＬＩＳＡ検定を用いて、酵母発現ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰへの血清抗体反応を測定した。ＥＬＩＳＡ中に用いられる抗原は、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）らにより実質的に記載（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻：３１５１〜３１５６頁，１９９０；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第７５巻：２２７１〜２２７６頁（１９９４））されている組換えバキュロウィルスを用いて昆虫細胞において発現されるＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰである。第２抗体としてヤギ抗−ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼを用い、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いた（キールケゴール・アンド・ペリー・ラブス社（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）。吸収は４０５ｎｍで測定した。力価は最終点希釈（１：１００で出発して血清を３倍希釈した）により決め、Ｌ１−特異性吸収が、ウサギ前免疫血清の平均吸収読取値プラス２の標準偏差を越えると陽性であると考えた。正確な力価は、ソフトマックス・プログラム（ＳＯＦＴｍａｘ ｐｒｏｇｒａｍ）バージョン２．３（カリフォルニア州メンロパーク在モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）製）を用いてこれらのデータから算出した。
抗Ｌ１ ＶＬＰ抗体力価は、最初の免疫化から４週間後に現われ、更なる追加抗原刺激毎に増大した。対照動物は陰性であった。ＣＲＰＶチャレンジから６週間後に、ワクチン接種した動物は１５部位（１：２希釈または１：１２希釈ウィルスストック）のうち１５がいぼがなく、対照動物は１５部位（１：２希釈ウィルス）のうち１２にまたは１５部位（１：１２希釈ウィルス）のうち９にいぼが形成されていた。１５週間後、ワクチン接種した動物はなお、いぼがなかった。
ウサギ血清をＣＲＰＶと混合し、続いて処理ＣＲＰＶでウサギをチャレンジすることによりウィルス中和アッセイを（実質的にクリステンセンらの，１９９１，ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１８１巻：５７２〜５７９頁の方法に従って）行った。中和抗体を測定するための標準は完全ウィルス中和（３／３部位にいぼ形成が陰性）である。５匹のワクチン接種動物および５匹の対照動物からの血清を分析した。ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰの１回の投与後に採集した血清は、８０％のウサギ（４／５）において非希釈ウィスルを完全に中和する抗体を含んでいた。ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰの２回または３回の投与後に、１００％のウサギ（５／５）がウィスル中和抗体を有していた。対照血清は、ウィルス中和活性を示さなかった。最終力価により、選択されたワクチン接種動物の血清を１０〜１０００倍に希釈することができ、なお１００％中和を維持した。
中和抗体反応が天然ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰに特異的であるかを試験するために、一つの免疫血清を選択し、天然または変性した酵母由来ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰをコートしておいたニトロセルローススクエアで培養した。ニトロセルローススクエア（１ｃｍ²）に天然または変性（還元および８Ｍ尿素中ヨード酢酸でアルキル化）した酵母発現ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰをコートした。対照として天然または変性した酵母抽出物を用いた。ウサギ免疫血清を、ニトロセルローススクエアで４℃で８〜１４時間、連続的に４回培養してから、前述のようにウィルス中和アッセイで試験した。天然ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰのみが、ＣＲＰＶ中和に反応性のある抗体を吸収することができ、変性または対照酵母タンパクはこれらの抗体を吸収しなかった。さらに、天然ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰはまた、昆虫細胞で発現されるＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰに対するＥＬＩＳＡ反応性を除去した（データは示されない。）。
実施例１６
単一プラスミドからのＣＲＰＶ Ｌ１／Ｌ２の同時発現のためのベクターの構築
プラスミドｐＳＰ７２−ＣＲＰＶ−Ｌ１（Ｐ１２９３０−３１４−４−１）をＢｇ１ＩＩで消化し、酵母５’−非翻訳リーダーと共にＣＲＰＶ Ｌ１ ＯＲＦを有する１．５ｋｂｐＢｇ１ＩＩフラグメントをゲル精製した。プラスミドｐ１２９３０−３２３−２−３（ｐＣ１／１−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐ−ＣＲＰＶ−Ｌ２）を，ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの間で切断するＢａｍＨＩで消化した。線状ベクターフラグメントをゲル精製し、次に、前記ＣＲＰＶ−Ｌ１ Ｂｇ１ＩＩフラグメントと結合してプラスミドＰ１２９３０−３６６−１−２（ｐＣ１／１−ＧＡＬ１／１０ｐ−ＣＲＰＶ／Ｌ１＋Ｌ２）を形成した。この得られたプラスミドは、ＧＡＬ１プロモーターの制御下にＣＲＰＶ−Ｌ１ ＯＲＦを含み、ＧＡＬ１０プロモーターの制御下にＣＲＰＶ−Ｌ２ ＯＲＦを含む。
実施例１７
二つのプラスミドからのＣＲＰＶ Ｌ１／Ｌ２の同時発現のためのベクターの構築
Ｌ２遺伝子を含むｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐベクターをＳｐｈＩで切断し、ＡＤＨ１ｔ−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐ−Ｌ２−ＡＤＨ１ｔ発現カセットを有する２．９ｋｂフラグメントをゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端平滑化した。酵母シャトルベクターＹＥｐ２４［ボートシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら，ジーン（Ｇｅｎｅ），第８巻：１７頁（１９７９）］をＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端平滑化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、次に前記末端平滑化Ｌ２発現カセットと結合してプラスミドｐ１５９４を形成した。
実施例１８
酵母中におけるＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２の同時発現
プラスミドｐ１２９３０−３６６−１−２（ｐＣ１／１−ＧＡＬ１／１０ｐ−ＣＲＰＶ／Ｌ１＋Ｌ２）を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株＃１５６９およびＢＪ５４６２（一つのプラスミド系）を形質転換し、得られる形質転換体を、ロイシンマイナス合成寒天培地上で選択した。並行実験において、菌株１５６９をｐＣ１／１−ＧＡＬ１０ｐ−ＣＲＰＶ−Ｌ１発現ベクターｐ１２９３０−３２３−６−１プラスＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−Ｌ２発現ベクターＰ１５９４（二つのプラシミド系）と同時形質転換し、両方のベクターを含む得られる形質転換体を、ロイシンおよびウラシルの両方を含まない合成寒天培地上で選択した。一つのプラスミド系と二つのプラスミド系の両方のクローン単離物を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ複合培地において３０℃で４８〜７２時間成長させた。細胞を採取した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊した。トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を０．５％の最終濃度となるように添加し、細胞溶解物をイムノブロット分析によりＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２の発現について分析した。総細胞タンパク５０μｇを含むサンプルを、還元および変性条件下に８〜１６％トリス−グリシン勾配ゲル（ノヴェックス社（Ｎｏｖｅｘ）製）上で電気泳動し、ＰＶＤＦ薄膜（ノヴェックス社製）上にエレクトロブロットした。第１抗体としてポリクローナルウサギ抗−Ｌ１または抗−Ｌ２抗血清（ハーシー・メディカル・センター（Ｈｅｒｓｈｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）のジョン・クライダー（Ｊｏｈｎ Ｋｒｅｉｄｅｒ）博士から入手）を用い、第２抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）製）に結合したタンパクＡを用いることにより、ＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパクを検出した。化学ルミネセントＥＣＬ^TM検出キット（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（アマーシャム社製）を用いて薄膜を処理した。Ｌ１＋Ｌ２発現プラスミドを有する酵母クローンからの全てのサンプルにおいて５５〜６１ｋＤａ Ｌ１タンパクバンドおよび〜９０ｋＤａ Ｌ２タンパクバンドが検出された。Ｌ１の発現プラスミドを有する酵母クローンから誘導されるサンプルにおいてＬ２のシグナルは検出されなかった。Ｌ２発現ベクターのみを含む細胞からのサンプルにおいてＬ１のシグナルは検出されなかった。
実施例１９
ＥＭ研究のためのＣＲＰＶ Ｌ１およびＣＲＰＶ Ｌ１＋Ｌ２ＶＬＰの精製
酵母によって発現されたＣＲＰＶ Ｌ１タンパクならびにＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパクを部分的に精製し、電子顕微鏡（ＥＭ）研究のために濃縮した。Ｌ１＋Ｌ２同時発現ベクターｐ１２９３０−３６６−１−２（ｐＣ１／１−ＧＡＬ１／１０ｐ−ＣＲＰＶ／Ｌ１＋Ｌ２）で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株＃１５６９およびＢＪ５４６２を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地１〜１．５リッターに接種し、３０℃で４８〜７２時間成長させた。並行実験において、ＧＡＬ１０ｐ−ＣＲＰＶ−Ｌ１発現ベクターｐ１２９３０−３２３−６−１プラスＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−Ｌ２プラスミドｐ１５９４で同時形質転換した菌株＃１５６９の細胞を同様の方法で成長させた。細胞を採取し、細胞ペレットを−７０℃で凍結した。以下の全ての工程は４℃で行った。細胞ペレットを融解し、等容量の「Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＬ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞を、マイクロフルイダイザー中を３〜５回通過させることにより溶解した。溶解物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。上澄みを、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｖ／ｖ）の５ｃｍクッションの上にのせ、Ｌ１、Ｌ２またはＬ１およびＬ２タンパクを１０００００×ｇで４時間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１／１０容のＬ１緩衝液中に再懸濁させた。再懸濁ペレットを、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。
ＥＭ分析（ペンシルバニア州ウエストチェスター在ストラクチャー・プローブ社（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ））のために、２００メッシュ炭素被覆銅グリッド上に各サンプルをのせた。２％ホスホタングステン酸（ＰＴＡ）（ｐＨ７．０）の一滴をグリッドの上に２０秒間のせた。グリッドを風乾してからＴＥＭ試験に付した。全ての顕微鏡検査はＪＥＯＬ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．製）を用いて１００ＫＶの加速電圧で行った。顕微鏡写真の最終倍率は１０００００Ｘとした。
