CZ336696A3 - Isolated and purified proteins of papillomavirus and process for preparing thereof - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká izolovaných a čištěných bílkovin papillomaviru a vektorů pro expresi rekombinantních bílkovin LI a L2 tohoto viru.

Dosavadní stav techniky

K infekcím uvedeným virem dochází u celé řady živočichů, včetně člověka, ovce, psa, kočky, králíka, opice, krávy a také u hadů. Virus infikuje epiteliální buňky a obvykle vyvolává tvorbu benigních epitheliálních nebo fibroepitheliálních nádorů v místě infekce. Viry jsou specifické pro určité čeledi, například lidský papillomavirus nemůže infikovat jiné živočichy.

Papillomaviry je možno klasifikovat do různých skupin v závislosti na hostiteli, které je virus schopen infikovat. Lidské papillomaviry, HPV je dále možno zařadit do více než 60 typů na bázi homologie sekvence DNA, jak bylo popsáno v souhrnné publikaci Popollomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press, lne., 1990. Papillomaviry jsou rovněž specifické, pokud jde o tento typ, takže neutralizační imunita k infekci určitým typem tohoto viru neznamená současně imunitu proti jinému typu viru.

U člověka způsobují různé typy HPV odlišná onemocnění. HPV typu 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 způsobují tvorbu benigních bradavic u zdravých jedinců i u jedinců s narušeným imunitním systémem. HPV typu 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, až 25, 36 a 46 až 50 způsobují plochá poškození u lidí s narušeným imunitním systémem. HPV typu 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až 55 způsobují tvorbu nemaligních kondylomů na sliznici genitálního nebo respiračního systému. HPV typu 15 a 18 vyvolávají epitheliální dysplasii sliznice pohlavních orgánů a jsou spojeny převážně s tvorbou invazivních karcinomů, vznikajících in šitu v pochvě, děložním krčku, vulvě a v analním kanálu. HPV5 a HPV11 způsobuje vide než 90 % všech kondylomů v genitální oblasti a papilomů hrtanu. Nejčastěji se vyskytujícím podtypem HPV typu 6 je HPV6a.

Imunologické studie u živočichů prokázaly, že tvorba neutralizačních protilátek proti antigenůin papillomaviru může zabránit infekci homologním virem. Vývoj účinné vakcíny proti tomuto viru byl zpomalen v důsledku obtíží, které jsou spojeny s pěstováním těchto virů in vitro. Dále pak byl vývoj účinné vakcíny proti HPV zpomalen skutečností, že neexistuje vhodný živočišný model.

Neutralizace papillomaviru protilátkami je patrně typově specifická a závislá na základních epitopech na povrchu určitého typu viru.

Papillomaviry jsou malé viry velikosti 50 až 60 nm, neopouzdřené DNA viry ve tvaru dvacetistěnu, s kódovými sekvencemi pro až 8 časných a 2 pozdní geny. Otevřené čtecí rámce ORF genomu viru jsou označeny El až E7 a LI a L2, kde E znamená časný a L znamená pozdní. LI a L2 jsou kódové sekvence pro bílkoviny kapsidu viru. Časné geny jsou spojeny s určitou funkcí, například replikací virů a jeho transformací uvnitř buněk.

Bílkovina LI je hlavní bílkovina kapsidu s molekulovou hmotností 55 000 až 60 000. Bílkovina LI je bílkovina kapsidu, vyskytující se v menším množství, s předpokládanou molekulovou hmotností 55 000 až 60 000 a zjevnou molekulovou hmotností 75 000 až 100 000 při stanovení slektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Podle imunologických údajů je možno předpokládat, že většina bílkoviny L2 je uložena uvnitř vzhledem k bílkovině LI. Bílkoviny L2 jsou u různých virů vysoce konzervovány, zvláště jde o 10 bazických aminokyselin na C-zakončení. LI ORF je vysoce konzervován u různých papillomavirů.

Geny LI a L2 byly užity pro tvorbu vakcín pro prevenci a léčení infekcí těmito viry u živočichů. Zhou a další, 1991, 1992 klonovaly HPV, geny typu 16, LI a L2 ve vakcinia viru jako vektoru a pak infikovaly rekombinantním vektorem savčí buněčný materiál CV-1 za vzniku částic, podobných viru a označovaných VLP.

Byly izolovány rekombinantní LI a L2 papillomavirů skotu, odvozené od bakterií. Neutralizační séra proti rekombinantním bakteriálním bílkovinám reagovaly s nativním virem, pravděpodobné vzhledem k rozdílu mezi nativními a z bakterií odvozenými bílkovinami však byla reaktivita velmi nízká.

Rekombinantní baculoviry, u nichž docházelo k expresi HPV6 LI, HPV11 LI, HPV16 LI, HPV18 LI, HPV31 LI nebo HPV16 L2 ORF byly použity k infekci hmyzích buněk SF9 a k produkci bílkovin LI a L2. Analýza Western Blot prokázala, že bílkoviny LI a L2, odvozené od baculoviru, reagují s protilátkou proti HPV16. LI, po odvození od baculoviru vytváří částice, podobné viru, VLP.

Carter a další, 1991 prokázali produkci bílkovin HPV16 LI a HPV16 L2 rekombinantním kmenem Saccharomyces cerevisia. Tito sutoři rovněž prokázali produkci bílkovin HPV6b LI a

L2. Bílkovina HPV6b LI neměla plnou délku bílkoviny LI. Rekombinantní bílkoviny byly produkovány uvnitř buněk, avšak byly také z buněk vylučovány. Molekulová hmotnost rekombinantních bílkovin LI a L2 byla,obdobná jako u přírodních bílkovin. V případě, že k expresi bílkovin došlo uvnitř buněk, byla většina těchto bílkovin nerozpustná i po rozrušení buněk v nepřítomnosti denaturačních reakčních činidel. Přesto že tato nerozpustnost může usnadnit čištění bílkoviny, může také zabránit analýze nativních epitopů těchto bílkovin.

Bylo prokázáno, že rekombinantní bílkoviny, vylučované kvasinkami, obsahují uhlohydráty, odvozené od těchto kvasinek. Přítomnost takových N-vázaných oligosacharidů může maskovat přítomnost nativních epitopů. Mimoto mohou vylučované rekombinantní bílkoviny obsahovat další modifikace, například retenci sekreční vedoucí sekvence.

Je zřejmé, že by bylo zapotřebí vyvinout způsoby, jimiž by bylo možno získat velké množství bílkoviny papillomaviru jakéhokoliv typu pěstováním rekombinantních kvasinek. Bylo by rovněž žádoucí získat velké množství těchto bílkovin se stejnými vlastnostmi jako nativní bílkoviny, pokud jde o vyvolání imunity.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří izolované a čištěné bílkoviny papillomaviru ze skupiny LI, L2, LI + L2 a jejich funkční deriváty s čistotou nejméně 50 %.

Vynález se také týká způsobu výroby rekombinantních bílkovin papillomaviru se schopností přenášet imunitu, odpovídající nativním bílkovinám. Vynález se také týká způsobu výroby vakcíny pro preventivní i léčebné použití proti infekci uvedeným virem. Rekombinantní bílkoviny podle vynálezu mají schopnost tvořit částice, podobné viru, VLP. Tyto částice jsou imunogenní a na živočišném modelu zabrání tvorbě bradavic. Podle vynálezu se užívá králičího papillomaviru CRPV a HPV typu 6 (podtyp 6a) jako modelových systémů

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn obousměrný vektor pro expresi v kvasinkách, užitý pro expresi bílkovin kapsidu papillomaviru LI a/nebo L2.

Na obr v kvasinkách je znázorněna exprese bílkoviny LI HPVóa (immunoblot).

Na obr. 3 je znázorněna exprese bílkoviny L2 HPVóa v kvasinkách (immunoblot). Dráha 1: molekulová hmotnost značení. Dráha 2: složená bílkovina trpE-L2 po expresi v E. coli jako positivní kontrola. Dráha 4: HPVóa LI po expresi v kvasinkách jako negativní kontrola. Dráha 5: H?V6a L2 po expresi v kvasinkách (podrobnější údaje budou dále uvedeny).

Na obr. 4 je znázorněna mikrofotograíie HPV6a LI VLP po expresi v kvasinkách v elektronovém mikroskopu.

Na obr. 5 je znázorněna mikrofotograíie HPV6a L1/L2 VLP po expresi v kvasinkách v elektronovém mikroskopu.

Na obr. 6 je znázorněn imunoblot CRPV LI, L2 a L1+L2 po expresi těchto bílkovin v kvasinkách.

Část A: exprese CRPV LI, měření podle reaktivity s antiserem proti CRPV LI.

.Část 3: exprese CRPV L2, měření podle reaktivity s antiserem proti CRPV L2.

Dráha 1: značení molekulové hmotnosti po hodnotách 1000 (Amersham Rainbow Markers, 14 300 az 200 000).

Dráha 2: BL5462 s obsahem vektoru pro expresi CRPV LI.

Dráha 3: kmen 1569 s obsahem vektoru pro expresi CRPV L2. Dráhy a a 5: dva izoláty kmene 1569, současně transformovaného dvěma plasmidy pro expresi CRPV LI a CRPV L2.

Dráhy 6 až 8: tři izoláty kmene 1569 ', obsahující jediný vektor pro současnou expresi bílkovin CRPV LI a L2.

Dráhy 9 a 10: dva izoláty BJ5462, obsahující jediný vektor . pro současnou expresi bílkovin CRPV LI a L2.

Poloha migrace LI a L2 je značena na pravé ose příslušné části obr. 6.

Na obr. cerevisiae

Na obr. cerevisiae je schematicky znázorněna konstrukce kmene 1558.

je schematicky znázorněna konstrukce kmene 1569 .

Na obr. 9 jsou uvedeny hlavní stupně čisticího postupu.

Na obr. 10 je uveden seznam rekombinantních kmenů kvasinek, u nichž dochází k expresi bílkovin LI a/nebo L2.

Na obr. 11 jsou znázorněny analýzy čištěných bílkovin HPV16 LI + L2 z kvasinek při použití SDS-PAGE. Kromě konečné čištěné frakce VLP jsou uvedeny také frakce z mezistupně. V každé dráze je identifikován vzorek. Je uveden gel, barvený barvivém Coomassie a také Western blot s použitím antiser proti bílkovinám LI a L2.

Na obr. 12 je schematicky znázorněn další možný způsob čištění LI z CRPV VLP.

Na obr. 13 a 14 jsou znázorněny analýzy čištěných částic VLP při použití SDS/PAGE.

Vynález se tedy týká postupů a prostředků pro charakterizaci, detekci, prevenci a léčení infekcí papillomavirem PV. Postupy jsou založeny na produkci rekombinantních bílkovin LI, L2 nebo LI + L2 v kvasinkách. Tyto rekombinantní bílkoviny mohou napodobit neutralizační epitopy nativního PV. Rekombinantní bílkoviny LI nebo LI + L2 mohou také vytvářet částice, podobné virům, VLP. Prostředek podle vynálezu obsahuje kódové rekombinantní molekuly DNA pro bílkoviny LI nebo L2 nebo LI + L2, rekombinantní bílkoviny jako takové nebo v kombinaci s dalšími rekombinantními bílkovinami, VLP s obsahem nejméně jedné rekombinantní bílkoviny, fragmenty těchto rekombinantních bílkovin, prostředky zahrnují také farmaceutické prostředky s obsahem rekombinantních bílkovin, vakcíny s obsahem rekombinantních bílkovin, .protilátky proti rekombinantním bílkovinám nebe VLP, imunogenní prostředky s obsahem nejméně jedné rekombinantní bílkoviny a diagnostické balíčky s obsahem rekombinantních molekul DNA nebo rekombinantních bílkovin. Způsoby podle vynálezu se týkají produkce rekombinantní bílkoviny transformací příslušných kvasinek rekombinantní molekulou DNA a pěstováním transformovaných kvasinek za podmínek, při nichž může dojít k expresi této DNA za produkce rekombinantní bílkoviny s následným čištěním této bílkoviny. Takto získané rekombinantní bílkoviny je možno podávat živočichům, včetně člověka, podávat je možno také prostředky s obsahem těchto bílkovin nebo VLP. Hostitelské buňky zahrnují kmeny kvasinek z rodů Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces a Hansenula.

K infekci papillomavirem může dojít u celé řady živočichů, včetně lidí, ovcí, psů, koček, králíků, opic, hadů a krav. Papillomaviry infikují epitheliální buňky a obvykle způsobují v místě infekce tvorbu benigních epitheliálních nebo fibroepitheliálních nádorů.

Papillomaviry je možno klasifikovat do různých skupin v závislosti na hostiteli, které je virus schopen infikovat Lidské papillomaviry, HPV je dále možno zařadit do více než 60 typů na bázi homologie sekvence DNA, jak bylo popsáno v souhrnné publikaci Popollomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.) ,. CRC Press,. Inc.., 1990. Papillomaviry jsou rovněž specifické, pokud jde o tento typ, takže neutralizač ní imunita k infekci určitým typem tohoto viru neznamená současně imunitu proti jinému typu viru.

U člověka způsobují různé typy HPV odlišná onemocnění HPV typu 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 způsobují tvorbu benigních bradavic u zdravých jedinců i u jedinců s narušeným imunitním systémem. HPV typu 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, až 25, 36 a 46 až 50 způsobují plochá poškození u lidí s narušeným imunitním systémem. HPV typu 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až 55 způsobují tvorbu nemaligních kondylomů na sliznici genitálního nebe respiračního systému. HPV typu 16 a 13 vyvolávají epitheliální dysplasii sliznice pohlavních orgánů a jsou spojeny převážně s tvorbou invazivních karcinomů, vznikajících in šitu v pochvě, děložním krčku, vulvě a v analním kanálu. HPV6 a HPV11 způsobuje vide než 90 % všech kondylomů v genitální oblasti a papilomu hrtanu.

Imunoldgické studie u živočichů prokázaly, že tvorba neutralizačních protilátek proti antig-enůin papillomaviry může zabránit infekci homologním virem. Vývoj účinné vakcí9 ny proti tomuto viru byl zpomalen v důsledku obtíží, které jsou spojeny s pěstováním těchto virů in vitro. Dále pak byl vývoj účinné vakcíny proti HPV zpomalen skutečností, že neexistuje vhodný živočišný model.

Neutralizace papillomaviru protilátkami je patrně typově specifická a závislá na základních epitopech na povrchu určitého typu viru.

Papillomaviry jsou malé viry velikosti 50 až 60 nm, neopouzdřené DNA viry ve tvaru dvacetistěnu, s kódovými sekvencemi pro až 8 časných a 2 pozdní geny. Otevřené čtecí rámce ORF genomu viru jsou označeny El až E7 a LI a L2, kde E znamená časný a L znamená pozdní. LI a L2 jsou kódové sekvence pro bílkoviny kapsidu viru. Časné geny jsou spojeny s určitou funkcí, například replikací virů a jeho transformací uvnitř buněk.

Bílkovina LI je hlavní bílkovina kapsidu a má molekulovou hmotnost 55 000 až 50 000. Bílkovina 12 se v kapsidu vyskytuje v menším množství, její předpokládaná molekulová hmotnst je 55 000 až 60 000 a zjevná molekulová hmotnost 75 000 až 100 000 při stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu.

Byly již podány zprávy o produkci bílkovin HPV16 LI, HPV16 L2 a HPV6 LI rekombinantními kmeny Saccharomyces cerevisiae. Bylo by vhodné vyvinout způsoby pro výrobu velkého množství bílkovin papillomaviru jakéhokoliv typu pěstováním rekombinantních kvasinek. Bylo by také vhodné získat velké množství bílkovin papillomaviru s imunitními vlast nostmi nativních bílkovin, například se schopností vyvolat imunitu proti infekci virem.

Vynález se týká způsobu výroby takových bílkovin a jejich použití. Vynález se zvláště týká výroby profylaktické vakcíny proti infekci uvedeným virem. K tomuto účelu byly využity kmeny virů CRPV králičího původu a kmeny HPV6 lidského původu jako modelové systémy. Je zřejmé, že obecný postup podle vynálezu je platný i pro další typy a podtypy papillomaviru PV včetně HPV typu 11, HPV typu 16 a HPV-typu 18, stejně jako HPV podtyl 6a a HPV podtyl 6b.

Farmaceutické prostředky s obsahem bílkovin nebo VLP je možno připravit známými postupy, například přidáním přijatelného nosiče. Příklady takových postupů a nosičů je možno nalézt v publikaci Remington s Pharmaceutical Sciences. Farmaceutický prostředek pro toto použití bude obsahovat účinné množství bílkoviny nebo VLP, tyto látky mohou být odvozeny od jedinoého typu nebo od většího počtu typů HPV.

Prostředky k diagnostickým nebo léčebným účelům podle vynálezu se podávají v množství, dostatečném k léčení nebo diagnostice infekce PV. Účinné množství může záviset na řadě faktorů, jako jsou celkový stav nemocného, hmotnost, pohlaví a věk, nebo také způsob podání. Obvykle se budou dávky pohybovat v rozmezí 1 až 250 mikrogramů.

Farmaceutické prostředky je možno podávat podkožně, místně, perorálně, na sliznici nebo nitrosvalově.

Vakcíny podle vynálezu obsahují rekombinantní bílkoviny nebo VLP s obsahem antigenních determinant, potřebných k vyvolání tvorby neutralizačních protilátek u hostitele. Vakcíny jsou dostatečně bezpečné pro podávání bez nebezpečí klinické infekce, nemají toxické vedlejší účinky, jsou stálé, kompatibilní s běžnými nosiči a je možno je podávat účinným způsobem.

