Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ksylozy na drodze enzymatycznej hydrolizy ksyla¬ nów.Znane jest stosowanie rodzimych, rozpuszczal¬ nych enzymów do scukrzania polisacharydów z blo- nek komórkowych drewna, (por. H. H. Dietrchis: Enzymatischer Abbau von Holzpolysacchariden und wirtschaftliche Nutzungsmóglichkeiten, Mitt. Bun- desforschungsanstalt fiir Forst — und Holzwirt- schaft Nr. 93, 1973, 153—169). Z drugiej strony wiadomo, ze dokonuje sie unieruchamianie enzy¬ mów na nierozpuszczalnych nosnikach. Unierucho¬ mione enzymy sa stabilniejsze i latwiej jest po¬ slugiwac sie nimi niz enzymami rozpuszczalnymi.Dotychczas jednak nie znano stosowania unieru¬ chomionych enzymów do scukrzania rozpuszczal¬ nych polisacharydów z blonek komórkowych.Do hydrolizy polisacharydów z blonek komórko¬ wych roslin nadaja sie zwlaszcza enzymy z przesa¬ czy kulturowych miokroorganizmów, (Sinner, M.: Mitteilungen der Bundssforschungsenstalt fiir Forst — und Holzwirtschaft Reinbek — Hamburg Nr. 104, Januar 1975, Claeyssens, M. et. al. FEBS lett, 11, 1970, 336—338.Reese, E.T. et al. Can. J. Microbiol. 19, 1973, 1065— 1074).Mikroorganizmy ^te produkuja mnóstwo protein, miedzy innymi enzymy rozszczepiajace hemicelu- loze. Te wolne nie zwiazane enzymy sa jednak 2 w swoich optymalnych warunkach reakcji tylko przez stosunkowo krótki czas aktywne, maksymal¬ nie przez kilka dni. Dlatego tez nie nadaja sie do 5 stonowania na skale techniczna.Jezeli enzymy z przesaczy kulturowych mikro¬ organizmów (to jest nieoczyszczone „surowe enzy¬ my") próbuja sie zwiazac ^ nosnikami, to zasadni¬ czo wszystkie proteiny obecne w enzymie surowym, 10 to jest takze te kazorazowo niepozadane enzymy, zostaja zwiazane w nosniku. Jezeli za pomoca te¬ go rodzaju zwiazanych z nosnikiem preparatów en¬ zymatycznych przeprowadza sie ksylany, np. ksyla • ny z drewna lisciastego na drodze enzymatycznej 15 hydrolizy w ksyloze, to potrzeba duzych ilosci te¬ go rodzaju enzymów zwiazanych z nosnikiem, po¬ niewaz powierzchnia nosnika bezuzytecznie prze¬ jmuje duza czesc enzymów niepotrzebnych, podczas gdy tylko mala czesc nagromadzonych enzymów, 20 mianowicie enzymy ksylanolityczne przejawiaja dzialanie katalityczne.Znane sa sposoby odzyskiwania z mieszaniny en¬ zymów, pewnych pozadanych enzymów w postaci czystej, przy czym wykorzystuje sie rózny ladunek 25 elektryczny, wielkosc czasteczkowa lub powino¬ wactwo enzymów do czynnika oddzialywujacego.(Sinner, M.u.H.H. Dietrichs, Holzforschung 29, 1975, 168—177, Robinson, R. J. et al., Biotechnol. Bioeng. 16, 1974, 1103—1112). 30 Dalej wiadomo, ze przy rozkladzie roslinnych 120 6543 120 654 i rozpuszczalnych w wodzie polisacharydów z blonek komórkowych na cukry pojedyncze, co najmniej dwie grupy enzymów biora w tym udzial, a mia¬ nowicie glikanazy, które rozszczepiaja wiazania we¬ wnatrz polisacharydu jak popadnie z wyjatkiem wiazan na koncu lancucha, i glikozydazy, które rozkladaja uwolnione od glikanaz oligosacharydy na pojedyncze cukry. I tak w przypadku rozkladu ksylanu potrzebne sa /?-l,4-ksylanazy oraz /?-ksy- lozadazy. O ile wystepuja ksylany zawierajace ja¬ ko boczne grupy kwas 4-0-metyloglikuronowy, to potrzebny jest dodatkowo dotychczas nie znany enzym odszczepiajacy kwas uronowy. Te poszcze¬ gólne enzymy mozna miedzy innymi takze korzys¬ tnie uzyskiwac z innych zródel.Wiadomo, ze obydwie grupy enzymów róznia sie pod wzlgedem ciezaru czasteczkowego i pod wzgle¬ dem warunk6w, w których rozwijaja swa opty¬ malna aktywnosc (porówn., Ahlgren, E. et al., Acta Chem. Scandinavia 21, 1967, 937—944).Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wyt¬ warzania ksylozy na drodze enzymatycznej hydro¬ lizy ksylanów, sposobu dajacego sie wykonywac nieskomplikowanie z duza skutecznoscia, wzlednie z duza wydajnoscia, przy zastosowaniu bardzo ak¬ tywnych, zwiazanych z nosnikami enzymów.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze mozna^ to osiag¬ nac, jezeli na roztwór ksylanu dziala sie róznymi zwiazanymi z nosnikami ukladami enzymów, o róznorodnym dzialaniu.Sposób wytwarzania ksylozy na drodze enzyma¬ tycznej hydrolizy ksylanów polega wedlug wyna¬ lazku na tym, ze na wodny roztwór ksylanu dziala sie preparatem A, stanowiacym nosnik, zawieraja¬ cy sposród ksylanolitycznych enzymów (jako enzym podstawowy) zwiazana ksylanaze w ilosci co naj¬ mniej 70% wagowych enzymów zwiazanych i pre¬ paratem B, stanowiacym nosnik, zawierajacy spo¬ sród ksylanolitycznych enzymów (jako enzym pod¬ stawowy) zwiazana i/?