ＣＲＰＶ Ｌ１発現プラスミドまたはＣＲＰＶ Ｌ１およびＬ２の同時発現のためのプラスミドを有する全ての酵母サンプルにおいて、５０〜５５ｎｍ直径寸法範囲においてＶＬＰが観察された。酵母対照サンプルまたはＬ２発現プラスミドのみを有する酵母サンプルにおいてＶＬＰは観察されなかった（図７，８，９）。
実施例２０
Ａ．組換えＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクの精製−スキーム２
全ての工程は特記しない限り４℃で行った。
−７０℃に貯蔵した細胞を融解し、等容量のブレーキング緩衝液（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＬ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞を、ビオネブ・セル・ディスラプター・システム（ＢｉｏＮｅｂ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）（インジアナ州テラホイテ在グラス−コル・アパレイタス社（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏ．）製）を用いて溶解した。溶解物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。
上澄みを、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍクッションの上にのせ、Ｌ１を１０００００×ｇで４時間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１／１０容のＬ１緩衝液中に再懸濁させた。再懸濁ペレットを、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。
上済みをＰＢＳで１：５に希釈し、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＳＡ−６００ローター中６５００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離することにより再清澄化した。０．２２ミクロンシリンジフィルターを通して上済みを濾過し、アニオン交換クロマトグラフィーにより分画した。
アニオン交感クロマトグラフィーは、５ミリリッターの注入ループを備えるパーキン−エルマー・シリーズ・４１０・バイオポンプ・ＨＰＬＣ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４１０ Ｂｉｏｐｕｍｐ ＨＰＬＣ）を用いて行った。クロマトグラフィー媒体は、１５０ｍｍ×１０ｍｍＩＤガラスカラム中のフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＦ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）２５〜４０ミクロン樹脂（ニュージャージー州ギブスタウン在イー・エム・セパレイションズ社（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）製）とした。カラムからのタンパクの溶出をモニターするために、パーキン−エルマー・ＬＣ−２３５・ダイオード・アレイ・デテクター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＣ−２３５ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて２８０ｎｍでの光学検出を行った。カラムを０．０１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中０．１５ＭＮａＣｌで予め平衡化させた。カラムは、流速０．７５ｍＬ／分で操作した。サンプルをカラムの上にのせ、カラムを緩衝液Ａで洗って非結合物質を除去した。結合物質は０．１５Ｍ〜０．６５Ｍの直線濃度勾配の塩化ナトリウムで５分間溶出し、次に０．６５Ｍ〜０．１５Ｍの直線勾配で３０分間溶出した。溶出中に収集されたフラクション中の抗原の検出は、イムノドットブロットアッセイで行った。免疫反応性物質を含むフラクション（すなわち、０．８１Ｍと１．０５ＭＮａＣｌとの間において溶出されるフラクション）を溜めた。
溜めたフラクションをマクロセップ（Ｍａｃｒｏｓｅｐ）遠心分離濃縮装置（マサチューセッツ州ノースボロウ在フィルトロン・テクノロジー社（Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．））において１／１５容量まで濃縮した。
濃縮物を、８７ｃｍ×２７ｍｍＩＤカラム内のセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１０００ＳＦ樹脂（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。カラムは２．５ｍｌ／分の流速で操作した。タンパクの溶出は、２８０ｎｍでの吸収によりモニターした。抗原をイムノブロットで検出した。
免疫反応性物質を含むフラクションを溜め、圧力１０ｐｓｉの窒素雰囲気下に４３ｍｍの直径のＹＭ−１００平坦シート薄膜（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）製）を有する攪拌セル（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社製）を用いて限外濾過により濃縮した。
最終生成物を、クーマシー染色を用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより、および溶液篩キャピラリー電気泳動（ＳＳＣＥ）により特徴付けた。スキーム２からの最終生成物は、ＳＳＣＥによれば８８％純度であった。
実施例２１
Ａ．組換えＣＲＰＶ Ｌ１カプシドタンパクの精製−スキーム３
全ての工程は特記しない限り４℃で行った。
−７０℃に貯蔵した細胞を融解し、等容量のブレーキング緩衝液（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＬ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞を、ビオネブ・セル・ディスラプター・システム（インジアナ州テラホイテ在グラス−コル・アパレイタス社（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏ．）製）を用いて溶解した。溶解物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。
上澄みを、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍクッションの上にのせ、Ｌ１を１０００００×ｇで４時間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１／１０容のＬ１緩衝液中に再懸濁させた。再懸濁ペレットを、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。
上済みを１／２容のクロロホルムで抽出した。水層を除去し、ベックマン・マイクロ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）において１２０００ｒｐｍにて室温で５分間遠心分離することにより清澄化した。
上済みをＰＢＳで１：５に希釈し、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＳＡ−６００ローター中６５００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離することにより再清澄化した。０．２２ミクロンシリンジフィルターを通して上済みを濾過し、アニオン交感クロマトグラフィーにより分画した。
アニオン交換クロマトグラフィーは、５ミリリッターの注入ループを備えるパーキン−エルマー・シリーズ・４１０・バイオポンプ・ＨＰＬＣ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４１０ Ｂｉｏｐｕｍｐ ＨＰＬＣ）を用いて行った。クロマトグラフィー媒体は、１５０ｍｍ×１０ｍｍＩＤガラスカラム中のフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＦ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）２５〜４０ミクロン樹脂（ニュージャージー州ギブスタウン在イー・エム・セパレイションズ社（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）製）とした。カラムからのタンパクの溶出をモニターするために、パーキン−エルマー・ＬＣ−２３５・ダイオード・アレイ・デテクター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＣ−２３５ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて２８０ｎｍでの光学検出を行った。カラムを０．０１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中０．１５ＭＮａＣｌ（緩衝液Ａ）で予め平衡化させた。カラムは、流速０．７５ｍＬ／分で操作した。サンプルをカラムの上にのせ、カラムを緩衝液Ａで洗って非結合物質を除去した。結合物質は０．１５Ｍ〜０．６５Ｍの直線濃度勾配の塩化ナトリウムで５分間溶出し、次に０．６５Ｍ〜０．１５Ｍの直線勾配で３０分間溶出した。溶出中に収集されたフラクション中の抗原の検出は、イムノドットブロットアッセイで行った。免疫反応性物質を含むフラクション（すなわち、０．８１Ｍと１．０５ＭＮａＣｌとの間において溶出されるフラクション）を溜めた。
溜めたフラクションをマクロセップ（Ｍａｃｒｏｓｅｐ）遠心分離濃縮装置（マサチューセッツ州ノースボロウ在フィルトロン・テクノロジー社（Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．））において１／１５容量に濃縮した。
濃縮物を、８７ｃｍ×２７ｍｍＩＤカラム内のセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１０００ＳＦ樹脂（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。カラムは２．５ｍｌ／分の流速で操作した。タンパクの溶出は、２８０ｎｍでモニターした。抗原をイムノブロットで検出した。
免疫反応性物質を含むフラクションを溜め、圧力１０ｐｓｉの窒素雰囲気下に４３ｍｍの直径のＹＭ−１００平坦シート薄膜（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）製）を有する攪拌セル（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社製）を用いて限外濾過により濃縮した。
最終生成物を、クーマシー染色を用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより、および溶液篩キャピラリー電気泳動（ＳＳＣＥ）により特徴付けた。スキーム３からの最終生成物は、ＳＳＣＥによれば９５％純度であった。
実施例２２
富裕な複合および化学的規定培地中におけるＣＲＰＶ Ｌ１およびＨＰＶタイプ６ａＬ１（菌株１６４４）の発現
これら菌株の接種は前述のロイシンを含まない合成培地において行い、振盪フラスコ培地に移した。使用した振盪フラスコは、高通気能のために邪魔板を設け（３００ｍＬフラスコ当たり７０ｍＬ液体，トゥンエア・ラブウエア社（Ｔｕｎａｉｒ Ｌａｂｗａｒｅ）製）、培地には約０．５ｍＬ／Ｌの消泡剤（ＵＣＯＮ ＬＢ−６２５，ユニオン・カーバイド社（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ）製）加えた。富裕複合培地は（リッター当たり）；４０ｇのディフコ（Ｄｉｆｃｏ）酵母抽出物；２０ｇのシェフィールド・ハイソイ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ＨｙＳｏｙ）ペプトン；３０ｇのグルコース；５０ｇのガラクトースを含み、培地は滅菌前にｐＨ５．３に調整された。使用した化学的規定培地は、オオウラ（Ｏｕｒａ）により記載されたもの（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．第１６巻：１１９７〜１２１２，１９７４）に類似しているが、０．１ｇの塩素Ｃｌ；０．４ｇのアデニン；３０ｇの窒素源としてのグルタミン酸一ナトリウム；０．２ｇのウラシル；２０ｇのグルコース；４０ｇのガラクトースを加えた。フラスコを接種物３ｍＬで接種し、回転振盪器において２８℃、２５０ｒｐｍで６６時間培養した。抗−ＣＲＰＶ Ｌ１および抗−ＨＰＶ ６ａ Ｌ１抗血清を用いてイムノブロットにより発現を確認するために間隔をおいてフラスコからサンプリングした。