Vakcíny je možno podávat různými cestami, například perorálně, parenterálně, podkožně, na sliznici nebo nitrosvalově. Podávaná dávka se může měnit v závislosti na celkovém stavu, pohlaví, hmotnosti a věku nemocného, na způsobu podání a na typu PV ve vakcíně. Vakcína může mít formu kapslí, suspenze, elixíru nebo roztoku. Může být zpracována spolu s imunologicky přijatelným nosičem.

Vakcíny se podávají v množství, dostatečném pro vyvolání ochranné odpovědi. Toto množství se může měnit v závislosti na použitém typu PV, vakcínu je možno podat ve formě jednotlivé nebo opakované dávky.

Způsoby podle vynálezu umožňují tvorbu vakcíny při použití menších prvků než virů pro prevenci infekce PV.

Při použití těchto postupů je možno připravit monovalentní nebo vícevalentní vakcíny. Například monovalentní vakcínu HPV typ 16 je možno připravit použitím rekombinantní bílkoviny HPV 16 LI nebo L2 nebo LI + L2. Vícevalentní vakcínu je možno připravit smísením LI nebo L2 nebo LI + L2 nebo VLP různých typů HPV.

Rekombinantní bílkoviny a VLP podle vynálezu je možno využít k vytvoření imunogenních prostředků. Tyto prostředky jsou po podání příslušnému hostiteli schopné vyvolat odpověď imunitního systému.

Rekombinantní bílkoviny a VLP je možno využít ke tvorbě protilátek. Může jít o polyklonální a monoklonální protilátky a také o jejich fragmenty, například o fragmenty Fv, Fab a FCabJg, schopné se vázat na antigen nebo na hapten.

Rekombinantní bílkoviny, VLP a protilátky podle vynálezu je také možno použít k sériovému vyšetření serotypů

HPV a infekcí těmito serotypy. Rekombinantní bílkoviny, VLP a protilátky mohou tvořit součást zkušebního balíčku , použitelného pro detekci a určení serotypů HPV. Takový zkušební balíček bude obsahovat nosič, uložený v zásobníku spolu s reakčními činidly, jako rekombinantní bílkovinou HPL nebo VLP nebo protilátkou proti HPV, vhod nou pro detekci různých typů HPV. Nosič může také obsaho vat prostředky pro detekci, například značený antigen, substráty pro enzymy a podobně.

Rekombinantní bílkoviny a VLP podle vynálezu je možno využít také jako značící látky pro určení molekulo vé hmotnosti.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava kmene kvasinek U9

Kmen kvasinek Saccharomyces cerevisiae 3150-2-3 (MATa, leu-2-04, adel, cir°) byl získán od Dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle, WA). Buňky kmene 2150-2-3 byly pěstovány přes noc při teplotě 30 C v 5 ml prostředí YEHD podle publikace Carty a další, J. Ind. Micro, 2, 1987, 117 - 121. Buněčný materiál se třikrát promyje sterilní destilovanou vodou, znovu se uvede do suspenze ve 2 ml sterilní destilované vody a 0,1 ml buněčné suspenze se nanese na každou ze šesti ploten, obsahujících kyselinu 5-fluororotovou, FOA, k selekci mutant ura3 (Čolci Spring Harbor Laboratory Manual of Yest Genetics). Plotny byly inkubovány při teplotě 30 °C. Prostředí obsahovalo ve 250 ml destilované vody 3,5 g základních dusíkatých látek (Difco) bez aminokyselin a síranu amonného, 0,5 g kyseliny 5-fluororotové, 25 mg uracilu a 10,0 g dextrosy.

Prostředí se sterilizuje filtrací přes membránu s otvory 0,2 mikrometru a pak se smísí s 250 ml 4% Bacto-agaru (Difco), udržovaného na teplotě 50 °C, 10 ml roztoku adeninu s obsahem 1,2 mg/ml této látky a 5 ml roztoku L-leucinu s obsahem 180 mg/50 ml. Výsledné prostředí se pak rozdělí do Petriho misek po 20 ml.

Po 5 dnech inkubace se vytvořila řada kolonií. Jednotlivé kolonie byly izolovány odebráním kolonií z počátečních ploten FOA a jejich rozetřením na čerstvé plotny FOA, které pak byly inkubovány při teplotě 30 °C. Kolonie ze druhé skupiny ploten FOA pak byly podrobeny zkouškám na přítomnost mutace ura3 opakovaným nanesením na plotny YEHD a na plotny uracil-minus. Bylo možno pozorovat dobrý růst na plotnách YEHD, kdežto v prostředí bez uracilu kvasinky nerostly. Byl oddělen izolát U9 s uvedenými vlastnost mi a uložen ve zmrazeném stavu v glycerolu při teplotě -70 °C pro další použití (kmen 325).

Příklad 2

Příprava vektoru pro rozrušení genu kvasinek MNN9

Aby bylo možno připravit vektor pro rozrušení genu MNN9, bylo nejprve zapotřebí klonovat gen MNN9 z DNA genomu S. cerevisiae. Tento postup byl uskutečněn s použitím

PCR-technologie. 5'-negativní primer a 3'-positivní primer pro PCR v plné délce kódové sekvence MNN9 byly zkonstruovány podle zveřejněné sekvence genu MNN9 z kvasinek v EP patentové přihlášce č. 88117834.7, zveřejnění pod číslem 314 096 (Zymogenetics). Byly použity následující oligodeoxynukleotidové primery s okrajovými částmi HindlII (podtrženo)

Negativní primer:

5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' (řet.č.l)

Positivní primer:

5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' (řet. č. 2).

Počáteční kodon pro methionin genu pro MNN9 je uložen těsně za místem působení HindlII, které je v negativním primeru podtrženo. PCR se provádí při použití DNA genomu kmene S. cerevisiae JRY188 jako matrice. Užije se Taq DNA polymeráza (Perkin Elmer) a 25 cyklů amplifikace (94 °C 1 minuta, 37 °C 2 minuty, a 72 °C 3 minuty). Výsledný fragment PCR o velikosti 1,2 kb se rozštěpí enzymem HinlII, čistí se na gelu a naváže na plasmid pUC13 (Pharmacia), předem rozštěpený enzymem HindlII a zpracovaný alkalickou fosfatázou. Výsledný plasmid byl označen pll83.

Aby bylo možno rozrušit gen MNN9 jeho přerušením genem URA3 z kvasinek, byl plasmid pBR322-URA3 (obsahující kódový fragment genu S. cerevisiae URA3 po štěpení enzymem HindlII o velikosti 1,1 párů kb, subklonovaný v místě působení HindlII plasmidu pBR322) rozštěpen enzymem HindlII a fragment DNA o velikosti 1,1 párů kb, obsahující funkční gen URA3 byl čištěn na gelu, zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou a pak byl fragment navázán na plasmid pll83 po jeho rozštěpení enzymem PmlI (PmlI štěpí v kodové sekvenci

MNN9 . Výsledný plasmid pll99 obsahuje přerušení genu MNN9 funkčním genem URA3.

Příklad 3

Konstrukce derivátu U9 kmene 1372 s obsahem přerušeného genu MNN9

K přerušení genu MNN9 u kmene U9(325), se 30 mikrogramů plasmidu pll99 štěpí enzymem HindlII za vzniku lineární kazety mnn9::URA3 s přerušením. Buněčný materiál kmene 325 se transformuje uložením DNA plasmidu pll99 po rozštěpení HindlII s využitím sferoplastů podle publikace Hinnen a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 5:1929 - 1933 a transformanty byly podrobeny selekci na syntetickém agarovém prostředí bez uracilu s obsahem 1,0 M sorbitolu. Syntetické prostředí, obsahovalo-na 1 litr destilované vody 20 g agaru, 6,7 g dusíkatých baží a aminokyselin z kvasinek,

0,04 g adeninu, 0,05 g L-tyrosinu, 182 g sorbitolu, 20 g glukosy a 10 ml roztoku 2 s nedostatkem leucinu. Tento roztok obsahuje na 1 litr destilované vody 2 g L-argininu, g L-histidinu, 6 g L-leucinu, 6 g L-isoleucinu, 4 g L-lysinu, 1 g L-methioninu, 6 g L-fenylalaninu, 6 g L-threoninu, g L-tryptofanu.

Plotny byly inkubovány 5 dní při teplotě 30 °C, v průběhu této doby se vytvořily četné kolonie. Z deseti kolonií byly připraveny preparáty chromosomální DNA a ty pak byly rozštěpeny enzymy EcoRI a HindlII. Rozštěpený materiál byl pak vyhodnocen metodou Southern blots podél J. Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání,

Cold Spning Harbon Laboratory Press, 1989, při použití fragmentu po štěpení HindlII s velikostí 1,2 párů kb s obsahem genu MNN9, izolovaného z plasmidu pll99 jako sondy. Jeden z izolátů, kmen 1372, který byl tímto způsobem identifikován, měl očekávaný posun pásů pro DNA při provádění metody Southern blot a také vytvářel shluky, které jsou typické pro mutanty s obsahem MNN9.

Příklad 4

Konstrukce vektoru pro přerušení genu HIS3 u kvasinek

Aby bylo možno vytvořit kazetu pro přerušení, v níž je gen HIS3 kvasinek S. cerevisiae přerušen genem URA3, byl plasmid YEp6 podle publikace K. Struhl a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 76:1035 rozštěpen enzymem BamHI. Fragment po tomto štěpení s velikostí 1,7 párů kb a obsahující gen HIS3, byl čištěn na gelu, zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou a fragmenty byly navázány na plasmid pUS18, předem rovněž rozštěpený působením BamHI a zpracovaný T4 DNA polymerázou. Výsledný plasmid, označovaný pl501 nebo pUC18-HIS3 byl rozštěpen enzymem Nhel, který štěpí kódovou sekvenci HIS3 a fragment vektoru byl čištěn na gelu, zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou a pak byl materiál zpracován alkalickou fosfatázou z telecích střev. Gen URA3 byl izolován z plasmidu pBR322 rozštěpením HindlII a fragment o 1,1 párů kb, obsahující gen URA3 byl čištěn na gelu, zakončení byla vyplněna T4 DN2 polymerázou a materiál byl navázán na svrchu uvedený fragment pUC18-HIS3 Nhel. Výsledný plasmid, označený pUC18-his3::URA3 nebo pl505 obsahuje kazetu, v níž je gen HIS3 kvasinek přerušen funkčním genem URA3.

Příklad 5

Konstrukce vektoru pro přerušení genu PRB1 kvasinek genem HIS3

Plasmid FP8deltaH s obsahem genu PRB1 kvasinek S. cerevisiae, byl dodán z Dr. E. Jines of Carnegie-Me1Ion, Univ., C. M. Moehle a další, 1987, Genetics, 115:255 - 263. Plasmid byl rozštěpen enzymy HindlII a Xhol a fragment DNA s obsahem 3,2 páru kb, nesoucí gen PRB1 byl čištěn na gelu a zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou. Plasmid pUC18 byl rozštěpen BamHI, čištěn na gelu a zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou. Výsledný fragment vektoru byl navázán na svrchu získaný fragment s genem PRB1 za vzniku plasmidu pUC18-PRBl. Plasmid YEp6, obsahující gen HIS3, byl rozštěpen enzymem BamHI. Výsledný fragment BamHI, obsahující 1,7 párů kb a funkční gen HIS3 byl čištěn na gelu a zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou. Plasmid pUC18-PRBl byl rozštěpen enzymy EcoRV a Ncoll, štěpícími uvnitř kódové sekvence PRB1 a odstraňujícími místo pro proteázu B a sousední řetězec. Fragment EcoRV-NcolI o 5,7 párů kb, obsahující zbývající 5*- a 3^-části kódové sekvence PRB1 v pUC18 byl čištěn na gelu, zakončení byla vyplněna' T4 DNA polymerázou a po defosforylaci alkalickou fosfatázou z telecích střev byl materiál navázán na svrchu popsaný fragment HIS3 s vyplněnými konci. Výsledný plasmid, označovaný pUC18-prbl::HIS3, kmen 1243, obsahuje funkční gen HIS3 místo části genu PRB1, který byl tímto postupem rozrušen.

Příklad 6

Konstrukce U9-kmene kvasinek s obsahem rozrušených genů MNN9 a PRB1

U9-kmen 1372, obsahující přerušený gen MNN9 byl popsán v příkladu 3. Izoláty klonů tohoto kmenu byly naneseny na plotny FOA k selekci mutant ura3. Byla získána řad izolátů ura3 kmene 1372 a jeden z nich (kmen 12930-190-S1-1) byl zvolen pro následující rozrušení genu HIS3. Vektor pUC18-his3::URA3, p!505 byl rozštěpen enzymy Xbal a EcoRI za vzniku lineární kazety his3::URA3 a byl použit k transformaci kmene 12930-190-S1-1 při použití octanu lithného podle publikace Methods in Enzymology, 194:290, 1991. Transformanty Ura⁺ byly podrobeny selekci na syntetickém agarovém prostředí bez uracilu, pak naneseny na totéž prostředí pro získání jednotlivých izolátů, ty pak byly nanášeny na prostředí bez uracilu nebo bez histidinu, aby bylo možno zjistit izoláty, současně Ura⁺ a His . Jeden z těchto izolátů, kmen 12930-230-1 byl zvolen pro následující rozrušení genu PRB1. Vektor pro rozrušení tohoto genu, pUC18-prbl::HIS3, kmen 1245, byl rozštěpen enzymy Sací a Xbal za vzniku lineární kazety prbl::HIS3 a ta pak byla použita pro transformaci kmene 12930-230-1 postupem s použitím octanu lithného. His⁺ transformanty byly podrobeny selekci na agarovém prostředí bez histidinu a pak přeneseny jednotlivě na totéž prostředí k získání izolátů jednotlivých klonů. Z řady výsledných izolátů His⁺ byla připravena DNA genomu, která byla rozštěpena enzymem EcoRI a podrobena elektroforéze na 0,8% agarosovém gelu. Pak byla provedena analýza Southern blot při použití radioaktivně značené sondy o 617 bp pro gen PRB1, připravený pomocí PCR s použitím následujících oligodeoxynukleotidových primerů:

5'TGG TCA TCO CAA ATC TTG AAA 3' (řetězec č. 3)

5'CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' (řetězec č. 4).

Bylo získáno jedenáct izolátů s očekávanou hybridizací sondy s fragmentem DNA prbl::HIS3 s velikostí 2,44 párů kb. Tato skutečnost kontrastuje s hybridizací stejné sondy s fragmentem divokého typu genu PRB1 o velikosti 1,59 párů kb. Jeden z izolátů, obsahující požadované přerušení prbl::HIS3 byl vybrán pro další použití a označen jako kmen 1558.

Příklad 7

Konstrukce vektoru pro rozrušení genu PEP4 kvasinek

Gen PEP4 kvasinek S. cerevisiae byl klonován z banky genomu kvasinek následujícím způsobem. Buňky E. coli, obsahující banku genomu kvasinek pLSlOl podle publikace Schult a Friesen, 1983, J. Bacteriol. 155:8 - 14, byly pěstovány přes noc v 5 ml prostředí LB s obsahem 100 mikro gramů/ml ampicilinu. Z této kultury byla nanesena ředění -4-5 a 10 na plotny prostředí LB s ampicilinem. Kolonie byly odebrány nitrocelulosovými filtry. Sonda o 600 bp pro gen PEP4 kvasinek byle připravena pomocí PCR a Taq DNA polymerázy při užití celkové DNA plasmidu z pLSlOl a následujících oligodeoxynukleotidových primerů, konstruovaných na bázi zveřejněné sekvence DNA pro PEP4 podle C. A. Woolford a další, Mol. Cell. Biol·., 6:2500, 1986.

Negativní primer:

5'-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3'

Positivní primer;

-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3 řetězec č. 5' řetězec č. 6)

PCR byla prováděna při použití 25 cyklů amplifikace, vždy 94 °C 1 minuta, 37 °C 2 minuty a 72 °C 3 minuty. PCR-sonda byla čištěna na gelu, radioaktivně značena a hybridizována se svrchu uvedenými filtry s odebranými koloniemi. Několik kolonií bylo pozitivních na hybridizaci se sondou PEP4. Tyto kolonie byly znovu naneseny jednotlivě na plotny s prostředím LB s ampicilinem. DNA-plasmidu byla připravena rozrušením pomocí alkalického prostředí a

SDS podle svrchu uvedené publikace Sambrooka a dalších, z materiálu z několika izolátů a rozštěpena enzymem BamHI. Bylo možno pozorovat očekávaný pás pro vektor o 14 párech kb a pás pro uložení PEP4 o 6,9 kbp. Po dvojím rozštěpení enzymy EcoRI a Xhol bylo možno pozorovat očekávaný pás pro PEP4 o 1,5 kbp. Jeden z izolátů, kmen 860 s očekávanými výsledky byl vybrán pro další použití, DNA tohoto kmene byla rozštěpena enzymem BamHI a vzniklý fragment DNA o 6,9 kbp s obsahem chromosomálního genu PEP4 byl subklonován v plasmidu pUC13 v místě jeho štěpení enzymem BamHI za vzniku plasmidu p890. Tento plasmid byl pak rozštěpen Nvol, štěpícím v kódové sekvenci PEP4, materiál byl čištěn na gelu, zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou a materiál byl navázán na fragment o 1,1 kbp s vyplněnými konci, obsahující funkční gen URA3 a připravený podle příkladu 2. Výsledný plasmid, obsahující gen PEP4, přerušený genem URA3 byl pak označen pUC13-pep4::URA3, kmen 906.