-ksylozydaze w ilosci co naj¬ mniej 50% wagowych enzymów zwiazanych i e- wentualnie zawierajacy zwiazany enzym odszcze¬ piajacy kwas uronowy.Istnieja ksylany zawierajace kwas uronowy i ksylany, które tego kwasu nie zawieraja. Jezeli sposobem wedlug wynalazku rozszczepia sie enzy¬ matycznie ksylany zawierajace kwas uronowy, to wymieniony w omówieniu preparat B nosnik mu¬ si zawierac takze zwiazany enzym odszczepiajacy kwas uronowy. Jezeli ksylany nie zawieraja kwasu uronowego, to nie jest wymagana obecnosc enzy¬ mu odszczepiajacego kwas uronowy.Sposób wedlug wynalazku stanowi bardzo pro¬ sta i skuteczna droge do otrzymywania z duza wydajnoscia monosacharydu ksylozy z wystepuja¬ cych w duzych ilosciach ksylanów, pochodzacych z roslinnych surowców. Ksyloza jest wartosciowym cukrem, który stosuje sie jako taki lub ewentual¬ nie redukuje sie do ksylitu, który jest wartoscio¬ wa substancja, lecz dotad stosunkowo trudno osia¬ galna w wiekszych ilosciach.Stosowane w sposobie wedlug wynalazku jako produkt wyjsciowy ksylany wzglednie fragmenty ksylanowe sa hemicelulozami, które odzyskuje sie z surowców roslinnych róznymi sposobami. Przyk¬ ladem takich surowców roslinnych sa drewna lis¬ ciaste, sloma, wytloki, plewy zbozowe, pozostalosci z kaczanów kukurydzy, sloma kukurydziana itp.Jezeli jako roslinne surowce stosuje sie takie, któ¬ re jak hemicelulozy zawieraja przede wszystkim ksylany, np. zawartosc ksylanów ponad okolo 15% wagowych, korzystnie ponad 25% wagowych, to mozna przechodzace przy wylugowywaniu do fazy wodnej ksylany i fragmenty ksylanowe w korzy¬ stny sposób zastosowac, w sposobie wedlug wynala¬ zku. Roztwór ksylanowy otrzymuje sie celowo wed¬ lug wynalazku. Roztwór ksylanowy otrzymuje sie celowo przez poddanie roslinnego surowca, zawie¬ rajacego ksylany obróbce pary nasyconej pod cis¬ nieniem w temperaturze od okolo 160°C do 230°C w ciagu okolo 2—60 minut i tak rozlozony roslinny surowiec wylugowywuje sie wodnym roztworem.Sposób wytwarzania tych roztworów ksylano- wych opisany jest szczególowo w austriackim zglo¬ szeniu patentowym Nr 5346/76 pod tytulem „Spo¬ sób uzyskiwania ksylanu i substancji wlóknistych z surowców roslinnych zawierajacych ksylan".Warunki prowadzenia hydrolizy ksylanów za po¬ moca enzymów zwiazanych z nosnikiem róznia sie do warunków prowadzenia hydrolizy za pomoca wolnych enzymów zasadniczo tym, ze ze wzgledu na wieksza stabilnosc enzymów zwiazanych moz¬ na stosowac wyzsza temperature, przez co przys¬ piesza sie reakcje. Temperatura w zakresie 30— 60°C, korzystnie w zakresie 40—45°C daje z re¬ guly optymalne warunki.Dalsza zaleta jest to, ze w przeciwienstwie do wolnych enzymów wykazujacych stosunkowo waski optymalny zakres wartosci pH, za pomoca enzy¬ mów zwiazanych mozna prowadzic reakcje w zna¬ cznie szerszym zakresie. Górne i dolne wartosci graniczne kazdorazowoo zaleza od konkretnych en¬ zymów. Ogólnie mozna powiedziec, ze w celu uzy¬ skania optymalnej hydrolizy, celowo postepowanie prowadzi sie w zakresie wartosci pH 3—8, ko¬ rzystnie 4—5. Zbyteczny jest przy tym z reguly do¬ datek roztworu buforowego dla nastwienia doklad¬ nej wartosci pH.Stezenie ksylanów w roztworze moze wahac sie w stosunkowo szerokich granicach. Górna granice okresla sie lepkoscia roztworów, a lepkosc nato¬ miast okresla sie srednim stopniem polimeryzacji ksylanów (DP). Przecietnie jako górna granice ste¬ zen uwaza sie okolo 8%, a w niektórych przy¬ padkach okolo 6%. Dolna granice stezenia ustala sie zasadniczo z uwagi na to, ze prowadzenie po¬ stepowania w rozcienczonych roztworach moze byc nieekonomiczne. Zwlaszcza korzystne jest stosowa¬ nie roztworów ksylanowych otrzymanych wedlug wymienionego austriackiego zgloszenia patentowe¬ go, bez dalszego rozcienczania.Enzymatyczna hydrolize prowadzi sie do chwi¬ li az nimal caly ksylen zostanie rozlozony na ksy- loze, co mozna latwo stwierdzic na podstawie ana¬ lizy roztworu. W postepowaniu nieciaglym (szarzo- wym) mozna uzyskac pelny rozklad na ksyloze po uplywie okolo 4 godzin.Sposób wedlug wynalazku mozna jednak pro¬ wadzic takze metoda nieciagla, która polega na tym, ze roztwór ksylanowy prowadzi sie przez ko- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60120 654 6 kolumne napelniona stosowanymi preparatami en¬ zymatycznymi. W urzadzeniu kolumnowym latwo jest sterowac okresem inkubacji na drodze pomia¬ rów w kolumnie i predkosci przeplywu.Zwlaszcza dobre wyniki uzyskuje sie sposobem wedlug wynalazku stosujac preparaty enzymatycz¬ ne wytworzone nizej opisanym sposobem. Prepara¬ ty te otrzymuje sie droga polegajaca na tym, ze surowy enzym zawierajacy ksylanoze, /?