実施例２３
ＨＰＶ−６ａゲノムのクローニング
重症の尖圭コンジローム（ｃｏｎｄｙｌｏｍａｔａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）（インジアナ医科大学（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のダロン・ブラウン（Ｄａｒｒｏｎ Ｂｒｏｗｎ）博士から提供された）を診断された患者からの組織を制限酵素消化およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により検出し、ＨＰＶタイプ６ａを含むことが示された。ＤＮＡを組織サンプルから抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化した。０．８％低融点アガロース分取用ゲルを通すサイズ分別に続いて、ゲルから８ｋｂの領域を切り出し、アガロースをゲラーゼ酵素（Ｇｅｌａｓｅ^TMｅｎｚｙｍｅ）（エピセンター・テクノロジー社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）製）で消化した。サンプルを、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化し脱リン酸化しておいたｐＵＣ１８（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ）製）で結合した。有効なＥ． ｃｏｌｉＤＨ５細胞（ＢＲＬ）の形質転換に続いて、プラスミドライブラリーを、ＨＰＶ−６ａ Ｌ１遺伝子に相補的な³²Ｐ−標識オリゴデオキシヌクレオチドを用いてＨＰＶ−６ａ陽性クローンについてスクリーニングした。８−ｋｂＨＰＶ−６ａゲノムを含むｐＵＣ１８プラスミドを単離し、制限酵素およびサザンブロット分析により特徴付けた。このプラスミドをｐＵＣ１８−ＨＰＶ−６ａと表した。完全８ｋｂ ＨＰＶ−６ａゲノムを、ＡＢＩ自動配列決定機（＃３７３Ａ）を用いて製造者の指示に従って配列決定した。
２５才の分娩後女性患者から大きな外陰尖圭コンジローム病巣を得た。病巣のフラグメントを液体窒素中で凍結し、ブラウン・ミクロディスメンブレーターＩＩ（Ｂｒａｕｎ ｍｉｋｒｏｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒＩＩ）（ドイツ国メルスンゲンのブラウン・インスツルメンツ社（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）で処理した。得られた材料を０．６％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、プロテナーゼＫ（５０ｍｃｇ／ｍｌ）で処理し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＵＶ分光光度計により定量した。高分子量ＤＮＡの存在は、アガロースゲル電気泳動およびその後のエシジウムブロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）による染色により確定された。
ＨＰＶ ＤＮＡタイプはヴィラ・タイプ・プラス（Ｖｉｒａ Ｔｙｐｅ Ｐｌｕｓ）（メリーランド州ベルツビル剤ジゲン・ダイアグノスティクス社（Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製）として販売されているハイブリッド捕捉アッセイを用いて決めた。使用したＨＰＶプローブを二つのプールに分け、その組成は各タイプと生殖器管悪性疾患との関係に基づく。プローブ群Ａは「低危険度」タイプＨＰＶ６，１１，４２，４３および４４を含み、プローブ群Ｂは「高危険度」タイプＨＰＶ１６，１８，３１，３３，３５，４５，５１，５２および５６を含む。全ＤＮＡをＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、高緊縮条件（Ｔｍ−１５℃）下にサザンブロットを行いＨＰＶサブタイプを決めた。
完全ＨＰＶ６ａ配列を決めるために、公表されているＨＰＶ６ｂ配列に基づき配列決定用プライマーを合成した。完全８．１ｋｂｐＨＰＶ６ａゲノムの両方のストランドを、ＰＲＩＳＭ^TMキットおよびアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ））自動配列決定機（＃３７３Ａ）を用い製造者（カリフォルニア州フォスターシティー在ＡＢＩ社）の指示に従ってジデオキシ鎖終止法により配列決定した。センスおよびアンチセンス配列が適合しない場合、コンセンサスを得るために問題の領域を越えて両方向に再配列決定するために更なるＨＰＶ６ａ特異性プライマーを合成した。
ＨＰＶ６ａおよびＨＰＶ６ｂのＤＮＡ配列は９７％を越える同一性を示し、８０１０ｂｐのうち全部で２２９ｂｐの変化が確認された。ＨＰＶ６ｂ配列と比較して最も重要な違いが長い調節領域（ＬＣＲ；ｎｔ７２０５−ｎｔ１０６）において見られた。ＨＰＶ６ａＬＣＲにおける幾つかの単一ヌクレオチド（ｎｔ）変化とは別に、ｎｔ７３５０における９４−ｂｐ挿入およびｎｔ７８０４におけるもう一つの１９−ｂｐ挿入が見られた。ｎｔ７６１５において、ＨＰＶ６ａゲノムから６つの塩基対が削除された。
実施例２４
ＨＰＶ６ａ Ｌ１酵母発現ベクターの構築
ＰＣＲのための鋳型としてＨＰＶタイプ６ａＤＮＡを用いた。ＨＰＶ６ａ Ｌ１遺伝子を、ベント（Ｖｅｎｔ）ポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）製）、３５サイクルの増幅（９４℃で１分；４８℃で１分；７２℃で１分４５秒）、およびフランキングＢｇ１ＩＩ部位（アンダーライン付）を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより増幅した。
センスプライマー：５’−ＣＴＣ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＧＴ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＴＡ ＧＣＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＣＡＧ−３’（配列番号１１）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＡＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＴＴＡ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＴＡ Ｃ−３’（配列番号１２）
センスプライマーは、ＨＰＶ６ａＬ１開始メチオニンコドン（太字で強調）の直ぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．５ｋｂｐＬ１ＰＣＲ生成物をＢｇ１ＩＩで消化しゲル精製した。両側に酵母ＡＤＨ１転写ターミネータのコピーがフランキングしているプラスミドｐＢＭ２７２（セントルイスのワシントン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のマーク・ジョンストン（Ｍａｒｋ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）博士から提供された）からの発散ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターを含む両方向プロモーターベクターｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐから１．４ｋｂｐＳｐｈＩフラグメントを単離することによりｐＣ１／１−ＧＡＬ発現ベクターを構築した［ベネツェン（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．）およびホール（Ｈａｌｌ，Ｂ．Ｄ．）（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７巻：３０１８−３０２５頁］。得られた発現カセットにおいて、ＢａｍＨＩ部位をＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの第１のコピーとの間に配置し、ＳｍａＩクローニング部位を発散ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの第２のコピーとの間に配置する。酵母シャトルベクターｐＣ１／１（ローゼンベルク（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，第３１２巻（１９８４）７７−８０頁）をＳｐｈｌで消化し、１．４ｋｂｐ Ｓｐｈｌ ＧＡＬプロモーターフラグメントと結合した。得られたベクターｐＣ１／１−ＧＡＬを、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターとの間で切断するＢａｍＨＩで線状化した。ＢａｍＨＩ消化ｐＣ１／１−ＧＡＬベクターおよびＢｇ１ＩＩ消化ＨＰＶ６ａ Ｌ１ＰＣＲフラグメントを連結し、Ｅ． ｃｏｌｉＤＨ５細胞（ＢＲＬ）の形質転換に用いた。ＨＰＶ−６ａ Ｌ１遺伝子を含むｐＣ１／１−ＧＡＬプラスミドを単離し、ｐ１３１７３−３５７−６と表示した。ｐ１３１７３−３５７−６中のＬ１遺伝子を配列決定（ＡＢＩ配列決定機，＃３７３Ａ）すると、ｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａ内のＬ１遺伝子と同一であることが示された。
実施例２５
ＨＰＶ６ａ Ｌ１およびＬ２酵母発現ベクターの構築
プラスミドｐ１３１７３−３５７−６（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ６ａ Ｌ１）をＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターとの間で切断するｍａＩで消化した。鋳型としてのｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａＤＮＡ、ベントポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）製）、１０サイクルのＰＣＲ増幅（９４℃で１分；４８℃で１分；７２℃で１分４５秒）、およびフランキングＳｍａＩ部位（アンダーライン付）を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより１．４ｋｂｐＨＰＶ６ｂ Ｌ２遺伝子を増幅した。
センスプライマー：５’−ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＣＡＣ ＡＴＡ ＧＴＡ ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＡＣ ＧＡＣ−３’（配列番号１３）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＡＴＣ ＴＧＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＡＡ ＧＧ−３’（配列番号１４）
センスプライマーは、ＨＰＶ６ａＬ２開始メチオニンコドン（太字で強調）の直ぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。ＰＣＲフラグメントをＳｍａＩで消化し、ゲル精製し、ＳｍａＩ消化ｐ１３１７３−３５７−６プラスミドと結合した。ＨＰＶ６ａＬ１およびＬ２遺伝子の両方を含むｐＣ１／１−ＧＡＬプラスミドを単離しｐ１４０４９−７−２と表示した。Ｌ２遺伝子を配列決定（ＡＢＩ配列分析機，＃３７３Ａ）すると、ｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａクローン内のＬ２遺伝子と同一であることが分かった。
実施例２６
酵母内におけるＨＰＶ６ａ Ｌ１の発現およびＨＰＶ６ａ Ｌ１およびＬ２の同時発現