Příklad 8

Konstrukce kmene 1569 kvasinek, který je derivátem kmene U9, obsahujícího mutace prbl i pep4

Aby bylo možno rozrušit gen HIS3 u kmene U9, byl rozštěpen vektor pUC18-his3;:URA3 enzymy EcoRI a Xbal a pak použit k transformaci kmene U9 při použití octanu lithného. Transformanty Ura⁺ byla podrobeny selekci na agarověm prostředí bez uracilu a pak znovu nanesena na totéž prostředí k izolaci klonů. Řada výsledných izolátů Ura⁺ pak byla znovu nanesena na agarové prostředí bez uracilu nebo bez histidinu a byly vyhledávány izoláty, současně Ura⁺ a His”. Jeden z izolátů, kmen 1524 byl vybrán pro rozrušení genu PRB1. Vektor pUC18-prbl::HIS3 byl rozštěpen enzymy Sací a Xbal a pak použit k transformaci kmene 1524 s použitím octanu lithného. Transformanty His⁺ byly podrobeny selekci na agarovém prostředí bez histidinu a izoláty jednotlivých klonů byly přeneseny na totéž prostředí. DNA genomu pak byla připravena z řady izolátů His⁺ a vyhodnocena hybridizací metodou Southern blot s použitím radioaktivně značené sondy PRB1. Jeden z izolátů, kmen 1537 s požadovaným přerušením genu PRB1 genem HIS3 (to znamená prbl::HIS3) byl vybrán pro následující rozrušení genu PEP4. Kmen 1537 byl pasážován na plotnách FOA k získání izolátů ura3 a jeden z těchto izolátů, kmen 1541 byl vybrán pro další použití.

K rozrušení genu PEP4 u kmene 1541 byl rozštěpen vektor pUC13-pep4::URA3 enzymem Xhol za vzniku lineární kazety pep4::URA3 a použit pro transformaci kmene 1541 s využitím octanu lithného. Transformanty Ura⁺ byly podrobeny selekcí na agarovém prostředí bez uracilu a jednotlivé izoláty byly přeneseny na totéž prostředí. DNA genomu byla při pravena z řady transformantů Ura⁺ a vyhodnocena metodou Southern blot při použití radioaktivně značené sondy pro gen PEP4. Jeden z izolátů, kmen 1569 s požadovaným přerušením genu PEP4 genem URA3 byl vybrán pro další použití.

Příklad 9

Konstrukce vektoru pro expresi CRPV LI

Gen CRPV LI byl amplifikován metodou PCR z plasmidu pLAII, obsahujícího úplný virový genom CRPV (Dr. Peter Howley, MCI) při použití polymerázy Vent (New England Biolabs, lne.) . Bylo užito 35 cyklů amplifikace, vždy 94 °C 1 minuta, 50 °C 1 minuta a 72 °C 2 minuty a následujících oligonukleotidových primerů s místy působení BglII v okrajových částech (podtrženo).

Negativní primer:

5'-GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC-3.' (řetězec č. 7)

Pozitivní primer:

5'-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTAG-3' (řetězec δ. 8) .

Negativní primer zavádí nepřenášenou vedoucí sekvenci z kvasinek bezprostředně proti směru exprese CRPV LI s počátečním methioninovým kodonem, označeným silnějšími písmeny. PCR produkt LI o 1,6 kb byl rozštěpen enzymem BglII, čištěn na gelu a subklonován v místě BglII vektoru pSP72 (Promega) za vzniku plasmidu pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-l).

U jednoho ze subklonů byl úplně analyzován řetězec a bylo prokázáno, že se čtyřmi nukleotidy liší od zveřejněné sekvence CRPV LI. Změny však nevedou ke změnám v řetězci aminokyselin. Gen LI byl vyštěpen z plasmidu pSP72-CRPV-L1 jako fragment BglII a subklonován v jediném místě BamHI, uloženém mezi promotorem GAL1O z kvasinek a terminátorem transkripce ADH1 ve vektoru pro expresi v kvasinkách, pCl/l-GAL10p-ADHlt, který obsahuje promotor GAL10 z plasmidu YEp52 podle Broach a další, Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83:81 - 116 a terminátor transkripce ADH1 v kostře vektoru pCl/1. Výsledný plasmid byl pak označen P12930-323-6-1.

Příklad 10

Konstrukce vektoru pro expresi CRPV L2

Gen CRPV L2 byl amplifikován pomocí PCR při použití polymerázy Vent (New England Biolabs, lne.) z plasmidu pLAII po jeho rozštěpení enzymem Sáli, fragment o 7,9 kb se čistí na gelu a pak se fragmenty na sebe naváží. Provádí se 35 cyklů PCR, vždy 90 °C 1 minuta, 50 °C 1 minuta a 72 °C 2 minuty při použití oligonukleotidových primerů s místy EcoRI v okrajových částech (podtrženo):

Negativní primer:

5^-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGT CAC GAA AAC-3' (řetězec č. 9)

Positivní primer:

5-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3' (řetězec 10)

Negativní primer zavádí nepřenášený vedoucí řetězec z kvasinek bezprostředně proti směru exprese CRPV LI s iniciačním'kodonem pro methionin, znázorněným silnějšími písmeny. Produkt PCR o 1,5 kb byl rozštělen EcoRI, fragmenty byly čištěna na gelu a subklonovány v místě EcoRI dvojsměrného promotorového vektoru pUC18-GALlp-GAL10p s obsahem promotoru GAL1/GAL10 z kvasinek. Tento vektor obsahuje jediné místo BamHI mezi promotorem GAL1 a první kopií terminátoru transkripce ADH1 a jediné místo působení EcoRI a Smál mezi promotorem GAL10 a druhou kopií terminátoru transkripce ADH1. Výsledná kazeta pro expresi je nesena fragmentem Sphl o 1,5 kb. Jeden z klonů, pl2930-295-2-2, obsahující požadovanou uloženou část L2 v bezprostřední blízkosti promotoru GAL10 se zcela analyzuje a bylo prokázáno, že jeho sekvence obsahuje šest změn v nukleotidech ve srovnání se známou sekvencí, přičemž čtyři z těchto změn mají za následek změnu aminokyseliny. Analýza sekvence původní matrice DNA potvrdila, že změny jsou přítomny v pLAII a nevznikají v průběhu PCR. Vektor pUC18-GALlp-GAL10p s obsahem genu L2 byl rozštěpen Sphl a fragment o 2,9 kb s kazetou pro expresi ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt byl navázán na velký fragment Sphl vektoru pCl/Ι kvasinek. Výsledný plasmid byl označen pl293O-323-2-3, pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2.

Příklad 11

Exprese bílkovin kapsidu CRPV LI a CRPV L2 v kvasinkách

Plasmid pl2930-323-6-l a pl293O-323-2-3 (pCl/l-GAL10p-CRPV/L1 a pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV/L2) byly použity k transformaci kmenů S. cerevisiae 1569, BJ5462 podle E. W. Jones, Methods in Enzymology, 194, 1991, 428 - 453 a BJ1995 (tamtéž). Izoláty klonů byly pěstovány při 30 °C na prostředí YEHD s obsahem 2 % galaktosy celkem 48 až 72 hodin. Po izolaci buněk byla usazenina buněk rozrušena skleněnými kuličkami, byl přidán Triton X-100 do konečné koncentrace 0,5 % a výsledné rozrušené buňky byly vyhodnoceny na expresi CRPV LI a L2 imunoblotovou analýzou. Vzorky 40 mg celkové bílkoviny buněk byly podrobeny elektroforéze na 12% gelu s tris-glycinem (Novex) za redukčních a denaturaóních podmínek a pak byl uskutečněn elektroblot na membránách PVDF (Novex). Bílkoviny CRPV LI a 12 byly prokazovány při použití polyklonálních králičích antisér proti LI nebo L2 (dar od Dr. Johna Kreidera, Hershey Medical Center) jako primárních protilátek a bílkoviny A, vázané na peroxidázu z křenu (Amersham, lne.) jako sekundární protilátky. Membrány byly zpracovány TM pri použití chemiluminiscenčmho baličku pro detekci ECL (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích s obsahem plasmidu pro expresi LI byl prokázán pás pro bílkovinu LI s molekulovou hmotností 55 000 až 61 000 a pás pro bílkovinu L2 s molekulovou hmotností přibližně 90 000 byl prokázán ve všech vzorcích klonu kvasinek s obsahem plasmidu pro expresi L2.

Žádný signál nebyl prokázán ve vzorcích s plasmidem pro expresi LI s antiserem proti L2 a obráceně.

Příklad 12

A. čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu CRPV LI

Všechny postupy byly prováděny při 4 C, není-li uvedeno jinak. 3uněčný materiál, skladovaný při teplotě -~0 °C byl po roztátí uveden do suspenze ve stejném objemu pufru pro LI s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2 se ICO mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Do suspenze byly přidány inhibitory PMSF a Pepstatin A do koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Pak byl buněčný materiál rozrušen 10 průchody mikrofluidioačním přístrojem. Lysát byl vyčeřen odstředěním 10 minut při 5000g. Supernatant byl navrstven na vrchol vrstvy 45% sacharosy v pufru LI s výškou 5 cm a pak byl materiál odstředěn - hodiny při 100 000 g k získání Li. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 1/10 objemu pufru LI a opět odstředěna 10 minut při 5000 g. K supernatantu byl přidán Tween-80 do konnečné koncentrace 0,01 % objemových a supernatant byl podroben při teplotě místnosti frakcionaci chromatografií na sloup ci s obsahem 1700 ml (5 cm vnitřní průměr) pryskyřice Sephacryl-S-1000 (Pharmacia). Jako eluční činidlo byl užit 10 mM fosfát sodný o pH 7,2 se 150 mM NaCl a 0,01 % objemovými Tween-80. Frakce, které podle metody imuno-dot blot obsahovaly imunoreaktivní materiál, byly spojeny a zahuštěny na 1/6 objemu ultrafiltraci při použití komory Amicon a ploché membrány YM-100 s průměrem 76 mm (100 000 MWCO). Produkt byl sterilizován filtrací přes membránu Millex-GV s průměrem otvorů 0,22 mikrometrů (Millipore). Čištěná bílkovina kapsidu CRPV LI byla adsorbována na hydroxid hlinitý v koncentraci 100 mikrogramů/ml.

B. Charakterizace rekombinantní bílkoviny kapsidu CRPV LI

Produkt byl identifikován metodou Western blot a analýzou N-terminální sekvence. Čistota byla ověřena pomocí

SDS/PAGE při barvení Coomassie a stříbrem a při použití kapilární elektroforézy SSCE s optickou detekcí při 215, nm. Čistota LI byla 75 % podle SSCE.

Příklad 13

Čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu CRPV L2

Všechny postupy byly prováděny při 4 ^L'C, není-li uvedeno jinak. Buněčný materiál, skladovaný při teplotě -70 °C byl po roztátí uveden do suspenze ve stejném objemu pufru pro LI s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2 se 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Do suspenze byly přidány inhibitory PMSE a Pepstatin A do koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Pak byl buněčný materiál rozrušen 10 průchody mikrofluidizačnim přístrojem. Lysát byl vyčeřen odstředěním 10 minut při 5000g. Supernatant byl navrstven na vrchol vrstvy 45% sacharosy v pufru LI s výškou 5 cm a pak byl materiál odstředěn 4 hodiny při 100 000 g k získání. LI. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 1/10 objemu pufru LI a opět odstředěna 10 minut při 5000 g. K supernatantu byl přidán Tween-80 do konnečné koncentrace 0,01 % objemových a supernatant byl podroben při teplotě místnosti frakcionaci chromatografií na sloupci s obsahem 1700 ml (5 cm vnitřní průměr) pryskyřice Sephacryl-S-1000 (Pharmacia). Jako eluční činidlo byl užit 10 mM fosfát sodný o pH 7,2 se 150 mM NaCl a 0,01 % objemovými Tween-80. Frakce, které podle metody imuno-dot blot obsahovaly imunoreaktivní materiál byly spojeny. Spojené frakce pak byly analyzovány pomocí SDS/PAGE při detekci stříbrem a metodou Western blot.

Příklad 14

A. Čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu CRPV Li

Buněčný materiál, skladovaný při teplotě -70 °C byl po roztátí uveden do suspenze ve stejném objemu pufru pro Li s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2 se 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Do suspenze byly přidány inhibitory PMSF a Pepstatin A do koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Pak byl buněčný materiál rozrušen 10 průchody mikrofluidizačním přístrojem. Lysat byl vyčeřen odstředěním 10 minut při SOOOg. Supernatant byl navrstven na vrchol vrstvy 45% sacharosy v pufru LI s výškou 5 cm a pak byl materiál odstředěn 4 hodiny při 100 000 g k získání LI. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 1/10 objemu pufru LI a opět odstředěna 10 minut při 5000 g. K supernatantu byl přidán Tween-80 do konnečné koncentrace 0,01 % objemových a supernatant byl podroben při teplotě místnosti frakcionaci chromatografií na sloup ci s obsahem 1700 ml (5 cm vnitřní průměr) pryskyřice Sephacryl-S-1000 (Pharmacia). Jako eluční činidlo byl užit 10 mM fosfát sodný o pH 7,2 se 150 mM NaCl a 0,01 % objemovými Tween-30. Frakce, které podle metody imuno-dot blot obsahovaly imunoreaktivní materiál, byly spojeny a zahuštěny na 1/6 objemu ultrafiltrací při použití komory Amicon a ploché membrány YM-100 s průměrem 76 mm (100 000 MWCO). Produkt byl sterilizován filtrací přes membránu Millex-GV s průměrem otvorů 0,22 mikrometrů (Millipore).

B. Charakterizace rekombinantní bílkoviny kapsidu CRPV LI

Totožnost výsledného produktu byla ověřena metodou Western blot a analýzou N-terminální sekvence. Čistota produktu byla ověřena pomocí SDS/PAGE při barvení Coomassie a stříbrem a kapilární elektroforézou SSCE s optickou detekcí při 215 nm. Podle této zkoušky byla čistota LI 75 %. V elektronovém mikroskopu bylo možno pozorovat případnost VLP s průměrem 50 až 55 nm.

C. Analytická HPLC s oddělením látek podle molekulové hmotnosti

Při zkoušce na VLP byly vzorky podrobeny frakcionaci chromatografií při použití Perkin-Elmer Series 410 Biopump se vstřikovacím zařízením ISS 100, opatřeným vstřikovací smyčkou s objemem 200 mikrolitrů. Byl použit sloupec TSK-gel G5000PW s rozměrem 7,5 x 600 mm (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA). Ke sledování eluce bílkoviny ze sloupce byla prováděna optická detekce při 280 nm při použití diodového detektoru Perkin-Elmer LC-235. Mobilní fází byl roztok 0,5 M NaCl v 10 mM fosfátu sodného o pH 7,2. Rychlost průtoku byla 0,5 ml/min, odebírané frakce měly objem 1 ml. Kalibrace sloupce byla provedena bílkovinným standardem (Sigma) a rekombinantním povrchovým antigenem hepatitidy B (Recombivax, Merck and Co., West Point, PA). Detekce antigenů ve frakcích, získaných elucí, byla provedena zkouškou immunodot blot.

D. Zkouška immunodot blot

Vzorek každé frakce s objemem 10 mikrolitrů byl nanesen na proužek membrány PVDF (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA), který byl předem zvlhčen a uložen na zvlhčený blotový papír. Vzorek se vsákl do membrány a membrána pak byla uložena do 5% blokovacího roztoku v odtučněném sušeném mléce, rozpuštěném v 0,15 M NaCl s 0,02 %.azidu sodíku a 0,01 M fosfátu sodného o pH 2 a inkubována při teplotě místnosti za opatrného míchání po dobu nejméně hodiny. Pak byl blokovací roztok odstraněn a nahrazen roztokem primární protilátky.

Primární protilátka se měnila v závislosti na antigenu, který měl být prokázán.

Přítomnost CRPV LI byla prokazována pomocí králičího antisera proti CRPV pro pozdní odpověď (Biodesign International, Kennebunk, ME). CRPV L2 byla prokazována pomocí králičího antisera proti CRPV L2. Bílkovina HPVBa LI byla prokazována při použití monoklonální protilátky MAB 837 (Chemicon International, lne., Temecula, CA). Bílkovina HPV6a L2 byla prokazována při použití myšího séra proti HPV6a L2-trpE.

Vytvořený komplex byl vizualizován běžně užívanými postupy s použitím druhé protilátky, konjugované s alkalickou fosfatázou a chromogenního substrátu NBT/BCIP.

E. Kapilární elektroforéza SSCE

Vzorky CRPV VLP, přibližně 0,2 mg/ml, byly zahřívány 15 minut na 100 °C v 1% 2-merkaptoethanolu a 1% SDS. Vzorek byl nanášen elektrokineticky spolu s referenčním značením, kyselinou mellitovou na kapiláru oxidu křemičitého s rozměrem 42 cm (22 cm k detektoru) a vnitřním průměrem 0,05 ml, předem v rovnovážném stavu s deseti objemy vnitřního prostoru 0,1 N NaOH ve vodě a sítem ProSort (Applied Biosystems, Foster City, CA). Pak bylo aplikováno dělicí napětí 300'V/cm při použití zařízení Applied Biosystems Model 270A-HT CE. Vymývaný vzorek byl sledován absorbancí při 215 nm a údaje byly zaznamenávány při použití softwaru Nelson Turbochrom 3.