-ksylozyda- ze i ewentualnie enzym odszczepiajacy kwas urono- wy rozdziela sie droga ultrafiltracji na jedna frak¬ cje, zawierajaca sposród ksylanolitycznych enzy¬ mów (jako podstawowy enzym) ksylanaze i na jed¬ na frakcje, zawierajaca sposród ksylanolitycznych enzymów (jako podstawowy enzym) /?-ksylozydaze i ewentualnie zawieraja enzym odszczepiajacy kwa o uronowy, zas i te obydwie frakcje oddzielnie wia¬ ze sie z nosnikami. Jako surowe enzymy stosuje sie korzystnie przesacze kultur mikroorganizmów produkujacych te enzymy. Tego rodzaju mikro¬ organizmy sa w wiekszosci znane, np. Trichoderma viride, Bacillus pumilus, rózne gatunki spergillus i Penicillium. Surowe preparaty enzymatyczne ot¬ rzymane z mikroorganizmów sa juz osiagalne w wielu miejscach jako produkty handlowe i mozna jest stosowac (w sposobie wedlug wynalazku).Zwlaszcza korzystne sa oczywiscie te preparaty, które wykazuja specjalnie silne dzialanie ksylano- lityczne. Przyklady takich preparatów stanowia ce- luzyma- 450 000 (Nagase), celulaza 20 000 i 9 x (Mi - les Lab., Flkard. Indiana), celulaza Onozuka P 500 i SS (Ali Jana Biochem. Co., Japan), hemicelulaza NBC (Nutritional Biochem. Co., Cleveland Ohio).Ponizej zestawiono liste mikroorganizmów, które produkuja specjalnie duzo enzymów o dzialaniu ksylanolitycznym. Nastepnie podano pozycje z lite¬ ratury, w których omówiono tego rodzaju mikroor¬ ganizmy i ich optymalne warunki hodowlane.Aspergillus niger Penicillium wortiani QM 877 dla /?-ksylozy- dazy Thichoderma viride Philadelphia QM Depot Trichoderma viride 10 15 QM 7322 Resse et al., Can. J. Mi- crobiol. 19, 1973 1065—1074 QM 6a dla ksylanazy Resse i Man- dels, Appl. Mic robiol. 7, 1959, 378—387 Culture Collection z US Natick Laboratiories Natick Massachusetts 01760, St. Zjedn. Am.Fusarium roseum QM 388 dla ksylanazy 25 35 Bacillus pumilus ORL B 12 dla ^-ksylo- zydazy Simp- son, F.J., Ca- nadian, J. Mi- crobiol. 2, 1956, 28—38 Prairie Reginal Laboratory Saskatoon, Sackatchewan, Kanada Coniophora cerebella dla ksylanazy Kin-;*, Fuller, Biochem. J. 108 1968, 571—576 F.P.R.L. culture No HE Forest Products Research Laboratory Frincess Risborough, Buck Dacillus No. C-59-2 dla ksylanazy bardzo termo- stabilny; szeroki zakres optimum pH 2-dniowa hodowla Institute of Physical and Chemical Research Wako-shi, Saitama 351 K. Horikoshi i Y. Atsukawa, Agr. Biol.Chem. 37, 1973, 2097—2103 Dalsze dane o mikroorganizmach z enzymami o silnym dzialaniu ksylanolitycznym mozna za¬ czerpnac z nastepujacych pozycji w literaturze: P ksylozydazy Aspergillus nige Botryddiplodia sp. Resse, E.T. et al., Can.Penicillium wortmanni J. Microbiol 19, 1973, 1065—1074 40 Chaetomium trilaterale 45 50 55 CMI 45553 dla ksylanazy Gascoigne i Ga coigne, J. Gen.Microbiol. 22, 1960, 242—248 Commonwealth Mycological Institute, Kew Bacillus pumilus /?-l-4-ksylanazy Trichoderma viride A. batatas 60 A. aryzae Fusarium roseum Fusarium moniliforme OMI 45499 dla ksylanazy 65 Kawaminami, I. i H. Izu- ka, J. Kerment. Technol. 4.8, 1970, 169—176 Simpson, F.J., Can. J.Microbiol. 2, 1956, 28—38 Resse, F.T. i M. Man- dels, Appl. Microbiol. 7, 1959, 378—387 Nomura, K. et al., J.Ferment. Technol. 46, 1968, 634—640 Takeniski, S. et al. J.Biochem. (Tokyo) 73, 1973, 335—343 Fukui, S. i M. Sato, Buli. agric. chem. Soc.Japan 21, 1957, 392—393 Fukui, S., J. Gen. Appl.Microbiol. 4, 1958, 39— 50 Gascoigne, J.A. i M.M.Gascoigne, J. Gen. Mi¬ crobiol. 2487 120 654 8 P. janthinellium Takenishi, S. i Y. Tsu- jisaka, J. Ferment, Te- chnol. 