プラスミドｐ１３１７３−３５７−６（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ６ａ Ｌ１）およびｐ１４０４９−７−２（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ６ａ Ｌ１ および Ｌ２）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株＃１５６９（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２−０４，ｐｒｂｌ，ａｄｅｌ，ｐｅｐ４，ｃｉｒ°）および＃１５５８（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２−０４，ｐｒｂｌ，ｍｎｎ９，ａｄｅｌ，ｃｉｒ°）を形質転換した。宿主菌株＃１５５８を用いて得られた組換え菌株は、表に示されるように＃１６４４（ＨＰＶ６ａＬ１）および＃１６７０（ＨＰＶ６ａＬ１＋Ｌ２）であった。クローン単離物を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地内で３０℃において６８〜７８時間成長させた。細胞を採取した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、細胞溶解物をイムノブロット分析によりＨＰＶ６ａＬ１またはＨＰＶ６ａＬ２タンパクの発現について分析した。総細胞タンパク４０μｇを含むサンプルを、還元および変性条件下に１０％トリス−グリシンゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター上にエレクトロブロットした。第１抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１融合タンパク（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｒ．）ら，ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）第２０１巻：４６−５４頁）に対するウサギ抗血清および第２抗体としてロバ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合（ＨＲＰ）全抗体（アマーシャム社製）を用いて、Ｌ１タンパクを免疫検出した。化学ルミネセントＥＣＬ^TMデテクションキット（アマーシャム社製）を用いてフィルターを処理した。陰性対照（Ｌ１またはＬ２遺伝子を含まないｐＣ１／１）を除いて全てのサンプルにおいて５０〜５５ｋＤａＬ１タンパクバンドを検出した。
第１抗体として実質的にカーター（Ｃａｒｔｅｒ）らの方法により調製したｔｒｐＥ−ＨＰＶ６ａ Ｌ２融合タンパクで３回免疫しておいたマウスからの１：２５０希釈血清を用い第２抗体としてＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（アマーシャム社製）（１：１０００希釈）を用いて、ウエスタン分析によりＬ２タンパクを７０ｋＤａタンパクバンドとして検出した。
ＥＭ分析（ペンシルバニア州ウエストチェスター在ストラクチャー・プローブ社（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ））のために、各サンプルのアリコートを２００メッシュ炭素被覆銅グリッドの上にのせた。２％ホスホタングステン酸（ＰＴＡ）（ｐＨ７．０）の一滴をグリッドの上に２０秒間のせた。グリッドを風乾してから、ＴＥＭ試験に付した。全ての顕微鏡検査はＪＥＯＬ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ製）を用いて１００ＫＶの加速電圧で行った。顕微鏡写真は最終倍率１０００００Ｘとした。
ＨＰＶ６ａＬ１またはＨＰＶ６ａＬ１およびＬ２同時発現プラスミドを有する全ての酵母サンプルにおいて５０〜５５ｎｍの直径寸法範囲のＶＬＰが観察された。酵母対照サンプルにおいてＶＬＰは観察されなかった。
実施例２７
ＨＰＶ６ａＬ１＋Ｌ２（菌株＃１６７０）の発酵
菌株１６７０の平板培養の表面成長部分を、１リッター当たり、アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない８．５ｇのディフコ（Ｄｉｆｃｏ）酵母窒素塩基；０．２ｇのアデニン；０．２ｇのウラシル；１０ｇのコハク酸；５ｇの硫酸アンモニウムおよび０．２５ｇのＬチロシンを含むロイシン非含有液体培地に無菌的に移し、この培地は滅菌前にＮａＯＨでｐＨ５．０〜５．３に調整した。回転振盪器で２８℃、２５０ｒｐｍで２５時間成長させた後、滅菌グリセロールを最終濃度１７％（ｗ／ｖ）になるように添加することにより凍結培地バイアルを調製し、−７０℃で貯蔵（クリオバイアル当たり１ｍＬ）した。菌株１６７０の発酵のための接種を同じ培地で行い（２Ｌフラスコ当たり５００ｍＬ）、二つの凍結培養バイアルの融解内容物を２Ｌフラスコに移すことにより開始し、回転振盪器で２８℃，２５０ｒｐｍで２５時間培養した。菌株１６７０の発酵は、接種後に有効容積１０Ｌのニュー・ブランスヴィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）ＳＦ−１１６発酵器を用いた。使用した製造培地は、１リッター当たり、２０ｇのディフコ酵母抽出物；１０ｇのシェフィールド・ハイソイ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ＨｙＳｏｙ）ペプトン；２０ｇのグルコース；２０ｇのガラクトースを含み、培地は滅菌前にｐＨ５．３に調整した。２Ｌ接種フラスコの全内容物（５００ｍＬ）を発酵器に移し、それを２８℃で、１分当たり５Ｌの空気を導入し、４００ｒｐｍ、３．５ｐｓｉの圧力で培養した。溶解酸素水準を飽和の４０％以上に維持するために必要に応じて攪拌を激しくした。発酵の進行は、オフライングルコース測定器（ベックマン・グルコース・２・アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２ Ａｎａｌｙｚｅｒ））およびオンラインマススペクトル測定器（パーキン−エルマー１２００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １２００））によりモニターした。６９時間の培養後、１Ｌ当たり９．９ｇの乾燥細胞重量の細胞密度に達した。培養物を中空繊維濾過器（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＤＣ−１０濾過システムにおけるアミコンＨ５ＭＰＯ１−４３カートリッジ）により２Ｌに濃縮し、２Ｌ燐酸緩衝塩水で透析濾過し、さらに濃縮（１Ｌに）してから、５００ｍＬの遠心分離瓶に分配した。細胞ペレットを８０００ｒｐｍにて４℃で２０分間の遠心分離（ソーバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＧＳ３ローター）により収集した。上澄みを傾瀉した後、ペレット（合計で２２５ｇの湿潤細胞）を使用するまで−７０℃で貯蔵した。
実施例２８
組換えＨＰＶ６ａＬ１＋Ｌ２カプシドタンパクの精製
特記しない限り全ての工程は４℃で行った。
菌株＃１６７０の細胞を−７０℃で凍結貯蔵した。凍結細胞（湿潤重量＝３８．０ｇ）を２０〜２３℃で溶解し、５０ｍＬの「Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＬ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞スラリーを、Ｍ１１０マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マサチューセッツ州ニュートン在マイクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．））中を３回通過させることにより約８０００ｐｓｉの圧力下に破壊した。破壊細胞スラリーを、５０００×ｇで１０分間の遠心分離にかけ細胞破壊物を除去した。Ｌ１＋Ｌ２抗原を含む上澄み液を回収した。
上澄み液を緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を添加することにより１：５に希釈し、緩衝液Ａ中に平衡化されたフラクトゲル^▲Ｒ▼（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＲ）ＥＭＤ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）樹脂（ニュージャージー州ギブスタウンＥＭＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製）のアニオン交換捕捉カラム（５．０ｃｍＩＤ×４．０ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａによる洗浄に続いて、緩衝液Ａ中０〜０．１ＭＮａＣｌの勾配で抗原を溶出した。イムノドットブロットを行ってカラムからのどのフラクションがＬ１タンパクを含むか決めた。
イムノドットブロットにより決められたＬ１タンパクを含むフラクションを、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法およびその後の銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより全タンパクについて検定した。
同等の純度および多量のＬ１タンパクを示すＴＭＡＥフラクションを溜めた。抗原を硫酸アンモニウム分画により濃縮した。溶液を、固体試薬を添加しつつ３０分間穏やかに攪拌することにより６３％飽和硫酸アンモニウムに調整した。サンプルを氷の上にのせ、３０分間沈降を起こさせた。サンプルを１２０００×ｇで遠心分離した。ペレットを２０．０ｍＬのＰＢＳ（燐酸ナトリウム６．２５ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１５０ｍＭ）中に再懸濁させた。
再懸濁ペレットを、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）５００ＨＲ樹脂（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）のサイズ排除カラム（２．６ｃｍＩＤ×８９ｃｍ）でクロマトグラフにかけた。ランニング緩衝液はＰＢＳとした。クロマトグラフィーは２０〜２３℃で行った。フラクションを銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット検出により分析した。最も純度の高いフラクションを溜めた。得られるプールを濃縮した。
最終生成物を、コロイド状クーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１およびＬ２タンパクは８５％均質であると推定された。Ｌ１およびＬ２タンパクの同一性は適当な抗血清を用いるウエスタンブロットにより確認した。最終生成物を採取し、−７０℃で貯蔵した。このプロセスにより全部で３．０ｍｇのタンパクを得た。
電子顕微鏡分析をストラクチャープローブ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ）（ペンシルバニア州ウエスト・チェスター社（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ）製）により行った。サンプルの一部を２００メッシュ炭素被覆銅グリッドにのせた。２％ホスホタンスグテン酸（ｐＨ７．０）を一滴をグリッドに２０秒間のせた。グリッドを風乾してからＴＥＭ試験に付した。全ての顕微鏡検査はＪＥＯＬ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．製）を用いて１００ｋｖの加速電圧で行った。顕微鏡写真は最終倍率１０００００ｘとした。５０〜５５ｎｍ寸法範囲のウィルス状粒子の存在が確認された。
実施例２９
ＥＭ研究のためのＨＰＶ−６ａ Ｌ１およびＬ１／Ｌ２ ＶＬＰの精製
酵母によって発現されたＨＰＶ−６ａ Ｌ１およびＨＰＶ−６ａ Ｌ１＋Ｌ２タンパクを部分精製し、電子鏡検法（ＥＭ）研究のために濃縮した。プラスミドｐ１３１７３−３５７−６（Ｌ１発現ベクター）またはプラスミドｐ１４０４９−７−２（Ｌ１およびＬ２同時発現ベクター）を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株＃１５５８を、２％ガラクトースおよび０．１Ｍソルビトールを含むＹＥＨＤ培地１〜１．５リッターに接種し、３０℃で６８〜７８時間成長させた。細胞を４０００ｇで１０分間の遠心分離により採取し、細胞ペレットを−７０℃で凍結した。以下の全ての工程は４℃で行った。細胞ペレットを融解し、等容量の「Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＭ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞を、マイクロフルイダイザー中を３〜５回通過させることにより溶解した。溶解物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。上澄みを、Ｌ１緩衝液中４５％（ｗ／ｖ）スクロースの５ｃｍクッションの上にのせ、Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパクを１０００００×ｇで４時間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１／１０容のＬ１緩衝液中に再懸濁させ、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。サンプルをＥＭにより研究すると、ウィルス状粒子を含むことが示された。
実施例３０
ＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２遺伝子のクローニング