F. Příprava vakcíny z rekombinantní bílkoviny kapsidu CRPV LI

Čištěná bílkovina kapsidu CRPV Li byla absorbována na hydroxid hlinitý v koncentraci 100 mikrogramů/ml.

Příklad 15

Ochrana proti vzniku papilomu, vyvolaného CRPV očkováním s použitím CLP CRPV LI, odvozených od kvasinek

Pět bílých králíků (New Zealand White) bylo imunizováno nitrosvalově při použití buď 135 mg LI VLP s čistotou 75 % z příkladu 17 po adsorpci na hydroxid hlinitý (alum) nebo 100 mg rekombinantního povrchového antigenu hepatitidy B s čistotou 99 % po absorpci na hydroxid hlinitý jako negativní kontroly. Zvířata byla přeočkována ještě dvakrát v průběhu 8 týdnů a 10 dnů po posledním přeočkování byla uskutečněna aplikace CRPV. Sérum bylo odebráno před imunizací, při každém přeočkování a před podáním antigenu a bylo analyzováno metodou ELISA, specifickou pro Ll-VLP. Nepřímá zkouška ELISA byla použita pro stanovení protilátek v séru jako odpovědi na CRPV LI VLP po expresi v kvasinkách. Použitými antigeny při zkoušce ELISA byly CRPV LI VLP po expresi v hmyzích buňkách s rekombinantním baculovirem v podstatě podle publikace Christensen a další, J. Virol., 64:3151 - 3156, 1990 a J. Gen. Virol., 75:2271 - 2276, 1994. Jako druhá protilátka byla použita kozí protilátka proti králičí IgG-alkalické fosfatáze a jako substrát byl použit p-nitrofenylfosfát (Kirkegaard a Perry Labs’., lne.) . Absorbance byla měřena při 405 nm. Titr byl stanoven ředěním (vždy trojnásobné ředění séra, vychází se. z hodnoty 1 : 100) a považuje se za positivní v případě, že absorbance, specifická pro LI převýší průměrnou absorbanci pro králičí sérum před imunizací plus dvojnásobek standardní odchylky.

Z těchto údajů byly vypočítány přesné titry při použití programu SOFTmax verse 2,3 (Molecular Devices lne., Menlo Park, CA) .

Titry protilátek proti LI VLP bylo možno prokázat 4 týdny po první imunizaci a zvyšovaly se při každém dalším přeočkování. Kontrolní zvířata nevytvořila žádné protilátky. Šest týdnů po aplikaci CRPV byla očkovaná zvířata prostá bradavic v 15 z 15 míst, vystavených působení viru (ředěný zásobní virus 1 : 2 nebo 1 : 12), kdežto kontrolní zvířata měla bradavice na dvanácti z patnácti míst při ředění viru 1 : 2 nebo na devíti z patnácti míst při ředění viru 1 : 12. Po 15 týdnech se u očkovaných zvířat stále ještě nevytvořily žádné bradavice.

Zkoušky na neutralizaci viru byly provedeny v podstatě podle publikace Christensen a další, 1991, Virology, 181, 572 - 579, smísením králičího séra s CRPV a takto zpracovaný CRPV byl pak aplikován králíkům. Standardem pro stanovení neutralizačních protilátek byla úplná neutralizace viru, to znamená, že ve třech místech ze tří míst aplikace se nevytvořily bradavice. Mimoto byla analyzována séra pěti očkovaných zvířat a pěti kontrolních zvířet. Séra, odebra ná po jedné dávce CRPV LI VLP obsahovala protilátky, které úplně neutralizovaly neředěný virus u 80 % králíků, to znamená u 4 z 5 zvířat. Po dvou nebo třech dávkách již vytvořilo 100 % zvířat, pět králíků z pěti, protilátky, neutralizující virus. U kontrolních sér nebylo možno pozorovat žádný neutralizační účinek na virus. V závislosti na konečném titru sér očkovaných zvířat bylo tato séra možno zředit 10 až lOOOx při zachování schopnosti neutralizovat virus na 100 %.

Aby bylo možno zjistit, zda neutralizační protilátky byly specifické pro nativní CRPV LI VLP, bylo zvoleno jedno imunní sérum a toto sérum bylo inkubováno se čtvercovými úseky nitrocelulosy, opatřené povlakem nativního nebo denaturovaného CRPV LI VLP, odvozeného od kvasinek. Nitrocelulosové čtverce s plochou 1 cm“ byly povlekany nativním nebo denaturovaným (redukce a alkylace kyselinou jodoctovou v 8 M močovině) CRPV LI VLP po expresi v kvasinkách.

Jako kontroly byly užity nativní nebo denaturované extrakty z kvasnic. Imunní králičí sérum bylo sériově inkubováno čtyřikrát s nitrocelulosovými čtverci po dobu 8 až 14 hodin při teplotě 4 °C a pak byla provedena zkouška na neutralizaci viru svrchu uvedeným způsobem. Pouze nativní CRPV LI VLP je schopen absorbovat protilátky, odpovědné za neutralizaci CRPV, kdežto denaturované nebo kontrolní bílkoviny z kvasinek tyto protilátky neadsorbují, Mimoto nativní CRPV LI VLP také ruší reaktivitu zkoušky ELISA na CRPV LI VLP po jeho expresi v hmyzích buňkách (údaje nejsou uvedeny).

Příklad 16

Kontrukce vektoru pro současnou expresi CRPV L1/L2 při použití jediného plasmidu

Plasmid pSP72-CRPV-Ll, pl2930-314-4-l byl rozštěpen enzymem BglII a fragment o 1,5 kbp, nesoucí CRPV LI ORF s 5'-nepřenášeným vedoucím řetězcem z kvasinek byl čištěn na gelu. Plasmid pl2930-323-2-3, pCl/l-GAllp-GA10p-CRPV-L2, byl rozštěpen enzymem BamHI, který štěpí mezi promotorem GAL1 a terminátorem transkripce ADH1. Lineární fragment vektoru byl čištěn na gelu a pak navázán na svrchu uvedený fragment CRPV-L1 BglII za vzniku plasmidu pl2930-366-l-2, pCl/1-GAL1/10Ú-CRPV/L1+L2. Tento výsledný plasmid obsahuje CRPV-L1 ORF pod řízením promotoru GAL1 a CRPV-L2 ORF pod řízením promotoru GAL10.

Příklad 17

Konstrukce vektoru pro současnou expresi CRPV L1/L2 ze dvou plasmidu

Vektor pUS18-GALlp-GAL10p s obsahem genu L2 byl rozštěpen pomocí Sphl a fragment o 2,9 kb s obsahem ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt ve formě kazety pro expresi byl čištěn na gelu a zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou. Vektor z kvasinek YEp24 podle Borstein a další, Gene, 8:17, 1979, byl rozštěpen enzymem BamHI, zakončení byla vyplněna T4 DNA polymerázou a po defosforylaci alkalickou fosfatázou z telecího střeva byl fragment navázán na svrchu uvedenou kazetu pro expresi L2 s vyplněnými konci za vzniku plasmidu pl594.

Příklad 18

Současná exprese LI a L2 v kvasinkách

Plasmid pl2930-366-l-2, pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2, byl použit k transformaci kmenů S. cerevisiae 1569 a BJ5462 při použití systému s jedním plasmidem a výsledné transformanty byly podrobeny selekci na syntetickém agarovém prostředí s nedostatkem leucinu. V paralelním pokusu byl kmen 1569 transformován současně vektorem pro expresi pCl/l-GAL10p -CRPV-L1, pl2930-323-6-l a mimoto vektorem pro expresi YEp24-GAL10p-L2, pl594 v systému s použitím dvou plasmidů a výsledné transformanty s obsahem obou vektorů byly podrobeny selekci na syntetickém agarovém prostředí bez leucinu a bez uracilu. Izoláty klonů v obou uvedených systémech byly pěstovány při teplotě 30 °C na komplexním prostředí YEHD s obsahem 2 % galaktosy po dobu 48 až 72 hodin. Po izolaci buněk byly usazeniny buněk rozrušeny skleněnými kuličkami. Pak byl přidán Triton X-100 do konečné koncentrace 0,5 % a materiál byl analyzován na expresi CRPV LI a L2 imunoblotovou analýzou. Vzorky s obsahem 50 mikrogramů celkové buněčné bílkoviny byly podrobeny elektroforéze na gelu s gradientem tris-glycinu 8 až 16 % (Novex) za redukčních a denaturačních podmínek a pak byl uskutečněn elektroblot na membránách PVDF (Novex). Bílkoviny CRPV LI a L2 byly prokazovány při použití polyklonálních králičích antisér proti LI a L2 (dar Dr. Johna Kreidera, Hershey Medical Center) jako primárními protilátkami a bílkovinou A, vázanou na peroxidázu z křenu (Amersham, lne.), jako sekundární protilátkou. Membrány byly zpracovány při použití chemiluminiscenčního detekčního balíčku ECL (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích s obsahem plasmidu pro expresi LI + L2 bylo možno prokázat pás bílkoviny s molekulovou hmotností 55 000 až 61 000 a pás bílkoviny L2 s molekulovou hmotností přibližně 90 000. Žádný signál pro L2 nebylo možno pozorovat ve vzorcích, odvozených od klonů kvasinek, obsahujících plasmid pro expresi LI. Žádný signál pro LI nebylo také možno pozorovat ve vzorcích z buněk, které obsahovaly pouze vektor pro expresi L2.

Příklad 19

Čištění CRPV LI a CRPV LI + L2 VLP analýzu EM

Bílkoviny CRPV LI a CRPV LI + L2 po expresi z kvasinek byly částečně čištěny a koncentrovány pro analýzu v elektronovém mikroskopu, EM. Jeden litr až 1,5 litru prostředí YEHD s obsahem 2 % galaktosy bylo naočkováno S. cerevisiae, kmenem 1569 nebo BJ5462, transformovaným vektorem pro expresi LI + L2, pl2930-366-l-2, pCl/l-GALl/lOp-CRPV/L1 a L2 a kvasinky byly pěstovány při teplotě 30 °C po dobu 48 až 72 hodin. V paralelním pokusu byly obdobným způsobem pěstovány buňky kmene 1569, současně transformované vektorem pro expresi GALlOp-CRPV-Ll, pl2930-323-6-l a mimoto vektorem YEp24-GAL10p-L2, plasmidem pl594. Buňky byly izolovány a usazeniny buněk byly zmrazený na -70 °0. Všechny následující stupně byly prováděny při teplotě 4 °C. Usazeniny buněk byly po roztátí uvedeny do suspenze ve stejném objemu pufru LI, který obsahoval 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2 se 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. K suspenzi byly přidány inhibitory bílkovin PMSF a Pepstatin A v konečné koncentraci 2 mM a 1,7 mikroM. Buňky byly rozrušeny 3 až 5 průchody mikrofluidizačním přístrojem. Materiál byl odstředěn 10 minut při 5000 g. Supernatant byl navrstven na vrstvu 45% sacharosy v pufru LI s výškou 5 cm a bílkovina LI, L2 nebo LI + L2 byly usazeny odstředěním 4 hodiny při 100 OOOg. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 1/10 objemu pufru LI. Suspenze pak byla znovu odstředěna celkem 10 minut při 5000 g.

Pro analýzu EM (Structure Probe, West Chester, PA), byl podíl každého vzorku uložen na měděnou mřížku s uhlíkovým povlakem s průměrem otvorů 200 mešh. Na mřížku byla na 20 sekund uložena kapka 2% roztoku kyseliny fosfowolfrámové, PTA, o pH 7,0. Pak byly mřížky usušeny na vzduchu před okouš kou TEM. Všechna mikroskopická pozorování byla prováděna při použití elektronového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, lne.) při urychlovacím napětí 100 kV. Získané mikrofotografie měly konečné zvětšení 100 OOOx.

Ve všech vzorcích kvasinek s uloženým plasmidem pro expresi CRPV LI nebo plasmidy pro současnou expresi CRPV LI a L2, bylo možno pozorovat VLP s průměrem 50 až 55 nm.

U kontrolních vzorků kvasinek nebo u kvasinek s obsahem plasmidu pro expresi L2 nebylo možno VLP pozorovat, jak je zřejmé z obr. 7, 8 a 9.

Příklad 20

Čištění rekombinantního kapsidového proteinu CRPV Li, schéma 2

Všechny stupně byly prováděny při teplotě 4 °C, není-li uvedeno jinak.

Buněčný materiál, uložený při -70 °C se po roztátí suspenduje ve stejném objemu pufru pro rozrušení buněk, který obsahuje 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. K suspenzi se přidají inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A do konečné koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Pak se buněčný materiál rozruší při použití systému BioNeb Call Disruptor (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN).

Lysát se vyčeří odstředěním 10 minut při 5000 g.

Supernatant se navrství na vrstvu 45% sacharosy v pufru LI s výškou 5 cm a bílkovina LI se usadí odstředěním 4 hodiny při 100 000 g. Usazenina se uvede znovu do suspenze v 1/10 objemů pufru LI. Suspenze se opět vyčeří odstředěním 10 minut při 5000 g.

Supernatant se zředí PBS v poměru 1:5a směs se znovu odstředí při použití rotoru Servali SA-600 při 6500'Ot/min 10 minut při teplotě 4 °C. Supernatant se zfiltruje přes filtr s průměrem otvorů 0,22 mikrometrů a frakcionuje se chromatografií na aniontoměniči.

Chromatografie na aniontoměniči se provádí s použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie na zařízení Perkin-Elmer Series 410 Biopump se vstřikovací smyčkou s objemem 5 ml. Jako prostředí pro chromatografii se užije pryskyřice Fractogel EMF TMAE-650 (S) s průměrem částic 25 až 40 mikrometrů (EM Separations, Gibbstown, NJ), užije se skleněný sloupec s výškou 150 mm a vnitrním průměrem 10 mm. Vymývání bílkoviny ze sloupce se sleduje optickou detekcí při 280 nm a zařízení Perkin-Elmer LC-235 s diodovým detektorem. Sloupec se předem uvede do rovnovážného stavu s 0,15 M NaCl v 0,01 M pufru s fosfátem sodným o pH 7,2 (pufr A). Rychlost průtoku je 0,75 ml/min. Vzorek se nanese na sloupec a sloupec se promývá pufrem A k odstranění nenavázaného materiálu. Vázaný materiál se pak vymývá při použití lineárního koncentračního gradientu chloridu sodného v rozmezí 0,15 až 0,65 M celkem 5 minut a pak v rozmezí 0,65 až 1,15 M po dobu 30 minut. Antigen v odebraných frakcích se prokazuje zkouškou immuno dot blot. Frakce, které obsahují imunoreaktivní materiál a vymývají se v rozmezí 0,81 a l,05M NaCl se spojí.

Spojené frakce se zahustí při použití zařízení Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) až na 1/5 původního objemu.

Koncentrát se podrobí frakcionaci chromatografií při použití pryskyřice Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) na sloupci s výškou 87 cm a vnitřním průměrem 27 mm. Rychlost průtoku je 2,5 ml/min. Eluce bílkoviny se sleduje při 280 nm, přítomnost antigenu se prokazuje imunoblotovou zkouškou.

Frakce s obsahem imunoreaktivního materiálu se spojí a zahustí ultrafiltrací za míchání v komoře (Amicon, lne., Beverly, MA) s membránou s průměrem 43 mm, YM-100 (Amicon, lne., Beverly, MA) pod dusíkem při tlaku 0,07 MPa.

Výsledný produkt se charakterizuje pomocí SDS/PAGE při barvení Coomassie a kapilární elektroforézou SSCE. Výsledný produkt, získaný podle schématu 2 měl čistotu 88 % podle výsledku SSCE.

Příklad 21

A. Čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu CRPV LI - schéma 3

Všechny stupně se provádějí při teplotě 4 °C, neníli uvedeno jinak.

Q

Buněčný materiál, uložený při -70 0 se po roztátí suspenduje ve stejném objemu pufru pro rozrušení buněk, který obsahuje 20 mM fosfátu sodného o pK 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. K suspenzi se přidají inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A do konečné koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Pak se buněčný materiál rozruší při použití systému aioNeb Cail Disruptor (C-Las-Ooi Apparatus Co., Terra Raute, ΣΝ) . lysát se vyčsří odstředěním 10 minut při 5000 g.

Supernatant se navrštví na ru li s výškou 5 cm a bílkovina hodiny při 100 000 g. Usazenina v 1/10 objemů pudru Li. Suspenze 10 minut při 5000 g.

vrstvu 4=% sacharosy v pudli se usadí odstředěním 4 se uvede znovu do suspenze se opět vyčeří odstředěním

Supernatant se extrahuje jednou polovinou svého objemu chloroformem. Vodná vrstva se oddělí a vyčeří odstředěním při 12 000 ot/min na mikroodstředivce Beckman celkem 5 minut při teplotě místnosti.

Supernatant se zředí P3S v poměru 1:5a směs se znovu odstředí při použití rotoru Servali SA-600 při 6500 ot/min 10 minut při teplotě 4 °C. Supernatant se zfiltruje přes filtr s průměrem otvoru 0,22 mikrometrů a frakcionuje se chromatografií na aniontoměnici.