51, 1973# 458—463 Chaetomium trilaterale Lizuka, H. i Kawami - nami, Agr. Biol. Chem. 5 33, 1969, 1257—1263 Coniophora cerebella Trametinae Coriolinae Lentineae Tricholomaeae Coprinaceae Fomitinae Polyporinae Bacillus No. C-59-2 King, N.J., iBochem, J. 100, 1966, 784—792 Kawai, M., Nippen, No- 10 gei Kagaku Kaishi 47, 1973, 529—34 (z próby klasyfikacji si¬ towej wsród podstaw- czaków) 15 20 Horijoshi, K. i Y. Atsu- kawa, Agr. Biol. Chem. 37, 1973, 2097—2103 Streptomyces xylophagus Lizuka, H. i T. Kawami- nami, Agr. Biol. Chem. 25 29, 1965, 520—524 Bacillus subtilis Lyr. H., Z. Allg. Mikro- biol. 12, 1972, 135—142 Sposób wytwarzania oczyszczonego, zwiazanego z nosnikiem enzymu polega na tym, ze roztwór 30 surowego enzymu uwalnia sie od nierozpuszczal - nych skladnikaw, celowo na drodze normalnej fil¬ tracji, otrzymany roztwór przesacza przez ultra- filtr o zakresie rozdzielania substancji o ciezarze czasteczkowym co najmniej okolo 80 000 i najwy- 35 zej okolo 120 000, korzystnie okolo 100 000, pozo¬ stalosc na filtrze przesacza sie przez ultrafiltr o zakresie rozdzielania substancji o ciezarze czastecz¬ kowym co najmniej okolo 250 000 i najwyzej okolo 350 000, korzystnie okolo 300 000 i otrzymany prze- 40 sacz zawierajacy zasadniczo /?-ksylozydaze i ewen¬ tualnie enzym odszczepiajacy kwas uronowy wiaze sie z nosnikiem, zas przesacz z ultrafilitracji o naj¬ pierw wymienionym zakresie rozdzielania przesa¬ cza sie przez ultrafiltr o zakresie rozdzielania 45 substancji o ciezarze czasteczkowym co najmniej okolo 10 000 i najwyzej okolo 50 000, korzystnie okolo 30 000, i przesacz zawierajacy zasadniczo ksy- lanaze wiaze sie z nosnikiem. Do przeprowadzenia tego sposobu celowo rozpuszcza sie surowy enzym 50 w okolo 10- do 30-krotnej, korzystnie okolo 20- krotnej ilosci wody.Bardziej dokladnie oczyszczanie frakcji zawiera¬ jacej zasadniczo ksylanaze polega na tym, ze prze¬ sacz po filtracji przez ultrafiltr o zakresie roz- 55 dzielania substancji o ciezarze czasteczkowym od okolo 10 000 do 50 000 przesacza sie przez ultra¬ filtr o zakresie rozdzielania co najmniej okolo 300 i najwyzej okolo 700, korzystnie 500 i pozostalosc na filtrze wiaze sie z nosnikiem. Przez te dodatko- 60 wa ultrafiltracje zateza sie ksylanaze.Jednoczesnie oddziela sie w ultraprzesaczu wiek¬ szosc weglowodanów, które stanowia do okolo 40% materialu wyjsciowego, zwrot „jako podstawowy enzym" umieszczony w opisie wynalazku w zwiaz- 65 ku z omawianymi enzymami oznacza, ze enzymy zawarte w danej frakcji ze wzgledu na dzialanie ksylanolityczne (skladaja sie w istocie z danego enzymu, albo ze dana frakcja zawiera jako enzym przede wszystkich dany omawiamy enzym).Po dokonaniu operacji oczyszczania otrzymuje sie na przyklad frakcje ksylanazowa, w której praktycznie nie mozna juz stwierdzic zawartosci /7-ksylozydazy. To samo lecz w sensie odwrotnym dotyczy frakcji /?-ksylodyzadowej. Zgodnie z wy¬ nalazkiem w sposobie wytwarzania ksylozy na drodze -enzymatycznej hydrolizy ksylanów, mozna stosowac takie preparaty, które nie wykazuja tak wysokiego stopnia czystosci danego enzymu. Na przyklad korzystne wyniki sposobem wedlug wy¬ nalazku otrzymuje sie takze wówczas, gdy pod pojeciem „jako podstawowy enzym" rozumie sie, ze dany enzym przyczynia sie do osiagniecia co najmniej okolo SO^/o, korzystnie co najmniej okolo 90%, a szczególnie korzystnie co najmniej okolo 95% danej zadanej aktywnosci glównej.Zaskakujacym jest to, ze przez prosta ultrafil¬ tracje mozna dokonac rozdzielenia surowego en¬ zymu na zadane skladniki, które sposobem tym otrzymuje sie o wysokim stopniu czystosci. Zwla¬ szcza nieoczekiwane jest i korzystne to, ze we frakcji zawierajacej /?-ksylozydaze zawarty jest takze enzym odszczepiajacy kwas uronowy. Ksy- lanaza i /?-ksylozydaza same nie sa w stanie w roztworze rozkladowym dalej rozszczepiac na mo- nomeryczna ksyloze kwasnych fragmentów ksy- lanowych, ewentualnie wspólpowstalych wobec dzialania ksylanazy na lancuch ksylanowy. Te kwasne ksylooligomery trzeba najpierw, zanim zo¬ stana zhydralizowane na ksyloze, pozbawic rodni¬ ka kwasowego dzialaniem katalitycznym enzymu odszczepiajacego kwas uronowy.Przylaczenie oczyszczonych frakcji enzymowych do nosników mozna przeprowadzic znanymi spo¬ sobami. Znane sa róznego rodzaju sposoby, przy¬ laczania, które róznia sie zaleznie od rodzaju wia¬ zania (adsorpcja, kowalencyjne wiazanie z powie¬ rzchnia nosnika, kowalencyjne usieciowanie, pop¬ rzeczne, wlaczenie i inne) i stopnia trudnosci oraz kosztów wytwarzania wiazania. Najlepsze sa spo¬ soby gwarantujace trwale zwiazanie (wiazanie kowalencyjne), które takze w przypadku wielko¬ czasteczkowych substratów minimalizuja trudnos¬ ci spowodowane przenikaniem. Zwlaszcza korzy¬ stne dla preparatów stosowanych w sposobie wed¬ lug wynalazku okazaly sie nastepujace wiazania: 1. Wiazanie na aldehydzie glutarowym (Westall, H.H., Science 166, 1969, 615—617), 2. Wiazanie na toluenosulfonianie cykloheksylo- morfolinoetylokarbodwuimidu (CMC) Line, W.F. et