全ゲノムＤＮＡをカスキ（Ｃａｓｋｉ）細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ １５５０）から標準的技術（前述のサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らによるもの）により抽出した。ＤＮＡをＢｓｔｌ１０７ＩおよびＳｐｈＩエンドヌクレアーゼにより消化し、０．８％低融点アガロース分取用ゲルにおいて電気泳動させた。〜３．５ｋｂｐのＤＮＡに相当する領域をゲルから切り出し、アガロースをゲラーゼ（Ｇｅｌａｓｅ^TM）酵素（エピセンター・テクノロジー社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製））で消化した。ゲル精製ＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化し、埋没ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む末端平滑化リン酸化オリゴデオキシヌクレオチドと結合した。連結混合物をＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し〜３．５ｋｂｐのＤＮＡを前述のようにアガロースゲルを通してサイズ分画した。ゲル精製ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し脱リン酸化しておいたｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡと結合した。コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ 細胞（ＢＲＬ）の形質転換に続いて、ＨＰＶ−１６Ｌ１遺伝子（５’−ＧＡＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＡＣ ＡＧＣ ＴＴＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＴＴＡ ＧＣ−３’）の３’末端に相補的なアンチセンス³²Ｐ標識オリゴデオキシヌクレオチドを用いるコロニーハイブリダイゼーションにより、プラスミドライブラリーをＨＰＶ１６陽性クローンについてスクリーニングした。３．３ｋｂｐＨＰＶ１６ゲノムフラグメントを含むｐＵＣ１８プラスミドを単離し、制限酵素およびサザンブロット分析により特徴付けた。このプラスミドはｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２と表され、Ｌ１およびＬ２コードＤＮＡ配列の全てを含んでいた。プラスミドＤＮＡはキアゲン・プラスミド・マクシ・キット（Ｑｉａｇｅｎ^TM Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）製）を用いて調製した。
実施例３１
ＨＰＶ１６Ｌ１酵母発現ベクターの構築
クローンｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２をＰＣＲのための鋳型として使用した。ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子を、ベントポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）製）、１０サイクルの増幅（９４℃で１分；４８℃で１分；７２℃で１分４５秒）、およびフランキングＢｇ１ＩＩ部位（アンダーライン付）を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。
センスプライマー：５’−ＣＴＣ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＡＧＧ ＣＣ−３’（配列番号１５）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＡＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＡＣ ＡＧＣ ＴＴＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＴＴＡ ＧＣ−３’（配列番号１６）
センスプライマーは、ＨＰＶ１６Ｌ１開始メチオニンコドン（太字で強調している）の直ぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．５ｋｂｐＬ１ＰＣＲ生成物を、Ｂｇ１ＩＩで消化し、ゲル精製し、ＢａｍＨＩ消化ｐＣ１／１−ＧＡＬベクターと結合した。ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子を含むｐＣ１／１−ＧＡＬプラスミドを単離し、ｐ１４０４９−３７−１と表した。ｐ１４０４９−３７−１中のＬ１遺伝子を、プリズム・キット（ＰＲＩＳＭ^TM ｋｉｔ（ＡＢＩ，Ｉｎｃ．製）およびＡＢＩ配列分析機（ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）モデル＃３７３Ａを用いて製造者の指示に従って配列決定した。この単離物中のＬ１遺伝子は、正しい公表されているプロトタイプ配列（キルンバウアー（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ）ら，（１９９３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７巻：６９２９〜６９３６頁）から３っのヌクレオチドの変化を含むことが示され、したがって二つのアミノ酸が変化している：Ｈｉｓ２０２→Ａｓｐ；Ｔｈｒ２６６→Ａｌａ。元の鋳型ＤＮＡの配列分析は、これらの変化がゲノムクローンｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２内にも存在しＰＣＲにより導入されないことを示した。
実施例３２
ＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２酵母発現ベクターの構築
プラスミドｐ１４０４９−３７−１（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ１６ Ｌ１）を、ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターとの間で切断するＳｍａＩで消化した。１．４ｋｂｐ ＨＰＶ１６ Ｌ２遺伝子を、鋳型としてのｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２ＤＮＡ、ベントポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）製）、１０サイクルのＰＣＲ増幅（９４℃で１分；４８℃で１分；７２℃で１分４５秒）、およびフランキングＳｍａＩ部位（アンダーライン付）を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。
センスプライマー：５’−ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＧＣ ＧＡＣ ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＡＣ−３’（配列番号１７）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＡＧＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＧＡ−３’（配列番号１８）
センスプライマーは、ＨＰＶ１６Ｌ２開始メチオニンコドン（太字で強調している）の直ぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．４ｋｂＬ２ＰＣＲ生成物を、ＳｍａＩで消化し、ゲル精製し、ＳｍａＩ消化ｐ１４０４９−３７−１ベクターと結合した。ＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２遺伝子の両方を含むｐＣ１／１−ＧＡＬプラスミドを単離し、ｐ１４０４９−４２−２と表した。ｐ１４０４９−４２−２中のＬ２遺伝子を、プリズム・キット（ＰＲＩＳＭ^TM ｋｉｔ（ＡＢＩ，Ｉｎｃ．製））およびＡＢＩ配列分析機（ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）モデル＃３７３Ａを用いて製造者の指示に従って配列決定した。この単離物中のＬ２遺伝子は、正しい公表されているプロトタイプ配列（キルンバウアー（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ）ら，（１９９３）前述）から５つのヌクレオチドの変化を含むことが示され、したがって一つのアミノ酸が変化している：Ｓｅｒ２６９→Ｐｒｏ。ゲノムクローンｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２の配列分析は、この変化が元の鋳型ＤＮＡ内にも存在しＰＣＲにより導入されないことを示した。
実施例３３
Ａ．酵母内におけるＨＰＶ１６ Ｌ１の発現およびＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２の同時発現
プラスミドｐ１４０４９−３７−１（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ１６ Ｌ１）およびｐ１４０４９−４２−２（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株＃１５５８を形質転換した。得られた組換え菌株は、表に示されるように＃１６７８（ＨＰＶ１６−Ｌ１）および＃１６７９（ＨＰＶ１６Ｌ１＋Ｌ２）であった。クローン単離物を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地内で３０℃において６８〜７８時間成長させた。細胞を採取した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、細胞溶解物をイムノブロット分析によりＨＰＶ１６Ｌ１またはＨＰＶ１６Ｌ２タンパクの発現について分析した。総細胞タンパク４０ｍｃｇを含むサンプルを、還元および変性条件下に１０％トリス−グリシンゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター上にエレクトロブロットした。第１抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１Ｌ１融合タンパク（Ｄ．ブラウン（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ）ら，ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）第２０１巻：４６−５４頁）に対するウサギポリクローナル抗血清および第２抗体としてＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（アマーシャム社製）を用いて、ＨＰＶ１６Ｌ１タンパクを免疫検出した。化学ルミネセントＥＣＬデテクションキット（アマーシャム社製）を用いてフィルターを処理した。陰性対照（Ｌ１またはＬ２遺伝子を含まないｐＣ１／１）を除いて全てのサンプルにおいて５０〜５５ｋＤａＬ１タンパクバンドを検出した。第１抗体としてＥ． ｃｏｌｉにおいて発現されるｔｒｐＥ−Ｌ２融合タンパクに対するマウス抗−ＨＰＶ１６Ｌ２血清を用いるイムノブロットにより７０ｋＤａタンパクとしてＬ２タンパクを検出した。第２抗体としてヤギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合（アマーシャム社製）を用い、フィルターを前述のように処理した。
Ｂ．組換えＨＰＶタイプ１６Ｌ１＋Ｌ２カプシドタンパクの精製
特記しない限り全ての工程は４℃で行った。
細胞を−７０℃で凍結貯蔵した。凍結細胞（湿潤重量＝２７．６ｇ）を２０〜２３℃で融解し、４０ｍＬの「Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＭ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に再懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞スラリーを、Ｍ１１０マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マサチューセッツ州ニュートン在マイクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．））中を３回通過させることにより約８０００ｐｓｉの圧力下に破壊した。破壊細胞スラリーを、５０００×ｇで１０分間の遠心分離にかけ細胞破壊物を除去した。Ｌ１＋Ｌ２抗原を含む上澄み液を回収した。