Chromatografie na aniontoměniči se provádí s použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie na zařízení Perkin-Elmer Series 410 Biopump se vstřikovací smyčkou s objemem 5 ml. Jako prostředí pro chromatografii se užije pryskyřice Practogel EMF TMAE-550 (S) s průměrem částic 25 až +0 mikrometrů (EM Separations, Gibbstown, NJ), užije se skleněný sloupec s výškou ISO mm a vnitřním průměrem 10 mm. Vymývání bílkoviny ze sloupce se sleduje optickou detekcí při 230 nm a zařízení Perkin-Elmer LC-235 s diodovým detektorem. Sloupec se předem uvede do rovnovážného stavu s 0,15 M NaCl v 0,01 M pufru s fosfátem sodným o pH 7,2 (pufr A). Rychlost průtoku je 0,75 ml/min. Vzorek se nanese na sloupec a sloupec se prcmývá pufrem A k odstranění nenavázaného materiálu. Vázaný materiál se pak vymývá při použití lineárního koncentračního gradientu chloridu sodného v rozmezí 0,15 až 0,55 M celkem 5 minut a pak v rozmezí 0,55 až 1,15 M po dobu 30 minut. Antigen v odebraných frakcích se prokazuje zkouškou immuno dot blot. Frakce, které obsahují imunoreaktivní materiál a vymývají se v rozmezí 0,81 a l,05M NaCl se spojí.

Spojené frakce se zahustí při použití zařízení Macrosep (PilZron Technology Corp., Norzhborough, MA) až na 1/5 původního objemu.

Koncentrát se podrobí frakcionaci chromatografií při použití pryskyřice Sephacryl S-LOCO SE (Pharmacia, Fiscataway, NJ) na sloupci s výškou 87 cm a vnitřním průměrem 27 mm. Rychlost průtoku je 2,5 ml/min. Eluce bílkoviny se sleduje při 230 nm, přítomnost antigenu se prokazuje imunobiotovou zkouškou.

Frakce s obsahem imunoreaktivního materiálu se spojí a zahustí ultrafiltrací za míchání v komoře (Amicor.,

Inc., Beverly, MA) s membránou s průměrem ^2 mm, YM-100 (Amicon, Inc., Beverly, MA) pod dusíkem při tlaku 0,07 MPa.

Výsledný produkt byl charakterizován pomocí SDS/PAGE při barvení Coomassie a pak kapilární elektroforézou SSCE. Výsledný produkt ze schématu 3 měl čistotu 95. % podle výsledků SSCE.

Příklad 22

Exprese CRPV LI a HPV typ 5a LI (kmen 1644) v komplexním obohaceném chemicky definovaném prostředí

Očkovací materiál těchto kmenů byl vypěstován na syntetickém prostředí bez leucinu, tak jak bylo popsáno svrchu. Třepací lahve byly opatřeny lopatkami pro větší provzdušnění (70 ml kapaliny na láhev s objemem 300 ml, Tunair Labware) a prostředí bylo doplněno přibližně 0,5 ml/1 protipěnivého prostředku UCON LB-625, Union Carbide). Obohacené komplexní prostředí obsahovalo v 1 litru: 40 g extraktu z kvasnic Difco, 20 g peptonu HySoy, Sheffield, 30 g glukosy a 50 g galaktosy, před sterilizací se pH prostředí upraví na hodnotu 5,3. Chemicky definované prostředí bylo obdobné prostředí, které bylo popsáno v publikaci Oura, Biotechnol. Bioengineer., 16, 1197 - 1212, 1974, bylo však doplněno na 1 litr následujícími složkami: 0,1 g cholinchloridu, 0,4g adeninu, 30 g glutamátu sodného jako zdroje dusíku, 0,2 g uracilu, 20 g glukosy, 40 g galaktosy. Lahve byly naočkovány 3 ml očkovacího materiálu a inkubovány 66 hodin při 28°C a při 250 ot/min na rotační třepačce. Z lahví byly v určitých časových intervalech odebírány vzorky pro ověření exprese metodou imunoblot při použití antisér proti CRPV LI a proti HPV 6a Li.

Příklad 23

Klonování genomu GPV-6a

Tkáň nemocného se závažným výskytem condylomata accuminata (Dr. Darron Brown, Indiana University Shool of Medicíně) , byla analyzována restrikčními enzymy a pomocí PCR a bylo prokázáno, že obsahuje HPV typu 6a. Ze vzorku tkáně byla extrahována DNA a rozštěpena enzymem HindlII. Pak byl materiál frakcionován na 0,8% agarosovém gelu s nízkou teplotou tání, z preparativního gelu byla vyříznuta oblast.

, TM odpovídající 8 kb a agarosa byla zpracovaná enzymem Geiase (Epicentre Technologies, lne.). Vzorek byl navázán na clasmid pUC18, předem rozštěpený HindlII a defosforylovaný (Pharmacia, lne.). Po transformaci příslušných buněk E. coli DH5 (BRL), byla plasmidová banka vyšetřena na přítomnost HPV-6a-pozitivních klonů při použití P-značeného oligcdeoxynukleotidu, komplementárního ke genu HPV-6a LI. Plasmid pUC18 s obsahem genomu HPV-6a o 8 kb byl izolován a charakterizován působením restrikčních enzymů a analýzou Southern blot. Vzniklý plasmid byl označen pUC18-HPV-6a.

Byla provedena analýza sekvence úplného genomu HPV-6a o 8 kb při použití automatického analyzátoru ABI (373A) podle pokynů výrobce.

Velký exemplář condyloma accuminatum byl získán cd 25 let staré ženy po porodu. Fragment tohoto exempláře byl zmrazen v kapalném dusíku a pak zpracováván při zvětšení pomocí přístroje Braun mikrodismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen, SRN). Výsledný materiál byl solubilizován působením 0,6% dodecylsulfátu sodného SDS, zpracován proteinázou K 50 mikrogramů/ml a extrahován směsí fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu. DNA byla vysrážena ethanolem a její množství bylo stanoveno spektrofotometricky v UV-záření. Přítomnost DNA s vysokou molekulovou hmotností byla

I prokázána elektroforézou na agarosovém gelu s následným barvením ethidiumbromidem.

DNA typu HPV byla určena při použití tvorby hybridu při použití zkušebního balíčku Vira Type Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). Použité sondy HPV byly rozděleny do dvou skupin v závislosti na vztahu určitého typu ke zhoubným afekcím pohlavních orgánů. Skupina A obsahovala typy s nízkým rizikem, HPV6, 11, 42, 43 a 44, kdežto skupina B obsahovala typy s vysokým rizikem 16, 18, 31,, 33, 3'5, 45, 51, 52 a 56. Celková DNA byla rozštěpena enzymy Pstl, BamHI a HindlII a metoda Southern blot byla prováděna za velmi omezujících podmínek (T -15 °C), aby bylo možno stanovit podtyp HPL.

Aby bylo možno určit úplnou sekvenci HPV 6a, byly syntetizovány primery pro analýzu na bázi zveřejněné sekvence HPV6b. Oba řetězce úplného genomu HPV6a o 8,1 kbp byly analyzovány dideoxyterminačním postupem při použití zkušebního balíčku PRISM a automatického analyzátoru (373A) podle pokynů výrobce (Applied Biosystems, ABI, lne., Foster City, CA). V případě, že negativní a pozitivní sekvence si neodpovídaly, byly syntetizovány další specifické primery pro HPV6a tak, aby bylo možno provést opakovanou analýzu uvedené oblasti v obou směrech a dosáhnout úspěchu.

Sekvence DNA pro HPV6a a HPV6b jsou totožné z 97 %,. u celkem 8010 bp bylo možno prokázat celkem 229 změn v párech baží. Nejvýznamnější rozdíly ve srovnání se sekvencí HPV6b bylo možno prokázat v dlouhé řídící oblasti (LRC, nt 7205 až nt 106). Kromě několika změn, týkajících se jednotlivých nukleotidů (nt) v oblasti HPV6a LOR, bylo možno prokázat uložení úseků o 94 bp při nt 7350 a dalšího úseku o velikosti 19 bp při nt 7804. Při nt 7615 je v genomu HPV6a vypuštěno šest párů baží.

Příklad 24

Konstrukce vektoru pro expresi HPV6a LI v kvasinkách

DNA HPV typu 6a byla užita jako matrice pro PCR. Gen HPB6a LI byl amplifikován pomocí PCR při použití polymerázy Vent (New England Biolabs., Inc.), bylo provedeno 35 cyklů amplifikace, vždy 94 °C 1 minuta, 48 °C 1 minuta a 72 °C 1 minuta 45 sekund, užity byly následující oligodeoxynukleotidové primery, obsahující místa BglII na zakončení (podtrženo ) :

Negativní primer:

5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3 (řetězec č. 11)

Positivní primer:

5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (řetězec č. 12)

Negativní primer zavádí nepřenášenou vedoucí sekvenci z kvasinek bezprostředně proti směru exprese iniciačního kodonu pro methionin v sekvenci HPV6a LI (silná písmena). Produkt PCR LI o 1,5 kbp se rozštěpí BglII a čistí na gelu. Vektor pro expresi pCl/l-GAL se zkonstruuje tak, že se izoluje fragment Sphl o 1,4 kbp z dvousměrného promotorového vektoru pUC18-GALlp-GAL10p,obsahujícího divergentní promotor GAL1/GAL10 z plasmidu pBM272 (Dr. Mark Johnston, Washing ton University, St. Louis), ohraničený na každé straně kopií terminárotu transkripce ADH1 z kvasinek (Bennetzen J.

L. a Halí B. D., 1982, J. Biol. Chem., 257:3018 - 3025. Ve výsledné kazetě pro expresi je místo BamHI uloženo mezi promotorem GAL1 a první kopií terminátoru transkripce ADH1 a místo Smál pro klonování je uloženo mezi divergentním pro44 motorem GAL10 a druhou kopií terminátoru transkripce ADH1. Vektor pCl/Ι z kvasinek (Rosenberg a další, Nátuře 312,

1984, 77 - 80) se rozštěpí Sphl a naváže na fragment promotoru Sphl GAL o 1,4 kbp. Výsledný vektor pCl/l-GAL se linearizuje působením BamHI, který štěpí mezi promotorem GAL1 a terminátorem transkripce ADH1. Vektor pCl/l-GAL, rozštěpený BamHI a fragment PCR HPV6a LI, rozštěpený BglII se vzájemně naváží a materiál se užije k transformaci buněk E. coli DH5 (BRL). Plasmid pCl/l-GAL se izoluje. Tento plasmid obsahuje gen HPV-6a LI a byl označen pl3173-357-6. Byla provedena analýza genu pro LI -v tomto plasmidu pomocí zařízení ABI Sequencer (373A) a bylo prokázáno, že tato sekvence je totožná se sekvencí genu pro LI v plasmidu pUC18-HPV6a příslušného klonu.

Příklad 25

Konstrukce vektoru pro expresi HPV6a LI a L2 v kvasinkách

Plasmid pl3173-357-6, pCl/l-GAL+HPV6a LI se rozštěpí enzymem Smál, který štěpí mezi promotorem GAL10 a terminátorem transkripce ADH1. Gen HPV6a L2 o 1,4 kbp se amplifikuje pomocí PCR při použití DNA plasmidu pUC18-HPV6a jako matrice. Dále se užije polymeráza Vent (New England Biolabs, Inc.) a provádí se deset cyklů PCR-amplifikace vždy 94 °C 1 minuta, 48 °C 1 minuta a 72 °C 1 minuta 45 sekund, současně se užijí následující oligodeoxynukleotidové primery, které obsahují místa působení Smál (podtrženo):

Negativné primer:

5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3' (řetězec č. 13)

Positivní primer:

5'-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GG-3' (řetězec č. 14).

Negativní příměr zavádí nepřenášenou vedoucí sekvenci z kvasinek bezprostředně proti směru exprese od iniciačního kodonu pro methionin HPV6a L2, jak je naznačeno silnými písmeny. PCR-fragment se rozštěpí Smál, čistí na gelu a naváže na plasmid pl3173-357-6, rovněž rozštěpený Smál. Plasmid pCl/I-GAL, který obsahuje oba geny pro HPV6a LI i L2 se izoluje a byl označen pl4049-7-2. Gen L2 byl analyzován automatickým zařízením (ABI Sequencer 373A) a bylo prokázáno, že je totožný s genem pro L2 v klonu plasmidu pUC18-HPV6a.

Příklad 26

Exprese HPV6a LI a současná exprese HPV6a LI a L2 v kvasinkách

Plasmidy pl3173-357-6 (pCl/l-GAL+HPV6a LI) a p-14049-7-2, pCl/l-GAL+HPV6a LI a L2 se užijí k transformaci kmenů S. cerevisiae 1569 (MATa.Ieu2-O4, prbl, adel, pep4, cir°) a 1558 (MATa, leu2-04, prbl, mnn9, adel, cir°). Výsledné rekombinantní kmeny, získané při použití hostitelského kmene 1558 byly kmeny 1644 (HPV6a LI), a 1670 (HPV6a LI + L2), jak je uvedeno v tabulce I (obr. 10). Izoláty klonů byly pěstovány při 30 °C na prostředí YEHD s obsahem 2 % galaktosy celkem 68 až 78 hodin. Po izolaci buněk byly usazeniny buněk rozrušeny skleněnými kuličkami a materiál byl analyzováni metodou immunoblot na expresi bílkoviny HPV6a LI nebo HPV6a L2. Vzorky, obsahující 40 mikrogramů celkové buněčné bílkoviny byly podrobeny elektroforéze na 10% tris-glycinovém gelu za redukčních a denaturačních podmínek a pak byl proveden elektroblot na nitrocelulosové filtry. Bílkovina LI byla prokazována při použití králičího antisera proti složené bílkovině trpE-HPVll podle Brown D. R. a další, Virology, 301:46 - 54, jako primární protilátky a úplné protilátky osla proti králičímu IgG, vázanému na peroxidázu z křenu, HRP (Amersham, lne.) jako sekundární protilátky. Filtry byly zpracovány chemiluminiscencí při použití detekčního balíčku ECL (Amersham, lne.). Ve všech vzorcích byl prokázán pás pro bílkovinu LI s molekulovou hmotností 50 000 až 55 000 s výjimkou negativní kontroly, kterou byl plasmid pCl/1 bez genu LI nebo L2.

Bílkovina L2 byla prokázána jako pás pro bílkovinu s molekulovou hmotností 70 000 při analýze Western blot při použití 1 : 250 ředění myšího séra, získaného trojí imunizací složenou bílkovinou trpE-HPV6a L2, získanou podle Carter a dalších, jako primární protilátky a ovčí protilátky proti myšímu IgG, vázanému na HRP (Amersham, lne.) jako sekundární protilátky při ředění 1 : 1000.

Pro analýzu EM (structure Probe, West Chester, PA), byl uložen podíl každého vzorku na měděnou mřížku s průměrem otvorů 20 mesh, opatřenou uhlíkovým povlakem. Na mřížku byla na 20 sekund uložena kapka 2% kyseliny fosfowolframové PTA o pH 7,0. Pak byla mřížka usušena na vzduchu před analýzou TEM. Všechna mikroskopická pozorování byla prováděna při použití elektronového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, lne.) při urychlujícím napětí 100 kV. Výsledné mikrofotografie měly zvětšení 100 OOOx.

Bylo možno pozorovat VLP s průměrem 50 až 55 nm ve všech vzorcích z kvasinek, v nichž byl uložen plasmid pro HPV6a LI nebo pro současnou expresi HPV6a LI a L2. V kontrolních vzorcích kvasinek nebylo možno VLP pozorovat.

Příklad 27

Pěstování kmene 1670 pro HPV6a L1+L2

Povrchová kultura kmene 1670 se asepticky přenese do kapalného prostředí, prostého leucinu, které obsahuje na 1 litr: 8,5 g dusíkatých baží z kvasinek Difco bez aminokyselin a síranu amonného, 0,2 g adeninu, 0,2 g uracilu, g kyseliny jantarové, 5 g síranu amonného a 0,25 g L-tyrosinu. Toto prostředí se před sterilizací upraví hydroxidem sodným na pH 5,0 až 5,3. Organismus se nechá růst 25 hodin při 28 °C za protřepávání 250 ot/min na rotační třepačce, pak se přidá sterilní glycerol do konečné koncentrace 17 g na 100 ml a pak se kultura skladuje při teplotě -70 °C po podílech 1 ml. Očkovací materiál pro fermentaci kmene 1670 se vytvoří v tomtéž prostředí, jehož se užije 500 ml v lahvi s objemem 2 litry, postupuje se tak, že se do lahve přidají obsahy dvou zmrazených podílů kultury a láhev se inkubuje 25 hodin na rotační třepačce při 250 ot/min při teplotě 28 °C. K fermentaci většího množství kmene 1670 se užije fermentor New Brunswick SF-116 s pracovním objemem 10 litrů po naočkování. Produkční prostředí obsahuje na 1 litr: 20 g extraktu z kvasinek Difco, 10 g peptonu HySoy Sheffield, 20 g glukosy a 20 g galaktosy, prostředí se před sterilizací upraví na pH 5,3. Pak se do fermentoru přenese celý obsah 500 ml svrchu uvedené kultury v lahvi s objemem 2 litry a produkční kultura se inkubuje při teplotě 28 °C při provzdušnění 5 litrů vzduchu za minutu, při 400 ot/min a při tlaku 0,025 MPa. Míchání je možno zintenzivnit tak, aby úroveň rozpuštěného kyslíku byla udržována na hodnotě vyšší než 40 % nasycení. Postup fermentace je možno sledovat měřením obsahu glukosy (Beckman Glucose 2 Analyser) a hmotovou spektrometrií (Perkin-Elmer 1200). Po 69 hodinách inkubace bylo dosaženo 9,9 g sušiny buněk na 1 litr. Kultura byla zahuštěna filtrací s použitím dutých vláken (náplň Amicon H5MP01-43 ve filtračním systému Amicon DC-10) na objem přibližně 2 litry a pak byla provedena diafiltrace proti fyziologickému roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem (2 litry) a pak byl materiál zahuštěn na přibližně 1 litr a pak rozdělen do lahví pro odstředivky s objemem

500 ml. Usazenina buněk se získá odstředěním při 8000,ot/min (rotor Sorval GS3) 20 minut při teplotě 4 °C. Po slití supernatantu se získá celkem 225 g vlhkých buněk a tento materiál se uloží až do použití při teplotě -70 °C.