al., Biochem. Biophys. Acta 242, 1971, 194—202), 3. Wiazanie na TiCh (Emery, A.N. et al., Chem.Eng. (London) 258, 1972, 71—76).Jako nosniki dla -enzymów mozna stosowac wszy¬ stkie nosniki rozpowszechnione w tej dziedzinie techniki, takie jak pyl stalowniczy, tlenek tyta¬ nu, skalenie i inne mineraly, piasek morski, zie¬ mia okrzemkowa, szklo porowate i zel krzemion¬ kowy. Dajace sie zastosowac nosniki nie ogranicza-120 654 10 ja sie jednak do podanych przykladów. Jak szklo porowate mozna stosowac np. produkt handlowy CPG-550, firmy Corning Class Works, Corning. N.Y., a jako zel krzemionkowy — produkt handlowy Merckogel SI-1000, Merck AG, Darmstadt.W celu wytworzenia wiazania enzymu z nosni¬ kiem wedlug metody 1 i 2 korzystnie jest, aby nosnik ogrzewac w ciagu nocy w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna z okolo 5—12%, korzystnie okolo 10% roztworem y-aminopropylo- trójetoksysilanu w toluenie. Droga tej operacji dany material nosnikowy wyposaza sie w jedna pierwszorzedowa grupe aminowa. Przy stosowaniu metody nr 3 operacja ta jest zbedna.Po intensywnym przemyciu odpowiednimi roz¬ puszczalnikami, takimi jak toluen i aceton doko¬ nuje sie aktywizacji nosnika.Operacja ta przy metodzie 1 polega na tym, ze kazdorazowy nosnik miesza sie w roztworze oko¬ lo 3—7%, korzystnie okolo 5% aldehydu glutaro- wego buforu addycyjnego. Wartosc pH buforu 6,5 okazala sie korzystniejsza od wartosci pH 4. Im wyzsza jest wartosc pH addycji, tym wiecej pro¬ tein zostaje zwiazanych. Poniewaz jednak enzymy stabilne sa w zakresie slabo kwasnym, dla addy¬ cji wchodzi w rachube wartosc pH 6—7,5, korzy¬ stnie 6,5.Po 60 minutowej inkubacji, czesciowo pod próz¬ nia, okazalo sie korzystnym, aby nadmiar aldehy¬ du glutarowego odsaczyc pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Material nosnikowy przed inkubowaniem z roztworem enzymowym, celowo przemywa sie jeszcze raz dokladnie.W drugiej metodzie nosnik alkiloaminowy celo¬ wo najpierw miesza sie dobrze w ciagu 5 minut z enzymem poddawanym sprzeganiu, zanim doda sie odczynnik CMC inicjujacy sprzeganie. Doda¬ wana ilosc CMC jest czynnikiem istotnym. Przy dodaniu malych ilosci CMC zwiazane zostaje ma¬ lo enzymu. Przy wiekszym dodatku CMC istnieje ryzyko powstania poprzecznego usieciowania z u- trata aktywnosci enzymu. Na 1 g nosnika i 150 mg enzymu korzystna okazala sie ilosc okolo 350— 450 mg, najlepiej okolo 400 mg CMC. Wartosc pH w ciagu pierwszych 30 minut inkubacji utrzymu¬ je sie celowo za pomoca 0,1 n HC1 na poziomie pH 3—5, korzystnie okolo 4,0. Ta wartosc pH okazala sie korzystniejsza od wartosci pH 6,5. Me¬ toda z CMC i metoda z TiCh nadaja sie zwlaszcza dla enzymów stabilnych w zakresie kwasnym.Najwieksze ilosci protein zostaja zwiazane w zakre¬ sie kwasnym.WNaaetodzie 3 aktywowanie nosnika polega na tym, ze nie obrobiony nosnik miesza sie w wod¬ nym roztworze okolo 6—15%, korzystnie okolo 12,5% TiCh. Nadmiar wody ^odparowuje sie, a produkt przemywa sie intensywnie bus£rem addy¬ cyjnym, przed inkubowaniem z przylaczonym roz¬ tworem enzymu.Inkubacja zaktywowanego nosnika z roztworem enzymu zostaj-e zakonczona po kilku godzinach, np. w ciagu nocy. Okres trwania inkubacji nie jes^ specjalnie czynnikiem istotnym. Inkabacje prowadzi sie celowo w temperaturze normalnej.Preparaty enzymatyczne zwiazane z nosnikiem po zabiegu addycji celowo przemywa sie na spie- 5 ku szklanym za pomoca 1 m NaCl, w 0,02 m bu¬ foru fosforanowego o pH 4 i nastepnie 0^02 m buforu fosforanowego o pH 5, do chwili stwier¬ dzenia nieobecnosci enzymu w popluczynach. 10 Sposobem tym dokonuje sie w bardzo wysokim stopniu oczyszczania enzymów potrzebnych do roz- . kladu ksylanów. Otrzymuje sie wiec preparaty o wybitnie duzej specyficznej aktywnosci katali¬ tycznej i mozna za ich pomoca korzystnie prowa- 15 dzic enzymatyczna hydrolize ksylanów. Zwlaszcza rewelacyjne okazalo sie, jak to wskazuje przyto¬ czona próba porównawcza, ze wydajnosc ksylozy w sposobie wedlug wynalazku jest znacznie wyz¬ sza niz w przypadku, gdy ksylanaze, jff-ksylozyda- 20 ze i enzym odszczepiajacy kwas uronowy razem wiaze sie z nosnikiem i usiluje dokonac enzyma¬ tycznej hydrolizy ksylanów dzialajac na wodny roztwór ksylanowy nosnikiem zawierajacym te wszystkie trzy enzymy. 