上澄み液を緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を添加することにより１：５に希釈し、緩衝液Ａ中に平衡化されたフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^▲Ｒ▼）ＥＭＤ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）樹脂（ニュージャージー州ギブスタウンＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製）のアニオン交換捕捉カラム（５．０ｃｍＩＤ×４．８ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａによる洗浄に続いて、緩衝液Ａ中０〜１．０ＭＮａＣｌの勾配で抗原を溶出した。イムノドットブロットを行ってカラムからのどのフラクションがＬ１タンパクを含むか決めた。
イムノドットブロットにより決められたＬ１タンパクを含むフラクションを、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法およびその後の銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより全タンパクについて検定した。
同等の純度および多量のＬ１タンパクを示すＴＭＡＥフラクションを溜めた。抗原を硫酸アンモニウム分画により濃縮した。サンプルを、固体試薬を添加しつつ３０分間穏やかに攪拌することにより４８％飽和硫酸アンモニウムに調整した。サンプルを氷の上にのせ、一晩沈降させた。サンプルを１２０００×ｇで遠心分離した。ペレットを２０．０ｍＬのＰＢＳ（燐酸ナトリウム６．２５ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１５０ｍＭ）中に再懸濁させた。
再懸濁ペレットを、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）５００ＨＲ樹脂（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）のサイズ排除カラム（２．６ｃｍＩＤ×８９ｃｍ）でクロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液はＰＢＳとした。フラクションを銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット検出により分析した。最も純度の高いフラクションを溜めた。得られるプールを、４〜６ｐｓｉのＮ₂圧下に４３ｍｍＹＭ−１００平坦シート薄膜（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用いて５０ｍＬ攪拌セル内において濃縮した。
最終生成物を、コロイド状クーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１およびＬ２タンパクは７０％均質であると評価された。Ｌ１およびＬ２タンパクの同一性は適当な抗血清を用いるウエスタンブロットにより確認した。最終生成物を採取し、−７０℃で貯蔵した。このプロセスにより全部で０．５３ｍｇのタンパクを得た。
電子顕微鏡分析をストラクチャープローブ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ）（ペンシルバニア州ウエスト・チェスター社（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ）製）により行った。サンプルの一部を２００メッシュ炭素被覆銅グリッドにのせた。２％ホスホタンスグテン酸（ｐＨ７．０）を一滴をグリッドに２０秒間のせた。グリッドを風乾してからＴＥＭ試験に付した。全ての顕微鏡検査はＪＥＯＬ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．製）を用いて１００ｋｖの加速電圧で行った。顕微鏡写真は最終倍率１０００００ｘとした。５０〜５５ｎｍ寸法範囲のウィルス状粒子の存在が確認された。
Ｃ．組換えＨＰＶタイプ１６ Ｌ１＋Ｌ２カプシドタンパクの精製
全ての工程は特記しない限り４℃で行った。
細胞を−７０℃で凍結貯蔵した。凍結細胞（湿潤重量：＝９２．８ｇ）を２０〜２３℃で融解し、１０５ｍＬの「Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌの１００ｍＭ，ＥＤＴＡ１．７ｍＭ）中に再懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞スラリーを、Ｍ１１０−Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マサチューセッツ州ニュートン在マイクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．））中を３回通過させることにより約１６０００ｐｓｉの圧力下に破壊した。破壊細胞スラリーを、６１００×ｇで１５分間の遠心分離にかけ細胞破壊物を除去した。Ｌ１＋Ｌ２抗原を含む上澄み液を回収した。
上澄み液を緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を添加することにより１：５に希釈し、緩衝液Ａ中に平衡化されたフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^▲Ｒ▼）ＥＭＤ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）樹脂（ニュージャージー州ギブスタウンＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製）のアニオン交換捕捉カラム（５．０ｃｍＩＤ×４．２ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａによる洗浄に続いて、緩衝液Ａ中０〜１．０ＭＮａＣｌの勾配で抗原を溶出した。イムノドットブロットを行ってカラムからのどのフラクションがＬ１タンパクを含むか決めた。
イムノドットブロットにより決められたＬ１タンパクを含むフラクションを、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法およびその後の銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより全タンパクについて検定した。
同等の純度および多量のＬ１タンパクを示すＴＭＡＥフラクションを溜めた。抗原を硫酸アンモニウム分画により濃縮した。サンプルを、固体試薬を添加しつつ１０分間穏やかに攪拌することにより３５％飽和硫酸アンモニウムに調整した。サンプルを氷の上にのせ、４時間沈降させた。サンプルを１２０００×ｇで遠心分離した。ペレットを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０．０ｍＬのＰＢＳ（燐酸ナトリウム６．２５ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１５０ｍＭ）中に再懸濁させた。
再懸濁ペレットを、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）５００ＨＲ樹脂（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）のサイズ排除カラム（２．６ｃｍＩＤ×８９ｃｍ）でクロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液はＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡとした。フラクションを銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット検出により分析した。最も純度の高いフラクションを溜めた。得られるプールを、４〜６ｐｓｉのＮ₂圧下に４３ｍｍＹＭ−１００平坦シート薄膜（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用いて５０ｍＬ攪拌セル内において濃縮した。
最終生成物を、コロイド状クーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１およびＬ２タンパクは７０％均質であると評価された。Ｌ１およびＬ２タンパクの同一性は適当な抗血清を用いるウエスタンブロットにより確認した。最終生成物を採取し、−７０℃で貯蔵した。このプロセスにより全部で３．８ｍｇのタンパクを得た。
実施例３４
Ａ．菌株１６７９（ＨＰＶタイプ１６Ｌ１＋Ｌ２）の発酵
凍結ストック培養の調製、接種、発酵および菌株１６７９の細胞回収に用いられる手順は本質的に前述した通りである。６７時間の培養後、１Ｌ当たり乾燥細胞重量４．２ｇの細胞密度が達成され、回収後、合計で９３ｇの湿潤細胞ペレットが得られた。
Ｂ．菌株１６７８（ＨＰＶタイプ１６Ｌ１）の発酵
凍結ストック培養の調製、接種、発酵および菌株１６７８の細胞回収に用いられる手順は本質的に前述した通りである。７０．５時間の培養後、二つの１０Ｌ発酵液の内容物を溜め（１Ｌ当たり乾燥細胞重量８．７ｇの細胞密度）、回収後、合計で２５８ｇの湿潤細胞ペレットが得られた。
Ｃ．組換えＨＰＶタイプ１６ Ｌ１カプシドタンパクの精製
全ての工程は特記しない限り４℃で行った。
菌株＃１６７８の細胞を細胞を−７０℃で凍結貯蔵した。凍結細胞（湿潤重量＝１２８ｇ）を２０〜２３℃で融解し、１４０ｍＬの「改良Ｌ１緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＭ）中に再懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるようにスラリーに添加した。細胞スラリーを、Ｍ１１０−Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マサチューセッツ州ニュートン在マイクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．））中を３回通過させることにより約１６０００ｐｓｉの圧力下に破壊した。破壊細胞スラリーを、１１０００×ｇで４０分間の遠心分離にかけ細胞破壊物を除去した。Ｌ１抗原を含む上澄み液を回収した。
上澄み液を緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を添加することにより１：５に希釈し、緩衝液Ａ中に平衡化されたフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^▲Ｒ▼）ＥＭＤ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）樹脂（ニュージャージー州ギブスタウンＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製）のアニオン交換捕捉カラム（５．０ｃｍＩＤ×６．４ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａによる洗浄に続いて、緩衝液Ａ中０〜１．０ＭＮａＣｌの勾配で抗原を溶出した。イムノドットブロットを行ってカラムからのどのフラクションがＬ１タンパクを含むか決めた。
イムノドットブロットにより決められたＬ１タンパクを含むフラクションを、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法およびその後の銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより全タンパクについて検定した。
同等の純度および多量のＬ１タンパクを示すＴＭＡＥフラクションを溜めた。抗原を硫酸アンモニウム分画により濃縮した。サンプルを、固体試薬を添加しつつ１０分間穏やかに攪拌することにより３５％飽和硫酸アンモニウムに調整した。サンプルを氷の上にのせ、５時間沈降させた。サンプルを１２０００×ｇで遠心分離した。ペレットを２０．０ｍＬのＰＢＳ（燐酸ナトリウム６．２５ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１５０ｍＭ）中に再懸濁させた。
再懸濁ペレットを、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）５００ＨＲ樹脂（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）のサイズ排除カラム（２．６ｃｍＩＤ×８９ｃｍ）でクロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液はＰＢＳとした。フラクションを銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット検出により分析した。最も純度の高いフラクションを溜めた。得られるプールを、４〜６ｐｓｉのＮ₂圧下に４３ｍｍＹＭ−１００平坦シート薄膜（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用いて５０ｍＬ攪拌セル内において濃縮した。