Příklad 28

Čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu HPVoa LI + L2

Všechny stupně byly prováděny při teplotě 4 °C, není-li uvedeno jinak.

Buňky kmene 1670 byly uloženy ve zmrazeném stavu při -70 °C. 38,0 g zmrazených buněk bylo po roztátí při 20 až 23 °C uvedeno do suspenze v 50 ml pufru LI s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Pak byly přidány inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A do konečné koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Buněčná suspenze byla rozrušena při tlaku 56 MPa při trojím průchodu mikrofluidizačním zařízením MHO (Microfluidics Corp., Mewton, MA) . Suspenze rozrušených buněk byla odstředěna 10 minut při 5000 g k odstranění buněčné drti. Pak byl oddělen supernatant, obsahující antigen LI + L2.

Supernatant byl zředěn v poměru 1 : 5 přidáním pufru A (20 mM MOPS o pH 7,0) a nanesen na sloupec aniontoměniče s výškou 4 cm a vnitřním průměrem 5 cm s náplní pryskyřice Fractogel^R EMD ZMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) v rovnovážném stavu v pufru A. Po promytí pufrem A byl antigen vymýván gradientem 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. V jednotlivých frakcích byla sledována přítomnost bílkoviny LI zkouškou immunodot blot.

Frakce, u nichž byla touto metodou bílkovina LI identifikována, byly analyzovány na celkové množství bílkoviny podle Bradforda a pak byla provedena analýza na SDS-PAGE při barvení stříbrem a metoda Western blot.

Frakce z pryskyřice TMAE se srovnatelnou čistotou a obsahem bílkoviny LI byly spojeny. Antigén byl koncentrován frakcionací síranem amonným. Roztok byl nasycen síranem amon ným na 63 % přidáním pevného reakčního Činidla a opatrným mícháním celkem 30 minut. Vzorek byl uložen do ledu, srážení probíhalo 30 minut. Pak byl vzorek odstředěn při 12 OOOg. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze ve 20 ml PBS (6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2 a 150 mM NaCl).

Resuspendovaná usazenina byla chromatografována na sloupci s výškou 89 cm a vnitřním průměrem 2,6 cm s náplní pryskyřice Sephacryl 500 HJ (Pharmacia, Piscataway, NJ).

K eluci byl použit PBS. Chromatografie byla prováděna při teplotě 20 až 23 °C. Frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE při barvení stříbrem a detekcí metodou Western blot. Nejčistší frakce byly spojeny a zkoncentrovány.

Výsledný produkt byl analyzován na SDS-PAGE při barvení koloidním barvivém Coomassie. Bylo prokázáno, že bílkoviny LI a L2 jsou z 85 % homogenní. Jejich totožnost byla potvrzena metodou Western blot při použití příslušného antisera. Produkt byl rozdělen na podíly a uložen při teplotě -70 °C. Bylo získáno celkem 3,0 mg bílkoviny.

Elektronová mikroskopie byla provedena pomocí Structure Probe (West Chester, PA). Podíl vzorku byl uložen na měděnou mřížku s průměrem otvorů 200 mesh, opatřenou uhlíkovým povlakem. Na tuto mřížku byla na 20 sekund uložena kapka 2% kyseliny fosfowolfrámové o pH 7,0. Před mikroskopií byla mřížka usušena na vzduchu. Mikroskopické pozorování bylo prováděno na elektronovém mikroskopu JEOL 100 CX (JEOL USA, lne.) při urychlujícím napětí 100 kV. Mikrofotografie měly konečné zvětšení 100 OOOx. Bylo možno prokázat přítomnost částic, podobných viru s průměrem v rozmezí 50 až 55 nm.

Příklad 29

Čištění VLP HPV-5a LI a L1/L2 pro sledování EM

Bílkoviny HPV-6a LI a HPV-6a L1+L2 byly po expresi v kvasinkách částečně čištěny a koncentrovány pro sledování elektronovým mikroskopem (EM). 1 litr až 1,5 litrů prostředí YEHD s obsahem 2 % galaktosy a 0,1 M sorbitolu byla naočkována kmenem S. cerevisiae 1558, obsahujícím plasmid j pl3173-357-5 (vektor pro expresi LI) nebo plasmid pl4049- j

-7-2 (vektor pro současnou expresi LI a L2) a materiál byl pěstován při teplotě 30 °C celkem 68 až 78 hodin. Buněčný materiál byl odstředěn 10 minut při 4000 g a usazenina buněk byla uložena při -70 °C. Všechny následující stupně byly prováděny při teplotě 4 °C. Po roztátí byl buněčný materiál uveden do suspenze ve stejném objemu pufru LI, obsahujícího 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. K suspenzi byly přidány inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A do konečné koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Buňky byly rozrušeny 3 až 5‘ průchody mikrofluidizačním přístrojem.

Lysát byl vyčeřen odstředěním 10 minut při 5000 g. Supernatant byl navrstven na vrchol vrstvy 45% sacharosy v pufru LI s výškou 5 cm a bílkovina LI nebo LI + L2 byly usazeny odstředěním 4 hodiny při 100 000 g. Pak byla usazenina znovu uvedena do suspenze v 1/10 objemu pufru LI a suspenze byla vyčeřena odstředěním 10 minut při 5000 g. Vzorky byly sledovány pomocí EM a bylo prokázáno, že obsahují částice, podobné viru.

Příklad 30

Klonování genů HPV16 LI a L2

Celková DNA genomu byla extrahována z buněk Caski.

ATCC CRL 1550, standardními postupy podle svrchu uvedené publikace Sambrooka a dalších. DNA pak byla rozštěpena endonukleázami Bstl 1071 a Sphl a podrobena elektroforéze na preparativním 0,8% agarosovém gelu s nízkou teplotou tání.

Z gelu byla vyříznuta oblast, odpovídající DNA o velikosti přibližně 3,5 kbp a agarosa byla zpracována působením enzymu Gelase (Epicentre Technologies, lne.). DNA, čištěna „ , ,4 na gelu byla zpracovaná vyplněním konců T DNA polymerazou a navázána na fosforylované oligodeoxynukleotidové spojovníky s vyplněnými zakončeními, obsahujícími místo HindIZI. Vazná směs byla úplně rozštěpena enzymem HindlII a DNA byla frakcionována na agarosovém gelu stejně jako svrchu. Čištěná DNA o přibližně 3,5 kbp pak byla navázána na DNA plasmidu pUC18, který byl rovněž rozštěpen HindlII a defosforylován. Po transformaci buněk E. coli DH5 (BRL), byla plasmidová banka vyšetřena na přítomnost HPV 16-positivních klonů hybridizací klonů při použití positivního P-znaceného oligodeoxynukleotidu, komplementárního k 3 -zakončení genu HPV-16 LI (5'-GAG AGA TCT TAO AGC TTA CGT TTT TTG GGT TTA GC-3*). Plasmid pUC18, obsahující fragment genomu HPV16 o 3,3 kbp byl isolován a charakterizován restrikčními enzymy a analýzou Southern blot. Tento plasmid byl označen pUC18-HPV 16 L1/L2 a obsahuje celou kódovou sekvenci DNA pro LI a L2. DNA plasmidu byla připravena při použití balíčku Qiagen Plasmid Maxi kit (Qiagen, lne.).

Příklad 31

Konstrukce vektoru pro expresi HPV16 LI v kvasinkách

Klon pUC18-HPV16 L1/L2 byl použit jako matnice pro PCR. Gen HPV16 LI byl amplifikován pomocí PCR při použití polymerázy Vent (New England Biolabs., Inc.), bylo užito 10 cyklů amplifikace, vždy 94 °C 1 minuta, 48 °C 1 minuta a 72 °C 1 minuta 45 sekund, použity byly následující oligodeoxynukleotidové primery s místy BglII (podtrženo):

Negativní primer:

5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC-3' (řetězec č. 15)

Positivní primer:

5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3' (řetězec č. 16).

Negativní primer zavádí nepřenášenou vedoucí sekvenci z kvasinek bezprostředně proti směru exprese iniciačního methioninového kodonu HPV16 LI, který je vyznačen silnými písmeny. PCR produkt LI o 1,5 kbp byl rozštěpen BglII, čištěn na gelu a navázán na vektor pCl/l-GAL, rozštěpený BamHI. Plasmid pCl/l-GAL byl izolován ve formě, obsahující gen HPV16 LI a tato forma byla označena pl4049-37-l. Byla provedena analýza sekvence genu LI v tomto plasmidu při použití balíčku PRISM (ABI, Inc.) a analyzátoru ABI Sequencer Model 373A podle návodu výrobce. Bylo prokázáno, že gen LI v tomto izolátu obsahuje tři změny v nukleotidech ve srovnání se zveřejněnou sekvencí prototypu podle Kirnbauer R. a další, 1993, J. Virol., 67:6929 - 6936, což má za následek dvě změny aminokyselin, His-202 na Asp a Thr-266 na Ala. Analýza sekvence původní matrice DNA potvrdila, že tyto změny jsou přítomny i v genomu klonu pUC18-HPV16 L1/L2 a nebyly způsobeny při provádění PCR.

Příklad 32

Konstrukce vektoru pro expresi HPV16 LI + L2 v kvasinkách

Plasmid pl4049-37-l, pC1/1-GAL+HPV16 LI se rozštěpí enzymem Smál, který štěpí mezi promotorem GAL10 a terminátorem transkripce ADH1. Gen HPV15 o 1,4 kbp se amplifikuje pomocí PCR při použití DNA plasmidu pUC18-HPV16 L1/L2 jako matrice, polymerázy Vent (New England Biolabs, lne.), deseti cyklů PCR-amplifikace, vždy 94 °C jedna minuta, 48 1 minuta a 72 °C 1 minuta 45 sekund a následujících oligodeoxynukleotidových primerů, obsahujících místo působení Smál (podtrženo).

Negativní primer:

5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA AAC GTT CTCCAA AAC-3* (řetězec č. 17).

Positivní primer:

5'-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TGA-3' (řetězec č. 18).

Negativní primer zavádí nepřenášenou vedoucí sekvenci kvasinek bezprostředně proti směru exprese iniciačního methioninového kodonu HPV16 L2, který je označen silnějšími písmeny. Produkt ECR L2 o 1,4 kbp se rozštěpí enzymem Smál, materiál se čistí na gelu a pak se naváže na vektor pl4049-37-l, rovněž rozštěpený Smál. Plasmid pCl/l-GAL. obsahující oba geny HPV15 LI i L2 se izoluje a byl označen pl4049-42-2. Gen L2 v tomto plasmidu byl analyzován při použití balíčku PRISM (ABI, lne.) a zařízení ABI Sequencer Model 373A podle pokynů výrobce. Bylo prokázáno, že gen L2 v tomto izolátu obsahuje pět změn v nukleotidech ve srovnání se zveřejněnou sekvencí, Kirnbauer R. a další, 199Ξ svrchu. Tyto změny mají za následek změnu jedné aminokyseliny,

Ser-269 na Pro. Analýza sekvence klonu genomu pUC18-HPV16 L1/L2 potvrdila, že tato změna již byla přítomna v původní matrici DNA a nebyla způsobena PCR.

Příklad 33

A. Exprese HPV16 LI a současná exprese HPV16 LI a L2 v kvasinkách

Plaámidy PL4049-37-1, pCl/1-GAL+HPV16 LI a pl4049-42-2, pCl/1-GAL+HPV16 LI a L2 byly použity pro transformaci S. cerevisiae, kmene 1558. Výsledné rekombinantní kmeny byly označeny 1678 (HPV16-L1) a 1679 (HPV16 L1+L2), jak je zná^ zorněno v tabulce I na obr. 10. Izoláty klonů byly pěstovány při teplotě 30 °C na prostředí YEHD s obsahem 2 % galaktosy celkem 68 až 78 hodin. Po izolaci buněk byla usazenina buněk rozrušena skleněnými kuličkami a lysáty buněk byly analyzovány na expresi bílkoviny HPV16 LI nebo HPV16 L2 analýzou imunoblot. Vzorky obsahující 40 mikrogramů celkové buněčné bílkoviny byly podrobeny elektroforéze na 10% tris-glycinovém gelu za redukčních a denaturačních podmínek a pak byl proveden elektroblot na nitrocelulosové filtry. Bílkovina HPL16 LI byla prokazována imunologicky při použití králičího polyklonálního antiséra proti složené bílkovině trpE-HPVll LI (D. Brown a další, Virology, 201:46 - 54) jako primární protilátky a protlátky osla proti králičímu IgG, konjugovanému s HRP (Amersham, lne.) jako sekundární protilátky. Filtry byly zpracovány balíčkem pro chemiluminiscenci (Amersham, lne.) . Ve všech vzorcích byla prokázána bílkovina LI s molekulovou hmotností 50 000 až 55 000 s výjimkou negativních kontrol, které obsahovaly plasmid pCl/1 bez genu LI nebo L2. Bílkovina L2 bylaprokazována jako pás bílkoviny s molekulovou hmotností 70 000 metodou imunoblot při použití myší protilátky proti složené bílkovině trpE-L2 po její expresi E. soli jako primární protilátky. Jako sekundární protilátka byla užita kozí protilátka proti myšímu IgG, vázaná na HRP (Amersham, lne.) a filtry byly zpracovány svrchu uvedeným způsobem.

B. Čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu HPV16 L1+L2

Všechny stupně byly prováděny při teplotě 4 °C, není-li uvedeno jinak.

3uňky kmene 1670 byly uloženy ve zmrazeném stavu při -70 °C. 38,0 g zmrazených buněk bylo po roztátí při 20 až 23 °C uvedeno do suspenze v 50 ml pufru LI s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Pak byly přidány inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A do konečné koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Buněčná suspenze byla rozrušena při tlaku 56 MPa při trojím průchodu mikrofluidizačním zařízením MHO (Microfluidics Corp., Mewton, MA) . Suspenze rozrušených buněk byla odstředěna 10 minut při 5000 g k odstranění buněčné drti. Pak byl oddělen supernatant, obsahující antigen LI + L2.

Supernatant byl zředěn v poměru 1 : 5 přidáním pufru A (20 mM MOPS o pH 7,0) a nanesen na sloupec aniontoměniče s výškou 4 cm a vnitřním průměrem 5 cm s náplní pryskyřice Fractogel EMD ΖΜΑΞ-650 (S) (EM Separatior.s, Gibbstown, NJ) v rovnovážném stavu v pufru A. Po promytí pufrem A byl antigen vymýván gradientem 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. V jednotlivých frakcích byla sledována přítomnost bílkoviny Li zkouš kou immunodot blot.

Frakce, u nichž byla touto metodou bílkovina LI identifikována, byly analyzovány na celkové množství bílkoviny podle Bradforda a pak byla provedena analýza na SDS-RAGE při barvení stříbrem a metoda Western blot.

Frakce TMAE se srovnatelnou čistotou a obsahem bílkoviny LI byly spojeny. Antigen byl koncentrován frakcionací síranem amonným. Vzorky byly upraveny síranem amonným do nasycení 48 % přidáním pevného reakčního Činidla za opatrného míchání v průběhu 30 minut. Vzorky byly uloženy do ledu, srážení probíhalo přes noc. Pak byly vzorky odstředěny při 12 000 g. Usazenina byla uvedena do suspenze ve 20 0 ml PBS s obsahem 6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2 a 150 mM NaCl.

Resuspendované usazeniny byly chromatografovány odděleně na sloupci s výškou 89 cm a vnitřním průměrem 2,6 cm s náplní pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ) při teplotě 20 až 23 °C. Elučním činidlem byl PBS. Frakce byly analyzovány na SDS-PAGE při barvení stříbrem a metodou Western blot. Nejčistší frakce byly spojeny. Pak byl materiál koncentrován v komoře s objemem 50 ml za míchání při použití membrány YM-100 s průměrem 43 mm (Amicon, Beverly, MA) při tlaku dusíku 0,03 až 0,06 MPa.

Produkt byl analyzován na SDS-PAGE při barvení koloidní Coomassie. Bylo prokázáno, že bílkoviny LI a L2 jsou homogenní ze 70 %. Jejich totožnost byla potvrzena metodou Western blot při použití příslušných antisér. Produkt byl rozdělen na podíly a uložen při -70 °C. Celkem bylo získáno 0,53 mg bílkoviny.

Analýza elektronovým mikroskopem byla prováděna při použití balíčku Structure Probe (West Chester, PA). Podíl vzorku byl uložen na měděnou mřížku s průměrem otvorů 200 mesh, opatřenou povlakem uhlíku. Na mřížku byla na 20 sekund nanesena kapka 2% kyseliny fosfowolfrámové o.pH 7,0. Mřížka byla usušena na vzduchu před sledováním mikroskopem. Byl užit mikroskop JEOL 100 CX (JEOL ZSA, Inc.) s urychlujícím napětím 100 kV. Mikrofotografie měly zvětšení 100 OOOx.