25 Podane nizej przyklady I—IV dotycza wytwarza¬ nia substratu oraz preparatów A i B, przyklad V objasnia blizej sposób wedlug wynalazku a przy¬ klad VI jest przykladem porównawczym.W opisie i przykladach procenty oznaczaja pro¬ centy wagowe, o ile nie zaznaczono inaczej. Uzys¬ kiwanie wzglednie wydzielanie i oczyszczanie po¬ zadanych znajdujacych sie w roztworze substancji odbywa sie, o ile jest to celowe, sposobami zna¬ nymi z chemicznej dziedziny cukrownictwa, np. przez zageszczanie roztworów, traktowanie cie¬ czami, w których pozadane produkty nie rozpu¬ szczaja, sie lub sa trudno rozpuszczalne, przekry- stalizowanie itp. Slowo „Atro" oznacza „Absolut¬ nie suchy". 40 Przyklad I. Proces roztwarzania. 400 g drewna czerwonego buku w postaci scin¬ ków wysuszonych na powietrzu traktuje sie w defibratorze Asplunda para w ciagu 6—7 minut 45 w temperaturze 185—190°C, odpowiednio pod ci¬ snieniem okolo 11,77 * 105 Pa i rozwlóknia w cia¬ gu okolo 40 sekund. Otrzymany w ten sposób wil¬ gotny material wlóknisty wyplukuje sie z defibra- tora lacznie 4 litrami wody i przemywa na sicie. 50 Wydajnosc materialu wlóknistego wynosi 83% w odniesieniu do wprowadzonego drewna (astro).Nastepnie przemyty i wycisniety material wlók¬ nisty zawiesza sie w 5 litrach 1% wodnego rozt- g5 woru NaOH w temperaturze pokojowej i po 30 minutach oddziela od alkalicznego wyciagu przez odsaczenie i wycisniecie. Po przemyciu woda, roz¬ cienczonym kwasem i ponownie woda wydajnosc materialu wlóknistego wynosi 66% w odniesieniu 60 do wprowadzonego drewna (astro).W odpowiedni sposób obrabia sie inne gatunki drewna, takze w postaci grubszych trocin oraz slo¬ my w postaci sieczki. Srednia wydajnosc materia¬ lów wlóknistych w odniesieniu do materialów wyj- 65 sciowych (atro) przedstawiono ponizej: 30 35120 11 Material wyjsciowy Drewno buku czerwonego drewno topoli drewno brzozowe drewno debowe drewno eukaliptusowe sloma pszeniczna sloma jeczmienna sloma owsiana Pozostalosci substancji wlóknistej (°/o) po przemy-'po obróbce 1 ciuwoda|zapomoca H NaOH | 83 87 86 82 85 90 82 88 66 71 68 66 71 67 65 68 Przyklad II. Sklad weglowodanów w wod¬ nych i alkalicznych wyciagach.Podwielokrotne czesci wodnych i alkalicznych wyciagów otrzymanych w przykladzie I poddaje sie calkowitej hydrolizie. Ilosciowego oznaczenia poszczególnych cukrów i calego cukru dokonuje sie za pomoca automatycznego analizatora biotro- nicznego (por. M. Sinner, M. H. Simatupang i H.H. Dietrichs, Wood Science and Technology 9, (1975), S. 307—322). W automatycznym analizato¬ rze bada sie ponadto drewno poddane calkowitej hydrolizie.Na figurze 1 przedstawiono wykresy otrzymane dla drewna buku czerwonego.Wyciag czerwony buk, dab, brzoza topola, eukaliptus pszenica jeczmien owies, H2O NaOH H2O NaOH H2O NaOH H2O NaOH H2O NaOH H2O NaOH H2O NaOH H2O NaOH Rozpuszczone weglowo- | calosc (%, w 1 odniesie¬ niu do materia¬ lu wyjs- sciowego | (atro) 13,5 7,0 13,2 6,8 11,2 7,3 8,3 6,5 9,5 5,0 7,0 8,3 6,1 9,5 5,1 4,4 dany czesci (%, w . odniesieniu do wyciagu ksyloza 59 83 65 81 77 84 76 83 71 80 53 88 41 88 44 88 gliko- za 13 3 ' 11 5 8 3 6 3 8 3 21 3 25 3 20 3 12 Przyklad III. Wydzielenie i zatezenie ksyla- nazy i jff-ksylozydazy z enzymatycznego preparatu handlowego. 220 g otrzymywanego w hadlu preparatu enzyma¬ tycznego „Celluzyme" firmy Nagase rozpuszcza sie w 4,8 1 0,02 buforu AmAc (bufor octan amonowy) o pH 5. Nierozpuszczalne czesci usuwa sie czesciowo na spieku szkalnym, po czym roztwór enzymowy przesacza sie przez filtr teflonowy (Chemware 90 CMM Coarse) w celu otrzymania klarownego prze¬ saczu. Nastepnie roztwór enzymowy poddaje sie u- ltrafiltracji na urzadzeniu ultrafiltracyjnym TCF- 10 firmy Aminocon (Lexington, Massachusetts).Stosuje sie nastepujace ultrafiltry Amicon (w ko¬ lejnosci stosowania): XM 100 A (zakres rozdzielania — ciezar czaste¬ czkowy 100 000) SM 300 (zakres rozdzielania — ciezar czaste¬ czkowy 300 000) PM 30 (zakres rozdzielania —v ciezar czaste¬ czkowy 30 000) DM 5 (zakres rozdzielania — ciezar czaste¬ czkowy 500) A wiec oczyszczony roztwór surowego enzymu fil¬ truje sie najpierw przez filtr o zakresie rozdziela¬ nia substancji o ciezarze czasteczkowym 100 000.Odpowiednio w ultraprzesaczu znajduje sie prze¬ waznie ksylanaza. W pozostalosci na filtrze znaj¬ duje sie po wiekszej czesci /?-ksylozydaza i doty¬ chczas nieznany enzym, odpowiedzialny za odszcze- pienie kwasu 4-0-metyloglikuronowego z kwaso¬ wych ksylooligamerów.Pozostalosc na ultrafiltrze przesacza sie teraz przez ultrafiltr o zakresie rozdzielania substancji 0 ciezarze czasteczkowym 300 000. Pod koniec tej obróbki w przezroczystym roztworze ultraprzesaczu stwierdza sie tylko obecnosc /7-kSylozydazy razem z aktywnoscia enzymatyczna odszczepiajaca kwas uronowy, podczas gdy gesta ciemno brazowa po¬ zostalosc na filtrze nie wykazuje zadnej aktyw¬ nosci /?