最終生成物を、コロイド状クーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１タンパクは７０％均質であると評価された。Ｌ１タンパクの同一性は適当な抗血清を用いるウエスタンブロットにより確認した。最終生成物を採取し、−７０℃で貯蔵した。このプロセスにより全部で７．４ｍｇのタンパクを得た。
Ｄ．分析手順
イムノドットブロット手順
サンプルを（必要な場合）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに１：１０に希釈し、サンプル１０ｍｃＬをポリスクリーン（ＰｏｌｙＳｃｒｅｅｎ^TM）ＰＶＤＥ薄膜（マサチューセッツ州ボストン在ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製）に滴下した。スポットが乾燥した後、薄膜を水で洗い、乾燥させた。適当な抗血清をブロッティング緩衝液（６．２５ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ ＮａＮ₃中の５％脱脂ミルク）中に希釈することにより第１抗体溶液を調製した。インキュベーションは２０〜２３℃で少なくとも１時間行った。ブロットはＰＢＳ（６．２５ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を３回交換し、その各々について１分間洗浄した。適当なアルカリホスファターゼ結合複合抗血清をブロッティング緩衝液で希釈することにより第２抗体溶液を調製した。インキュベーションは同じ条件下に少なくとも１時間行った。ブロットは前述のように洗浄し、１ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（イリノイ州ロックフォード在Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて検出した。
検出に用いた抗体は以下のものである：
ＨＰＶ６ａＬ１をＭＡＢ ８３７（カリフォルニア州テメキュラ在Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．製）により検出した。ＨＰＶ６ａＬ２はマウス抗−ＨＰＶ６ａＬ２−ｔｒｐＥ融合血清プール＃６４１および６４７により検出した。ＨＰＶ１６Ｌ１はＭＡＢ ８８５（カリフォルニア州テメキュラ在Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．製）により検出した。ＨＰＶ１６Ｌ２はマウス抗−ＨＰＶ１６Ｌ２−ｔｒｐＥ融合血清プール＃６１１により検出した。
全タンパクのブラッドフォードアッセイ
全タンパクを市販されているクーマシー・プラス・キット（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ＰｌｕｓＲ ｋｉｔ）（イリノイ州ロックフォード在Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて調べた。サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに適当なレベルに希釈した。必要な容量は、標準およびマイクロアッセイプロトコールについてそれぞれ０．１ｍＬおよび１．０ｍＬであった。両方のプロトコールのために、ＢＳＡ（イリノイ州ロックフォード在Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて標準曲線を作成した。アッセイは製造者の勧めに従って行った。標準曲線ブはマッキントッシュＩＩｃｉコンピューター上のクリケットグラフ（ＣｒｉｃｋｅｔＧｒａｐｈ^▲Ｒ▼）ソフトウエアを用いてプロットした。
実施例３５
組換えＨＰＶタイプ１１ Ｌ１カプシドタンパクの精製
全ての工程は特記しない限り４℃で行った。
細胞を−７０℃で凍結貯蔵した。凍結細胞（湿潤重量＝１８０ｇ）を２０〜２３℃で融解し、９００ｍＬの「ブレーキング緩衝液（Ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）」（ＭＯＰＳ５０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ５００ｍＭ，ＣａＣｌ₂ １ｍＭ）中に再懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦおよびペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび１．７μＭになるように添加した。細胞スラリーを、Ｍ１１０−Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マサチューセッツ州ニュートン在マイクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．））中を４回通過させることにより約１６０００ｐｓｉの圧力下に破壊した。充分な容量の１０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００^▲Ｒ▼界面活性剤（イリノイ州ロックフォード在Ｐｉｅｒｃｅ製）を添加して細胞スラリーを破壊してＴＸ１００の濃度を０．５％にした。スラリーを２０時間攪拌した。トリトンＸ１００処理溶解物を１２０００×ｇで４０分間の遠心分離にかけ細胞破砕物を除去した。Ｌ１タンパクを含む上澄み液を回収した。
３００Ｋのタンジェンシャルフロー薄膜カセット（マサチューセッツ州ノースボロウ在Ｆｉｌｔｒｏｎ製）を用いて５つの溶液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，０．５Ｍ ＮａＣｌ）に対して上澄み液を透析ろ過した。薄膜により保持された物質は、ラジオイムノアッセイおよびウエスタンブロッティングによりＬ１タンパクを含むことが示された。
保持物を、２０ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，０．５Ｍ ＮａＣｌ中に平衡化されたＳＰスフェロデックス（Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ）（Ｍ）^▲Ｒ▼樹脂（フランス国Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ在ＩＢＦ製）の高分離能親和性カラム１１．０ｃｍＩＤ×５．３ｃｍ）に添加した。平衡緩衝液による洗浄および２０ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１．０Ｍ ＮａＣｌによる１工程洗浄に続いて、Ｌ１タンパクを１工程洗浄液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，２．５Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。洗浄および溶出中にフラクションを収集した。カラムフラクションを、ブラッド法により全タンパクについて検定した。次にフラクションをウエスタンブロットおよびコロイド状クーマシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。フクションはラジオイムノアッセイによっても分析した。
同等の純度および多量のＬ１を示すＳＰスフェロデックスフラクションを溜めた。
最終生成物をウエスタンブロットおよびコロイド状クーマシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１タンパクは、クーマシー染色ゲルの濃度測定により９０％以上均質であることが示された。Ｌ１タンパクの同一性はウエスタンブロットにより確認した。最終生成物を０．２２μｍの薄膜を通して無菌的に濾過して４℃で貯蔵した。このプロセスにより合成２０２ｍｇのタンパクを得た。
電子顕微鏡分析をストラクチャープローブ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ）（ペンシルバニア州ウエスト・チェスター社（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ）製）により行った。サンプルの一部を２００メッシュ炭素被覆銅グリッドにのせた。２％ホスホタングステン酸（ｐＨ７．０）を一滴をグリッドに２０秒間のせた。グリッドを風乾してからＴＥＭ試験に付した。全ての顕微鏡検査はＪＥＯＬ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．製）を用いて１００ｋｖの加速電圧で行った。顕微鏡写真は最終倍率１０００００ｘとした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットアッセイ
全てのゲル、緩衝液および電気泳動装置はノヴェックス社（Ｎｏｖｅｘ）（カリフォルニア州サンジエゴ在）から得られ、製造者の勧めに従って操作した。簡単に言えば、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏ中に等タンパク濃度に希釈し、２００ｍＭ ＤＴＴを含むサンプルインキュベーション緩衝液と１：１に混合した。サンプルを１００℃で１５分間インキュベートし、予め作製しておいた１２％トリス−グリシンゲル上にのせた。サンプルを１２５Ｖで１時間４５分間電気泳動した。ゲルは、市販のキット（マサチューセッツ州ネイチック（Ｎａｔｉｃｋ）在Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてコロイド状クーマシー染色により発色させた。
ウエスタンブロットのために、タンパクを２５Ｖで４０分間、ＰＶＤＦ薄膜に移動させた。薄膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ＿Ｈ₂Ｏで洗浄し風乾した。第１抗体は、ＴｒｐＥ−ＨＰＶ１１Ｌ１融合タンパク（ブラウン（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ）博士から入手）に対するポリクローナルウサギ抗血清であった。この抗体溶液は、抗血清をブロッティング緩衝液（６．２５ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ ＮａＮ₃中の５％脱脂ミルク）に希釈することにより調製した。インキュべーションは２０〜２３℃で少なくとも１時間行った。ブロットはＰＢＳを３回交換し、そのの各々について１分間洗浄した（６．２５ｍＭ燐酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）。ヤギ抗−ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合複合抗血清（イリノイ州ロックフォード在Ｐｉｅｒｃｅ製）をブロッティング緩衝液で希釈することにより第２抗体溶液を調製した。インキュベーションは同じ条件下に少なくとも１時間行った。ブロットは前述のように洗浄し、１ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（イリノイ州ロックフォード在Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて検出した。
実施例３６
酵母内におけるＨＰＶ１８ Ｌ１およびＬ２の発現
プラスミドｐ１９１−６（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ１８Ｌ１）およびｐ１９５−１１（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ１８Ｌ１＋Ｌ２）を用いてＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株＃１５５８（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２−０４，ｐｒｂｌ：：ＨＩＳ３，ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３，ａｄｅｌ，ｃｉｒ°）を形質転換した。クローン単離物を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地内で３０℃で８８時間成長させた。細胞を採取した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、細胞溶解物をイムノブロット分析によりＨＰＶ１８Ｌ１および／またはＨＰＶ１８Ｌ２タンパクの発現について分析した。全細胞タンパク２５μｇを含むサンプルを、変性条件下に１０％トリス−グリシンゲル（ノヴェックス社製）上で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター上にエレクトロブロットした。第１抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１Ｌ１融合タンパク（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら，ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）第２０１巻：４６−５４頁）に対するウサギ抗血清および第２抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（アマーシャム社製）を用いて、Ｌ１タンパクを免疫検出した。化学ルミネセントＥＬＣ^TMデテクションキット（アマーシャム社製）を用いてフィルターを処理した。Ｌ１およびＬ１＋Ｌ２同時発現体酵母クローン（それぞれ菌株１７２５および１７２７）の両方において５０〜５５ｋＤａＬ１タンパクバンドを検出し、陰性対照（Ｌ１またはＬ２遺伝子を含まないｐＧＡＬ１−１０）では検出されなかった。