V materiálu byly prokázány částice, podobné viru s rozměrem 50 až 55 nm.

C. Čištění rekombinantních bílkovin kapcidu HPV16 L1 + L2

Všechny stupně byly prováděny při teplotě 4 °C , není-li uvedeno jinak.

Buněčný materiál byl uložen pří -70 °C. 92,8 g buněk bylo po rotátí při teplotě 20 až 23 °C uvedeno do suspenze ve 105 ml pufru LI s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pR 7,2 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A byly přidány do konečné koncentrace 2 mM a 1, mikroM. Buněčná suspenze byla rozrušena při tlaku přibližně 100 MPa trojím průchodem mikrofluidisačním přístrojem M110-Y (Microfluidics Cor., Newton, MA). Rozrušená suspenze byla odstředěna 15 minut při 6100 g k odstranění buněčné drti. Kapalný supernatant s obsahem antigenu LI + L2 byl oddělen.

Pak byl supernatant zředěn 1 : 5 přidáním pufru A (20 mM MOPS, pH 7,0) a nanese na sloupec aniontoměniče s výškou 4,2 cm a vnitřním průměrem 5,0 cm s náplní pryskyřice Fractogel^R EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) v rovnovážném stavu v pufru A. Po promytí pufrem A byl antigen vymýván při použití gradientu 0 až 0,1 M NaCl v pufru A. Ke stanovení obsahu LI ve frakcích byl užit imunodot blot.

Frakce s obsahem bílkoviny LI byly analyzovány na cel kovy obsah bílkoviny podle Bradforda a pak zpracovány na SDS-PAGE při barvení stříbrem a metodou Western blot.

Frakce TMAE se srovnatelnou čistotou a obsahem bílkoviny LI byly spojeny a antigen byl koncentrován frakcionací síranem amonným. Vzorky byly upraveny na nasycení síranem amonným 35 % přidáním pevného reakčního činidla v průběhu 10 minut za opatrného míchání. Vzorky byly uloženy do ledu, srážení trvalo 4 hodiny. Vzorky byly odstředěny při 12 000 g. Usazeniny byly uvedeny do suspenze ve 20,0 ml PBS (5,25 mM . fosfátu sodného o pH 7,2 a 150 mM NaCl) s obsahem 1 mM EDTA.

Resuspendované pelety byly odděleně chromatografovány na sloupci s výškou 89 cm a vnitřním průměrem 2,6 cm s náplní pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ).

K eluci byl užit PBS .+ 1 mM EDTA. Frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE při barvení stříbrem a metodou Western blot. Nejčistší frakce byly spojeny a koncentrovány v komoře s obsahem 50 ml při použití membrány YM-100 s průměrem 43 mm (Amicon, Beverly, MA) pod dusíkem při tlaku 0,02 až 0,04 MPa.

Produkt byl analyzován na SDS-PAGE při barvení koloidní Coomassie. Bylo prokázáno, že bílkoviny LI a L2 jsou homogenní ze 70 %. Jejich totožnost byla potvrzena metodou Western Blot při použití příslušných antisér. Produkt byl rozdělen na podíly a uložen při -70 °C. Tímto způsobem bylo získáno celkem 3,8 mg bílkoviny.·

Příklad 34

A. Fermentace kmene 1679, HPV16 LI + L2

Příprava zmrazené zásobní kultury, očkovacího materiálu, fermentace a izolace kmene 1679 byla prováděna stejným způsobem jako svrchu. Po 67 hodinách inkubace bylo získáno 4,2 g sušiny buněk na 1 litr prostředí, celkem bylo získáno 93 g vlhké usazeniny buněk.

B. Fermentace kmene 1678 HPV16 LI

Postupy pro přípravu zmrazené zásobní kultury, očkovacího materiálu, fermentace a izolace buněk kmene 16~3 byly provedeny stejně jako svrchu. Po 70,5 hodinách inkubace byly spojeny obsahy dvou fermentoru po 10 litrech, bylo získáno 8,7 g sušiny buněk na 1 litr živného prosoředí a celkem 258 g vlhké usazeniny buněk.

C. Čištění rekombinantních bílkovin kapsidu HPV16 LI

Všechny stupně byly provedeny při teplotě 4 °C, není-li uvedeno jinak.

Buňky kmene 1678 byly uloženy při teplotě -70 °C.

128 g buněk bylo po roztátí při teplotě 20 až 23 °C uvedeno do suspenze ve 140 ml modifikovaného pufru LI s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2 a 100 mM NaCl. Inhibitory proteázy PMSF a pepstatin A byly přidány do konečné koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Buněčná suspenze byla rozrušena při tlaku přibližně 100 MPa trojím průchodem mikrofluidisačním přístrojem M110-Y (Microfluidics Corp., Newton. MA) . Rozrušená suspenze byla odstředěna 40 minut při 11 00C g k odstranění buněčné drti. Pak byl oddělen kapalný suoernatant, obsahující antigen LI.

Supernatant byl zředěn 1 : 5 pufrem A (20 mM MOPS, pH 7,0) a nanesen na sloupec aniontoměniče s výškou 6,4 cm R a vnitřním průměrem 5,0 cm s náplní pryskyřice Fractogel EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) v rovnováž něm stavu pufru A. Po promytí pufrem A byl antigen vymýván při použití gradientu 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. Ke scanove ní obsahu LI ve frakcích byl použit imunodot blot.

Frakce, které obsahovaly bílkovinu LI byly analyzovány na celkový obsah bílkoviny podle Bradforda a pak zpracovány na SDS-PAGE při barvení srříbrem a metodou Western blot.

Frakce TMAE se srovnatelnou čistotou a obsahem bílkoviny LI byly spojeny. Antigen byl koncentrován fraktionací síranem amonným. Vzorky byly upraveny na nasycení síranem amonným na 35 % přidáním pevného reakčního činidla v průběhu 10 minut za opatrného míchání. Vzorky byly uloženy do ledu, srážení probíhalo 5 hodin. Pak byly vzorky odstředěny při 12 000 g. Usazenina byla uvedena do suspenze ve 20,0 ml PBS s obsahem 6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2 a 150 mM NaCl.

Resuspendované pelety byly odděleně chromatografovány na sloupci s výškou 89 cm a vnitřním průměrem 2,6 cm s náplní pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway,

NJ) . Jako eluční činidlo byl užit PBS. Frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE při barvení stříbrem a také metodou Western blot. Nejčistší frakce byly spojeny a koncentrovány v komoře s objemem 50 ml při použití membrány YM-100 s průměrem 43 mm (Amicon, Beverly, MA) pod dusíkem při tlaku v rozmezí 0,03 až 0,04 MPa.

Produkt byl analyzován pomocí SDS-PAGE při barvení koloidní Coomassie. Bílkovina LI byla homogenní ze 70 %. Její totožnost byla potvrzena metodou Western blot při použití příslušných antisér. Produkt byl rozdělen na podíly a uložen při -70 °C. Tímto způsobem bylo získáno celkem 7,4 mg bílkoviny.

D. Analytické postupy

Metoda Imunodot blot

V případe potřeby byly vzorky zředěny 1 : 10 v Milli-Q-H-0 a pak bylo vždy 10 mikrolitrů vzorku naneseno na . TM , membrány PolyScreen PVDF (NEN Research Products, Boston, MA) . Po usušení skvrn byly membrány omyty vodou a usušeny. Primární roztok protilátky byl připraven ředěním příslušného antiséra v pufru pro blot (5 % odtučněného mléka v 6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN^). Inkubace byla prováděna nejméně 1 hodinu při teplotě 20 až 23 °C. Blot byl promýván 1 minutu, třikrát vždy v čerstvém PBS (6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundární protilátky byl připraven zředěním příslušného konjugátu antiséra a alkalické fosfatázy v pufru pro blot Inkubace probíhala nejména 1 hodinu za stejných podmínek, pak byly vzorky omyty stejně jako svrchu. Detekce byla prováděna při použití substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL)

Pro detekci byly použity následující protilátky: Bílkovina HPV6a LI byla prokazována při použití MAB 837 (Chemicon International, lne., Temecula, CA). HPV6a L2 byla prokazována při použití myšího séra proti složené bílkovině HPV6a L2-trpE, šarže 641 a 647. HPV16 LI byla prokazována pomocí MAB 885 (Chemicon International, lne., Temecula, CA). HPV16 L2 byla prokazována s použitím myšího antiséra proti složené bílkovině HPV16 L2-trpE, šarže 611.

Bradfordova zkouška na celkové množství bílkoviny

Celkové množství bílkoviny bylo stanoveno při použití běžně dodávaného balíčku Coomassie Plus (Pierce, Rockford, IL). Vzorky byly zředěny na příslušné ředění pomocí Milli-Q-H₂0. Objemy vzorků byly 0,1 ml a 1,0 ml pro mikrozkoušky a běžné zkoušky. V obou případech byl pro vytvoření standardní křivky použit BSA (Pierce, Rockford, IL).

Zkouška byla provedena podle doporučení výrobce. Sledování bylo prováděno srovnáním se standardní křivkou při použití softwaru CricketGraph na počítači Macintosh líci.

Příklad 35

Čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu HPV 11 LI

Všechny stupně byly prováděny při teplotě 4 °C, není-li uvedeno jinak.

Buněčný materiál byl zmrazen na teplotu -70 °C. 180 g buněk bylo rozmraženo při teplotě 20 až 23 °C a pak uvedeno do suspenze v 900 ml pufru pro rozrušení s obsahem 50 mM MOPS o pH 7,2, 500 mM NaCl a 1 mM CaClg. Pak byly přidány inhibitory proteázy AEBSF a pepstatin A do konečné koncentrace 1 mM a 1,7 mikroM. buněčná suspenze byla rozrušena při tlaku přibližně 100 MPa čtyřmi průchody mikrofluidisačním zařízením M110-Y (Microfluidics Cor., Newton, MA). Pak p

byl přidán dostatečný objem smáčedla 10 % Triton X100 (Pierce, Rockford, IL) k úpravě koncentrace uvedené látky na 0,5 %. Suspenze byla míchána 20 hodin a pak odstředěna 40 minut při 12 000 g k odstranění buněčné drti. Kapalný supernatant s obsahem bílkovin LI byl oddělen.

Supernatant se podrobí diafiltraci proti pěti objemům 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2 s 0,5 M NaCl při použití kazety 300K s membránou s tangenciálním průtokem (Filtron, Northborough, MA). Bylo prokázáno radioimunologicky a metodou Western Blot, že materiál, zadržený na membráně obsahuje bílkovinu LI.

Zadržený podíl se nanese na afinitní sloupec s výškou 5,3 cm a vnitřním průměrem 11,0 cm s náplní pryskyřice SP

Spherodex (M) (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Grancie) v rovnovážném stavu ve 20 mM fosfátu sodném o pH 7,2 s 0,5 M NaCl. Po promytí ekvilibračním pufrem a postupným promytím 20 mM fosfátem sodným o pH 7,2, s 1,0 M NaCl se bílkovina LI vymývá 20 mM fosfátem sodným o pH 7,2 s 2,5 M NaCl. Odebírají se jednotlivé frakce, v nichž se stanoví celkový obsah bílkoviny podle Bradforda. Frakce se pak analyzují metodou Western blot a SDS-PAGE při barvení koloidní Coomassie Mimoto se také frakce analyzují radioimunologicky.

Frakce z pryskyřice SP Spherodex mají srovnatelnou čistotu, frakce s větším obsahem LI byly spojeny.

Produkt byl analyzován metodou Western blot a na SDS-PAGE při detekci koloidní Coomassie. Bylo prokázáno, že bílkovina LI je homogenní z více než 90 %. Identita bílkoviny LI byla potvrzena metodou Western blot. Produkt byl asepticky odfiltrován přes membránu s průměrem ok 0,22 mikrometrů a uložen při teplotě 4 °C. Tímto způsobem bylo získáno celkem 202 mg bílkoviny.

Analýza v elektronovém mikroskopu byla provedena při použití balíčku Structure Probe (West Chester, PA). Podíl vzorku se uloží na měděnou mřížku s průměrem otvorů 20 mesh, opatřenou povlakem uhlíku. Na mřížku se na 20 sekund nanese kapka 2% kyseliny fosfowolfrámové o pH 7,0. Pak se mřížka usuší na vzduchu. Mikroskopické pozorování se provádí s použitím elektronového mikroskopu JEOL 100 CX (JEOL US, lne.) při urychlovacím napětí 100 kV. Mikrofotografie měly zvětšení 100 OOOx.

SDS-PAGE a Western blot

Všechny gely, pufry a elektroforetické zařízení byly získány od Novex (San diego, CA) a zkoušky byly prováděny podle doporučení výrobce. Vzorky byly zředěny na stejnou koncentraci bílkoviny při použití Milli-Q-H^O a smíseny 1 : 1 s inkubačním pufrem, obsahujícím 200 mM DTT. Vzorky byly inkubovány 15 minut při 100 °C a pak naneseny na předem odlité 12% tris-glycinové gely. Elektroforéza byla prováděna 1 hodinu 45 minut při 125 V. Gely byly vyvíjeny barvením koloidní Coomassie při použití běžně dodávaného balíčku (Integrated Separation Systems, Natick, MA) .

Při provádění metody Western blot byly bílkoviny přeneseny na 40 minut na membrány PVDF při 25 V. Membrány byly omyty Milli-Q-H^O a usušeny na vzduchu. Primární protilátkou bylo polyklonální králičí antisérum proti složené bílkovině TrpE-HPVll LI (dar Dr. D. Browna). Roztok protilátky byl připraven zředěním antiséra v pufru pro blot (5% odtučněné mléko v 6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN^). Vzorek se inkubuje nejméně 1 hodinu při teplotě 20 až 23 C. Pak se blot omývá vždy 1 minutu třikrát vždy čerstvým PBS (6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundární protilátka byla připravena zředěním kozího antiséra proti králičímu IgG, konjugovanému s alkalickou fosfatázou (Pierce, Rockford, IL) v pufru pro blot. Inkubace byla prováděna nejméně 1 hodinu za týchž podmínek. Bloty byly omyty jako svrchu, detekce byla prováděna v jednom stupni při použití substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL) .

Příklad 36

Exprese HPV18 LI a L2 v kvasinkách

Plasmidy pl91-6, pGall-10+HPV18 LI a pl95-ll, PGAL1-10+HPV18 LI + L2 byly použity k-transformaci S. cerevisiae, kmene 1558 (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°). Izoláty klonů byly pěstovány při 30 °C v prostředí YEHD s obsahem 2 % galaktosy celkem 88 hodin. Po izolaci buněk se usazenina buněk rozruší skleněnými kuličkami a lysát buněk se analyzuje na expresi bílkoviny HPV18 LI a/nebo HPV18 L2 pomocí imunoblotu. Vzorky, obsahující 25 mikrogramů celkové buněčné bílkoviny byly podrobeny elektroforéze na 10% tris-glycinovém gelu (Novex, Inc.) za denaturačních podmínek, mimoto byl uskutečněn elektroblot na nitrocelulosových filtrech. Bílkovina LI byla prokázána imunologicky při použití králičího antiséra proti složené bílkovině trpE-HPVll LI jako primární protilátky (Brown a další, 1994, Virology 20:46 - 54) a jako sekundární protilátka byla použita protilátka osla proti králičímu IgG, vázanému na peroxidázu z křenu, HRP (Amersham, Inc.). Filtry byly zpracovány při použití chemiluminiscenčního balícku ECL (Amersham, Inc.). V obou klonech kvasinek, to znamená kmenech 1725 a 1727 byl prokázán pás bílkoviny LI s molekulovou hmotností 50 000 až 55 000, tento pás nebyl prokázán pouze u negativní kontroly pGALl-10 bez genů LI nebo L2

Bílkovina HPV18 L2 byla prokazována analýzou Western blot při použití kozího polyklonálního antiséra proti složené bílkovině trpE-HPV18 L2 jako primární protilátce, sekundární protilátkou byla králičí protilátka proti kozímu IgG, konjugovaná s HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Filtry byly zpracovány svrchu uvedeným způsobem. Bílkovina L2 byla prokázána jako pás bílkoviny s molekulovou hmotností 75 000 v klonu kvasinek pro současnou expresi LI a L2, kmen 1727, avšak nikoliv u negativní kontroly nebo u klonu pro expresi LI.