-ksylozydazy, ani zadnej aktywnosci od- szczepiania kwasu uronowego.Przesacz otrzymany po pierwszej ultrafiltracji przerabia sie w nastepujacy sposób: Ultrafiltracja przez ultrafiltr DM 5: Po tej operacji ksylanaza znajduje sie ponownie w ultraprzesaczu. Substancje ksylanowe nieaktyw¬ ne zostaly oddzielone w pozostalosci na filtrze.(Jltrafiltracja przez ultrafiltr DM 5: Ksylanaza znajduje sie w pozostalosci na ultrafilt¬ rze; w tej operacji zostaje zageszczona. Jednoczes¬ nie w ultraprzesaczu zostaje oddzielona wiekszosc weglowodanów (w materiale wyjsciowym: 39%).W przytoczonej tablicy podano aktywnosci ksy- lanazy, /?-ksylozydazy i enzymu odszczepiajacego kwas uronowy. Wartosci podano w „jednostkach". 1 jednostka stanowi ilosc enzymu, która zwieksza zawartosc cukru w roztworze rozkladowym [l°/o ksylanu z drewna bukowego dla ksylanazy, 2 mmole p-nitrofenyloksylopiranozydu dla /?-ksylo- zydazy, 0,2 //g/ul 4-0-metyloglikuronazyloksylotrio- zy dla enzymu odszczepiajacego kwas] w tempera¬ turze 37°C o 1 ^mol ksylozy dla ksylanazy i .6- ksylozydazyi o 1 /^mol kwasu 4-0-metyloglukuro- nowego dla enzymu odszczepiajacego kwas. \\13 120 654 14 rozpusz¬ czona ce- 1 liizymy pozostalosc na ultra- filtrze XM 100 A ultraprze- sacz XM 100 A ultraprze- sacz XM 300 ultraprze- sacz PM 30 pozostalosc na ultra- filtrze DM 5 Ksylanaza 34,560 jed¬ nostek 7,968 jed¬ nostek 24,480 jed¬ nostek — 21,173 jed¬ nostek 19,730 jed¬ nostek /?-ksylozy- daza 1,541 jed¬ nostek 1,290 „ 13 „ - 1,011 „ aktywnosc enzymu od- szczepiajace go kwas glikokuro- '. nowy 2,568 jed¬ nostek 1.996 „ 524 „ 1,817 „ Stwierdzenie aktywnosci odbywa sie za pomoca nizej opisanych sposobów.Stwierdzenie obecnosci ksylanazy z ksylanem drewna bukowego jako substratem odbywa sie reduktometrycznie (SUMNER, por. HOSTECTLER, F., E. BOREL i H. DEUEL, Helv. Chim. Acta 34, 1951, 2132—39). W celu oznaczenia aktywnosci fi- ksylozydazy roztwór p-nitrofenyloksylozydu roz¬ cienczony do 1,5 ml zadaje sie 2 ml 0,1 m roz¬ tworu buforowego boranu o pH 9,8. Ekstynkcje u- wolnionego p-nitrofenolu oznacza sie bezposrednio przy 420 nm. Ilosc p-nitrofenolu odczytuje sie na krzywej wzorcowej i przelicza na ksyloze. Jako substrat enzymu odszczepiajacego kwas uronowy sluzy 4-0-metyloglikuronozyloksylotrioza. Roztwo¬ ry rozkladowe analizuje sie na kolumnie chroma¬ tograficznej przy zastosowaniu zywicy jonitowej Durium Da X-4. (SINNER, M., M.H. SIMATU- PANG i H.H. DIETRISCH, Wood Soi. Technol. 9, 1975, 307—22). Uwolnione ilosci kwasu 4-0-metylo- glikuronowego oblicza sie w /^mol/min.Przyklad IV. Zwiazanie enzymu z nosnikem.Jako nosnik enzymu obiera sie szklo porowate (CPG-550, Corning Class Works, Corning N.Y.).Enzymy ksylanolityczne wiaze sie z nosnikiem en¬ zymu na aldehydzie glutarowym (WEETALL, H.H.Science 166, 1969, 615—17). i 1 g porowatego szkla uzytego jako nosnik og¬ rzewa sie w ciagu nocy z 10% y-aminopropylo- trójetyloksysilanem w toluenie pod chlodnica zwrotna. W ten sposób wyposaza sie nosnik w pierwszorzedowa grupe aminowa. Nastepnie prze¬ mywa sie intensywnie kolejno toluenem i aceto¬ nem. Potem miesza sie nosnik z 20 ml 5% roz¬ tworu aldehydu glutarowego w 0,02 m buforou fo¬ sforanowego o pH 6,5. Nastepnie miesza sie w cia¬ gu 15 minut pod próznia (300 torów), po czym nadal inkubuje w ciagu 45 minut pod normalnym 5 cisnieniem. Potem odsysa sie i material nosniko¬ wy przemywa dokladnie 200 ml roztworu buforo¬ wego.Stosujac ten uaktywniony material nosnikowy wytwarza sie dwa zwiazane z nosnikami prepara- 1° ty enzymatyczne. (a) 1 g zaktywowanego nosnika miesza sie w ciagu nocy z 5 ml otrzymanego wedlug przykladu III roztworu enzymatycznego o 657 jednostkach ksylanazy. 15 Nastepnie na spieku szklanym przemywa sie 1 m NaCl w 0,02 m fosforanowego buforu o pH 4, po czym 0,02 m buforu fosforanowego o pH 5, do chwili stwierdzenia nieobecnosci enzymu w poplu¬ czynach. 20 Otrzymany w ten sposób preparat 1 zawiera 64 jednostki aktywnej ksylanazy w 1 gramie. (b) Postepuje sie jak podano pod (a), z tym, ze stosuje sie 5 ml roztworu otrzymanego wedlug przykladu III, zawierajacego 33 jednostki /?