第１抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１８ Ｌ２融合タンパクに対するヤギポリクローナル抗血清を用い次にＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（メリーランド州ガイザーブルク在Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いてウエスタンブロットによりＨＰＶ１８Ｌ２タンパクを検出した。フィルターを前述のように処理した。Ｌ１＋Ｌ２同時発現体酵母クローン（菌株１７２７）において７５ｋＤａタンパクバンドとしてＬ２タンパクが検出されたが、陰性対照またはＬ１発現クローンでは検出されなかった。
実施例３７
ＨＰＶ１８Ｌ１（菌株１７２５）および１８Ｌ１＋ΔＬ２（菌株１７２７）の発酵
菌株１７２５および１７２７の平板培養の表面成長部分を、１リッター当たり、アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない８．５ｇのディフコ（Ｄｉｆｃｏ）酵母窒素塩基；０．２ｇのアデニン；０．２ｇのウラシル；１０ｇのコハク酸；５ｇの硫酸アンモニウム；４０ｇのグルコース；０．２５ｇのＬ−チロシン；０．１ｇのＬ−アルギニン；０．３ｇのＬ−イソロイシン；０．０５ｇのＬ−メチオニン；０．２ｇのＬ−トリプトファン；０．０５ｇのＬ−ヒスチジン；０．２ｇのＬ−リシン；０．３ｇのＬ−フェニルアラニンを含むロイシン非含有液体培地に無菌的に移し、この培地は滅菌前にＮａＯＨでｐＨ５．０〜５．３に調整した。回転振盪器で２８℃、２５０ｒｐｍで成長させた後、滅菌グリセロールを最終濃度１７％（ｗ／ｖ）になるように添加することにより凍結培養バイアルを調製し、−７０℃で貯蔵（クリオバイアル当たり１ｍＬ）した。接種は同じ培地で行い（２Ｌフラスコ当たり５００ｍＬ）、凍結培養バイアルの融解内容物を移すことにより開始し、回転振盪器で２８℃，２５０ｒｐｍで２５時間培養した。各菌株発酵は、接種後に有効容積１０Ｌのニュー・ブランスヴィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）ＳＦ−１１６発酵器を用いた。製造培地は、１リッター当たり、２０ｇのディフコ酵母抽出物；１０ｇのシェフィールド・ハイソイ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ＨｙＳｏｙ）ペプトン；２０ｇのグルコース；２０ｇのガラクトース；０．３ｍＬのユニオン・カーバイド・ＵＣＯＮ ＬＢ−６２５消泡剤を含み、培地は滅菌前にｐＨ５．３に調整した。２Ｌ接種フラスコの全内容物（５００ｍＬ）を発酵器に移し、それを２８℃で、１分当たり５Ｌの空気を導入し、４００ｒｐｍ、３．５ｐｓｉの圧力で培養した溶解酸素レベルを飽和の４０％以上に維持するために必要に応じて攪拌を激しくした。発酵の進行は、オフライングルコース測定器（ベックマン・グルコース・２・アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｌｕｃｏｓｅ２ Ａｎａｌｙｚｅｒ））およびオンラインマススペクトル測定器（パーキン−エルマー１２００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １２００））によりモニターした。６６時間の培養後、１Ｌ当たり９．５〜９．７ｇの乾燥細胞重量の細胞密度に達した。培養物を中空繊維濾過器（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＤＣ−１０濾過システムにおけるアミコンＨ５ＭＰＯ１−４３カートリッジ）により約２Ｌに濃縮し、２Ｌの燐酸緩衝塩水で透析濾過し、さらに濃縮（約１Ｌに）してから、５００ｍＬの遠心分離瓶に分配した。細胞ペレットを８０００ｒｐｍにて４℃で２０分間の遠心分離（ソーバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＧＳ３ローター）により収集した。上澄みを傾瀉した後、ペレット（合計で１９１〜２０８ｇの湿潤細胞）を使用するまで−７０℃で貯蔵した。
実施例３８
組換えＨＰＶタイプ１８Ｌ１カプシドタンパクの精製
特記しない限り全ての工程は４℃で行った。
細胞を−７０℃で凍結貯蔵した。凍結細胞（湿潤重量＝１２６ｇ）を２０〜２３℃で融解し、７０ｍＬの「ブレーキング緩衝液」（燐酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１００ｍＭ）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａを、最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１．７μＭになるように添加した。細胞スラリーを、Ｍ１１０−Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マサチューセッツ州ニュートン在マイクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．））中を４回通過させることにより約１６０００ｐｓｉの圧力下に破壊した。破壊細胞スラリーを、１２０００×ｇで４０分間の遠心分離にかけ細胞破砕壊物を除去した。Ｌ１抗原を含む上澄み液を回収した。
上澄み液を緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を添加することにより１：５に希釈し、緩衝液Ａ中に平衡化されたフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^▲Ｒ▼）ＥＭＤ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）樹脂（ニュージャージー州ギブスタウンＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製）のアニオン交換捕捉カラム（９．０ｃｍＩＤ×３．９ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａによる洗浄に続いて、緩衝液Ａ中０〜１．０ＭＮａＣｌの勾配で抗原を溶出した。カラムフラクションを、ブラッドフォード法により全タンパクについて検定した。フラクションを、ウエスタンブロットおよび銀染色検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより等量の全タンパク負荷で分析した。
同等の純度および多量のＬ１タンパクを示すＴＭＡＥフラクションを溜めた。抗原を硫酸アンモニウム分画により濃縮した。溶液を、固体試薬を添加しつつ１０分間穏やかに攪拌することにより３５％飽和硫酸アンモニウムに調整した。サンプルを氷の上にのせ、４時間沈降させた。サンプルを１６０００×ｇで４５分間遠心分離した。ペレットを２０．０ｍＬのＰＢＳ（燐酸ナトリウム６．２５ｍＭ，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ１５０ｍＭ）中に再懸濁させた。
再懸濁ペレットを、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）５００ＨＲ樹脂（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）のサイズ排除カラム（２．６ｃｍＩＤ×８９ｃｍ）でクロマトグラフィーにかけた。ランニング緩衝液はＰＢＳとした。フラクションをウエスタンブロットおよび銀染色検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。最も純度の高いフラクションを溜めた。得られたプールを、４〜６ｐｓｉのＮ₂圧下に４３ｍｍＹＭ−１００平坦シート薄膜（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用いて５０ｍＬ攪拌セル内にて濃縮した。
最終生成物を、ウエスタンブロットおよびコロイド状クーマシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１タンパクは５０〜６０％均質であると評価された。Ｌ１タンパクの同一性はウエスタンブロットにより確認した。最終生成物をアリコートに分けて、−７０℃で貯蔵した。このプロセスにより全部で１２．５ｍｇのタンパクを得た。
実施例３９
免疫原性組成物の調製
精製ＶＬＰを医薬上許容できる担体、安定剤またはワクチンアジュバントを混合することのような既知の方法により調製する。本発明の免疫原性ＶＬＰは、例えばＰＢＳ、塩水または蒸留水のような生理的に許容できる組成物と組み合わせることによりワクチン用に調製することができる。免疫原性ＶＬＰは、所望の免疫原性効果を得るために、約０．１−１００μｇ、好ましくは約１〜約２０μｇの量で投与される。組成物当たりのＶＬＰの量は、限定されないが個体の症状、体重、年齢および性別を含む種々の因子により変化し得る。ＶＬＰ組成物の投与は、限定されないが経口，皮下、局所、粘膜および筋肉内を含む種々の経路によることができる。そのようなＶＬＰ製剤は、一種類のタイプのＶＬＰ（すなわちＨＰＶ６ａからのＶＬＰ）またはＶＬＰの混合物（すなわちＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８からのＶＬＰ）からなり得る。
必要に応じて、抗菌防腐剤、例えばチメロサールが存在してよい。本発明の免疫原性抗原は、望まれる場合、ワクチン安定剤およびワクチンアジュバントと組み合わせて用いることができる。典型的な安定剤は特異的化合物、例えばヘパリン、イノシトールヘキサスルフェート、硫酸化ベータ−シクロデキストリンのようなポリアニオン、特異性の劣る賦形剤、例えばアミノ酸、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、グリセロール、スクロース、デキストロースおよびトレハロースであり、溶液条件、例えば中性ｐＨ、高イオン強度（約０．５〜２．０Ｍ塩）、二価カチオン（Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺）により変化する。アジュバントの例はＡｌ（ＯＨ）₃およびＡｌ（ＰＯ₄）である。本発明のワクチンは冷蔵または凍結乾燥状態で保存することができる。
実施例４０
ＶＬＰに対する抗体の調製
抗体を調製するために精製ＶＬＰを用いる。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびに抗原またはハプテンと結合することのできるＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）₂フラグメントのような前記抗体のフラグメントを含む抗体は、限定されないが組換えＶＬＰの精製、天然Ｌ１またはＬ２タンパクの精製を含む種々の方法やキットに使用される。キットは、少なくとも一つの容器を密閉して保持するのに適当な区画化された担体を含む。担体は、さらに、ＨＰＶまたはＨＰＶのフラグメントまたはＨＰＶに対する抗体の検出に適するＶＬＰまたは抗−ＶＬＰ抗体のような試薬を含む。担体はまた、標識された抗原または酵素基質等のような検出手段を含み得る。抗体またはＶＬＰまたはキットは、限定されないが法医学分析および疫病研究を含む種々の目的に有用である。

Claims (3)

1. （ａ）精製されたヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のウイルス様粒子の製造方法であって、
   （ａ）ＨＰＶＬ１タンパク質又はＨＰＶＬ１＋Ｌ２タンパク質をコードするＤＮＡ分子で酵母を形質転換して形質転換酵母細胞を形成し、
   （ｂ）組換えタンパク質の生産を可能とし、それが自発的に集合してウイルス様粒子となる条件下で前記形質転換細胞を培養し、
   （ｃ）前記形質転換細胞からウイルス様粒子を集め、
   （ｄ）前記ウイルス様粒子を少なくとも１回のクロマトグラフィー工程により精製することを特徴とする前記製造方法。
2. 酵母がサッカロミセス セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１に記載の方法。
3. ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）タンパク質が、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８からなる群から選択される請求項１に記載の方法。

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