Příklad 37

Pěstování kmene HPV18 LI, kmen 1725 a 18 LI + deltaL2, kmene 1727

Povrchově rostoucí kultura kmenů 1725 a 1727 byla z plotny asepticky přenesena do kapalného prostředí, prostého leucinu a obsahujícího v 1 litru: 8,5 g dusíkatých baží z kvasinek Difco bez aminokyselin a síranu amonného, 0,2 g adeninu, 0,2 g uracilu, 10 g kyseliny jantarové, 5 g síranu amonného, 40 g glukosy, 0,25 g L-tyrosinu, 0,1 g L-argininu, 0,3 g L-isoleucinu, 0,05 g L-methioninu, 0,2 g L-triptofanu, 0,05 g L-histidinu, 0,2 g L-lysinu, a 0,3 g L-fenylalaninu, toto prostředí bylo přidáním NaOH upraveno na pH 5,0 až 5,3 před sterilizací. Po růstu při 28 °C za protřepávání při 250 ot/min na rotační třepačce byly připraveny zmrazené podíly kultury v lahvičkách přidáním sterilního hlycerolu do konečného obsahu 17 g/100 ml s následným uložením při teplotě -70 °C, obsah kultury v každé lahvičce byl 1 ml. Očkovací materiál byl připraven v tomtéž prostředí, bylo užito vždy 500 ml prostředí v lahvi s obsahem 2 litry, kultura byla založena přenesením roztátého obsahu zmrazené lahvičky s následnou inkubací 29 hodin při teplotě 28 °C a při 250 ot/min na rotační třepačce. Fermentace každého kmene byla provedena po naočkování ve fermentoru New Brunswick SF-116 s pracovním objemem 10 litrů. Produkční prostředí obsahovalo v 1 litru: 20 g extraktu z kvasnic Difco, 10 g peptonu HySoy Sheffield, 20 g glukosy, 20 g, galaktosy, a 0,3 ml protipěnivého činidla Union Carbide UCON LB-625, před sterilizací bylo prostředí upraveno na pH 5,3. Celý objem 500 ml z lahve s objemem 2 litry byl přenesen do fermentoru s následnou inkubací při teplotě 28 °C, provzdušenění 5 litrů vzduchu za minutu, 400 ot/min, plak 0,25 MPa. Míchání bylo zintenzivněno v případě, že bylo zapotřebí zvýšit obsah rozpuštěného kyslíku na hodnotu vyšší než 40 % nasycení. Postup fermentace se sleduje měřením glukosy (3eckman Glukose 2 Analyzer) a hmotovou spektrometrií (Perkin-Elmer 1200). Po inkubaci 66 hodin bylo získáno 9,5 až 9,7 g sušiny buněk na 1 litr živného prostředí. Kultura byla zahuštěna filtrací s použitím dutých vláken (náplň Amicon H5MP01-43 ve filtračním systému Amicon DC-10) až na objem přibližně 2 litry a pak byla podrobena diafiltra ci při použití 2 litrů fyziologického roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem a dále zahuštěna až na přibližně 1 litr před rozdělením do lahví pro odstředivku s objemem 500 ml. Usazenina buněk byla získána odstředěním 20 minut při 8000 ot/min a teplotě 4 °C (rotor Sorval GS-3). Po slití supernatantu se usazenina buněk, celkem 191 až 208 g vlhké usazeniny uloží při teplotě -70 °C až do použití.

Příklad 38

Čištění rekombinantní bílkoviny kapsidu HPV18 LI z _V vz w O

Všechny stupně byly prováděny pri teplote 4 C, není-li uvedeno jinak.

Buněčný materiál byl uložen při -70 °C. 126 g buněk bylo rozmraženo při teplotě 20 až 23 °C a uvedeno do suspenze v 70 ml pufru pro rozrušení buněk s obsahem 20 mM fosfátu sodného o pH 7,2 a 100 mM NaCl. Inhibitory prcteázy PMSF a pepstatin A byly přidány do konečné koncentrace 2 mM a 1,7 mikroM. Buněčná suspenze byla rozrušena při tlaku přibližně 100 MPa čtyřmi průchody mikrofluidizačním přístrojem M110-Y (Microfluidics Cor., Newton, MA). Suspenze rosrušených buněk byla odstředěna 40 minut při 12 000 g k odstranění buněčné drti. Kapalný supernatant s obsahem antigenu LI byl oddělen.

Kapalný supernatant byl zředěn 1 : 5 přidáním pufru A (20 mM MOPS o pH 7,0) a nanesen na sloupec aniontoměniče s rozměry 3,9 cm, vnitřní průměr 9,0 cm s náplní pryskyřice Fractogel^R EMD TMAE-650 (M) (EM Separations, Gibbstown,

NJ) v rovnovážném stavu v pufru A. Po promytí pufrem A se antigen vymývá při použití gradientu 0 až 1,0 M NaCl v pufru A. Frakce byly analyzovány na celkový obsah bílkoviny podle Bradforda. Frakce se stejným obsahem bílkoviny pak byly analyzovány metodou Western blot a SDS-PAGE při barvení stříbrem.

Frakce TMAE se srovnatelnou čistotou a obsahem bílkoviny LI byly spojeny. Antigen byl koncentrován frakcionaci síranem amonným. Roztok byl upraven na 35% nasycení síranem amonným přidáváním pevného reakčního činidla za opatrného míchání v průběhu 10 minut. Pak byl vzorek uložen do ledu a srážení probíhalo ještě 4 hodiny. Pak byl materiál osdstředěn 45 minut při 16 000 g. Usazenina byla uvedena do suspenze ve 20,0 ml PBS s obsahem 6,25 mM fosfátu sodného o pH 7,2a 150 mM NaCl.

Resuspendovaná peleta byla chromatografována na sloupci s výškou 89 cm a vnitřním průměrem 2,6 cm s náplní pryskyřice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). K eluci byl užit PBS. Frakce byly analyzovány metodou Western blot a SDS-PAGE při barvení stříbrem. Nejčistší frakce byly spojeny a koncentrovány v komoře s objemem 50 ml za míchání při použití membrány s průměrem 43 mm YM-100 (Amicon,

Beverly, MA) pod dusíkem při tlaku 0,03 až 0,04 MPa.

Produkt byl analyzován metodou Western blot SDS-PAGE při detekci koloidní Coomassie. Bílkovina LI byla homogenní z 50 až 60 %, její identita byla potvrzena metodou Western blot. Výsledný produkt byl rozdělen na podíly a uložen při teplotě -70 °C. Postupem bylo získáno 12,5 mg bílkoviny.

Příklad 39

Příprava prostředků pro vyvolání imunity

Čištěná frakce VLP se zpracovává známým způsobem, například přidáním farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů nebo pomocných prostředků pro vakcíny. Imuno.genní VLP podle vynálezu je možno připravit pro použití jako vakcína smísením s fyziologicky přijatelným nosným prostředím, jako je PBS, fyziologický roztok chloridu sodného nebo destilovaná voda. VLP se podává v dávce 0,1 až 100, s výhodou 1 až 20 mikrogramů pro dosažení imunogenního účinku. Množství VLP v prostředku se může měnit v závislosti na různých faktorech, jako jsou zdravotní stav, věk, hmotnost a pohlaví. Prostředek s obsahem VLP je možno podávat různým způsobem, například perorálně, podkožně, místně, na sliznici a nitrosvalově. Prostředky mohou obsahovat VLP jediného typu, například VLP z HPB6a nebo směs VLP, například VLP z HPV6a, HPB11, HPV16 a HPV18.

Prostředek může obsahovat antimikrobiální konzervační prostředek, například thimerosal. Použité antigeny je možno kombinovat se známými stabilizátory a pomocnými látkami pro vakcíny. Typickými stabilizátory jsou některé specifické sloučeniny, například polyanionty, jako heparin, inositolhexasulfát, beta-cyklodextrin sulfát a některé méně specifické pomocné látky, jako aminokyseliny, sorbitol, mannitol, xylitol, glycero, sacharosa, dextrosa, trehalosa, nebo je možno měnit hodnotu pH, užít vysokou iontovou sílu přibližně 0,5 až 2,0 M solí, dvojvazné kationty, jako vápenatý nebo horečnatý kation. Jako příklady pomocných prostředků je možno uvést hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý. Vakcínu podle vynálezu je možno skladovat za chlazení nebo také v lyofilizované formě.

Příklad 40

Příprava protilátek proti VLP

Čištěné VLP je také možno použít pro tvorbu protilátek. Pojem protilátka v tomto případě zahrnuje polyklonální i monoklonální protilátky a jejich fragmenty, jako Fv, Fab a Fíab^, které jsou schopné vázat antigen nebo hapten. Protilátky je možno využít v různém směru, například při čištění rekombinantních VLP, k čištění nativních bílkovin LI nebo L2 a jako součást zkušebních balíčků. Tyto balíčky budou obsahovat reakční činidla, například protilátku proti VLP nebo VLP pro detekci HPV nebo fragmentů HPV nebo protilátek proti HPV. Nosič může také obsahovat prostředky pro detekci, jako značený antigen nebo substrát pro enzym a podobně. Protilátky nebo VLP nebo balíčky uvedeného typu je možno použít k řadě účelů, například k soudním účelům nebo k epidemiologickým studiím.

Zastupuje:

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná a čištěná bílkovina papilomaviru ze skupiny bílkovina Li, bílkovina L2, bílkovina LI + L2 a jejich funkční deriváty při čistotě bílkoviny nejméně 60 %.
2. 2. Bílkovina podle nároku 1, z lidského papilomaviru nebo papilomaviru králíka.
3. 3. Bílkovina podle nároku 2, z lidského papilomaviru ze skupiny HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HFV33, HPV35, HPV41, HPV45 a HPV58.
4. 4. Bílkovina podle nároku 1, produkovaná v syntetickém systému, včetně rekombinantního hostitele.
5. 5. Kapsid s obsahem bílkoviny z nároku 1.
6. 6. Částice, podobné viru, obsahující bílkovinu podle nároku 1.
7. 7. Způsob výroby čištěné bílkoviny podle nároku I, vyznačující se tím, že se

   a) transformuje hostitel rekombinantní molekulou DNA, která je kódem pro bílkovinu ze skupiny bílkovina LI papilomaviru, bílkovina L2 papilomaviru, bílkoviny LI + L2 papilomaviru, a jejich funkční deriváty,

   b) transformovaný hostitel se pěstuje za podmínek, dovolujících expresi rekombinantní molekuly DNA za vzniku surové rekombinantní bílkoviny papilomaviru, načež se

   c) surová rekombinantní bílkovina papilomaviru čistí za vzniku čištěné bílkoviny.
8. 8. Rekombinantní bílkovina papilomaviru, získatelná způsobem podle nároku 7.
9. 9. Kapsidy, obsahující bílkovinu podle nároku 7.
10. 10. Částice, podobné viru, obsahující bílkovinu podle nároku 7.
11. 11. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje bílkovinu podle nároku 1.
12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje bílkovinu podle nároku 1.

    14. Zkušební balíček pro detekci papilomaviru nebo protilátek proti papilomaviru, vyznačují cí se t í m , že obsahuje reakční činidlo ze skupiny kódová molekula DNA pro bílkovinu papilomaviru z nároku 1, bílkovinu z nároku 1, částice, podobná viru s obsahem bílkoviny podle nároku 1, protilátka proti bílkovině podle nároku 1 a protilátka proti částicím, podobným viru s obsahem bílkoviny podle nároku 1.

    15. Způsob výroby rekombinantní bílkoviny kapsidu papilomaviru, začleněné do kapsidu nebo do částice, podobné viru, vyznačující se tím, že se

    a) klonuje gen papilomaviru, který je kódem pro nejméně jednu bílkovinu kapsidu papilomaviru, ve vhodném vektoru,

    b) vektor se přenese do hostitelské buňky za vzniku rekombinantní hostitelské buňky,

    c) rekombinantní hostitelská buňka se pěstuje za podmínek, při nichž může dojít k produkci bílkoviny kapsidu papilomaviru a

    d) vytvořená bílkovina kapsidu papilomaviru se čistí.

    16. Kapsidy, získatelné způsobem podle nároku 15.

    17. Částice, podobné viru, získatelné způsobem podle nároku 15.

    '--•-iS. Způsob vyvolání odpovědi imunitního syscému u obratlovce^/ yznačující se t íxhn , že se podává čištěná biTS<Qyina podle nároku IS^nebo kapsid podle nároku 15 nebo částice. podobná^víru a získaná způsobem podle nároku 15. J/Xý

    19. Způso^-ýyvolání odpovědi irntmátního systému u živoč icha^-Vy značující se t ihrp, že se živočicjaůffípodává bílkovina podle nároku 1.

    20. Syntetický systém pro výrobu bílkoviny podle· nároku 4,vyznačující se tím, že se tento systém volí ze skupiny transformovaných hmyzích buněk, transformovaných buněk kvasinek, transformovaných bakteriálních buněk, transformovaných houbových buněk, transformovaných rostlinných buněk a transformovaných živočišných buněk.

    21. Syntetický systém podle nároku 20, v y z n ačující se tím, že se transformované buňky kva74 sinek volí ze skupiny Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragílis a Schizosaccharomyces pombe.

    22. Syntetický systém podle nároku 21, vyznačující se t í m , že se transformované buňky kvasinek Saccharomyces cerevisiae volí ze skupiny, tvořené kmeny 2150-2-3, U9 , 1372, 1372-ura3, 1372-his3, 1558, 1524, 1537, 1541, 1582 a 1569.

    Zastupuje:

    WO 95/31532

    1/14

    5 / óV- 7 PCT/US95/06006

    RECRRED SHEcT (RULE 91)

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006

    2/14

    STRAIN 1558

    STRAIN 1569

    CD in to t

    PC £rc

    o.

    x.

    O

    o.

    FIG.2A

    F1G.2B

    RffiTSEI SHET(aui£91)

    PCT/US9S/06006

    WO 95/31532

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006 |μ»4-ϊ*·Ί

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006

    5/14

    WO 93/31532

    6/ U ^pCT/US95/06006

    5/7 * t+1 * j ./ í 3 y r ?. i ý /q

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006 ®W!?^3<W7 ©U ©©QWlSW&te ©tf @©ίη<1©δΏ3Ώ$£) e©Qíft bm$ aro<£) ^ís>7

    2150-2-3 (MATa, Ieu2, ade1)

    Seíect ura* on FOA píates

    T . U9 (MATa, Ieu2, adet, ura3)

    ÍTransform with mnn9::URA3 disruption cassette

    1372 (mnn9, Ieu2, ade1) y Select ura' on FOA píates

    1372-ura3 (mnnS, lsu2, ura3, ads1)

    ÍTransform with his3::URA3 disruption cassette

    1372-his3 (mnn9, Ieu2, his3, adet)

    Transform with prb1::HIS3 disruption cassette strain 1558 (MATa, leu2, mnn9, prb1, ade1}

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006

    8/14

    Owrvisw G@rasUiu©ító©ini SUcán HSSS) comíaining boílh prtol and p@p4 mojítaítáosnis

    2150-2-3 (MATa, Ieu2, ade1)

    Select ura' on FOA plates U9 (MATa, Ieu2, ade1, ura3)

    Transform with his3::URA3 disruption cassette

    1524 (Ieu2, ade1, his3)

    I Transform with prbt::HIS3 disruption cassette

    1537 (Ieu2, prb1, ade1)

    Seiect ura' on FOA plates

    1541 (Ieu2, prbt, ade1, ura3]

    Transform with pep4::URA3 disruption cassette

    1569 (MATa, Ieu2, prb1, pep4, ade1)

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006 q / 1 / □ / < Η» íÍerO«.S. í-f

    Prototype Puriřication Scheme For Human Papillomavirus VLPs

    Yeast Cell Suspension

    Cell Breakage in microfiuidizer

    T

    Yeast Cell Lysáte

    Centrifuge at 5,000 xg, 4 C, 10 min. Recover supernatant

    Clarified Lysáte

    Dilute 1:5 in 20 mM MOPS, pH 7.2 .

    _T_

    Strong AEX Chromatography ^ΓΙ auuUyCl cMO i MA*I ícSitt}

    Fractional analysis by siiver staining and western blot.

    , r Pooí best fractions

    Purifíed VLPs

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006

    10/14 αχ 1 C

    Table I. Recombinant Yeast Strains which Express PV LI and/or L2 Proteins

    Recombinant Strain PV Codina SeauenceCs) Yeast Host Strain^a 1582 CRPV LI 1569 1583 'CRPV L2 1538 1603 CRPV LI + L2 (2-plasmid svstem) 1592 1606 CRPV LI + L2 1569 1609 CRPV LI + L2 BJ5462 1644' HPV 6a LI 1558 « w t w HP-VčaLl*L2 1 «2 1678 HPV 16 LI 1558 1679 HPV 16L1 +L2 1558

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006

    Lané * 1 Samotě 1 1 MrStanoaros

    —2- Qanned Csilutar Lvsate 3 KkiSÓ4 Supemate Poot 1 4· ř>JhUSÓ4 Suoemate Pool 2 5 Concentrated ΤΜΑΞ Pcot i 6 Concentrated TMAE Pool 2 7 Seoňacrvi 500HR Pool 1 8 Seenacrvi 500HR Pool 2 9 Fina: Concentrated Product JÍL·,1 M_r Standaros ar Blank

    11/14

    Colloidal Coomassie Stain i z 3 *t r 4 “> ti ··

    Western Blot for LI Protein

    Purífication of HPV Type 16

    I i 1 u. f L 7 t 1 »·

    Western Blot for L2 Protein

    LI + L2 Capsid Proteins

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006

    12/14

    FÍ&urs12.

    □URE JC~2: Schematic dagram of CRPV VLP purification proeess ře.· i < tam. '

    CPPV-VPL Purification Proeess: Schemes.,2. ,an±3.

    cell lysis t

    darification of lysáte by Iow speed centrífugation t ' sedímentation through 45% sucrose t

    resuspension of pellet and darification by Iow speed centrífugation t

    CHCb - extra ction (This step was ommitted in scheme 2) t

    anion-exchange chromatography t

    uitrafiítration (polyethersulfone membrane) t

    size-exdusion chromatography uitrafiítration (YM-100 membrane)

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006 \i
13. 13/14

    SDS/PAGE (REDUCING CONDITIONS)

    Purified VLP's

    Scheme 1 / •á· <?

    ř / //// & iP <J £ S* £

    $ / <?

    I I I I l

    i ffc—·<U -*w

    20.2
14. 14.4

    4.

    WO 95/31532

    PCT/US95/06006

    14/14

    F\<^Q<ZS 14

    SDS/PAGE (REDUC1NG CONDITIONS)

    Purified VLP‘s

    Scheme 2 Scheme 3