-ksylo- 25 zydazy i 60 jednostek enzymu odszczepiajacego kwas uronowy.Przyklad V. Hydroliza ksylanu z drewna bukowego. 2 ml roztworu ksylanowego otrzyma¬ nego z roztwarzanego drewna bukowego wedlug 30 przykladu I droga przemywania woda (roztwór zawiera 1,3% ksylanu) inkubuje sie z 60 mg pre¬ paratu 2, otrzymanych wedlug przykladu IV, w temperaturze 40°C na wstrzasnej lazni wodnej.Hydrolize ksylanu prowadzi sie analizujac na ko^ 35 lumnie chromatograficznej przy zastosowaniu zy¬ wicy jonitowej (produkt handlowy Durrum DA X-4 firmy Durrum). (SINNER, M., N.H. SIMATU- PANC i H.H. DIETRCHS, Wood Sci. Technol. 9, 1975, 307—22). 40 Po uplywie 4 godzin ksylan z drewna bukowego jest juz zhydrolizowany na monomeryczne skladni¬ ki ksyloze i kwas 4-0-metyloglikuronowy. Na fig. 2 przedstawiono chromatograf po czterogodzinnym inkubowaniu. Z chromatografu wynika, ze w roz- 43 tworze nastapil calkowity rozklad ksylanu na ksy¬ loze. Roztwór nie zawiera zadnej ksylobiozy. Na rysunku skrót C1CA oznacza kwas 4-0-metylogli¬ kuronowy.Pr z y k l a d VI. (porównawczy). Postepuje sie jak 50 w przykladzie V, z tym, ze stosuje sie jeden prc parat enzymatyczny wytworzony wedlug przykladu IV, przy czym jednak roztwory enzymatyczne, zawierajace ksylanaze oraz /?-ksylozydaze i enzym odszczepiajacy kwas uronowy zostaly razem w 55 mieszaninie zwiazane z nosnikiem.Dwa ml roztworu ksylanowego zastosowano w przykladzie V inkubuje sie w temperaturze 4Q°C z 60 mg preparatu tego, zawierajacego razem ksy¬ lanaze, /?-ksylozydaze i enzym odszczepiajacy kwas 60 uronowy.Poza tym w innej próbie porównawczej poste¬ puje sie w ten sposób, z tym, ze stosuje sie jedy¬ nie 60 mg preparatu 1 wytworzonego wedlug przykladu IV (ksylanaza zwiazana z nosnikiem). 65 Rozklad ksylanu w tych trzech roztworach prze-120 654 15 16 biega jak opisano w przykladzie ksylobiozy i ksy- lozy w roztworach zaznaczono na fig. 3. Na wy¬ kresie tym zaznaczono równiez zawartosc ksylo¬ biozy i ksylozy w roztworze z przykladu V (ksy- lanaza i /?-ksylozydaza oraz enzym odszczepiajacy kwas uronowy oddzielnie unieruchomione, wspól¬ nie inkubowane). Z fig. 3 wynika co nastepuje: Wspólnie unieruchomione enzymy co prawda juz po 1 godzinie zhydrolizowaly duza czesc obecnego ksylanu [13 mg/ml] na ksylobioze, lecz stezenie po¬ zadanego koncowego produktu rozkladu — ksylo¬ zy jednak nie zwiekszalo sie dalej z przedluzaja¬ cym sie czasem inkubacji.Ksynalaza zwiazana z nosnikiem juz po 3€ minu¬ tach rozlozyla wieksza czesc obecnego ksylanu na cukry oligomery. Zawartosc ksylozy oczywiscie nie zwiekszala sie, poniewaz koncowym produktem rozkladu ksylanozy jest zasadniczo ksylobioza.Enzymy wedlug przykladu V, to znaczy w sto¬ sowanych wedlug wynalazku preparatach oddziel¬ nie unieruchomione, lecz wspólnie inkubowane roz¬ lozyly roztwór ksylanowy po 30 minutach na ksy¬ lobioze i ksyloze i na cukry kwasne. Z przedluza¬ jacym sie czasem tiwania inkubacji zwiekszalo sie stezenie ksylozy pod dzialaniem /?-ksylozydazy i odpowiednio zmniejszala sie zawartosc ksylobiozy 5 w roztworze rozkladowym. Po uplywie 4 godzin osiagnieto calkowita hydrolize na ksyloze i kwas 4-0-metyloglikuronowy, jak to widac na fig. 2 (porównaj przyklad V).Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania ksylozy na drodze enzyma¬ tycznej hydrolizy ksylanów, znamienny tym, ze na wodny roztwór ksylanów dziala sie preparatem A, stanowiacym nosnik, zawierajacy sposród ksylano- litycznych enzymów, jako enzym podstawowy zwiazana ksylanaze w ilosci co najmniej 70% wa¬ gowych enzymów zwiazanych, i preparatem B, stanowiacym nosnik zawierajacy sposród ksylano- litycznych enzymów, jako enzym podstawowy, zwiazana /?-ksylozydaze w ilosci co najmniej 50% wagowych enzymów zwiazanych i ewentualnie za¬ wierajacy enzym odszczepiajacy kwas uronowy. 15120 654 FIG. 2120 654 O ^ !^fi_±£^Ie glikurono galakloza arabinoza mannoza glikoza kwas 4-0-Me glinuronowy galakloza arabinoza mannoza glikoza kwas 4-0-Me glikuronowy o 3 glikoza ksyloza ksyloza galakloza ma nnoza ksyloz 12 i mg/m/ — — — —•— ¦ J .a. ^"" // <"¦¦¦¦¦¦-.. 1! 1 ' - i,' / :l 1 ;l i U ! Ul 1 _..<— 1 / X""""" 1 .' .•¦ 1 /*•*" —— — — "•"• — • Ksylobioza *A Ksylobioza / " '''xx, ...•'" •* ..•jcr" **••. .••*"*" \ \ i -A- p Ksyloza .* —o \ Ksylobioza 9 - •- ksylanaza zwiazana z nosnikiem ksylanaza i /3-ksylozydaza wspólnie unieruchomione ksylanaza i /3-ksylozydaza oddzielnie unieruchomione wspólnie inkubowane FIG. 3 d h /gon*I DN-8 724/83 Cena 100 zl PL